JP6716619B2 - 赤血球結合治療剤 - Google Patents

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関連出願の相互参照
本出願は、参照により本明細書に組み込まれる２０１２年２月１５日に出願された米国特許出願第１３／３９７，２０２号明細書の優先権を主張する。
技術分野は、医薬組成物および赤血球に結合するリガンドまたは抗体の使用に関する。具体的な使用としては、免疫寛容化、薬物送達、および癌治療が挙げられる。
移植組織の拒絶および自己免疫疾患は、外来生体分子の抗原性質による外来生体分子の免疫拒絶を含む病態である。多くの薬物および臨床プロセスは、免疫拒絶の抑制または治療に関与する。ワクチンは、抗病原性生体分子上の抗原に対する免疫応答を刺激してその抗原を担持するタンパク質または他の生体分子に対する免疫系応答を構築することによりこのプロセスに有利である。
寛容導入は、物質に対する免疫学的寛容を創成するプロセスである。物質の寛容を創成するために治療される患者、ヒトまたは非ヒトのいずれかは、低減した物質に対する適応免疫応答を有する。適応免疫応答の低減は、物質に反応性の循環抗体の量を分析することにより、または物質および寛容化剤に対するＴ細胞反応を分析することにより計測することができる。寛容化のための組成物および方法が、本明細書において提供される。実施形態の多くは、赤血球結合部分と組み合わせた寛容化抗原を有する融合分子を投与することを含む。融合分子は、赤血球に結合し、寛容化抗原を免疫系に寛容を創成する様式で提示するプロセスを開始させる。
赤血球（赤血球細胞としても公知）に特異的に結合するペプチドは、発見されている。これらのペプチドリガンドは、血液中に存在する他の因子の存在下でも赤血球に特異的に結合する赤血球結合部分である。これらのリガンドは、種々の手法で使用することができる。
本発明の一実施形態は、寛容誘発抗原および患者中の赤血球に特異的に結合する赤血球結合部分を含む分子融合物を含む薬学的に許容可能な組成物であって、赤血球結合部分は、Ｂａｎｄ３（ＣＤ２３３）、アクアポリン−１、Ｇｌｕｔ−１、Ｋｉｄｄ抗原、ＲｈＡｇ／Ｒｈ５０（ＣＤ２４１）、Ｒｈ（ＣＤ２４０）、Ｒｈ３０ＣＥ（ＣＤ２４０ＣＥ）、Ｒｈ３０Ｄ（ＣＤ２４０Ｄ）、Ｋｘ、グリコホリンＢ（ＣＤ２３５ｂ）、グリコホリンＣ（ＣＤ２３５ｃ）、グリコホリンＤ（ＣＤ２３５ｄ）、Ｋｅｌｌ（ＣＤ２３８）、Ｄｕｆｆｙ／ＤＡＲＣｉ（ＣＤ２３４）、ＣＲ１（ＣＤ３５）、ＤＡＦ（ＣＤ５５）、グロボシド、ＣＤ４４、ＩＣＡＭ−４（ＣＤ２４２）、Ｌｕ／Ｂ−ＣＡＭ（ＣＤ２３９）、ＸＧ１／ＸＧ２（ＣＤ９９）、ＥＭＭＰＲＩＮ／ニューロセリン（ｎｅｕｒｏｔｈｅｌｉｎ）（ＣＤ１４７）、ＪＭＨ、グリコシルトランスフェラーゼ、Ｃａｒｔｗｒｉｇｈｔ、Ｄｏｍｂｒｏｃｋ、Ｃ４Ａ／ＣＡＢ、Ｓｃｉａｎｎａ、ＭＥＲ２、ストマチン、ＢＡ−１（ＣＤ２４）、ＧＰＩＶ（ＣＤ３６）、ＣＤ１０８、ＣＤ１３９、およびＨ抗原（ＣＤ１７３）からなる群から選択される生体分子に特異的に結合する組成物である。
本発明の一実施形態は、標的、例えば、寛容誘発抗原を含むタンパク質に特異的に結合するドメインに結合している赤血球結合部分を含む薬学的に許容可能な組成物である。これらのドメインの一方または両方は、ペプチド性リガンドまたは抗体もしくは抗体断片であり得る。
別の実施形態は、抗体枯渇またはそうでなければ患者中の循環からの抗体の除去において使用される薬学的に許容可能な組成物である。組成物は、抗原、例えば、ネイティブ自己抗原または治療タンパク質についての抗原に結合している赤血球結合部分を有する。
ＥＲＹ１およびオボアルブミン（ＯＶＡ）の分子融合物についての実験スキームおよび結果を示し、ＥＲＹ１−ＯＶＡ融合物は、マウス赤血球の赤道周辺に高親和性で結合する；パネル（ａ）赤血球表面グリコホリン−Ａへの結合をもたらすオボアルブミン（ＯＶＡ）へのＥＲＹ１ペプチドのコンジュゲーションの図解；パネル（ｂ）フローサイトメトリーにより特徴決定されたそれぞれのＯＶＡコンジュゲートおよび中間体の結合；黒塗りヒストグラム、ＥＲＹ１−ＯＶＡ；白抜きヒストグラム、ＳＭＣＣ−ＯＶＡ；点線ヒストグラム、ＭＩＳ−ＯＶＡ；ＥＲＹ１＝赤血球結合ペプチドＷＭＶＬＰＷＬＰＧＴＬＤ（配列番号１）、ＭＩＳ＝ミスマッチペプチドＰＬＬＴＶＧＭＤＬＷＰＷ（配列番号２）、ＳＭＣＣ＝スルホスクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート、ＥＲＹ１をＯＶＡにコンジュゲートするために使用；パネル（ｃ）フローサイトメトリーにより測定された、ＥＲＹ１−ＯＶＡの低解離定数（Ｒ２＝０．９７、単一部位結合）を実証する赤血球へのＥＲＹ１−ＯＶＡの平衡結合。 赤血球結合が抗原チャレンジに対する寛容を誘導することを示す結果の図である：パネル（ａ）実験ならびにチャレンジおよび未処置対照群についての実験プロトコルを示すＯＴＩ ＣＤ８＋Ｔ細胞養子移入寛容モデル（ｎ＝５）；パネル（ｂ）ＯＴＩ ＣＤ８＋Ｔ細胞集団（ＣＤ３ε＋ＣＤ８α＋ＣＤ４５．２＋）のフローサイトメトリー検出；パネル（ｃ）ＣＤ４５．１＋マウスにおける抗原チャレンジ４日後の流入領域リンパ節（鼠径および膝窩）中のＯＴＩ ＣＤ８＋Ｔ細胞集団定量（＊＊Ｐ＜０．０１）；パネル（ｄ）ＩＦＮγ発現ＯＴＩ ＣＤ８＋Ｔ細胞のフローサイトメトリー検出；パネル（ｅ）抗原チャレンジおよびＳＩＩＮＦＥＫＬペプチド（配列番号３）による再刺激４日後の流入領域リンパ節中のＩＦＮγ発現ＯＴＩ ＣＤ８＋Ｔ細胞（＊＊Ｐ＜０．０１）；パネル（ｆ）ＥＬＩＳＡにより測定された、ＳＩＩＮＦＥＫＬペプチド（配列番号３）による再刺激４日後のリンパ節細胞培養培地中のＩＦＮγ濃度（＊＊Ｐ＜０．０１）；パネル（ｇ）ＥＬＩＳＡにより測定された、ＯＶＡによる再刺激４日後のリンパ節細胞培養培地中のＩＬ−１０濃度（＊Ｐ＜０．０５）。データは、中央値±最小〜最大値を表す；パネル（ｈ）１９日目におけるＯＶＡ特異的血清ＩｇＧ力価、（＊Ｐ＜０．０５）データは、平均値±ＳＥを表す；パネル（ｉ）実験および対照群（それぞれｎ＝４、３）についての実験プロトコルを示す、ＯＴＩおよびＯＶＡ発現ＥＬ４胸腺腫（Ｅ．Ｇ７−ＯＶＡ）組合せの腫瘍寛容モデル；パネル（ｊ）養子移入５日後に血液中で循環する非増殖（０世代）ＯＴＩ ＣＤ８＋Ｔ細胞の定量；データは、中央値±最小〜最大値を表す（＊＊Ｐ＜０．０１）；パネル（ｋ）ＯＴＩ養子移入９日後に皮下注射されたＥ．Ｇ７−ＯＶＡ腫瘍の成長プロファイル、データは、平均値±ＳＥを表す（＊Ｐ＜０．０５）。 赤血球結合がＣ５７ＢＬ／６マウス中の抗原特異的液性応答をいかに減弱させるかを示す棒グラフである。Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける６日間の間隔を置いた１μｇのＯＶＡまたは１μｇのＥＲＹ１−ＯＶＡの２回投与１９日後の血清中のＯＶＡ特異的ＩｇＧ検出（＊Ｐ≦０．０５）。 ８アームＰＥＧ−ＥＲＹ１がインビトロおよびインビボで赤血球に結合する実験結果を表す；パネル（ａ）インビトロインキュベーション後、８アームＰＥＧ−ＥＲＹ１（黒塗りヒストグラム）はマウス赤血球に結合するが、８アームＰＥＧ−ＭＩＳ（灰塗りヒストグラム）も８アームＰＥＧ−ピリジルジスルフィドも結合しない；パネル（ｂ）静脈内注射時、８アームＰＥＧ−ＥＲＹ１（黒塗りヒストグラム）は循環赤血球に結合するが、８アームＰＥＧ−ＭＩＳ（灰塗りヒストグラム）は結合しない。 フローサイトメトリーにより測定された、８アームＰＥＧ−ＥＲＹ１（黒色丸）および８アームＰＥＧ−ＭＩＳ（白抜き四角）の赤血球細胞表面半減期を示す実験結果を表す。 ヒト赤血球へのペプチド性リガンドの結合を示す棒グラフとしての実験結果を表す。 フローサイトメトリーヒストグラムとしての実験結果を表す。マウス赤血球をＴＥＲ１１９−ＳＩＩＮＦＥＫＬ（灰塗りヒストグラム）またはアルブミン（白抜きヒストグラム）とインキュベートした。蛍光シグナルは、ｓｃＦｖの検出において使用される抗６×Ｈｉｓ−ＰＥ抗体から生じる。 生理食塩水、ＯＶＡ、ＥＲＹ１−ＯＶＡ、またはＴＥＲ１１９−ＳＩＩＮＦＥＫＬの静脈内投与後の脾臓中の増殖ＯＴ−Ｉ ＣＤ８Ｔ細胞を示す実験結果のプロットである。＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１ 養子移入および生理食塩水、ＯＶＡ、ＥＲＹ１−ＯＶＡ、またはＴＥＲ１１９−ＳＩＩＮＦＥＫＬの静脈内投与後のＯＴＩ ＣＤ８Ｔ細胞の表現型特徴決定を示す実験結果のプロットである。左パネル：フローサイトメトリーにおけるアネキシンＶ結合により標識されたアポトーシスＯＴＩ細胞誘導；右パネル：フローサイトメトリーにおけるＰＤ−１の発現により標識された疲弊ＯＴＩ細胞誘導。 フローサイトメトリーにより分析された、種々の注射配合物により寛容化されたマウスからのチャレンジの部位に流入するリンパ節中の炎症（ＩＦＮγ＋）ＯＴＩ Ｔ細胞の特徴決定を示す実験結果のプロットである。 ＥＬＩＳＡにより測定された、２または６用量のＥＲＹ１−ＡＳＮアーゼまたは野生型ＡＳＮアーゼを受けたマウスからの投与２１日後のアスパラギナーゼ（ＡＳＮアーゼ）特異的血清ＩｇＧ力価を示す実験結果のプロットである。 種々の培地添加剤を有する脾臓ＤＣとの共培養物中のトランスジェニックＮＯＤＢＤＣ２．５マウスからのＣＤ４Ｔ細胞の増殖を示す実験結果のプロットである。 フローサイトメトリーにより測定された、養子移入およびＴＥＲ１１９−ＣｈｒＡ、フリー１０４０−ｐ３１ペプチド、または生理食塩水の静脈内投与後の非増殖ＮＯＤＢＤＣ２．５ＣＤ４Ｔ細胞の定量を示す実験結果のプロットである。
寛容誘発についての分子設計が提供される。寛容が求められるタンパク質または他の分子抗原は、赤血球結合部分とのコンジュゲートとして形成される。この部分は、ペプチドリガンド、抗体、アプタマー、または抗体断片を含み得る。コンジュゲートは、分子融合物とも称され、融合タンパク質であり得、またはリンカー、例えば、ポリマーもしくはポリマーミセルもしくはポリマーナノ粒子コンジュゲートを含み得る。
赤血球に特異的に結合するペプチドが本明細書において記載される。これらは、赤血球に特異的に結合する配列を有するペプチド性リガンドとして、または赤血球への特異的結合を提供する抗体もしくはその断片として提供される。ペプチドは、治療剤、寛容化抗原、または標的化ペプチドとの分子融合物として調製することができる。治療剤は、有利には、それらが融合物の一部である場合に増加したインビボ循環半減期を有し得る。免疫寛容は、融合物の使用および寛容が望まれる物質に基づく抗原の選択により創成することができる。これに関して、抗原という用語は、完全サイズの抗原、その抗原性断片、または寛容誘発抗原の模倣物を意味する。標的化ペプチドとの融合物は、融合物を標的、例えば、腫瘍に指向させ、赤血球結合リガンドは、赤血球を標的に動員することによる腫瘍への血流を低減させ、または完全に排除する。
赤血球に特異的に結合するペプチド性配列
赤血球に特異的に結合するペプチドは、本出願人によりＰＣＴ米国特許出願公開第２０１１／０４７０７８号明細書において発見および報告されており、そのペプチドとしては、赤血球に特異的に結合するＥＲＹ１と称されるペプチドが挙げられる。ヒト赤血球に特異的に結合する６つのペプチド（ＥＲＹ１９、ＥＲＹ５９、ＥＲＹ６４、ＥＲＹ１２３、ＥＲＹ１４１およびＥＲＹ１６２）も報告された。実施例９は、ペプチド性リガンド（ＥＲＹ６４、ＥＲＹ１２３、およびＥＲＹ１４１）がいかに蛍光タンパク質レポーターとの融合タンパク質の一部とし、それらの特異的結合特性を保持したかを詳述する。本発明の一実施形態は、ＥＲＹ１のアミノ酸配列、もしくはヒト赤血球結合ペプチドの１つ、もしくはそれらの保存的置換物を含む実質的に純粋なポリペプチド、またはそれらをコードする核酸である。そのようなポリペプチドは、赤血球に特異的に結合し、赤血球についてのリガンドである。リガンドは、標的分子への特異的結合を有する化学部分を指す用語である。標的は、使用者がリガンドとの結合を意図する所定の分子、組織、または局在部位を指す。したがって、組織への標的化された送達は、意図される標的組織への分子または他の材料、例えば、細胞の送達を指す。したがって、実施形態は、赤血球に結合させるために使用される本明細書に開示されるリガンドの少なくとも１つを含む分子または組成物を含む。赤血球へのポリペプチドの結合活性は、本明細書に記載の以下の実験プロトコルにより簡易に測定することができる。そのような方法を使用して、所与の生理学的条件下でのＥＲＹ１またはヒト赤血球結合ペプチドに対するポリペプチドバリアント、例えば、保存的置換、フランキング基の付加もしくは除去、または水溶液中の配列溶解度を調整するための変化もしくは付加を使用して作製された配列の結合強度を測定することができる。ペプチド性リガンドは、以下の標的または標的群の１つ以上について特異的に生成することができる：赤血球表面分子（タンパク質、糖タンパク質）、Ｂａｎｄ３（ＣＤ２３３）、グリコホリン、より特定すると、グリコホリンＡ（ＣＤ２３５ａ）、グリコホリンＢ（ＣＤ２３５ｂ）、グリコホリンＣ（ＣＤ２３５ｃ）およびグリコホリンＤ（ＣＤ２３５ｄ）、アクアポリン−１、Ｇｌｕｔ−１、Ｋｉｄｄ抗原、ＲｈＡｇ／Ｒｈ５０（ＣＤ２４１）、Ｒｈ（ＣＤ２４０）、Ｒｈ３０ＣＥ（ＣＤ２４０ＣＥ）、Ｒｈ３０Ｄ（ＣＤ２４０Ｄ）、Ｋｘ、Ｋｅｌｌ（ＣＤ２３８）、Ｄｕｆｆｙ／ＤＡＲＣ（ＣＤ２３４）、ＣＲ１（ＣＤ３５）、ＤＡＦ（ＣＤ５５）、グロボシド、ＣＤ４４、ＩＣＡＭ−４（ＣＤ２４２）、Ｌｕ／Ｂ−ＣＡＭ（ＣＤ２３９）、ＸＧ１／ＸＧ２（ＣＤ９９）、ＥＭＭＰＲＩＮ／ニューロセリン（ＣＤ１４７）、ＪＭＨ、グリコシルトランスフェラーゼ、Ｃａｒｔｗｒｉｇｈｔ、Ｄｏｍｂｒｏｃｋ、Ｃ４Ａ／ＣＡＢ、Ｓｃｉａｎｎａ、ＭＥＲ２、ストマチン、ＢＡ−１（ＣＤ２４）、ＧＰＩＶ（ＣＤ３６）、ＣＤ１０８、ＣＤ１３９、およびＨ抗原（ＣＤ１７３）。赤血球細胞表面タンパク質は、精製された調製物またはそれらの混合物のいずれかで、ペプチド性リガンドについてスクリーニングすることができる。赤血球細胞表面タンパク質は、それらの完全形態で、またはタンパク質の発現もしくは安定性を向上させるタグに融合している部分ドメインとして組換え発現させることができる。次いで、組換えタンパク質標的を、プレートまたはビーズ上で固定化し、ライブラリースクリーニングプロセスのための親和性標的として使用することができる。赤血球細胞表面タンパク質は、全血の細胞調製物から単離することもでき、それから膜タンパク質の精製または複合体混合物を固体マトリックス（ビーズ、プレートなど）上で固定化し、スクリーニングプロセスのための親和性標的として使用することができる。全スクリーニングプロセスは、高濃度の血清アルブミン（例えば、５０ｍｇ／ｍＬ）の存在下で３７℃において実施して非特異的結合イベントを低減させ、血清中で好ましい結合特徴を有するペプチドを選択することができる。ペプチド性リガンドは、最も好ましくは、Ｂａｎｄ３（ＣＤ２３３）、グリコホリンＢ（ＣＤ２３５ｂ）、グリコホリンＣ（ＣＤ２３５ｃ）およびグリコホリンＤ（ＣＤ２３５ｄ）から選択される。
ペプチド性リガンドは、細胞形態を変化させず、細胞質移行なしで赤血球細胞表面に結合することが観察された。リガンドは、細胞表面にわたり分布し、クラスター化しなかった。グリコホリン−Ａ（ＧＹＰＡ）は、ＥＲＹ−１の標的として同定された特異的タンパク質である。ＥＲＹ−１は、マウスおよびラット種とのみ反応性である。ヒト赤血球に特異的に結合するペプチド性リガンドは、ヒト赤血球に特異的であり、他の種には特異的でないことが決定された。マウス赤血球細胞表面に対する高親和性ペプチドＷＭＶＬＰＷＬＰＧＴＬＤ（配列番号１ 本明細書においてＥＲＹ１と称される）を示すファージクローンが報告された。他の実験は、表１〜２に示されるヒト赤血球についての結合リガンドを同定した。６つの配列が、ヒト赤血球に特異的に結合した。ＥＲＹ５０と命名された第７の配列は、ヒト赤血球に結合し、上皮／内皮細胞にも結合した。
本発明の実施形態は、赤血球の表面に特異的に結合するペプチドを含む。配列は、最小長について最適化しなかった。そのような最適化は、当技術分野の技能の範囲内であり、本明細書に記載の技術を使用して実施することができる。例えば、Ｋｅｎｒｉｃｋ ｅｔ ａｌ．（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．Ｄｅｓ．Ｓｅｌ．（２０１０）２３（１）：９−１７）は、１５残基ライブラリーからスクリーニングし、次いで最小結合配列の７残基長を同定した。Ｇｅｔｚ（ＡＣＳ Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，Ｍａｙ ２６，２０１１は、５残基長ほどの小さい最小結合ドメインを同定した。赤血球結合ペプチドは、同一配列のリピート、例えば、２〜２０リピート中に存在し得；当業者は、明示される範囲内の全ての範囲および値が企図されることを直ちに認識する。さらに、ペプチドは、同一ペプチド中に存在し、または単一分子融合物の一部である２つ以上の区別される配列との組合せで存在し得る。
特異的結合を提供する連続残基の数は、約４〜１２残基であると予測される。したがって、表２に見出される４つの連続残基長の全てのペプチド、および例えば５、６、７、または８つの連続残基の全てのペプチドが開示される。この数は、他のペプチド性タンパク質−結合リガンドについての残基の数に基づく。本発明の実施形態は、本明細書、例として表１に記載の赤血球結合配列番号の１つについての最小長配列を含む。したがって、ある実施形態は、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１、およびそれらの保存的置換物からなる群から選択される配列の４〜１２の連続アミノ酸残基のいくつかの連続アミノ酸配列を含むペプチド、または単離された（または精製された）ペプチドを含む組成物であって、前記配列は、赤血球に特異的に結合する組成物を対象とする。あるいは、連続残基の数は、約５〜約１８になるように選択することができ；当業者は、明示される範囲内の全ての範囲および値、例えば、７、８、９、１０、または８〜１８が企図されることを直ちに認識する。赤血球結合配列は、例えば、その配列の少なくとも１つおよび２つ以下のアミノ酸の保存的置換、または１、２、もしくは３つの置換、または１〜５つの置換を有し得る。さらに、発見された配列中のＤ−アミノ酸によるＬ−アミノ酸の置換は、Ｇｉｏｒｄａｎｏにおけるように高頻度で達成することができる。ペプチドまたは組成物は、一部の実施形態において、本質的に、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１からなる群から選択される配列からなっていてよい。ペプチドは、長さを限定することができ、例えば、約１０〜約１００の残基の数を有し；当業者は、明示される範囲内の全ての範囲および値、例えば、約１０〜約５０または約１５〜約８０が企図されることを直ちに認識する。ペプチドと赤血球との間の平衡結合計測により測定された約１０μＭ〜０．１μＭの解離定数を有するペプチドリガンドを含むペプチド赤血球結合部分を提供することができ；当業者は、明示される範囲内の全ての範囲および値、例えば、約１μＭ〜約１ｎＭが企図されることを直ちに認識する。ペプチドは、治療剤をさらに含み得る。治療剤は、例えば、タンパク質、生物製剤、抗体断片、ＳｃＦｖ、またはペプチドであり得る。ペプチドは、寛容誘発抗原、例えば、タンパク質を欠損しているヒトにおいて使用されるヒトタンパク質（例えば、血液因子、例えば、第ＶＩＩＩ因子または第ＩＸ因子）、非ヒトグリコシル化を有するタンパク質、ヒト中で天然では見出されない合成タンパク質、ヒト食物アレルゲン、またはヒト自己免疫抗原をさらに含み得る。
種々の長さのポリペプチドを、特定の用途に適宜使用することができる。一般に、ポリペプチドリガンド配列を含有するポリペプチドは、ポリペプチドがインビボでの赤血球との相互作用に利用可能である場合、特異的結合を示す。フォールドする潜在性を有するペプチドは、本明細書に記載の方法を使用して試験することができる。したがって、ある実施形態は、天然では生じないポリペプチドリガンドを有するポリペプチドを対象とし、ある他の実施形態は、特定の長さ、例えば、６〜３０００残基、または１２〜１０００、または１２〜１００、または１０〜５０を有するポリペプチドを対象とし；当業者は、明示される限度内の全ての値および範囲が企図されることを直ちに認識する。
ある実施形態は、種々のポリペプチド配列および／または精製もしくは単離されたポリペプチドを提供する。ポリペプチドは、翻訳後修飾（例えば、リン酸化またはグリコシル化）ならびに／または追加のポリペプチドとの複合体化、核酸および／もしくは炭水化物、もしくは他の分子とのマルチサブユニット複合体への合成にかかわらず、アミノ酸残基の鎖を指す用語である。したがって、プロテオグリカンは、本明細書においてポリペプチドとも称される。本明細書において使用される「機能性ポリペプチド」は、示される機能を促進し得るポリペプチドである。ポリペプチドは、多数の方法により産生することができ、その多くが当技術分野において周知である。例えば、ポリペプチドは、抽出（例えば、単離された細胞から）により、ポリペプチドをコードする組換え核酸の発現により、または化学合成により得ることができる。ポリペプチドは、例えば、組換え技術、およびコードされるポリペプチドの発現のために宿主細胞中に導入（例えば、形質転換または形質移入により）されたポリペプチドをコードする発現ベクターにより産生することができる。
活性を変化させずに一般にアミノ酸配列になすことができる種々の保存的変化が存在する。これらの変化は、保存的置換または突然変異と称され；すなわち、特定のサイズまたは特徴を有するアミノ酸のグループに属するアミノ酸を別のアミノ酸と置換することができる。アミノ酸配列についての置換物は、そのアミノ酸が属するクラスの他のメンバーから選択することができる。例えば、非極性（疎水性）アミノ酸としては、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニン、およびチロシンが挙げられる。極性中性アミノ酸としては、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギンおよびグルタミンが挙げられる。正荷電（塩基性）アミノ酸としては、アルギニン、リジンおよびヒスチジンが挙げられる。負荷電（酸性）アミノ酸としては、アスパラギン酸およびグルタミン酸が挙げられる。そのような変化は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動または等電点により測定される見かけの分子量に実質的に影響しないと予測される。保存的置換としては、配列の光学異性体を他の光学異性体に、具体的には、配列の１つ以上の残基についてＤアミノ酸をＬアミノ酸に、置換することも挙げられる。さらに、配列中のアミノ酸の全ては、ＤからＬ異性体への置換を受け得る。例示的な保存的置換としては、限定されるものではないが、陽性電荷を維持するためのＬｙｓのＡｒｇへの置換およびその逆；陰性電荷を維持するためのＧｌｕのＡｓｐへの置換およびその逆；フリー−−ＯＨが維持されるようなＳｅｒのＴｈｒへの置換；ならびにフリーＮＨ２を維持するためのＧｌｎのＡｓｎへの置換が挙げられる。さらに、ポリペプチド配列または対応する核酸配列の点突然変異、欠失、および挿入を、一部の場合、ポリペプチドまたは核酸断片の機能の損失なしでなすことができる。置換は、例えば、１、２、３つ以上の残基を含み得る。本明細書に記載のアミノ酸残基は、一文字アミノ酸表記または三文字略記のいずれかを用いる。本明細書において使用される略記は、標準的なポリペプチド命名法、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，（１９６９），２４３，３５５２−３５５９に従う。全てのアミノ酸残基配列は、慣用のアミノ末端からカルボキシ末端方向で左右方向を有する式により本明細書において表される。
一部の場合、本明細書に記載のペプチドと配列との同一性パーセントの決定が要求され得る。そのような場合、同一性パーセントは、ペプチド、またはペプチドの一部の残基の数に関して計測される。例えば、９０％の同一性のポリペプチドは、より大きいペプチドの一部でもあり得る。
ポリペプチドに関して本明細書において使用される精製されたという用語は、化学合成され、したがって他のポリペプチドにより実質的に汚染されておらず、または天然で付随する他のほとんどの細胞成分（例えば、他の細胞タンパク質、ポリヌクレオチド、または細胞成分）から分離もしくは精製されたポリペプチドを指す。精製されたポリペプチドの一例は、天然で会合するタンパク質および天然有機分子を有さない乾燥重量で少なくとも７０％であるポリペプチドである。したがって、精製されたポリペプチドの調製物は、例えば、乾燥重量で少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９９％のポリペプチドであり得る。ポリペプチドは、ポリペプチドの精製または標識（例えば、親和性マトリックス上への捕捉、顕微鏡下での可視化）を容易にするタグ配列（例えば、ポリヒスチジンタグ、ｍｙｃタグ、またはＦＬＡＧ（登録商標）タグ）を含有するようにエンジニアリングすることもできる。したがって、ポリペプチドを含む精製された組成物は、特に記載のない限り、精製されたポリペプチドを指す。単離されたという用語は、本発明のポリペプチドまたは核酸がそれらの天然環境中で存在しないことを示す。したがって、本発明の単離された産生物は、培養上清中で含有させ、部分濃縮し、異種源から産生し、ベクター中でクローニングし、またはビヒクルと配合などすることができる。
ポリペプチドは、化学的改変を含み得；その用語は、それに関して、アミノ酸の天然化学構造の変化を指す。そのような改変は、例えば、アミノ末端またはカルボキシル末端を変化させて側鎖または末端になすことができる。一部の実施形態において、改変は、ポリペプチドを他の材料に結合させるため、または治療剤に結合させるために便利に使用することができる化学基の創成に有用である。
生物学分野において一般に使用される用語の特異的結合は、非標的組織と比較して比較的高い親和性で標的に結合する分子を指し、一般に、複数の非共有相互作用、例えば、静電相互作用、ファン・デル・ワールス相互作用、水素結合などを含む。特異的結合相互作用は、抗体−抗原結合、酵素−基質結合、および特異的結合タンパク質−受容体相互作用を特徴づける一方；そのような分子は、それらの標的の他の組織に随時結合し得、そのような結合は、特異性を欠き、特異的結合でないとされる。ペプチドＥＲＹ１およびその誘導体ならびにヒト赤血球結合ペプチドおよびその誘導体は、一部の状況において非赤血球に結合し得るが、そのような結合は、他の細胞またはタンパク質とは対照的に赤血球へのペプチドのかなり大きい結合により証明されるとおり、非特異的であると観察されている。
したがって、実施形態は、赤血球に特異的に結合し、他の血液成分、例えば、血液タンパク質、アルブミン、フィブロネクチン、血小板、白血球細胞、典型的なヒトから採取された血液試料中に見出される実質的に全ての成分の１つ以上に特異的に結合しないリガンドを含む。血液試料に関して、用語「実質的に全ての」は、典型的に存在する成分を指すが、他のバイオアベイラブルなリガンドの力価を事実上低減させないような極めて低濃度の付随成分を排除する。
抗体ペプチド
赤血球に結合するペプチドに加え、タンパク質、具体的には、抗体、特に単鎖抗体断片も本明細書に提示される。抗原に対する抗体を生じさせるための技術は、周知である。抗原という用語は、これに関して、抗原に対応する宿主免疫系により認識される部位を指す。抗原選択は、数ある分野のうち、抗体を生じさせる分野において公知である。実施形態は、本明細書に提示される分子融合物および他の方法におけるそれらのペプチドの使用を含む。抗原は、それらの完全形態で、またはタンパク質の発現もしくは安定性を向上させるタグに融合している部分ドメインとして組換え発現させることができる。次いで、組換えタンパク質抗原を、プレートまたはビーズ上で固定化し、ライブラリースクリーニングプロセスのための親和性標的として使用することができる。抗原は、全血の細胞調製物から単離することもでき、それから膜タンパク質の精製または複合体混合物を固体マトリックス（ビーズ、プレートなど）上で固定化し、スクリーニングプロセスのための親和性標的として使用することができる。
本開示を精読する当業者は、赤血球に特異的に結合する抗体を創成することができる。実施例４〜６は、抗体またはその断片の作製に関する。多数の並行技術、例として、限定されるものではないが、ファージディスプレイ、酵母ディスプレイ、および細菌ディスプレイが、新たな抗体もしくは抗体断片を発見するため、または赤血球に対して活性なそのような断片を含む組成物を作製するために使用される。追加の赤血球結合抗体もしくは抗体断片、またはｓｃＦｖは、以下の標的または標的群（集合的に、本明細書において赤血球標的群と称される）の１つ以上について特異的に生成することができ、それは、Ｂａｎｄ３（ＣＤ２３３）、アクアポリン−１、Ｇｌｕｔ−１、Ｋｉｄｄ抗原、ＲｈＡｇ／Ｒｈ５０（ＣＤ２４１）、Ｒｈ（ＣＤ２４０）、Ｒｈ３０ＣＥ（ＣＤ２４０ＣＥ）、Ｒｈ３０Ｄ（ＣＤ２４０Ｄ）、Ｋｘ、グリコホリンＡ（ＣＤ２３５ａ）、グリコホリンＢ（ＣＤ２３５ｂ）、グリコホリンＣ（ＣＤ２３５ｃ）、グリコホリンＤ（ＣＤ２３５ｄ）、Ｋｅｌｌ（ＣＤ２３８）、Ｄｕｆｆｙ／ＤＡＲＣ（ＣＤ２３４）、ＣＲ１（ＣＤ３５）、ＤＡＦ（ＣＤ５５）、グロボシド、ＣＤ４４、ＩＣＡＭ−４（ＣＤ２４２）、Ｌｕ／Ｂ−ＣＡＭ（ＣＤ２３９）、ＸＧ１／ＸＧ２（ＣＤ９９）、ＥＭＭＰＲＩＮ／ニューロセリン（ＣＤ１４７）、ＪＭＨ、グリコシルトランスフェラーゼ、Ｃａｒｔｗｒｉｇｈｔ、Ｄｏｍｂｒｏｃｋ、Ｃ４Ａ／ＣＡＢ、Ｓｃｉａｎｎａ、ＭＥＲ２、ストマチン、ＢＡ−１（ＣＤ２４）、ＧＰＩＶ（ＣＤ３６）、ＣＤ１０８、ＣＤ１３９、およびＨ抗原（ＣＤ１７３）からなる群から選択される。
