EA028087B1 - Связывающиеся с эритроцитами терапевтические средства - Google Patents

Связывающиеся с эритроцитами терапевтические средства Download PDF

Info

Publication number
EA028087B1
EA028087B1 EA201491524A EA201491524A EA028087B1 EA 028087 B1 EA028087 B1 EA 028087B1 EA 201491524 A EA201491524 A EA 201491524A EA 201491524 A EA201491524 A EA 201491524A EA 028087 B1 EA028087 B1 EA 028087B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
antigen
fragment
red blood
binding
protein
Prior art date
Application number
EA201491524A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201491524A1 (ru
Inventor
Джеффри А. Хаббелл
Джеффри А. ХАББЕЛЛ
Стефан Конто
Карен И. Дейн
Original Assignee
Эколь Политекник Федераль Де Лозан
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from US13/397,202 external-priority patent/US9517257B2/en
Application filed by Эколь Политекник Федераль Де Лозан filed Critical Эколь Политекник Федераль Де Лозан
Publication of EA201491524A1 publication Critical patent/EA201491524A1/ru
Publication of EA028087B1 publication Critical patent/EA028087B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K39/4611—T-cells, e.g. tumor infiltrating lymphocytes [TIL], lymphokine-activated killer cells [LAK] or regulatory T cells [Treg]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/4644—Cancer antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6843—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a material from animals or humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Liposomes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/745—Blood coagulation or fibrinolysis factors
    • C07K14/755—Factors VIII, e.g. factor VIII C (AHF), factor VIII Ag (VWF)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2896—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against molecules with a "CD"-designation, not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/38—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the dose, timing or administration schedule
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/33—Fusion polypeptide fusions for targeting to specific cell types, e.g. tissue specific targeting, targeting of a bacterial subspecies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/40—Fusion polypeptide containing a tag for immunodetection, or an epitope for immunisation

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

Представлены пептиды, которые специфически связываются с эритроцитами. Они предложены в виде пептидных лигандов, имеющих последовательности, которые специфически связываются с эритроцитами, или в виде антител или их фрагментов, которые обеспечивают специфическое связывание с таковыми. Пептиды можно получать в виде гибридных молекул вместе с терапевтическими средствами, толеризирующими антигенами или нацеливающими пептидами. Иммунотолерантность можно сформировать с помощью гибридов и выбора антигена на веществе, толерантность к которому является желательной.

Description

Заявка на настоящий патент испрашивает приоритет согласно заявке на патент США с серийным номером 13/397202, поданной 15 февраля 2012 г., которая включена в настоящий документ посредством ссылки.
Область изобретения
Область изобретения относится к медицинским композициям и применениям лигандов или антител, которые связываются с эритроцитами. Конкретное применение включает иммунотолеризацию, доставку лекарственных средств и разновидности терапии рака.
Предпосылки изобретения
Отторжение трансплантированной ткани и аутоиммунные заболевания являются патологическими состояниями, которое включают иммунное отторжение чужеродной биомолекулы в связи с ее антигенной природой. В подавление или лечение иммунного отторжения вовлечены многие лекарственные средства и клинические способы. В этом способе вакцины используют для стимуляции иммунного ответа к антигенам на патогенных биомолекулах с целью вызова иммунного ответа против белков или других биомолекул, которые несут антиген.
Краткое описание изобретения
Толерогенез является процессом создания иммунологической толерантности к веществу. Пациент, либо человек, либо представитель другого вида, которого лечат с целью получения толерантности к веществу, будет иметь сниженный адаптивный иммунный ответ к веществу. Снижение адаптивного иммунного ответа можно измерить с помощью анализа количеств циркулирующих антител, реактивных к веществу, или с помощью анализа реакций Т-клеток на вещество и толеризирующее средство. В настоящем документе предложены композиции и способы для толеризации. Многие из вариантов осуществления включают введение молекулы-гибрида, которая имеет толеризирующий антиген, объединенный со связывающимся с эритроцитами фрагментом. Молекула-гибрид связывается с эритроцитом и начинается процесс презентации толеризирующего антигена иммунной системы таким образом, что вырабатывается толерантность.
Были открыты пептиды, которые специфически связываются с эритроцитами (также известными как красные кровяные клетки). Эти пептидные лиганды являются связывающимися с эритроцитами фрагментами, которые специфически связываются с эритроцитами даже в присутствии других факторов, присутствующих в крови. Эти лиганды можно применять различными способами.
Вариантом осуществления настоящего изобретения является фармацевтически приемлемая композиция, содержащая гибридную молекулу, которая содержит толерогенный антиген и связывающийся с эритроцитами фрагмент, который специфически связывается с эритроцитом у пациента, при этом связывающийся с эритроцитами фрагмент специфически связывается с биомолекулой, выбранной из группы, включающей белок полосы 3 (00233), аквапорин-1, О1и1-1, антиген Κίάά, КЬА§/КЬ50 (00241), Кй (00240), КЙ30СЕ (СО240СЕ), КЙ30О (СП240П), Κχ, гликофорин В (0О235Ь), гликофорин С (СП235с), гликофорин Ό (002356), Ке11 (СО238), Оийу/ОАКП (СО234), СК1 (0035), ΏΛΕ (СО55), глобозид, 0044, 1САМ-4 (00242), Ьи/В-САМ (СО239), ХО1/ХО2 (СО99), ΕΜΜΡΚΙΝ/нейротелин (00147), 1МН, гликозилтрансферазу, СагЦупдШ. ОотЬгоск, С4А/САВ, §с1аииа, МЕК2, стоматин, ВА-1 (СО24), 0Р1У (СО36), 00108, 00139 и антиген Н (00173).
Вариантом осуществления настоящего изобретения является фармацевтически приемлемая композиция, содержащая связывающийся с эритроцитами фрагмент, присоединенный к домену, который специфически связывается с мишенью, например, белком, который содержит толерогенный антиген. Один или оба эти домена могут быть пептидным лигандом, или антителом, или фрагментом антитела.
Другим вариантом осуществления является фармацевтически приемлемая композиция для применения при истощении антител или удалении антител иным путем из кровотока пациента. Эта композиция имеет связывающийся с эритроцитами фрагмент, соединенный с антигеном, например нативным аутоантигеном или антигеном для терапевтического белка.
Краткое описание фигур
На фиг. 1 представлена экспериментальная схема и результаты для гибридной молекулы ΕΚΥ1 и овальбумина (ОУА), где гибрид ΕКΥ1-ОУΛ с высокой аффинностью связывается с экваториальной периферией эритроцитов мыши; секция (а) схематическое изображение конъюгации пептида ΕΚΥ1 с овальбумином (ОУА), результатом чего является связывание с поверхностным гликофорином А эритроцита; секция (Ь) связывание как конъюгатов, так и промежуточных соединений ОУА, характеризуемое с помощью проточной цитометрии; гистограмма, закрашенная черным цветом, ЕК/У1-ОУА; незакрашенная гистограмма, δΜСС-ОУΛ; пунктирная гистограмма, ΜΙδ-ОУА; связывающийся с эритроцитами пептид ЕК/У1 \\'\1У1.Р\\'1.РС,Т1.1) (5ЕО ГО Ш: 1), ΜΙδ = несовпадающий пептид РРРТУСЛГОРУТА (δΙΤ) ГО NО: 2), δΜ00 = сульфосукцинимидил-4-^-малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилат, применяемый для конъюгации ЕК/У1 с ОУА; секция (с) равновесное связывание ЕКУ1-ОУА с эритроцитами, характеризующееся низкой константой диссоциации ЕК/У1-ОУА (К = 0,97, связывание с одним сайтом), определенное с помощью проточной цитометрии.
На фиг. 2 объединены результаты, показывающие, что связывание с эритроцитами вызывает толе- 1 028087 рантность к антигенной стимуляции:
секция (а) модель толерантности адаптивного переноса Ρ'Ό8' Т-клеток ΟΤΙ, на которой представлен протокол эксперимента для экспериментальной группы, а также для групп стимуляции и наивного контроля (п = 5);
секция (Ь) выявление с помощью проточной цитометрии популяций СЭ8' Т-клеток ΟΤΙ (ΡΌ3ί:' ΡΌ8α' СО45.2+);
секция (с) количественное определение популяции СЭ8' Т-клеток ΟΤΙ в дренирующих лимфатических узлах (паховом и подколенном) через 4 дня после антигенной стимуляции мышей ΡΌ45.Ρ (** Р<0,01);
секция (4) выявление с помощью проточной цитометрии СЭ8' Т-клеток ΟΤΙ, экспрессирующих
ΙΡΝγ;
секция (е) СЭ8' Т-клетки ΟΉ, экспрессирующие ΙΡΝγ в дренирующих лимфатических узлах через 4 дня после антигенной стимуляции и повторной стимуляции пептидом δΙΙΝΡΕΚΌ (8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 3) (** Р<0,01);
секция (£) концентрации ΙΡΝγ в средах клеточных культур лимфатических узлов через 4 дня после повторной стимуляции пептидом δΙΙΝΡΕΚΕ (8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 3), определенные с помощью ΕΌΙδΆ (** Р<0,01);
секция (д) концентрации ΙΌ-10 в среде клеточной культуры лимфатических узлов через 4 дня после повторной стимуляции ΟνΑ, определенные с помощью ΕΌΙδΑ (* Р<0,05). Данные представляют среднее медианное значение±значение от минимального до максимального;
секция (Ь) титры ΟνΑ-специфического ΙβΟ в сыворотке на день 19, (* Р<0,05) данные представляют среднее значение±δΕ;
секция (ί) комбинированная модель толерантности с использованием ΟΉ и экспрессирующей ΟνΑ опухоли тимомы ΕΌ4 (Ε.Ο7-ΟνΑ), на которой представлен протокол эксперимента для экспериментальной, а также для контрольной групп (п = 4, 3 соответственно);
секция (]) количественное определение непролиферирующих (поколение 0) СО8+ Т-клеток ΟΉ, циркулирующих в крови через 5 дней после адаптивного переноса; данные представляют медианное значение±значение от минимального до максимального (** Р<0,01);
секция (к) профиль роста опухолей Ε.Ο7-ΟνΑ, инъецированных подкожно через 9 дней после адаптивного переноса ΟΉ, данные представляют среднее значение±δΕ (* Р<0,05).
Фиг. 3 представляет собой столбиковую диаграмму, показывающую как связывание с эритроцитами ослабляет антиген-специфические гуморальные ответы у мышей С57ВЬ/6. Выявление ΟνΑспецифического ΙβΟ в сыворотке через 19 дней после двух введений 1 мкг ΟνΑ или 1 мкг ΕΚΥ1-ΟνΑ через 6 дней у мышей С57ВЬ/6 (* Р<0,05).
На фиг. 4 представлены результаты эксперимента, в которых РΕΟ-ΕΚΥ1 с 8 ветвями связывается с эритроцитами ίη νίίτο и ίη νίνο; секция (а) РΕΟ-ΕΚΥ1 с 8 ветвями (гистограмма, закрашенная черным цветом), но не РΕΟ-ΜIδ с 8 ветвями (гистограмма, закрашенная серым цветом) или РΕΟпиридилдисульфид с 8 ветвями связывается с эритроцитами мыши после инкубации ίη νίίτο; секция (Ь) РΕΟ-ΕΚΥ1 с 8 ветвями (гистограмма, закрашенная черным цветом), но не РΕΟ-ΜIδ с 8 ветвями (гистограмма, закрашенная серым цветом), связывается с циркулирующими эритроцитами при внутривенной инъекции.
На фиг. 5 представлены результаты эксперимента, в которых описано время полужизни на клеточной поверхности эритроцита РΕΟ-ΕΚΥ1, имеющего 8 РаЬ-фрагментов, (закрашенные кружки) и РΕΟΜΙδ, имеющего 8 РаЬ-фрагментов, (незакрашенные прямоугольники), определенное с помощью проточной цитометрии.
На фиг. 6 представлены результаты эксперимента в виде столбиковой диаграммы, показывающей связывание пептидных лигандов с эритроцитами человека.
На фиг. 7 представлены результаты эксперимента в виде гистограммы проточной цитометрии. Эритроциты мыши инкубировали с ΤΕΚ119-δIINΡΕΚ^ (гистограмма, закрашенная серым цветом) или альбумином (незакрашенная гистограмма). Флуоресцентный сигнал исходит от антитела к Γ^ΗΝ-ΓΕ. применяемого при выявлении 8сΡν.
Фиг. 8 представляет собой график результатов эксперимента, показывающий пролиферирующие Ρ'Ό8 Т-клетки ΟΤ-I в селезенке после внутривенного введения физиологического раствора, ΟνΑ, ΕΚΥ1ΟνΑ или ΊΡΗ119-δΠ\ΡΕΚΙ.. ** Р<0,01, *** Р<0,001.
Фиг. 9 представляет собой график результатов эксперимента, показывающий фенотипическую характеристику Т-клеток ΟΉ после адаптивного переноса и внутривенного введения физиологического раствора, ΟνΑ, ΕΚΥ1-ΟνΑ или ΤΕΚ119-δIINΡΕΚ^. Левая секция: индукция апоптических клеток ΟΉ, характеризуемая связыванием аннексина-ν при проточной цитометрии; правая секция: индукция истощенных клеток ΟΉ, характеризуемая экспрессией ΓΌ-1 при проточной цитометрии.
Фиг. 10 представляет собой график результатов эксперимента, показывающий характеристику воспалительных (ΙΡΝγ+) Т-клеток ΟΉ в лимфатических узлах, дренирующих место стимуляции, получен- 2 028087 ных от мышей, толеризированных различными инъекционными составами, исследованную с помощью проточной цитометрии.
Фиг. 11 представляет собой график результатов эксперимента, показывающий титры аспарагиназа(Л§Ыа8е)-специфического 1дС в сыворотке у мышей, получающих 2 или 6 доз ЕК.У1-А5№-15С или Л§Ыа8е дикого типа, через 21 день после введения, определенные с помощью ЕЫ§Л.
Фиг. 12 представляет собой график результатов эксперимента, показывающий пролиферацию СЭ4 Т-клеток, полученных от трансгенной мыши ΝΟΟΒΟί'.'2.5. в совместной культуре с ОС (дендритными клетками) селезенки, с различными средовыми добавками.
Фиг. 13 представляет собой график результатов эксперимента, показывающий результаты количественного определения непролиферирующих ΝΟΟΒΟί'.'2.5 СЭ4 Т-клеток после адаптивного переноса и внутривенного введения ТЕК119-СЬгЛ, свободного пептида 1040-р31 или физиологического раствора, полученные с помощью проточной цитометрии.
Подробное описание предпочтительных вариантов осуществления
Для толерогенеза предложены разновидности молекулярного дизайна. Белок или другой молекулярный антиген, к которому определяют толерантность, получают в виде конъюгата со связывающимся с эритроцитами фрагментом. Фрагмент может содержать пептидный лиганд, антитело, аптамер или фрагмент антитела. Конъюгат, также называемый гибридной молекулой, может представлять собой гибридный белок или может включать линкер, например, конъюгат с полимером или полимерной мицеллой или полимерными наночастицами.
В настоящем документе описаны пептиды, которые специфически связываются с эритроцитами. Они предложены в виде пептидных лигандов с последовательностями, которые специфически связываются, или в виде антител или их фрагментов, которые обеспечивают специфическое связывание с эритроцитами. Пептиды можно получить в виде гибридных молекул с терапевтическими средствами, толеризирующими антигенами или нацеливающими пептидами. Терапевтические средства преимущественно могут иметь повышенный период полужизни в кровотоке ίη νίνο, если они являются частью гибрида. Иммунотолерантность можно создать с помощью гибридов и выбора антигена на веществе, к которому необходима толерантность. Термин антиген, в настоящем контексте, обозначает непроцессированный антиген, его антигенный фрагмент или миметик толерогенного антигена. Г ибридизации с нацеливающими пептидами направляют гибриды к мишени, например, к опухоли, где связывающиеся с эритроцитами лиганды снижают или полностью прекращают ток крови к опухоли путем рекрутинга эритроцитов к мишени.
Пептидные последовательности, которые специфически связываются с эритроцитами.
Пептиды, которые специфически связываются с эритроцитами, были обнаружены и описаны заявителем в РСТ/и82011/047078, включали пептид, называемый ΕΚΥ1, который специфически связывается с эритроцитом. Также были описаны шесть пептидов (ΕΚΥ19, ΕΚΥ59, ΕΚΥ64, ΕΚΥ123, ΕΚΥ141 и ΕΚΥ162), которые специфически связываются с эритроцитами человека. В Примере 9 подробно описано как пептидные лиганды (ΕΚΥ64, ΕΚΥ123 и ΕΚΥ141) вводили в состав гибридного белка с флуоресцентным белком-репортером и сохраняли их свойства специфического связывания. Вариантом осуществления настоящего изобретения является практически чистый полипептид, содержащий аминокислотную последовательность ΕΚΥ1, или один из связывающихся с эритроцитами пептидов человека, или его консервативную замену, или нуклеиновую кислоту, кодирующую их. Такие полипептиды специфически связываются с эритроцитами и являются лигандом для них. Лиганд является термином, который обозначает химическую молекулу, специфически связывающуюся с молекулой-мишенью. Мишень обозначает заранее определенную молекулу, ткань или место, которое потребитель намеревается связать с лигандом. Таким образом, целенаправленная доставка в ткань обозначает доставку молекулы или другого материала, такого как клетка, к предполагаемой ткани-мишени. Соответственно, варианты осуществления включают молекулы или композиции, содержащие по меньшей мере один из раскрытых в данном документе лигандов, которые применяют для связывания с эритроцитом. Связывающую активность полипептида к эритроциту можно легко определить согласно описанным в настоящем документе протоколам эксперимента. С помощью таких способов можно определить показатели силы связывания вариантов полипептидов по отношению к ΕΚΥ1 или связывающегося с эритроцитами пептида человека при определенных физиологических условиях, например, последовательностей, созданных с использованием консервативных замен, добавления или удаления фланкирующих групп, или изменений или добавлений для корректировки растворимости последовательности в водном растворе. Можно получить пептидные лиганды, специфичные к одной или нескольким следующим мишеням или группам мишеней: поверхностной молекуле эритроцита (белку, гликопротеину), белку полосы 3 (СИ233), гликофорину, в частности, гликофорину Л (СИ235а), гликофорину В (СИ235Ь), гликофорину С (СО235с) и гликофорину Ό (СО2354), аквапорину-1, С1Ш-1, антигену Κίάά, КЬЛ§/КЬ50 (СИ241), Кй (СИ240), Κ130ΟΕ (С^240СΕ), КЬ30И (СО240И), Кх, Ке11 (СИ238), Оийу/ОЛКС (СИ234), СК1 (СИ35), ИЛЕ (СИ55), глобозиду, СИ44, 1САМ-4 (СИ242), Ьи/В-СЛМ (СИ239), ХС1/ХС2 (СИ99), ΕΜΜΡΚΙΝ/нейротелину (СО147), ДМН, гликозилтрансферазе, СагЮТфЫ, ОотЬгоск, С4Л/СЛВ, §с1аппа, ΜΕΚ2, стоматину, ВЛ-1 (СО24), СР1У (СИ36), СО108, 00139 и антигена Н (00173). Белки клеточной поверхности эритроцитов, либо очищенные препараты,
- 3 028087 либо их смесь, можно подвергнуть скринингу на предмет пептидных лигандов. Белки клеточной поверхности эритроцитов можно рекомбинантно экспрессировать в их полной форме или в виде частичных доменов, гибридизированных с метками, которые повышают экспрессию или стабильность белка. Затем рекомбинантный белок-мишень можно иммобилизировать на пластине или сфере и применять в качестве аффинной мишени для способа скрининга библиотеки. Белки клеточной поверхности эритроцитов также можно выделить из клеточных препаратов цельной крови, из которой очищенные или комплексные смеси мембранных белков можно иммобилизировать на твердой матрице (сфере, пластине или др.) и применять в качестве аффинных мишеней для способов скрининга. Весь способ скрининга можно выполнять в присутствии высокой концентрации сывороточного альбумина (например, 50 мг/мл) и при температуре 37°С для снижения числа событий неспецифического связывания и для отбора пептидов с благоприятными характеристиками связывания в сыворотке крови. Пептидные лиганды наиболее предпочтительно выбирают из белка полосы 3 (СЭ233), гликофорина В (СЭ235Ь), гликофорина С (СЭ235с) и гликофорина Ώ (СП235б).
Было замечено, что пептидные лиганды связываются с клеточными поверхностями эритроцитов без изменения морфологии клетки и без цитоплазматической транслокации. Лиганды были распределены по поверхности мембраны и не образовывали кластеров. Гликофорин-А (ΟΥΡΑ) был отдельным белком, идентифицированным в качестве мишени ΕΚΥ-1. ΕΚΥ-1 был реактивным только у мышей и крыс. Было установлено, что пептидные лиганды, которые специфически связываются с эритроцитами человека, являются специфическими по отношению к эритроцитам человека, а не для других видов. Описан клон фага с дисплеем пептида с высокой аффинностью ШМУРРШРРС'ПТ) (8Ε^ ГО ΝΟ: 1, обозначенный в настоящем документе как ΕΚΥ1) к клеточной поверхности эритроцитов мыши. Другие эксперименты выявили связывающие лиганды к эритроцитам человека, показанные в табл. 1, 2. Шесть последовательностей специфически связывались с эритроцитами человека. Седьмая последовательность, названная ΕΚΥ50, связывалась с эритроцитами человека и также связывалась с эпителиальными/эндотелиальными клетками.
Таблица 1
Пептидные лиганды, которые связываются с эритроцитами человека
Название Последовательность пептида, Идентификатор
пептида связывающегося с эритроцитами человека последовательности
ΕΚΥ19 ΟΟδΟΟΡΝδΚΑΥΙΥΜΤΡΕδΡΟΙΥΚΟδδΟΟδ 8Е0 Ш N0:4
ΕΚΥ50 ΟΟδΟΟδλΥδΚΑΙΕΡΕΕΚΙΟνΡΟδδΟΟδ 8Е0 Ш N0:5
ΕΚΥ59 СО8СОУ1СТ8АОЕОЕУСЕГОС88СС8 8Е0 Ш N0:6
ΕΚΥ64 СО8СОТУЕСТРЕЕООУС8УС88СС8 8Е0 Ш N0:7
ΕΚΥ123 СО8СНА¥НСООРЕА?А¥УС88СС8 8Е0 Ш N0:8
ΕΚΥ141 ΟΟδΟΟΕΟΤνίΥΝΤΥΤΟνΡδδΟδδΟΟδ δΕ(2 Ш N0:9
ΕΚΥ162 ΟΟδΟΟδΥλνΥδδΚΟΝΡΕΚΟΤΟΟδδΟΟδ δΕ(2ΙϋΝΟ:10
Подчеркнутые части последовательностей указывают линкерные последовательности.
- 4 028087
Таблица 2
Пептидные лиганды, которые связываются с эритроцитами человека или мыши
Пептид Идентификатор последовательности
ΕΚΥ19’ ΡΧδΚΑΊΥΜΤΡΙ.δΡΟΙΥΚ δΕΟΙϋΝΟ:11
ΕΚ.Υ50’* 8А8КЛ1РРРРК1(>Р δΕΟΙϋΝΟ:12
ΕΚΥ59’ ΥΙΟΤδΑΟΕΟΕΥΟΕΙϋ δΕΟΙϋΝΟ:13
ΕΚΥ64’ ТУРОРРРСААСЗУ δΕΟΙϋΝΟ:14
ΕΚΥ123’ ΗΑΉΟΟΟΡΕΑΝλΥν δΕΟΙϋΝΟ:15
ΕΚ.Υ14Γ ΕΟΤνίΥΝΤΥΤΟνΡδδ δΕΟΙϋΝΟ:16
ΕΚΥ162’ 8ν\\Ύ88ΙΑι\ΡΡΚ(?Τίι δΕΟΙϋΝΟ:17
ΕΚ.Υ1** \ν\ινι.ρ\νι.ρ(τπ.ΐ) δΕΟΙϋΝΟ:!
* Не специфичен к эритроцитам.
** К эритроцитам мыши.
Варианты осуществления настоящего изобретения включают пептиды, которые специфически связываются с поверхностью эритроцитов. Последовательности не оптимизировали по минимальной длине. Такая оптимизация известна из уровня техники и ее можно осуществлять на практике с помощью методик, описанных в настоящем документе. Например, Кеппек е! а1. (Рго1ет Епд. Эе§. 8е1. (2010) 23(1):9-17) исследовали при помощи скрининга библиотеку из 15 остатков, и затем обнаружили минимальные связывающие последовательности длиной в 7 остатков. Се!/ (АС8 СЬет. Βΐοΐ., Мау 26, 2011) обнаружил минимальные связывающие домены длиной до 5 остатков. Связывающиеся с эритроцитами пептиды могут присутствовать в повторах тех же самых последовательностей, например, от 2 до 20 повторов; специалисты в данной области сразу поймут, что подразумеваются все диапазоны и значения в четко указанных пределах. Более того, пептиды могут присутствовать в комбинации, причем две или более последовательностей, расположены в одном пептиде или являются частью одной гибридной молекулы.
Полагают, что число последовательных остатков, которые обеспечивают специфическое связывание, находится от приблизительно 4 до 12 остатков. Соответственно, раскрыты все пептиды длиной из четырех последовательных остатков, которые можно найти в табл. 2, а также пептиды, например, из 5, 6, 7 или 8 последовательных остатков. Это число основано на числе остатков для других пептидных связывающихся с белком лигандов. Варианты осуществления настоящего изобретения включают последовательности минимальной длины для одной из связывающихся с эритроцитами 8Е^ ΙΌ, изложенных в данном документе, включая табл. 1. Соответственно, некоторые варианты осуществления относятся к композиции, содержащей пептид или выделенный (или очищенный) пептид, содержащий ряд последовательностей последовательных аминокислот с 4-12 последовательными аминокислотным остатками из последовательности, выбранной из группы, включающей 8Е^ ΙΌ ΝΟ: 11, 8Е^ ΙΌ ΝΟ: 13, 8Е^ ΙΌ ΝΟ: 14, 8Е^ ΙΌ ΝΟ: 15, 8Е^ ΙΌ ΝΟ: 16, 8Е^ ΙΌ ΝΟ: 17, 8Е^ ΙΌ ΝΟ: 1 и их консервативные замены, при этом указанная последовательность специфически связывается с эритроцитом. Альтернативно число последовательных остатков можно выбрать, равным от приблизительно 3 до приблизительно 18; специалисты в данной области сразу поймут, что подразумеваются все диапазоны и значения в четко указанных пределах, например, 7, 8, 9, 10 или от 8 до 18. Связывающаяся с эритроцитами последовательность может иметь, например, консервативную замену по меньшей мере одной и не более двух аминокислот последовательности, или 1, 2 или 3 замены, или от 1 до 5 замен. Более того, в обнаруженной последовательности часто может осуществить замену Б-аминокислот на Ό-аминокислоты, как описано у Сюгбапо. Пептид или композиция может в некоторых вариантах осуществления преимущественно состоять из последовательности, выбранной из группы, включающей 8Е^ ΙΌ ΝΟ: 11, 8Е^ ΙΌ ΝΟ: 13, 8Е^ ΙΌ ΝΟ: 14, 8Е^ ΙΌ ΝΟ: 15, 8Е^ ΙΌ ΝΟ: 16, 8Е^ ΙΌ ΝΟ: 17, 8Е^ ΙΌ ΝΟ: 1. Пептид может быть ограничен по длине, например, с числом остатков от приблизительно 10 до приблизительно 100; специалисты в данной области сразу поймут, что подразумеваются все диапазоны и значения в четко указанных пределах, например, от приблизительно 10 до приблизительно 50 или от приблизительно 15 до приблизительно 80. Можно предложить пептидный связывающийся с эритроцитами фрагмент, который содержит пептидный лиганд, который имеет константу диссоциации от приблизительно 10 до 0,1 нМ, определенную с помощью измерений равновесного связывания между пептидом и эритроцитами; специалисты в данной области сразу поймут, что подразумеваются все диапазоны и значения в четко указанных пределах, например, от при- 5 028087 близительно 1 мкМ до приблизительно 1 нМ. Пептид может дополнительно содержать терапевтическое средство. Терапевтическим средством может быть, например, белок, биопрепарат, фрагмент антитела, §сРу или пептид. Пептид может дополнительно содержать толерогенный антиген, например, белок человека, применяемый человеком с недостаточностью по этому белку (например, факторы крови, такие как фактор VIII или фактор IX), белки с гликозилированием, отличным от гликозилирования у человека, синтетические белки, не встречающиеся в естественных условиях у людей, пищевые аллергены человека или аутоиммунные антигены человека.