さらに、新たな赤血球特異的抗体は、インタクトなヒト赤血球またはそのタンパク質調製物によるマウスの免疫化により生成することができる。アジュバント中で配合された標的による免疫化後、マウスを所定の時点において屠殺し、それらの抗体レパートリーをシーケンシングし、および／またはそれらのＢ細胞をハイブリドーマベーススクリーニングのために単離する。これらの抗体または抗体断片は、いくつかの上記のインビトロ技術により、改善された結合および／または安定性パラメーターについて最適化することができる。追加の赤血球結合抗体または抗体断片は、赤血球に結合することが既に発見されている抗体ハイブリドーマクローンを使用することにより生成することができる。これらは、例えば、ＴＥＲ１１９ｓｃＦｖを生成するために使用される方法を使用することにより生成することができる。テンプレートとして、または抗体源として、とりわけ、以下のハイブリドーマクローンを使用することができる：ＢＲＩＣ４、５、６、１０、１４、１８、３９、６６、６８、６９、８７、１０８、１１０、１１１、１２５、１２６、１２８、１４５、１５５、１５７、１６３、１７０、１９８、２０３、２１６、２２０、２２１、２２２、２２９、２３０、２３１、２３５、または２５６；ＢＲＡＣ１７、１８；ＢＧＲＬ１、２、１１、１００；ＢＲＡＤ３；ＢＩＲＭＡ Ｄ６、Ｄ１０、Ｋ３、８４Ｂ；６Ａ７；ＣＯＥ；またはＫＺ１。
ペプチドという用語は、本明細書におけるポリペプチドという用語と互換的に使用される。抗体および抗体断片は、ペプチドである。抗体断片という用語は、抗体の抗原結合機能を保持する抗体の一部を指す。断片は、文字通り、より大きい抗体の一部から作製することができ、あるいは、デノボ合成することができる。抗体断片としては、例えば、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）が挙げられる。ｓｃＦｖは、リンカーペプチド、例えば、約１０〜約５０アミノ酸と連結している免疫グロブリンの重鎖（ＶＨ）および軽鎖（ＶＬ）の可変領域の融合タンパク質である。リンカーは、ＶＨのＮ末端をＶＬのＣ末端に、またはその逆のいずれかで連結し得る。ｓｃＦｖという用語は、二価ｓｃＦｖ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディおよび他の抗体断片の組合せを含む。抗体は、パラトープと称される抗原結合部分を有する。ペプチドリガンドという用語は、パラトープの一部でないペプチドを指す。
抗体およびその断片による、ペプチド性結合リガンドによる、およびアプタマーによる赤血球の結合は、赤血球への共有結合なしで実施することができる。結合は、インビボで、エクスビボ赤血球結合イベントなしで実施することができる。この結合イベント、例として、赤血球との抗原の得られる会合は、赤血球のアポトーシスを引き起こさずに実施することができる。このプロセスは、赤血球の表面分子が、架橋剤および／または結合イベントにより互いに架橋されないように、ならびに共有結合により架橋されないように実施することができる。
抗原を赤血球に結合させるための二重特異的タンパク質構築物
赤血球に結合するタンパク質構築物を創成する場合、主な設計任意選択は、関心対象の抗原および赤血球結合部分の両方を含有する単一タンパク質または分子融合物を創成することである。
産生および使用においてより有効であり得る代替的設計は、関心対象の抗原に直接的または間接的に結合する追加のドメインに融合している赤血球に結合する１つのドメインを含有する二重特異的タンパク質または分子構築物である。関心対象の実際の抗原は、この分子融合物中に含まれず、関心対象の抗原に直接的または間接的に結合する部分のみが含まれる。したがって、関心対象の抗原を改変することもエンジニアリングすることも要求されない。そのような設計の一例は、関心対象の抗原を有する生体分子に特異的に結合する第２の抗体ドメインに組換え融合している赤血球に特異的な１つの抗体ドメインを有する二重特異的抗体または抗体断片である。複数の異なる二重特異的抗体構築物、例として、限定されるものではないが、タンデムｓｃＦｖ、ダイアボディ、およびタンデムｓｃＦｖ−ＩｇＧ分子を実現させることができる（６２）。関心対象の抗原に結合するドメイン、および赤血球に結合する別のドメインを保有することにより二重特異性についてエンジニアリングされた他の非タンパク質性足場、例として、ポリマーナノ粒子または他の多価ポリマーコンジュゲートも使用される。
二重特異的構築物の親和性部分は、ペプチドドメインおよび／または抗体断片ドメインの任意の組合せであり得る。赤血球または標的タンパク質抗原に結合するペプチドは、慣用のペプチドライブラリースクリーニング技術、例として、例えば、ビーズまたは多重化ペプチドライブラリースクリーニング、ファージディスプレイ、細菌ディスプレイ、および酵母ディスプレイを用いて得られる。エンジニアリングされたペプチドは、標準的な生化学アッセイ、例えば、ＥＬＩＳＡ、表面プラズモン共鳴、およびフローサイトメトリーベースの方法を使用してその結合標的に対する特異性および親和性について特徴決定される。赤血球または標的タンパク質抗原に結合する抗体または抗体断片は、慣用の技術、例えば、ハイブリドーマベース選択法、ファージディスプレイ、酵母ディスプレイ、細菌ディスプレイ、リボソームディスプレイ、または免疫化動物の直接抗体遺伝子もしくはプロテオミクスベースシーケンシング法を使用して得られる。エンジニアリングされた抗体または抗体断片は、標準的な生化学アッセイ、例えば、ＥＬＩＳＡ、表面プラズモン共鳴、およびフローサイトメトリーベースの方法を使用してその結合標的に対する特異性および親和性について特徴決定される。
それぞれの親和性部分（ペプチド、抗体、および／または抗体ドメイン）の発見および特徴決定後、それらを融合して標準的な組換えＤＮＡ技術、例えば、アセンブリーＰＣＲまたは直接遺伝子合成を使用して二重特異的分子構築物を形成し、次いで融合タンパク質を好適な宿主中で発現させる。二重特異的構築物は、２つの個々の部分を、二重特異的結合に好適と考えられる任意の組合せ（ペプチド−ペプチド、ペプチド−抗体断片など）で一緒に化学的にコンジュゲートすることによっても創成される。２つの抗体ドメインは、種々の技術水準のアーキテクチャーを使用して二重特異的抗体を創成するために使用される（１）。さらに、合成ポリマー足場（ＰＥＧ、ＰＰＧなど）がそれぞれの結合部分間の安定的結合を創成し、構築物のフレキシビリティーを改善するために使用される。分枝鎖ポリマーも、アビディティー効果により赤血球への、タンパク質抗原への、またはその両方への結合の親和性を増加させるために使用される。
二重特異的構築物の結合効力の特徴決定は、標準的なインビトロ生化学結合親和性アッセイ、例えば、ＥＬＩＳＡおよび表面プラズモン共鳴を使用して実施される。二重特異的構築物のインビボ性能は、二重特異的構築物または二重特異的構築物および抗原を動物モデル、例えば、マウスまたはラット中に注射し、次いで血液をサンプリングし、同様のインビトロアッセイを使用して赤血球および抗原結合の両方について試験することにより実施される。
実施形態は、標的に特異的に結合するドメインに結合している赤血球結合部分を含む薬学的に許容可能な組成物を含む。標的は、寛容誘発抗原をさらに含むタンパク質を有するタンパク質を含み得る。赤血球結合部分は、ペプチドリガンド、抗体、抗体断片、単鎖抗原結合ドメイン（ＳｃＦｖ）またはアプタマーを含み得る。ドメインは、抗体、抗体断片、および単鎖抗原結合ドメイン（ＳｃＦｖ）、ペプチドリガンド、およびアプタマーからなる群から選択することができる。一実施形態は、分子融合物、タンデムｓｃＦｖ、ダイアボディ、およびタンデムｓｃＦｖ−ＩｇＧ分子から選択される群のメンバーを含み、赤血球結合部分およびドメインが前記メンバーの一部である組成物である。単一融合タンパク質またはそれをコードする核酸は、赤血球結合ドメインおよび標的に結合する他のドメインを含み得る。
赤血球結合抗原を使用する抗原特異的抗体の治療的枯渇
抗原特異的抗体の誘導は治療に有害であり、タンパク質置換療法の間、自己免疫の発病において、および一般の生物製剤治療の間に危険な副作用を引き起こし得る（６３〜６８）。血液中の循環抗原特異的抗体を枯渇させ得る治療的介入は、そのような薬物特異的抗体の枯渇が、薬物−抗体複合体に起因する負の免疫学的副作用のリスクを縮小させつつ、薬物による将来的な治療を可能とするという点で正の臨床的影響を有する。血友病Ａの場合、患者の約３０％は、標準的な治療タンパク質薬物第ＶＩＩＩ因子に対する抗薬物抗体を誘導し、したがって、第ＶＩＩＩ因子によるさらなる治療を危険および無効とする。そのような患者中の第ＶＩＩＩ因子特異的循環抗体を枯渇させる治療的介入は、治療第ＶＩＩＩ因子レジメンを再度可能とし、患者を他のより高価で有効でない治療代替物に切り替える必要性を除く。全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ、ループス）、主として体内のネイティブ自己抗原に対する抗体の誘導により媒介される自己免疫疾患の場合、血液中で循環する自己抗原特異的抗体を枯渇させ得る治療的治療は、疾患発症の発病および進行を大幅に減少させる。
抗原特異的抗体を枯渇させるため、抗原は、投与後に循環赤血球に結合するようにエンジニアリングされる。関心対象の抗原に結合している赤血球結合部分の分子構築物が、赤血球結合抗原を形成するように創成される。あるいは、二重特異的構築物は、上記のとおり抗原の赤血球結合配合物を創成するように実現させることができる。この様式において、赤血球結合抗原の注射時、抗原に特異的なあらゆる循環抗体が、エンジニアリングされた抗原に結合し、したがって、インサイチューで循環赤血球と密接に会合する。天然循環細胞、例えば、赤血球への抗原特異的抗体の密接な物理的会合の間、危険な炎症免疫効果は、赤血球上に存在する制御性シグナルにより阻害される。赤血球は、それらの表面上でいくつかの制御性分子、とりわけ、例として、ＣＤ５５およびＣＤ５９を発現する（６７）。したがって、抗原特異的抗体は、赤血球に結合し、赤血球の天然クリアランスの帯域にトラフィックされたままであり、その間にそれらは同様にクリアランスされる。抗原装飾された赤血球は、抗原特異的抗体のための細胞保管庫および枯渇担体として機能する。
抗原特異的抗体の枯渇は、エンジニアリングされた抗原構築物の投与後に、試験動物から血液を周期的にサンプリングし、抗原特異的抗体力価測定技術、例えば、ＥＬＩＳＡを実施することによりインビボで特徴決定される。抗体分泌免疫細胞（Ｂ細胞、形質細胞など）の特異的欠失または不活化も、レシピエントマウスの血液、骨髄、脾臓、またはリンパ系からの免疫細胞の単離ならびに抗原特異的インビトロ再刺激Ｂ細胞ＥＬＩＳｐｏｔアッセイ、およびマルチパラメーターフローサイトメトリーの実施により特徴決定される。自己免疫関連試験において、自己免疫障害の関連マウスモデルが、自己抗原枯渇における赤血球結合抗原の効果を特徴決定するために使用される。
組成物の使用は、循環から抗体を除去し、および／またはそれらを赤血球細胞に結合させることを含む。一実施形態は、抗原に結合している赤血球結合部分を含む薬学的に許容可能な組成物である。抗原は、ネイティブ自己抗原、例えば、全身性エリテマトーデス抗原であり得る。あるいは、抗原は、患者に投与される治療タンパク質用の抗原、例えば、第ＶＩＩＩ因子抗原であり得る。
赤血球の特異的結合のためのアプタマー
赤血球に結合するペプチドリガンドに加え、赤血球表面成分についてのヌクレオチドアプタマーリガンドが教示される。したがって、他の赤血球結合部分についてのアプタマーを本明細書に記載のとおり作製および使用することができる。ＤＮＡおよびＲＮＡアプタマーは、非共有赤血球結合を提供するために使用することができる。アプタマーはヌクレオチドのみから構成されるため、それらはスクリーニング方法が十分に確立されており、それらが容易に化学合成され、それらの急速なインビボクリアランスに起因する限定された副作用毒性および／または免疫原性を有するという点で有望な生体分子標的化部分である（Ｋｅｅｆｅ，Ｐａｉ，ｅｔ ａｌ．，２０１０）。さらに、ヌクレオチド−標的タンパク質相互作用の非カノニカル性質に起因して、インビボでの標的結合時のいかなるプロダクティブなアゴニストシグナリングも見込まれず、したがって、低い免疫原性および毒性に寄与する。したがって、多数のアプタマーベース分子が、現在、多数の臨床適応症、例として、白血病、黄斑変性症、血栓症、および２型糖尿病についてのヒト臨床試験中である（Ｋｅｅｆｅ，Ｐａｉ，ｅｔ ａｌ．，２０１０）。アプタマーは、癌化学療法および蛍光または放射線腫瘍検出技術などの用途において薬物ペイロードを特異的組織にインビボで送達するための標的化剤としても使用されている（Ｒｏｃｋｅｙ，Ｈｕａｎｇ，ｅｔ ａｌ．，２０１１；Ｓａｖｌａ，Ｔａｒａｔｕｌａ，ｅｔ ａｌ．，２０１１）。
アプタマーは、特異的標的分子に結合するオリゴ核酸またはペプチドである。アプタマーは、通常、大きいランダム配列プールからそれらを選択することにより関心対象の標的に結合するように創成される。アプタマーは、ＤＮＡアプタマー、ＲＮＡアプタマー、またはペプチドアプタマーとして分類することができる。核酸アプタマーは、標的、例えば、小分子、タンパク質、核酸、細胞、組織または器官に特異的に結合するようにインビトロ選択または指数関数的増加によるリガンドの系統的展開（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｌｉｇａｎｄｓ ｂｙ Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）（ＳＥＬＥＸ）法（Ａｒｃｈｅｍｉｘ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ，ＵＳＡ）（Ｓａｍｐｓｏｎ，２００３）の反復ラウンドを介してエンジニアリングされた核酸種である。ペプチドアプタマーは、典型的には、タンパク質足場に両末端において結合している短い可変ペプチドドメインを有する。ペプチドアプタマーは、細胞内の他のタンパク質相互作用を干渉するように設計されるタンパク質である。それらは、タンパク質足場に両末端において結合している可変ペプチドループからなる。この二重の構造的拘束は、ペプチドアプタマーの結合親和性を抗体と匹敵するように大幅に増加させる。可変ループ長は、典型的には、約１０〜約２０アミノ酸から構成され、足場は、良好な溶解度を有する小型のタンパク質である。例えば、細菌タンパク質チオレドキシン−Ａは足場タンパク質であり、可変ループは、野生型タンパク質中の−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−ループであり、２つのシステイン側鎖がジスルフィド架橋を形成し得る還元活性部位内に挿入されている。
アプタマー作製するための一部の技術は、Ｌｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ Ｒｅｖ ２００９：１０９（５）：１９４８−１９９８、ならびにさらに米国特許第７，８９２，７３４号明細書、米国特許第７，８１１，８０９号明細書、米国特許出願公開第２０１０／０１２９８２０号明細書、米国特許出願公開第２００９／０１４９６５６号明細書、米国特許出願公開第２００６／０１２７９２９号明細書、および米国特許出願公開第２００７／０１１１２２２号明細書に詳述されている。実施例８は、本明細書に開示される実施形態について使用されるアプタマーを作製および使用するための材料および方法をさらに詳述している。
分子融合物
分子融合物は、第１のペプチド性赤血球結合リガンドと第２のペプチドとの間で形成することができる。融合物は、直接的または間接的に互いにコンジュゲートしているペプチドを含む。ペプチドは、直接的に互いに、またはリンカーを介して間接的にコンジュゲートすることができる。リンカーは、ペプチド、ポリマー、アプタマー、核酸、または粒子であり得る。粒子は、例えば、マイクロ粒子、ナノ粒子、ポリマーソーム、リポソーム、またはミセルであり得る。ポリマーは、例えば、天然、合成、直鎖または分枝鎖であり得る。第１のペプチドおよび第２のペプチドを含む融合タンパク質は、ペプチドの分子融合物の一例であり、融合タンパク質は、直接的に互いに結合しており、または一方もしくは両方の端部における介在リンカー配列および／もしくはさらなる配列を有するペプチドを含む。リンカーへのコンジュゲーションは、共有結合を介し得る。他の結合としては、イオン結合が挙げられる。方法は、分子融合物または分子融合物を含む組成物を調製することを含み、分子融合物は、赤血球に特異的に結合するペプチドおよび治療剤、寛容誘発抗原、または他の物質を含む。
分子融合物という用語、またはコンジュゲートされたという用語は、化学結合、例として、共有結合、静電イオン結合、電荷−電荷結合による直接的または間接的会合を指す。コンジュゲーションは、化学結合により支持される単位を創成する。直接的コンジュゲーションは、中間リンカーまたは化学基を有し、または有さない薬剤への化学結合を指す。間接的コンジュゲーションは、担体への化学結合を指す。担体は、概して、薬剤を封入し得、例えば、ポリマーソーム、リポソームもしくはミセルもしくは一部のタイプのナノ粒子であり、または薬剤をその表面上に有し得、例えば、金属ナノ粒子もしくはビーズ、もしくはその両方、例えば、薬剤の一部を内部中および外部上に含む粒子である。担体は、免疫寛容のための抗原も封入し得る。例えば、抗原を封入するポリマーソーム、リポソーム、または粒子を作製することができる。封入するという用語は、いかなる部分も露出させずに完全に、有効に被覆することを意味し、例えば、抗原または薬剤を封入するポリマーソームを作製することができる。治療剤の例は、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、抗体断片、小分子薬物、生物活性ペプチド、生物活性タンパク質、および生物活性生体分子である。
コンジュゲーションは、リンカーを使用してまたは使用せずにペプチドを別の分子に共有結合させることにより達成することができる。そのようなコンジュゲートの形成は、当業者の技能の範囲内であり、コンジュゲーションを達成するための種々の技術が公知であり、特定の技術の選択は、コンジュゲートすべき材料により定められる。イオン化可能な側鎖、すなわち、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、アルギニン、システイン、ヒスチジン、またはチロシンを含有し、ポリペプチド配列の活性部分中で含有されないポリペプチド（ＣまたはＮ末端）へのアミノ酸の付加は、強力な求核試薬としてそれらの非プロトン化状態で機能してポリマーに結合している反応性基、すなわち、ホモまたはヘテロ二官能性ＰＥＧとの種々のバイオコンジュゲーション反応に関与する（例えば、Ｌｕｔｏｌｆ ａｎｄ Ｈｕｂｂｅｌｌ，Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ２００３；４：７１３−２２，Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｌｏｎｄｏｎ．Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｌｔｄ；１９９６）。一部の実施形態において、可溶性ポリマーリンカーを使用し、患者に薬学的に許容可能な形態で投与することができる。または薬物をポリメロソーム（ｐｏｌｙｍｅｒｏｓｏｍｅ）もしくはベシクル中で封入し、またはペプチドリガンドに共有結合させることができる。
一実施形態は、非タンパク質治療剤および赤血球に特異的に結合するペプチドリガンド、抗体、抗体断片、またはアプタマーのコンジュゲーションである。赤血球結合ペプチド法の適用は、ポリペプチド治療剤に制限されず；むしろ、それを他の薬物配合物、例えば、小分子およびポリマー粒子に転換することができる。小分子および医薬におけるそれらの適用の長い歴史において、短い循環半減期および不十分なバイオアベイラビリティーは、それらのインビボでの効力を一貫して妨げている。ポリマーミセルおよびナノ粒子は、比較的新しい世代の薬物クラスを表すが、それにもかかわらず、それらの薬物動態学的挙動は、細網内皮系の作用を介する高いクリアランス速度を含む理由のために準最適のままである（Ｍｏｇｈｉｍｉ ａｎｄ Ｓｚｅｂｅｎｉ，２００３）。赤血球結合設計は、それらの他の薬物クラスに拡張させてそれらの循環半減期および臨床効力を増加させることができる。
コンジュゲートは、粒子を含み得る。赤血球結合ペプチドは、粒子に結合させることができる。抗原、薬剤、または他の物質は、粒子中または粒子上に存在し得る。ナノ粒子、ミセル、および他の粒子の例は、例えば、米国特許出願公開第２００８／００３１８９９号明細書、米国特許出願公開第２０１０／００５５１８９号明細書、米国特許出願公開第２０１０／０００３３３８号明細書において見出され、それらの出願は、全ての目的、例として、それらを本明細書に記載のリガンドと合わせるために参照により本明細書に組み込まれ；しかしながら、矛盾する場合、本明細書が優先する。
ナノ粒子は、約１０ｎｍ〜約２００ｎｍの平均直径を有する粒子の集合物として調製することができ、明示される限界間の全ての範囲および値、例えば、調製法により生じる多分散性に応じて約２０〜約２００、および約２０〜約４０、約７０、または約１００ｎｍを含む。種々のナノ粒子系、例えば、ポリ（エチレングリコール）およびポリ（乳酸）のコポリマーから形成されるもの、ポリ（エチレンオキシド）およびポリ（ベータ−アミノエステル）のコポリマーから形成されるもの、ならびにタンパク質、例えば、血清アルブミンから形成されるものを利用することができる。他のナノ粒子系は、当業者に公知である。Ｄｅｖａｌａｐａｌｌｙ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，０７−２５−０６；Ｌａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ，２５７：１６９−１８０（２００３）；およびＴｏｂｉｏ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１５（２）：２７０−２７５（１９９８）も参照。
軟骨組織結合リガンドを取り込む約２００ｎｍの平均直径を超えるより大きい粒子を調製することもでき、それらの粒子は、ミクロンスケールに接近し始め、光学分解能のほぼ限界内に収まるため、本明細書においてマイクロ粒子と称される。例えば、マイクロ粒子を作製するためのある技術は、米国特許第５，２２７，１６５号明細書、米国特許第６，０２２，５６４号明細書、米国特許第６，０９０，９２５号明細書、および米国特許第６，２２４，７９４号明細書に記載されている。
標的化能力を用いるためのナノ粒子の機能化は、例えば、バイオコンジュゲーション技術を使用する共有結合による標的化ポリペプチドと粒子との会合を要求し、特定の技術の選択は、ポリペプチドを結合させるべき粒子もしくはナノ粒子、または他の構築物により定められる。一般に、ペプチドを他の材料に結合させるための多くのバイオコンジュゲーション技術が周知であり、ほとんどの好適な技術を特定の材料について選択することができる。例えば、追加のアミノ酸をポリペプチド配列に結合させることができ、例えば、ポリペプチドをチオール反応性分子に結合させる場合、システインを結合させることができる。
複数の異なる生物活性分子をディスプレイし得るマルチマー分子を創成するため、市販の８アームＰＥＧデンドリマーを、容易なコンジュゲーション反応のための反応性基を含むように化学修飾した。８アームＰＥＧ−ピリジルジスルフィドは、小分子および／またはシステイン含有ペプチドもしくはタンパク質からのチオレートと容易に反応するピリジルジスルフィド基を含有し、結合生物活性部分と８アームＰＥＧ足場との間のジスルフィド結合をもたらした。８アームＰＥＧのマルチマーアーキテクチャーは、足場への異なるペプチドまたは分子のコンジュゲーションを可能とし、したがって、結合部分による複数の活性を有するヘテロ官能化生体分子を創成した。インビトロで（図４Ａ）およびインビボで（図４Ｂ）赤血球に結合し得るヘテロ官能化蛍光８アームＰＥＧ構築物を創成した。この結合は、ＥＲＹ１ペプチドに配列特異的であった。それというのも、非特異的ＭＩＳペプチドを保有するコンジュゲートが赤血球への結合をほとんど実証せず、または全く実証しなかったためである。インビボ結合は長期であった。それというのも、蛍光８アームＰＥＧ−ＥＲＹ１−ＡＬＥＸＡＦＬＵＯＲ６４７が、静脈内投与５時間後に循環赤血球上で検出され、２．２時間の細胞表面半減期を示したためである（図５）。自己免疫糖尿病マウスモデルにおける寛容の誘導を実証するため、ＥＲＹ１および糖尿病抗原クロモグラニン−Ａ（ＣｒＡ）の両方とコンジュゲートしている８アームＰＥＧを創成した。８アームＰＥＧ−ピリジルジスルフィド足場のモジュール性は、化学量論的に定義された量の分子を連続的に添加することにより異なるチオール含有分子を同時コンジュゲートすることを可能とした。
分子融合物は、ポリマーを含み得る。ポリマーは、分枝鎖または直鎖であり得る。分子融合物は、デンドリマーを含み得る。一般に、コンジュゲートが可溶性であり、患者中への導入後にバイオアベイラブルであるように可溶性親水性生体適合性ポリマーを使用することができる。可溶性ポリマーの例は、少なくとも１００、４００、または１００〜４００，０００（それらの明示される値間の全ての範囲および値が企図される）の分子量を有するポリビニルアルコール、ポリエチレンイミン、およびポリエチレングリコール（ポリエチレンオキシドを含む用語）である。これに関する溶解度は、１リットル当たり少なくとも１グラムの水または生理学的食塩水中の溶解度を指す。生分解性ポリマー、例えば、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ乳酸およびポリグリコール酸のコポリマー、ポリカプロラクトン、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルトエステル、ポリアセタール、ポリジヒドロピラン、ならびにポリシアノアクリレートのドメインを使用することもできる。
一部の実施形態において、ポリペプチド−ポリマー会合物、例えば、コンジュゲートは、薬学的に許容可能な条件下の、または医薬賦形剤を有する精製された組成物として調製され、体内に導入される。導入部位は、例えば、全身、または組織もしくは移植部位であり得る。
当業者は、当技術分野において公知の技術を使用して融合タンパク質を調製することができる。実施形態は、融合タンパク質を調製し、それらを単離し、それらを他の薬剤を有しまたは有さない薬学的に許容可能な形態で、例えば、ＴＧＦ−ベータのインターロイキンとの組合せで投与することを含む。実施形態は、細胞を形質移入してそれにより細胞をエンジニアリングして融合タンパク質をインビボで作製するためのベクター、およびその方法を含み、細胞をインビトロ、エクスビボ、またはインビボで形質移入し、細胞は、組織移植片のメンバーまたはそれとは区別される。以下の米国特許出願は、全ての目的、例として、融合タンパク質を作製する目的のために参照により本明細書に組み込まれ、矛盾する場合は本明細書が優先する：米国特許第５２２７２９３号明細書、米国特許第５３５８８５７号明細書、米国特許第５８８５８０８号明細書、米国特許第５９４８６３９号明細書、米国特許第５９９４１０４号明細書、米国特許第６５１２１０３号明細書、米国特許第６５６２３４７号明細書、米国特許第６９０５６８８号明細書、米国特許第７１７５９８８号明細書、米国特許第７７０４９４３号明細書、米国特許出願公開第２００２／０００４０３７号明細書、米国特許出願公開第２００５／００５３５７９号明細書、米国特許出願公開第２００５／０２０３０２２号明細書、米国特許出願公開第２００５／０２５０９３６号明細書、米国特許出願公開第２００９／０３２４５３８号明細書。
分子融合物の実施形態は、例えば、寛容誘発抗原および患者中の赤血球に特異的に結合し、それにより抗原を赤血球に結合させる赤血球結合部分を含む分子融合物であって、寛容誘発抗原を含む物質に対する免疫寛容を生成するために有効な量で投与される分子融合物を含む。実施形態は、例えば、ポリマー、分枝鎖ポリマー、および粒子からなる群から選択される担体に結合している赤血球に特異的に結合する赤血球結合部分を含む組成物であって、担体は、治療剤に結合している組成物を含む。粒子は、例えば、マイクロ粒子、ナノ粒子、ポリマーソーム、リポソーム、またはミセルであり得る。赤血球結合部分は、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１、およびそれらの保存的置換物からなる群から選択される配列の少なくとも５つの連続アミノ酸残基を含むペプチドを含み得、前記配列は、赤血球に特異的に結合する。赤血球結合部分は、抗体、抗体断片、アプタマー、ｓｃＦｖまたはペプチドリガンドを含み得る。分子融合物の実施形態は、赤血球結合部分および寛容誘発抗原、抗体、抗体断片、ＳｃＦｖ、小分子薬物、粒子、タンパク質、ペプチド、またはアプタマーを含む。
本発明の好ましい態様において、寛容誘発抗原およびＢａｎｄ３（ＣＤ２３３）、グリコホリンＢ（ＣＤ２３５ｂ）、グリコホリンＣ（ＣＤ２３５ｃ）およびグリコホリンＤ（ＣＤ２３５ｄ）から選択される赤血球結合部分を含む分子融合物が提供される。分子融合物は、特に、免疫寛容の生成において使用される。好ましい分子融合物は、タンパク質、タンパク質の一部、ヒトタンパク質またはその一部、非ヒトタンパク質またはその一部、グリカン、非ヒトグリコシル化を含むタンパク質のグリカン、ヒト自己免疫抗原、ヒト用タンパク質治療剤またはその一部、およびヒト食物の一部、遺伝性疾患により欠損しているタンパク質、非ヒトグリコシル化を有するタンパク質、非ヒトタンパク質、ヒト中で天然では見出されない合成タンパク質、ヒト食物抗原、ヒト移植抗原、ならびにヒト自己免疫抗原から選択される寛容誘発抗原；ならびにＢａｎｄ３（ＣＤ２３３）、グリコホリンＢ（ＣＤ２３５ｂ）、グリコホリンＣ（ＣＤ２３５ｃ）、グリコホリンＤ（ＣＤ２３５ｄ）から選択される赤血球結合部分を含む分子融合物である。
改善された薬物動態のための赤血球結合リガンド
多くの薬物が血液循環系に全身送達されるため、有効な薬物送達の課題に対する解決策は、長時間の血液中の薬物の維持にフォーカスすることが多い。したがって、長時間にわたり血液中で生物学的に利用可能なままである長期循環（長期半減期）治療剤の開発は、効力、安全性、および経済的実現性についてエンジニアリングされた新世代の薬物を表す。
本発明の実施形態は、赤血球結合ペプチドおよび治療剤の分子融合物を含む。赤血球に特異的に結合するペプチドと治療剤または他の物質との間の分子融合物は、薬剤／物質についての増加した循環時間（インビボ血中循環半減期）を提供する。増加は、例えば、血清半減期の１．５倍〜２０倍の増加であり得、当業者は、明示される範囲内の全ての範囲および値、例えば、約３倍または約６倍または約３倍〜約６倍が企図されることを直ちに認識する。
分子融合物は、例えば、ペプチドの組換え付加、またはペプチドを治療剤もしくは会合分子もしくは粒子上の反応性部位に化学コンジュゲーションにより付加することにより達成することができる。固相ペプチド合成を使用し、種々の末端反応性基を有する高収量の純粋ペプチドを合成することができるため、治療剤上へのペプチドの結合のための複数のコンジュゲーション方針が存在する。この官能化法は、タンパク質について使用される組換え法と異なるが、効果（循環半減期の増加を起こす赤血球結合）は同一と仮定される。
本発明の一実施形態は、治療剤の薬物動態パラメーターの改善のためのツールとしての赤血球に特異的に結合する短いペプチドリガンドによる治療剤の官能化を含む。この半減期延長法は、治療薬物設計における重要なパラメーター、すなわち、製造における簡易性、モジュール性、および延長効果を調整する能力を考慮する。標準的な組換えＤＮＡ技術を使用して、タンパク質は、新たなまたは変化した機能性を含有するようにアミノ酸レベルにおいて容易に変化される。一般に、機能のためのより短いペプチドドメインの使用の依存は、より長いポリペプチドドメインの使用よりも好ましい。その理由としては、製造の容易性、機能性治療タンパク質への正確なフォールディング、および元の治療剤自体の最小の生物物理学的変化が挙げられる。ポリペプチド、例えば、ＥＲＹ１、ヒト赤血球結合リガンド、または抗体もしくは抗体断片は、赤血球に特異的に結合するようにエンジニアリングし、治療剤にコンジュゲートし、例えば、薬剤の循環半減期により計測されるバイオアベイラビリティーを延長させることができる。
本明細書に報告される結果は、治療剤、例えば、インスリン、酢酸プラムリンチド、成長ホルモン、インスリン様成長因子−１、エリスロポエチン、１型アルファインターフェロン、インターフェロンα２ａ、インターフェロンα２ｂ、インターフェロンβ１ａ、インターフェロンβ１ｂ、インターフェロンγ１ｂ、β−グルコセレブロシダーゼ、アデノシンデアミナーゼ、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、インターロイキン１、インターロイキン２、インターロイキン１１、第ＶＩＩａ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、エキセナチド、Ｌ−アスパラギナーゼ、ラスブリカーゼ、腫瘍壊死因子受容体、およびエンフビルチドの薬物動態パラメーターを改善するための分子融合物を作製する機会を提供する。
受動的な半減期改善法を創成するための他の研究者らによる試みは、薬物の見かけの流体力学半径の増加にフォーカスする。腎臓の糸球体濾過装置は、血液成分が濾過される体内の主要部位である。濾過の主な決定因子は、血液中の分子の流体力学半径であり；より小さい分子（＜８０ｋＤａ）が、より大きい分子よりも高い程度で血液外に濾過される。研究者らは、主として高分子量の水溶性ポリマー、例えば、ポリエチレングリコシル（ＰＥＧ）への化学コンジュゲーションを介して、この一般化規則を使用してより大きい流体力学半径およびしたがってより長期の半減期を示すように薬物を修飾させてきた。この方法の成功は、診療所において現在提供されている多数のＰＥＧ化タンパク質および小分子治療剤において明らかである（Ｐａｓｕｔ ａｎｄ Ｖｅｒｏｎｅｓｅ，２００９；Ｆｉｓｈｂｕｒｎ，２００８）。多くの場合、特に、グラフトまたは融合物の流体力学半径が増加する場合、循環半減期の増加において有効であるが（Ｇａｏ，Ｌｉｕ，ｅｔ ａｌ．，２００９）、それらの方法は、製造および生物学的エフェクター機能の維持における課題を提供する。コンジュゲーション反応における不均一性は、ほとんどが部位非特異的化学反応の利用に起因して種々の生物学的活性を有する複雑な産物混合物を引き起こし得る。広範な生化学的特徴決定が、均一な治療産物を保持するために厳密な精製法に続くことが多い（Ｈｕａｎｇ，Ｇｏｕｇｈ，ｅｔ ａｌ．，２００９；Ｂａｉｌｏｎ，Ｐａｌｌｅｒｏｎｉ，ｅｔ ａｌ．，２００１；Ｄｈａｌｌｕｉｎ，Ｒｏｓｓ，ｅｔ ａｌ．，２００５）。さらに、タンパク質の反応性帯域への大きい部分、例えば、分枝鎖ＰＥＧの結合は、受容体親和性の減少を起こし得る（Ｆｉｓｈｂｕｒｎ，２００８）。
他の研究者らによる他の研究は、薬物の循環増加のためのアルブミンに結合させる治療タンパク質を提供している（Ｄｅｎｎｉｓ，２００２；Ｗａｌｋｅｒ，Ｄｕｎｌｅｖｙ，ｅｔ ａｌ．，２０１０）。腎臓濾過に関する上記と同一の一般的規則の考慮は、Ｄｅｎｎｉｓらは、血液中の別のタンパク質（例えば、血清アルブミン）に結合させるためのエンジニアリングによる治療剤の見かけのサイズの増加が、薬物クリアランス速度を減少させることを仮定した。この様式において、薬物は、血流中への投与後にのみその大きい分子サイズに達する。抗体断片への親和性成熟血清アルブミン結合ペプチドの付加は、マウスにおいてそれらの循環時間を２４倍増加させた（Ｄｅｎｎｉｓ，２００２）。この方法は有効であるが、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）によるアルブミン再循環の動態および機能性のためのシステイン拘束環式ペプチドの使用により複雑化される。Ｗａｌｋｅｒらは、２００２年のＤｅｎｎｉｓにより寄与された結果、すなわち、タンパク質への血清アルブミン親和性の付与がその半減期を増加させることを裏付けている。Ｗａｌｋｅｒらにより記載された方法は、タンパク質薬物への大きい抗体断片の組換え付加を含み、それは、構造的および製造的複雑性を引き起こし得る。ＤｅｎｎｉｓおよびＷａｌｋｅｒの方法は的確で有効であるが、機能性のための複雑な環式または大きいドメインの使用により複雑化される。Ｄｅｎｎｉｓらにより発見されたペプチドは、アルブミンについて高親和性を示すが、それらは、使用前に環式構造を正確に形成する物理的拘束を要求する。よりかさ高いアプローチの、より大きい抗体断片を融合するＷａｌｋｅｒの方法は、既に複雑なフォールディング構造または低発現収量を有するタンパク質に修正することができない。
単鎖抗体
本発明の一実施形態は、ｓｃＦｖと赤血球に特異的に結合するペプチドとの分子融合物である。ｓｃＦｖは、治療剤を使用することができ、赤血球結合ペプチドとのその組合せを使用してその循環半減期を延長させ、体内コンパートメントへの接近を提供することができる。組換え抗体および組換え抗体断片は、生物製剤産業における治療剤としての潜在性を有する（Ｓｈｅｒｉｄａｎ，２０１０）。
単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）抗体断片は、全長ＩｇＧの全抗原結合ドメインからなるが、ヒンジおよび定常断片領域を欠く（Ｍａｙｎａｒｄ ａｎｄ Ｇｅｏｒｇｉｏｕ，２０００）。ｓｃＦｖの組換え構築は、可変重鎖（ＶＨ）ドメインと可変軽鎖（ＶＬ）ドメインをグリシンおよびセリンのタンデムリピートからなる短いポリペプチドリンカー（例えば、（ＧＧＧＧＳ）４）（配列番号１８）により融合させることを含む。ｓｃＦｖの簡易性は治療用途に魅力的であるが、それらの主な欠点は、２６〜２８ｋＤａのそれらの比較的小さい分子量によりそれらが示す短い循環半減期である（Ｗｅｉｓｓｅｒ ａｎｄ Ｈａｌｌ，２００９）。
ｓｃＦｖ設計において一般に使用されるグリシン−セリンリンカーは天然では非機能性であり、むしろそれは正確なＶＨ−ＶＬフォールディングを確保するための物理的架橋として存在するため、本明細書において血液中の赤血球への結合の機能を示すリンカードメインを試験した。したがって、エンジニアリングされたｓｃＦｖは、多機能性および二重特異的であり得、ＶＨ−ＶＬドメインを介するネイティブ抗原に対する親和性、およびそのリンカードメインにおける赤血球に対する親和性を示す。赤血球への結合において、エンジニアリングされたｓｃＦｖは、この同一の機能性を有する別のモデルタンパク質について実証されるとおり、より長い循環半減期を示す。ｓｃＦｖ抗体断片は、本明細書に記載のリンカーを有し得、または当業者に公知の他のリンカーを提供することができる。代替的な実施形態は、ｓｃＦｖのリンカー領域中にエンジニアリングされたフリーシステイン基を提供し、このシステインチオールを使用して化学コンジュゲーションにより赤血球結合リガンドに結合させる。
エンジニアリングされたｓｃＦｖ抗体の設計は、リンカードメイン長、および赤血球結合ペプチドの間隔の重要性にフォーカスした。野生型バリアントが設計され、（ＧＧＧＧＳ）４リンカー（配列番号１８）との抗原結合について検証されたため、２０アミノ酸の最小リンカー長のリンカーを有する後続の突然変異体が設計された。リンカードメインはｓｃＦｖのその正確な四次構造への正確なフォールディングをモジュレートし得るため、２つのＥＲＹ１含有突然変異体が設計された。ＲＥＰ突然変異体は、親２０アミノ酸リンカー長を維持するために正確な数のＧｌｙおよびＳｅｒ残基によりフランキングされたリンカードメインの中央に配置されたＥＲＹ１ペプチドを含有する。疎水性性質のＥＲＹ１ペプチドが直線的に配列しないが、より短い集合したドメインにクラスター化すると考えられる場合、ＲＥＰのリンカー長はより短く、それにより正確なフォールディングを妨害し得る。そのような理由のため、ＩＮＳ突然変異体が、親リンカードメインの中央に付加されたＥＲＹ１ペプチドを含有し、リンカーを３２アミノ酸に長くするように設計された。フリーＮ末端を有するＥＲＹ１ペプチドが発見されたため、拘束されたポリペプチド立体構造中のその存在が赤血球結合に影響するか否かは不明であった。この潜在的な挙動に対処するため、ｓｃＦｖバリアントが合成ＥＲＹ１ペプチドとの化学コンジュゲーションにより創成され、それによりペプチドのＮ末端はフリーであり、Ｃ末端はｓｃＦｖにコンジュゲートしている。
この様式において、赤血球結合ペプチドの数、およびしたがってｓｃＦｖの赤血球結合能力を、コンジュゲーション反応の間に化学量論的に調整することができる。したがって、ＳｃＦｖは、本明細書に教示される赤血球結合ペプチドを含むようにエンジニアリングすることができる。実施形態は、１〜２０の範囲の数のリガンドを含むｓｃＦｖを含み；当業者は、明示される範囲内の全ての範囲および値、例えば、２〜６つが企図されることを直ちに認識する。
実施形態は、例えば、ｓｃＦｖに結合しているＯＶＡに対する寛容の創成について例示される寛容の創成を詳述する実施例６におけるような、寛容を誘導する分子融合物を作製するための寛容誘発抗原にコンジュゲートしているｓｃＦｖを含む。実施例６は、抗原の免疫認識エピトープに組換え融合しているｓｃＦｖタンパク質構築物を作製するための材料および方法も詳述する。ｓｃＦｖは、赤血球の認識に指向される。抗原は、本明細書に記載の抗原、例えば、寛容誘発抗原である。本明細書に報告される実施例は、ネズミモデルを使用し、構築物中の抗体ドメインとして使用されるネズミＴＥＲ１１９ｓｃＦｖを使用した結果を記載する。ＴＥＲ１１９は、マウス赤血球に結合する抗体である。ＴＥＲ１１９抗体ドメインは、他の抗体ドメイン、例えば、ヒトまたは他の動物中の赤血球に指向されるドメインにより置き換えることができる。例えば、１０Ｆ７抗体ドメインを使用し、ヒト赤血球に結合し得る抗体−抗原構築物を創成することができる。実施例６に報告されるとおり、ＯＶＡの免疫優性ＭＨＣ−Ｉエピトープ、クロモグラニン−Ａミモトープ１０４０−ｐ３１、およびプロインスリンを含む３つの異なる抗原との、Ｔｅｒ−１１９からのｓｃＦｖの追加の融合物を作製した。
実施例１３は、動物モデルにおいて試験するための実施形態およびヒトに反応性の実施形態を含む作製されたｓｃＦｖの他の実施形態を記載する。これらは、タンパク質レベルに関するもの：ＴＥＲ１１９−ＳＩＩＮＦＥＫＬ、ＴＥＲ１１９−ＣｈｒＡ、およびＴＥＲ１１９−プロインスリンを含む。これらは、遺伝子レベルに関するもの：ＴＥＲ１１９−ＳＩＩＮＦＥＫＬ、ＴＥＲ１１９−ＣｈｒＡ、ＴＥＲ１１９−プロインスリン、ＴＥＲ１１９−ウリカーゼ、ＴＥＲ１１９−ＩｎｓＢ９−２３、ＴＥＲ１１９−ＩＳＱＡＶＨＡＡＨＡＥＩＮＥＡＧＲ（配列番号８０）、ＴＥＲ１１９−Ｈ−２ｋｂ、ＴＥＲ１１９−Ｈ−２ｋｄ、１０Ｆ７−ＳＩＩＮＦＥＫＬ、１０Ｆ７−ＣｈｒＡ、１０Ｆ７−プロインスリン、および１０Ｆ７−ウリカーゼも含む。
特定部位、例えば、腫瘍血管系への赤血球の結合
薬物の半減期の増加に加え、赤血球に結合するエンジニアリングされた治療剤の能力は、赤血球を体内の特定部位に選択的に結合および局在させるために有用である。固形腫瘍の治療において、肝動脈化学塞栓術（ＴＡＣＥ）を使用して腫瘍への血液供給を制限することができ、それにより成長に要求される栄養素へのその接近を妨害する。ＴＡＣＥ治療は、腫瘍血液供給上流へのポリマー固体マイクロ粒子の外科的挿入を含む。マイクロ粒子が腫瘍血管床に到達すると、それらは血管網中で物理的に捕捉され、それにより腫瘍への血液供給の遮断が創成される（Ｖｏｇｌ，Ｎａｇｕｉｂ，ｅｔ ａｌ．，２００９）。
ＴＡＣＥの主題に従って、本明細書における実施形態は、赤血球結合ペプチドを含有するように腫瘍ホーミング治療剤をエンジニアリングすることにより腫瘍塞栓のための天然マイクロ粒子として血液中で循環する自己赤血球を使用することである。この様式において、治療剤は、腫瘍血管床に局在化し、血管への通過赤血球の結合を動員し、それにより、腫瘍塊への血流を制限および遮断する。そのような治療は、古典的なＴＡＣＥよりも低侵襲性であり：薬物は、簡易に静脈内注射され、塞栓粒子として血液中に既に存在する天然赤血球を使用する。腫瘍結合または腫瘍ホーミングという用語は、腫瘍血管系中または腫瘍細胞上の血液コンパートメントからの接近可能な成分に結合するペプチドを指す。
特異的腫瘍ホーミング治療剤の発見は、癌研究分野において公知である。腫瘍の生物活性標的化のパラダイムは、腫瘍環境中で特異的に発現されるタンパク質マーカーへの結合に依存する。これらとしては、限定されるものではないが：ＲＧＤ指向性インテグリン、アミノペプチダーゼ−Ａおよび−Ｎ、エンドシアリン、細胞表面ヌクレオリン、細胞表面アネキシン−１、細胞表面ｐ３２／ｇＣ１ｑ受容体、細胞表面プレクチン−１、フィブロネクチンＥＤＡおよびＥＤＢ、インターロイキン１１受容体α、テネイシン−Ｃ、エンドグリン／ＣＤ１０５、ＢＳＴ−２、ガレクチン−１、ＶＣＡＭ−１、フィブリン、および組織因子受容体が挙げられる。（Ｆｏｎｓａｔｔｉ，Ｎｉｃｏｌａｙ，ｅｔ ａｌ．，２０１０；Ｄｉｅｎｓｔ，Ｇｒｕｎｏｗ，ｅｔ ａｌ．，２００５；Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ，Ｂｈａｔｉａ，ｅｔ ａｌ．，２０１０；Ｔｈｉｊｓｓｅｎ，Ｐｏｓｔｅｌ，ｅｔ ａｌ．，２００６；Ｓｃｈｌｉｅｍａｎｎ，Ｒｏｅｓｌｉ，ｅｔ ａｌ．，２０１０；Ｂｒａｃｋ，Ｓｉｌａｃｃｉ，ｅｔ ａｌ．，２００６；Ｒｙｂａｋ，Ｒｏｅｓｌｉ，ｅｔ ａｌ．，２００７）。これらの分子のいずれかに対して標的化される治療剤は、赤血球結合ペプチドを腫瘍血管系に運搬して特異的閉塞を引き起こすためのベクターであり得る。
一実施形態は、癌性細胞または腫瘍血管系もしくは腫瘍血管系の成分、例えば、内皮下層中のタンパク質（腫瘍中の血液に部分的に曝露される）または腫瘍内皮細胞の表面上のタンパク質に特異的に結合する第２のリガンドとコンジュゲートしている赤血球に特異的に結合する第１のリガンドである。リガンドは、患者中に、例えば、血流中に導入される薬学的に許容可能な組成物の一部であり得る。リガンドは赤血球に結合し、腫瘍ホーミングリガンドは、腫瘍もしくは腫瘍血管系の部位もしくはその近傍の部位、または癌性細胞に結合する。赤血球は、標的化された部位に集まり、例えば、血管を塞栓することにより栄養素への標的部位の接近を遮断する。塞栓が機械的であり、赤血球の物理的サイズにより決定されることを考慮すると、塞栓は迅速である。
固形腫瘍は、その血管供給に強く依存し、その血管供給の成長を遮断するため、またはその血管供給の流れを遮断するための生体分子治療剤および材料治療剤が開発されてきた。一実施形態は、既知または未知の局在部位における原発腫瘍または転移において、固形腫瘍の血管系を急速に閉塞するために全身注射すべき生体分子配合物または生体分子−ナノ粒子配合物である。
腫瘍塞栓術は、多数の手法、例として、粒子および生体分子ベースの方法の使用においてアプローチされている。生体材料粒子、例として、ポリビニルアルコールから作製されるものは、直径が腫瘍微小血管よりも大きく、例えば、直径５０〜５００マイクロメートルであり、経カテーテル動脈塞栓術、またはＴＡＣＥにおける臨床使用のために開発されている（Ｍａｌｕｃｃｉｏ，Ｃｏｖｅｙ，ｅｔ ａｌ．，２００８）。並行のアプローチとしては、主として肝細胞癌のための治療に使用される肝動脈化学塞栓術（ＴＡＣＥ）において徐放のため粒子内に負荷される化学療法薬が挙げられる（Ｇａｄａｌｅｔａ ａｎｄ Ｒａｎｉｅｒｉ，２０１０）。両方の場合において、通常、レントゲン透視下でインターベンショナルラジオロジストにより動脈循環中に粒子が注射される場合、それらの粒子は、腫瘍血管系中に流れ、それを閉塞し得、流れを遮断する（Ｍａｌｕｃｃｉｏ，Ｃｏｖｅｙ ｅｔ ａｌ．，２００８）。これらの局所アプローチを用いる場合、カテーテルの留置により直接標的化される腫瘍のみが治療され、粒子は血管中で容易に標的化されないため、他の腫瘍、例えば、既知または未知の局在部位における転移は治療されない。最近になって、例えば、正常な血管系中に存在しない血栓症因子および腫瘍血管内皮のマーカーの両方を認識する二重特異的抗体を使用する生体分子アプローチが検討されている。抗体は、腫瘍血管系に特異的に結合した後、蓄積し、腫瘍血管内で血栓の形成を開始させて血管を遮断し；この効果は、抗体が腫瘍に標的化された場合のみ誘導された（Ｈｕａｎｇ，Ｍｏｌｅｍａ ｅｔ ａｌ．，１９９７）。これらの生体分子アプローチは、特異的腫瘍血管の特徴（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ）を同定することができる場合に、点滴静注から原発腫瘍および二次腫瘍の両方を標的化する利益を有し；ただし、このアプローチは、腫瘍に対して迅速な機械的閉塞を提供しないという欠点を有する。
本発明の実施形態は、標的化部分に結合している赤血球結合部分を含む組成物を患者に投与することを含む患者中の腫瘍を塞栓する方法であって、標的化部分は、腫瘍および腫瘍微小血管からなる群から選択される標的に指向される抗体、抗体断片またはペプチドであり、赤血球結合部分は、赤血球に特異的に結合するペプチド、抗体、抗体断片、またはアプタマーを含む方法を含む。ペプチドは、例えば、本明細書に記載の配列であり得る。
抗原特異的免疫学的寛容
治療剤の薬物動態学的挙動の改善に加え、赤血球親和性を、抗原特異的寛容を創成する方法において使用することができることが発見されている。ある実施例および予測的実施形態を、実施例に記載する。本明細書において実証される寛容誘発は、抗原に対する循環抗体の排除、または少なくとも１０倍、すなわち、少なくとも１００倍、少なくとも１０００倍、または１０，０００倍を超えるだけの抗原に対する循環抗体の低減をもたらし得る。寛容誘発は、疾患進行を予防し、治癒し、もしくは遅延させ、または移植組織の拒絶を低減させ、もしくは排除し、物質に対するアレルギー反応を低減させ、もしくは排除し得る。
実施例３および１０〜１２は、ヒト挙動を予測するマウス動物モデルにおいて寛容がいかに創成されたかを詳述する。実施例３は、赤血球表面に結合するペプチドリガンドに連結している試験抗原（オボアルブミン）を使用する寛容の創成を示した。実施例１０〜１２は、実施例３の結果を裏付け、ｓｃＦｖに結合しているオボアルブミンおよびペプチド性リガンドに結合しているアスパラギナーゼを使用する寛容の創成を示すさらなる実施例を提供する。既存の免疫拒絶を反転させる寛容の創成を示す実施例を実施例１２に提供する。したがって、実施形態は、アスパラギナーゼ、アスパラギナーゼの抗原性ミモトープの抗原性アスパラギナーゼ断片、および赤血球結合部分を含み、赤血球結合部分は、例えば、グリコホリンＡまたはＢａｎｄ３、グリコホリンＢ、グリコホリンＣもしくは赤血球標的群の他のメンバーからなる群から選択される標的に特異的に結合する、寛容誘発のための融合分子を含む。赤血球結合部分は、例えば、抗体、抗体断片、ｓｃＦｖ、ペプチドリガンドおよびアプタマーからなる群から、ならびに／またはＥＲＹ１９、ＥＲＹ５９、ＥＲＹ６４、ＥＲＹ１２３、ＥＲＹ１４１、ＥＲＹ１６２、ＥＲＹ１９’、ＥＲＹ５９’、ＥＲＹ６４’、ＥＲＹ１２３’、ＥＲＹ１４１’、およびＥＲＹ１６２’ならびにそれらの保存的置換物からなる群から選択することができる。これらの融合分子は、アスパラギナーゼの第１の投与前に、アスパラギナーゼによる治療過程の間に、および／またはアスパラギナーゼによる治療過程後に予防的に適用することができる。これらの融合分子は、アスパラギナーゼ薬物に対する免疫応答が観察される前に、またはそのような応答が観察された後に適用することができる。
実施例３において、マウス赤血球に結合するペプチド、ＥＲＹ１が発見された。ＥＲＹ１と試験抗原、オボアルブミン（ＯＶＡ）との分子融合物を作製した。この融合物はインビボで赤血球に特異的に結合し、他の分子、例として、血液または血管系中の分子には結合しなかった。長期の循環半減期が観察された。ＥＲＹ１−ＯＶＡの赤血球結合は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）によるＯＶＡ免疫優性ＭＨＣ Ｉエピトープ（ＳＩＩＮＦＥＫＬ）の有効なクロスプレゼンテーションおよび対応する反応性Ｔ細胞のクロスプライミングを起こすことが観察された。ＥＲＹ１−ＯＶＡは、ＯＶＡよりもかなり多い数のアネキシン−Ｖ＋増殖ＯＴ−Ｉ ＣＤ８＋Ｔ細胞を誘導し、最終的にクローン欠失を起こすアポトーシスの運命が示唆された。確立されたＯＴ−Ｉチャレンジ対寛容モデル（ｃｈａｌｌｅｎｇｅ−ｔｏ−ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｍｏｄｅｌ）（Ｌｉｕ，Ｉｙｏｄａ ｅｔ ａｌ．，２００２）（図２）を使用して、ＥＲＹ１−ＯＶＡが、極めて強力な細菌由来アジュバントを用いてもワクチン媒介性抗原チャレンジに対する後続の免疫応答を予防することが実証された。ＥＲＹ１−ＯＶＡの静脈内投与は、ＬＰＳによる抗原チャレンジ前に非修飾ＯＶＡが投与されたマウスと比較して、流入領域リンパ節（図２；図１２ｂにゲーティング）および脾臓中のＯＴ−Ｉ ＣＤ８＋Ｔ細胞集団の顕著な減少をもたらし（図２ｃ）、欠失性寛容が実証された。ＥＲＹ１−ＯＶＡが投与されたマウスにおいて示されたこの有効なクローン欠失は、ＯＴ−Ｉ ＣＤ８＋Ｔ細胞のクロスプライミングの向上という早期の観察結果を支持し、さらにクロスプライミングが共刺激分子のＡＰＣ提示の不存在下で起こり、欠失性寛容を起こしたことを示した。ＥＲＹ１−ＯＶＡの静脈内投与は、第１の抗原投与から１９日後、ＯＶＡにより処置されたマウスと比較して３９．８倍低いＯＶＡ特異的血清ＩｇＧレベルを引き起こした（図３）。抗原特異的免疫寛容の誘導をさらに検証するため、ＯＴ−Ｉチャレンジ対寛容モデルをＯＶＡ発現腫瘍グラフトモデルと組み合わせ（図２）、好ましい結果が得られた。本実施例に詳述される結果は、ＥＲＹ１−ＯＶＡによる赤血球結合が、抗原特異的免疫寛容を誘導することを実証する。これは、強力なアジュバントチャレンジ、および異種抗原を発現する移植細胞グラフトに応答して示された。さらに、寛容は、直接的なＣＤ４＋Ｔ細胞の調節に関係なく、循環赤血球上に存在する抗原との相互作用を介する反応性ＣＤ８＋Ｔ細胞の機能的不活化および欠失により達成された。ＥＲＹ１、マウス赤血球結合ペプチドを用いるこれらの詳細な実験は、いくつかは本明細書に教示されるヒト赤血球結合ペプチドを使用して、ヒトにおいて同様の結果を予測する。さらに、ペプチドリガンドを有することが有効であることが示されているため、他の赤血球結合リガンド、例えば、抗体、抗体断片、またはアプタマーとのコンジュゲートを使用して同様の結果が得られ得、それらの部分は、赤血球の表面分子、例えば、本明細書に記載の表面タンパク質または抗原の１つに結合する。
実施例１０は、寛容誘発抗原を、赤血球に結合するｓｃＦｖに融合し、患者への投与のための医薬としての融合分子を調製することにより、寛容誘発抗原に対する寛容の創成をさらに実証した。実施例１０は、ペプチドＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号３）であるＯＶＡのＭＨＣ−Ｉ免疫優性ドメインに対する寛容の誘導を実証する。この抗原を、マウス赤血球に結合することが既知であるｓｃＦｖのＴＥＲ−１１９に融合した。フローサイトメトリーにより計測された、蛍光ＣＦＳＥの希釈により測定されたＯＴ−Ｉ ＣＤ８＋Ｔ細胞増殖は、ＥＲＹ１−ＯＶＡまたはＯＶＡと比較してＴＥＲ１１９−ＳＩＩＮＦＥＫＬが投与されたマウスにおいて顕著に向上し（図８）、赤血球結合が、可溶性抗原ＳＩＩＮＦＥＫＬと比較して抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞クロスプライミングを増加させたことが実証された。さらに、これらのデータにより、赤血球に結合し、免疫エピトープをディスプレイするように設計された抗体断片が、免疫細胞により有効に処理されて抗原特異的Ｔ細胞をクロスプライミングすることが実証される。クロスプレゼンテーションおよびクロスプライミングに関するこれらの結果は、アポトーシス細胞からの抗原を貪食するＡＰＣによるＭＨＣ Ｉ上の寛容誘発抗原提示に関する他の研究と一致する（Ａｌｂｅｒｔ １９９８，Ｇｒｅｅｎ ２００９）。ＴＥＲ１１９−ＳＩＩＮＦＥＫＬおよびＥＲＹ１−ＯＶＡは、ＯＶＡよりもかなり多い数のアネキシン−Ｖ＋およびＰＤ−１＋増殖ＯＴ−Ｉ ＣＤ８＋Ｔ細胞を誘導し（図１３）、クローン欠失を起こす疲弊およびアポトーシス運命が示された。増殖ＣＤ８＋Ｔ細胞のこの表現型は、ＡＰＣによる抗原特異的Ｔ細胞受容体エンゲージメントの調節が炎症応答を誘導し得ない他の報告されたＯＴ−Ｉ養子移入モデルと一致する（Ｂｕｒｓｃｈ，Ｒｉｃｈ，ｅｔ ａｌ．，２００９）。
実施例１０を参照すると、ワクチン媒介性抗原チャレンジに対する後続の免疫応答を予防するＴＥＲ１１９−ＳＩＩＮＦＥＫＬおよびＥＲＹ１−ＯＶＡの能力が、極めて強力な細菌由来アジュバントによりチャレンジされた場合でも実証された。したがって、赤血球への結合のためのｓｃＦｖまたはペプチドリガンドとの融合分子は、寛容を生成するために有効であった。