Полипептиды с различной длиной могут быть пригодны для определенного применения. В целом, полипептиды, которые содержат полипептидные последовательности лигандов, будут проявлять специфическое связывание в случаях, если полипептид может взаимодействовать с эритроцитами ίη νίνο. Пептиды, способные сворачиваться, можно протестировать с помощью способов, описанных в настоящем документе. Соответственно, некоторые варианты осуществления относятся к полипептидам, которые имеют полипептидный лиганд, но не встречаются в естественных условиях, а некоторые варианты осуществления относятся к полипептидам, имеющим определенную длину, например, от 6 до 3000 остатков, или 12-1000, или 12-100, или 10-50; специалисты в данной области сразу поймут, что подразумеваются все диапазоны и значения в четко указанных пределах.
Некоторые варианты осуществления предлагают различные полипептидные последовательности и/или очищенные или выделенные полипептиды. Полипептид представляет собой термин, который обозначает цепь аминокислотных остатков, не принимая во внимание посттрансляционную модификацию (например, фосфорилирование или гликозилирование) и/или комплексообразование с дополнительными полипептидами, синтез в комплексы из многих субъединиц, с нуклеиновыми кислотами и/или углеводами, или другими молекулами. Таким образом, в настоящем документе протеогликаны также называют полипептидами. Применяемый в настоящем документе функциональный полипептид является полипептидом, способным к активации указанной функции. Полипептиды можно получить рядом способов, многие из которых хорошо известны в данной области. Например, полипептиды можно получить с помощью экстракции (например, из выделенных клеток), экспрессии рекомбинантных нуклеиновых кислот, кодирующих полипептид, или химического синтеза. Полипептиды можно получить, например, с помощью рекомбинантной технологии и векторов экспрессии, кодирующих полипептид, введенный в клетки-хозяева (например, с помощью трансформации или трансфекции) для экспрессии кодируемого полипептида.
Существует ряд консервативных изменений, которые обычно можно выполнить без изменения активности. Эти изменения называются консервативными заменами или мутациями; другими словами, аминокислоту, принадлежащую к группе аминокислот, имеющих определенный размер и характеристику, можно заменить на другую аминокислоту. Замены для аминокислотной последовательности можно выбрать из других членов класса, к которому принадлежит аминокислота. Например, неполярные (гидрофобные) аминокислоты включают аланин, лейцин, изолейцин, валин, пролин, фенилаланин, триптофан, метионин и тирозин. Полярные нейтральные аминокислоты включают глицин, серии, треонин, цистеин, тирозин, аспарагин и глутамин. Положительно заряженные (основные) аминокислоты включат аргинин, лизин и гистидин. Отрицательно зараженные (кислые) аминокислоты включают аспарагиновую кислоту и глутаминовую кислоту. Предполагают, что такие изменения существенно не повлияют на кажущийся молекулярный вес, определенный с помощью электрофореза в полиакриламидном геле или изоэлектрической точки. Консервативные замены также включают замену оптических изомеров последовательностей другими оптическими изомерами, а именно, Ό-аминокислот на Ь-аминокислоты для одного или нескольких остатков последовательности. Более того, все аминокислоты в последовательности можно подвергнуть замене Ό-изомера на Ь-изомер. Иллюстративные консервативные замены включают, но без ограничения, Ьуз на Агд и наоборот для поддержания положительного заряда; О1и на Азр и наоборот для поддержания отрицательного заряда; Зег на ТЬт для поддержания свободной ОН-группы; и Ο1η на Азп для поддержания свободной ЫН2-группы. Более того, точечные мутации, делеции или вставки полипептидных последовательностей или соответствующих последовательностей нуклеиновых кислот в некоторых случаях можно получить без потери функции фрагмента полипептида или нуклеиновой кислоты. Замены могут содержать, включать, 1, 2, 3 или более остатка. Для аминокислотных остатков, описанных в настоящем документе, используют либо однобуквенное обозначение аминокислот, либо трехбуквенную аббревиатуру. Применяемые в настоящем документе аббревиатуры соответствуют стандартной номенклатуре полипептидов, ί. Βίο1. Сйеш. (1969), 243, 3552-3559. Все последовательности аминокислотных остатков представлены в настоящем документе с помощью формулы с левой и правой ориентацией в стандартном направлении от амино-конца к карбокси-концу.
В некоторых случаях может быть необходим процент идентичности пептида к последовательности, изложенной в настоящем документе. В таких случаях процент идентичности измеряют как число остатков пептида или части пептида. Полипептид, например, с идентичностью в 90%, также может быть частью более крупного пептида.
Применяемый в настоящем документе термин очищенный в отношении полипептида обозначает полипептид, который синтезировали химически и, таким образом, он практически не загрязнен другими
- 6 028087 полипептидами, или который отделили или очистили от большинства других клеточных компонентов, сопровождающих его в естественных условиях (например, других клеточных белков, полинуклеотидов или клеточных компонентов). Примером очищенного полипептида является такой полипептид, который по меньшей мере на 70% относительно сухого веса не содержит белки и органические молекулы природного происхождения, с которыми он связан в естественных условиях. Препарат очищенного полипептида, таким образом, может, например, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 90% или по меньшей мере на 99% относительно сухого веса представлять собой полипептид. Также можно сконструировать полипептиды, содержащие последовательность метки (например, полигистидиновой метки, тус-метки или РЬЛС®-метки), что облегчает очистку или маркировку полипептида (например, захват на аффинных матрицах, визуализацию под микроскопом). Таким образом, очищенная композиция, которая содержит полипептид, обозначает очищенный полипептид, если не указано иное. Термин выделенный указывает на то, что полипептиды или нуклеиновые кислоты по настоящему изобретению находятся не в своей естественной среде. Выделенные продукты по настоящему изобретению могут, таким образом, содержаться в надосадочной жидкости культуры, частично обогащенной, полученной из гетерологичных источников, клонированной или находящейся в составе с основой и др.
Полипептиды могут включать химическую модификацию; термин, который в настоящем контексте обозначает изменение естественной химической структуры аминокислот. Такие модификации можно создать в боковой цепи или в концевом участке, например, изменяя амино-конец или карбокси-конец. При некоторых вариантах осуществления модификации подходят для создания химических групп, которые в целях удобства можно применять для связывания полипептидов с другими материалами или для присоединения терапевтического средства.
Специфическое связывание, в силу того, что термин часто применяется в биологических областях, относится к молекуле, которая связывается с мишенью с относительно высокой аффинностью по сравнению с тканями, не являющимися мишенью, и, как правило, включает множество нековалентных взаимодействий, таких как электростатические взаимодействия, ван-дер-ваальсовые взаимодействия, образование водородных связей и др. Взаимодействия при специфическом связывании характеризуют взаимодействия при связывании типа антитело-антиген, связывании типа фермент-субстрат и особенно связывании типа белок-рецептор; вместе с тем такие молекулы время от времени помимо своих мишеней могут связываться с тканями, полагают, что такое связывание не обладает специфичностью и не является специфическим связыванием. Пептид ΕΚΥ1 и его производные, а также связывающиеся с эритроцитами пептиды человека и их производные при некоторых обстоятельствах могут связываться с объектами, не являющимися эритроцитами, но было замечено, что такое связывание было неспецифическим, доказательством чего является значительно большее связывание пептидов с эритроцитами в отличие от других клеток и белков.
Поэтому варианты осуществления включают лиганд, который специфически связывается с эритроцитом и не специфически связывается с другими компонентами крови, например, одним или несколькими из белков крови, альбумина, фибронектина, тромбоцитов, лейкоцитов, практически всех компонентов, обнаруживаемых в образце крови, взятом у обычного человека. В контексте образца крови термин практически все обозначает компоненты, которые присутствуют обычно, но исключают случайные компоненты в очень низких концентрациях, поэтому они не существенно снижают титр биодоступных в другом отношении лигандов.
Пептиды антител.
В дополнение к пептидам, которые связываются с эритроцитами, в данном документе также представлены белки, в частности антитела и особенно фрагменты одноцепочечных антител. Хорошо известны методики по индукции выработки антител против антигена. Термин антиген, в этом контексте, относится к сайту, распознаваемому иммунной системой хозяина, которая отвечает на антиген. Выбор антигенов известен в областях по индукции выработки антител, наряду с другими областями. Варианты осуществления включают применение этих пептидов в молекулярной гибридизации и других способах, представленных в данном документе. Антигены могут рекомбинантно экспрессироваться в своей полной форме или в виде частичных доменов, гибридизированных с метками, которые усиливают экспрессию или стабильность белка. Затем антиген рекомбинантного белка можно иммобилизировать на пластине или сфере и применять в качестве аффинной мишени для способа скрининга библиотеки. Антигены также можно выделить из клеточных препаратов цельной крови, из которых очищенные или сложные смеси мембранных белков можно иммобилизировать на твердой матрице (сфере, пластине или др.) и применять в качестве аффинных мишеней для способа скрининга.
Специалисты в данной области, читающие настоящее раскрытие, смогут создать антитела, которые специфически связываются с эритроцитами. Примеры 4-6 имеют отношение к созданию антител или их фрагментов. Для выявления новых антител или фрагментов антител или для создания композиций, содержащих такие фрагменты, активные в отношении эритроцитов, включая, но без ограничения, фаговый дисплей, дрожжевой дисплей и бактериальный дисплей, применяют многочисленные параллельные методики. Дополнительные связывающиеся с эритроцитами антитела или фрагменты антител или 8сРу можно, в частности, создать для одной или нескольких из следующих мишеней или групп мишеней (со- 7 028087 вместно называемых в данном документе как целевая группа эритроцита), выбранных из группы, включающей белок полосы 3 (СЭ233). аквапорин-1, С1и1-1. антиген Κί66, КйА§/КЬ50 (СЭ241). Кй (СЭ240). КЙ30СЕ (СЭ240СЕ), КН30Э (СО240Э), Кх, гликофорин А (СЭ235а), гликофорин В (СЭ235Ь), гликофорин С (СЭ235с), гликофорин Ό (СЭ2356), Ке11 (СЭ238), 1)и1'1\/1)АКС (СЭ234), СК1 (СЭ35), ЭАЕ (СЭ55), глобозид, СЭ44, 1САМ-4 (СЭ242), Ьи/В-САМ (СЭ239), ХО1/ХО2 (СО99), ΕΜΜΡΚΙΝ/нейротелин (СЮ147), ΙΜΗ, гликозилтрансферазу, СагЕупдйЕ ОотЬтоек, 4А/САВ, §с1апиа, МЕК2, стоматин, ВА-1 (СЭ24), ОР1У (СЭ36), СЭ108, СЭ139 и антиген Н (СО173).
Дополнительно можно создавать новые специфичные к эритроцитам антитела с помощью иммунизации мышей интактными или белковыми препаратами эритроцитов человека. После иммунизации мишени, находящейся в составе с адъювантом, мышей умерщвляют в заранее определенные моменты времени, и репертуары их антител секвенируют и/или их В-клетки выделяют для скрининга на основе гибридом. Эти антитела или фрагменты антител можно оптимизировать с помощью ряда упомянутых выше методик ίη νίΐτο с целью улучшения параметров связывания и/или стабильности. Можно создавать дополнительные связывающиеся с эритроцитами антитела или фрагменты антител с помощью гибридомных клонов антител с ранее обнаруженной способностью к связыванию с эритроцитами. Их можно создавать, например, с помощью способа, применяемого для создания бсЕу ТЕК119. В качестве матрицы, или в качестве источника антитела, можно применять следующие гибридомные клоны среди прочих: ВК1С 4, 5, 6, 10, 14, 18, 39, 66, 68, 69, 87, 108, 110, 111, 125, 126, 128, 145, 155, 157, 163, 170, 198, 203, 216, 220, 221, 222, 229, 230, 231, 235 или 256; ВКАС 17, 18; ВСКЬ 1, 2, 11, 100; ВКА1) 3; В1КМА Ό6, Ό10, К3, 84В; 6А7; СОЕ или ΚΖ1.
В данном документе термин пептид применяют взаимозаменяемо с термином полипептид. Антитела и фрагменты антител являются пептидами.
Термин фрагмент антитела обозначает часть антитела, которая сохраняет антигенсвязывающую функцию антитела. Фрагмент можно буквально создать из части более крупного антитела или, альтернативно, можно синтезировать бе ηονο. Фрагменты антител включают, например, одноцепочечный вариабельный фрагмент (хсЕу). бсЕу является гибридным белком на основе вариабельных участков тяжелой (νΗ) и легкой (Уъ) цепей иммуноглобулина, соединенных линкерным пептидом размером, например, от приблизительно 10 до приблизительно 50 аминокислот. Линкер может соединять Ν-конец νΗ с С-концом ν2 или наоборот. Термин 'ЭсЕу включает бивалентные бсЕу, диатела, триатела, тетратела и другие комбинации фрагментов антител. Антитела имеют антигенсвязывающую часть, обозначаемую как паратоп. Термин пептидный лиганд обозначает пептид, который не является частью паратопа.
Связывание эритроцитов с помощью антител и их фрагментов, пептидных связывающих лигандов и аптамеров можно выполнять без ковалентного связывания с эритроцитами. Связывание можно выполнять ίη νίνο и без события связывания с эритроцитами ех νίνο. Такое событие связывания, в том числе получаемую в результате ассоциацию антигена с эритроцитом, можно выполнять, не вызывая апоптоз эритроцитов. Этот процесс можно выполнить так, что поверхностные молекулы эритроцитов не сшиваются друг с другом посредством сшивающего средства и/или события связывания и не сшиваются с помощью ковалентных связей.
Биспецифические белковые конструкты для связывания антигенов с эритроцитами.
При создании белковых конструктов для связывания с эритроцитами основным вариантом разработки является создание одного белка или гибридной молекулы, которые содержат как антиген, представляющий интерес, так и связывающийся с эритроцитами фрагмент.
Альтернативной разработкой, которая может быть более эффективной в создании и применении, является биспецифический белок или молекулярный конструкт, который содержит один домен, связывающийся с эритроцитами, гибридизированный с дополнительным доменом, связывающимся прямо или непрямо с антигеном, представляющим интерес. В эту гибридную молекулу включают не сам антиген, представляющий интерес, а только фрагмент, который прямо или непрямо связывается с антигеном, представляющим интерес. По этой причине требования по модификации или конструированию антигена, представляющего интерес, отсутствуют. Одним примером такой разработки является биспецифическое антитело или фрагмент антитела, причем один домен антитела, специфичный для эритроцитов, подвергнут рекомбинантной гибридизации со вторым доменом антитела, который специфически связывается с биомолекулой, содержащей антиген, представляющий интерес. Внедряют множество различных конструктов на основе биспецифических антител, включая, без ограничения, тандемные бсЕу, диатела и тандемные молекулы 5сЕу-1дС (62). Также применяют другие небелковые каркасные структуры, включая полимерные наночастицы или другие поливалентные полимерные конъюгаты, которые сконструированы обладающими двойной специфичностью благодаря тому, что содержат домен, который связывается с антигеном, представляющим интерес, и другой домен, который связывается с эритроцитами.
Аффинные фрагменты биспецифического конструкта могут представлять собой любую комбинацию пептидных доменов и/или доменов фрагментов антител. Пептиды, которые связываются с эритроцитами или антигеном белка-мишени, получают с помощью традиционных методик скрининга библиотек пептидов, включая, например, скрининг библиотек пептидов на гранулах или в мультиплексном формате, фаговый дисплей, бактериальный дисплей и дрожжевой дисплей. Специфичность и аффин- 8 028087 ность сконструированного пептида к своей связываемой мишени характеризуют при помощи стандартных биохимических анализов, например, способов на основе ЕЬ1§Л, поверхностного плазмонного резонанса и проточной цитометрии. Антитела или фрагменты антител, которые связываются с эритроцитами или антигенами белков-мишеней, получают с помощью традиционных методик, например, способов гибридомной селекции, фагового дисплея, дрожжевого дисплея, бактериального дисплея, рибосомного дисплея или способов прямого секвенирования генов антител или протеомного секвенирования с участием иммунизированных животных. Специфичность и аффинность сконструированного антитела или фрагмента антитела к своей связываемой мишени характеризуют при помощи стандартных биохимических анализов, например, способов на основе ЕЫ§А, поверхностного плазмонного резонанса и проточной цитометрии.
После обнаружения и характеристики каждого аффинного фрагмента (пептида, антитела и/или домена антитела) их гибридизируют с образованием биспецифического молекулярного конструкта с помощью стандартных методик рекомбинантной ДНК, таких как сборочная ПЦР или прямой синтез генов, затем гибридный белок экспрессируется у подходящего хозяина. Биспецифические конструкты также создают путем химической конъюгации двух отдельных фрагментов совместно в любой комбинации, считающейся пригодной для биспецифического связывания (пептид-пептид, пептид-фрагмент антитела и др.). Для создания биспецифических антител с применением различных конфигураций из современного уровня техники (1) применяют два домена антитела. Дополнительно, для создания стабильных связей между каждым связывающим фрагментом и улучшения гибкости конструкта применяют синтетическую полимерную каркасную структуру (РЕО, РРО или другую). Для повышения аффинности связывания с эритроцитом, антигеном белка или обоими вследствие эффектов авидности также применяют разветвленные полимеры.
Характеристику эффективности связывания биспецифического конструкта проводят с помощью стандартных биохимических анализов аффинности связывания ίη νίΐτο, таких как ЕЫ8А и поверхностный плазмонный резонанс. Функциональные характеристики биспецифического конструкта ίη νίνο демонстрируют с помощью инъекции биспецифического конструкта или биспецифического конструкта и антигена модельным животным, таким как мыши или крысы, с последующим взятием образца крови и тестированием связывания как с эритроцитами, так и с антигенами с помощью аналогичных анализов ίη νίίτο.
Варианты осуществления включают фармацевтически приемлемую композицию, содержащую связывающийся с эритроцитами фрагмент, соединенный с доменом, который специфически связывается с мишенью. Мишень может включать в себя белок, при этом белок дополнительно содержит толерогенный антиген. Связывающийся с эритроцитами фрагмент может включать в себя пептидный лиганд, антитело, фрагмент антитела, одноцепочечный антигенсвязывающий домен (δεΡν) или аптамер. Домен можно выбрать из группы, включающей антитело, фрагмент антитела и одноцепочечный антигенсвязывающий домен (δεΡν), пептидный лиганд и аптамер. Вариантом осуществления является композиция, которая содержит член группы, выбранный из гибридной молекулы, тандемного δεΡν. диатела и тандемной молекулы 5сРу-1дО. при этом связывающийся с эритроцитами фрагмент и домен составляют часть указанного члена. Отдельный гибридный белок или кодирующая его нуклеиновая кислота могут содержать связывающийся с эритроцитами домен и другой домен, который связывается с мишенью.
Терапевтическое истощение антиген-специфических антител с помощью связывающихся с эритроцитами антигенов.
Индукция антиген-специфических антител неблагоприятно сказывается на лечении и может приводить к опасным побочным эффектам во время применения методов заместительной белковой терапии, в патогенезе аутоиммунитета и во время лечения биопрепаратами в целом (63-68). Терапевтические вмешательства, способные истощить циркулирующие антиген-специфические антитела в крови, должны оказывать положительное клиническое влияние в том, что истощение таких специфических к лекарственному средству антител способствовало бы дальнейшему лечению этим лекарственным средством при снижении в то же время риска нежелательных иммунологических побочных эффектов, обусловленных комплексами лекарственное средство-антитело. В типичном случае гемофилии А примерно у 30% пациентов происходит индукция антител к стандартному терапевтическому белковому лекарственному средству фактору VIII, что, таким образом, делает дальнейшее лечение фактором VIII опасным и неэффективным. Терапевтическое вмешательство, истощающее циркулирующие антитела, специфичные к фактору VIII, у такого пациента, снова дает возможность применения схемы лечения фактором VIII и избавляет от необходимости перехода пациента к другим более дорогостоящим и менее эффективным альтернативным методам лечения. В типичном случае системной красной волчанки (8ЬЕ, волчанка), аутоиммунного заболевания, опосредованного главным образом индукцией антител к нативным аутоантигенам организма, терапевтическое лечение, способное истощить антитела, специфичные к аутоантигенам, циркулирующим в крови, должно значительно уменьшить патогенез и прогрессирование заболевания после его начала.
Для истощения антиген-специфических антител конструируют антигены для связывания с циркулирующими эритроцитами после введения. Для образования связывающегося с эритроцитами антигена
- 9 028087 создают молекулярные конструкты на основе связывающегося с эритроцитами фрагмента, гибридизированного с антигеном, представляющим интерес. Альтернативно, можно применять биспецифический конструкт для создания связывающегося с эритроцитами состава на основе антигена, описанного выше. Таким образом, при инъекции связывающегося с эритроцитами антигена любое циркулирующее антитело, специфичное к этому антигену, будет связываться со сконструированным антигеном и таким образом будет тесно ассоциированным с циркулирующим эритроцитом ίη 8Йи. При тесной физической ассоциации антиген-специфического антитела и циркулирующей в естественных условиях клетки, такой как эритроцит, опасные воспалительные иммунные эффекты ингибируются регуляторными сигнальными молекулами, присутствующими на поверхности эритроцита. Эритроциты экспрессируют несколько регуляторных молекул на своей поверхности, в том числе, среди прочих, СЭ55 и СЭ59 (67).
Таким образом, антиген-специфические антитела остаются связанными с эритроцитами и направляются в места естественного выведения эритроцитов, во время чего они также выводятся. Эритроцит, декорированный антигенами, выполняет функцию клеточного хранилища и истощающего носителя для антиген-специфического антитела.
Истощение антиген-специфических антител характеризуют ίη νίνο после введения сконструированного антигенного конструкта с помощью периодического взятия крови у подопытных животных и выполнения методик титрования антиген-специфических антител, таких как ЕЬ1§А. Специфическое истощение или инактивация иммунных клеток, секретирующих антитела (В-клеток, плазматических клеток или других клеток) также характеризуют с помощью выделения иммунных клеток из крови, костного мозга, селезенки или лимфатической системы мышей-реципиентов и выполнения ίη νίίτο антигенспецифических анализов ЕЬ1§ро1 с повторной стимуляцией В-клеток и многопараметрической проточной цитометрии. В исследованиях, связанных с аутоиммунитетом, для характеристики эффектов связывающихся с эритроцитами антигенов в истощении аутоантигена применяются соответствующие мышиные модели аутоиммунных нарушений.
Применение композиций включает удаление антител из кровотока и/или их связывание с красными кровяными клетками. Вариантом осуществления является фармацевтически приемлемая композиция, содержащая связывающийся с эритроцитами фрагмент, соединенный с антигеном. Антиген может быть нативным аутоантигеном, например, антигеном системной красной волчанки. Антиген может альтернативно быть антигеном для терапевтического белка, который вводится пациенту, например, антигеном фактора VIII.
Аптамеры для специфического связывания с эритроцитами.
В дополнение к пептидным лигандам, которые связываются с эритроцитами, приводятся нуклеотидные аптамерные лиганды для поверхностных компонентов эритроцитов. Соответственно, аптамеры следует создавать и применять, как описано в данном документе для других связывающихся с эритроцитами фрагментов. ДНК- и РНК-аптамеры можно применять для обеспечения нековалентного связывания с эритроцитами. Поскольку аптамеры состоят только из нуклеотидов, они являются многообещающими молекулами нацеливающимися на биомолекулы, в том смысле, что для них надежно отработана методика скрининга, они легко синтезируются химическим путем и проявляют ограниченные побочные эффекты в виде токсичности и/или иммуногенности благодаря своему быстрому выведению ίη νίνο (КееТе, Ραί. е! а1., 2010). Кроме того, благодаря неканонической природе взаимодействия нуклеотид-белок-мишень, любая эффективная сигнализация со стороны агониста при связывании с мишенью ίη νίνο маловероятна, что способствует, таким образом, низкой иммуногенности и токсичности. По этой причине в настоящее время в клинических испытаниях с участием людей для ряда клинических показаний, включая лейкоз, макулярную дегенерацию, тромбоз и сахарный диабет 2 типа (КееТе, Рак е! а1., 2010), находятся многочисленные молекулы на основе аптамеров. Аптамеры также применялись в качестве нацеливающих средств для доставки нагрузки в виде лекарственных средств в конкретные ткани ίη νίνο в таких путях применения, как противоопухолевая химиотерапия или методики флуоресцентной или рентгенологической детекции опухолей (Кцскеу, Нш-пщ е! а1., 2011; §ау1а, Тата1и1а, е! а1., 2011).
Аптамеры представляют собой олигонуклеиновые кислоты или пептиды, которые связываются со специфической молекулой-мишенью. Аптамеры, как правило, создают для связывания с мишенью, представляющей интерес, путем их отбора из большого пула случайных последовательностей. Аптамеры можно классифицировать как ДНК-аптамеры, РНК-аптамеры или пептидные аптамеры. Аптамеры в виде нуклеиновых кислот являются разновидностями нуклеиновых кислот, которые сконструировали в ходе повторных циклов селекции ίη νίίτο или с помощью способа систематической эволюции лигандов экспоненциальным обогащением (§ЕЬЕХ) (АтсЬеш1х, Кембридж, Массачусетс, США) (§атр8οη, 2003) для специфического связывания с мишенями, такими как малые молекулы, белки, нуклеиновые кислоты, клетки, ткани и организмы. Пептидные аптамеры обычно имеют короткий вариабельный пептидный домен, прикрепленный обоими концами к белковой каркасной структуре. Пептидные аптамеры являются белками, предназначенными для препятствования взаимодействию других белков в клетках. Они содержат вариабельную пептидную петлю, прикрепленную обоими концами к белковой каркасной структуре. Это двойное структурное ограничение значительно повышает аффинность связывания пептидного аптамера до значения, сравнимого с таковым для антитела. Длина вариабельной петли обычно составляет от
- 10 028087 приблизительно десяти до приблизительно двадцати аминокислот, и каркасная структура является белком, который имеет хорошую растворимость и является компактным. Например, бактериальный белок тиоредоксин А является каркасным белком с вариабельной петлей, вставленной в восстанавливающий активный центр, которая в белке дикого типа представляет собой петлю -Су8-С1у-Рго-Су8-, при этом две боковые цепи цистеина способны образовывать дисульфидный мостик.
Некоторые методики создания аптамеров подробно описаны в Ьи с1 а1., Сйет Кеу 2009:109(5): 1948-1998, а также в И8 7892734, И8 7811809, И8 2010/0129820, И8 2009/0149656, И8 2006/0127929 и И8 2007/0111222. В примере 8 дополнительно подробно рассматриваются материалы и способы создания и применения аптамеров для применения в вариантах осуществления, раскрытых в данном документе.
Гибридная молекула.
Гибридную молекулу можно создать из первого пептидного связывающегося с эритроцитами лиганда и второго пептида. Гибрид содержит пептиды, конъюгированные прямо или непрямо друг с другом. Пептиды можно конъюгировать друг с другом прямо или непрямо, посредством линкера. Линкером может быть пептид, полимер, аптамер, нуклеиновая кислота или частица. Частицей может быть, например, микрочастица, наночастица, полимерсома, липосома или мицелла. Полимер может быть, например, природным, синтетическим, линейным или разветвленным. Гибридный белок, который содержит первый пептид и второй пептид, является примером гибридной молекулы, содержащей пептиды, при этом гибридный белок содержит пептиды, соединенные друг с другом напрямую или с помощью находящихся между ними линкерных последовательностей и/или дополнительных последовательностей на одном или обоих концах. Конъюгация с линкером может происходить посредством ковалентных связей. Другие связи включают ионные связи. Способы включают создание гибридной молекулы или композиции, содержащей гибридную молекулу, где гибридная молекула содержит пептиды, которые специфически связываются с эритроцитами и терапевтическим средством, толеризирующим антигеном или другим веществом.
Термин гибридная молекула или термин конъюгированный относится к прямой или непрямой ассоциации с помощью химических связей, включая ковалентные, электростатические ионные, между заряженными частицами. При конъюгации создается единица, поддерживаемая с помощью химического связывания. Прямая конъюгация обозначает химическое связывание со средством при наличии или в отсутствие промежуточных линкеров или химических групп. Непрямая конъюгация обозначает образование химической связи с носителем. Носитель может в значительной мере инкапсулировать средство, например, в случае полимерсомы, липосомы или некоторых видов наночастиц, или содержать средство на своей поверхности, например, в случае металлических наночастиц или гранул, или могут проявляться оба варианта, например, в случае частицы, которая содержит часть средства во внутренней части, а также на внешней части. Носитель также может инкапсулировать антиген для иммунотолерантности. Например, можно создать полимерсому, липосому или частицу, которые инкапсулируют антиген. Термин инкапсулировать обозначает полностью покрывать, фактически не оставляя открытой никакую часть, например, можно создать полимерсому, которая инкапсулирует антиген или средство. Примерами терапевтических средств являются одноцепочечные вариабельные фрагменты (δοΡν), фрагменты антител, лекарственные средства на основе малых молекул, биологически активные пептиды, биологически активные белки и биологически активные биомолекулы.
Конъюгацию можно выполнять посредством ковалентного связывания пептида с другой молекулой при наличии или в отсутствие линкера. Создание таких конъюгатов находится в пределах компетенции специалистов в данной области, и известны различные методики для выполнения конъюгации, при этом выбор определенной методики определяется материалами, которые необходимо конъюгировать. Добавляемые к полипептиду (на С- или Ν-конце) аминокислоты, которые содержат ионизируемые боковые цепи, например, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота, лизин, аргинин, цистеин, гистидин или тирозин, и которые не содержатся в активной части последовательности полипептида, служат в своем непротонированном состоянии мощными нуклеофилами для включения в различные реакции биоконъюгации с реакционноспособными группами, присоединенными к полимерам, т.е. с гомо- и гетеробифункциональными РЕС (например, Ьи1о1£ апй НиЬЬе11, Вютасгото1еси1е8 2003;4:713-22, Негтаи8ои, Вюсоищ§а!е ТесНпищех. Ьопйоп. Асайетю Рге88 Ый; 1996). В некоторых вариантах осуществления применяется растворимый полимерный линкер, и его можно вводить пациенту в фармацевтически приемлемой форме. В противном случае лекарственное средство можно инкапсулировать в полимерсомы или пузырьки или ковалентно присоединить к лиганду.
Вариантом осуществления является конъюгация небелкового терапевтического средства и пептидного лиганда, антитела, фрагмента антитела или аптамера, которые специфически связываются с эритроцитом. Применение методики, основанной на связывающихся с эритроцитами пептидах, не ограничивается полипептидными терапевтическими средствами; наоборот, ее можно переносить на другие лекарственные составы, такие как малые молекулы или полимерные частицы. В ходе продолжительного исследования малых молекул и их применения в медицине короткие периоды полужизни в кровотоке и низкая биодоступность постоянно ослабляли их эффективность ίη νί\Ό.
Полимерные мицеллы и наночастицы представляют сравнительно более новое поколение класса
- 11 028087 лекарственных средств, однако, их фармакокинетическое поведение остается субоптимальным по причинам, которые включают высокую скорость выведения в результате работы ретикулоэндотелиальной системы (МодЫш1 апб 5>/сЬсш. 2003). Разработки в направлении связывания с эритроцитами можно распространить на эти другие классы лекарственных средств для повышения их периодов полужизни в кровотоке и клинической эффективности.
Конъюгат может содержать частицу. Связывающийся с эритроцитами пептид может присоединяться к этой частице. Антиген, средство или другое вещество может находиться внутри или на поверхности частицы. Примеры наночастиц, мицелл и других частиц находятся, например, в И8 2008/0031899, И8 2010/0055189, И8 2010/0003338, каковые заявки настоящим включены в данный документ посредством ссылки для всех целей, включая их объединение с лигандом, изложенное в данном документе; однако, в случае конфликта контрольным документом является настоящее описание.
Наночастицы можно получать в виде наборов частиц, имеющих средний диаметр от приблизительно 10 нм до приблизительно 200 нм, включая все диапазоны и значения между точно обозначенными границами, например, от приблизительно 20 до приблизительно 200, и от приблизительно 20 до приблизительно 40, до приблизительно 70 или до приблизительно 100 нм, в зависимости от полидисперсных свойств, достигаемых с помощью препаративного способа. Можно применять различные системы наночастиц, как, например, образованные из сополимеров полиэтиленгликоля и полимолочной кислоты, образованные из сополимеров полиэтиленоксида и поли(бета-аминоэфира) и образованные из различных белков, таких как сывороточный альбумин. Специалистам в данных областях известны другие системы наночастиц. Также см. Эеуа1ара11у е! а1., Сапсег Сйето1йег РЬагтасо1., 07-25-06; Ьаидег е! а1., 1п!егиабоиа1 1оигпа1 о! РЬагтасеибск, 257:169-180 (2003); и ТоЪю е! а1., РЬагтасеибса1 КекеагсЬ, 15(2):270-275 (1998).
Также можно получать более крупные частицы со средним диаметром более чем приблизительно 200 нм, содержащие лиганды, связывающиеся с хрящевой тканью, причем эти частицы называются в данном документе микрочастицами, поскольку их размер начинает приближаться к микронному диапазону и примерно находится в пределах оптического разрешения. Например, некоторые методики создания микрочастиц изложены в патентах США № 5227165, 6022564, 6090925 и 6224794.
Функционализация наночастиц для задействования способности к нацеливанию требует ассоциации нацеливающего полипептида и частицы, например, достигаемой путем ковалентного связывания с помощью методики биоконъюгации, при этом выбор конкретной методики определяется частицей, или наночастицей, или другим конструктом, с которым полипептид должен быть соединен. Как правило, многие методики биоконъюгации для присоединения пептидов к другим материалам хорошо известны, и для конкретного материала можно выбрать наиболее подходящую методику. Например, с последовательностями полипептидов могут связываться дополнительные аминокислоты, такие как цистеин в случае присоединения полипептида к тиол-реактивным молекулам.
Для создания мультимерной молекулы, способной представлять несколько других биологически активных молекул, коммерчески доступный дендример РЕО с 8 ветвями подвергали химической модификации с целью включения реакционноспособных групп для легко осуществляемых реакций конъюгации. РЕО-пиридилсульфид с 8 ветвями содержал пиридилсульфидную группу, легко реагирующую с тиолатами малых молекул и/или цистеинсодержащих пептидов или белков, приводя к образованию дисульфидной связи между присоединенным биологически активным фрагментом и каркасной структурной на основе РЕО с 8 ветвями. Мультимерная конфигурация РЕО с 8 ветвями способствовала конъюгации различных пептидов или молекул с каркасной структурой с созданием, таким образом, гетерофункционализированной биомолекулы с несколькими видами активности за счет присоединенных к ней фрагментов. Были созданы гетерофункционализированные флуоресцентные конструкты на основе РЕО с 8 ветвями, способные к связыванию эритроцитов ίη уйго (фиг. 4А) и ίη У1уо (фиг. 4В). Это связывание являлось специфичным в отношении последовательности пептида ΕΚ.Υ1, поскольку конъюгаты, содержащие неспецифический пептид М1§, проявляли связывание с эритроцитами от незначительного до отсутствующего. Связывание ίη У1уо было длительным, поскольку флуоресцентный РΕО-ΕΚΥ1АЕЕХАРЬиОК647 с 8 ветвями выявлялся на циркулирующих эритроцитах спустя 5 ч после внутривенного введения и демонстрировал период полужизни на поверхности клеток, составлявший 2,2 ч (фиг. 5). Для демонстрации индукции толерантности в мышиной модели аутоиммунного диабета создали РЕО с 8 ветвями, конъюгированный как с ΕΚ.Υ1, так и с антигеном диабета хромогранином А (СгА). Модульная природа каркасной структуры РЕО-пиридилсульфид с 8 ветвями позволила производить совместную конъюгацию различных тиолсодержащих молекул с помощью последовательного добавления стехиометрически определенных количеств молекул.
Гибридная молекула может содержать полимер. Полимер может быть разветвленным или линейным. Гибридная молекула может содержать дендример. Как правило, можно применять растворимые гидрофильные биосовместимые полимеры для того, чтобы конъюгат был растворимым и обладал биодоступностью после введения пациенту. Примерами растворимых полимеров являются поливиниловые спирты, полиэтиленимины и полиэтиленгликоли (термин, включающий полиэтиленоксиды), имеющие молекулярную массу, составляющую по меньшей мере 100, 400 или от 100 до 400000 (при этом подразумеваются все диапазоны и значения в пределах этих четко указанных значений). Растворимость в этом
- 12 028087 контексте относится к растворимости в воде или физиологическом растворе, составляющей по меньшей мере 1 г/л. Также могут применяться домены биоразлагаемых полимеров, например, полимолочной кислоты, полигликолевой кислоты, сополимеров полимолочной и полигликолевой кислот, поликапролактонов, полигидроксимасляной кислоты, сложных полиортоэфиров, полиацеталей, полигидропиранов и полицианоакрилатов.
В некоторых вариантах осуществления получают и вводят в организм ассоциацию полипептидполимер, например, конъюгат, в виде очищенной композиции в фармацевтически приемлемом состоянии или с фармацевтическим наполнителем. Введение может быть, например, системным или происходить в определенном участке - ткани или месте трансплантации.
Специалисты в данных областях могут получать гибридные белки с помощью методик, известных в этих областях. Варианты осуществления включают создание гибридных белков, выделение их и введение их в фармацевтически приемлемой форме с другими средствами или без них, например, в комбинации с интерлейкином или ТСР-бета. Варианты осуществления включают вектор для трансфекции клетки и способы таковой для конструирования, таким образом, клетки с целью создания гибридного белка ίη νίνο, при этом клетку трансфицируют ίη νίίΓΟ, ех νίνο или ίη νίνο, и при этом клетка является частью тканевого имплантата или отличается от него. Следующие заявки на патенты США настоящим включены в данный документ посредством ссылки для всех целей, включая цели создания гибридных белков: 5227293, 5358857, 5885808, 5948639, 5994104, 6512103, 6562347, 6905688, 7175988, 7704943, И8 2002/0004037, И8 2005/0053579, И8 2005/0203022, И8 2005/0250936, И8 2009/0324538, при этом в случае конфликта контрольным документом является настоящее описание.
Варианты осуществления гибридной молекулы включают, например, гибридную молекулу, которая содержит толерогенный антиген и связывающийся с эритроцитами фрагмент, который специфически связывается с эритроцитом пациента и, таким образом, связывает антиген эритроцита, где гибридная молекула вводится в количестве, эффективном для выработки иммунотолерантности к веществу, которое содержит толерогенный антиген. Варианты осуществления включают, например, композицию, содержащую связывающийся с эритроцитами фрагмент, который специфически связывается с эритроцитом, соединенным с носителем, выбранным из группы, включающей полимер, разветвленный полимер и частицу, где носитель соединен с терапевтическим средством. Частицей может быть, например, микрочастица, наночастица, полимерсома, липосома или мицелла. Связывающийся с эритроцитами фрагмент может включать в себя пептид, содержащий по меньшей мере 5 последовательных аминокислотных остатков последовательности, выбранной из группы, включающей §ЕЦ ГО N0: 11, §ЕЦ ГО N0: 13, §ЕЦ ГО N0: 14, §ЕЦ ГО N0: 15, §ЕЦ ГО N0: 16, §ЕЦ ГО N0: 17, §ЕЦ ГО N0: 1 и их консервативные замены, где указанная последовательность специфически связывается с эритроцитом. Связывающийся с эритроцитами фрагмент может включать в себя антитело, фрагмент антитела, аптамер, 8сΡν или пептидный лиганд. Варианты осуществления гибридной молекулы включают связывающийся с эритроцитами фрагмент и толерогенный антиген, антитело, фрагмент антитела, 8сΡν, лекарственное средство на основе малых молекул, частицу, пептид или аптамер.
В предпочтительном аспекте настоящего изобретения предлагается гибридная молекула, которая содержит толерогенный антиген и связывающийся с эритроцитами фрагмент, выбранный из белка полосы 3 (СГО233), гликофорина В (СЭ235Ь). гликофорина С (СГО235с) и гликофорина Ό (СГО235Ь). Гибридная молекула, в частности, применяется при выработке иммунотолерантности. Предпочтительной гибридной молекулой является гибридная молекула, которая содержит толерогенный антиген, выбранный из белка, части белка, белка человека или его части, белка, отличного от белка человека, или его части, гликана, гликана белка, имеющего гликозилирование, отличное от гликозилирования у человека, аутоиммунного антигена человека, белка, являющегося терапевтическим для человека, или его части, а также части пищи человека, белков, для которых характерна недостаточность в связи с генетическим заболеванием, белков с гликозилированием, отличным от гликозилирования у человека, белков, отличных от белков человека, синтетических белков, в естественных условиях не встречающихся у людей, антигенов пищи человека, трансплантационных антигенов человека и аутоиммунных антигенов человека; а также связывающийся с эритроцитами фрагмент, выбранный из белка полосы 3 (СГО233), гликофорина В (СГО235Ь), гликофорина С (СГО235с), гликофорина Ό (СГО235Ь).
Связывающиеся с эритроцитами лиганды для улучшения фармакокинетических параметров.
Поскольку многие лекарственные средства системно доставляются в кровеносную систему, разрешение проблемы эффективной доставки лекарственного средства часто направлено на поддержание лекарственного средства в крови в течение продолжительных периодов времени. Таким образом, в результате разработки терапевтических средств длительного действия (с длительным периодом полужизни), которые остаются биологически доступными в крови в течение продолжительных периодов времени, будет представлено новое поколение лекарственных средств, сконструированных для обеспечения эффективности, безопасности и экономической целесообразности.
Варианты осуществления настоящего изобретения включают гибридные молекулы на основе связывающегося с эритроцитами пептида и терапевтического средства. Гибридные молекулы из пептидов, которые специфически связываются с эритроцитами, и терапевтического средства или другого вещества
- 13 028087 обеспечивают увеличение времени циркуляции (периода полужизни в кровотоке ίη νίνο) средства/вещества. Это увеличение может представлять собой увеличение периода полужизни в сыворотке, например, от приблизительно 1,5-кратного до 20-кратного, а специалисты в данной области сразу поймут, что подразумеваются все диапазоны и значения в пределах четко указанных диапазонов, например, приблизительно 3-кратное или приблизительно 6-кратное или от приблизительно 3-кратного до приблизительно 6-кратного.
Получение гибридных молекул можно осуществлять, например, путем рекомбинантного добавления пептида или добавления пептида с помощью химической конъюгации к реакционноспособному участку терапевтического средства или соответствующей молекулы или частицы. Поскольку для синтеза большого количества чистых пептидов с различными концевыми реакционноспособными группами можно применять твердофазный синтез пептидов, существует несколько стратегий конъюгации для присоединения пептида к терапевтическому средству. Хотя этот способ функционализации отличается от рекомбинантного способа, применяемого для белков, предполагается, что эффект будет тем же (связывание с эритроцитами, приводящее к увеличению периода полужизни в кровотоке).
Один вариант осуществления настоящего изобретения включает функционализацию терапевтических средств с короткими пептидными лигандами, которые специфически связываются с эритроцитами, как средство улучшения фармакокинетических параметров лекарственных средств. Эта методика увеличения периода полужизни учитывает ключевые параметры разработки лекарственных средств, а именно простоту производства, модульный принцип и способность регулировать эффект увеличения. С помощью стандартных методик рекомбинантной ДНК белки легко изменяют на уровне аминокислот, чтобы они содержали новые или измененные функциональные группы. Как правило, расчет на применение более коротких доменов пептидов для функционирования является предпочтительным по сравнению с применением более крупных доменов полипептидов по причинам, которые включают простоту производства, правильное сворачивание в функциональный терапевтический белок и минимальные биофизические изменения самого исходного терапевтического средства. Полипептиды, например, ΕΚΥ1, связывающийся с эритроцитами человека лиганд, или антитела или фрагменты антител можно сконструировать для специфического связывания с эритроцитами и конъюгировать с терапевтическим средством для увеличения биодоступности, например, измеряемой по периоду полужизни средства в кровотоке.
Результаты, описанные в данном документе, предоставляют возможности для создания гибридных молекул с целью улучшения фармакокинетических параметров терапевтических средств, таких как инсулин, ацетат прамлинтида, гормон роста, инсулиноподобный фактор роста 1, эритропоэтин, интерферон типа альфа-1, интерферон а2а, интерферон а2Ь, интерферон [31а. инте рферон β 1Ь. интерферон γ -1Ь, βглюкоцереброзидаза, аденозиндезаминаза, гранулоцитарный колониестимулирующий фактор, гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор, интерлейкин 1, интерлейкин 2, интерлейкин 11, фактор У11а, фактор VIII, фактор IX, эксенатид, Ь-аспарагиназа, расбуриказа, рецептор фактора некроза опухоли и энфувиртид.
Попытки других исследователей по созданию пассивных способов улучшения периода полужизни направлены на повышение видимого гидродинамического радиуса лекарственного средства. Аппарат клубочковой фильтрации почек является основным местом в организме, в котором происходит фильтрация компонентов крови. Основным детерминантом фильтрации является гидродинамический радиус молекулы в крови; меньшие молекулы (<80 кДа) отфильтровываются из крови в большей мере, чем более крупные молекулы. Исследователи воспользовались этим обобщенным правилом для модификации лекарственных средств с целью проявления ими большего гидродинамического радиуса и, таким образом, более длительного периода полужизни главным образом посредством химической конъюгации высокомолекулярных водорастворимых полимеров, таких как полиэтиленгликоль (ΡΕΟ). Успех этого способа очевиден в связи с тем, что в клинической практике в настоящее время предлагаются многочисленные терапевтические средства на основе пегилированных белков и малых молекул (Раки! апб νβτοηβδβ, 2009; ИзйЬитп, 2008). Будучи эффективными во многих случаях в увеличении периода полужизни в кровотоке, особенно в силу увеличения гидродинамического радиуса имплантата или гибрида (Оао, Ьш, е! а1., 2009), эти способы создают трудности при производстве и поддержании биологической эффекторной функции. Разнородность реакционных смесей для конъюгации может приводить к смешиванию сложных продуктов с различными видами биологической активности главным образом из-за использования химических соединений, не являющихся сайт-специфическими. Для поддержания однородности терапевтического препарата после применения способов тщательной очистки часто следует подробная биохимическая характеристика (Ниапд, Ооидй, е! а1., 2009; Вайоп, Ра11егот, е! а1., 2001; ПЬа11шп, Козз, е! а1., 2005). Помимо этого, присоединение крупных фрагментов, таких как разветвленные ΡΕΟ, к реакционноспособным местам белков может привести к снижению аффинности к рецепторам (ИзйЬитп, 2008).
В других работах других исследователей предложен терапевтический белок для связывания с альбумином с целью повышения циркуляции лекарственного средства (Эептз, 2002; ^а1кет, Оип1е\у, е! а1., 2010). Учитывая тот же самый общий вышеупомянутый принцип почечной фильтрации, Эепи1з с коллегами предположили, что повышение видимого размера терапевтического средства с помощью его конструирования для связывания с другим белком в крови (таким как сывороточный альбумин) должно сни- 14 028087 зить скорость выведения лекарственного средства. Таким образом, лекарственное средство достигает большого молекулярного размера только после введения в кровяное русло. Добавление связывающихся с сывороточным альбумином пептидов, подвергнутых созреванию аффинности, к фрагментам антител повышало их циркуляцию в крови мышей в 24 раза ГОепшз, 2002). Будучи эффективным, этот способ осложняется динамикой рециркуляции альбумина с помощью неонатального Рс-рецептора (РсРп) и применением циклических пептидов с ограниченным содержанием цистеина в целях обеспечения функциональных свойств. \Уа1кег с коллегами подтвердили результаты, предоставленные Эепп15 в 2002 г., а именно то, что придание сывороточному альбумину аффинности к белку увеличивает его период полужизни. Способ, описанный \Уа1кег с коллегами, включает рекомбинантное добавление крупных фрагментов антител к белковому лекарственному средству, которое может вызвать структурные нарушения, а также осложнения производства. Будучи простыми и эффективными, способы Эепп15 и \Уа1кег осложняются применением сложных циклических или крупных доменов в целях обеспечения функциональных свойств. Хотя пептиды, обнаруженные Эепп15 с коллегами, проявляли высокую аффинность к альбумину, перед применением они требуют физического ограничения корректно образующейся циклической структуры. Более громоздкий подход, способ гибридизации крупных фрагментов антител по \Уа1кег, может не подойти для белков, которые уже свернулись в сложную структуру или характеризуются низким уровнем экспрессии.
Одноцепочечные антитела.
Вариантом осуществления настоящего изобретения является гибридная молекула на основе 5сРν и пептида, который специфически связывается с эритроцитом. 5сРν можно применять в качестве терапевтического средства, а его комбинацию со связывающимся с эритроцитами пептидом можно применять для увеличения его периода полужизни в кровотоке и обеспечения доступа к частям тела. Рекомбинантные антитела и фрагменты рекомбинантных антител перспективны в качестве терапевтических средств в индустрии биопрепаратов (ЗНег^ап, 2010).
Фрагменты антител, представляющие собой одноцепочечные вариабельные фрагменты (5сРу), содержат целый антигенсвязывающий домен ЦС полной длины, но в них отсутствуют шарнирные и константные участки фрагментов (Маупатб апб Сеогдюи, 2000). Рекомбинантное конструирование 5сРν включает гибридизацию вариабельного домена тяжелой цепи (νΗ) с вариабельным доменом легкой цепи (Ж) с помощью короткого полипептидного линкера, включающего тандемные повторы глицина и серина (например, (ССССЗ)4) (8ЕЦ ГО N0: 18). Хотя простота 5сРν является привлекательной для терапевтических путей применения, их основным недостатком является короткий период полужизни, который они проявляют вследствие их относительно небольшой молекулярной массы в 26-28 кДа (^е15зег апб На11, 2009).
Поскольку глицин-сериновый линкер, обычно применяемый в разработке 5сРν, является нефункциональным по своей природе, а скорее существует в качестве физического мостика для обеспечения правильного сворачивания νΗ-ν2, в данном документе тестировали линкерные домены, которые проявляют функцию связывания с эритроцитами в крови. Таким образом, сконструированный 5сРν может быть многофункциональным и биспецифическим, проявляя аффинность к своему нативному антигену посредством доменов νΗ-ν и аффинность к эритроцитам посредством своего линкерного домена. При связывании с эритроцитами сконструированный 5сРν будет проявлять более длительный период полужизни в кровотоке, как было показано для другого модельного белка с теми же самыми функциональными свойствами. Фрагмент антитела 5сРν может иметь линкер, описанный в данном документе, или можно предложить другие линкеры, известные специалистам в данных областях. В альтернативном варианте осуществления предлагается свободная группа цистеина, встроенная в линкерную область 5сРν, и эта тиоловая группа цистеина применяется для связывания связывающегося с эритроцитами лиганда посредством химической конъюгации.
Разработка конструируемых 5сРν-фрагментов антител концентрировалась на важности длины линкерного домена, а также на расстоянии до него от связывающегося с эритроцитами пептида. Поскольку вариант дикого типа был разработан и утвержден для связывания антигена с линкером (ССССЗ)4 (8ЕЦ ГО N0: 18), последующих мутантов разрабатывали с линкером с минимальной длиной линкера 20 аминокислот. Поскольку линкерный домен может модулировать правильное сворачивание 5сРν в правильную третичную структуру, были разработаны два мутанта, содержащих ΕΚΥ1. Мутант РЕР содержит пептид ΕΡΥ1 в центре линкерного домена, фланкированный остатками С1у и Зег в соответствующем количестве, необходимом для поддержания исходной длины линкера в 20 аминокислот. В возможном случае, когда гидрофобная природа пептида ΕΡΥ1 не позволяет выполнить линейное выравнивание, но приводит к кластеризации с образованием более короткого собранного домена, длина линкера РЕР будет короче и поэтому может препятствовать правильному сворачиванию. По этим причинам был создан мутант ΓΝ8, содержащий добавленный пептид ΕРΥ1 в центре исходного линкерного домена, что удлиняло линкер до 32 аминокислот. Поскольку пептид ΕРΥ1 был обнаружен со свободным Ν-концом, не было известно, будет ли его присутствие в ограниченной конформации полипептида влиять на связывание с эритроцитами. Для решения вопроса, связанного с этим возможным поведением, был создан вариант 5сРν посредством химической конъюгации с синтетическим пептидом ΕРΥ1, причем Ν-конец пептида
- 15 028087 является свободным, а С-конец конъюгирован с 8сРу.
Таким образом, число связывающихся с эритроцитами пептидов и, следовательно, способность 5сРу к связыванию с эритроцитами можно стехиометрически регулировать в ходе реакции конъюгации. Соответственно, можно сконструировать 5сРу. содержащий связывающиеся с эритроцитами пептиды, как показано в данном документе. Варианты осуществления включают 8сРу, содержащий лиганды, количество которых варьирует в диапазоне от 1 до 20; специалисты в данной области сразу поймут, что подразумеваются все диапазоны и значения в четко указанных диапазонах, например, от 2 до 6.
Варианты осуществления включают 8сРу, конъюгированный с толерогенным антигеном для создания гибридной молекулы, которая индуцирует толерантность, например, как в примере 6, где подробно описывается формирование толерантности на примере формирования толерантности к ОУА, присоединенному к ксРу. В примере 6 также подробно описываются материалы и способы создания белковых конструктов на основе 8сРу, подвергнутых рекомбинантной гибридизации с эпитопом антигена, подвергаемым иммунному распознаванию. 5сРу направлен на распознавание эритроцитов. Антигеном является антиген, описанный в данном документе, например, толерогенный антиген. Действующие образцы, представленные в данном документе, описывают результаты с помощью мышиных моделей, с использованием ксРу ΤΕΚ119 мыши, применяемого в качестве домена антитела в конструктах. ΤΕΚ119 представляет собой антитело, которое связывается с эритроцитами мыши. Домен антитела ΤΕΚ119 можно заменить доменами других антител, например, доменами, направленными на эритроциты человека и других животных. Например, домен антитела 10Р7 можно применять для создания конструктов антителоантиген, способных к связыванию с эритроцитами человека. Дополнительные гибриды на основе 5сРу ΤΕΚ119 создавали с тремя различными антигенами, как представлено в примере 6, включая иммунодоминантный эпитоп ОУА, презентируемый МНС-Ι, мимотоп 1040-р31 хромогранина А и проинсулин.