実施例１１は、治療タンパク質および治療潜在性を有するタンパク質に対する抗原特異的免疫寛容を誘導することが可能であることを示す。多くの治療タンパク質は、免疫反応を誘導し、それらの臨床的使用を危険または無効とする。アスパラギナーゼは、急性リンパ芽球性白血病を治療するために使用される細菌由来の治療酵素であるが、その反復使用を妨げる危険な免疫応答も誘導する。マウスモデルを使用した。アスパラギナーゼおよび赤血球結合部分（ペプチドＥＲＹ１）の融合分子をマウスに投与し、臨床薬物アスパラギナーゼにより処置されたマウスと比較した。薬物アスパラギナーゼは抗体を産生したが、融合分子は産生せず；この試験は、抗体レベルを寛容の尺度として使用することができることを確立した。次いで、寛容は、融合分子をマウスに投与し、次いで臨床薬物アスパラギナーゼを反復投与し、薬物による反復投与による極めて侵襲的なチャレンジの後でも強力な抗体応答が存在しないことを観察することにより証明した。対照的に、薬物を受けたが融合分子を受けなかったマウスは、免疫反応性および危険な程度に過敏になった。
実施例１２は、免疫反転（ｉｍｍｕｎｏｒｅｖｅｒｓａｌ）が可能であることを示す。タンパク質に対して免疫反応性であったマウスを、そのタンパク質に寛容になるように処置した。実施例１１のアスパラギナーゼマウスモデルを使用した。薬物アスパラギナーゼに対して免疫反応性であったマウスを、融合分子（アスパラギナーゼおよび赤血球結合剤）により処置し、マウスは薬物アスパラギナーゼに寛容になった。
これに対し、従来の報告は、赤血球の表面への抗原の結合により免疫拒絶が創成され、それによりワクチンを作製することを教示し、他の報告は、ワクチンを創成するために赤血球内に封入された抗原を使用している。例えば、抗原が赤血球内に封入された場合、それによりワクチンが作製される（Ｍｕｒｒａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ ２４：６１２９−６１３９（２００６））。または、赤血球表面にコンジュゲートしている抗原は免疫原性であり、ワクチンとして提唱された（Ｃｈｉａｒａｎｔｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ １５（３）：２７６−２８０（１９９７））。これらの参考文献は、赤血球送達アプローチがアジュバントを有する通常のワクチンについて得られるのと同様の免疫応答を示すことを示す。肝臓中のクッパー細胞によるクリアランスを向上させるように赤血球表面を変化させるためのいくつかの手段も教示する、特許出願の国際公開第２０１１／０５１３４６号パンフレットにおけるように、他の研究者らは、寛容を誘導するために赤血球内への配置が必要であると報告している。この同一出願は、赤血球表面タンパク質、例えば、グリコホリンＡに結合する抗体も教示しているが、クッパー細胞によるそのクリアランスを向上させるために赤血球上に免疫複合体を作製することを目的としたものである。
本明細書に記載の実施形態は、免疫寛容を生成する方法であって、寛容誘発抗原および患者中の赤血球に特異的に結合し、それにより抗原を赤血球に結合させる赤血球結合部分を含む分子融合物を含む組成物を投与することを含み、分子融合物を、寛容誘発抗原を含む物質に対する免疫寛容を生成するために有効な量で投与する方法を提供する。赤血球、および患者は、赤血球の他の変化を引き起こす治療を受けなくてよく、赤血球架橋、化学的共有結合コンジュゲーション、コーティング、およびペプチドの特異的結合以外の他の変化を受けなくてよい。分子融合物は、抗原に直接共有結合している赤血球結合部分を含み得、またはそれからなっていてよい。分子融合物は、抗原に結合している粒子に結合している赤血球結合部分を含み得る。粒子は、マイクロ粒子、ナノ粒子、リポソーム、ポリマーソーム、またはミセルを含み得る。寛容誘発抗原は、治療タンパク質の一部、例えば、血液因子の産生欠如を罹患する患者に投与される血液因子を含み得る。実施形態は以下の例を含む：患者がヒトであり、寛容誘発抗原が、患者が遺伝的に欠損しているヒトタンパク質である例；患者がヒトであり、寛容誘発抗原が、非ヒトタンパク質の一部を含む例；患者がヒトであり、寛容誘発抗原が、ヒト中で天然では見出されないエンジニアリングされた治療タンパク質の一部を含む例；患者がヒトであり、寛容誘発抗原が、非ヒトグリコシル化を含むタンパク質の一部を含む例；寛容誘発抗原がヒト自己免疫疾患タンパク質の一部を含む例；寛容誘発抗原が同種移植における抗原である例；寛容誘発抗原が、ヒト食物からなる群から選択される物質の一部を含む例；ならびに／または赤血球結合部分がペプチド、抗体および抗体断片からなる群から選択される例。実施形態は、赤血球結合部分が配列番号１１、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１、およびそれらの保存的置換物からなる群から選択される配列の少なくとも５つの連続アミノ酸残基を含むペプチドを含み、前記配列は赤血球に特異的に結合する、寛容化の材料および方法を含む。
分子融合物は、抗原を赤血球の内側または外側上で配置するように選択することができる。特定の作用機序に拘束されるものではないが、以下の理論を提示する。ヒトにおいて、赤血球の約１％がアポトーシス性（エリプトーシス性）になり、毎日クリアランスされ、多数の細胞およびそれらのタンパク質が、赤血球自己抗原に対する寛容を維持するように処理される。ＥＲＹ１ペプチドまたはヒト赤血球結合ペプチド、赤血球結合単鎖抗体もしくは抗体、赤血球結合アプタマー、または別の赤血球結合剤の使用を介して赤血球に結合するようにエンジニアリングされた抗原も、同一の寛容誘発応答を誘発させ得る。Ｍｉｌｌｅｒらにより開発された現在の技術水準の方法（上記参照）が、再投与のためドナー脾細胞を回収し、反応させることを要求するという点で煩雑であることを考慮すると、本発明者らの非共有結合的赤血球結合法は、より簡易な代替法を提供する。ＥＲＹ１−赤血球、もしくはヒト赤血球結合ペプチド−赤血球、または他の親和性生体分子（例えば、単鎖抗体、抗体、またはアプタマー）の相互作用は、インビボで抗原コンジュゲートまたは融合物を導入した後に自然に生じるため、エンジニアリングされた抗原は注射により簡易に投与され、結合はインサイチューで生じる。
一部の場合において、寛容誘発抗原は、寛容が望まれる治療剤タンパク質に由来する。例は、野生型のタンパク質薬物、例えば、ヒト第ＶＩＩＩ因子または第ＩＸ因子（患者がこれらのタンパク質を欠損していたため、中枢性寛容を確立できなかったもの）；またはヒトにおいて使用される非ヒトタンパク質薬物である。他の例は、産生に起因して非ヒト形態でグリコシル化されるタンパク質薬物、またはエンジニアリングされたタンパク質薬物、例えば、不所望の免疫応答を誘起し得る非ネイティブ配列を有するものである。ヒト中で天然では見出されないエンジニアリングされた治療タンパク質である寛容誘発抗原の例としては、エンジニアリングされた突然変異、例えば、薬理学的特徴を改善させるための突然変異を有するヒトタンパク質が挙げられる。非ヒトグリコシル化を含む寛容誘発抗原の例としては、酵母または昆虫細胞中で産生されたタンパク質が挙げられる。
実施形態は、タンパク質をある頻度Ｘまたは用量Ｙにおいて投与し、さらに、そのタンパク質からの抗原をより低い頻度および／または用量、例えば、０．２Ｘ以下の頻度、または０．２Ｙ以下の用量において投与することを含み；当業者は、明示される範囲内の全ての範囲および値、例えば、０．０１または００５Ｘまたはその間のある範囲が企図されることを直ちに認識する。
実施形態は、タンパク質が欠損しているヒトに投与されるそのタンパク質からの寛容誘発抗原を選択することを含む。欠損は、タンパク質を受ける患者が十分なそのタンパク質を天然では産生しないことを意味する。さらに、タンパク質は、患者が遺伝的に欠損しているタンパク質であり得る。そのようなタンパク質としては、例えば、アンチトロンビン−ＩＩＩ、タンパク質Ｃ、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、成長ホルモン、ソマトトロピン、インスリン、酢酸プラムリンチド、メカセルミン（ＩＧＦ−１）、β−グルコセレブロシダーゼ、アルグルコシダーゼ−α、ラロニダーゼ（α−Ｌ−イズロニダーゼ）、イズルスファーゼ（イズロネート−２−スルファターゼ）、ガルスルファーゼ、アガルシダーゼ−β（α−ガラクトシダーゼ）、α−１プロテイナーゼインヒビターおよびアルブミンが挙げられる。したがって、実施形態は、赤血球結合部分および少なくとも１つの抗原、抗原性断片、またはそれらのタンパク質の１つ以上の抗原性ミモトープを含み、赤血球結合部分は、例えば、グリコホリンＡまたはＢａｎｄ３、グリコホリンＢ、グリコホリンＣもしくは赤血球標的群の他のメンバーからなる群から選択される標的に特異的に結合する、寛容誘発のための融合分子を含む。赤血球結合部分は、例えば、抗体、抗体断片、ｓｃＦｖ、ペプチドリガンドおよびアプタマーからなる群から選択することができる。
実施形態は、治療抗体および抗体様分子、例として、抗体断片ならびに抗体および抗体断片との融合タンパク質からの寛容誘発抗原を選択することを含む。これらとしては、非ヒト（例えば、マウス）抗体、キメラ抗体、およびヒト化抗体が挙げられる。ヒト化抗体に対する免疫応答もヒトにおいて観察されている（Ｇｅｔｔｓ，２０１０）。したがって、実施形態は、赤血球結合部分および少なくとも１つの抗原、抗原性断片、またはそれらのタンパク質の１つ以上の抗原性ミモトープを含み、赤血球結合部分は、例えば、グリコホリンＡまたはＢａｎｄ３、グリコホリンＢ、グリコホリンＣもしくは赤血球標的群の他のメンバーからなる群から選択される標的に特異的に結合する、寛容誘発のための融合分子を含む。赤血球結合部分は、例えば、抗体、抗体断片、ｓｃＦｖ、ペプチドリガンドおよびアプタマーからなる群から選択することができる。
実施形態は、非ヒトであるタンパク質からの寛容誘発抗原を選択することを含む。そのようなタンパク質の例としては、アデノシンデアミナーゼ、膵リパーゼ、膵アミラーゼ、ラクターゼ、Ａ型ボツリヌス毒素、Ｂ型ボツリヌス毒素、コラゲナーゼ、ヒアルロニダーゼ、パパイン、Ｌ−アスパラギナーゼ、ラスブリカーゼ、レピルジン、ストレプトキナーゼ、アニストレプラーゼ（アニソイル化プラスミノーゲンストレプトキナーゼ活性化因子複合体）、抗胸腺細胞グロブリン、マムシ多価免疫Ｆａｂ、ジゴキシン免疫血清Ｆａｂ、Ｌ−アルギナーゼ、およびＬ−メチオナーゼが挙げられる。
実施形態は、ヒト同種移植抗原からの寛容誘発抗原を選択することを含む。これらの抗原の例としては、種々のＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩハプロタイプタンパク質のサブユニット、ならびにマイナー血液型抗原に関する単一アミノ酸多型、例として、ＲｈＣＥ、Ｋｅｌｌ、Ｋｉｄｄ、ＤｕｆｆｙおよびＳｓが挙げられる。
一部の場合、寛容誘発抗原は、患者が自己免疫応答を発達させており、または自己免疫応答を発達させ得る自己抗原である。例は、プロインスリン（糖尿病）、コラーゲン（関節リウマチ）、ミエリン塩基性タンパク質（多発性硬化症）である。
例えば、１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）は、膵島タンパク質を認識するＴ細胞が免疫調節から離脱し、膵臓組織を破壊するように免疫系をシグナリングする自己免疫疾患である。そのような糖尿病誘発Ｔ細胞の標的である多数のタンパク質抗原、例として、とりわけ、インスリン、ＧＡＤ６５、クロモグラニン−Ａが発見されている。Ｔ１Ｄの治療または予防において、規定の糖尿病誘発抗原に対する抗原特異的免疫寛容を誘導して糖尿病誘発Ｔ細胞クローンを機能的に不活化または欠失させることは有用である。実施例１４は、他の実施例において予測因子として確立されたＴ細胞データに基づき、いかに寛容誘発抗原としてのクロモグラニン−Ａ（ＣｈｒＡ）ミモトープを提示する融合分子が良好にＣｈｒＡに対する寛容誘発を創成したかを詳述する。したがって、実施形態は、クロモグラニン−Ａ、抗原もしくはその抗原部分、またはそのミモトープを赤血球結合部分とともに含み、赤血球結合部分は、例えば、グリコホリンＡまたはＢａｎｄ３、グリコホリンＢ、グリコホリンＣもしくは赤血球標的群の他のメンバーからなる群から選択される標的に特異的に結合する、寛容誘発のための融合分子を含む。赤血球結合部分は、例えば、抗体、抗体断片、ｓｃＦｖ、ペプチドリガンドおよびアプタマーからなる群から、ならびに／またはＥＲＹ１９、ＥＲＹ５９、ＥＲＹ６４、ＥＲＹ１２３、ＥＲＹ１４１、ＥＲＹ１６２、ＥＲＹ１９’、ＥＲＹ５９’、ＥＲＹ６４’、ＥＲＹ１２３’、ＥＲＹ１４１’、ＥＲＹ１６２’およびそれらの保存的置換物からなる群から選択することができる。
したがって、寛容および／または自己免疫疾患の発症もしくは進行の遅延は、ヒト自己免疫タンパク質である種々の多くのタンパク質について達成することができ、その用語は、疾患を引き起こす１つまたは複数のタンパク質が公知であり、定型試験により確定することができる種々の自己免疫疾患を指す。
実施形態は、自己免疫タンパク質を同定するために患者を試験すること、および分子融合物において使用される抗原を創成すること、およびタンパク質に対する免疫寛容を創成することを含む。実施形態は、以下のタンパク質の１つ以上からの抗原、または以下のタンパク質の１つ以上からの抗原を選択することを含む。１型糖尿病において、以下のいくつかの主要な抗原が同定されている：インスリン、プロインスリン、プレプロインスリン、グルタミン酸デカルボキシラーゼ−６５（ＧＡＤ−６５）、ＧＡＤ−６７、インスリノーマ関連タンパク質２（ＩＡ−２）、およびインスリノーマ関連タンパク質２β（ＩＡ−２β）；他の抗原として、ＩＣＡ６９、ＩＣＡ１２（ＳＯＸ−１３）、カルボキシペプチダーゼＨ、Ｉｍｏｇｅｎ３８、ＧＬＩＭＡ３８、クロモグラニン−Ａ、ＨＳＰ−６０、カルボキシペプチダーゼＥ、ペリフェリン、グルコーストランスポーター２、肝細胞癌−腸−膵臓／膵臓関連タンパク質、Ｓ１００β、グリア線維性酸性タンパク質、再生遺伝子ＩＩ（ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ ｇｅｎｅ ＩＩ）、膵臓十二指腸ホメオボックス１、筋強直性ジストロフィーキナーゼ、膵島特異的グルコース−６−ホスファターゼ触媒サブユニット関連タンパク質、およびＳＳＴ Ｇタンパク質共役型受容体１〜５が挙げられる。甲状腺の自己免疫疾患、例として、橋本甲状腺炎およびグレーブス病において、主要な抗原としては、サイログロブリン（ＴＧ）、甲状腺ペルオキシダーゼ（ＴＰＯ）およびサイロトロピン受容体（ＴＳＨＲ）が挙げられ；他の抗原としては、ナトリウムヨウ素共輸送体（ＮＩＳ）およびメガリンが挙げられる。甲状腺関連眼疾患および皮膚症において、甲状腺自己抗原、例として、ＴＳＨＲに加え、抗原は、インスリン様成長因子１受容体である。副甲状腺機能低下症において、主要な抗原は、カルシウム感受性受容体である。アジソン病において、主要な抗原としては、２１−ヒドロキシラーゼ、１７α−ヒドロキシラーゼ、およびＰ４５０側鎖開裂酵素（Ｐ４５０ｓｃｃ）が挙げられ；他の抗原としては、ＡＣＴＨ受容体、Ｐ４５０ｃ２１およびＰ４５０ｃ１７が挙げられる。早発閉経において、主要な抗原としては、ＦＳＨ受容体およびα−エノラーゼが挙げられる。自己免疫性下垂体炎、または下垂体自己免疫疾患において、主要な抗原としては、下垂体特異的タンパク質因子（ＰＧＳＦ）１ａおよび２が挙げられ；別の抗原は、２型ヨードチロニンデヨージナーゼである。多発性硬化症において、主要な抗原としては、ミエリン塩基性タンパク質、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質およびプロテオリピドタンパク質が挙げられる。関節リウマチにおいて、主要な抗原はコラーゲンＩＩである。免疫胃炎において、主要な抗原は、Ｈ＋，Ｋ＋−ＡＴＰアーゼである。悪性貧血（ｐｅｒｎｉｃｉｏｕｓ ａｎｇｅｍｉｓ）において、主要な抗原は、内因子である。セリアック病において、主要な抗原は、組織トランスグルタミナーゼおよびグリアジンである。白斑において、主要な抗原は、チロシナーゼ、ならびにチロシナーゼ関連タンパク質１および２である。重症筋無力症において、主要な抗原は、アセチルコリン受容体である。尋常性天疱瘡および異型において、主要な抗原は、デスモグレイン３、１および４であり；他の抗原としては、ペムファキシン（ｐｅｍｐｈａｘｉｎ）、デスモコリン、プラコグロビン、ペルプラキン（ｐｅｒｐｌａｋｉｎ）、デスモプラキン、およびアセチルコリン受容体が挙げられる。水疱性類天疱瘡において、主要な抗原としては、ＢＰ１８０およびＢＰ２３０が挙げられ；他の抗原として、プレクチンおよびラミニン５が挙げられる。デューリング疱疹状皮膚炎において、主要な抗原としては、筋内膜および組織トランスグルタミナーゼが挙げられる。後天性表皮水疱症において、主要な抗原は、コラーゲンＶＩＩである。全身性硬化症において、主要な抗原としては、マトリックスメタロプロテイナーゼ１および３、コラーゲン特異的分子シャペロン熱ショックタンパク質４７、フィブリリン−１、ならびにＰＤＧＦ受容体が挙げられ；他の抗原としては、Ｓｃｌ−７０、Ｕ１ＲＮＰ、Ｔｈ／Ｔｏ、Ｋｕ、Ｊｏ１、ＮＡＧ−２、セントロメアタンパク質、トポイソメラーゼＩ、核小体タンパク質、ＲＮＡポリメラーゼＩ、ＩＩおよびＩＩＩ、ＰＭ−Ｓｌｃ、フィブリラリン、ならびにＢ２３が挙げられる。混合性結合組織病において、主要な抗原は、Ｕ１ｓｎＲＮＰである。シェーグレン症候群において、主要な抗原は、核抗原ＳＳ−ＡおよびＳＳ−Ｂであり；他の抗原としては、フォドリン、ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼおよびトポイソメラーゼが挙げられる。全身性エリテマトーデスにおいて、主要な抗原としては、核タンパク質、例として、ＳＳ−Ａ、ハイモビリティ・グループ・ボックス１（ＨＭＧＢ１）、ヌクレオソーム、ヒストンタンパク質および二本鎖ＤＮＡが挙げられる。グッドパスチャー症候群において、主要な抗原としては、糸球体基底膜タンパク質、例として、コラーゲンＩＶが挙げられる。リウマチ性心疾患において、主要な抗原は心臓ミオシンである。多腺性自己免疫症候群１型において明らかにされた他の自己抗原としては、芳香族Ｌ−アミノ酸デカルボキシラーゼ、ヒスチジンデカルボキシラーゼ、システインスルフィン酸デカルボキシラーゼ、トリプトファンヒドロキシラーゼ、チロシンヒドロキシラーゼ、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ、肝臓Ｐ４５０チトクロームＰ４５０１Ａ２および２Ａ６、ＳＯＸ−９、ＳＯＸ−１０、カルシウム感知受容体タンパク質、ならびに１型インターフェロンのインターフェロンアルファ、ベータおよびオメガが挙げられる。実施例１５は、そのようなタンパク質に対する寛容誘発のための詳細な指針を提供し、一例としてインスリンを用いるプロセスを具体的に記載する。
一部の場合、寛容誘発抗原は、患者が不所望の免疫応答を発達させた外来抗原である。例は食物抗原である。実施形態は、外来抗原を同定するために患者を試験すること、および抗原を含む分子融合物を創成すること、および抗原または食品に対する免疫寛容を発達させるように患者を治療することを含む。そのような食品および／または抗原の例を提供する。例は、ピーナッツからのもの：コンアラキン（Ａｒａ ｈ１）、アレルゲンＩＩ（Ａｒａ ｈ２）、ピーナッツアグルチニン、コングルチン（Ａｒａ ｈ６）；リンゴからのもの：３１ｋｄａの主要アレルゲン／耐病性タンパク質ホモログ（Ｍａｌ ｄ２）、脂質転移タンパク質前駆物質（Ｍａｌ ｄ３）、主要アレルゲンＭａｌ ｄ１．０３Ｄ（Ｍａｌ ｄ１）；乳からのもの：α−ラクトアルブミン（ＡＬＡ）、ラクトトランスフェリン；キウイからのもの：アクチニジン（Ａｃｔ ｃ１、Ａｃｔ ｄ１）、フィトシスタチン、タウマチン様タンパク質（Ａｃｔ ｄ２）、キウェリン（ｋｉｗｅｌｌｉｎ）（Ａｃｔ ｄ５）；カラシナからのもの：２Ｓアルブミン（Ｓｉｎ ａ１）、１１Ｓグロブリン（Ｓｉｎ ａ２）、脂質転移タンパク質（Ｓｉｎ ａ３）、プロフィリン（Ｓｉｎ ａ４）；セロリからのもの：プロフィリン（Ａｐｉ ｇ４）、高分子量糖タンパク質（Ａｐｉ ｇ５）；エビからのもの：Ｐｅｎ ａ１アレルゲン（Ｐｅｎ ａ１）、アレルゲンＰｅｎ ｍ２（Ｐｅｎ ｍ２）、速筋トロポミオシンアイソフォーム；コムギおよび／または他の穀類からのもの：高分子量グルテニン、低分子量グルテニン、アルファ−およびガンマ−グリアジン、ホルデイン、セカリン、アベニン；イチゴからのもの：主要イチゴアレルギーＦｒａ ａ１−Ｅ（Ｆｒａ ａ１）、バナナからのもの：プロフィリン（Ｍｕｓ ｘｐ１）である。
ヒトおよび動物医薬において使用される多くのタンパク質薬物は免疫応答を誘導し、それは患者についてのリスクを創成し、薬剤の効力を限定する。これは、エンジニアリングされたヒトタンパク質、ヒトタンパク質産生の先天性欠損患者に使用されるヒトタンパク質、および非ヒトタンパク質について生じ得る。初回投与前にこれらのタンパク質薬物に対してレシピエントを寛容化することは有利であり、初回投与後、および免疫応答の発達後に、これらのタンパク質薬物に対してレシピエントを寛容化することは有利である。自己免疫を有する患者において、自己免疫が発達する自己抗原が公知である。これらの場合、自己免疫の発達前にリスクのある対象を寛容化することが有利であり、初期自己免疫の生体分子指標の発達時またはその後に、対象を寛容化することは有利である。例えば、１型糖尿病において、膵臓中のベータ細胞の広範な破壊前、およびグルコースホメオスタシスに関与する臨床疾患の発症前に自己免疫の免疫学的指標が存在する。臨床疾患の発症前、これらの免疫学的指標の検出後に対象を寛容化することは有利である。
Ｍｉｌｌｅｒらをリーダーとする最近の研究は、抗原をエクスビボで同種脾細胞に共有結合的にコンジュゲートし、マウス中に静脈内投与した場合、抗原特異的免疫寛容が創成されることを示している（Ｇｏｄｓｅｌ，Ｗａｎｇ，ｅｔ ａｌ．，２００１；Ｌｕｏ，Ｐｏｔｈｏｖｅｎ，ｅｔ ａｌ．，２００８）。このプロセスは、ドナー脾臓の抗原提示細胞を回収することおよびアミン−カルボン酸架橋反応スキームにおいてそれらを化学的に反応させることを含む。この技術は、多発性硬化症（Ｇｏｄｓｅｌ，Ｗａｎｇ，ｅｔ ａｌ．，２００１）、初発１型糖尿病（Ｆｉｆｅ，Ｇｕｌｅｒｉａ，ｅｔ ａｌ．，２００６）、および同種膵島移植（Ｌｕｏ，Ｐｏｔｈｏｖｅｎ，ｅｔ ａｌ．，２００８）のマウスモデルに抗原特異的寛容を誘導するのに有効であることが証明されている。寛容誘発応答を担う正確な機序は不明であるが、主要な要件は、アポトーシスの抗原結合細胞上の共刺激分子の発現なしの抗原提示を含むことが提唱されている（Ｍｉｌｌｅｒ，Ｔｕｒｌｅｙ，ｅｔ ａｌ．，２００７）。国際公開第２０１１／０５１３４６号パンフレットにおけるように赤血球ゴースト内に抗原を封入し、赤血球をエクスビボで処理し、それを再注射することも企図されてきた。
投与
本明細書に記載の本発明の多くの実施形態は、ヒトまたは他の動物患者に投与することができる組成物を記載する。本発明の実施形態は、例えば、赤血球または腫瘍または腫瘍血管系上の抗原、およびそれらの組合せを認識する分子融合物、融合タンパク質、ペプチドリガンド、抗体、ｓｃＦｖを含む。これらの組成物は、好適な薬学的に許容可能な担体または賦形剤とともに薬学的に許容可能な組成物として調製することができる。
赤血球に結合する組成物は、特異的に結合し得る。この特異性は、組成物と赤血球とのインビボ結合、および代替のエクスビボプロセスを提供する。したがって、組成物は、患者の血管系中に直接注射することができる。代替例は、後続の赤血球接触および取り込みのための、組織、例えば、筋肉、皮膚または皮下中への注射である。本発明の実施形態は、寛容化抗原を赤血球結合部分との会合物で患者に投与してそれにより抗原を赤血球にインビボで結合させることを含む、患者中の寛容誘発を誘導する方法であり；したがって、インビボ結合は、赤血球のエクスビボ処理なしで実施することができる。赤血球をプロセスの結果としてアポトーシスにさせないこのプロセスを実施することができる。このプロセスは、赤血球を、架橋剤；赤血球の表面分子を架橋する架橋剤；少なくとも２つの官能基を含む架橋剤；赤血球との共有結合を形成する架橋剤；赤血球との共有結合を形成する官能基；ならびに赤血球に共有結合する抗原および／または抗原性物質の１つ以上に曝露させることを有さない（含まない）ように実施することができる。このプロセスは、赤血球および／または抗原が１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド）（ＥＤＣ；さらにはＥＤＡＣまたはＥＤＣＩ）を有さないように実施することができ、さらにはカルボジイミドとのいかなる反応も示し得ない。このプロセスは、自己赤血球を用いて実施することができ、同種赤血球を有さなくてよい。
本明細書に記載の実施形態を送達するため、薬学的に許容可能な担体または賦形剤を使用することができる。賦形剤は、治療剤に希釈剤またはビヒクルとして使用される不活性物質を指す。薬学的に許容可能な担体は、一般に、治療のためにまたは製品として化合物が有用となるように化合物とともに使用される。一般に、任意の物質について、薬学的に許容可能な担体は、動物に送達するためにその物質と組み合わせる材料である。慣用の医薬担体、水性、粉末または油性基剤、増粘剤などが必要であり、または望ましいことがある。一部の場合、担体は、例えば、液体送達のために不溶性化合物を可溶化するために送達に不可欠であり、活性を保存するために物質のｐＨを制御するための緩衝剤；または貯蔵容器中の物質の損失を防ぐための希釈剤である。しかしながら、他の場合、担体は便宜上、例えば、より便利な投与のための液体である。当業者に公知の方法により、本明細書に記載の化合物の薬学的に許容可能な塩を合成することができる。したがって、薬学的に許容可能な組成物は、汚染物質を有さないように高度に精製され、生体適合性であり、非毒性であり、患者への投与に適している。水が担体の場合、水は高度に精製され、汚染物質、例えば、エンドトキシンを有さないように処理される。
本明細書に記載の化合物は、典型的には、意図される投与形態に関して好適に選択され、慣用の医薬実務に沿った好適な医薬希釈剤、賦形剤、増量剤または担体（本明細書において薬学的に許容可能な担体、または担体と称される）との混合物として投与することができる。したがって、送達可能な化合物は、経口投与、直腸投与、局所投与、静脈内注射、関節内注射、または非経口投与に好適な形態で作製することができる。担体は、固体または液体を含み、担体のタイプは、使用される投与のタイプに基づき選択される。例えば、丸剤について、担体として好適な結合剤、滑沢剤、崩壊剤、着色剤、着香剤、流動化剤、および溶解剤を含めることができる。例えば、活性成分は、経口非毒性の薬学的に許容可能な不活性担体、例えば、ラクトース、ゼラチン、寒天、デンプン、スクロース、グルコース、メチルセルロース、ステアリン酸マグネシウム、リン酸二カルシウム、硫酸カルシウム、マンニトール、ソルビトールなどと組み合わせることができる。化合物は、固体剤形、例えば、カプセル剤、錠剤および散剤で、または液体剤形、例えば、エリキシル剤、シロップ剤、および懸濁剤で経口投与することができる。活性化合物は、滅菌液体剤形で非経口投与することもできる。生理学的ｐＨまたはオスモル濃度を達成するための緩衝液を使用することもできる。
実施例１
マウス赤血球に結合する分子標的の特徴決定
結果：ＥＲＹ１ペプチドについての分子標的を探索するため、ビオチン化された可溶性ペプチドを使用する親和性プルダウン技術を用い；この方法により、赤血球膜上のＥＲＹ１リガンドとしてグリコホリン−Ａ（ＧＹＰＡ）が明らかになった。全赤血球を、ビオチンにより官能化されたＥＲＹ１ペプチドおよび光活性化架橋剤とインキュベートした場合、ストレプトアビジンウエスタンブロットにより検出して単一の２８ｋＤａのタンパク質がペプチド−ビオチン複合体とコンジュゲートした。反応溶解物を十分に洗浄し、ストレプトアビジン磁気ビーズを使用して精製して赤血球溶解物からの非標識タンパク質が残留しないことを確保した。予測されるとおり、ミスマッチペプチドは、どの赤血球タンパク質ともコンジュゲートし得なかった。ミスマッチペプチドＰＬＬＴＶＧＭＤＬＷＰＷ（配列番号２）は、ＥＲＹ１と同一のアミノ酸残基を含有し、その疎水性分布と一致するように設計した。相互作用タンパク質の見かけのサイズの証拠により、考えられるリガンドとしていくつかのより小さい１回膜貫通タンパク質、すなわち、グリコホリンが示唆された。架橋反応から精製された同一の試料の抗ＧＹＰＡウエスタンブロッティングにより、候補ビオチン化タンパク質がＧＹＰＡであることが確認された。
ＥＲＹ１ファージとＧＹＰＡとの共局在を、高解像度の共焦点顕微鏡により分析した。ＧＹＰＡは天然で発現され、いくつかの膜および細胞骨格タンパク質からなる複合体の一部として提示される（Ｍｏｈａｎｄａｓ ａｎｄ Ｇａｌｌａｇｈｅｒ，２００８）。これは、ＧＹＰＡ染色において視覚的に明らかであり、それにより細胞の赤道周辺において不均一標識が認められた。ＥＲＹ１ファージによる標識は、極端に類似する染色分布をもたらした。共局在分析におけるオーバーラップ係数が０．９７と高いことから、ＥＲＹ１ファージおよび抗ＧＹＰＡが同一タンパク質に結合するという結論が裏付けられた。ライブラリーファージにより標識された赤血球中でＧＹＰＡクラスター化も認められたが、ファージ結合が明らかでなく、したがって共局在がないことが明らかであった。