В примере 13 описываются другие варианты осуществления созданных ксРу, в том числе варианты осуществления для тестирования в животных моделях и варианты осуществления, реактивные для людей. Они включают варианты, относящиеся к белковому уровню: ΤΕΚ119-δΙΙΝΕΕΚΡ, ΤΕΚ119-ΟιγΛ и ΤΕΚ119-проинсулин. Также они включают варианты, относящиеся к генетическому уровню: ΤΕΚ119δΠΝΡΕΚΌ, ΤΕΚ119-№Α, ΤΕΚ119-проинсулин, ΤΕΚΤ^^μ^, ΤΕΚ119-ΙηδΒ9-23, ΤΕΚ119ΙδρΑνΗΑΑΗΑΕΙΝΕΑΟΚ (5ΕΟ ΙΌ ΝΟ: 80), ΤΕΚ119-Η-2№, ΤΕΚ119-ΙΙ-2Κ 10Ρ7-δΙΙΝΡΕΚΡ, 10Р7-СРгА, 10Р7-проинсулин и 10Р7-уриказу.
Связывание эритроцитов с определенными участками, такими как участки сосудистой сети опухоли.
Помимо увеличения периода полужизни лекарственного средства, способность сконструированного препарата к связыванию с эритроцитами является применимой в целях селективного связывания с эритроцитами и их локализации в определенном месте в организме. При лечении солидных опухолей можно применять трансартериальную химиоэмболизацию (ΤΑСΕ) для ограничения кровоснабжения опухоли, что, таким образом, препятствует доступу к ней питательных веществ, необходимых для роста. Лечение с помощью ΤΑСΕ включает хирургическое введение полимерных твердых микрочастиц выше источника кровоснабжения опухоли. Поскольку микрочастицы достигают сосудистого ложа опухоли, они оказываются физически захваченными в сети кровеносных сосудов, что, таким образом, создает блокировку кровоснабжения опухоли (Уод1, №дшЬ, с1 а1., 2009).
Согласно основной идее ΤΑСΕ, вариантом осуществления в данном документе является применение аутологичных эритроцитов, циркулирующих в крови в качестве естественных микрочастиц для эмболизации опухоли, путем конструирования терапевтического средства, наводящегося на опухоль, содержащего связывающийся с эритроцитами пептид. Таким образом, терапевтическое средство локализуется в сосудистом ложе опухоли и привлекает проходящие эритроциты к связыванию с сосудом, таким образом ограничивая и блокируя поток крови в опухолевой массе. Такое лечение является менее инвазивным, чем классическая ΤΑСΕ: можно просто инъецировать лекарственное средство внутривенно и применять обычные эритроциты, уже находящиеся в крови, в качестве частицы для эмболизации. Термины связывающийся с опухолью и наводящийся на опухоль относятся к пептиду, который связывается с компонентом, доступным из компартмента-крови сосудистой сети опухоли или на клетках опухоли.
Обнаружение специфических терапевтических средств, наводящихся на опухоли, известно в области исследования рака. Парадигма биологически активного нацеливания на опухоли основана на связывании с белковыми маркерами, специфически экспрессирующимися в окружении опухоли. Они включают, без ограничения: ΚΟΌ-направленные интегрины, аминопептидазы А и Ν, эндосиалин, нуклеолин клеточной поверхности, аннексии-1 клеточной поверхности, рецептор р32/дС1с| клеточной поверхности, плектин-1 клеточной поверхности, фибронектины ΕΌΑ и ΕΌΒ, а-рецептор интерлейкина 11, тенасцин С, эндоглин/СО105, ΒδΤ-2, галектин-1, УСАМ-1, фибрин и рецептор тканевого фактора (Ропкай, №со1ау, с1 а1., 2010; Όίβηδΐ, Сгипоте, е! а1., 2005; КиобйаЬй, ВРаРа, е! а1., 2010; Τ1ιί)550ΐι Рок!е1, е! а1., 2006; 8сРРетапп, КоекР, е! а1., 2010; Вгаск, 5>Пасск е! а1., 2006; КуЬак, КоекР, е! а1., 2007). Терапевтическое средство, нацеленное на любую из этих молекул, может быть вектором для переноса связывающегося с эритроцитами пептида в сосудистую сеть опухоли с вызовом специфической окклюзии.
- 16 028087
Вариантом осуществления является первый лиганд, который специфически связывается с эритроцитами, конъюгированный со вторым лигандом, который специфически связывается с раковой клеткой, или сосудистой сетью опухоли, или компонентом сосудистой сети опухоли, таким как белок в субэндотелии (который в опухоли частично подвергается воздействию крови) или белок на поверхности эндотелиальной клетки опухоли. Лиганд может быть частью фармацевтически приемлемой композиции, которую вводят пациенту, например, в кровоток. Лиганды связываются с эритроцитами, и лиганд, наводящийся на опухоль, связывается с участком в или возле опухоли или сосудистой сети опухоли или с раковой клеткой. Эритроциты собираются в целевом участке и блокируют доступ к целевому участку питательных веществ, например, путем эмболизации кровеносного сосуда. С учетом того, что эмболизация является механической, определенной на основании физического размера эритроцитов, эмболизация будет мгновенной.
Солидные опухоли сильно зависят от своей системы кровоснабжения, и были разработаны терапевтические средства на основе биомолекул, а также синтетические терапевтические средства для блокирования роста системы кровоснабжения или блокирования потока по системе кровоснабжения. Вариантом осуществления является состав на основе биомолекул или состав на основе биомолекул и наночастиц, который необходимо инъецировать системно для быстрой окклюзии сосудистой сети солидных опухолей в первичной опухоли или в метастазах известной или неизвестной локализации.
Подход с эмболизацией опухоли реализован во многих направлениях, включая применение способов на основе частиц и биомолекул. Частицы из биоматериалов, включая таковые, созданные из поливинилового спирта, имеют диаметр, больший, чем у микрососудистой сети опухоли, например, их диаметр составляет 50-500 мкм, и были разработаны для применения в клинической практике при транскатетерной артериальной эмболизации, или ТАСЕ (Ма1иссю, Соуеу, е! а1., 2008). Параллельный подход включает химиотерапевтические препараты, загруженные внутрь частиц для медленного высвобождения при трансартериальной эмболизации (ТАСЕ), применяемой главным образом для лечения гепатоклеточной карциномы (Саба1е1а апб Вашеп. 2010). В обоих случаях, когда частицы инъецируют в артериальный кровоток, обычно интервенционным радиологом под рентгенографическим контролем, эти частицы могут проникать в сосудистую сеть опухоли и приводить к ее окклюзии, блокируя поток (Ма1иссю, Соуеу, е! а1., 2008). При этих локальных подходах лечению подвергается только опухоль, на которую непосредственно нацелен катетер благодаря своему расположению, а другие опухоли, такие как метастазы известной или неизвестной локализации, остаются нелечеными, поскольку частицы с трудом направляются в сосуды. В последнее время были разработаны подходы с применением биомолекул, например, в которых используются биспецифические антитела, которые распознают как фактор тромбоза, так и маркер сосудистого эндотелия опухоли, отсутствующие в нормальной сосудистой сети. После специфического связывания с сосудистой сетью опухоли антитела накапливаются и вызывают образование кровяных сгустков в сосудах опухоли для их блокирования; этот эффект был индуцирован только тогда, когда антитело направляли в опухоль (Ниапд, Мо1ета, е! а1., 1997). Эти подходы с применением биомолекул имеют преимущество нацеливания как на первичные, так и на вторичные опухоли при внутривенных инфузиях в случаях, когда можно выявить специфические характерные признаки сосудов опухоли; однако, они имеют недостаток, заключающийся в неспособности к обеспечению мгновенной механической окклюзии в опухоли.
Варианты осуществления настоящего изобретения включают способ эмболизации опухоли пациента, включающий введение композиции пациенту, которая содержит связывающийся с эритроцитами фрагмент, соединенный с нацеливающим фрагментом, в которой нацеливающим фрагментом является антитело, фрагмент антитела или пептид, который направляется к мишени, выбранной из группы, включающей опухоль и микрососудистую сеть опухоли, и в которой связывающийся с эритроцитами фрагмент включает в себя пептид, антитело, фрагмент антитела или аптамер, которые специфически связываются с эритроцитами. Пептидом может являться, например, последовательность, приведенная в данном документе.
Антиген-специфическая иммунологическая толерантность.
Помимо улучшения фармакокинетического поведения терапевтического средства, было обнаружено, что аффинность к эритроцитам может применяться в способах создания антиген-специфической толерантности. В примерах изложены ряд действующих и возможных для применения вариантов осуществления. Толерогенез, как показано в данном документе, может приводить к элиминации циркулирующих антител к антигену или уменьшению количества циркулирующих антител к антигену по меньшей мере в 10 раз, т.е. по меньшей мере в 100 раз, по меньшей мере в 1000 раз или более чем в 10000 раз. Толерогенез может предупредить, излечить заболевание или замедлить его прогрессирование, уменьшить или устранить отторжение трансплантированной ткани или уменьшить или устранить аллергическую реакцию на вещество.
В примерах 3 и 10-12 подробно описано, как формировали толерантность в мышиных животных моделях, предсказывающих поведение у человека. В примере 3 показано формирование толерантности с помощью тестового антигена (овальбумина), соединенного с пептидным лигандом, который связывается с поверхностью эритроцита. В примерах 10-12 подтверждаются результаты примера 3 и предлагаются
- 17 028087 дополнительные действующие образцы, показывающие формирование толерантности с помощью овальбумина, присоединенного к 8сΡν, и аспарагиназы, присоединенной к пептидному лиганду. В примере 12 предложен действующий образец, показывающий формирование толерантности, которая обуславливает реверсию предсуществующего иммунного отторжения. Соответственно, варианты осуществления включат молекулу-гибрид для толерогенеза, содержащую аспарагиназу, антигенный фрагмент аспарагиназы или антигенный мимотоп аспарагиназы и связывающийся с эритроцитами фрагмент, при этом связывающийся с эритроцитами фрагмент специфически связывается, например, с гликофорином А или мишенью, выбранной из группы, включающей белок полосы 3, гликофорин В, гликофорина С или другие члены целевой группы эритроцита. Связывающийся с эритроцитами фрагмент, можно, например, выбрать из группы, включающей антитела, фрагменты антител, 8сΡν, пептидные лиганды и аптамеры, и/или из группы, включающей ΕΚΥ19, ΕΚΥ59, ΕΚΥ64, ΕΚΥ123, ΕΚΥ141, ΕΚΥ162, ΕΚΥ19', ΕΚΥ59', ΕΚΥ64', ΕΚΥ1231, ΕΚΥ1411 и ΕΚΥ1621 и их консервативные замены. Эти молекулы-гибриды можно применять профилактически перед первым введением аспарагиназы, в течение курса лечения аспарагиназой и/или после курса лечения аспарагиназой. Эти молекулы-гибриды можно применять перед тем, как будет наблюдаться иммунный ответ на лекарственное средство аспарагиназу, или после того, как будет наблюдаться такой ответ.
В примере 3 описан пептид ΕΚΥ1, который связывается с эритроцитами мыши. Была создана гибридная молекула на основе ΕΚΥ1 и тестового антигена, овальбумина (ΟνΑ). Гибрид специфически связывался с эритроцитами ίη νίνο и не связывался с другими молекулами, включая таковые в крови или сосудистой сети. Наблюдали продолжительный период полужизни в кровотоке. Было замечено, что связывание эритроцита с ΕΚΥ1-ΟνΑ приводит к эффективной перекрестной презентации иммунодоминантного эпитопа ΟνΑ, презентируемого МНС Ι (δΙΙΝΡΕΚΕ), с помощью антигенпрезентирующих клеток (АРС) и соответствующего примирования реактивных Т-клеток перекрестно-реагирующим антигеном. ΕΚΥ1-ΟνΑ индуцировал пролиферацию гораздо большего количества аннексин-У СЭ8+ Т-клеток, чем ΟνΑ, что свидетельствовало об апоптическом исходе, который в конечном итоге должен привести к клональной делеции. С помощью достоверной модели стимуляции ΟΤ-I с выработкой толерантности (Ьш, Ινοώ·ι. е1 а1., 2002) (фиг. 2) было показано, что ΕΚΥ1-ΟνΑ предупреждает последующие иммунные ответы на опосредованную вакциной антигенную стимуляцию даже с очень сильным адъювантом бактериального происхождения. Внутривенное введение ΕΚΥ1-ΟνΑ приводило к выраженному сокращению популяций ΕΌ8' Т-клеток ΟΤ-I в дренирующих лимфатических узлах (фиг. 2; диапазон отображения данных на фиг. 2Ь) и селезенке по сравнению с мышами, которым вводили немодифицированный ΟνΑ перед антигенной стимуляцией с ^Рδ (фиг. 2с), что указывает на делеционную толерантность. Эта эффективная клональная деления, проявляемая у мышей, которым вводили ΕΚΥ1-ΟνΑ, подтвердила более ранние наблюдения усиленного примирования ΕΌ8' Т-клеток ΟΤ-I перекрестно-реагирующим антигеном и также показала, что примирование перекрестно-реагирующим антигеном происходило в отсутствие презентации костимулирующих молекул с помощью АРС для активации делеционной толерантности. Внутривенное введение ΕΚΥ1-ΟνΑ приводило к снижению уровней ΟνΑ-специфического ΙβΟ в сыворотке в 39,8 раз спустя 19 дней после первого введения антигена (фиг. 3) по сравнению с мышами, обработанными ΟνΑ. Для дальнейшего подтверждения индукции антиген-специфической иммунной толерантности модель стимуляции ΟΤ-I с выработкой толерантности объединяли с моделью опухолевого имплантата, экспрессирующего ΟνΑ (фиг. 2), с получением положительных результатов. Результаты, подробно представленные в этом примере, показывают, что связывание ΕΚΥ1-ΟνΑ с эритроцитами индуцирует антиген-специфическую иммунную толерантность. Она проявлялась в ответ на стимуляцию с сильным адъювантом, а также на имплантированные клеточные имплантаты, экспрессирующие ксеноантиген. Кроме этого, толерантности достигали с помощью функциональной инактивации и делеции реактивных ΕΌ8' Т-клеток в процессе взаимодействия с антигеном, присутствующим на циркулирующих эритроцитах, независимо от непосредственной регуляции ΕΌ4' Т -клеток. Эти подробные эксперименты с ΕΚΥ1, связывающимся с эритроцитами мыши пептидом, предсказывают подобные результаты у людей с применением связывающихся с эритроцитами человека пептидов, некоторые из которых рассматриваются в данном документе. Кроме этого, при показанной эффективности пептидных лигандов подобные результаты можно получить с применением конъюгатов с другими связывающимися с эритроцитами лигандами, например, антителами, фрагментами антител или аптамерами, когда эти фрагменты связываются с поверхностной молекулой эритроцита, например, одним из поверхностных белков или антигенов, приведенных в данном документе.
В примере 10 дополнительно продемонстрировано формирование толерантности к толерогенному антигену с помощью гибридизации толерогенного антигена с 8сΡν, который связывается с эритроцитом, и получение гибридной молекулы в качестве лекарственного препарата для введения пациенту. В примере 10 продемонстрирована индукция толерантности к иммунодоминантному домену ΟνΑ, презентируемому МНС-Ι, который представляет собой пептид δΙΙΝΡΕΚΕ (δΕΟ ΙΌ ΝΟ: 3). Этот антиген гибридизировали с δсΡν ΤΕΚ-119, который, как известно, связывается с эритроцитами мыши. Пролиферация ΟΌ8+ Тклеток ΟΉ, определенная по разбавлению флуоресцентного средства ΟΡδΕ, измеренному с помощью проточной цитометрии, значительно усиливалась у мышей, которым вводили ΤΕΚ119-δIINΡΕΚ^, по
- 18 028087 сравнению с теми, кому вводили ΕКΥ1-ОУΛ или ОУА (фиг. 8), что указывало на то, что связывание с эритроцитами повышало примирование антиген-специфических 0Ό8+ Т-клеток перекрестнореагирующим антигеном по сравнению с растворимым антигеном 81ЮТЕКЬ. Также эти данные демонстрируют, что фрагменты антител, предназначенные для связывания с эритроцитами и представления эпитопов для иммунной системы, подвергаются эффективному процессингу иммунными клетками для примирования антиген-специфических Т-клеток перекрестно-реагирующим антигеном. Эти результаты по перекрестной презентации и примированию перекрестно-реагирующим антигеном согласуются с другими исследованиями касательно презентации толерогенных антигенов на ΜΗ0 I посредством поглощения АРС антигена, выделенного из апоптических клеток (А1Ьей 1998, Огееи 2009). ТЕКТт^ПОТЕКЬ и ΕКΥ1-ОУΛ индуцировали пролиферацию гораздо большего количества аннексии-У+ и ΡΌ-1+ ОТ-Ι 0Ό8+ Т-клеток, чем ОУА (фиг. 13), что указывало на истощение и апоптический исход, которые приводят к клональной делеции. Этот фенотип пролиферирующих 0Ό8' Т-клеток согласуется с другими описанными моделями адаптивного переноса ОТ-Ι, в которых регулируемое вовлечение рецептора антигенспецифических Т-клеток с помощью АРС не приводит к индукции воспалительных ответов (ВшъсЬ, Ктсй, е! а1., 2009).
Как видно из примера 10, была продемонстрирована способность ΊΈΚ.119-δΙΙΝϊΈΚΕ и ΕКΥ1-ОУΛ к предупреждению последующих иммунных ответов на опосредованную вакциной антигенную стимуляцию даже при стимуляции с очень сильным адъювантом бактериального происхождения. Таким образом, молекулы-гибриды с 8сРу или пептидным лигандом для связывания с эритроцитами были эффективными в выработке толерантности.
В примере 11 показано, что возможно индуцировать антиген-специфическую иммунную толерантность по отношению к терапевтическим белкам и белкам с терапевтическим потенциалом. Многие терапевтические белки индуцируют иммунные реакции, что делает их клиническое применение опасным и неэффективным. Аспарагиназа является терапевтическим ферментом микробного происхождения, применяемым для лечения острого лимфобластного лейкоза, однако, также индуцирует опасные иммунные ответы, которые исключают ее повторное применение. Применяли мышиную модель. Мышам вводили молекулу-гибрид на основе аспарагиназы и связывающегося с эритроцитами фрагмента (пептида ΕКΥ1), и их сравнивали с мышами, обработанными лекарственным средством аспарагиназой для клинического применения. Лекарственное средство аспарагиназа приводило, а молекула-гибрид не приводила к выработке антител; в этом тестировании установили, что уровни антител можно применять в качестве меры толерантности. Позже толерантность подтвердили посредством введения молекулы-гибрида мышам с последующим повторным введением лекарственного средства аспарагиназы для клинического применения и наблюдения отсутствия выраженного ответа с выработкой антител даже после очень интенсивной стимуляции с повторным введением доз лекарственного средства. В противоположность, мыши, которые получали лекарственное средство, а не молекулу-гибрид, становились иммунореактивными и до опасной степени гиперчувствительными.
В примере 12 показана возможность иммунной реверсии. Мышей, которые были иммунореактивными в отношении белка, обрабатывали для того, чтобы они стали толерантными к белку. Применяли мышиную модель с аспарагиназой из примера 11. Мышей, которые были иммунореактивными в отношении лекарственного средства аспарагиназы, обрабатывали молекулой-гибридом (связывающую аспарагиназу и эритроцит), и они становились толерантными к лекарственному средству аспарагиназе.
В противоположность, в предыдущих сообщениях указывается, что иммунное отторжение формируется посредством прикрепления антигена к поверхности эритроцита для создания, таким образом, вакцины, а согласно другим сообщениям для создания вакцин применяли антигены, инкапсулированные в эритроциты. Например, если антиген инкапсулирован в эритроцит, то благодаря этому создается вакцина (ΜιίΓΗΚ е! а1., Уассше 24: 6129-6139 (2006)). В противном случае антигены, конъюгированные с поверхностью эритроцитов, были иммуногенными и предлагались в качестве вакцины (ОйагаШий е! а1., Уассше 15(3): 276-280 (1997)). В этих литературных источниках показано, что доставка эритроцитов приближает иммунный ответ практически к уровню ответов, получаемых для нормальных вакцин с адъювантами. Другие исследователи сообщали, что размещение внутри эритроцита является необходимым для индукции толерантности, как указано в заявке на патент \О 2011/051346, в которой также изложен ряд способов, с помощью которых изменяют поверхность эритроцита с целью усиления выведения клетками Купфера в печени. В этой же заявке также изложено связывании антител с поверхностными белками эритроцитов, такими как гликофорин А, но с целью создания иммунных комплексов на эритроците для усиления его выведения клетками Купфера.
Варианты осуществления, изложенные в данном документе, предлагают способ выработки иммунотолерантности, при этом способ включает введение композиции, содержащей гибридную молекулу, которая содержит толерогенный антиген и связывающийся с эритроцитами фрагмент, который специфически связывается с эритроцитом пациента и, таким образом, связывает антиген эритроцита, где гибридная молекула вводится в количестве, эффективном для выработки иммунотолерантности к веществу, которое содержит толерогенный антиген. Эритроцит и пациент могут не подвергаться обработкам, которые вызывают другие изменения эритроцитов, и не подвергаться сшиванию с эритроцитами, химической кова- 19 028087 лентной конъюгации, покрыванию и другим изменениям, отличным от специфического связывания с пептидом. Гибридная молекула может содержать или иметь в составе связывающийся с эритроцитами фрагмент, напрямую ковалентно связанный с антигеном. Гибридная молекула может содержать связывающийся с эритроцитами фрагмент, присоединенный к частице, которая присоединена к антигену. Частица может включать в себя микрочастицу, наночастицу, липосому, полимерсому или мицеллу. Толерогенный антиген может включать в себя часть терапевтического белка, например, фактора крови, вводимого пациенту, страдающему от отсутствия выработки фактора. Варианты осуществления включают примеры, в которых пациент является человеком и толерогенный антиген является белком человека, недостаточность которого, обусловленную генетическими факторами, испытывает пациент; в которых пациент является человеком и толерогенный антиген содержит часть белка, отличного от белка человека; в которых пациент является человеком, и толерогенный антиген включает в себя часть сконструированного терапевтического белка, в естественных условиях не встречающегося у человека; в которых пациент является человеком, и толерогенный антиген включает в себя часть белка, имеющего гликозилирование, отличное от гликозилирования у человека; в которых толерогенный антиген включает в себя часть белка, характерного для аутоиммунного заболевания человека; в которых толерогенный антиген является антигеном аллогенного трансплантата; в которых толерогенный антиген включает в себя часть вещества, выбранного из группы, включающей пищу человека; и/или в которых связывающийся с эритроцитами фрагмент выбран из группы, включающей пептид, антитело и фрагмента антитела. Варианты осуществления включают материалы и способы для толеризации, в которых связывающийся с эритроцитами фрагмент включает в себя пептид, содержащий по меньшей мере 5 последовательных аминокислотных остатков последовательности, выбранной из группы, включающей 8Е0 ГО N0: 11, 8Е0 ГО N0: 13, 8Е0 ГО N0: 14, 8Е0 ГО N0: 15, 8Е0 ГО N0: 16, 8Е0 ГО N0: 17, 8Е0 ГО N0: 1 и их консервативные замены, где указанная последовательность специфически связывается с эритроцитом.
Можно выбрать гибридную молекулу для размещения антигена внутри или снаружи эритроцита. Не привязываясь к конкретному механизму действия, представляют следующую теорию. У человека ежедневно становятся апоптическими (эриптотическими) и выводятся приблизительно 1% эритроцитов, что представляет собой большое количество клеток, и их белки подвергаются процессингу таким образом, чтобы поддерживать толерантность к аутоантигенам эритроцитов. Антиген, сконструированный для связывания с эритроцитами посредством применения пептида ЕКУ1 или связывающегося с эритроцитами человека пептида, связывающегося с эритроцитами одноцепочечного антитела или антитела, связывающегося с эритроцитами аптамера или другого связывающегося с эритроцитами средства, может вызывать такой же толерогенный ответ. С учетом того, что существующий в современном уровне техники способ, разработанный МШет с коллегами (см. ранее) является трудоемким в том плане, что требует сбора и введения в реакцию донорских спленоцитов для повторного введения, данный способ нековалентного связывания с эритроцитами обеспечивает более простую альтернативу. Поскольку взаимодействие ЕКУ1 с эритроцитом, или связывающегося с эритроцитами человека пептида с эритроцитом, или другой аффинной биомолекулы (например, одноцепочечного антитела, антитела или аптамера) происходит спонтанно после введения конъюгата или гибрида на основе антигена ίη νίνο, сконструированный антиген легко вводят посредством инъекции, и связывание происходит ίη δίΐυ.
В некоторых случаях толерогенный антиген получают из белка терапевтического средства, толерантность к которому является желательной. Примерами являются белковые лекарственные средства дикого типа, например, фактор VIII или фактор IX человека, к которым у пациентов не выработалась центральная толерантность в связи с наблюдаемой у них недостаточностью этих белков; или лекарственные средства на основе белков, отличных от белков человека, применяемые у человека. Другими примерами являются белковые лекарственные средства, подвергнутые гликозилированию с образованием форм, отличных от таковых у человека, по производственным причинам или сконструированные белковые лекарственные средства, например, имеющие ненативные последовательности, которые могут вызывать нежелательный иммунный ответ. Примеры толерогенных антигенов, которые являются сконструированными терапевтическими белками, в естественных условиях не встречающимися у людей, включают белки человека с внедренными мутациями, например, мутациями с целью улучшения фармакологических характеристик. Примеры толерогенных антигенов, имеющих гликозилирование, отличное от гликозилирования у человека, включают белки, вырабатываемые в клетках дрожжей и насекомых.
Варианты осуществления включают введение белка при некоторой частоте X или дозе Υ, а также введение антигена этого белка при меньшей частоте и/или дозе, например, при частоте, не превышающей 0,2Х, или дозе, не превышающей 0,2Υ; специалисты в данной области сразу поймут, что подразумеваются все диапазоны и значения в четко указанных диапазонах, например, 0,01 или 0,05Х или какой-либо диапазон между ними.
Варианты осуществления включают выбор толерогенного антигена из белков, которые вводят людям с недостаточностью этого белка. С недостаточностью означает, что у пациента, получающего белок, в естественных условиях не вырабатывается белок в достаточном количестве. Кроме этого, белки могут быть белками, недостаточность которых, обусловленную генетическими факторами, испытывает пациент. Такие белки включают, например, антитромбин III, протеин С, фактор VIII, фактор IX, гормон
- 20 028087 роста, соматотропин, инсулин, ацетат прамлинтида, мекасермин (1СР-1), β-глюкоцереброзидазу, αалглюкозидазу, ларонидазу (-Ь-идуронидазу), идурсурфазу (идуронат-2-сульфатазу), галсульфазу, αагалзидазу α (-галактозидазу), ингибитор-1-протеиназы и альбумин. Соответственно, варианты осуществления включат молекулу-гибрид для толерогенеза, содержащую связывающийся с эритроцитами фрагмент и по меньшей мере один антиген, антигенный фрагмент или антигенный мимотоп одного или нескольких из этих белков, при этом связывающийся с эритроцитами фрагмент специфически связывается, например, с гликофорином А или мишенью, выбранной из группы, включающей белок полосы 3, гликофорин В, гликофорин С или другие члены целевой группы эритроцита. Связывающийся с эритроцитами фрагмент можно, например, выбрать из группы, включающей антитела, фрагменты антител, δсΡν, пептидные лиганды и аптамеры.
Варианты осуществления включают выбор толерогенного антигена из терапевтических антител и антителоподобных молекул, в том числе фрагментов антител и гибридных белков на основе антител и других фрагментов. Они включают антитела, отличные от антител человека (такие как мышиные), химерные антитела и гуманизированные антитела. У людей наблюдались иммунные ответы даже на гуманизированные антитела (Сей8, 2010). Соответственно, варианты осуществления включают молекулугибрид для толерогенеза, содержащую связывающийся с эритроцитами фрагмент и по меньшей мере один антиген, антигенный фрагмент или антигенный мимотоп одного или нескольких из этих белков, при этом связывающийся с эритроцитами фрагмент специфически связывается, например, с гликофорином А или мишенью, выбранной из группы, включающей белок полосы 3, гликофорин В, гликофорин С или другие члены целевой группы эритроцита. Связывающийся с эритроцитами фрагмент можно, например, выбрать из группы, включающей антитела, фрагменты антител, δсΡν, пептидные лиганды и аптамеры.