方法：ＴＧＲ樹脂上の標準的な固相ｆ−ｍｏｃ化学反応を使用して、ＥＲＹ１（Ｈ２Ｎ−ＷＭＶＬＰＷＬＰＧＴＬＤＧＧＳＧＣＲＧ−ＣＯＮＨ２）（配列番号１９）およびミスマッチ（Ｈ２Ｎ−ＰＬＬＴＶＧＭＤＬＷＰＷＧＧＳＧＣＲＧ−ＣＯＮＨ２）（配列番号２０）ペプチドを合成した。ペプチドは、９５％のトリフルオロ酢酸、２．５％のエタンジチオール、２．５％の水中で樹脂から開裂させ、氷冷ジエチルエーテル中で沈殿させた。精製は、Ｃ１８逆相カラムを使用してＷａｔｅｒｓ分取ＨＰＬＣ−ＭＳ上で実施した。
ＥＲＹ１およびミスマッチペプチドをＭｔｓ−Ａｔｆ−ビオチン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に、製造業者により推奨されるとおりにコンジュゲートした。簡潔に述べると、ペプチドをＰＢＳ／ＤＭＦ中で可溶化し、１．０５当量のＭｔｓ−ａｔｆ−ビオチンと４℃において一晩反応させた。反応物を遠心分離により清澄化した後、ＰＢＳＡ−５０中でビオチン化ペプチドを赤血球と３７℃において１時間インキュベートし、細胞を新たなＰＢＳ中で２回洗浄し、３６５ｎｍにおいて室温で８分間ＵＶ照射した。細胞を音波処理により溶解させ、溶解物を、ストレプトアビジンコート磁気ビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して精製した。溶出液をＳＤＳ−ＰＡＧＥ上でランさせ、ＰＶＤＦ膜に転写し、ストレプトアビジン−ＨＲＰ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）または抗マウスＧＹＰＡによりイムノブロットした。
実施例２
ヒト赤血球への結合の特徴決定
結果：ヒト赤血球に結合した選択されたペプチドを特徴決定するため、そのような個々のペプチドをディスプレイする細菌を、複数の細胞型を用いる結合アッセイに供した。７つのペプチドのうち６つ（ＥＲＹ１９、ＥＲＹ５９、ＥＲＹ６４、ＥＲＹ１２３、ＥＲＹ１４１およびＥＲＹ１６２）が、ヒト上皮２９３Ｔ細胞およびヒト内皮ＨＵＶＥＣに対する結合と比較してヒト赤血球に特異的に結合した。さらに、ペプチドは、ヒト血液型ＡおよびＢに結合したが、マウス血液に結合せず、このことは、これらのペプチドがヒト血液に特異的であるが、共通の血液型抗原に依存しないことを示した。ペプチドは、標準的な固相ｆ−ｍｏｃ化学反応を使用して合成し、ナノ粒子にコンジュゲートし、上記の個々の細胞型への結合について分析する。赤血球表面への結合は、顕微鏡観察およびフローサイトメトリーの両方を使用して試験した。
実施例３
ＥＲＹ１ペプチド−コンジュゲート抗原またはヒト赤血球結合ペプチド−コンジュゲート抗原との非共有結合的赤血球結合を介する抗原特異的免疫学的寛容の誘導
赤血球への抗原の強力で特異的な生物物理学的結合を得るため、本発明者らがファージディスプレイによりマウスグリコホリン−Ａに特異的に結合することを発見した合成１２アミノ酸ペプチド（ＥＲＹ１）を使用した（Ｋｏｎｔｏｓ ａｎｄ Ｈｕｂｂｅｌｌ，２０１０）。この調査において、モデル抗原ＯＶＡを、ＣＤ８＋Ｔ細胞集団がＭＨＣ Ｉ免疫優性ＯＶＡペプチドＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号３）に特異的なＴ細胞受容体を発現するトランスジェニックマウス株（ＯＴ−Ｉ）とともに使用した。ＥＲＹ１ペプチドをＯＶＡに化学的にコンジュゲートし、高い親和性および特異性でマウス赤血球に結合するＯＶＡバリアント（ＥＲＹ１−ＯＶＡ）を創成した（図１ａ）。高解像度共焦点顕微鏡観察により、ＥＲＹ１結合に関する早期の観察が確認され（Ｋｏｎｔｏｓ ａｎｄ Ｈｕｂｂｅｌｌ，２０１０）、すなわち、細胞膜赤道周辺への局在が確認され、ＥＲＹ１−コンジュゲートタンパク質の細胞内移行は確認されなかった。ＥＲＹ１と同一のアミノ酸を含有するが、一次配列の順序をスクランブルしたミスマッチペプチド（ＭＩＳ−ＯＶＡ）とコンジュゲートしているＯＶＡバリアントが無視可能な程度の結合を示したため、グリコホリン−ＡへのＥＲＹ１媒介結合は配列特異的であった（図１ｂ）。ペプチドをコンジュゲートするために使用された架橋分子のみとコンジュゲートしているＯＶＡは、赤血球に対していかなる計測可能な親和性も示さず、ＥＲＹ１−ＯＶＡ結合が、ＥＲＹ１ペプチドと赤血球表面上のグリコホリン−Ａとの非共有結合性相互作用から生じることが確認された。さらに、ＥＲＹ１−ＯＶＡは、高親和性で赤血球に結合し、平衡結合計測により測定して６．２±１．３ｎＭという抗体様解離定数（Ｋｄ）が示された（図１ｃ）。
マウス中への静脈内投与後、循環赤血球に対するＥＲＹ１−ＯＶＡ結合をインビボで検証した。１５０μｇのＯＶＡまたはＥＲＹ１−ＯＶＡのいずれかの注射から３０分後に採取した全血試料により、血液の複雑で不均一な環境および血管系中でもＥＲＹ１−ＯＶＡの特異的な赤血球結合能が確認された。ＥＲＹ１−ＯＶＡは、グリコホリン−Ａ会合と一致して、赤血球（ＣＤ４５−）に結合するが、白血球（ＣＤ４５＋）には結合しなかった。ＥＲＹ１−ＯＶＡ結合は、赤血球のアポトーシス状態に関して偏ることなく、アネキシン−Ｖ＋およびアネキシン−Ｖ−のＣＤ４５−集団の両方に強く結合した。ＯＶＡコンジュゲートの薬物動態試験により、ＥＲＹ１−ＯＶＡ赤血球結合がインビボで長く続き、１７．２時間の細胞表面半減期が示されることが証明された。ＥＲＹ１−ＯＶＡは投与後７２時間ほど長く赤血球に結合したままであり；この時間枠の間、マウスにおいて赤血球の約１３％がクリアランスされる（Ｋｈａｎｄｅｌｗａｌ ａｎｄ Ｓａｘｅｎａ，２００６）。インビボで赤血球に結合したＥＲＹ１−ＯＶＡの定量により、１０６個の赤血球当たり０．１７４±０．００５ｎｇのＯＶＡという比較的高い負荷が示された。
赤血球機能に対するＯＶＡの負荷のいかなる潜在的な生理学的効果も排除するため、ＥＲＹ１−ＯＶＡまたはＯＶＡのいずれかの静脈内投与後の種々の時点において血液学的パラメーターを特徴決定した。ＥＲＹ１−ＯＶＡによる赤血球結合はＯＶＡの投与と比較して、ヘマトクリットの検出可能な差異も、赤血球容積の検出可能な差異も、赤血球ヘモグロビン含有量の検出可能な差異も誘発しなかった。これらの結果により、抗原とのグリコホリン−Ａ媒介赤血球結合は、それらの血液学的パラメーターを変化させなかったことが実証される。
投与時の赤血球結合抗原の細胞標的を明らかにするため、ＥＲＹ１（ＥＲＹ１−アロフィコシアニン）またはＭＩＳペプチド（ＭＩＳ−アロフィコシアニン）のいずれかにコンジュゲートしている高蛍光性アロフィコシアニンタンパク質をマウスに静脈内注射した。投与から１２および３６時間後の脾臓ＤＣ集団のフローサイトメトリー分析により、ＭＨＣＩＩ＋ＣＤ１１ｂ−ＣＤ１１ｃ＋ＤＣによるＥＲＹ１−アロフィコシアニンの取り込みがＭＩＳ−アロフィコシアニンと比較して９．４倍向上するが、ＭＨＣＩＩ＋ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１１ｃ＋ＤＣによるＥＲＹ１−アロフィコシアニンおよびＭＩＳ−アロフィコシアニンの取り込みは同様であることが示された。さらに、ＭＨＣＩＩ＋ＣＤ８α＋ＣＤ１１ｃ＋ＣＤ２０５＋脾臓ＤＣは、ＭＩＳ−アロフィコシアニンよりも３．０倍程度多くＥＲＹ１−アロフィコシアニンを取り込むが、絶対量は、脾臓中の他のＤＣ集団の場合より顕著に低いことが見出された。非活性化およびＣＤ８α＋ＣＤ２０５＋脾臓ＤＣに対する抗原のそのような標的化は、これらの集団が、アポトーシス細胞により駆動される寛容誘発に広く関与しているため、赤血球結合の寛容誘発の潜在性を強化し得る（Ｆｅｒｇｕｓｏｎ，Ｃｈｏｉ，ｅｔ ａｌ．，２０１１；Ｙａｍａｚａｋｉ，Ｄｕｄｚｉａｋ，ｅｔ ａｌ．，２００８）。肝臓において、ＥＲＹ１−アロフィコシアニンは、ＭＩＳ−アロフィコシアニンと比較して、肝細胞（ＣＤ４５−ＭＨＣＩＩ−ＣＤ１ｄ−；７８．４倍だけ）および肝星細胞（ＣＤ４５−ＭＨＣＩＩ＋ＣＤ１ｄ＋；６０．６倍だけ）による取り込みも大きく向上させ；両方の集団は、ＣＤ８＋Ｔ細胞欠失性寛容を誘発する抗原提示細胞として報告されている（Ｈｏｌｚ，Ｗａｒｒｅｎ，ｅｔ ａｌ．，２０１０；Ｉｃｈｉｋａｗａ，Ｍｕｃｉｄａ，ｅｔ ａｌ．，２０１１；Ｔｈｏｍｓｏｎ ａｎｄ Ｋｎｏｌｌｅ，２０１０）。興味深いことに、そのような取り込みは、赤血球および補体被覆粒子のクリアランスを助ける細網内皮系のメンバーとして機能する肝臓ＤＣ（ＣＤ４５＋ＣＤ１１ｃ＋）中でもクッパー細胞（ＣＤ４５＋ＭＨＣＩＩ＋Ｆ４／８０＋）中でも認められなかった。寛容誘発脾臓ＤＣおよび肝細胞集団による赤血球結合抗原の取り込みの増加により、非リンパ球肝細胞およびカノニカルな脾細胞のクロストークにより駆動される抗原特異的Ｔ細胞欠失の相互に関係する複雑な機序についての潜在性が示唆される。
ＥＲＹ１−ＯＶＡの赤血球結合は、ＡＰＣによるＯＶＡ免疫優性ＭＨＣ Ｉエピトープ（ＳＩＩＮＦＥＫＬ）（配列番号３）の有効なクロスプレゼンテーションおよび対応する反応性Ｔ細胞のクロスプライミングを起こすことが観察された。ＣＦＳＥ標識ＯＴ−Ｉ ＣＤ８＋Ｔ細胞（ＣＤ４５．２＋）をＣＤ４５．１＋マウス中に養子移入した。１０μｇのＯＶＡ、１０μｇのＥＲＹ１−ＯＶＡ、または１０μｇの無関連赤血球結合抗原、ＥＲＹ１−グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＥＲＹ１−ＧＳＴ）の静脈内投与後５日間、ＯＴ−Ｉ ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を計測した。フローサイトメトリーにより計測された、蛍光ＣＦＳＥの希釈により測定されたＯＴ−Ｉ ＣＤ８＋Ｔ細胞増殖は、ＯＶＡと比較してＥＲＹ１−ＯＶＡが投与されたマウスにおいて顕著に向上し、赤血球結合が、可溶性抗原と比較して抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞クロスプライミングを増加させたことが実証された。同様の結果は、１０倍低い１μｇという抗原用量の投与によっても得られ、赤血球結合抗原により誘導されるＯＴ−Ｉ ＣＤ８＋Ｔ細胞増殖の効力の広い動態範囲が実証された。クロスプレゼンテーションおよびクロスプライミングに関する結果は、アポトーシス細胞からの抗原を貪食するＡＰＣによるＭＨＣ Ｉ上の寛容誘発抗原提示に関する他の研究と一致する（Ａｌｂｅｒｔ，Ｐｅａｒｃｅ，ｅｔ ａｌ．，１９９８；Ｇｒｅｅｎ，Ｆｅｒｇｕｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．，２００９）。
機能性エフェクター表現型に拡張されるＴ細胞と、増大および欠失されるＴ細胞とを区別するため、増殖ＯＴ−Ｉ ＣＤ８＋Ｔ細胞を、アポトーシス、したがって欠失の特徴としてのアネキシン−Ｖについて分析した。ＥＲＹ１−ＯＶＡは、ＯＶＡよりもかなり多い数のアネキシン−Ｖ＋増殖ＯＴ−Ｉ ＣＤ８＋Ｔ細胞を誘導し（図１２ｄ）、最終的にクローン欠失を起こすアポトーシス運命が示唆された。ＥＲＹ１−ＯＶＡ投与により誘導された同一の増殖ＯＴ−Ｉ ＣＤ８＋Ｔ細胞は、１および１０μｇの用量の両方において抗原を経験した表現型を示し、ＣＤ４４の上方調節およびＣＤ６２Ｌの下方調節が示された。増殖ＣＤ８＋Ｔ細胞のこの表現型は、ＡＰＣによる抗原特異的Ｔ細胞受容体エンゲージメントの調節が炎症応答を誘導し得ない他の報告されたＯＴ−Ｉ養子移入モデルと一致する（Ｂｕｒｓｃｈ，Ｒｉｃｈ，ｅｔ ａｌ．，２００９）。
確立されたＯＴ−Ｉチャレンジ対寛容モデル（Ｌｉｕ，Ｉｙｏｄａ，ｅｔ ａｌ．，２００２）（図２ａ）を使用して、ＥＲＹ１−ＯＶＡが、極めて強力な細菌由来アジュバントを用いてもワクチン媒介性抗原チャレンジに対する後続の免疫応答を予防することが実証された。寛容化するため、ＯＴ−Ｉ ＣＤ８＋（ＣＤ４５．２＋）Ｔ細胞の養子移入から１および６日後、１０μｇのＯＶＡまたはＥＲＹ１−ＯＶＡのいずれかをＣＤ４５．１＋マウスに静脈内投与した。さらに９日後、移入されたＴ細胞の潜在的欠失を可能とするため、次いで、リポ多糖（ＬＰＳ）によりアジュバント添加されたＯＶＡをレシピエントマウスに皮内注射によりチャレンジした。チャレンジから４日後、流入領域リンパ節および脾細胞の特徴決定ならびにそれらの炎症応答により、欠失が実際に生じたか否かを決定することができた。
ＥＲＹ１−ＯＶＡの静脈内投与は、ＬＰＳによる抗原チャレンジ前に非修飾ＯＶＡが投与されたマウスと比較して、流入領域リンパ節（図２；図２ｂにゲーティング）および脾臓中のＯＴ−Ｉ ＣＤ８＋Ｔ細胞集団の顕著な減少をもたらし（図２ｃ）、欠失性寛容が実証された。ＥＲＹ１−ＯＶＡにより処置されたマウスからの流入領域リンパ節は、ＯＶＡにより処置されたマウスと比較して１１倍超少ないＯＴ−Ｉ ＣＤ８＋Ｔ細胞を含有し、抗原の静脈内注射を受けなかったチャレンジ対照マウスよりも３９倍少ないＯＴ−Ｉ ＣＤ８＋Ｔ細胞を含有し；脾細胞における応答も同様であった。ＥＲＹ１−ＯＶＡが投与されたマウスにおいて示されたこの有効なクローン欠失は、ＯＴ−Ｉ ＣＤ８＋Ｔ細胞のクロスプライミングの向上という早期の観察結果を支持し、さらにクロスプライミングが、共刺激分子のＡＰＣ提示の不存在下で生じ、欠失性寛容を起こしたことを示す。
抗原チャレンジ後の免疫応答をさらに評価するため、常在性のリンパ節および脾細胞の炎症性質を、ＯＴ−Ｉ ＣＤ８＋Ｔ細胞によるインターフェロン−γ（ＩＦＮγ）の発現により特徴決定した（図２ｄ）。ＯＶＡおよびＬＰＳによるチャレンジ後、ＥＲＹ１−ＯＶＡにより予め処置されたマウスのリンパ節は、チャレンジ対照マウス（抗原を予め受けていない）と比較して５３倍少ないＩＦＮγ発現細胞を保有し、等用量のＯＶＡにより予め処置されたマウスと比較して１９倍超少ないＩＦＮγ発現細胞を保有し（図２ｅ）、チャレンジに対する寛容誘発保護における赤血球結合の重要性が実証され；脾細胞における応答も同様であった。さらに、ＥＲＹ１−ＯＶＡにより予め処置されたマウスのリンパ節および脾臓中で存在する少ないＯＴ−Ｉ ＣＤ８＋Ｔ細胞集団の中で、ＩＦＮγを発現する細胞の割合が低く、クローン不活化が示唆された。さらに、ＥＲＹ１−ＯＶＡにより予め処置されたマウスにおいて、ＳＩＩＮＦＥＫＬ再刺激時に流入領域リンパ節から単離された細胞により産生される総ＩＦＮγレベルの大きさは実質的に低減し（図２ｆ）、赤血球結合はＩＦＮγレベルをＯＶＡ投与と比較して１６倍低減させ、チャレンジ対照と比較して１１５倍超低減させた。特記される点として、この抑制現象は、インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）発現の下方調節とも相関付けられ、それというのも、ＥＲＹ１−ＯＶＡにより予め処置されたマウスからのリンパ節細胞は、ＯＶＡにより予め処置されたマウスおよびチャレンジ対照マウスと比較してそれぞれ３８％および５０％少ないＩＬ−１０を発現したためである（図２ｇ）。Ｔｈ１応答を減衰させるためのＡＰＣ−Ｔ細胞コミュニケーションに関して制御性ＣＤ４＋Ｔ細胞により発現されるサイトカインを考慮するのが典型的であり（Ｄａｒｒａｈ，Ｈｅｇｄｅ，ｅｔ ａｌ．，２０１０；Ｌｅｅ ａｎｄ Ｋｉｍ，２００７）、ＩＬ−１０発現は、チャレンジに対する脱感作には不要であった。同様のＩＬ−１０の下方調節が、ＣＤ８＋Ｔ細胞媒介性寛容誘発に関与している（Ｆｉｆｅ，Ｇｕｌｅｒｉａ，ｅｔ ａｌ．，２００６；Ａｒｎａｂｏｌｄｉ，Ｒｏｔｈ−Ｗａｌｔｅｒ，ｅｔ ａｌ．，２００９；Ｓａｉｎｔ−Ｌｕ，Ｔｏｕｒｄｏｔ，ｅｔ ａｌ．，２００９）。ＥＲＹ１−ＯＶＡにより処置されたマウスが、可溶性ＯＶＡにより処置されたマウスと比較して１００倍低い血清中の抗原特異的ＩｇＧ力価を示したため、赤血球結合は、抗原に対する液性免疫応答も実質的に減弱させた（図２ｈ）。赤血球結合の結果としてのＯＶＡ特異的ＩｇＧ力価低減の同様の低減が、非養子移入Ｃ５７ＢＬ／６（ＣＤ４５．２＋）マウスにおいて認められた。１μｇのＯＶＡまたはＥＲＹ１−ＯＶＡを７日間の間隔を置いて２回静脈内投与した後、ＥＲＹ１−ＯＶＡにより処置されたマウスは、第１の抗原投与から１９日後３９．８倍低いＯＶＡ特異的血清ＩｇＧレベルを示した（図３）。抗原による赤血球連結後のＢ細胞活性化のこの明らかな低減により、寛容誘発の間の非炎症性抗原提示に関する現在の仮説が裏付けられる（Ｍｉｌｌｅｒ，Ｔｕｒｌｅｙ，ｅｔ ａｌ．，２００７；Ｇｒｅｅｎ，Ｆｅｒｇｕｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．，２００９；Ｍｕｅｌｌｅｒ，２０１０）。
抗原特異的免疫寛容の誘導をさらに検証するため、ＯＴ−Ｉチャレンジ対寛容モデルをＯＶＡ発現腫瘍グラフトモデルと組み合わせた（図２ｉ）。以前の実験設計と同様に、ＯＴ−Ｉ ＣＤ８＋Ｔ細胞の養子移入後に１０μｇのＥＲＹ１−ＯＶＡまたは１０μｇのＯＶＡを２回静脈内投与することによりマウスを寛容化した。第１の抗原投与から５日後、ＥＲＹ１−ＯＶＡが注射されたマウスは、２．９倍少ない血液中の非増殖（０世代）ＯＴ−Ｉ ＣＤ８＋Ｔ細胞を保有したため、顕著なＴ細胞欠失が検出された（図２ｊ）。外部から投与される強力なアジュバントの不存在下で増殖するＯＴ−Ｉ ＣＤ８＋Ｔ細胞の機能応答性を決定するため、養子移入から９日後、ＯＶＡ発現ＥＬ−４胸腺腫細胞（Ｅ．Ｇ７−ＯＶＡ）をマウスの背中皮膚中に皮内注射した。赤血球結合抗原の寛容誘発効力を評価するため、用量およびスケジュールをチャレンジ対寛容モデルと同様にして、腫瘍グラフト導入から６日後、腫瘍担持マウスにＬＰＳアジュバント添加されたＯＶＡをチャレンジした。ＥＲＹ１−ＯＶＡにより処置されたマウスにおいて、ＯＶＡにより処置されたマウスまたは未処置対照マウスと比較してロバストな腫瘍成長が腫瘍グラフト導入から８日後まで継続的に観察され（図２ｋ）、ＥＲＹ１−ＯＶＡにより駆動されるＯＴ−Ｉ ＣＤ８＋Ｔ細胞増殖がＯＶＡに対する機能的な免疫非応答性を誘導することが確認された。腫瘍サイズがグラフト導入から８日後に定常状態に停止したことは、ＥＲＹ１−ＯＶＡにより駆動される欠失性寛容をまだ受けていない残留ＯＴ−Ｉ ＣＤ８＋Ｔ細胞を示し得る。
動物
スイス獣医当局は既に全ての動物処置を承認した。８〜１２週齢の雌Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）をインビボ結合試験に、Ｅ．Ｇ７−ＯＶＡ腫瘍宿主として使用した。Ｃ５７ＢＬ／６−Ｔｇ（ＴｃｒａＴｃｒｂ）１１００Ｍｊｂ（ＯＴ−Ｉ）マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｓ）をＥＰＦＬ動物施設において飼育し、脾細胞単離には６〜１２週齢の雌を使用した。８〜１２週齢の雌Ｂ６．ＳＪＬ−ＰｔｐｒｃａＰｅｐｃｂ／Ｂｏｙ（ＣＤ４５．１）マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）を、ＯＴ−Ｉ ＣＤ８＋Ｔ細胞養子移入および寛容誘発試験のためのレシピエント宿主として使用した。
ペプチド設計および合成
およびミスマッチ（Ｈ２Ｎ−ＰＬＬＴＶＧＭＤＬＷＰＷＧＧＳＧＣＲＧ−ＣＯＮＨ２）（配列番号２０）ペプチドは、ＴＧＲ樹脂（Ｎｏｖａ Ｂｉｏｃｈｅｍ）を使用して自動リキッドハンドラー（ＣＨＥＭＳＰＥＥＤ）により標準的な固相ｆ−ｍｏｃ化学反応により合成した。下線で示した配列は、本発明者らがファージディスプレイによりマウスグリコホリン−Ａ結合剤として以前に発見したＥＲＹ１の１２−ｍｅｒ配列である（Ｋｏｎｔｏｓ ａｎｄ Ｈｕｂｂｅｌｌ，２０１０）。ＧＧＳＧ領域は、コンジュゲーションに使用されるシステイン残基へのリンカーとして機能し；フランキングするアルギニン残基はｐＫａを低下させ、したがってシステイン残基の反応性を増加させるように機能した（Ｌｕｔｏｌｆ，Ｔｉｒｅｌｌｉ，ｅｔ ａｌ．，２００１）。ペプチドは、９５％のトリフルオロ酢酸、２．５％のエタンジチオール、２．５％の水中で樹脂から３時間開裂させ、氷冷ジエチルエーテル中で沈殿させた。精製は、Ｃ１８逆相カラム（ＰｅｒＳｐｅｃｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して分取ＨＰＬＣ−ＭＳ（Ｗａｔｅｒｓ）上で実施した。
ＥＲＹ１−抗原コンジュゲーション
ジメチルホルムアミド中で溶解させた１０モル当量のスクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ、ＣＡＳ番号６４９８７−８５−５、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）をＰＢＳ中５ｍｇ／ｍＬのエンドトキシンフリー（＜１ＥＵ／ｍｇ）ＯＶＡ（Ｈｙｇｌｏｓ ＧｍｂＨ）と室温において１時間反応させた。２ｍＬのＺＥＢＡ脱塩スピンカラム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）による脱塩後、３Ｍのグアニジン−ＨＣｌ中で溶解させた１０当量のＥＲＹ１またはＭＩＳペプチドを添加し、室温において２時間反応させた。コンジュゲートを２ｍＬのＺＥＢＡ脱塩スピンカラムを使用して脱塩し、０．２μｍ滅菌濾過し、作業アリコートに分注し、−２０Ｃにおいて貯蔵した。タンパク質濃度は、ＢＣＡアッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を介して測定した。このスキームは、ペプチド上のシステイン側鎖と抗原上のリジン側鎖とのコンジュゲーションをもたらす。グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）をＢＬ２１大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）中で発現させ、標準的なグルタチオン親和性クロマトグラフィーを使用して精製した。オンカラムエンドトキシン除去を十分なＴｒｉｔｏｎ−Ｘ１１４（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）洗浄により実施し、エンドトキシン除去は、ＴＨＰ−１Ｘ Ｂｌｕｅ細胞（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）により確認した。同一の反応手順を使用してＥＲＹ１をＧＳＴにコンジュゲートした。マレイミド活性化アロフィコシアニン（Ｉｎｎｏｖａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）をＰＢＳ中で溶解させ、上記のとおりＥＲＹ１またはＭＩＳとコンジュゲートした。
赤血球への結合の顕微鏡観察
新たに単離された５×１０５個のマウス赤血球を、１０ｍｇ／ｍＬのＢＳＡを含有するＰＢＳ中の１００ｎＭのＥＲＹ１−ＯＶＡまたはＯＶＡに３７Ｃにおいて１時間曝露させた。遠心分離および洗浄の後、細胞を１：２００希釈ヤギ抗マウスグリコホリン−Ａ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）およびウサギ抗ＯＶＡ（ＡｂＤ ＳＥＲＯＴＥＣ）により氷上で２０分間標識した。遠心分離および洗浄の後、細胞を１：２００ＡＬＥＸＡＦＬＵＯＲ４８８抗ヤギＩｇＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５４６抗ウサギＩｇＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により氷上で２０分間標識した。最終の回転／洗浄サイクル後、細胞を固化してマウントし、６３倍油浸対物レンズを有するＺｅｉｓｓ ＬＳＭ７００倒立共焦点顕微鏡により画像化した。画像分析は、ＩＭＡＧＥＪ（ＮＩＨ）において実施し、両方の画像に同一の処理を実施した。
インビボ結合および生体内分布
０．９％の生理食塩水中１５０μｇのＥＲＹ１−ＯＶＡまたはＯＶＡ（Ｂ．Ｂｒａｕｎ）を１００μＬの容量で８〜１２週齢の雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスの尾中に、イソフルランによる麻酔下で静脈内注射した。実験の間、加温パッドによりマウスを３７Ｃに保持するのを確保するように注意した。所定の時点において、５μＬの血液を尾上の小切開部から採取し、ＰＢＳ中１０ｍＭのＥＤＴＡ中に１００倍希釈し、１０ｍｇ／ｍＬのＢＳＡを有するＰＢＳにより３回洗浄し、フローサイトメトリーおよびＥＬＩＳＡによりＯＶＡ含有量について分析した。ＯＶＡは、捕捉用マウスモノクローナル抗ＯＶＡ抗体（Ｓｉｇｍａ）、検出用ポリクローナルウサギ抗ＯＶＡ抗体（ＡｂＤ ＳＥＲＯＴＥＣ）、最終検出用ヤギ抗ウサギ−ＩｇＧ−ＨＲＰ抗体（ＢｉｏＲａｄ）、次いでＴＭＢ基質（ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用するサンドイッチＥＬＩＳＡにより定量した。血液学的特徴決定を、ＡＤＶＩＶＡ ２１２０ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｓｉｅｍｅｎｓ）により実施した。赤血球結合ＥＲＹ１−ＧＳＴを、標識細胞をヤギ抗ＧＳＴ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）とインキュベートし、次いでＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８ロバ抗ヤギ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とインキュベートすることにより検出し、フローサイトメトリーにより分析した。生体内分布試験のため、２０μｇのＥＲＹ１−ＡＰＣまたはＭＩＳ−ＡＰＣを上記の８〜１２週齢の雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスの尾静脈中に静脈内注射した。マウスを所定の時点において屠殺し、脾臓、血液、および肝臓を摘出した。それぞれの器官をコラゲナーゼＤ（Ｒｏｃｈｅ）により消化し、ホモジナイズしてフローサイトメトリー染色のための単一細胞懸濁液を得た。
Ｔ細胞養子移入
ＣＤ８磁気ビーズネガティブ選択キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を製造業者の説明書に従って使用してＯＴ−Ｉ（ＣＤ４５．２＋）マウス脾臓からのＣＤ８＋Ｔ細胞を単離した。新たに単離されたＣＤ８＋ＯＴ−Ｉ細胞をＰＢＳ中で再懸濁し、１μＭのカルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により室温において６分間標識し、１０％のＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）を有する等容量のＩＭＤＭにより反応を１分間クエンチした。細胞を洗浄し、カウントし、注射前に純粋なＩＭＤＭ中で再懸濁した。３×１０６個のＣＦＳＥ標識ＣＤ８＋ＯＴ−Ｉ細胞をレシピエントＣＤ４５．１＋マウスの尾静脈中に静脈内注射した。短期増殖試験のため、１０μｇのＥＲＹ１−ＯＶＡまたはＯＶＡを１００μＬの容量で養子移入から２４時間後に注射した。脾細胞を抗原投与から５日後に回収し、フローサイトメトリーによる分析のために染色した。
ＯＴ−Ｉ寛容およびチャレンジモデル
３×１０５個のＣＦＳＥ標識ＯＴ−Ｉ ＣＤ８＋Ｔ細胞を上記のとおりＣＤ４５．１＋レシピエントマウス中に注射した。養子移入から１および６日後に、マウスの尾静脈中に１００μＬの生理食塩水中１０μｇのＥＲＹ１−ＯＶＡまたはＯＶＡを静脈内投与した。養子移入から１５日後、５μｇのＯＶＡおよび２５ｎｇの超高純度の大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＬＰＳ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）を２５μＬでマウスのそれぞれの後肢肉趾中に皮内チャレンジした（Ｈｏｃｋ法、１０μｇのＯＶＡおよび５０ｎｇのＬＰＳの総用量）。マウスをチャレンジから４日後に屠殺し、再刺激のために脾臓および流入領域リンパ節細胞を単離した。細胞内サイトカインのフローサイトメトリー分析のため、細胞を１ｍｇ／ｍＬのＯＶＡまたは１μｇ／ｍＬのＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号３）ペプチド（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ）の存在下で３時間再刺激した。ブレフェルジン−Ａ（Ｓｉｇｍａ、５μｇ／ｍＬ）を添加し、染色およびフローサイトメトリー分析前に再刺激をさらに３時間再開した。分泌因子のＥＬＩＳＡ測定のため、１００μｇ／ｍＬのＯＶＡまたは１μｇ／ｍＬのＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号３）ペプチドの存在下で細胞を４日間再刺激した。細胞を回転させ、ＩＦＮγおよびＩＬ−１０のＲｅａｄｙ−Ｓｅｔ−Ｇｏキット（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を製造業者の説明書に従って使用してＥＬＩＳＡ分析のため培地を回収した。ＯＶＡ特異的血清ＩｇＧを、ＯＶＡコートプレート上で種々の希釈物のマウス血清をインキュベートし、次いで最後にヤギ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）とインキュベートすることにより検出した。
ＯＴ−ＩのＥ．Ｇ７−ＯＶＡ寛容モデル