Варианты осуществления включают выбор толерогенного антигена из белков, отличных от белков человека. Примеры таких белков включают аденозиндезаминазу, панкреатическую липазу, панкреатическую амилазу, лактазу, ботулинический токсин типа А, ботулинический токсин типа В, коллагеназу, гиалуронидазу, папаин, Ь-аспарагиназу, расбуриказу, лепирудин, стрептокиназу, анистреплазу (анизоилированный активаторный комплекс стрептокиназы и плазминогена), антитимоцитарный глобулин, поливалентную иммунную сыворотку с РаЬ-фрагментами против яда змей семейства ямкоголовых, иммунную сыворотку с РаЬ-фрагментами против дигоксина, Ь-аргиназу и Ь-метионазу.
Варианты осуществления включают выбор толерогенного антигена из антигенов аллогенного трансплантата человека. Примерами этих антигенов являются субъединицы различных белков гаплотипа МНС класса I и МНС класса II и минорные антигены групп крови с одноаминокислотными полиморфизмами, в том числе РИСЕ, Ке11, Кгйй, БнГГу и §8.
В некоторых случаях толерогенным антигеном является аутоантиген, на который у пациента развился аутоиммунный ответ или может развиться аутоиммунный ответ. Примерами являются проинсулин (сахарный диабет), коллагены (ревматоидный артрит), основной белок миелина (рассеянный склероз).
Например, сахарный диабет 1 типа (Т1Б) является аутоиммунным заболеванием, при котором Тклетки, которые распознают белки островковых клеток, освободились от контроля иммунной регуляции и подают иммунной системе сигналы к разрушению ткани поджелудочной железы. Были обнаружены различные белковые антигены, которые являются мишенями для таких диабетогенных Т-клеток, в том числе, среди прочих, инсулин, САБ65, хромогранин А. При лечении или предупреждении Т1Б будет полезным индуцировать антиген-специфическую иммунную толерантность по отношению к определенным диабетогенным антигенам для функциональной инактивации или удаления диабетогенных клонов Т-клеток. В примере 14 подробно описано, как с помощью молекулы-гибрида, презентирующей мимотоп хромогранина А (СЬгА) в качестве толерогенного антигена, успешно сформировали толерогенез к СЬгА, на основе данных о Т-клетках, определенных в качестве прогностических в других примерах. Соответственно, варианты осуществления включают молекулу-гибрид для толерогенеза, содержащую хромогранин А, антиген или его антигенную часть или его мимотоп, вместе со связывающимся с эритроцитами фрагментом, при этом связывающийся с эритроцитами фрагмент специфически связывается, например, с гликофорином А или мишенью, выбранной из группы, включающей белок полосы 3, гликофорина В, гликофорина С или другие члены целевой группы эритроцита. Связывающийся с эритроцитами фрагмент, можно, например, выбрать из группы, включающей антитела, фрагменты антител, δсΡν, пептидные лиганды и аптамеры, и/или из группы, включающей ЕКУ19, ЕКУ59, ЕКУ64, ЕКУ123, ЕКУ141, ЕКУ162, ЕК.У19', ЕКУ59', ЕКУ64', ЕКУ123', ЕКУ141', ЕКУ162' и их консервативные замены.
Соответственно, толерантности и/или задержки начала или прогрессировать аутоиммунных заболеваний можно достичь для различных из многих белков, которые являются аутоиммунными белками человека, каковой термин относится к различным аутоиммунным заболеваниям, при которых белок или белки, вызывающие заболевания, известны или могут быть определены посредством стандартного тестирования.
Варианты осуществления включают тестирование пациента для определения аутоиммунного белка и создание антигена для применения в гибридной молекуле и формирования иммунотолерантности к
- 21 028087 белку. Варианты осуществления включают антиген или выбор антигена из одного или нескольких из следующих белков. При сахарном диабете 1 типа были определены несколько главных антигенов: инсулин, проинсулин, препроинсулин, декарбоксилаза-65 глутаминовой кислоты (ОАЭ-65), ОАЭ-67, инсулинома-ассоциированный белок 2 (1А-2) и инсулинома-ассоциированный белок 2β (ΙΛ-2β); другие антигены включают 1СА69, 1СА12 (8ОХ-13), карбоксипептидазу Н, Ιιηο^η 38, ОЫМА 38, хромогранин А, Н8Р-60, карбоксипептидазу Е, периферии, переносчик глюкозы 2, панкреатит-ассоциированный белок, экспрессирующийся в гепатокарциноме, кишечнике и поджелудочной железе, 8100β, глиофибриллярный кислый белок, ген регенерации II, панкреатический дуоденальный гомеобокс 1, киназу гена миотонической дистрофии, специфичный для островковых клеток белок, родственный каталитической субъединице глюкозо-6-фосфатазы, и рецепторы 1-5, связанные с О-белком ССТ. При аутоиммунных заболеваниях щитовидной железы, включая тиреоидит Хасимото и болезнь Грейвса, главные антигены включают тиреоглобулин (ТО), тиреоидную пероксидазу (ТРО) и рецептор тиреотропина (Т8НК); другие антигены включают натрий-йодный симпортер (N18) и мегалин. При тиреоид-ассоциированных офтальмопатии и дермопатии, помимо аутоантигенов щитовидной железы, в том числе Т8НК, антигеном является рецептор инсулиноподобного фактора роста 1. При гипопаратиреоидизме главным антигеном является кальций-чувствительный рецептор. При болезни Аддисона главные антигены включают 21-гидроксилазу, 17а-гидроксилазу и фермент, расщепляющий боковую цепь холестерина, Р450 (Р450§сс); другие антигены включают рецептор АСТН, Р450с21 и Р450с17. При синдроме истощения яичников главные антигены включают рецептор Р8На -енолазу. При аутоиммунном гипофизите, или аутоиммунном заболевании гипофиза, главные антигены включают специфичный для гипофиза белковый фактор (РО8Р) 1а и 2; другим антигеном является йодтирониндейодиназа 2 типа. При рассеянном склерозе главные антигены включают основной белок миелина, миелиновый олигодендроцитарный гликопротеин и протеолипидный белок. При ревматоидном артрите главным антигеном является коллаген II типа. При аутоиммунном гастрите главным антигеном является Н+, К+-АТФаза. При пернициозной анемии главным антигеном является внутренний фактор Касла. При целиакии главными антигенами являются тканевая трансглутаминаза и глиадин. При витилиго главными антигенами являются тирозиназа и тирозиназа-родственный белок 1 и 2. При миастении гравис главным антигеном является ацетилхолиновый рецептор. При вульгарной пузырчатке и ее вариантах главными антигенами являются десмоглеин 3, 1 и 4; другие антигены включают пемфаксин, десмоколлины, плакоглобин, перплакин, десмоплакины и ацетилхолиновый рецептор. При буллезном пемфигоиде главные антигены включают ВР180 и ВР230; другие антигены включают плектин и ламинин 5. При герпетиформном дерматите Дюринга главные антигены включают эндомизий и тканевую трансглутаминазу. При приобретенном буллезном эпидермолизе главным антигеном является коллаген VII типа. При системном склерозе главные антигены включают матриксную металлопротеиназу 1 и 3, коллаген-специфический белок теплового шока 47 типа молекулярного шаперона, фибриллин-1 и рецептор РЭОР; другие антигены включают 8с1-70, И1 ΚΝΡ, ТИ/Γο, Ки, Ιο1, ЫАО-2, центромерные белки, топоизомеразу I, ядрышковые белки, РНК-полимеразу I, II и III, РМ-81с, фибриллярин и В23. При смешанном заболевании соединительной ткани главным антигеном является υίδηΚΝΡ. При синдроме Шегрена главными антигенами являются ядерные антигены 88-А и 88-В; другие антигены включают фодрин, поли(АДФ-рибоза)-полимеразу и топоизомеразу. При системной красной волчанке главные антигены включают ядерные белки, включая 88-А, бокс 1 группы высокой подвижности (НМОВ1), нуклеосомы, гистоновые белки и двухцепочечную ДНК. При синдроме Гудпасчера главные антигены включают белки клубочковой базальной мембраны, включая коллаген IV типа. При ревматической болезни сердца главным антигеном является сердечный миозин. Другие аутоантигены, выявляемые при аутоиммунном полигландулярном синдроме 1 типа, включают декарбоксилазу ароматических Ьаминокислот, гистидиндекарбоксилазу, декарбоксилазу цистеинсульфиновой кислоты, триптофангидроксилазу, тирозингидроксилазу, фенилаланингидроксилазу, цитохромы Р450 печени Р4501А2 и 2А6, 8ОХ-9, 8ОХ-10, кальций-чувствительный рецепторный белок и интерфероны 1 типа - интерферон альфа, бета и омега. В примере 15 предложено подробное руководство по толерогенезу для таких белков и, в частности, в качестве примера описывается способ для инсулина.
В некоторых случаях толерогенным антигеном является чужеродный антиген, к которому у пациента развился нежелательный иммунный ответ. Примерами являются пищевые антигены. Варианты осуществления включают тестирование пациента для определения чужеродного антигена, и создание гибридной молекулы, которая содержит антиген, и лечение пациента для развития иммунотолерантности к антигену или пище. Предложены примеры такой пищи и/или антигенов. Примерами являются: из арахиса - конарахин (Ага И 1), аллерген II (Ага И 2), арахисовый агглютинин, конглютин (Ага И 6); из яблони: основной аллерген/гомолог белка устойчивости к заболеваниям на 31 кДа (Ма1 ά 2), предшественник белка-переносчика липидов (Ма1 ά 3), основной аллерген Ма1 ά 1.03Э (Ма1 ά 1); из молока: αлактальбумин (АРА), лактотрансферрин; из киви: актинидии (Ас! с 1, Ас! ά 1), фитоцистатин, тауматинподобный белок (Ас! ά 2), кивеллин (Ас! ά 5); из горчицы: альбумин 28 (8ίη а 1), глобулин 118 (8ίη а 2), белок-переносчик липидов (8ίη а 3), профилин (8ίη а 4); из сельдерея: профилин (Ар1 д 4), высокомолекулярный гликопротеин (Ар1 д 5); из креветки: аллерген Рсп а 1 (Рсп а 1), аллерген Рсп т 2 (Рсп т 2),
- 22 028087 быстрая изоформа тропомиозина; из пшеницы и/или других злаковых: высокомолекулярный глютенин, низкомолекулярный глютенин, α- и γ-глиадин, гордеин, секалин, авенин; из клубники: основной аллерген клубники Ега а 1-Е (Ега а 1), из банана: профилин (Мик хр 1).
Многие белковые лекарственные средства, которые применяются в медицине и ветеринарии, вызывают иммунные ответы, которые создают риски для пациента и ограничивают эффективность лекарственного средства. Они могут возникнуть с белками человека, которые являются сконструированными, с белками человека, применяемыми у пациентов с врожденной недостаточностью выработки этого белка, и с белками, отличными от белков человека. Было бы предпочтительным производить толеризацию реципиента к этим белковым лекарственным средствам перед начальным введением, и было бы предпочтительным производить толеризацию реципиента к этим белковым лекарственным средствам после начального введения и развития иммунного ответа. У пациентов с аутоиммунитетом известен(известны) аутоантиген(ы), к которому(ым) развивается аутоиммунитет. В этих случаях было бы предпочтительным производить толеризацию субъектов, подверженных риску, до развития аутоиммунитета, и было бы предпочтительным производить толеризацию во время или после появления биомолекулярных индикаторов возникающего аутоиммунитета. Например, при сахарном диабете 1 типа иммунологические индикаторы аутоиммунитета присутствуют до обширного разрушения бета-клеток в поджелудочной железе и начала клинических проявлений заболевания, затрагивающих гомеостаз глюкозы. Было бы предпочтительным производить толеризацию субъекта после выявления этих иммунологических индикаторов до начала клинических проявлений заболевания.
В недавней работе под руководством МШег с коллегами было показано, что при ковалентной конъюгации антигена с аллогенными спленоцитами ех νίνο формируется антиген-специфическая иммунная толерантность в случае внутривенного введения мышам (Сойке1, \Уапд, е( а1., 2001; Ьио, ΡοίЬονеη, е( а1., 2008). Способ включает сбор донорских антигенпрезентирующих клеток селезенки и введение их в химическую реакцию согласно схеме реакции сшивания аминов и карбоновых кислот. Методика оказалась эффективной в индукции антиген-специфической толерантности для мышиных моделей рассеянного склероза (Сойке1, \Уапд, е( а1., 2001), впервые выявленного сахарного диабета 1 типа (ПГе, Си1епа, е( а1., 2006) и аллогенных трансплантатов островковых клеток (Ьио, ΡοίЬονеη, е( а1., 2008). Хотя точный механизм, ответственный за толерогенный ответ, неизвестен, предполагается, что основное требование включает презентацию антигена без экспрессии костимулирующих молекул на апоптических клетках, соединенных с антигеном (МП1ег, Тиг1еу, е( а1., 2007). Также рассмотрели инкапсулирование антигенов внутри теней эритроцитов, обрабатывая эритроциты ех νί\Ό и повторно их инъецируя, как представлено в АО 2011/051346.
Введение.
Многие варианты осуществления настоящего изобретения, изложенные в данном документе, описывают композиции, которые можно вводить человеку или другому пациенту-животному. Варианты осуществления настоящего изобретения включают, например, гибридные молекулы, гибридные белки, пептидные лиганды, антитела, 5сЕν, которые распознают антигены на эритроцитах, или в опухолях, или в сосудистой сети опухолей, а также их комбинации. Эти композиции можно получить в виде фармацевтически приемлемых композиций и с подходящими фармацевтически приемлемыми носителями или наполнителями.
Композиции, которые связываются с эритроцитами, могут это делать специфически. Эта специфичность обеспечивает связывание композиций с эритроцитами ίη νί\Ό, а также альтернативные процессы ех νί\Ό. Соответственно, можно осуществлять прямую инъекцию композиции в сосудистую сеть пациента. Альтернативой является инъекция в ткань, например, мышечная, дермальная или подкожная, для последующего контакта и захвата эритроцита. Вариантом осуществления настоящего изобретения является способ индукции толерогенеза у пациента, включающий введение пациенту толеризирующего антигена в ассоциации со связывающимся с эритроцитами фрагментом для присоединения, таким образом, антигена к эритроциту ίη υΑό; присоединение ίη νί\Ό можно, таким образом, выполнять без обработки эритроцитов ех νί\Ό. Этот способ можно выполнять в случае, когда эритроцит не делали апоптическим в результате выполнения способа. Этот способ можно выполнить так, что в нем будет отсутствовать (он не будет включать) воздействие на эритроциты одного или нескольких из сшивающего средства; сшивающего средства, которое сшивает поверхностные молекулы эритроцита; сшивающего средства, содержащего по меньшей мере две функциональные группы; сшивающего средства, которое образует ковалентную связь с эритроцитом; функциональных групп, которые образуют ковалентную связь с эритроцитом; и антигена и/или антигенного вещества, которые ковалентно связываются с эритроцитом. Способ можно выполнять так, что эритроциты и/или антигены не будут содержать 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид (ЕЭС; также Ε^ЛС или ΕΩΕΙ) и также могут не вступать в какие-либо реакции с карбодиимидом. Этот способ можно выполнять с аутологичными эритроцитами, и в нем могут не быть задействованы аллогенные эритроциты.
Для выполнения вариантов осуществления, описанных в данном документе, можно применять фармацевтически приемлемые носители или наполнители. Наполнитель означает инертное вещество, применяемое в качестве растворителя или основы для терапевтического средства. Фармацевтически при- 23 028087 емлемые носители применяют, как правило, с соединением для того, чтобы создать соединение, пригодное для терапии или в качестве препарата. Как правило, для любого вещества фармацевтически приемлемым носителем является материал, который объединяется с веществом для доставки животному. Могут быть необходимыми или желательными стандартные фармацевтические носители, водные, порошковые или масляные основы, загустители и т.д. В некоторых случаях носитель является существенным для доставки, например, для солюбилизации нерастворимого соединения в целях доставки в жидком состоянии; буфер - для контроля рН вещества с целью сохранения его активности или растворитель - для предотвращения потери вещества в сосуде для хранения. В других случаях, однако, носитель применяется для удобства, например, жидкость для более удобного введения. Фармацевтически приемлемые соли соединений, описанных в данном документе, можно синтезировать согласно способам, известным специалистам в данных областях. Таким образом, фармацевтически приемлемые композиции характеризуются высокой степенью очистки с избавлением от загрязнителей, являются биологически совместимыми и нетоксичными, пригодными для введения пациенту. В случае применения воды в качестве носителя вода характеризуется высокой степенью очистки и обработана с избавлением от загрязнителей, например, эндотоксинов.
Соединения, описанные в данном документе, обычно вводят в смеси с пригодными фармацевтическими растворителями, наполнителями, сухими разбавителями или носителями (называемые в данном документе фармацевтически приемлемым носителем, или носителем), выбранными подходящим образом с учетом предполагаемой формы или введения и в соответствии с традиционной фармацевтической практикой. Таким образом, доставляемое вещество можно получить в форме, пригодной для перорального, ректального, местного введения, внутривенной инъекции, внутрисуставной инъекции или парентерального введение. Носители включают твердые вещества или жидкости, и тип носителя выбирают с учетом применяемого типа введения. В качестве носителей, например, для пилюлей, можно включить пригодные связующие средства, смазывающие средства, разрыхлители, красители, ароматизаторы, антислеживающие средства и средства, способствующие плавлению. Например, активный компонент можно объединять с нетоксичным фармацевтически приемлемым инертным носителем для перорального введения, таким как лактоза, желатин, агар, крахмал, сахароза, глюкоза, метилцеллюлоза, стеарат магния, фосфат дикальция, сульфат кальция, маннит, сорбит и т.д. Соединения можно вводить перорально в твердых лекарственных формах, таких как капсулы, таблетки и порошки, или жидких лекарственных формах, таких как эликсиры, сиропы и суспензии. Активные соединения также можно вводить парентерально, в виде стерильных жидких лекарственных форм. Также можно применять буферы для достижения физиологического рН или осмолярности.
Примеры
Пример 1. Характеристика молекулярной мишени связывания с эритроцитами мыши.
Результат. Для поиска молекулярной мишени для пептида ΕΚΥ1 применяли методы аффинной хроматографии с помощью биотинилированного растворимого пептида; этот способ выявил гликофорин А (ОУРА) в качестве лиганда ΕΚΥ1 на мембране эритроцита. При инкубации эритроцитов цельной крови с пептидом ΕΚΥ1, функционализированным биотином и фотоактивированным сшивающим средством, с пептид-биотиновым комплексом был конъюгирован единственный белок с массой 28 кДа, обнаруженный с помощью вестерн-блоттинга с применением стрептавидина. Лизат реакционной смеси тщательно отмывали и очищали с помощью магнитных гранул, покрытых стрептавидином, для обеспечения отсутствия немеченых белков в оставшемся лизате эритроцитов. Как и предполагалось, пептиду с несоответствием не удалось осуществить конъюгацию ни с одним белком эритроцитов. Пептид с несоответствием, РЬЬТУОМПЬАРА (8Ε0 ГО N0: 2), разработали содержащим те же аминокислотные остатки, что и ΕΚΥ1, и соответствующим его топографии гидрофобности. Сведения, подтверждающие видимый размер взаимодействующего белка, свидетельствовали о несколько меньших по размеру, однократно проходящих через мембрану белках, выступавших в качестве вероятных лигандов, а именно гликофоринах. Вестерн-блоттинг с применением антител к ОУРА тех же самых очищенных образцов, полученных из реакции сшивания, подтвердил, что биотинилированный белок-кандидат представлял собой ОУРА.
Колокализацию фага ΕΚΥ1 с ОУРА анализировали с помощью конфокальной микроскопии высокого разрешения. ОУРА в естественных условиях экспрессируется и представлен в виде части комплекса, содержащего несколько мембранных белков и белков цитоскелета (МоЬапбак апб Оа11адЬег, 2008). Это визуально проявляется при окрашивании ОУРА, в соответствии с которым неоднородное мечение было отмечено на периферии экватора клетки. Мечение фага ΕΚΥ1 обуславливало окрашивание очень близкой топографии. Высокий коэффициент перекрытия 0,97 в анализе колокализации подтвердил вывод о том, что фаг ΕΚΥ1 и антитело к ОУРА связываются с тем же самым белком. Кластеризацию ОУРА также наблюдали в эритроцитах, меченных фагом из библиотеки, однако, ни связывание фага, ни колокализация не проявились.
Способ. Пептид ΕΚΥ1 (Н;\-АМЕЕРАЕРОТЕПОО5ОСИО-СО\Н;) (ЕЕ) ГО N0: 19) и пептид с несоответствием (Н2Х-РЕЕТУОМОЕАРАОО8ОСРО-СОХН2) (8Ε0 ГО N0: 20) синтезировали с помощью ί-тос-стратегии стандартного твердофазного синтеза на смоле ТОК. Пептид отделяли от смолы в растворе 95% трифторуксусной кислоты, 2,5% этандитиола, 2,5% воды и осаждали в охлажденном на
- 24 028087 льду диэтиловом эфире. Очистку проводили в системе для препаративной ВЭЖХ-МС от \Уа1ег5 с помощью колонки с обращенной фазой С18.
ΕΚΥ1 и пептид с несоответствием конъюгировали с М18-Л1Т-биотином (ТЬегто 8с1епИйс), как предложено изготовителем. Вкратце, пептиды растворяли в ΡΒδ/ОМР и вводили на ночь в реакцию с 1,05 экв. М18-а1Т-биотина при температуре 4°С. После отстаивания реакционной смеси с помощью центрифугирования биотинилированный пептид инкубировали с эритроцитами в ΡΒδΑ-50 в течение 1 ч при 37°С, клетки отмывали дважды в свежем ΡΒδ и облучали УФ-лучами с длиной волны 365 нм при комнатной температуре. Клетки лизировали путем обработки ультразвуком, и лизат очищали с помощью магнитных гранул, покрытых стрептавидином (ЧпуПгодеп). Элюат выливали на δΌδ-ΡΑΟΕ и переносили на мембрану РУЭР, затем выполняли иммуноблоттинг с помощью стрептавидина-НКР (Κ&Ό §у81ет8) или антител к ΟΥΡΆ мыши.
Пример 2. Характеристика связывания с эритроцитами человека.
Результат. Для характеристики выбранных пептидов, которые связывались с эритроцитами человека, бактерии, экспонирующие каждый конкретный пептид, подвергали анализам связывания с многочисленными типами клеток. Шесть (ΕΚΥ19, ΕΚΥ59, ΕΚΥ64, ΕΚΥ123, ΕΚΥ141 и ΕΚΥ162) из семи пептидов специфически связывались с эритроцитами человека по сравнению со связыванием с клетками эпителия человека 293Т и клетками эндотелия человека ΗυΥΈΟ Также пептиды связывались с клетками крови человека групп А и В, но не крови мыши, что указывает на то, что эти пептиды были специфичными для крови человека, но не зависели от общих антигенов групп крови. Пептиды синтезировали с помощью £тос-стратегии стандартного твердофазного синтеза, конъюгировали с наночастицами и анализировали на предмет связывания с конкретными типами клеток, как указано выше. Связывание с поверхностью эритроцитов изучали с помощью как микроскопии, так и проточной цитометрии.
Пример 3. Индукция антиген-специфической иммунной толерантности посредством нековалентного связывания с эритроцитами антигена, конъюгированного с пептидом ΕΚΥ1, или антигена, конъюгированного с пептидом, связывающимся с эритроцитами человека.
Для получения эффективного и специфического биофизического связывания антигена с эритроцитами применяли пептид из 12 аминокислот (ΕΚΥ1), описанный с помощью фагового дисплея, для специфического связывания с гликофорином А мыши (Коп!ок апй НиЬЬе11, 2010). В этом исследовании модельный антиген ΟνΑ применяли у линии трансгенных мышей (ΟΤ-Ι), у которых популяция СЭ8' Тклеток экспрессирует рецептор Т-клеток, специфичный для иммунодоминантного δΙΙΝΡΈΚΣ пептида ΟνΑ (δΕΟ ΙΌ ΝΟ: 3), презентируемого МНС Ι. Пептид ΕΚΥ1 химически конъюгировали с ΟνΑ для создания варианта ΟνΑ (ΕΚΥ1-ΟνΑ), который связывается с эритроцитами мыши с высокой аффинностью и специфичностью (фиг. 1а). С помощью конфокальной микроскопии высокого разрешения были подтверждены более ранние наблюдения касательно связывания ΕΚΥ1 (Койок апй НиЬЬе11, 2010), а именно, локализация на периферии экватора клеточной мембраны без внутриклеточной транслокации белка, конъюгированного с ΕΚΥ1. Опосредованное ΕΚΥ1 связывание с гликофорином А было специфичным для последовательности, поскольку вариант ΟνΑ конъюгировался с пептидом с несоответствием (МРЗΟνΑ), содержащим аминокислоты, идентичные таковым ΕΚΥ1, однако, был скремблирован в первичной последовательности, обнаруживая ничтожно малое связывание (фиг. 1Ь). ΟνΑ, конъюгированный только со сшивающей молекулой, применяемой для конъюгирования с пептидом, не проявлял какой-либо измеримой аффинности по отношению к эритроцитам, что свидетельствовало о том, что связывание ΕΚΥ1ΟνΑ происходило в результате нековалентного взаимодействия между пептидом ΕΚΥ1 и гликофорином А на поверхности эритроцита. Также ΕΚΥ1-ΟνΑ связывался с эритроцитами с высокой аффинностью, демонстрируя подобную антителам константу диссоциации (К,|) 6,2±1,3 нМ, определенную с помощью измерений равновесного связывания (фиг. 1с).
Связывание ΕΚΥ1-ΟνΑ с циркулирующими эритроцитами подтверждали ίη νί\Ό после внутривенного введения мышам. Образцы цельной крови, взятые через 30 мин после инъекции 150 мкг ΟνΑ или ΕΚΥ1-ΟνΑ, подтверждали специфическую способность ΕΚΥ1-ΟνΑ к связыванию с эритроцитами даже в сложной гетерогенной среде крови и сосудистой сети. ΕΚΥ1-ΟνΑ связывался с эритроцитами (СЭ45-). но не с лейкоцитами (СО45+), что было сообразно ассоциации с гликофорином А. Связывание ΕΚΥ1ΟνΑ было несмещенным по отношению к апоптическому состоянию эритроцитов при сильном связывании с популяциями как аннексин-У, так и с аннексии-ν- СЭ45-. Фармакокинетические исследования конъюгата ΟνΑ показали, что связывание ΕΚΥ1-ΟνΑ с эритроцитами ίη у1уо было стабильным, при этом демонстрировался период полужизни на поверхности эритроцита 17,2 ч. ΕΚΥ1-ΟνΑ оставался связанным с эритроцитами в течение 72 ч после введения; в течение этого временного промежутка у мыши выводилось примерно 13% эритроцитов (КЬапйеЮй апй §ахепа, 2006). Количественное определение связанного с эритроцитом ΕΚΥ1-ΟνΑ ίη у1уо показало сравнительно высокую нагрузку 0,174±0,005 нг ΟνΑ на 10 эритроцитов.
Для исключения любых возможных физиологических влияний нагрузки ΟνΑ на функцию эритроцитов гематологические параметры характеризовали в различные моменты времени после внутривенного введения ΕΚΥ1-ΟνΑ или ΟνΑ. Связывание эритроцитов с ΕΚΥ1-ΟνΑ не вызывало никаких обнару- 25 028087 жимых различий в гематокрите, объеме эритроцита или содержании гемоглобина в эритроците по сравнению с введением ΟVΑ. Эти результаты показывают, что связывание эритроцитов с антигеном, опосредованное гликофорином А, не изменяло их гематологических параметров.
Для выявления клеточных мишеней связанного с эритроцитами антигена при введении мышам внутривенно инъецировали белок аллофикоцианин с сильными флуоресцентными свойствами, конъюгированный с ΕΚΥ1 (ЕКУ1-аллофикоцианин) или пептидом М1§ (М1§-аллофикоцианин). Анализ популяций ОС селезенки по методу проточной цитометрии через 12 и 36 ч после введения показал увеличенный в 9,4 раза захват ΕКΥ1-аллофикоцианина ОС МНС11 СЭ11Ь- СЭ11с' по сравнению с М1§аллофикоцианином, при этом наблюдался сходный захват ΕКΥ1-аллофикоцианина и М1§аллофикоцианина ОС МНС11+ СЭ11Ь' СЭ11с'. Дополнительно было обнаружено, что МНС11+ СЭ8а' СЭ11с' СЭ205' ОС селезенки захватывают ΕКΥ1-аллофикоцианин в 3 раза сильнее, чем М1§аллофикоцианин, хотя абсолютная величина была значительно ниже, чем для других популяций ОС в селезенке. Такое нацеливание антигена на неактивированные и СО8</.' СЭ205' ОС селезенки могло усилить толерогенный потенциал связывания с эритроцитами, поскольку эти популяции были в значительной степени вовлечены в толерогенез, активированный апоптическими клетками (Еегдиюн С1юк ек а1., 2011; Υатаζак^, Оиб/1ак ек а1., 2008). В печени также наблюдалось существенное усиление захвата ΕКΥ1-аллофикоцианина гепатоцитами (СЭ45- МНС11+ СЭ16-; в 78,4 раза) и звездчатыми клетками печени (СЭ45- МНС11+ СЭ16'; в 60,6 раз) по сравнению с М1§-аллофикоцианином; обе популяции описывали в качестве антигенпрезентирующих клеток, которые активируют делеционную толерантность СЭ8' Тклеток (Ήοΐ/, Щаггеп, ек а1., 2010; КЫката, Миаба, ек а1., 2011; ΤЬοт5οη апб КтоИе, 2010). Примечательно, что такой захват не наблюдался в ОС печени (СЭ45' СЭ11с') или клетках Купфера (СЭ45' МНС11+ Е4/80'), которые функционировали в качестве компонентов ретикулоэндотелиальной системы, оказывающей содействие в выведении эритроцитов и частиц, покрытых комплементом. Повышенный захват связанного с эритроцитами антигена толерогенными ОС селезенки и популяциями клеток печени свидетельствует о возможности сложного взаимосвязанного механизма антиген-специфической делеции Тклеток, активированной взаимовлиянием нелимфоидных клеток печени и канонических клеток селезенки.
Было замечено, что связывание эритроцитов с ΕКΥ1-ΟVΑ приводит к эффективной перекрестной презентации иммунодоминантного эпитопа ΟVΑ, презентируемого МНС I (δΙΓΝΕΈΚΚ) (8ЕО ΙΌ ΝΟ: 3), с помощью АРС и соответствующего примирования реактивных Т-клеток перекрестно-реагирующим антигеном. СЭ8' Т-клетки ΟΤ-Ι, меченные СЕ8Е (СО45.2+), адаптивно переносили мышам СЭ45.1'. Пролиферацию СЭ8' Т-клеток ОТ-Ι измеряли в течение 5 дней после внутривенного введения 10 мкг ΟVΑ, 10 мкг ΕКΥ1-ΟVΑ или 10 мкг нерелевантного связывающегося с эритроцитами антигена, ΕКΥ1глутатион-§-трансферазы (ЕОТ1-О8Т). Пролиферация СЭ8' Т-клеток ОТ-Ι, определенная по разбавлению флуоресцентного средства СЕ8Е, измеренному с помощью проточной цитометрии, значительно усиливалась у мышей, которым вводили ΕКΥ1-ΟVΑ, по сравнению с теми, кому вводили ΟVΑ, что указывало на то, что связывание с эритроцитами повышало примирование антиген-специфических СЭ8' Тклеток перекрестно-реагирующим антигеном по сравнению с растворимым антигеном. Подобные результаты также были получены при введении дозы антигена 1 мкг, меньшей в 10 раз, что указывало на широкий динамический диапазон эффективности пролиферации СЭ8' Т-клеток ОТ-Ι, индуцированной антигеном, связанным с эритроцитом. Результаты по перекрестной презентации и примированию перекрестно-реагирующим антигеном согласуются с другими исследованиями касательно презентации толерогенных антигенов на МНС Ι посредством поглощения АРС антигена, выделенного из апоптических клеток (А1Ьегк, Реагсе, ек а1., 1998; Огееп, Еегдиюн ек а1., 2009).
Для разграничения между Т-клетками, разведенными до функционального эффекторного фенотипа, и разведенными и подвергнутыми делеции Т-клетками анализировали пролиферирующие СЭ8' Т-клетки ОТ-Ι на связывание с аннексином V как отличительный признак апоптоза, а значит, и делеции. ΕКΥ1ΟVΑ индуцировал пролиферацию гораздо большего количества аннексии V' СЭ8' Т-клеток ОТ-Ι, чем ΟVΑ (фиг. 126), что свидетельствовало об апоптическом исходе, который в конечном итоге должен привести к делеции. Те же самые СЭ8' Т-клетки ОТ-Ι, пролиферация которых была индуцирована введением ΕКΥ1-ΟVΑ, проявляли фенотип клеток, испытавших контакт с антигеном в дозах как 1, так и 10 мкг, демонстрируя повышенную экспрессию СЭ44 и пониженную экспрессию СО62Ь. Этот фенотип пролиферирующих СЭ8' Т-клеток согласуется с другими описанными адаптивными моделями переноса ОТ-Ι, при которых регулируемое вовлечение рецептора антиген-специфических Т-клеток с помощью АРС не приводит к индукции воспалительных ответов (Вигбсй, Кюй, ек а1., 2009).
С помощью достоверной модели стимуляции ОТ-Ι с выработкой толерантности (Ьш, рцба, ек а1., 2002) (фиг. 2а) было показано, что ΕКΥ1-ΟVΑ предупреждает последующие иммунные ответы на опосредованную вакциной антигенную стимуляцию даже с очень сильным адъювантом бактериального происхождения.
С целью толеризации мышам СЭ45.1' внутривенно вводили 10 мкг ΟVΑ или ΕКΥ1-ΟVΑ спустя 1 и 6 дней после адаптивного переноса СЭ8' Т-клеток ОТ-Ι. Спустя 9 дополнительных дней, необходимых
- 26 028087 для обеспечения возможной делеции перенесенных Т-клеток, мышей-реципиентов подвергали стимуляции с помощью внутрикожной инъекции ΟνΑ, вводимого с липополисахаридом (ЬР8) в качестве адъюванта. Характеристика клеток дренирующих лимфатических узлов и селезенки, а также их воспалительные ответы спустя 4 дня после стимуляции позволили определить, имела ли место делеция на самом деле.
Внутривенное введение ΕΚΥ1-θνΑ приводило к выраженному сокращению популяций СЭ8' Тклеток ОТЛ в дренирующих лимфатических узлах (фиг. 2; диапазон отображения данных на фиг. 2Ь) и селезенке по сравнению с мышами, которым вводили немодифицированный ΟνΑ перед антигенной стимуляцией с ЬР8 (фиг. 2с), что указывает на делеционную толерантность. Дренирующие лимфатические узлы мышей, обработанных ΕΚΥ1-θνΑ, содержали более чем в 11 раз меньше СЭ8' Т-клеток ОТ4 по сравнению с таковыми у мышей, обработанных ΟνΑ, и в 39 раз меньше, чем у мышей из контрольной группы стимуляции, которые не получали внутривенные инъекции антигена; ответы клеток селезенки были сходными. Эта эффективная клональная деления, проявляемая у мышей, которым вводили ΕΚΥ1ΟνΑ, подтвердила более ранние наблюдения усиленного примирования СЭ8' Т-клеток ОТ4 перекрестно-реагирующим антигеном и также показала, что примирование перекрестно-реагирующим антигеном происходило в отсутствие презентации костимулирующих молекул с помощью АРС для активации делеционной толерантности.
Для дальнейшей оценки иммунного ответа после антигенной стимуляции характеризовали воспалительную природу резидентных клеток лимфатических узлов и селезенки с помощью экспрессии интерферона γ βΡΝγ) СЭ8' Т-клетками ОТ4 (фиг. 26). После стимуляции с помощью ΟνΑ и ЬР§ лимфатические узлы мышей, ранее обработанных ΕΚΥ1-ΟνΑ, содержали в 53 раза меньше клеток, экспрессирующих ΓΡΝγ, по сравнению с таковыми у мышей из контрольной группы стимуляции (ранее не получавших антиген) и более чем в 19 раз меньше клеток, экспрессирующих ΓΡΝγ по сравнению с таковыми у мышей, ранее обработанных эквивалентной дозой ΟνΑ (фиг. 2е), что показывает важность связывания с эритроцитами в толерогенной защите в ответ на стимуляцию; ответы клеток селезенки были сходными. Также при анализе небольшой популяции СЭ8' Т-клеток ΟТ-I, присутствующих в лимфатических узлах и селезенке мышей, ранее обработанных ΕΚΥ1-ΟνΑ, меньший процент клеток экспрессировал ΣΡΝγ, что свидетельствовало о клональной инактивации. Также величина уровней общего ΣΡΝγ вырабатываемого клетками, выделенными из дренирующих лимфатических узлов при повторной стимуляции с помощью δΠΝΡΕΚΣ, была значительно снижена у мышей, ранее обработанных ΕΚΥ1-ΟνΑ (фиг. 2Γ), при этом уровни ΞΡΝγ при связывании с эритроцитами снижались в 16 раз по сравнению с таковыми в случае введения ΟνΑ и более чем в 115 раз по сравнению с таковыми у представителей контрольной группы стимуляции. Следует отметить, что явление подавления также коррелировало с понижением экспрессии интерлейкина-10 ЦЬ-Ю), поскольку клетки лимфатических узлов мышей, ранее обработанных ΕΚΥ1ΟνΑ, экспрессировали на 38 и 50% меньше !И-10 по сравнению с мышами, ранее обработанными ΟνΑ, и мышами из контрольной группы активации, соответственно (фиг. 2д). С учетом того, что обычно регуляторные СЭ4' Т-клетки экспрессировали цитокины в рамках коммуникации АРС и Т-клеток для ослабления ответов со стороны Тй1 (Оаттай, Недбе, е! а1., 2010; Ьее апб Κίιιι, 2007), экспрессия !И-10 была необязательной для десенсибилизации в ответ на стимуляцию. Подобное снижение экспрессии Ш-Ю было вовлечено в толерогенез, опосредованный СЭ8' Т-клетками (ΡίΓο, Ои1епа, е! а1., 2006; Α^иаЬο16^. Ко!йХУаЙег, е! а1., 2009; §ат!-Ьи, Тоитбо!, е! а1., 2009). Связывание с эритроцитами также значительно ослабляло гуморальные иммунные ответы на антиген, поскольку мыши, обработанные ΕΚΥ1-ΟνΑ, проявляли в 100 раз меньшие сывороточные титры антиген-специфического βΟ по сравнению с мышами, обработанными растворимым ΟνΑ (фиг. 2й). Подобное снижение титра ΟνΑ-специфического βΟ в результате связывания с эритроцитами наблюдалось у мышей С57ВЙ/6 (СЭ45.2'), не подвергнутых адаптивному переносу. После двух внутривенных введений 1 мкг ΟνΑ или ΕΚΥ1-ΟνΑ с промежутком в 7 дней мыши, обработанные ΕΚΥ1-ΟνΑ, проявляли снижение уровня ΟνΑ-специфического βΟ в сыворотке в 39,8 раз спустя 19 дней после первого введения антигена (фиг. 3). Это видимое снижение в активации Вклеток после связывания эритроцитов антигеном подтверждает текущие гипотезы относительно невоспалительной презентации антигенов во время индукции толерантности (МШет, Тиг1еу, е! а1., 2007; Огееп, Регдизоп, е! а1., 2009; Мие11ег, 2010).
Для дальнейшего подтверждения индукции антиген-специфической иммунной толерантности модель стимуляции ΟТ-I с выработкой толерантности объединяли с моделью опухолевого имплантата, экспрессирующего ΟνΑ (фиг. 2ί). Подобно предыдущему плану эксперимента, производили толеризацию мышей с помощью двух внутривенных введений 10 мкг ΕΚΥ1-ΟνΑ или 10 мкг ΟνΑ после адаптивного переноса СЭ8' Т-клеток ΟТ-I. Выраженную делению Т-клеток выявили спустя 5 дней после первого введения антигенов, поскольку кровь мышей, которым инъецировали ΕΚΥ1-ΟνΑ, содержала в 2,9 раз меньше непролиферирующих (поколение 0) СЭ8' Т-клеток ΟТ-I (фиг. 2|). Для определения функциональной реактивности пролиферирующих СЭ8' Т-клеток ΟТ-I в отсутствие сильного экзогенно вводимого адъюванта клетки тимомы ΕΠ4, экспрессирующие ΟνΑ (Ε.Ο7-ΟνΑ), инъецировали внутрикожно в кожу спины мышей через 9 дней после адаптивного переноса. Для оценки толерогенной эффективности
- 27 028087 связывающегося с эритроцитами антигена мышей-опухоленосителей стимулировали с помощью 0УА с адъювантом ЬР§ спустя 6 дней после имплантации опухоли аналогично модели стимуляции с выработкой толерантности по дозе и схеме введения. У мышей, обработанных ΕКΥ1-0УА, постоянно наблюдался устойчивый рост опухолей по сравнению с мышами, обработанными 0УА, или необработанными контрольными мышами вплоть до 8 дня после имплантации опухоли (фиг. 2к), что подтверждало то, что пролиферация СГО8' Т-клеток 0Т-1, активированная ΕКΥ1-0УА, индуцировала функциональную иммунную реактивность в отношении 0УА. То, что размер опухоли приостанавливался с достижением стабильного состояния через 8 дней после имплантации, может свидетельствовать о том, что оставшиеся СГО8' Т-клетки 0Т-1 должны были еще подвергнуться выработке делеционной толерантности, активированной ΕКΥ1 -0УА.
Животные.
Все процедуры с животными ранее были одобрены ветеринарными учреждениями Швейцарии. В исследованиях по связыванию ίη νίνο и в качестве носителей опухоли из Е.С7-0УА применяли 8-12недельных самок мышей С57ВЬ/6 (Скаг1е8 РУег). Мышей линии С57ВЬ/6-Тд(ТсгаТсгЬ) 1100М_)Ь (0Т-1) Цаскюн ЬаЬв) разводили в условиях вивария ЕРРЬ, и самок в возрасте 6-12 недель использовали для выделения спленоцитов.
Самок мышей линии В6.§^^-Рίр^саРерсι7Вοу (СГО45.1) (Скаг1е8 РУег) в возрасте 8-12 недель применяли в качестве носителей-реципиентов для адаптивного переноса СГО8' Т-клеток 0Т-1 и исследований по индукции толерантности.
Разработка и синтез пептидов.
Пептид ЕКУ1 (Н2\-УМУЕРУЕРОТЕРОО5ОСРО-С0\Н2) (8ЕЦ ГО N0: 19) и пептид с несоответствием (Н2Н-РЕЕТУСМ0Е\УР\УСС5>ССРС-С0НН2) (8ЕЦ ГО N0: 20) синтезировали с помощью ί^ο^ стратегии стандартного твердофазного синтеза на смоле ТОК (Nονа Вюсйет) в автоматизированной системе регулируемой подачи жидкостей (СНЕМ8РЕЕП). Подчеркнутая последовательность представляет собой последовательность ΕКΥ1 из 12 мономеров, ранее описанную с помощью фагового дисплея как участок связывания с гликофорином А мыши (Κοηΐοδ аиЬ НиЬЬе11, 2010). Область ОО8О выполняла роль линкера для цистеинового остатка, применяемого для конъюгации; фланкирующий аргининовый остаток способствовал понижению рКа и, таким образом, увеличению реакционной способности цистеинового остатка (Ρυΐο1ί, ТиеШ, е1 а1., 2001). Пептид отделяли от смолы в течение 3 ч в растворе 95% трифторуксусной кислоты, 2,5% этандитиола, 2,5% воды и осаждали в охлажденном на льду диэтиловом эфире. Очистку проводили в системе для препаративной ВЭЖХ-МС (\Уа1ег8) с помощью колонки с обращенной фазой С18 (РегвресГОе ВювуЫетв).
Конъюгация ΕКΥ1 и антигена.
молярных эквивалентов сукцинимидил-4-Щ-малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилата (8МСС, СА§ № 64987-85-5, Ткегию 5с1еШ|Пс), растворенного в диметилформамиде, вводили в реакцию с 5 мг/мл 0УА, не содержащим эндотоксинов (<1 МЕ/мг) (НудКв ОтЬН), в РВ§ в течение 1 ч при комнатной температуре. После обессоливания на спин-колонке для обессоливания 2ЕВА на 2 мл (Ткегию БОеиОПс) добавляли 10 эквивалентов пептида ΕКΥ1 или М1§, растворенного в 3 М гуанидине-НС1, и предоставляли возможность протекания реакции в течение 2 ч при комнатной температуре. Конъюгат обессоливали с помощью спин-колонки для обессоливания 2ЕВА на 2 мл, 0,2 мкл фильтровали в стерильных условиях, распределяли в рабочие аликвоты и хранили при -20°С. Концентрацию белка определяли с помощью ВСА-анализа (ΊΈοι^ο §с1еи1|Пс). Реализация этой схемы приводила к конъюгации боковой цепи цистеина пептида с боковыми цепями лизина антигена. Глутатион-§-трансферазу (О8Т) экспрессировали в ВЬ21 Евсйеггскга той и очищали с помощью стандартной аффинной хроматографии с применением глутатиона. Удаление эндотоксина непосредственно на колонке проводили путем тщательного отмывания с помощью ТпЮп-Х1 14 (§гдта А1Ьпск), и удаление эндотоксина подтверждали с помощью клеток ТНР-1Х В1ие (Iην^νοОеη). Ту же самую процедуру реакции применяли для конъюгирования ΕКΥ1 с О8Т. Аллофикоцианин, активированный малеимидом (Iηηονа Рюваеисев), растворяли в РВ§ и конъюгировали с ΕКΥ1 или М1§, как описано ранее.
Микроскопическое исследование связывания с эритроцитами.
5х105 свежевыделенных эритроцитов мыши подвергали воздействию 100 нМ ΕКΥ1-0УА или 0УА в РВ§, содержащем 10 мл/мл В8А, в течение 1 ч при температуре 37°С. После центрифугирования и отмывания клетки метили антителами козы к гликофорину А мыши (5>аШа Сги/) в разведении 1:200 и антителами кролика к 0УА (ЛЬЭ 8ЕК0ТЕС) в течение 20 мин на льду. После центрифугирования и отмывания клетки метили антителами АРЕХАЕЬи0К488 к 1§О козы в разведении 1:200 (Ιηνίίτο^η) и антителами А1ехаЕк.юг546 к 1§О кролика (Ιηνίΐτο^η) в течение 20 мин на льду. После заключительного цикла центрифугирования/отмывания клетки фиксировали с помещением в заливочную среду и визуализировали с помощью инвертированного конфокального микроскопа 2ег88 Й8М700 с иммерсионным объективом с увеличением 68. Анализ изображения проводили в 1МАОЕ1 (N14) при одинаковой обработке обоих изображений.
Связывание и биораспределение ίη νίνο.
150 мкг ΕКΥ1-0УА или 0УА в 0,9% физиологическом растворе (В. Вгаии) в объеме 100 мкл инъе- 28 028087 цировали внутривенно в хвост 8-12-недельным самкам мышей линии С57ВЬ/6, подвергнутых анестезии изофлураном. Во время эксперимента следили за тем, чтобы мыши содержались при температуре 37°С, применяя электрогрелку. В заранее определенные моменты времени из небольшого надреза в хвосте брали 5 мкл крови, разбавляли в 100 раз в 10 мМ ЭДТА в РВЗ, отмывали трижды с помощью РВЗ с 10 мкг/мл ВЗА и анализировали на содержание ОУА с помощью проточной цитометрии и ЕЫЗА. ОУА количественно определяли с помощью сэндвич-ЕЫЗА, используя моноклональное антитело мыши к ОУА (Зчдта) для захвата, поликлональное антитело кролика к ОУА (ЛЬЭ ЗЕКОТЕС) для детекции, антитело козы к 1дС кролика, конъюгированное с НКР (ВюКаб), для заключительной детекции с последующим применением субстрата ТМВ (СЕ ЫЕе Заемек). Гематологическую характеристику проводили в системе гематологического анализа АОУ1УА 2120 (Зчетепк). Связанный с эритроцитами ЕКУ1-СЗТ выявляли с помощью инкубации меченых клеток с антителом козы к СЗТ (СЕ НеаИЬсате ЫЕе Зиепсек) с последующей инкубацией с антителом осла А1ехаР1иог488 к антигенам козы (ЧпучЧгодеп) и анализировали с помощью проточной цитометрии. Для исследований биораспределения 20 мкг ЕКУ1-АРС или М1З-АРС инъецировали внутривенно в хвостовую вену 8-10-недельных самок мышей линии С57ВЬ/6, как описано ранее. Мышей умерщвляли в заранее определенные моменты времени и удаляли селезенку, кровь и печень. Каждый орган подвергали расщеплению с помощью коллагеназы Ό (КосЬе) и гомогенизировали с получением суспензии отдельных клеток для окрашивания с целью проведения проточной цитометрии.
Адаптивный перенос Т-клеток.
СГО8' Т-клетки из селезенок мышей ОТ-Ι (СО45.2+) выделяли с помощью набора магнитных гранул для отрицательной селекции СЭ8 (МШепуч ВчоЧес) согласно инструкциям изготовителя. Свежевыделенные СГО8' клетки ОТ-Ι ресуспендировали в РВЗ и метили 1 мкМ карбоксифлуоресцинсукцинимидиловым эфиром (СРЗЕ, 1пу|1годеп) в течение 6 мин. при комнатной температуре, а реакционную смесь гасили в течение 1 мин равным объемом ГМЭМ с 10% РВЗ (СчЬсо). Перед инъекцией клетки отмывали, подсчитывали и ресуспендировали в чистой ГМЭМ. 3х106 СЭ8' клеток ОТ-Ι, меченных СРЗЕ, инъецировали внутривенно в хвостовую вену мышей-реципиентов СГО45.Е. Для кратковременных исследований пролиферации 10 мкг ЕКУ1-ОУА или ОУА в объеме 100 мкл инъецировали спустя 24 ч после адаптивного переноса. Спленоциты собирали спустя 5 дней после введения антигена и окрашивали для анализа с помощью проточной цитометрии.
Модель толерантности и стимуляции ОТ-Ι.
3х105 СЭ8+ Т-клеток ОТ-Ι, меченных СРЗЕ, инъецировали мышам-реципиентам СЭ45.Е, как описано ранее. Спустя 1 и 6 дней после адаптивного переноса мышам внутривенно вводили 10 мкг ЕКУ1ОУА или ОУА в 100 мкл физиологического раствора в хвостовую вену. Спустя 15 дней после адаптивного переноса мышей подвергали стимуляции с помощью 5 мкг ОУА и 25 нг ультрачистого ЬРЗ ЕксНепсЫа сой (ЧпукоСеп) путем внутрикожного введения 25 мкл в подушечки обеих задних лап (способ Носк, общая доза 10 мкг ОУА и 50 нг ЬРЗ). Мышей умерщвляли через 4 дня после активации, и клетки селезенки и дренирующих лимфатических узлов выделяли для повторной стимуляции. Для анализа внутриклеточного цитокинеза с помощью проточной цитометрии клетки повторно стимулировали в присутствии 1 мг/мл ОУА или 1 мкг/мл пептида ЗПОТРКЬ (ЗЕС ГО ЫО: 3) (СепкспрЧ) в течение 3 ч. Добавляли брефелдин А (Зчдта, 5 мкг/мл), и повторную стимуляцию продолжали в течение дополнительных 3 ч перед окрашиванием и анализом с помощью проточной цитометрии. Для измерения выделяемых факторов посредством ЕЫЗА клетки повторно стимулировали в присутствии 100 мкг/мл ОУА или 1 мкг/мл пептида ЗПОТРКЬ (ЗЕС ГО ЫО: 3) в течение 4 дней. Клетки центрифугировали, и среду собирали для ЕЫЗА-анализа с помощью наборов Кеабу-ЗеЧ-Со для ΙΡΝγ и ΙΗ-10 (еВюкаеисек) согласно инструкциям изготовителя. фС сыворотки, специфичный для ОУА, выявляли с помощью инкубации сыворотки мыши в различных разведениях на планшетах, покрытых ОУА, с последующей заключительной инкубацией с антителом козы к фС мыши, конъюгированным с НКР (ЗоиЧНегп ВчоЧесН).
Модель толерантности ОТ-Ι, индуцированной Е.С7-ОУА.
1х106 СГО8' Т-клеток ОТ-Ι, меченных СРЗЕ, инъецировали 8-12-недельным самкам мышей линии С57ВЬ/6, как описано ранее. Спустя 1 и 6 дней после адаптивного переноса мышам внутривенно вводили 10 мкг ЕКУ1-ОУА или 10 мкг ОУА в 100 мкл физиологического раствора в хвостовую вену. Спустя 5 дней после адаптивного переноса забирали кровь для характеристики пролиферации СГО8' Т-клеток ОТ-Ι с помощью проточной цитометрии. Клетки тимомы ЕЬ-4, экспрессирующие ОУА (Е.С7-ОУА, АТСС СКЬ-2113) культивировали согласно рекомендациям АТСС. Вкратце, клетки культивировали в среде КРМI 1640 с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки, 10 мМ НЕРЕЗ, 1 мМ пирувата натрия, 0,05 мМр -меркаптоэтанола, 1% пуромицина/стрептомицина (Iиν^ί^одеи СчЬсо) и 0,4 мг/мл С418 (РАА ЬаЬотаЧопек). Непосредственно перед инъекцией клетки разводили в среде без С418 и ресуспендировали в НВЗЗ (СЬсо) непосредственно после сбора. Спустя 9 дней после адаптивного переноса мышей подвергали анестезии изофлураном, область спины брили, и 1 х 106 клеток Е.С7-ОУА инъецировали внутрикожно между лопатками. Спустя 4 дня после имплантации Е.С7-ОУА каждые 24 ч измеряли размеры опухоли с помощью цифрового штангенциркуля, и объем опухоли рассчитывали по формуле для эллипсоида (У=(п/6)1-№-Ь, где У - объем, 1 - длина, ν - ширина и Ь - высота опухоли). Спустя 15 дней после адаптив- 29 028087 ного переноса мышей подвергали стимуляции с помощью 5 мкг ОУА и 25 нг ультрачистого ЬР8 Εδсйепс1йа сой (ΙηνίνοΟεη) путем внутрикожного введения 25 мкл в подушечки обеих передних лап (общая доза 10 мкг ОУА и 50 нг ЬР§).
Антитела и проточная цитометрия.