１×１０６個のＣＦＳＥ標識ＯＴ−Ｉ ＣＤ８＋Ｔ細胞を、上記のとおり８〜１２週齢の雌Ｃ５７ＢＬ／６マウス中に注射した。養子移入から１および６日後、１００μＬの生理食塩水中１０μｇのＥＲＹ１−ＯＶＡまたは１０μｇのＯＶＡをマウスの尾静脈中に静脈内投与した。養子移入から５日後、フローサイトメトリーによるＯＴ−Ｉ ＣＤ８＋Ｔ細胞増殖の特徴決定のために血液を採取した。ＯＶＡ発現ＥＬ−４胸腺腫細胞（Ｅ．Ｇ７−ＯＶＡ、ＡＴＣＣ ＣＲＬ−２１１３）をＡＴＣＣ指針に従って培養した。簡潔に述べると、１０％のウシ胎仔血清、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、０．０５ｍＭのβ−メルカプトエタノール、１％のピューロマイシン／ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｇｉｂｃｏ）、および０．４ｍｇ／ｍＬのＧ４１８（ＰＡＡ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）が補充されたＲＰＭＩ１６４０中で細胞を培養した。注射直前、Ｇ４１８を有さない培地中で細胞を増大させ、回収時にＨＢＳＳ（Ｇｉｂｃｏ）中で再懸濁した。養子移入から９日後、マウスをイソフルランにより麻酔し、背部を剃毛し、肩甲骨間に１×１０６個のＥ．Ｇ７−ＯＶＡ細胞を皮内注射した。Ｅ．Ｇ７−ＯＶＡグラフトから４日後、腫瘍寸法を２４時間毎にデジタルカリパスにより計測し、腫瘍容積を楕円体（Ｖ＝（π／６）ｌ・ｗ・ｈ）として計算し、式中、Ｖは腫瘍の容積、ｌは長さ、ｗは幅、ｈは高さである）。養子移入から１５日後、５μｇのＯＶＡおよび２５ｎｇの超高純度の大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＬＰＳ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）を２５μＬでマウスのそれぞれの前肢肉趾中に皮内チャレンジした（１０μｇのＯＶＡおよび５０ｎｇのＬＰＳの総用量）。
抗体およびフローサイトメトリー
フローサイトメトリーには以下の抗マウス抗体：ＣＤ１ｄ Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ、ＣＤ３ε ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５、ＣＤ８α ＰＥ−Ｃｙ７、ＣＤ１１ｂ ＰＥ−Ｃｙ７、ＣＤ１１ｃ Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ、ビオチン化ＣＤ４５、ＣＤ４５．２ Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ、ＣＤ４５ Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ、ＩＦＮγ−ＡＰＣ、ＣＤ８α ＡＰＣ−ｅＦ７８０、ＣＤ４４ ＰＥ−Ｃｙ５．５、ＣＤ６２Ｌ ＰＥ、ＣＤ２０５ ＰＥ−Ｃｙ７、Ｆ４／８０ ＰＥ、Ｉ−Ａ／Ｉ−Ｅ ＭＨＣＩＩ ＦＩＴＣ（全てｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ製）のほか、ｆｉｘａｂｌｅ ｌｉｖｅ／ｄｅａｄ色素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、アネキシン−Ｖ−Ｃｙ５標識キット（ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ）、ストレプトアビジンＰａｃｉｆｉｃ Ｏｒａｎｇｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および抗ＯＶＡ−ＦＩＴＣ（Ａｂｃａｍ）を使用した。試料は、ＣｙＡｎ ＡＤＰフローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）により分析した。最初に細胞をＰＢＳにより洗浄し、ｌｉｖｅ／ｄｅａｄ色素により氷上で２０分間染色し、２４Ｇ２ハイブリドーマ培地により氷上で２０分間ブロッキングし、氷上で２０分間表面染色し、２％のパラホルムアルデヒドにより氷上で２０分間固定し、０．５％のサポニンの存在下で氷上で４５分間細胞内染色し、次いで分析前に最後の洗浄を行った。アポトーシス染色のため、アネキシン−Ｖ−Ｃｙ５を分析５分前に添加した。ＣＤ４５染色のため、細胞をストレプトアビジンＰａｃｉｆｉｃ Ｏｒａｎｇｅにより氷上で２０分間染色し、洗浄し、分析した。
粒子を用いる実現
ＥＲＹ１ペプチドを、ＥＲＹ１ペプチドおよび寛容誘発抗原の両方がコンジュゲートしているナノ粒子の形態でも寛容誘発のために実現させた。
ＥＲＹ１と、ペプチドまたはタンパク質抗原にさらにコンジュゲートしているポリマーナノ粒子とのコンジュゲートを形成するため、化学量論量のそれぞれの成分を連続的に添加してコンジュゲーション変換を制御することができる。ＯＶＡおよびＥＲＹ１またはミスマッチペプチドの両方とコンジュゲートしているナノ粒子を形成するため、ペプチドを最初に３Ｍの水性グアニジンＨＣｌ中で溶解させ、０．５当量を、チオール反応性ピリジルジスルフィド基を含有するナノ粒子に添加した。３４３ｎｍにおいて吸光度計測を行い、反応変換をモニタリングした。それというのも、この反応は、この波長において高い吸光度を有する非反応性ピリジン−２−チオン種を創成するためである。室温において２時間後、３４３ｎｍにおける吸光度は安定し、ＯＶＡを３Ｍの水性グアニジンＨＣｌ中で溶解させ、ナノ粒子溶液に２倍モル過剰において添加した。室温において２時間後、３４３ｎｍにおける吸光度はより高い値に再び安定し、溶液中のペプチドおよびＯＶＡの両方の濃度を算出した。この二機能性ナノ粒子を、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ６Ｂ充填カラム上のゲル濾過により非反応成分から精製した。それぞれの０．５ｍＬの画分をフルオレサミンによりタンパク質および／またはペプチドの存在について分析し、ナノ粒子サイズを動的光散乱（ＤＬＳ）により評価した。
抗原がそのような反応を実施するためのいかなるフリーチオール基も含有しない場合、フリーチオール基を組換えＤＮＡ技術により導入して突然変異体を創成することができ、次いでそれを組換えにより発現させ、精製することができる。あるいは、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）を使用してナノ粒子と抗原との間でアミン−カルボン酸架橋を実施することができる。
ＥＲＹ１と、ペプチドまたはタンパク質抗原にさらにコンジュゲートしているポリマーミセルとのコンジュゲートを形成するため、ポリマーナノ粒子についての記載と同様の反応を使用することができる。ミセルは、適切なコンジュゲーションスキームに望ましい官能基を含有するように形成する。本発明者らのナノ粒子およびミセルは、多くの異なる官能化学基を含むように合成することができることを考慮すると、ナノ粒子／ミセル−抗原−ＥＲＹ１複合体の創成において用いるためのコンジュゲーションスキームの多数の可能性が存在する。
実施例４
マウスおよび／またはヒト赤血球に結合する抗体および抗体断片の開発
赤血球に非共有結合させる別の方法として、赤血球結合抗体を使用して抗原特異的免疫学的寛容を誘導することもできる。技術水準のディスプレイプラットフォーム、例として、限定されるものではないが、バクテリオファージディスプレイ、酵母および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）表面ディスプレイを使用する抗体ライブラリーのスクリーニングにより、赤血球表面タンパク質に対する高親和性を示す抗体を単離することができる。新規赤血球結合抗体を発見したら、ＥＲＹ１ペプチドについて実施されたものと同様の結合の生化学的特徴決定を評価することができる。改善された結合特徴を有する、より高い親和性の突然変異体を創成するため、初回ライブラリースクリーニングから赤血球に結合することが発見された抗体断片に対して親和性成熟を実施する。標準的な組換えＤＮＡ技術、例えば、エラープローンＰＣＲおよび部位特異的突然変異誘発を使用して、親結合配列から新たなライブラリーを創成する。次いで、上記の技術水準のディスプレイプラットフォームを使用して、親結合配列と比較して赤血球について向上した親和性を有する他の抗体断片の親和性成熟ライブラリーをディスプレイさせる。
親和性成熟は、マウス赤血球またはヒト赤血球のいずれかに結合する既存の抗体に対して実施することもできる。ラットモノクローナルＴＥＲ−１１９クローン抗体（Ｋｉｎａ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｒ Ｊ Ｈａｅｍａｔｏｌ，２０００）は、依然として十分に決定されていない部位においてマウス赤血球に結合するが、その特異性は、不均一な細胞集団から赤血球を取り出すのに一般に使用されている。マウス赤血球に対する増加した親和性を有する新たな抗体を発見するため、全長抗体または抗体断片、例えば、ｓｃＦｖとしてのＴＥＲ−１１９抗体に対して親和性成熟を実施する。マウスモノクローナル１０Ｆ７クローン抗体（Ｌａｎｇｌｏｉｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９８４年）は、ヒト赤血球細胞表面上のヒトグリコホリン−Ａに結合する。ヒト赤血球に対する増加した親和性を有する新たな抗体を発見するため、全長抗体または抗体断片、例えば、ｓｃＦｖとしての１０Ｆ７抗体に対して親和性成熟を実施する。
ＴＥＲ−１１９抗体の一次配列を決定するため、ＴＥＲ−１１９ハイブリドーマから単離された抗体特異的ｃＤＮＡを、遺伝子断片の容易なシーケンシングを可能とするプラスミド中にクローニングした。遺伝子セグメントの複数の可変ドメインの増幅を可能とする抗体遺伝子のＰＣＲ増幅プロセスには、規定のプライマーセットを使用した（Ｋｒｅｂｂｅｒ，ｅｔ ａｌ．，１９９７；Ｒｅｄｄｙ，ｅｔ ａｌ．，２０１０）。抗体ドメインのＤＮＡ配列により、ＴＥＲ−１１９ ＩｇＧ抗体の重鎖および軽鎖の可変領域を決定することができた。ＴＥＲ−１１９ ＩｇＧのｓｃＦｖ型を構築するため、アセンブリーＰＣＲを使用してＴＥＲ−１１９の可変重鎖、次いで（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）４（配列番号１８）リンカー、次いでＴＥＲ−１１９の可変軽鎖からなる遺伝子を創成した。
Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩ Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、ＴＥＲ−１１９ハイブリドーマクローンからのｍＲＮＡに対して標準的な逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）を実施し、クローンの相補的（ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔａｒｙ）ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を創成した。次いで、以下のプライマーセットを使用してＰＣＲを実施して抗体の可変重鎖（ＶＨ）および可変軽鎖（ＶＬ）領域のＤＮＡ配列を特異的に増幅した。
次いで、増幅されたＶＨおよびＶＬ遺伝子を制限エンドヌクレアーゼ（ＶＬについてはＮｃｏＩおよびＮｏｔＩ、ＶＨについてはＮｄｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ）により消化し、遺伝子断片を、アガロース電気泳動後に標準的なキット（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｏｒａｎｇｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して精製し、クローニングプラスミドｐＭＡＺ３６０中にライゲートした。ＶＨまたはＶＬの遺伝子のいずれかを含有するプラスミドをシーケンシングし、アセンブリーＰＣＲを使用して新たな遺伝子を構築して以下のＴＥＲ−１１９ ｓｃＦｖ配列を創成し：
この配列は、翻訳されるタンパク質のＮ末端におけるＴＥＲ−１１９クローンのＶＨ領域、次いで（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）４（配列番号１８）リンカードメイン、次いで翻訳されるタンパク質のＣ末端におけるＴＥＲ−１１９クローンのＶＬ領域をコードする。ＴＥＲ−１１９ ｓｃＦｖ遺伝子は、以下のＶＨ領域に特異的なプライマーＳＫ０７およびＳＫ０８、ならびにＶＬ領域に特異的なＳＫ０９およびＳＫ１０を用いてＴＥＲ−１１９ ｃＤＮＡを増幅することにより構築した。
それぞれの最終的に完成したｓｃＦｖ遺伝子産物をＳｆｉＩおよびＸｈｏＩ（ＮＥＢ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ，ＵＳＡ）により消化し、ｐＳｅｃＴａｇＡ哺乳動物発現プラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）上の同一部位中にライゲートした。
ヒトグリコホリン−Ａに結合する１０Ｆ７ ｓｃＦｖを親和性成熟させるため、遺伝子をＤＮＡ２．０（Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ，ＣＡ，ＵＳＡ）から以下の配列として商業的に合成し、得た。
ＴＥＲ−１１９について上記の組換えＤＮＡ技術を用いて同様の親和性成熟を１０Ｆ７遺伝子に対して実施してヒト赤血球に対する向上した結合のスクリーニングを可能とする突然変異体のライブラリーを得る。
実施例５
抗体コンジュゲート抗原との非共有結合的赤血球結合を介する抗原特異的免疫学的寛容の誘導
抗体は、実施例３および本明細書の他箇所に挙げられる標準的な架橋反応を使用して抗原とコンジュゲートすることができる。精製された抗体−抗原コンジュゲートは、１型糖尿病、多発性硬化症、膵島移植の標準的なマウスモデル中の抗原、およびＯＶＡモデル抗原に対する寛容の誘導を示す。
ＯＶＡに対する寛容の誘導を実証するため、ＯＶＡ−抗体コンジュゲートまたはＯＶＡ−ナノ粒子−抗体コンジュゲートをマウスに静脈内投与または血管外投与することができる。投与後所定の日数において、マウスを屠殺し、リンパ節、脾臓、および血液を分析のために回収することができる。脾細胞およびリンパ節由来の細胞をプレーティングし、ＯＶＡおよび／またはＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドによりエクスビボで３日間再刺激し、寛容の確立された証拠であるそれらのＩＦＮγ、ＩＬ−１７ａ、ＩＬ−２、およびＩＬ−４の発現の下方調節、ならびにＴＧＦ−β１の上方調節をＥＬＩＳＡにより計測する。ＩＦＮγ、ＩＬ−１７ａ、ＩＬ−２、およびＩＬ−４の細胞内染色は、ＯＶＡおよび／またはＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドによるエクスビボ再刺激から６時間後、脾細胞およびリンパ節由来細胞に対してフローサイトメトリーを使用して実施する。さらに、フローサイトメトリーを使用してリンパ節、脾臓および血液由来細胞からのＣＤ４、ＣＤ８、および制御性Ｔ細胞の発現プロファイルを特徴決定する。さらに、種々の時点においてマウスから血液試料を採取してＯＶＡ抗原に対する液性抗体応答を計測する。エクスビボ再刺激のバリアント実験を実施して全身性寛容が確立したか否かを決定する。マウスに上記のとおりＯＶＡ−抗体コンジュゲートまたはＯＶＡ−抗体−ナノ粒子コンジュゲートを投与し、アジュバント（リポ多糖、完全フロイントアジュバント、ミョウバンなど）とともに９日後にＯＶＡを再投与し、ＯＶＡ抗原に対する脾細胞の応答性を上記のとおりＥＬＩＳＡおよび／またはフローサイトメトリーにより評価する。ＯＶＡ−抗体コンジュゲートおよび／またはＯＶＡ−抗体−ナノ粒子配合物により、脾細胞はＯＶＡおよびアジュバントによる第２のチャレンジに対して非応答性になり、それは全身性寛容の有効な確立を実証するための１つの方法である。ＯＶＡ−抗体コンジュゲートおよび／またはＯＶＡ−抗体−ナノ粒子配合物による初回投与後、同様のインビボチャレンジ実験を、寛容をさらに実証するものとして、トランスジェニック細胞株、例えば、実施例３に詳述される試験と同様にＯＴ−Ｉ Ｔ細胞による養子移入を用いて実施することができる。自己免疫のマウスモデルにおける免疫寛容または治療分子の脱免疫化（ｄｅｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ）を実証するため、ＯＶＡについて本明細書に記載されたものと類似の、関連抗原に対する抗体コンジュゲートを作製することができる。
実施例６
単鎖抗体融合抗原との非共有結合的赤血球結合を介する抗原特異的免疫学的寛容の誘導
単鎖抗体断片（ｓｃＦｖ）は、赤血球に対する非共有結合結合剤として使用することができる。赤血球表面タンパク質に対する高親和性を示すｓｃＦｖは、技術水準のディスプレイプラットフォームを使用してｓｃＦｖライブラリーをスクリーニングすることにより単離することができる。新規赤血球結合抗体断片を発見したら、ＥＲＹ１ペプチドについて実施されたものと同様の結合の生化学的特徴決定を評価することができる。ｓｃＦｖは１本のポリペプチド鎖を有するため、標準的な組換えＤＮＡ技術を使用する部位特異的組換え様式において抗原に融合させる。抗原融合パートナーの性質に応じて、ｓｃＦｖを抗原のＮまたはＣ末端に融合して二機能性タンパク質種を創成する。抗原についての主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）ペプチド認識配列が既知である場合、ペプチドをさらにｓｃＦｖのリンカードメイン中に挿入し、こうしてｓｃＦｖのネイティブ末端を含有する新たな二機能性抗体／抗原構築物を創成する。
ＯＶＡに対する寛容の誘導を実証するため、ＯＶＡ−ｓｃＦｖまたはＯＶＡ−ナノ粒子−ｓｃＦｖコンジュゲートをマウスに静脈内投与または血管外投与することができる。投与後所定の日数において、マウスを屠殺し、リンパ節、脾臓、および血液を分析のために回収することができる。脾細胞およびリンパ節由来細胞をプレーティングし、ＯＶＡおよび／またはＳＩＩＮＦＥＫＬペプチド（配列番号３）によりエクスビボで３日間再刺激することができ、寛容の確立された証拠であるそれらのＩＦＮγ、ＩＬ−１７ａ、ＩＬ−２、およびＩＬ−４の発現の下方調節、ならびにＴＧＦ−β１の上方調節を、例えば、ＥＬＩＳＡにより計測することができる。ＩＦＮγ、ＩＬ−１７ａ、ＩＬ−２、およびＩＬ−４の細胞内染色は、ＯＶＡおよび／またはＳＩＩＮＦＥＫＬペプチド（配列番号３）によるエクスビボ再刺激から６時間後、脾細胞およびリンパ節由来細胞に対してフローサイトメトリーを使用して実施する。さらに、フローサイトメトリーを使用してリンパ節、脾臓、および血液由来細胞からのＣＤ４、ＣＤ８、および制御性Ｔ細胞の発現プロファイルを特徴決定することができる。さらに、種々の時点においてマウスから血液試料を採取してＯＶＡ抗原に対する液性抗体応答を計測する。エクスビボ再刺激のバリアント実験を実施して全身性寛容が確立したか否かを決定する。マウスに上記のとおりＯＶＡ−ｓｃＦｖまたはＯＶＡ−ナノ粒子−ｓｃＦｖコンジュゲートを投与し、アジュバント（リポ多糖、完全フロイントアジュバント、ミョウバンなど）とともに９日後にＯＶＡを再投与し、ＯＶＡ抗原に対する脾細胞の応答性を上記のとおりＥＬＩＳＡおよび／またはフローサイトメトリーにより評価する。ＯＶＡ−ｓｃＦｖおよび／またはＯＶＡ−ｓｃＦｖ−ナノ粒子配合物により、脾細胞はＯＶＡおよびアジュバントによる第２のチャレンジに対して非応答性になり、それにより全身性寛容の有効な確立が説明される。ＯＶＡ−ｓｃＦｖおよび／またはＯＶＡ−ｓｃＦｖ−ナノ粒子配合物による初回投与後、寛容を実証するため、同様のインビボチャレンジ実験を、トランスジェニック細胞株、例えば、実施例３に詳述される試験と同様にＯＴ−Ｉ Ｔ細胞による養子移入を用いて実施することができる。自己免疫のマウスモデルにおける免疫寛容または治療分子の脱免疫化を実証するため、ＯＶＡについて本明細書に記載されたものと類似の、関連抗原に対するｓｃＦｖ融合物を作製することができる。
標準的な組換えＤＮＡ技術を使用してマウス赤血球に結合し、ＯＶＡの免疫優性ＭＨＣ−Ｉエピトープ（ＳＧＬＥＱＬＥＳＩＩＮＦＥＫＬ）（配列番号７５）をディスプレイする抗体構築物を創成した。最初に、オーバーラップエクステンションＰＣＲを使用して、ＴＥＲ１１９配列の３’末端に相補的（ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔａｒｙ）な重複５’ドメインとともに、ＳＧＬＥＱＬＥＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号７５）ペプチドを含む末端３’ドメインをコードするＤＮＡ断片を創成した。このＤＮＡ断片をリバースプライマーとして、相補的（ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔａｒｙ）なフォワード５’プライマーとともに標準的なＰＣＲにおいて使用して、ＴＥＲ１１９−ＳＧＬＥＱＬＥＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号７５）をコードする全ＤＮＡ断片を創成した：
下線で示した配列は、ＳＧＬＥＱＬＥＳＩＩＮＦＥＫＬをコードする遺伝子セグメントを示す。このＤＮＡ断片を組換え発現のための哺乳動物および原核生物発現ベクター中に挿入した。
標準的な組換えＤＮＡ技術を使用して、マウス赤血球に結合し、クロモグラニン−Ａミメトープ（ｍｉｍｅｔｏｐｅ）１０４０−ｐ３１（ＹＶＲＰＬＷＶＲＭＥ）（配列番号７７）をディスプレイする抗体構築物を創成した。オーバーラップエクステンションＰＣＲを使用して、ＴＥＲ１１９配列の３’末端に相補的（ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔａｒｙ）な重複５’ドメインとともに、ＹＶＲＰＬＷＶＲＭＥ（配列番号７７）ペプチドを含む末端３’ドメインをコードするＤＮＡ断片を創成した。このＤＮＡ断片をプライマーとして、相補的（ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔａｒｙ）なフォワード５’プライマーとともに標準的なＰＣＲにおいて使用して、ＴＥＲ１１９−ＹＶＲＰＬＷＶＲＭＥをコードする全ＤＮＡ断片を創成した：
下線で示した配列は、クロモグラニン−Ａ（１０４０−ｐ３１）ミメトープ（ｍｉｍｅｔｏｐｅ）（ＹＶＲＰＬＷＶＲＭＥ）（配列番号７７）をコードする遺伝子セグメントを示す。このＤＮＡ断片を組換え発現のための哺乳動物および原核生物発現ベクター中に挿入した。
標準的な組換えＤＮＡ技術を使用してマウス赤血球に結合し、ＮＯＤマウス中の主要糖尿病自己抗原マウスプロインスリンをディスプレイする抗体構築物を創成した。最初に、オーバーラップエクステンションＰＣＲを使用して、ＴＥＲ１１９配列の３’末端に相補的（ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔａｒｙ）な重複５’ドメインとともに、全プロインスリンタンパク質を含む末端３’ドメインをコードするＤＮＡ断片を創成した。このＤＮＡ断片をプライマーとして、相補的（ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔａｒｙ）フォワード５’プライマーとともに標準的なＰＣＲにおいて使用して、ＴＥＲ１１９−プロインスリンをコードする全ＤＮＡ断片を創成した：
下線で示した配列は、構築物のプロインスリン遺伝子セグメントを示す。このＤＮＡ断片を組換え発現のための哺乳動物および原核生物発現ベクター中に挿入した。
実施例７
赤血球結合リガンドおよび他の機能を含む分枝鎖ポリマーの合成
８アームＰＥＧ−チオアセテートの合成のため、８アームＰＥＧ−ＯＨ（Ｎｅｋｔａｒ）をトルエン中で溶解させ、１０当量のトリエチルアミン（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、ＣＡＳ番号１２１−４４−８）および１０当量のメタンスルホニルクロリド（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、ＣＡＳ番号１２４−６３−０）とアルゴン下で室温において１８時間反応させた。残渣を濾過し、濾液を減圧下で濃縮し、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中で溶解させ、１０当量のチオ酢酸カリウム（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、ＣＡＳ番号１０３８７−４０−３）を添加した。室温において１８時間後、残渣を濾過し、濾液を減圧下で濃縮し、ジエチルエーテル中で沈殿させた。沈殿物を濾過し、減圧下で乾燥させて最終生成物を得た。
８アームＰＥＧ−ピリジルジスルフィドの合成のため、８アームＰＥＧ−チオアセテートをジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中で溶解させ、１．０５当量のナトリウムメトキシド（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、ＣＡＳ番号１２４−４１−４）によりシュレンク管中、アルゴン下で室温において１時間脱保護した。脱保護されたたチオールをチオレートに還元するため、２当量のトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＣＡＳ番号５１８０５−４５−９）および２当量の蒸留水をこの溶液に添加した。室温において２時間後、１２当量の２，２’−ジチオジピリジン（アルドリチオール−２、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、ＣＡＳ番号２１２７−０３−９）を添加し、溶液を室温において２４時間撹拌した。次いで、反応混合物を、ＭＷＣＯ３，５００Ｄａの透析チューブ中で５Ｌの蒸留水に対して４８時間透析し、その間、蒸留水を４回交換した。８アームＰＥＧ上にロードしたピリジルジスルフィドを、１００ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ８．０中２５ｍＭのＴＣＥＰ中で還元することにより定量し、３４３ｎｍにおけるＵＶ−ｖｉｓスペクトルを計測してピリジン−２−チオン脱離基の存在をモニタリングした。
８アームＰＥＧ−ピリジルジスルフィド−ＡＬＥＸＡＦＬＵＯＲ６４７の合成のため、８アームＰＥＧ−チオアセテートをＤＭＦ中で溶解させ、１．０５当量のナトリウムメトキシド（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、ＣＡＳ番号１２４−４１−４）によりシュレンク管中、アルゴン下で室温において１時間脱保護した。脱保護されたチオールをチオレートに還元するため、２当量のトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＣＡＳ番号５１８０５−４５−９）および等量の１００ｍＭのＨＥＰＥＳ ｐＨ８．０をこの溶液に添加した。室温において２時間後、０．１２５当量（８アームのうち１アームに相当）のＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７−Ｃ２−マレイミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をこの溶液に添加した。室温において２時間後、１２当量の２，２’−ジチオジピリジン（アルドリチオール−２、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、ＣＡＳ番号２１２７−０３−９）を添加し、溶液を室温において２４時間撹拌した。次いで、反応混合物を、ＭＷＣＯ３，５００Ｄａの透析チューブ中で５Ｌの蒸留水に対して４８時間透析し、その間、蒸留水を４回交換した。８アームＰＥＧ上にロードしたピリジルジスルフィドを、１００ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ８．０中２５ｍＭのＴＣＥＰ中で還元することにより定量し、３４３ｎｍにおけるＵＶ−ｖｉｓスペクトルを計測してピリジン−２−チオン脱離基の存在をモニタリングした。
３Ｍの水性グアニジン−ＨＣｌ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、ＣＡＳ番号５０−０１−１０）中で溶解させた化学量論量のペプチドを８アームＰＥＧ−ピリジルジスルフィドの水溶液に室温において添加することにより、チオール含有ペプチドを８アームＰＥＧ−ピリジルジスルフィドにコンジュゲートした。３４３ｎｍにおけるＵＶ−ｖｉｓスペクトルを計測し、ピリジン−２−チオン脱離基の存在を定量することにより、反応変換をモニタリングした。２つ以上の分子を８アームＰＥＧ−ピリジルジスルフィドにコンジュゲートすべき場合、この反応手順を同一ポット中で新たな分子を用いて繰り返した。コンジュゲーションを完了させたら、反応混合物をＺＥＢＡＳＰＩＮ脱塩カラム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上で脱塩し、精製された生成物を適切な滅菌条件下で貯蔵した。