Для проточной цитометрии применяли следующие антитела к антигенам мыши: РасШс В1ие к ί',ΌΙά. РегСР-Су5.5 к СЭЗ::. РЕ-Су7 к 0Ό8α, РЕ-Су7 к СЭ11Ь. РасШс В1ие к СЭ11с. биотинилированное к СЭ45. РасШс В1ие к СЭ45.2. РасШс В1ие к СЭ45. конъюгированное с АРС к ΙΡΝγ. АРС-еР780 к ί'.Ό8α. РЕ-Су5.5 к С1144. РЕ к С1)б>21.. РЕ-Су7 к СО205. РЕ к Р4/80. Р1ТС к Ι-Α/Ι-Е из МНС11 (все от еВю^лепсе). в дополнение к красителю для фиксации живых/мертвых клеток (1пуйгодеп). набору для мечения аннексина-У-Су5 (Είονίδίοη). стрептавидину РасШс Огапде (1пуйгодеп) и антителу к ОУА-Р1ТС (АЬеат). Образцы анализировали на проточном цитометре СуАп АЭР (Весктап СоиНет). Сначала клетки отмывали с помощью РВ8. окрашивали в течение 20 мин на льду красителем для живых/мертвых клеток. блокировали в течение 20 мин на льду в гибридомной среде 24С2. подвергали поверхностному окрашиванию в течение 20 мин на льду. фиксировали в 2% параформальдегиде в течение 20 мин на льду. подвергали внутриклеточному окрашиванию в присутствии 0.5% сапонина в течение 45 мин на льду с последующей заключительной отмывкой перед анализом. Для окрашивания апоптических клеток за 5 мин до анализа добавляли аннексии-У-Су5. Для окрашивания СЭ45 клетки окрашивали стрептавидином РасШс Огапде в течение 20 мин на льду. отмывали и анализировали.
Применение с частицами.
Пептид ΕΚΥ1 также применяли для толерогенеза в форме наночастиц. с которыми были конъюгированы как пептид ΕΡΥ1. так и толерогенный антиген.
Для образования конъюгатов ΕΚ.Υ1 с полимерной наночастицей. которая также конъюгирована с пептидным или белковым антигеном. стехиометрические количества каждого компонента можно добавлять последовательно с целью контроля преобразований в ходе конъюгации. Для образования наночастицы. конъюгированной как с ОУА. так и с ΕΚΥ1 или с пептидом с несоответствием. пептиды сначала растворяли в водном 3М гуанидине-НС1. и 0.5 эквивалента добавляли к наночастицам. содержащим пиридилсульфидную тиол-реактивную группу. Измерение абсорбции проводили при 343 нм для наблюдения за преобразованиями в ходе реакции. поскольку в ходе реакции образуются нереакционноспособные пиридин-2-тионовые соединения с высокой абсорбцией при этой длине волны. Через 2 ч в условиях комнатной температуры абсорбция при 343 нм стабилизировалась. и ОУА растворяли в водном 3М гуанидине-НС1. и добавляли к раствору наночастиц в 2-кратном молярном избытке. Через 2 ч в условиях комнатной температуры абсорбция при 343 нм снова стабилизировалась до более высокого значения. и в растворе рассчитывали концентрации как пептида. так и ОУА. Бифункционализированные наночастицы очищали от непрореагировавших компонентов с помощью фильтрации в геле на колонке. наполненной сефарозой СЬбВ. Каждые 0.5 мл фракции анализировали на наличие белка и/или пептида с помощью флуорескамина. и размер наночастиц оценивали с помощью динамического светорассеяния (ОЬ§).
В случае. если антиген не содержит никаких свободных тиоловых групп для вступления в такую реакцию. их можно вводить с помощью технологий рекомбинантной ДНК для создания мутанта. который можно было бы затем экспрессировать и очищать рекомбинантным путем. Альтернативно. можно выполнять сшивание амина и карбоновой кислоты между наночастицей и антигеном с помощью 1-этил3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида (ΕΌΟ).
Для образования конъюгатов ΕΚ.Υ1 с полимерной мицеллой. которая также конъюгирована с пептидным или белковым антигеном. следует применять подобные реакции. описанные для полимерных наночастиц. Мицеллу следует создавать таким образом. чтобы она содержала функциональные группы. желательные для соответствующей схемы конъюгации. Учитывая. что наночастицы и мицеллы можно синтезировать так. что они будут содержать множество различных функциональных химических групп. имеются различные возможные схемы конъюгации для применения в создании комплекса наночастицы/мицелла-антиген-ΕΡΥ 1.
Пример 4. Разработка антител и фрагментов антител. которые связываются с эритроцитами мыши и/или человека.
Для индукции антиген-специфической иммунной толерантности в качестве другого способа нековалентного связывания эритроцитов также можно применять связывающееся с эритроцитами антитело. Антитела. проявляющие высокую аффинность к поверхностным белкам эритроцитов. можно выделять с помощью скрининга библиотек антител с помощью известных в данной области платформ дисплеев. включая. но без ограничения. бактериофаговый дисплей. дрожжевой дисплей и поверхностный дисплей Ε. сой. При обнаружении нового связывающегося с эритроцитами антитела можно выполнить биохимическую характеристику связывания. подобную той. которая была проведена для пептида ΕΚΥ1. Для создания мутантов с повышенной аффинностью с улучшенными характеристиками связывания проводят созревание аффинности для фрагментов антител. у которых при начальном скрининге библиотеки была обнаружена способность к связыванию с эритроцитами. С помощью стандартных методик рекомбинантной ДНК. таких как ПЦР с внесением ошибок и сайт-направленный мутагенез. создают новую библиоте- 30 028087 ку из родительской связывающей последовательности. Библиотека фрагментов антител, подвергнутых созреванию аффинности, представляется в дальнейшем с помощью известных в данной области платформ дисплеев, как описано ранее для других фрагментов антител с усиленной аффинностью к эритроцитам по сравнению с родительской связывающей последовательностью.
Созревание аффинности также выполняют для существующих антител, которые связываются с эритроцитами мыши или эритроцитами человека. Моноклональное антитело клона ТЕР-119 крысы (К1па е1 а1., Вг ί. Наета1о1, 2000) связывается с эритроцитами мыши в еще не полностью изученном сайте, в то же время его специфичность привела к его широкому применению при удалении эритроцитов из гетерогенных популяций клеток. Для обнаружения новых антител с повышенной аффинностью к эритроцитам мыши созревание аффинности проводят с антителом ТЕР-119 в качестве антитела полной длины либо фрагмента антитела, такого как 5сРν. Моноклональное антитело клона 10Р7 мыши (Ьап§1о15 е1 а1., ί. Пптипо1. 1984) связывается с гликофорином А человека на поверхности клетки - эритроцита человека. Для обнаружения новых антител с повышенной аффинностью к эритроцитам человека созревание аффинности проводят с антителом 10Р7 в качестве антитела полной длины либо фрагмента антитела, такого как 5сРν.
Для определения первичной последовательности антитела ТЕР-119 была клонирована выделенная кДНК, специфичная для антитела, из гибридомы ТЕР-119 в плазмиду с созданием возможности простого секвенирования фрагментов гена. В способе ПЦР-амплификации генов антитела применяли определенный набор праймеров, который способствует амплификации многочисленных вариабельных доменов генных сегментов (КтеЬЬет е1 а1., 1997; Реййу е1 а1., 2010). Последовательность ДНК доменов антитела позволила определить вариабельные участки тяжелой и легкой цепей антитела ЦС ТЕР-119. Для конструирования варианта 5сРν ЦС ТЕР-119 применяли сборочную ПЦР с целью создания гена, кодирующего фрагмент, содержащий вариабельный участок тяжелой цепи ТЕР-119 с расположенным за ним линкером (С1у-С1у-С1у-С1у-Зег)4 (ЗЕЦ ГО N0: 18), за которым располагается вариабельный участок легкой цепи ТЕР-119.
Для создания комплементарной ДНК (кДНК) клона выполняли стандартную ПЦР с обратной транскриптазой (ОТ-ПЦР) на мРНК, выделенной из гибридомного клона ТЕР-119 с помощью системы синтеза первой цепи Зирегзспр! III (ЧпуПгодеп). Затем проводили ПЦР с помощью следующего набора праймеров для специфической амплификации последовательностей ДНК, соответствующих вариабельным участкам тяжелой (νΗ) и легкой (Ж) цепи антитела.
- 31 028087
Название праймера Последовательность праймера (от 5’к 3’) 5ЕЦ Ш N0
УЕ-ЕОК1 АОС СОО ССА ТОО СОО ΑΥΑ ТСС АОС ТОА СТО АОСС 8ЕЦ Ш N0:21
УЕ-ЕОК2 АОС СОО ССА ТОО СОО ΑΥΑ ТТО ТТС ТСА ССС АОТС 8ЕЦ Ш N0:22
УЬ-РОКЗ АОС СОО ССА ТОО СОО ΑΥΑ ТТО ТОМ ТМА СТС АОТС 5ЕЦ Ш N0:23
УЬ-РОК4 АОС СОО ССА ТОО СОО ΑΥΑ ТТО ΤΟΥ ТКА САС АОТС 8ЕЦ Ш N0:24
УЬ-РОК5 АОС СОО ССА ТОО СОО ΑΥΑ ТТО ТКА ТОА СМС АОТС 5ЕЦ Ш N0:25
УЬ-РОКб АОС СОО ССА ТОО СОО ΑΥΑ ТТМ АСА ТКА МСС АОТ С 5ЕЦ Ш N0:26
УЬ-РОК7 АОС СОО ССА ТОО СОО ΑΥΑ ТТС АСА ТОА ΥϋΟ АОТС 8ЕЦ Ш N0:27
УЬ-РОК8 АОС СОО ССА ТОО ССС ΑΥΑ ТУС АСА ТОА САС АСА С 8ЕЦ Ш N0:28
УЬ-РОК9 АОС СОО ССА ТОО СОО ΑΥΑ ТТО ТТС ТСА АСС АОТС 5ЕЦ Ш N0:29
УЬ-РОКЮ АОС СОО ССА ТОО СОО ΑΥΑ ТТО АОС Т8А ССС ААТС 8ЕЦ Ш N0:30
УЬ-РОКП АОС СОО ССА ТОО СОО ΑΥΑ ТТ8 ТКА ТОА ССС АКТС 8ΕΟΙϋΝΟ:31
УЬ-РОК12 АОС СОО ССА ТОО СОО ΑΥΚ ТТК ТОА ТОА ССС АКАС 8ЕЦ Ш N0:32
УЬ-РОК13 АОС СОО ССА ТОО СОО ΑΥΑ ТТО ТОА ТОА СВС АОКС 5ЕЦ Ш N0:33
УЬ-РОК14 АОС СОО ССА ТОО СОО ΑΥΑ ТТО ТОА ТАА СУС АОО А 8ЕЦ Ш N0:34
УЬ-РОК15 АОС СОО ССА ТОО СОО ΑΥΑ ТТО ТОА ТОА ССС АОАТ 8ЕЦ Ш N0:35
ΥΊ.-1ΌΚ16 АОС СОО ССА ТОО СОО ΑΥΑ ТТО ТОА ТОА САС ААСС 8ЕЦ Ш N0:36
УЬ-РОК17 АОС СОО ССА ТОО СОО ΑΥΑ ТТТ ТОС ТОА СТС АОТС 8ЕЦ Ш N0:37
УЬ-РОК18 АОС СОО ССА ТОО СОО АКО СТО ТТО ТОА СТС АОО ААТС 8ЕЦ Ш N0:38
- 32 028087
УЬ-КЕУ1 ОАТ ОСТ ОСО ОСС ОСА СТА СОТ ТТС АТТ ТСС АОС ТТО С δΕΟ ГО N0:39
УЬ-КЕУ2 ОАТ СОТ ОСС ОСС ОСА ОТА СОТ ТТТ АТТ ТСС АОС ТТО С δΕΟ ГО N0:40
УЕ-ЕЕУЗ ОАТ СОТ ОСС ОСС ОСА ОТА СОТ ТТТ АТТ ТСС ААС ТТТ С δΕΟ ГО N0:41
УЕ-ЕЕУ4 ОАТ ОСТ ОСС ОСС ОСА ОТА СОТ ТТС АОС ТСС АОС ТТО С δΕΟ ГО N0:42
УЕ-ЕЕУ5 ОАТ ОСТ ОСС ОСС ОСА ОТА СОТ АОС АСА ОТС АОТ ТТО С δΕΟ ГО N0:43
УЕ-ЕЕУ6 ОАТ ОСТ ОСС ОСС ОСА ОТА СОТ АОС АСА ОТО АСС ТТО О δΕΟ ГО N0:44
УН-ЕОЕ1 ОТТ АТТ ОСТ АСС ОСС ТСА ОСС ОСС ААТ ОСС ОСА КОТ ЕМА ОСТ ТСА ОСА ОТС δΕΟ ГО N0:45
УН-ЕОЕ2 ОТТ АТТ ОСТ АОС ОСС ТСА ОСС ОСС ААТ ОСС ОСА СОТ ВСА ОСТ ВСА ОСА ОТС δΕΟ ГО N0:46
УН-ЕОЕЗ ОТТ АТТ ОСТ АОС ОСС ТСА ОСС ОСС ААТ ОСС ОСА ОСТ ОСА ОСТ ОАА ΟδΑ δΤΟ δΕΟ ГО N0:47
УН-ЕОЕ4 ОТТ АТТ ОСТ АОС ОСС ТСА ОСС ОСС ААТ ОСС ОСА СОТ ССА ЕСТ ОСА АСА ЕТС δΕΟ ГО N0:48
УН-ЕОЕ5 ОТТ АТТ ОСТ АОС ОСС ТСА ОСС ОСС ААТ ОСС ОСА ОСТ УСА ОСТ ВСА ОСА ЕТС 8ЕЦ ГО N0:49
УН-ЕОЕ6 ОТТ АТТ ОСТ АОС ОСС ТСА ОСС ОСС ААТ ОСС ОСА ОСТ УСА ЕСТ ОСА ОСА ОТС 8ЕЦ ГО N0:50
УН-ЕОЕ7 ОТТ АТТ ОСТ АОС ОСС ТСА ОСС ОСС ААТ ОСС ОСА ОСТ ССА СОТ ОАА ОСА ОТС δΕ0ΙϋΝΟ:51
УН-ЕОЕ8 ОТТ АТТ ОСТ АОС ОСС ТСА ОСС ОСС ААТ ОСС ОСА СОТ ОАА δ δΤ ОСТ ОСА АТС 8ЕЦ ГО N0:52
УН-ЕОЕ9 ОТТ АТТ ОСТ АОС ОСС ТСА ОСС ОСС ААТ ОСС ОСА УОТ САЗУ ΟΥΤ ОСТ ОСА ОТС δΕΟ ГО N0:53
УН-ЕОЕЮ ОТТ АТТ ОСТ АОС ОСС ТСА ОСС ОСС ААТ ОСС ОСА СОТ ОСА ΟδΚ ОСТ ОСА ОТС δΕΟ ГО N0:54
УН-ЕОЕ11 ОТТ АТТ ОСТ АОС ОСС ТСА ОСС ОСС ААТ ОСС ОСА КОТ ОСА МСТ ОСТ ОСА ОТС δΕΟ ГО N0:55
УН-ЕОЕ12 ОТТ АТТ ОСТ АОС ОСС ТСА ОСС ОСС ААТ ОСС ССА СОТ ОАА ОСТ ОАТ ОСА ЕТС δΕΟ ГО N0:56
УН-ЕОЕ13 ОТТ АТТ ОСТ АОС ОСС ТСА ОСС ОСС ААТ ОСС ССА СОТ ОСА ЕСТ ТОТ ТОА ОТС δΕΟ ГО N0:57
УН-ЕОЕ14 ОТТ АТТ ОСТ АОС ОСС ТСА ОСС ССС ААТ ОСС ССА ЕОТ ЕАА ОСТ ТСТ ССА ОТС δΕΟΙϋΝΟ:58
УН-ЕОЕ15 ОТТ АТТ ОСТ АОС ССС ТСА ОСС ССС ААТ ОСС ССА АОТ ОАА ΕδΤ ТОА ОСА ОТС δΕΟ ГО N0:59
УН-ЕОЕ16 ОТТ АТТ ОСТ АОС ССС ТСА ОСС ССС ААТ ОСС ССА ОСТ ТАС ТСТ ЕАА АСЗУ ΟΤδ ТО δΕΟ ГО N0:60
УН-ЕОЕ17 ОТТ АТТ ОСТ АОС ССС ТСА ОСС ССС ААТ ОСС ССА ОСТ ССА АСТ УСА ОСА ЕСС δΕΟ ГО N0:61
УН-ЕОЕ18 ОТТ АТТ ОСТ АОС ССС ТСА ОСС ССС ААТ ОСС ССА ТОТ ОАА СТТ ОСА АСТ ОТС δΕΟ ГО N0:62
УН-ЕОЕ19 ОТТ АТТ ОСТ АОС ССС ТСА ОСС ССС ААТ ОСС ССА ОСТ ОАА ОСТ САТ ССА ОТС δΕΟ ГО N0:63
УН-ЕЕУ1 ССС ТТО ААО СТТ ОСТ ОАО ОАА АСС СТО АСС СТО СТ δΕΟ ГО N0:64
УН-ЕЕУ2 ССС ТТО ААО СТТ ОСТ ОАО САО АСТ ОТС АСА СТО СТ δΕΟ ГО N0:65
УН-ЕЕУЗ ССС ТТО ААО СТТ ОСТ ОСА ОАО АСА ОТС АСС АСА ОТ δΕΟ ГО N0:66
ΥΗ-ΕΕΥ4 ССС ТТС ААС СТТ ОСТ ОАО ОАО АСС СТО АСТ САО СТ δ ЕС ГО N0:67
Затем амплифицированные гены УН и Ур расщепляли с помощью рестрикционных эндонуклеаз (ΝοχΠ и для УЕ, Ше1 и НтбШ для УН), фрагменты гена очищали после электрофореза в агарозном геле с помощью стандартного набора (/.уто ЕеьеагсН, Ориндж, Калифорния, США) и лигировали в кло- 33 028087 нирующую плазмиду ρΜΛΖ360. Плазмиду, содержащую ген УН или Уь, секвенировали, и с помощью сборочной ПЦР конструировали новый ген для создания последовательности, кодирующей зсРу ТЕК119:
5’-САООТСААОСТОСАСОАСТСТОСАССАОССТТОСТОСААССТСОСОС
СТСТСТСАААСТСТССТСТСТАСССТСАОСАТТСАСТТТСАСООАССАСТ
ССАТСААТТСССТСССССАСССТСССССАААСАССАТССАСТССАТТС
САОАТАТТАСАССТОАТОССАСТСАСАСАААСТАТССАССАТСТОТСАО
СААТАОАТТСАСААТСТССАОАОАСААТСССАССАОСАТССТОТАССТС
САОАТОАОСААТАТОАОАТСТСАТТАСАСАСССАСТТАТТАСТОТОТТА
САОАСТСАССТАСССССССТССССТТАТООАТОССТООООТСААСОААС
СТСАОТСАСТОТСТССТСАОССООТООТССТООТТСТСОТООТООТООТТ
СТСССООСООССССТСССОТООТООТООАТСССАСАТТСАОАТСАСОСА
ОТСТССТТСАОТССТОТСТССАТСТОТСССАСАСАОАОТСАСТСТСААСТ
ОСАААОСААСТСАОААТАТТААСААОТАСТТАААСТООТАТСАОСАААА
ОСТТООАОААОСТСССАААОТССТОАТАТАТААТАСАААСААТТТССАА
АСОООСАТСССАТСААССТТСАОТООСАСТООАТСТССТАСАОАТТТСА
САСТСАССАТСАОТАСССТССАСССТСААСАТТТТСССАСАТАТТТСТССТ
ТТСАОСАТТАТАСТТСССССАСОТТТСОАОСТСООАССААОСТСОАААТС
АААССТАСТ-3' (ЗЕО ГО N0:69), которая кодирует УН-участок клона ТЕК-119 на Ν-конце транслированного белка с расположенным за ним линкерным доменом (С1у-О1у-О1у-О1у-Зег)4 (ЗЕР ГО NО: 18), за которым располагается Уьучасток клона ТЕК-119 на С-конце транслированного белка. Ген §сРу ТЕК-119 конструировали путем амплификации кДНК ТЕК-119 с помощью праймеров ЗК07 и ЗК08, специфичных для УН-участка, и ЗК09 и З10, специфичных для Уь-участка.__
Название праймера Последовательность праймера (от 5’к 3’) ЗЕЦ ГО N0
8К07 АСТ СОС ООС ССА ОСС ООС САТ ООС ОСА СОТ САА ОСТ ССА ССА СТС 8ЕЦ ГО N0:70
ЗК08 ССА ССС ССС ССС ССС АСА АСС АСС АСС АСС АСА АСС АСС АСС АСС ССС ТСА ССА САС АСТ САС ТС ЗЕЦ ГО N0:71
ЗК09 ССС ССС ССС ССС ТСС ССТ ССТ ССТ ССА ТСС САС АТТ САС АТС АСС САС ТС ЗЕЦ ГО N0:72
ЗК10 САС ТАС ТАС ССС ССС САС ССС АСТ АСС ТТТ САТ ТТС САС СТ ЗЕЦ ГО N0:73
Каждый полностью сформированный продукт в виде гена зсРу расщепляли с помощью ЗйТ и ΧΡοΙ (ИЕВ, Ипсуич, Массачусетс, США) и лигировали в те же самые сайты в плазмиде для экспрессии у млекопитающих рЗесТадА Цпуйгодеп, Карлсбад, Калифорния, США).
Для созревания аффинности зсРу 10Р7, который связывается с гликофорином А человека, соответствующий ген синтезировали коммерческим путем и получали из ГЖАЗ.С) (Менло-Парк, Калифорния, США) в виде следующей последовательности:
- 34 028087
5'-ОТТАТТАСТСОСООСССАОССООССАТООСООСОСАООТОАААСТ
ССАССАСАСССССССССААСТССТСАААСССССССССАСССТСАААСТС
АОСТОСАААОСОАОСООСТАТАССТТТААСАОСТАТТТТАТОСАТТСОАТС
АААСАОСОСССООТОСАОООССТООААТООАТТСОСАТСАТТСОСССОАА
СССССССАССАСССАТТАТААССАААААТТТАААААСАААСССАСССТСА
СССТССАТААААССАССААСАСССССТАТАТССАССТСААСАСССТСАСС
АОСООСОАТАОСОСООТОТАТТАТТОСОСОСОСТСООААООСАОСТАТТА
ТССССТССАТТАТТССССССАССССАССАСССТСАСССТСАССАСССССС
ОСООСООСАОСООСООСООСООСАОСООСООСООСООСАОСОАТАТТСА
АСТСАСССАСАССССССССАТТАТСАСССССАСССТСССССАААААСТС
АССАТСАССТССССССССАССАССААССТСАААТАТАТСТАТТССТАТСА
ССАСААААССССССССАСССССАААСТСТССАТТТАТТАТАССАССААСС
ТССССАССССССТССССССССССТТТАСССССАСССССАСССССАССАС
СТАТАСССТСАССАТТАССАСССТССААССССААСАТССССССАССТАТТ
АТТСССАССАСТТТАССАССАСССССТАТАССТТТСССССССССАССААА
СТССАААТТАААСССССССССССССССТСССССССССАСССССССССТТ
СТ-3' (8Е(2 ГО N0:74).
Подобное созревание аффинности с помощью методик рекомбинантной ДНК, описанное ранее для ТЕК-119, выполняли для гена 10Р7 с целью получения библиотеки мутантов, обеспечивающей возможность скрининга для выявления усиленного связывания с эритроцитами человека.
Пример 5. Индукция антиген-специфической иммунной толерантности посредством нековалентного связывания антигена, конъюгированного с антителом, с эритроцитами.
Антитело можно конъюгировать с антигеном с помощью стандартных реакций сшивания, как указано в примере 3 и в других местах в данном документе. Очищенный конъюгат антитело-антиген будет проявлять индукцию толерантности к антигену в стандартных мышиных моделях сахарного диабета 1 типа, рассеянного склероза, трансплантации островковых клеток и в случае модельного антигена ОУА.
Для демонстрации индукции толерантности к ОУА конъюгат ОУА-антитело или конъюгат ОУАнаночастица-антитело можно вводить мышам внутривенным или внесосудистым путем. Через заранее определенное число дней после введения мышей необходимо умертвить, а лимфатические узлы, селезенку и кровь собрать для анализа. Спленоциты и клетки, полученные из лимфатических узлов, высевают и повторно стимулируют в течение 3 дней ех νί\Ό с помощью ОУА и/или пептида 8ΙΙΝΤΗΚ1,, и посредством ЕЫ8А у них измеряют снижение экспрессии ΙΡΝγ, ГО-17а, ГО-2 и ГО-4 и повышение экспрессии ТСР-31, которые являются достоверными признаками толерантности. Внутриклеточное окрашивание ΙΡΝγ, ГО -17а, ГО-2 и ГО-4 выполняют с помощью проточной цитометрии спленоцитов и клеток, полученных из лимфатических узлов, спустя 6 ч после повторной стимуляции ех νί\Ό с помощью ОУА и/или пептида 8ΙΙΝΡΡΚΡ. Также проточную цитометрию применяют для характеристики профилей экспрессии СИ4, СИ8 и регуляторных Т-клеток из клеток, выделенных из лимфатических узлов, селезенки и крови. Дополнительно, у мышей берут образцы крови в различные моменты времени для измерения гуморального ответа на антиген ОУА с выработкой антител. Для определения того, является ли системная толерантность установившейся, выполняют другой эксперимент повторной стимуляции ех νί\Ό. Мышам вводят конъюгат ОУА-антитело или конъюгат ОУА-антитело-наночастица, как описано ранее, ОУА повторно вводят спустя 9 дней с адъювантом (липополисахаридом, полным адъювантом Фрейнда, квасцами и др.), и реактивность спленоцитов в отношении антигена ОУА оценивают посредством ЕЫ8А и/или проточной цитометрии, как описано ранее. Состав на основе конъюгата ОУА-антитело и/или конъюгата ОУА-антитело-наночастица сделает спленоциты нереактивными в отношении второй активации с помощью ОУА и адъюванта, что является одним из способов демонстрации эффективного установления системной толерантности. После начального введения составов на основе конъюгата ОУА-антитело и/или конъюгата ОУА-антитело-наночастица можно проводить подобные эксперименты по стимуляции ΐη νί\Ό с трансгенными клеточными линиями в качестве дальнейшей демонстрации толерантности, такие как адаптивный перенос Т-клеток ОТ-Ι, подобные исследованиям, подробно описанным в примере 3. Для демонстрации иммунной толерантности в мышиных моделях аутоиммунитета или деиммунизации терапевтических молекул можно создавать аналогичные конъюгаты антител для соответствующих антигенов, как было описано в данном документе для ОУА.
Пример 6. Индукция антиген-специфической иммунной толерантности посредством нековалентно- 35 028087 го связывания антигена, гибридизированного с одноцепочечным антителом, с эритроцитами.
Можно применять одноцепочечные фрагменты антител (зсРу) в качестве участников нековалентного связывания с эритроцитами. δсΡν, проявляющие высокую аффинность к поверхностным белкам эритроцитов, можно выделять путем скрининга библиотек зсРу с помощью известных в данной области платформ дисплеев. При обнаружении нового связывающегося с эритроцитами фрагмента антитела необходимо выполнить биохимическую характеристику связывания, подобную той, которая была проведена для пептида ΕΚΥ1. Поскольку зсРу имеет одну полипептидную цель, его будут гибридизировать с антигеном сайт-специфическим рекомбинантным путем с помощью стандартных методик рекомбинантной ДНК. В зависимости от природы партнера гибридизации для антигена зсРу гибридизируют с Ν- или С-концом антигена с созданием бифункциональных белковых соединений. В случае, если последовательность узнавания пептида главного комплекса гистосовместимости (МНС) известна антигену, пептид также включают в линкерный домен зсРу, создавая, таким образом, новый бифункциональный конструкт антитело/антиген, содержащий нативные концы зсРу.