ＯＶＡに対する寛容の誘導は、８アームＰＥＧ−ＥＲＹ１／ＭＩＳ−ＳＩＩＮＦＥＫＬコンジュゲート（ＳＩＩＮＦＥＫＬ：配列番号３）について、それをマウスに静脈内投与または血管外投与することにより実証することができる。この試験は、ヒト特異的リガンドを使用してヒトにおける寛容の誘導も示す。そのような実証において、投与後所定の日数において、マウスを屠殺し、リンパ節、脾臓、および血液を分析のため回収する。脾細胞およびリンパ節由来細胞をプレーティングし、ＯＶＡおよび／またはＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号３）ペプチドによりエクスビボで３日間再刺激し、寛容の確立された証拠であるそれらのＩＦＮγ、ＩＬ−１７ａ、ＩＬ−２、およびＩＬ−４の発現の下方調節、ならびにＴＧＦ−β１の上方調節をＥＬＩＳＡにより計測する。ＩＦＮγ、ＩＬ−１７ａ、ＩＬ−２、およびＩＬ−４の細胞内染色は、ＯＶＡおよび／またはＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号３）ペプチドによるエクスビボ再刺激から６時間後、脾細胞およびリンパ節由来細胞に対してフローサイトメトリーを使用して実施する。さらに、フローサイトメトリーを使用してリンパ節、脾臓、および血液由来細胞からのＣＤ４、ＣＤ８、および制御性Ｔ細胞の発現プロファイルを特徴決定する。さらに、種々の時点においてマウスから血液試料を採取してＯＶＡ抗原に対する液性抗体応答を計測する。エクスビボ再刺激のバリアント実験を実施して全身性寛容が確立したか否かを決定する。マウスに上記のとおり８アームＰＥＧ−ＥＲＹ１／ＭＩＳ−ＳＩＩＮＦＥＫＬコンジュゲート（ＳＩＩＮＦＥＫＬ：配列番号３）を投与し、アジュバント（リポ多糖、完全フロイントアジュバント、ミョウバンなど）とともに９日後にＯＶＡを再投与し、ＯＶＡ抗原に対する脾細胞の応答性を上記のとおりＥＬＩＳＡおよび／またはフローサイトメトリーにより評価する。８アームＰＥＧ−ＥＲＹ１−ＳＩＩＮＦＥＫＬコンジュゲート（ＳＩＩＮＦＥＫＬ：配列番号３）配合物により、脾細胞はＯＶＡおよびアジュバントによる第２のチャレンジに対して非応答性になり、それは全身性寛容の有効な確立を説明する方法である。８アームＰＥＧ−ＥＲＹ１／ＭＩＳ−ＳＩＩＮＦＥＫＬコンジュゲート配合物（ＳＩＩＮＦＥＫＬ：配列番号３）による初回投与後、寛容をさらに実証するため、同様のインビボチャレンジ実験を、トランスジェニック細胞株、例えば、実施例３に詳述される試験と同様にＯＴ−Ｉ Ｔ細胞による養子移入を用いて実施することができる。自己免疫のマウスモデルにおける免疫寛容または治療分子の脱免疫化を実証するため、ＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号３）について本明細書に記載されたものと類似の、関連抗原に対する８アームＰＥＧ構築物を作製することができる。
実施例８
アプタマーコンジュゲート抗原との非共有結合的赤血球結合を介する抗原特異的免疫学的寛容の誘導
他の非抗体生体親和性試薬を使用する方法を実施して非共有結合的赤血球結合を介して免疫学的寛容を誘導するそれらの能力を計測することができる。他のタンパク質ベースの親和性部分、例えば、設計されたアンキリンリピートタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）（Ｓｔｅｉｎｅｒ，Ｆｏｒｒｅｒ，ｅｔ ａｌ．，２００８）、設計されたアルマジロリピートタンパク質（Ｐａｒｍｅｇｇｉａｎｉ，Ｐｅｌｌａｒｉｎ，ｅｔ ａｌ．，２００８）、フィブロネクチンドメイン（Ｈａｃｋｅｌ，Ｋａｐｉｌａ，ｅｔ ａｌ．，２００８）、およびシステイン−ノット（ｋｎｏｔｔｉｎ）親和性足場（Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ，Ｌｅｖｉｎ，ｅｔ ａｌ．，２００９）を、赤血球に対する結合親和性を示すものについてスクリーニングする。
赤血球に対する高親和性ＤＮＡ／ＲＮＡアプタマーを発見するためのライブラリースクリーニングは、十分に確立された指数関数的増加によるリガンドの系統的展開（ＳＥＬＥＸ）法（Ａｒｃｈｅｍｉｘ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ，ＵＳＡ）を使用して実施する（Ｓａｍｐｓｏｎ，２００３）。高親和性で赤血球に結合する新規ＤＮＡ／ＲＮＡ配列を発見したら、抗原および／またはポリマーミセル／ナノ粒子へのコンジュゲーションのために３’または５’末端上のいずれかに追加の化学反応基を含むようにそれらを化学合成する。化学合成されたアプタマーは、例えば、赤血球結合アプタマーおよび抗原または抗原−ナノ粒子からなる単一のバイオコンジュゲートを創成するための、ナノ粒子または抗原またはナノ粒子−抗原複合体上のいずれかに存在するＣＯＯＨ基とのＥＤＣ／ＮＨＳコンジュゲーション化学反応を介してコンジュゲートされる反応性ＮＨ２基を保有する。アプタマー、抗原、および／または抗原−ナノ粒子に対するオルトゴナルな反応基およびコンジュゲーションスキームの両方を変化させることにより、種々の化学的コンジュゲーション技術が試みられている。
ＯＶＡに対する寛容の誘導を実証するため、ＯＶＡ−アプタマーまたはＯＶＡ−ナノ粒子−アプタマーコンジュゲートをマウスに静脈内投与または血管外投与する。投与後所定の日数において、マウスを屠殺し、リンパ節、脾臓、および血液を分析のために回収する。脾細胞およびリンパ節由来細胞をプレーティングし、ＯＶＡおよび／またはＳＩＩＮＦＥＫＬペプチド（配列番号３）によりエクスビボで３日間再刺激し、寛容の確立された証拠であるそれらのＩＦＮγ、ＩＬ−１７ａ、ＩＬ−２、およびＩＬ−４発現の下方調節、ならびにＴＧＦ−β１の上方調節をＥＬＩＳＡにより計測する。ＩＦＮγ、ＩＬ−１７ａ、ＩＬ−２、およびＩＬ−４の細胞内染色は、ＯＶＡおよび／またはＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号３）ペプチドによるエクスビボ再刺激から６時間後、脾細胞およびリンパ節由来細胞に対してフローサイトメトリーを使用して実施する。さらに、フローサイトメトリーを使用してリンパ節、脾臓、および血液由来細胞からのＣＤ４、ＣＤ８、および制御性Ｔ細胞の発現プロファイルを特徴決定する。さらに、種々の時点においてマウスから血液試料を採取してＯＶＡ抗原に対する液性抗体応答を計測する。エクスビボ再刺激のバリアント実験を実施して全身性寛容が確立したか否かを決定する。マウスに上記のとおりＯＶＡ−抗体またはＯＶＡ−抗体−ナノ粒子コンジュゲートを投与し、アジュバント（リポ多糖、完全フロイントアジュバント、ミョウバンなど）とともに９日後にＯＶＡを再投与し、ＯＶＡ抗原に対する脾細胞の応答性を上記のとおりＥＬＩＳＡおよび／またはフローサイトメトリーにより評価する。ＯＶＡ−抗体および／またはＯＶＡ−抗体−ナノ粒子配合物により、脾細胞がＯＶＡおよびアジュバントによる第２のチャレンジに対して非応答性になることが予測され、それにより全身性寛容の有効な確立が説明される。ＯＶＡ−アプタマーおよび／またはＯＶＡ−アプタマー−ナノ粒子配合物による初回投与後、寛容を実証するため、同様のインビボチャレンジ実験を、トランスジェニック細胞株、例えば、実施例３に詳述される試験と同様にＯＴ−Ｉ Ｔ細胞による養子移入を用いて実施する。自己免疫のマウスモデルにおける免疫寛容または治療分子の脱免疫化を実証するため、ＯＶＡについて本明細書に記載されたものと類似の、関連抗原に対するアプタマー構築物を作製する。
実施例９
ヒト赤血球への結合の特徴決定
非細胞ディスプレイ状況においてヒト赤血球に結合した選択された細菌ディスプレイペプチドを特徴決定するため、ペプチドを化学合成し、蛍光タンパク質アロフィコシアニン（ＡＰＣ）にコンジュゲートした。この様式において、それぞれのペプチドの赤血球結合能を、可溶性状況において、すなわち、タンパク質コンジュゲートとして特徴決定した。図６に実証されるとおり、ペプチドＥＲＹ６４、ＥＲＹ１２３、およびＥＲＹ１４１が、ヒト赤血球にＡＰＣのコンジュゲートとして結合した。
ＡＰＣ−ペプチドコンジュゲーション法
ＰｏｌｙＰｅｐｔｉｄｅ Ｇｒｏｕｐ（Ｓｔｒａｓｂｏｕｒｇ，Ｆｒａｎｃｅ）からの標準的なｆｍｏｃ固相ペプチド合成を介してペプチドをオーダーおよびカスタム合成した。３Ｍのグアニジン−ＨＣｌ中に溶解させた１０当量のペプチドを、ＰＢＳ中２ｍｇ／ｍＬのマレイミド活性化ＡＰＣ（ＩｎｎｏｖａＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）に添加した。４℃において４時間インキュベートした後、反応物を２ｍＬのＺＥＢＡ Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ Ｃｏｌｕｍｎ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上で脱塩し、４℃において貯蔵した。
フローサイトメトリー法による赤血球結合の定量
新たに単離されたヒト血液を、２０ｍｇ／ｍＬのＢＳＡが補充されたＰＢＳ中で１００倍に溶解させた。５×１０５個の赤血球を１５０μＬの１μＭのＡＰＣ−ペプチドコンジュゲートに添加し、３７Ｃにおいて４５分間インキュベートした。細胞をＰＢＳ＋２０ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ中で十分に洗浄し、ＣｙＡｎ ＡＤＰフローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）によりＡＰＣ蛍光について分析した。
実施例１０
単鎖抗体融合抗原との赤血球結合を介する抗原特異的免疫学的寛容の誘導
ＯＶＡのＭＨＣ−Ｉ免疫優性ドメインＳＩＩＮＦＥＫＬへのｓｃＦｖの組換え融合物を創成した。得られたｓｃＦｖ（本明細書においてＴＥＲ１１９−ＳＩＩＮＦＥＫＬと称される）は、図７にフローサイトメトリーにより実証されるとおり、マウス赤血球に結合した。
ＥＲＹ１−ＯＶＡは、本明細書においてこの寛容を誘導することが既に示されているため、それは、免疫学的イベントを特徴決定するために有用な系である。ＥＲＹ１−ＯＶＡの赤血球結合は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）によるＯＶＡ免疫優性ＭＨＣ Ｉエピトープ（ＳＩＩＮＦＥＫＬ）の有効なクロスプレゼンテーションおよび対応する反応性Ｔ細胞のクロスプライミングを起こすことが決定された。ＣＦＳＥ標識ＯＴ−Ｉ ＣＤ８＋Ｔ細胞（ＣＤ４５．２＋）をＣＤ４５．１＋マウス中に養子移入し、次いで１０μｇのＯＶＡ、１０μｇのＥＲＹ１−ＯＶＡ、等モル用量のＴＥＲ１１９−ＳＩＩＮＦＥＫＬ、または等モル用量のＳＩＩＮＦＥＫＬの静脈内投与後５日にわたり、ＯＴ−Ｉ ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を計測した。フローサイトメトリーにより計測された、蛍光ＣＦＳＥの希釈により測定されたＯＴ−Ｉ ＣＤ８＋Ｔ細胞増殖は、ＥＲＹ１−ＯＶＡまたはＯＶＡと比較してＴＥＲ１１９−ＳＩＩＮＦＥＫＬが投与されたマウスにおいて顕著に向上し（図８）、赤血球結合が、可溶性抗原ＳＩＩＮＦＥＫＬと比較して抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞クロスプライミングを増加させたことが実証された。
機能性エフェクター表現型に拡張されるＴ細胞と、増大および欠失されるＴ細胞とを区別するため、増殖ＯＴ−Ｉ ＣＤ８＋Ｔ細胞を、アポトーシス、したがって欠失の特徴としてのアネキシン−Ｖ、および疲弊マーカーｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｄｅａｔｈ−１（ＰＤ−１）について分析した。ＴＥＲ１１９−ＳＩＩＮＦＥＫＬおよびＥＲＹ１−ＯＶＡは、ＯＶＡよりもかなり多い数のアネキシン−Ｖ＋およびＰＤ−１＋増殖ＯＴ−Ｉ ＣＤ８＋Ｔ細胞を誘導した（図９）。
確立されたＯＴ−Ｉチャレンジ対寛容モデル（Ｌｉｕ，Ｉｙｏｄａ，ｅｔ ａｌ．，２００２）を使用して、極めて強力な細菌由来アジュバントを含むチャレンジを用いてもワクチン媒介性抗原チャレンジに対する後続の免疫応答を予防するＴＥＲ１１９−ＳＩＩＮＦＥＫＬおよびＥＲＹ１−ＯＶＡの能力が実証された。寛容化するため、ＯＴ−Ｉ ＣＤ８＋（ＣＤ４５．２＋）Ｔ細胞の養子移入から１および６日後、１０μｇのＯＶＡまたはＥＲＹ１−ＯＶＡのいずれか、または等モル用量のＴＥＲ１１９−ＳＩＩＮＦＥＫＬをＣＤ４５．１＋マウスに静脈内投与した。さらに９日後、移入されたＴ細胞の潜在的欠失を可能とするため、次いで、リポ多糖（ＬＰＳ）がアジュバント添加されたＯＶＡをレシピエントマウスに皮内注射によりチャレンジした。チャレンジから４日後、流入領域リンパ節および脾細胞の特徴決定ならびにそれらの炎症応答により、欠失が実際に生じたか否かを決定することができた。
ＴＥＲ１１９−ＳＩＩＮＦＥＫＬまたはＥＲＹ１−ＯＶＡの静脈内投与は、ＬＰＳによる抗原チャレンジ前に非修飾ＯＶＡが投与されたマウスと比較して、流入領域リンパ節および脾臓中のＯＴ−Ｉ ＣＤ８＋Ｔ細胞集団の顕著な減少をもたらし、欠失性寛容が実証された。ＥＲＹ１−ＯＶＡにより処置されたマウスからの流入領域リンパ節は、ＯＶＡにより処置されたマウスと比較して１１倍超少ないＯＴ−Ｉ ＣＤ８＋Ｔ細胞を含有し、抗原の静脈内注射を受けなかったチャレンジ対照マウスよりも３９倍少ないＯＴ−Ｉ ＣＤ８＋Ｔ細胞を含有し；脾細胞における応答も同様であった。ＴＥＲ１１９−ＳＩＩＮＦＥＫＬにより処置されたマウスからの流入領域リンパ節は、ＯＶＡにより処置されたマウスと比較して１３倍超少ないＯＴ−Ｉ ＣＤ８＋Ｔ細胞を含有し、抗原の静脈内注射を受けなかったチャレンジ対照マウスよりも４２倍超少ないＯＴ−Ｉ ＣＤ８＋Ｔ細胞を含有し；脾細胞における応答も同様であった。ＴＥＲ１１９−ＳＩＩＮＦＥＫＬまたはＥＲＹ１−ＯＶＡが投与されたマウスにおいて示されたこの有効なクローン欠失は、ＯＴ−Ｉ ＣＤ８＋Ｔ細胞のクロスプライミングの向上という早期の観察結果を支持し（図８）、さらにクロスプライミングが、共刺激分子のＡＰＣ提示の不存在下で生じ、欠失性寛容を起こしたことを示す。
抗原チャレンジ後の免疫応答をさらに評価するため、常在性のリンパ節および脾細胞の炎症性質を、ＯＴ−Ｉ ＣＤ８＋Ｔ細胞によるインターフェロン−γ（ＩＦＮγ）の発現により特徴決定した（図１０）。ＯＶＡおよびＬＰＳによるチャレンジ後、ＥＲＹ１−ＯＶＡにより予め処置されたマウスのリンパ節は、チャレンジ対照マウス（抗原を予め受けていない）と比較して１０倍少ないＩＦＮγ発現細胞を保有し、等用量のＯＶＡにより予め処置されたマウスと比較して４倍超少ないＩＦＮγ発現細胞を保有した。ＯＶＡおよびＬＰＳによるチャレンジ後、ＴＥＲ１１９−ＳＩＩＮＦＥＫＬにより予め処置されたマウスのリンパ節は、チャレンジ対照マウス（抗原を予め受けていない）と比較して３３倍少ないＩＦＮγ発現細胞を保有し、等用量のＯＶＡにより予め処置されたマウスと比較して１４倍超少ないＩＦＮγ発現細胞を保有し、チャレンジに対する寛容誘発保護における赤血球結合の重要性が実証され；脾細胞における応答も同様であった。
動物方法
スイス獣医当局は既に全ての動物処置を承認した。Ｃ５７ＢＬ／６−Ｔｇ（ＴｃｒａＴｃｒｂ）１１００Ｍｊｂ（ＯＴ−Ｉ）マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｓ）をＥＰＦＬ動物施設において飼育し、脾細胞単離には６〜１２週齢の雌を使用した。８〜１２週齢の雌Ｂ６．ＳＪＬ−ＰｔｐｒｃａＰｅｐｃｂ／Ｂｏｙ（ＣＤ４５．１）マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）を、ＯＴ−Ｉ ＣＤ８＋Ｔ細胞の養子移入および寛容誘発試験のためのレシピエント宿主として使用した。
ペプチド設計および合成法
は、ＴＧＲ樹脂（Ｎｏｖａ Ｂｉｏｃｈｅｍ）を使用して自動リキッドハンドラー（Ｃｈｅｍｓｐｅｅｄ）により標準的な固相ｆ−ｍｏｃ化学反応を使用して合成した。下線で示した配列は、本発明者らがファージディスプレイによりマウスグリコホリン−Ａ結合剤として以前に発見したＥＲＹ１の１２−ｍｅｒ配列である（Ｋｏｎｔｏｓ ａｎｄ Ｈｕｂｂｅｌｌ，２０１０）。ＧＧＳＧ領域は、コンジュゲーションに使用されるシステイン残基へのリンカーとして機能し；フランキングするアルギニン残基はｐＫａを低下させ、したがってシステイン残基の反応性を増加させるように機能した（Ｌｕｔｏｌｆ，Ｔｉｒｅｌｌｉ，ｅｔ ａｌ．，２００１）。ペプチドは、９５％のトリフルオロ酢酸、２．５％のエタンジチオール、２．５％の水中で樹脂から３時間開裂させ、氷冷ジエチルエーテル中で沈殿させた。精製は、Ｃ１８逆相カラム（ＰｅｒＳｐｅｃｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して分取ＨＰＬＣ−ＭＳ（Ｗａｔｅｒｓ）上で実施した。
ＥＲＹ１−抗原コンジュゲーション法
ジメチルホルムアミド中で溶解させた１０モル当量のスクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ、ＣＡＳ番号６４９８７−８５−５、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）をＰＢＳ中５ｍｇ／ｍＬのエンドトキシンフリー（＜１ＥＵ／ｍｇ）ＯＶＡ（Ｈｙｇｌｏｓ ＧｍｂＨ）と室温において１時間反応させた。２ｍＬのＺＥＢＡ脱塩スピンカラム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上での脱塩後、３Ｍのグアニジン−ＨＣｌ中で溶解させた１０当量のＥＲＹ１ペプチドを添加し、室温において２時間反応させた。コンジュゲートを２ｍＬのＺｅｂａ脱塩スピンカラムを使用して脱塩し、０．２μｍ滅菌濾過し、作業アリコートに分注し、−２０Ｃにおいて貯蔵した。タンパク質濃度は、ＢＣＡ Ａｓｓａｙ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を介して測定した。このスキームは、ペプチド上のシステイン側鎖と抗原上のリジン側鎖とのコンジュゲーションをもたらす。
Ｔ細胞養子移入法
ＣＤ８磁気ビーズネガティブ選択キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を製造業者の説明書に従って使用してＯＴ−Ｉ（ＣＤ４５．２＋）マウス脾臓からのＣＤ８＋Ｔ細胞を単離した。新たに単離されたＣＤ８＋ＯＴ−Ｉ細胞をＰＢＳ中で再懸濁し、１μＭのカルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により室温において６分間標識し、１０％のＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）を有する等容量のＩＭＤＭにより反応を１分間クエンチした。細胞を洗浄し、カウントし、注射前に純粋なＩＭＤＭ中で再懸濁した。３×１０６個のＣＦＳＥ標識ＣＤ８＋ＯＴ−Ｉ細胞をレシピエントＣＤ４５．１＋マウスの尾静脈中に静脈内注射した。短期増殖試験のため、１０μｇのＥＲＹ１−ＯＶＡもしくはＯＶＡ、または等モル用量のＴＥＲ１１９−ＳＩＩＮＦＥＫＬを１００μＬの容量で養子移入から２４時間後に注射した。脾細胞を抗原投与から５日後に回収し、フローサイトメトリーによる分析のために染色した。
ＯＴ−Ｉ寛容およびチャレンジモデル法
３×１０５個のＣＦＳＥ標識ＯＴ−Ｉ ＣＤ８＋Ｔ細胞を上記のとおりＣＤ４５．１＋レシピエントマウス中に注射した。養子移入から１および６日後に、マウスの尾静脈中に１００μＬの生理食塩水中１０μｇのＥＲＹ１−ＯＶＡもしくはＯＶＡ、または等モル用量のＴＥＲ１１９−ＳＩＩＮＦＥＫＬを静脈内投与した。養子移入から１５日後、５μｇのＯＶＡおよび２５ｎｇの超高純度の大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＬＰＳ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）を２５μＬでマウスのそれぞれの後肢肉趾中に皮内チャレンジした（Ｈｏｃｋ法、１０μｇのＯＶＡおよび５０ｎｇのＬＰＳの総用量）。マウスをチャレンジから４日後に屠殺し、再刺激のために脾臓および流入領域リンパ節細胞を単離した。細胞内サイトカインのフローサイトメトリー分析のため、細胞を１ｍｇ／ｍＬのＯＶＡまたは１μｇ／ｍＬのＳＩＩＮＦＥＫＬペプチド（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ）の存在下で３時間再刺激した。ブレフェルジン−Ａ（Ｓｉｇｍａ、５μｇ／ｍＬ）を添加し、染色およびフローサイトメトリー分析前に再刺激をさらに３時間再開した。
抗体およびフローサイトメトリー法
フローサイトメトリーには以下の抗マウス抗体：ＣＤ１ｄ Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ、ＣＤ３ε ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５、ＣＤ８α ＰＥ−Ｃｙ７、ＣＤ４５．２ Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ、ＩＦＮγ−ＡＰＣ、ＣＤ８α ＡＰＣ−ｅＦ７８０（全てｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ製）のほか、ｆｉｘａｂｌｅ ｌｉｖｅ／ｄｅａｄ色素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、およびアネキシン−Ｖ−Ｃｙ５標識キット（ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ）を使用した。試料は、ＣｙＡｎ ＡＤＰフローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）により分析した。最初に細胞をＰＢＳにより洗浄し、ｌｉｖｅ／ｄｅａｄ色素により氷上で２０分間染色し、２４Ｇ２ハイブリドーマ培地により氷上で２０分間ブロッキングし、氷上で２０分間表面染色し、２％のパラホルムアルデヒドにより氷上で２０分間固定し、０．５％のサポニンの存在下で氷上で４５分間細胞内染色し、次いで分析前に最後の洗浄を行った。アポトーシス染色のため、アネキシン−Ｖ−Ｃｙ５を分析５分前に添加した。
実施例１１
赤血球結合ペプチドおよびコンジュゲートされた抗原の融合分子を介する治療タンパク質に対する抗原特異的免疫学的寛容の創成
マウス赤血球特異的ペプチドＥＲＹ１（Ｋｏｎｔｏｓ ａｎｄ Ｈｕｂｂｅｌｌ，２０１０）をコンジュゲートすることにより、アスパラギナーゼのマウス赤血球結合バリアント（ＥＲＹ１−ＡＳＮアーゼ）を創成した。野生型アスパラギナーゼに対する赤血球結合の免疫原性を測定するため、２つのレジメン、すなわち、２用量および６用量レジメンのＥＲＹコンジュゲート（ＥＲＹ１−ＡＳＮアーゼ）またはネイティブ形態（ＡＳＰＡＲＡＧＩＮＡＳＥ ＭＥＤＡＣ，Ｍｅｄａｃ ＧｍｂＨ；それをＥＲＹ１−ＡＳＮアーゼコンジュゲートのための原料としても使用した）への曝露を評価するための評価するための試験を実施した。それぞれのレジメンにおいて、１５μｇのＥＲＹ１−ＡＳＮアーゼまたはＡＳＮアーゼを２日毎に静脈内投与し、血液を７日毎に採取した。
治療用量における曝露後、抗体力価を種々の時点において、最終注射から２１日後まで計測した。結果は、赤血球コンジュゲーションを介する免疫原性の膨大な低減を明確に示し、２用量レジメンおよび６用量レジメン系列において抗体は全く観察されなかった（図１１）。対照的に、野生型ネイティブアスパラギナーゼ（製品ＡＳＰＡＲＡＧＩＮＡＳＥ ＭＥＤＡＣにおいて現在臨床使用されている）は、２用量レジメン後にも活発な免疫を誘導した。
赤血球結合アスパラギナーゼが野生型アスパラギナーゼに対する真正の免疫寛容を誘導するか否かを決定するための予防試験を実施した。野生型臨床アスパラギナーゼが予め投与されたマウスに、液性免疫の発症後に追加の用量をチャレンジした。抗体レベルは、タンパク質の再投与後に増加し、または高いままであり；このことは、治療剤に対する過敏およびショック反応の危険な臨床的状況の代表例である。ＥＲＹ１−コンジュゲートアスパラギナーゼにより予め処置されたマウスは、野生型アスパラギナーゼによる６回のチャレンジ後でも強力な抗体応答を誘導し得なかった。平均して、赤血球結合アスパラギナーゼにより寛容化されたマウスは、臨床野生型アスパラギナーゼに対して約６０００倍少ない抗体を発達させた。
ＥＲＹ１−ＡＳＮアーゼコンジュゲーション法
ジメチルホルムアミド中で溶解させた１０モル当量のスクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ、ＣＡＳ番号６４９８７−８５−５、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を、ＰＢＳ中５ｍｇ／ｍＬのＡｓｐａｒａｇｉｎａｓｅ Ｍｅｄａｃと室温において２時間反応させた。２ｍＬのＺＥＢＡ脱塩スピンカラム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上での脱塩後、３Ｍのグアニジン−ＨＣｌ中で溶解させた２．５当量のＥＲＹ１ペプチドを添加し、室温において２時間反応させた。コンジュゲートを２ｍＬのＺｅｂａ脱塩スピンカラムを使用して脱塩し、０．２μｍ滅菌濾過し、作業アリコートに分注し、−２０Ｃにおいて貯蔵した。タンパク質濃度は、ＢＣＡ Ａｓｓａｙ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を介して測定した。このスキームは、ペプチド上のシステイン側鎖とタンパク質上のリジン側鎖とのコンジュゲーションをもたらす。
フローサイトメトリー結合検出法
新たに単離されたヒト血液を、２０ｍｇ／ｍＬのＢＳＡが補充されたＰＢＳ中に１００倍希釈した。約５００，０００個の赤血球を１００ｎＭのアスパラギナーゼに添加し、３７Ｃにおいて１時間インキュベートした。洗浄後、細胞をヤギ抗アスパラギナーゼ（Ａｂｎｏｖａ）と氷上で３０分間インキュベートした。第２の洗浄ラウンド後、細胞をＡＬＥＸＡＦＬＵＯＲ４８８コンジュゲート抗ヤギＩｇＧ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と氷上で２０分間インキュベートした。最終洗浄後、細胞をフローサイトメトリーにより分析して赤血球結合アスパラギナーゼについて検出した。
アスパラギナーゼ投与法
所望の投与量のＥＲＹ１−ＡＳＮアーゼまたはＡＳＮアーゼを、滅菌０．９％生理食塩水中で調製し、１００μＬの溶液を麻酔されたＣ５７ＢＬ／６マウスの尾静脈中に注射した。血液を所定の時点において頬穿刺または尾切開のいずれかにより採取した。
血清からの抗アスパラギナーゼ抗体検出法
実験群からの血清をＰＢＳ中に段階希釈し、ＡＳＮアーゼコートＥＬＩＳＡプレート上で室温において２時間インキュベートした。ＨＲＰコンジュゲート抗マウスＩｇＧ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を検出抗体として使用した。
実施例１２
免疫反応後に寛容を創成するための免疫反転
治療タンパク質または関心対象のタンパク質に対する免疫（抗薬物抗体の存在により例示される）が患者中で既に誘導されている臨床例において、薬物に対する免疫応答を反転させ、したがって治療剤のさらなる使用を可能とすることが望ましい。ここでも、臨床的に利用可能な微生物酵素アスパラギナーゼを本実施例において使用し、アスパラギナーゼに対する既存の免疫を有するマウス中の治療タンパク質に対する寛容の誘導を実証した。マウス赤血球特異的ペプチドＥＲＹ１をコンジュゲートすることにより、アスパラギナーゼのマウス赤血球結合バリアント（ＥＲＹ１−ＡＳＮアーゼ）を創成した。
赤血球結合アスパラギナーゼが臨床アスパラギナーゼに対する免疫を反転させ得たか否かを決定するためのクロスオーバー試験を実施した。マウスに複数用量の野生型アスパラギナーゼを２日間の間隔を置いて静脈内投与した。投与２１日後、高レベルの抗アスパラギナーゼ抗体が血清中で検出された。次いで、免疫化されたマウスを、種々の用量における赤血球結合アスパラギナーゼレジメンにより治療的に処置した。両方の投与レジメンにおいて、ＥＲＹコンジュゲートアスパラギナーゼは、抗体レベルを約１０倍低減させ、したがって、既存の液性免疫を反転させた。
ＥＲＹ１−ＡＳＮアーゼコンジュゲーション法
ジメチルホルムアミド中で溶解させた１０モル当量のスクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ、ＣＡＳ番号６４９８７−８５−５、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を、ＰＢＳ中５ｍｇ／ｍＬのＡＳＰＡＲＡＧＩＮＡＳＥ ＭＥＤＡＣと室温において２時間反応させた。２ｍＬのＺＥＢＡ脱塩スピンカラム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上での脱塩後、３Ｍのグアニジン−ＨＣｌ中で溶解させた２．５当量のＥＲＹ１ペプチドを添加し、室温において２時間反応させた。コンジュゲートを２ｍＬのＺＥＢＡ脱塩スピンカラムを使用して脱塩し、０．２μｍ滅菌濾過し、作業アリコートに分注し、−２０Ｃにおいて貯蔵した。タンパク質濃度は、ＢＣＡ Ａｓｓａｙ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を介して測定した。このスキームは、ペプチド上のシステイン側鎖とタンパク質上のリジン側鎖とのコンジュゲーションをもたらす。
フローサイトメトリー結合検出法
新たに単離されたヒト血液を、２０ｍｇ／ｍＬのＢＳＡが補充されたＰＢＳ中に１００倍希釈した。約５００，０００個の赤血球を１００ｎＭのアスパラギナーゼに添加し、３７Ｃにおいて１時間インキュベートした。洗浄後、細胞をヤギ抗アスパラギナーゼ（Ａｂｎｏｖａ）と氷上で３０分間インキュベートした。第２の洗浄ラウンド後、細胞をＡＬＥＸＡＦＬＵＯＲ４８８コンジュゲート抗ヤギＩｇＧ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と氷上で２０分間インキュベートした。最終洗浄後、細胞をフローサイトメトリーにより分析して赤血球結合アスパラギナーゼについて検出した。
アスパラギナーゼ投与法
所望の投与量のＥＲＹ１−ＡＳＮアーゼまたはＡＳＮアーゼを、滅菌０．９％生理食塩水中で調製し、１００μＬの溶液を麻酔されたＣ５７ＢＬ／６マウスの尾静脈中に注射した。血液を所定の時点において頬穿刺または尾切開のいずれかにより採取した。
血清からの抗アスパラギナーゼ抗体検出法
実験群からの血清をＰＢＳ中に段階希釈し、ＡＳＮアーゼコートＥＬＩＳＡプレート上で室温において２時間インキュベートした。ＨＲＰコンジュゲート抗マウスＩｇＧ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を検出抗体として使用した。
実施例１３
マウスおよび／またはヒト赤血球に結合する抗体および抗体断片の開発
いくつかの赤血球結合抗原構築物を創成した。これらとしては、タンパク質レベルに関するもの：ＴＥＲ１１９−ＳＩＩＮＦＥＫＬ、ＴＥＲ１１９−ＣｈｒＡ、およびＴＥＲ１１９−プロインスリンが挙げられる。これらとしては、遺伝子レベルに関するもの：ＴＥＲ１１９−ＳＩＩＮＦＥＫＬ、ＴＥＲ１１９−ＣｈｒＡ ＴＥＲ１１９−プロインスリン、ＴＥＲ１１９−ウリカーゼ、ＴＥＲ１１９−ＩｎｓＢ９−２３、ＴＥＲ１１９−ＩＳＱＡＶＨＡＡＨＡＥＩＮＥＡＧＲ（配列番号８０）、ＴＥＲ１１９−Ｈ−２ｋｂ、ＴＥＲ１１９−Ｈ−２ｋｄ、１０Ｆ７−ＳＩＩＮＦＥＫＬ、１０Ｆ７−ＣｈｒＡ、１０Ｆ７−プロインスリン、および１０Ｆ７−ウリカーゼも挙げられる。
方法
ＴＥＲ−１１９ハイブリドーマクローンからのｍＲＮＡを、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｇｅｎｅｖａ，ＳｗｉｔｚｅｒｌａｎｄのＳｈｏｚｏ Ｉｚｕｉ教授からの寄贈品として得た。ＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴ ＩＩＩ ＦＩＲＳＴ ＳＴＲＡＮＤ ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ ＳＹＳＴＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して標準的な逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）を実施し、クローンの相補的（ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔａｒｙ）ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を創成した。次いで、以下のプライマーセットを使用してＰＣＲを実施して抗体の可変重鎖（ＶＨ）および可変軽鎖（ＶＬ）領域のＤＮＡ配列を特異的に増幅した。
次いで、増幅されたＶＨおよびＶＬ遺伝子を制限エンドヌクレアーゼ（ＶＬについてはＮｃｏＩおよびＮｏｔＩ、ＶＨについてはＮｄｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ）により消化し、遺伝子断片を、アガロース電気泳動後に標準的なキット（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｏｒａｎｇｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して精製し、クローニングプラスミドｐＭＡＺ３６０中にライゲートした。次いで、クローニングプラスミドをシーケンシングしてＴＥＲ１１９のＶＨおよびＶＬ遺伝子のＤＮＡ配列を決定した。
ＴＥＲ１１９および１０Ｆ７−抗原ＤＮＡ構築物を設計し、ＤＮＡ２．０（Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ，ＣＡ，ＵＳＡ）から商業的に合成し、得た。
それぞれの最終的に完成したｓｃＦｖ遺伝子をＳｆｉＩおよびＸｈｏＩ（ＮＥＢ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ，ＵＳＡ）により消化し、ｐＳｅｃＴａｇＡ哺乳動物発現プラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）上の同一部位中にライゲートした。
実施例１４
赤血球結合糖尿病抗原を使用する糖尿病誘発抗原に対する寛容の誘導
クロモグラニン−Ａミモトープペプチド（１０４０−ｐ３１またはＣｈｒＡと称される）を、ペプチドをマウス赤血球特異的ｓｃＦｖのＴＥＲ１１９に組換え融合することによりマウス赤血球に結合するようにエンジニアリングした。得られたｓｃＦｖは、本明細書においてＴＥＲ１１９−ＣｈｒＡと称され、マウス赤血球にタイトに結合した（データ示さず）。クロモグラニン−Ａ抗原バリアントに対するＴ細胞挙動を試験するため、クロモグラニン−Ａ抗原の認識に特異的なＴ細胞を保有するＮＯＤＢＤＣ２．５トランスジェニックマウスを使用した。ＴＥＲ１１９−ＣｈｒＡが、ＢＤＣ２．５Ｔ細胞プライミングに十分な様式で処理され、主要組織適合性ＩＩ型（ＭＨＣ−ＩＩ）複合体上でディスプレイされたか否かを決定するため、抗原をＢＤＣ２．５脾臓樹状細胞およびＣＤ４Ｔ細胞を有する共培養系に添加した。図１２に実証されるとおり、ＴＥＲ１１９−ＣｈｒＡが有効に処理され、正確な抗原性ドメインがＭＨＣ−ＩＩ上でディスプレイされ、インビボでのＴ細胞寛容に必要であるトランスジェニックＢＤＣ２．５ＣＤ４Ｔ細胞の抗原特異的増殖がインビボでプライミングされた。
インビボでのＣＤ４増殖に対する自己抗原の赤血球結合の結果を決定するため、蛍光分子ＣＦＳＥにより標識されたＢＤＣ２．５ＣＤ４Ｔ細胞を使用して同様の増殖試験を実施した。標識されたＢＤＣ２．５ＣＤ４Ｔ細胞を未処置ＮＯＤマウス中に養子移入した後、１０μｇのＴＥＲ１１９−ＣｈｒＡまたは等モル用量のフリー可溶性１０４０−ｐ３１ペプチドを静脈内投与した。図１３において実証されるとおり、ＴＥＲ１１９−ＣｈｒＡにより処置されたマウスは、脾臓および膵臓リンパ節（ｐＬＮ）の両方において可溶性１０４０−ｐ３１ペプチドにより処置されたマウスと比較してかなり少ない非増殖ＢＤＣ２．５ＣＤ４Ｔ細胞を保有した。これらのデータにより、赤血球結合抗原が、可溶性抗原と機能的に区別される様式で強力な抗原特異的ＣＤ４Ｔ細胞シグナリングおよびプライミングを駆動することが実証され、ＣＤ８Ｔ細胞欠失性寛容の本発明者らの詳細な調査と類似する。全身（脾臓）および局所（膵臓リンパ節）糖尿病誘発Ｔ細胞のそのような顕著な低減は、疾患発症の管理のための好ましいアウトカムの明らかな肯定的指標である。
実施例１５
インスリンに対する寛容の誘導
本明細書において既に実証されているとおり（例えば、実施例１４参照）、寛容は種々の抗原に対して創成することができる。本実施例は、インスリンに対する寛容をいかに創成することができるかを記載する。糖尿病誘発Ｔ細胞により認識される別の膵島抗原であるインスリンに対する寛容を誘導するため、インスリンを、マウス赤血球特異的ｓｃＦｖのＴＥＲ１１９への組換え融合により、マウス赤血球に結合するようにエンジニアリングする。得られたｓｃＦｖは、本明細書においてＴＥＲ１１９−プロインスリンと称され、自然発症Ｔ１Ｄの慣用のマウスモデル、すなわち、ＮＯＤ／ＳｈｉＬｔマウス中で実現させる。ＮＯＤ／ＳｈｉＬｔマウスは、インスリン産生膵臓組織の免疫細胞媒介性破壊を自然に受け、したがって、高血糖症および疾患の臨床的発症が誘導される。同様に、ヒトインスリンおよびヒト赤血球結合因子を使用してヒト中のインスリンに対する寛容を創成することができる。
このロバストな自然自己免疫マウスモデル中の寛容を実証するため、ＴＥＲ１１９−プロインスリンを、幼若（約３週齢）マウスに種々の時間間隔および用量において投与してインスリン反応性Ｔ細胞を機能的に不活化および／または欠失させることができる。処置されたマウスのグルコースレベルをモニタリングして高血糖症および疾患の臨床的発症を評価する。ＴＥＲ１１９−プロインスリンは、治療モードにおいても使用して疾患の寛解を誘導する。そのような試験において、ＴＥＲ１１９−プロインスリンを初発高血糖症マウスに種々の用量および時間間隔において投与し、グルコースレベルをモニタリングして高血糖症の低減およびホメオスタシスへの回帰を評価し、したがって、Ｔ１Ｄの臨床的発症の寛解が実証された。
実施例１６
赤血球結合ＭＨＣ分子の使用による細胞グラフトおよび移植片に対する寛容の創成
グラフトの寛容を創成する方法を例として提供する。赤血球結合ペプチドを可溶性ＭＨＣドメインに化学的にコンジュゲートすることにより、赤血球結合ＭＨＣ分子をエンジニアリングする。あるいは、ＭＨＣ分子を赤血球特異的ｓｃＦｖとの融合物として組換え発現させることができる。
赤血球結合によるＭＨＣ分子に対する寛容を実証するため、細胞グラフト導入、例えば、腫瘍グラフト、皮膚グラフト、膵島移植片、および造血細胞移植片のマウスモデルを実施する。それぞれの試験において、宿主マウスを、グラフト処置前またはその間の赤血球結合ＭＨＣの投与によりドナーＭＨＣクラスに対して寛容化する。それぞれの試験に適切な方法；すなわち、腫瘍グラフトにおける腫瘍成長の計測、皮膚移植片における組織壊死または成長のモニタリング、膵島移植片における膵島塊および血糖のモニタリング、ならびに造血細胞移植片におけるキメラ現象の特徴決定を使用してグラフト受容性をモニタリングする。
さらなる開示
一実施形態は、免疫寛容を生成する方法であって、寛容誘発抗原および患者中の赤血球に特異的に結合し、それにより抗原を赤血球に結合する赤血球結合部分を含む分子融合物を含む組成物を投与することを含み、分子融合物を、寛容誘発抗原を含む物質に対する免疫寛容を生成するために有効な量で投与する方法である。一実施形態は、分子融合物が、抗原に直接共有結合している少なくとも１つの赤血球結合部分からなる方法であり、例えば、融合タンパク質は、その部分および抗原を含む。一実施形態は、分子融合物が、抗原に結合しているまたは抗原を含有する粒子に結合している少なくとも１つの赤血球結合部分を含み、例えば、粒子はマイクロ粒子、ナノ粒子、リポソーム、ポリマーソーム、およびミセルからなる群から選択される方法である。一実施形態は、寛容誘発抗原が治療タンパク質の一部を含み、例えば、タンパク質は第ＶＩＩＩ因子または第ＩＸ因子を含む事例である。一実施形態は、寛容誘発抗原が非ヒトタンパク質の一部を含む事例である。一実施形態は、タンパク質がアデノシンデアミナーゼ、Ｌ−アスパラギナーゼ、ラスブリカーゼ、抗胸腺細胞グロブリン、Ｌ−アルギナーゼ、およびＬ−メチオナーゼを含む事例である。一実施形態は、患者がヒトであり、寛容誘発抗原が天然では見出されないタンパク質の一部を含む方法である。一実施形態は、患者がヒトであり、寛容誘発抗原が、非ヒトグリコシル化を含むタンパク質のグリカンを含む事例である。一実施形態は、寛容誘発抗原が、ヒト移植抗原の少なくとも一部を含む事例である。一実施形態は、寛容誘発抗原が、例えば、プレプロインスリン、プロインスリン、インスリン、ＧＡＤ６５、ＧＡＤ６７、ＩＡ−２、ＩＡ−２β、サイログロブリン、甲状腺ペルオキシダーゼ、サイロトロピン受容体、ミエリン塩基性タンパク質、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質、プロテオリピドタンパク質、コラーゲンＩＩ、コラーゲンＩＶ、アセチルコリン受容体、マトリックスメタロプロテイン１および３、分子シャペロン熱ショックタンパク質４７、フィブリリン−１、ＰＤＧＦ受容体α、ＰＤＧＦ受容体β、ならびに核タンパク質ＳＳ−Ａからなる群から選択されるヒト自己免疫疾患タンパク質の一部を含む事例である。一実施形態は、寛容誘発抗原が、例えば、コンアラキン（Ａｒａ ｈ１）、アレルゲンＩＩ（Ａｒａ ｈ２）、ピーナッツアグルチニン（Ａｒａ ｈ６）、α−ラクトアルブミン（ＡＬＡ）、ラクトトランスフェリン、グルテイン、低分子量グルテイン、α−およびγ−グリアジン、ホルデイン、セカリン、ならびにアベニンからなる群から選択されるヒト食物の一部を含む事例である。一実施形態は、赤血球結合部分がペプチドリガンド、抗体、抗体断片、および単鎖抗原結合ドメイン（ＳｃＦｖ）からなる群から選択される事例である。一実施形態は、赤血球結合部分が、赤血球に対する抗体を産生するハイブリドーマ由来の抗体、抗体断片またはＳｃＦｖを含み、ハイブリドーマは、ＢＲＩＣ４、ＢＲＩＣ５、ＢＲＩＣ６、ＢＲＩＣ１０、ＢＲＩＣ１４、ＢＲＩＣ１８、ＢＲＩＣ３９、ＢＲＩＣ６６、ＢＲＩＣ６８、ＢＲＩＣ６９、ＢＲＩＣ８７、ＢＲＩＣ１０８、ＢＲＩＣ１１０、ＢＲＩＣ１１１、ＢＲＩＣ１２５、ＢＲＩＣ１２６、ＢＲＩＣ１２８、ＢＲＩＣ１４５、ＢＲＩＣ１５５、ＢＲＩＣ１５７、ＢＲＩＣ１６３、ＢＲＩＣ１７０、ＢＲＩＣ１９８、ＢＲＩＣ２０３、ＢＲＩＣ２１６、ＢＲＩＣ２２０、ＢＲＩＣ２２１、ＢＲＩＣ２２２、ＢＲＩＣ２２９、ＢＲＩＣ２３０、ＢＲＩＣ２３１、ＢＲＩＣ２３５、ＢＲＩＣ２５６、ＢＲＡＣ１７、ＢＲＡＣ１８、ＢＧＲＬ１、ＢＧＲＬ２、ＢＧＲＬ１１、ＢＧＲＬ１００、ＢＲＡＤ３、ＢＩＲＭＡ Ｄ６、ＢＩＲＭＡ Ｄ１０、ＢＩＲＭＡ Ｋ３、ＢＩＲＭＡ Ｋ３、８４Ｂ；６Ａ７；ＣＯＥ；またはＫＺ１からなる群から選択される事例である。一実施形態は、赤血球結合部分が、Ｂａｎｄ３（ＣＤ２３３）、アクアポリン−１、Ｇｌｕｔ−１、Ｋｉｄｄ抗原、ＲｈＡｇ／Ｒｈ５０（ＣＤ２４１）、Ｒｈ（ＣＤ２４０）、Ｒｈ３０ＣＥ（ＣＤ２４０ＣＥ）、Ｒｈ３０Ｄ（ＣＤ２４０Ｄ）、Ｋｘ、グリコホリンＡ、グリコホリンＢ（ＣＤ２３５ｂ）、グリコホリンＣ（ＣＤ２３５ｃ）、グリコホリンＤ（ＣＤ２３５ｄ）、Ｋｅｌｌ（ＣＤ２３８）、Ｄｕｆｆｙ／ＤＡＲＣｉ（ＣＤ２３４）、ＣＲ１（ＣＤ３５）、ＤＡＦ（ＣＤ５５）、グロボシド、ＣＤ４４、ＩＣＡＭ−４（ＣＤ２４２）、Ｌｕ／Ｂ−ＣＡＭ（ＣＤ２３９）、ＸＧ１／ＸＧ２（ＣＤ９９）、ＥＭＭＰＲＩＮ／ニューロセリン（ＣＤ１４７）、ＪＭＨ、グリコシルトランスフェラーゼ、Ｃａｒｔｗｒｉｇｈｔ、Ｄｏｍｂｒｏｃｋ、Ｃ４Ａ／ＣＡＢ、Ｓｃｉａｎｎａ、ＭＥＲ２、ストマチン、ＢＡ−１（ＣＤ２４）、ＧＰＩＶ（ＣＤ３６）、ＣＤ１０８、ＣＤ１３９、およびＨ抗原（ＣＤ１７３）からなる群から選択される生体分子に特異的に結合する事例である。寛容誘発抗原は、ミモトープを含み得る。一実施形態は、ｓｃＦｖが１０Ｆ７の一部または全部、例えば、１０Ｆ７の軽鎖および／もしくは１０Ｆ７の重鎖の１つ以上、ならびに／または１０Ｆ７の軽鎖および／もしくは１０Ｆ７の重鎖のより高い親和性のバリアントを含む事例である。一実施形態は、赤血球結合部分が、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１、およびそれらの保存的置換物からなる群から選択される配列の少なくとも５つの連続アミノ酸残基を含むペプチドリガンドを含み、前記配列は赤血球に特異的に結合する方法である。
一実施形態は、寛容誘発抗原および患者中の赤血球に特異的に結合し、それにより抗原を赤血球に結合させる赤血球結合部分を含む分子融合物を含む組成物である。一例は、赤血球結合部分が抗原に共有結合している事例である。別の例は、分子融合物が、抗原に結合している粒子、例えば、マイクロ粒子、ナノ粒子、リポソーム、ポリマーソーム、またはミセルに結合している赤血球結合部分を含む事例である。寛容誘発抗原の例は、治療タンパク質の一部、非ヒトタンパク質の一部、ヒト中で天然では見出されないタンパク質の一部（そのタンパク質の全部、すなわち、全てのタンパク質を含む）、非ヒトグリコシル化を含むタンパク質のグリカン、ヒト自己免疫抗原の一部、ヒト食物の一部である。一実施形態は、赤血球結合部分がペプチドリガンド、抗体、抗体断片、および単鎖抗原結合ドメイン（ＳｃＦｖ）、例えば、１０Ｆ７の全部または一部からなる群から選択される組成物である。赤血球結合部分は、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１、およびそれらの保存的置換物からなる群から選択される配列の少なくとも５つの連続アミノ酸残基を含むペプチドリガンドを含み得、前記配列は赤血球に特異的に結合する。赤血球結合部分は、ペプチドと赤血球との間の平衡結合計測により測定して約１０μＭ〜０．１ｎＭの解離定数を有するペプチドリガンドを含む部分であり得る。一実施形態は、赤血球結合部分が、赤血球に対する抗体を産生するハイブリドーマ由来の抗体、抗体断片またはＳｃＦｖを含み、ハイブリドーマは、ＢＲＩＣ４、ＢＲＩＣ５、ＢＲＩＣ６、ＢＲＩＣ１０、ＢＲＩＣ１４、ＢＲＩＣ１８、ＢＲＩＣ３９、ＢＲＩＣ６６、ＢＲＩＣ６８、ＢＲＩＣ６９、ＢＲＩＣ８７、ＢＲＩＣ１０８、ＢＲＩＣ１１０、ＢＲＩＣ１１１、ＢＲＩＣ１２５、ＢＲＩＣ１２６、ＢＲＩＣ１２８、ＢＲＩＣ１４５、ＢＲＩＣ１５５、ＢＲＩＣ１５７、ＢＲＩＣ１６３、ＢＲＩＣ１７０、ＢＲＩＣ１９８、ＢＲＩＣ２０３、ＢＲＩＣ２１６、ＢＲＩＣ２２０、ＢＲＩＣ２２１、ＢＲＩＣ２２２、ＢＲＩＣ２２９、ＢＲＩＣ２３０、ＢＲＩＣ２３１、ＢＲＩＣ２３５、ＢＲＩＣ２５６、ＢＲＡＣ１７、ＢＲＡＣ１８、ＢＧＲＬ１、ＢＧＲＬ２、ＢＧＲＬ１１、ＢＧＲＬ１００、ＢＲＡＤ３、ＢＩＲＭＡ Ｄ６、ＢＩＲＭＡ Ｄ１０、ＢＩＲＭＡ Ｋ３、ＢＩＲＭＡ Ｋ３、８４Ｂ；６Ａ７；ＣＯＥ；またはＫＺ１からなる群から選択される事例である。一実施形態は、赤血球結合部分が、Ｂａｎｄ３（ＣＤ２３３）、アクアポリン−１、Ｇｌｕｔ−１、Ｋｉｄｄ抗原、ＲｈＡｇ／Ｒｈ５０（ＣＤ２４１）、Ｒｈ（ＣＤ２４０）、Ｒｈ３０ＣＥ（ＣＤ２４０ＣＥ）、Ｒｈ３０Ｄ（ＣＤ２４０Ｄ）、Ｋｘ、グリコホリンＡ、グリコホリンＢ（ＣＤ２３５ｂ）、グリコホリンＣ（ＣＤ２３５ｃ）、グリコホリンＤ（ＣＤ２３５ｄ）、Ｋｅｌｌ（ＣＤ２３８）、Ｄｕｆｆｙ／ＤＡＲＣｉ（ＣＤ２３４）、ＣＲ１（ＣＤ３５）、ＤＡＦ（ＣＤ５５）、グロボシド、ＣＤ４４、ＩＣＡＭ−４（ＣＤ２４２）、Ｌｕ／Ｂ−ＣＡＭ（ＣＤ２３９）、ＸＧ１／ＸＧ２（ＣＤ９９）、ＥＭＭＰＲＩＮ／ニューロセリン（ＣＤ１４７）、ＪＭＨ、グリコシルトランスフェラーゼ、Ｃａｒｔｗｒｉｇｈｔ、Ｄｏｍｂｒｏｃｋ、Ｃ４Ａ／ＣＡＢ、Ｓｃｉａｎｎａ、ＭＥＲ２、ストマチン、ＢＡ−１（ＣＤ２４）、ＧＰＩＶ（ＣＤ３６）、ＣＤ１０８、ＣＤ１３９、およびＨ抗原（ＣＤ１７３）からなる群から選択される生体分子に特異的に結合する事例である。寛容誘発抗原は、ミモトープを含み得る。
寛容誘発組成物は、病態、例えば、移植片拒絶、自己免疫疾患、食物アレルギー、および治療剤に対する免疫応答からなる群から選択される病態の治療において使用することができる。
一実施形態は、赤血球結合部分および物質の抗原を含む融合分子を含む物質に対する免疫応答の免疫反転において使用される薬学的に許容可能な組成物である。組成物は、例えば、タンパク質、タンパク質の一部、ヒトタンパク質またはその一部、非ヒトタンパク質またはその一部、グリカン、非ヒトグリコシル化を含むタンパク質のグリカン、ヒト自己免疫抗原、ヒト用治療タンパク質またはその一部、およびヒト食物の一部からなる群から選択される寛容誘発抗原を有し得る。組成物は、寛容誘発抗原を有し得、それは、例えば、遺伝性疾患により欠損しているタンパク質、非ヒトグリコシル化を有するタンパク質、非ヒトタンパク質、ヒト中で天然では見出されない合成タンパク質、ヒト食物抗原、ヒト移植抗原、およびヒト自己免疫抗原からなる群から選択される。Ｂａｎｄ３（ＣＤ２３３）、アクアポリン−１、Ｇｌｕｔ−１、Ｋｉｄｄ抗原、ＲｈＡｇ／Ｒｈ５０（ＣＤ２４１）、Ｒｈ（ＣＤ２４０）、Ｒｈ３０ＣＥ（ＣＤ２４０ＣＥ）、Ｒｈ３０Ｄ（ＣＤ２４０Ｄ）、Ｋｘ、グリコホリンＡ、グリコホリンＢ（ＣＤ２３５ｂ）、グリコホリンＣ（ＣＤ２３５ｃ）、グリコホリンＤ（ＣＤ２３５ｄ）、Ｋｅｌｌ（ＣＤ２３８）、Ｄｕｆｆｙ／ＤＡＲＣｉ（ＣＤ２３４）、ＣＲ１（ＣＤ３５）、ＤＡＦ（ＣＤ５５）、グロボシド、ＣＤ４４、ＩＣＡＭ−４（ＣＤ２４２）、Ｌｕ／Ｂ−ＣＡＭ（ＣＤ２３９）、ＸＧ１／ＸＧ２（ＣＤ９９）、ＥＭＭＰＲＩＮ／ニューロセリン（ＣＤ１４７）、ＪＭＨ、グリコシルトランスフェラーゼ、Ｃａｒｔｗｒｉｇｈｔ、Ｄｏｍｂｒｏｃｋ、Ｃ４Ａ／ＣＡＢ、Ｓｃｉａｎｎａ、ＭＥＲ２、ストマチン、ＢＡ−１（ＣＤ２４）、ＧＰＩＶ（ＣＤ３６）、ＣＤ１０８、ＣＤ１３９、およびＨ抗原（ＣＤ１７３）からなる群から選択される生体分子に特異的に結合する赤血球結合部分を提供することができる。赤血球結合部分は、ペプチドリガンド、抗体、抗体断片、および単鎖抗原結合ドメイン（ＳｃＦｖ）からなる群から選択することができる。赤血球結合部分は、それが赤血球に対する抗体を産生するハイブリドーマ由来の抗体、抗体断片またはＳｃＦｖを含むように調製することができ、ハイブリドーマは、ＢＲＩＣ４、ＢＲＩＣ５、ＢＲＩＣ６、ＢＲＩＣ１０、ＢＲＩＣ１４、ＢＲＩＣ１８、ＢＲＩＣ３９、ＢＲＩＣ６６、ＢＲＩＣ６８、ＢＲＩＣ６９、ＢＲＩＣ８７、ＢＲＩＣ１０８、ＢＲＩＣ１１０、ＢＲＩＣ１１１、ＢＲＩＣ１２５、ＢＲＩＣ１２６、ＢＲＩＣ１２８、ＢＲＩＣ１４５、ＢＲＩＣ１５５、ＢＲＩＣ１５７、ＢＲＩＣ１６３、ＢＲＩＣ１７０、ＢＲＩＣ１９８、ＢＲＩＣ２０３、ＢＲＩＣ２１６、ＢＲＩＣ２２０、ＢＲＩＣ２２１、ＢＲＩＣ２２２、ＢＲＩＣ２２９、ＢＲＩＣ２３０、ＢＲＩＣ２３１、ＢＲＩＣ２３５、ＢＲＩＣ２５６、ＢＲＡＣ１７、ＢＲＡＣ１８、ＢＧＲＬ１、ＢＧＲＬ２、ＢＧＲＬ１１、ＢＧＲＬ１００、ＢＲＡＤ３、ＢＩＲＭＡ Ｄ６、ＢＩＲＭＡ Ｄ１０、ＢＩＲＭＡ Ｋ３、ＢＩＲＭＡ Ｋ３、８４Ｂ；６Ａ７；ＣＯＥ；またはＫＺ１からなる群から選択される。
実施形態は、赤血球結合部分およびアスパラギナーゼの抗原を含む融合分子を含む。赤血球結合部分の複数の開示から明らかなとおり、そのための多くの任意選択、例として：ヒト赤血球に結合するｓｃＦｖまたは配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、およびそれらの保存的置換物からなる群から選択されるペプチド性結合リガンドが存在し、前記配列は、赤血球に特異的に結合する。融合分子を含むそのような組成物は、アスパラギナーゼに対する寛容の誘導に使用することができる。
実施形態は、赤血球結合部分およびクロモグラニン−Ａの抗原を含む融合分子を含む。抗原は、クロモグラニン−Ａのミモトープまたは一部または全部であり得る。赤血球結合部分の複数の開示から明らかなとおり、そのための多くの任意選択、例として：ヒト赤血球に結合するｓｃＦｖまたは配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、およびそれらの保存的置換物からなる群から選択されるペプチド性結合リガンドが存在し、前記配列は、赤血球に特異的に結合する。融合分子を含むそのような組成物は、クロモグラニン−Ａに対する寛容の誘導におよび／または糖尿病の予防もしくは糖尿病疾患の進行の低減に使用することができる。
別の例は、合成ポリマー、分枝鎖合成ポリマー、および粒子からなる群から選択される実体に結合している赤血球に特異的に結合する赤血球結合部分を含む組成物である。粒子は、例えば、マイクロ粒子、ナノ粒子、リポソーム、ポリマーソーム、およびミセルであり得る。組成物は、寛容誘発抗原、治療剤、または腫瘍ホーミングリガンドをさらに含み得る。
一実施形態は、赤血球に特異的に結合するペプチドリガンドを含む単鎖抗原結合ドメイン（ｓｃＦｖ）である。ペプチドは、ｓｃＦｖに結合させ、またはリンカー部分中に配置することができる。ペプチドリガンドの１つ以上を含めることができる。
本明細書において挙げられる全ての特許出願、特許、および刊行物は、全ての目的のために参照により本明細書に組み込まれ；矛盾がある場合は、本明細書が優先する。
参考文献

Claims (17)

  1. 抗原特異的免疫寛容を達成するための免疫調節のための組成物であって、該組成物が：
    抗原に曝された患者で不所望の免疫応答を誘導し得る、寛容が望まれる抗原、
    ここで、抗原がペムファキシン、デスモコリン、プラコグロビン、ペルプラキン、およびアセチルコリン受容体の１つ以上、またはかかる抗原のいずれかの少なくとも１つの免疫原性断片を含む；
    血液においてｉｎ ｓｉｔｕで外部赤血球表面に非共有結合的に特異的に結合する能力を有し、かつ単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含む、赤血球結合部分であって、当該赤血球結合部分がグリコホリンＡを対象とする、赤血球結合部分、
    を含み、
    ここで、寛容が望まれる抗原が赤血球結合部分に組換え的に融合されたまたは化学的にコンジュゲートされており、かつ
    抗原への寛容が望まれるヒトへの投与の際に：
    組成物が、ＣＤ４５ポジティブ細胞ではなくＣＤ４５ネガティブ細胞に結合し、かつ組成物が、ヒトが抗原単独に曝された場合と比較して抗原特異的Ｔ細胞において炎症応答を減少させる、誘導し得ない、または予防する、かつ
    組成物が、寛容誘発抗原に特異的なＣＤ４＋Ｔ細胞の欠失を誘導する、
    組成物。
  2. ｓｃＦｖが、親和性成熟されている、請求項１に記載の組成物。
  3. ｓｃＦｖが１０Ｆ７クローンに由来する、請求項１または２に記載の組成物。
  4. 赤血球結合部分が、抗原に共有結合している、請求項１−３のいずれかに記載の組成物。
  5. 赤血球結合部分が、抗原のＮまたはＣ末端に、リンカーを介して融合されている、請求項１−３のいずれかに記載の組成物。
  6. 赤血球結合部分が、抗原に化学的にコンジュゲートされている、請求項１−３のいずれかに記載の組成物。
  7. 赤血球結合部分が、組換えＤＮＡ技術を介して抗原に融合されている、請求項１−３のいずれかに記載の組成物。
  8. 抗原が、ペムファキシンを含む、請求項１−７のいずれかに記載の組成物。
  9. 抗原が少なくとも１つのペムファキシンの免疫原性断片を含む、請求項１−７のいずれかに記載の組成物。
  10. 寛容誘発抗原に対する不所望の免疫応答を治療することにおける使用のための、請求項１−９のいずれかに記載の組成物。
  11. 該組成物が：
    寛容誘発抗原および患者中の赤血球に特異的に結合する赤血球結合部分を含む分子融合物を含み、
    赤血球結合部分が、血液においてｉｎ ｓｉｔｕでヒト赤血球に特異的に結合する単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）であり、
    赤血球結合部分が、グリコホリンＡを対象とするものであり、
    寛容誘発抗原が、該抗原に曝された対象が不所望の免疫応答を示す抗原であり、
    寛容誘発抗原が、デスモグレイン３、デスモグレイン１、デスモグレイン４、ペムファキシン、デスモコリン、プラコグロビン、ペルプラキン、デスモプラキン、およびアセチルコリン受容体の１つ以上、少なくとも１つの前記抗原のいずれかの免疫原性断片、または少なくとも１つのいずれかのかかる抗原のミモトープを含み；かつ
    対象への投与の際に、組成物が、寛容誘発抗原に特異的なＣＤ４＋Ｔ細胞の欠失を誘導する、
    不所望の免疫応答を治療するための医薬の製造のための治療有効量の薬学的に許容可能な組成物の使用。
  12. 寛容誘発抗原がデスモグレイン３、デスモグレイン１、またはデスモグレイン４の１つ以上を含む、請求項１１に記載の使用。
  13. 寛容誘発抗原がデスモグレイン３、デスモグレイン１、またはデスモグレイン４の１つ以上の少なくとも１つの免疫原性断片を含む、請求項１１に記載の使用。
  14. 赤血球結合部分が親和性成熟されている、請求項１１−１３のいずれかに記載の使用。
  15. 赤血球結合部分が１０Ｆ７クローンに由来する、請求項１１−１４のいずれかに記載の使用。
  16. 組成物が抗原に対する不所望の免疫応答の前に患者に投与され、治療が不所望の免疫応答を予防または減少させる、請求項１１−１５のいずれかに記載の使用。
  17. 組成物が抗原に対する不所望の免疫応答を有する患者に投与され、治療が不所望の免疫応答を元に戻すまたは減少させる、請求項１１−１５のいずれかに記載の使用。
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