Для демонстрации индукции толерантности к ΟνΑ конъюгат ΟνΑ-^Ρν или конъюгат ΟνΑнаночастица-δсΡу можно вводить мышам внутривенным или внесосудистым путем. Через заранее определенное число дней после введения мышей необходимо умертвить, а лимфатические узлы, селезенку и кровь необходимо собрать для анализа. Спленоциты и клетки, полученные из лимфатических узлов, необходимо высеять и повторно стимулировать в течение 3 дней ех νίνο с помощью ΟνΑ и/или пептида δΙΙΝΡΕΚΕ (δΕ^ ΙΌ ΝΟ: 3), и с помощью, например, ΙΈΙδΑ необходимо измерить у них снижение экспрессии ΙΡΝγ, Ш-17а, ΙΡ-2 и ΙΡ-4 и повышение экспрессии ΤΟΡ-β1, которые являются достоверными признаками толерантности. Внутриклеточное окрашивание ΙΡΝγ, Ш-Па, ΙΕ-2 и ΙΡ-4 выполняют с помощью проточной цитометрии спленоцитов и клеток, полученных из лимфатических узлов, спустя 6 ч после повторной стимуляции ех νίνο с помощью ΟνΑ и/или пептида δΙΙΝΡΕΚΕ (δΕ^ ΙΌ ΝΟ: 3). Также проточную цитометрию можно применять для характеристики профилей экспрессии СЭ4, СЭ8 и регуляторных Т-клеток из клеток, выделенных из лимфатических узлов, селезенки и крови. Дополнительно, у мышей берут образцы крови в различные моменты времени для измерения гуморального ответа на антиген ΟνΑ с выработкой антител. Для определения того, является ли системная толерантность установившейся, выполняют другой эксперимент повторной стимуляции ех νίνο. Мышам вводят конъюгат ΟνΑδсΡу или конъюгат ΟVΑ-наночастица-δсΡу, как описано ранее, ΟνΑ повторно вводят спустя 9 дней с адъювантом (липополисахаридом, полным адъювантом Фрейнда, квасцами и др.), и реактивность спленоцитов в отношении антигена ΟνΑ оценивают посредством ΕΕΙδΑ и/или проточной цитометрии, как описано ранее. Состав на основе конъюгата ΟνΑ^Ρν и/или конъюгата ΟVΑ-δсΡу-наночастица сделает спленоциты нереактивными в отношении второй активации с помощью ΟνΑ и адъюванта, что демонстрирует, таким образом, эффективное установление системной толерантности. После начального введения составов на основе конъюгата ΟνΑ^Ρν и/или конъюгата ΟVΑ-зсΡу-наночастица можно проводить подобные эксперименты по активации ΐη νίνο с трансгенными клеточными линиями для демонстрации толерантности, такие как адаптивный перенос Т-клеток ΟΕΙ, подобные исследованиям, подробно описанным в примере 3. Для демонстрации иммунной толерантности в мышиных моделях аутоиммунитета или деиммунизации терапевтических молекул можно создавать аналогичные гибридные молекулы на основе δсΡу для соответствующих антигенов, как было описано в данном документе для ΟνΑ.
Для создания конструкта на основе антитела, который как связывается с эритроцитами мыши, так и представляет иммунодоминантный эпитоп ΟνΑ, презентируемый МНС-Ι (δΟ^Ε^^ΕδΠNΡΕΚ^) (δΕ^ ΙΓ) ΝΟ: 75), применяют стандартные методики рекомбинантной ДНК. С помощью ПЦР с перекрывающимися праймерами впервые был создан фрагмент ДНК, который кодировал 3'-концевой домен, в том числе пептид δΟ^Ε^^ΕδΠNΡΕΚ^ (δΕ^ ΙΓ) ΝΟ: 75), перекрывающийся с 5'-доменом, комплементарным 3'концу последовательности ΤΕΚ119. Этот фрагмент ДНК применяли в качестве обратного праймера наряду с комплементарным прямым 5'-праймером в стандартной ПЦР для создания целого фрагмента ДНК, кодирующего ΤΕΚ119-δΟ^Ε^^ΕδIINΡΕΚ^ (δΕς ΙΌ ΝΟ: 75):
5'-ОАООТОААОСТОСАООАОТСТООАООАООСТТООТОСААССТОООООО
ТСТСТОАААСТСТССТОТОТАОССТСАООАТТСАСТТТСАОООАССАСТОО
АТОААТТОООТССООСАООСТСССООАААОАССАТООАОТООАТТООАО
АТАТТАОАССТОАТООСАОТОАСАСАААСТАТОСАССАТСТОТОАООААТ
АОАТТСАСААТСТССАОАОАСААТОССАООАОСАТССТОТАССТОСАОАТ
ОАОСААТАТОАОАТСТОАТТАСАСАОССАСТТАТТАСТОТОТТАОАОАСТ
САССТАСССОООСТОООСТТАТООАТОССТООООТСААООААССТСАОТС
АСТОТСТССТСАОССООТООТООТООТТСТООТООТООТООТТСТООСОО
СООСООСТССООТООТООТООАТССОАСАТТСАОАТОАСОСАОТСТССТТ
САОТССТОТСТОСАТСТОТОООАОАСАОАОТСАСТСТСААСТОСАААОСА
- 36 028087
АОТСАОААТАТТААСААОТАСТТАААСТООТАТСАОСААААОСТТООАО
ААОСТСССАААОТССТОАТАТАТААТАСАААСААТТТОСАААСОООСАТ
СССАТСААООТТСАОТООСАОТООАТСТООТАСАОАТТТСАСАСТСАССА
ТСАОТАОССТОСАОССТОААОАТТТТОССАСАТАТТТСТОСТТТСАОСАТТ
АТАСТТООСССАСОТТТООАООТОООАССААОСТООАААТСАААСОТАС
ТСАТСАТСАССАТСАТСАСООТООСООТТСТООССТООАОСАОСТООАОТ
СТ АТТ АТТ А АТТТСО А А А А АСТО-3' (8Е0 ГО N0:76).
Подчеркнутая последовательность обозначает генный сегмент, кодирующий δΟΙ.ΗΟΙ.ΗδΙΙΝΡΗΚΡ. Для рекомбинантной экспрессии фрагмент ДНК включали в вектор экспрессии у млекопитающих и прокариот.
Для создания конструкта на основе антитела, который связывается с эритроцитами мыши и представляет мимотоп 1040-р31 хромогранина А (УУКРРАУКМР) (5Ε9 ΙΡ) ΝΟ: 77), применяют стандартные методики рекомбинантной ДНК. С помощью ПЦР с перекрывающимися праймерами был создан фрагмент ДНК, который кодировал 3'-концевой домен, в том числе пептид УУКРРАУКМР (5Ε9 ΙΡ) ΝΟ: 77), перекрывающийся с 5'-доменом, комплементарным 3'-концу последовательности ТΕК119. Этот фрагмент ДНК применяли в качестве праймера наряду с комплементарным прямым 5'-праймером в стандартной ПЦР для создания целого фрагмента ДНК, кодирующего ТΕК119-ΥVКΡ^АVКΜΕ:
5-АООТОААОСТОСАООАОТСАООАООАООСТТООТОСААССТОООО
ООТСТСТОАААСТСТССТОТОТАОССТСАООАТТСАСТТТСАОООАССАС
ТООАТОААТТОООТССООСАООСТСССООАААОАССАТООАОТООАТТО
ОООАТАТТАОАССТОАТООСАОТОАСАСАААСТАТОСАССАТСТОТОАО
ОААТАОАТТСАСААТСТССАОАОАСААТАССАООАОСАТССТОТАССТО
САОАТОООСААТАТОАОАТСТОАТТАСАСАОССАСТТАТТАСТОТОТТАО
АОАСТСАССТАСССОООСТОООСТТАТООАТОССТООООТСААООААСС
ТСАОТСАСТОТСТССТСАОССООТООТООТООТТСТООТООТООТООТТС
ТООСООСООСООСТССООТООТООТООАТССОАСАТТСАОАТОАСОСАО
ТСТССТТСАОТССТОТСТОСАТСТОТОООАОАСАОАОТСАСТСТСААСТО
САААОСААОТСАОААТАТТААСААОТАСТТАААССООТАТСАОСААААО
СТТООАОААОСТСССАААОТССТООТАТАТААТАСАААСААТТТОСАААС
ОООСАТСССАТСААООТТСАОТООСАОТООАТСТООСАСАОАТТТСАСАС
ТСАССАТСАОТАОССТОСАОССТОААОАТТТТОССАСАТАТТТСТОСТТТС
АОСАТТАТАСТТООСССАСОТТТООАООТОТОАССААОСТООАААТСАА
АСОТАСТСАТСАТСАССАТСАТСАСООТООСООТТАТОТСАОАССТСТОТ
СООТСАОААТООАА-31 (5Е0 ГО N0:78).
Подчеркнутая последовательность обозначает генный сегмент, кодирующий мимотоп хромогранина А (1040-р31) (УУКРРАУКМР) (5Ε9 ΙΡ) ΝΟ: 77). Для рекомбинантной экспрессии фрагмент ДНК включали в вектор экспрессии у млекопитающих и прокариот.
Для создания конструкта на основе антитела, который связывается с эритроцитами мыши и представляет проинсулин мыши, главный аутоантиген сахарного диабета у мышей ΝΟΏ, применяли стандартные методики рекомбинантной ДНК. С помощью ПЦР с перекрывающимися праймерами впервые был создан фрагмент ДНК, который кодировал 3'-концевой домен, в том числе целый белок проинсулин, перекрывающийся с 5'-доменом, комплементарным 3'-концу последовательности ΕΕΚ119. Этот фрагмент ДНК применяли в качестве праймера наряду с комплементарным прямым 5'-праймером в стандартной ПЦР для создания целого фрагмента ДНК, кодирующего ТΕК119-проинсулин:
- 37 028087
5'-ОАООТОААОСТОСАООАОТСАООАООАООСТТООТОСААССТООООО
ОТСТСТОАААСТСТССТОТОТАОССТСАООАТТСАСТТТСАОООАССАСТ
ООАТОААТТОООТССООСАООСТСССООАААОАССАТООАОТООАТТОО
АОАТАТТАОАССТОАТООСАОТОАСАСАААСТАТОСАССАТСТОТОАОО
ААТАОАТТСАСААТСТССАОАОАСААТОССАООАОСАТССТОТАССТОС
АОАТОАОСААТАТОАОАТСТОАТТАСАСАОССАСТТАТТАСТОТОТТАОА
ОАСТСАССТАСССОООСТОООСТТАТООАТОССТООООТСААООААССТС
АОТСАСТОТСТССТСАОССООТООТООТООТТСТООТООТООТООТТСТО
ОСООСООСООСТССООТООТООТООАТССОАСАТТСАОАТОАСОСАОТС
ТССТТСАОТССТОТСТОСАТСТОТОООАОАСАОАОТСАСТСТСААСТОСА
ААОСААОТСАОААТАТТААСААОТАСТТАААСТООТАТСАОСААААОСТ
ТООАОААОСТСССАААОТССТОАТАТАТААТАСАААСААТТТОСАААСО
ООСАТСССАТСААООТТСАОТООСАОТООАТСТСОТАСАОАТТТСАСАСТ
САССАТСАОТАОССТОСАОССТОААОАТТТТОССАСАТАТТТСТОСТСТС
АОСАТТАТАСТТООСССАСОТТТОАТООТОООАССААОСТООАААТСАА
АСОТАСТСАТСАТСАССАТСАТСАСООТООСООТТТТСТСАААСАОСАТС
ТОТОСООТССОСАТСТООТООААОСОСТОТАТСТООТОТОСООСОААСОТ
60СТТТТТТТАТАСССС0АААА0СС0ТС0Т0АА0Т00АА0АТСС0СА00Т
00ААСА0СТ00ААСТ000С00СА6ССС000Т0АТСТ0СА0АСССТ00СС
СТООААОТООСОСОТСАОАААСОТООСАТТОТООАТСАОТОСТОСАССА
ОСАТТТОСАОССТОТАТСАОСТООААААСТАТТАСААС-31 (ЗЕ<^ ГО N0:79).
Подчеркнутая последовательность обозначает генный сегмент конструкта, кодирующий проинсулин. Для рекомбинантной экспрессии фрагмент ДНК включали в вектор экспрессии у млекопитающих и прокариот.
Пример 7. Синтез разветвленных полимеров, содержащих связывающиеся с эритроцитами лиганды и другие функциональные группы.
Для синтеза ΡΕΟ-тиоацетата с 8 ветвями ΡΕΟ-ΟΗ с 8 ветвями (\ек!аг) растворяли в толуоле и вводили в реакцию на 18 ч с 10 эквивалентами триэтиламина (81дша АМпсй, СА8 № 121-44-8) и 10 эквивалентами метансульфонилхлорида (81дта АМпсй, СА8 № 124-63-0) при комнатной температуре под аргоном. Остаток отфильтровывали, и фильтрат концентрировали при пониженном давлении, растворяли в диметилформамиде (ЭМР), и добавляли 10 эквивалентов тиоацетата калия (8щта АМпсй, СА8 № 1038740-3). Спустя 18 ч нахождения при комнатной температуре фильтрат концентрировали под пониженным давлением и осаждали в диэтиловом эфире. Осадок отфильтровывали и высушивали при пониженном давлении с получением конечного продукта.
Для синтеза ΡΕΟ-пиридилдисульфида с 8 ветвями ΡΕΟ-тиоацетат с 8 ветвями растворяли в диметилформамиде (ЭМР), и с него удаляли защитные группы с помощью 1,05 эквивалента метоксида натрия (Мдта АМпсй, СА8 № 124-41-4) в течение 1 ч при комнатной температуре под аргоном в сосуде Шленка. Для восстановления незащищенных тиоловых групп до тиолатных к раствору добавляли 2 эквивалента гидрохлорида трис(2-карбоксиэтил)фосфина (ТСЕР, 'Попо 8с1епййс, СА8 № 51805-45-9) и 2 эквивалента дистиллированной воды. Спустя 2 ч нахождения при комнатной температуре добавляли 12 эквивалентов 2,2'-дитиодипиридина (алдритиол-2, 8щта АМпсй, СА8 № 2127-03-9), и раствор взбалтывали при комнатной температуре в течение 24 ч. Затем реакционную смесь диализировали против 5 л дистиллированной воды в диализной трубке МАСО на 3500 Да в течение 48 ч, во время которых дистиллированную воду заменяли 4 раза. Нагрузку пиридилсульфида на ΡΕΟ с 8 ветвями определяли количественно по восстановлению в 25 мМ ТСЕР в 100 мМ ΗΕΡΕ8, рН 8,0, и спектры в УФ- и видимой области измеряли при 343 нм для отслеживания присутствия пиридин-2-тионовой уходящей группы.
Для синтеза 14С-11ириди.:1су.:1ьфид-А1.РХА1;1Л.’С)К647 с 8 ветвями ΡΕΟ-тиоацетат с 8 ветвями растворяли в 1)МР, и с него удаляли защитные группы с помощью 1,05 эквивалента метоксида натрия (Мдта АМпсй, СА8 № 124-41-4) в течение 1 ч при комнатной температуре под аргоном в сосуде Шленка. Для восстановления незащищенных тиоловых групп до тиолатных к раствору добавляли 2 эквивалента гидрохлорида трис(2-карбоксиэтил)фосфина (ТСЕР, 'ГНетто ЗМепййс, СА8 № 51805-45-9) и равный объем 100 мМ ΗΕΡΕ8, ρΗ 8,0. Спустя 2 ч нахождения при комнатной температуре к раствору добавляли 0,125 эквивалента (эквивалентно 1 ветви из 8) Α^ΕXΑР^υΟΚ647-С2-малеимида (Тпуйтодеп). Спустя 2 ч
- 38 028087 нахождения при комнатной температуре добавляли 12 эквивалентов 2,2'-дитиодипиридина (алдритиол-2, 81дта Λ1ά^^сИ. СА8 № 2127-03-9), и раствор взбалтывали при комнатной температуре в течение 24 ч. Затем реакционную смесь диализировали против 5 л дистиллированной воды в диализной трубке МАС0 на 3500 Да в течение 48 ч, во время которых дистиллированную воду заменяли 4 раза. Нагрузку пиридилсульфида на РЕО с 8 ветвями определяли количественно по восстановлению в 25 мМ ТСЕР в 100 мМ НЕРЕ8, рН 8,0, и спектры в УФ- и видимой области измеряли при 343 нм для отслеживания присутствия пиридин-2-тионовой уходящей группы.
Тиолсодержащие пептиды конъюгировали с РЕО-пиридилсульфидом с 8 ветвями путем добавления стехиометрических количеств пептида, растворенного в водном 3 М гуанидине-НС1 (81дта Λ1ά^^сИ. СА8 № 50-01-10), к водному раствору РЕО-пиридилсульфида с 8 ветвями при комнатной температуре. Преобразования в ходе реакции отслеживали путем измерения спектров в УФ- и видимой области при 343 нм для количественного определения присутствия пиридин-2-тионовой уходящей группы. При необходимости конъюгации более одной молекулы с РЕО-пиридилсульфидом с 8 ветвями процедуру реакции повторяли с новой молекулой в том же сосуде. Сразу после завершения конъюгации реакционную смесь обессоливали на колонке для обессоливания 2ЕВА8РГО (ТИетю 8с1Сп11Пс), и очищенный продукт хранили в соответствующих стерильных условиях.
Индукцию толерантности к ОVА можно было продемонстрировать для конъюгата РЕО с 8 ветвямиЕКУ/МГО^ПОТЕКЬ (8П№РКР: 8ЕЦ ГО N0: 3) посредством его введения мышам внутривенным или внесосудистым путем. Этот тест также должен свидетельствовать об индукции толерантности у людей с помощью лигандов, специфичных для человека. При такой демонстрации через заранее определенное число дней после введения мышей следовало умертвить, а лимфатические узлы, селезенку и кровь собрать для анализа. Спленоциты и клетки, полученные из лимфатических узлов, высевают и повторно стимулируют в течение 3 дней ех νίνο с помощью ОVА и/или пептида 8П№'ЕКЬ (8ЕЦ ГО N0: 3), и посредством ЕЫ8А у них измеряют снижение экспрессии ΓΡΝγ, ГО-17а, ГО-2 и ГО-4 и повышение экспрессии ТОР-βΕ которые являются достоверными признаками толерантности. Внутриклеточное окрашивание ГО-17а, ГО-2 и ГО-4 выполняют с помощью проточной цитометрии на спленоцитах и клетках, полученных из лимфатических узлов, спустя 6 ч после повторной стимуляции ех νίνο с помощью ОVА и/или пептида ЗПОТЕКЬ (8ЕЦ ГО N0: 3). Также проточную цитометрию применяют для характеристики профилей экспрессии СГО4, СЭ8 и регуляторных Т-клеток из клеток, выделенных из лимфатических узлов, селезенки и крови. Дополнительно, у мышей берут образцы крови в различные моменты времени для измерения гуморального ответа на антиген ОVА с выработкой антител. Для определения того, является ли системная толерантность установившейся, выполняют другой эксперимент повторной стимуляции ех νίνο. Мышам вводят конъюгат РЕО с 8 ветвями-ЕРУРМ^^ПЖЕКИ (8П№ЕКР: 8ЕЦ ГО N0: 3), как описано ранее, ОVА повторно вводят спустя 9 дней с адъювантом (липополисахаридом, полным адъювантом Фрейнда, квасцами и др.), и реактивность спленоцитов в отношении антигена ОVА оценивают посредством ЕЫ8А и/или проточной цитометрии, как описано ранее. Конъюгат РЕО с 8 ветвями-ЕКУ1ЗПОТРКЬ (8П№ЕКР: 8ЕЦ ГО N0: 3) сделает спленоциты нереактивными в отношении второй активации с помощью ОVА и адъюванта, что является способом иллюстрации эффективного установления системной толерантности. После начального введения составов на основе конъюгата РЕО с 8 ветвямиЕ^ГОП/МГО^ПОТЕКЬ (8П№ЕКР: 8ЕЦ ГО N0: 3) можно проводить подобные эксперименты по активации ίη νίνο с трансгенными клеточными линиями для дополнительной демонстрации толерантности, такие как адаптивный перенос Т-клеток 0Т-Е подобные исследованиям, подробно описанным в примере 3. Для демонстрации иммунной толерантности в мышиных моделях аутоиммуннитета или деиммунизации терапевтических молекул можно создавать аналогичные конструкты на основе РЕО с 8 ветвями для соответствующих антигенов, как было описано в данном документе для ЗПОТРКЬ (8ЕЦ ГО N0: 3).
Пример 8. Индукция антиген-специфической иммунной толерантности посредством нековалентного связывания антигена, конъюгированного с аптамером, с эритроцитами.
Можно осуществлять способы с применением других биоаффинных реагентов, отличных от антител, для измерения их способности к индукции иммунной толерантности посредством нековалентного связывания с эритроцитами. Другие белковые аффинные фрагменты, такие как сконструированные белки с анкириновыми повторами (ПАРРт) (8!етет, Роггее е! а1., 2008), сконструированные белки с повторами ;·ιηη;·ιάί11ο (Раттедд1ат, РеИатт е! а1., 2008), домены фибронектина (Наске1, КарПа, е! а1., 2008) и аффинные каркасные структуры типа цистиновых узлов (ноттинов) (8ί1\Όπη;·ιη, Ьсут, е! а1., 2009), подвергали скринингу для выявления тех, которые проявляли аффинность связывания с эритроцитами.
Скрининг библиотек для обнаружения аптамеров ДНК/РНК, обладающих высокой аффинностью к эритроцитам, проводят с помощью общепризнанного способа систематической эволюции лигандов экспоненциальным обогащением (8ЕЬЕХ) (АтсИет1х, Кембридж, Массачусетс, США) (8атр8οη, 2003). С момента обнаружения новых последовательностей ДНК/РНК, которые связываются с эритроцитами с высокой аффинностью, их синтезируют химическим путем содержащими дополнительную химическую реакционноспособную группу на 3'- или 5'-конце для конъюгации с антигеном и/или полимерной мицеллой/наночастицей. Для создания одного биоконъюгата, содержащего связывающийся с эритроцитами
- 39 028087 аптамер и антиген или комплекс антиген-наночастица, аптамер, синтезированный химическим путем, содержит, например, реакционноспособную группу ΝΗ2, которую конъюгируют посредством стратегии конъюгации посредством ЕЭС.'^НЗ с группами СООН, присутствующими в наночастице или антигене или комплексе наночастица-антиген. Испытывали различные методики химической конъюгации путем изменения ортогональных реакционноспособных групп и схем конъюгации для каждого из аптамера, антигена и/или комплекса антиген-наночастица.
Для демонстрации индукции толерантности к ΟνΑ конъюгат ΟνΑ-аптамер или конъюгат 0νΑнаночастица-аптамер вводят мышам внутривенным или внесосудистым путем. Через заранее определенное число дней после введения мышей умерщвляют, а лимфатические узлы, селезенку и кровь собирают для анализа. Спленоциты и клетки, полученные из лимфатических узлов, высевают и повторно стимулируют в течение 3 дней ех утуо с помощью ΟνΑ и/или пептида ЗПОТЕКЬ (ЗЕЦ ГО N0: 3), и посредством ЕЫЗА у них измеряют снижение экспрессии ГРЖ, [Ь-17а, ГО-2 и ГО-4 и повышение экспрессии ТСР-β 1, которые являются достоверными признаками толерантности. Внутриклеточное окрашивание ГО-17а, [Ь-2 и ГО-4 выполняют с помощью проточной цитометрии на спленоцитах и клетках, полученных из лимфатических узлов, спустя 6 ч после повторной стимуляции ех νί\Ό с помощью ΟVΑ и/или пептида ЗРГОРЕКЬ (ЗЕЦ ГО N0: 3). Также проточную цитометрию применяют для характеристики профилей экспрессии СГО4, СГО8 и регуляторных Т-клеток из клеток, выделенных из лимфатических узлов, селезенки и крови. Дополнительно, у мышей берут образцы крови в различные моменты времени для измерения гуморального ответа на антиген ΟVΑ с выработкой антител. Для определения того, является ли системная толерантность установившейся, выполняют другой эксперимент повторной стимуляции ех νί\Ό. Мышам вводят конъюгат ΟVΑ-антитело или конъюгат ΟVΑ-антитело-наночастица, как описано ранее, ΟVΑ повторно вводят спустя 9 дней с адъювантом (липополисахаридом, полным адъювантом Фрейнда, квасцами и др.), и реактивность спленоцитов в отношении антигена ΟVΑ оценивают посредством ЕЫЗА и/или проточной цитометрии, как описано ранее. Предполагается, что составы на основе конъюгата ΟVΑантитело и/или конъюгата ΟVΑ-антитело-наночастица сделают спленоциты нереактивными в отношении второй активации с помощью ΟVΑ и адъюванта, что демонстрирует, таким образом, эффективное установление системной толерантности. После начального введения составов на основе конъюгата ΟVΑаптамер и/или конъюгата ΟVΑ-аптамер-наночастица можно проводить подобные эксперименты по активации ш утуо с трансгенными клеточными линиями для демонстрации толерантности, такие как адаптивный перенос Т-клеток 0Т4, подобные исследованиям, подробно описанным в примере 3. Для демонстрации иммунной толерантности в мышиных моделях аутоиммунитета или деиммунизации терапевтических молекул создают аналогичные конструкты на основе аптамеров для соответствующих антигенов, как было описано в данном документе для ΟVΑ.
Пример 9. Характеристика связывания с эритроцитами человека.
Для характеристики выбранных пептидов из бактериального дисплея, которые связывались с эритроцитами человека в условиях отсутствия представления клетками, пептиды синтезировали химическим путем и конъюгировали с флуоресцентным белком аллофикоцианином (АРС). Подобным образом характеризовали способность к связыванию с эритроцитами каждого пептида в растворимой форме, т.е. в виде белкового конъюгата. Как показано на фиг. 6, пептиды ΕРΥ64, ΕРΥ123 и ΕРΥ141 связывались с эритроцитами человека в виде конъюгатов с АРС.
Способ конъюгации АРС с пептидами.
Пептиды заказывали и синтезировали под заказ посредством стандартного твердофазного синтеза по ί-тос-стратегии в Ро1урерйбе Сгоир (Страсбург, Франция). 10 эквивалентов пептида, растворенного в 3 М гуанидине-НС1 добавляли к 2 мг/мл АРС, активированного малеимидом (ЧппоуаВюзаепсез, Кэмбридж, Великобритания) в РВЗ. После 4 ч инкубации при температуре 4°С реакционную смесь обессоливали колонке для обессоливания 2ЕВА на 2 мл (Тйегто Зшепййс) и хранили при температуре 4°С.
Количественное определение связывания с эритроцитами посредством способа проточной цитометрии.
Свежевыделенную кровь человека разводили в 100 раз в РВЗ с добавлением 20 мг/мл ВЗА. 5х105 эритроцитов добавляли к 150 мкл 1 мкМ конъюгата АРС-пептид и инкубировали при температуре 37°С в течение 45 мин. Клетки тщательно отмывали в РВЗ + 20 мг/мл ВЗА и анализировали для выявления флуоресценции АРС на проточном цитометре СуАп АЭР (Весктап СоиЙет).
Пример 10. Индукция антиген-специфической иммунной толерантности посредством связывания антигена, гибридизированного с одноцепочечным антителом, с эритроцитами.
Была создана рекомбинантная гибридная молекула на основе зсРу и ЗПОТЕКЬ, иммунодоминантного домена ΟVΑ, презентируемого МНС-Р Полученный зсРу (называемый в данном документе ТΕР119-ЗIINΡΕК^) связывался с эритроцитами мыши, как показано с помощью проточной цитометрии на фиг. 7.
Поскольку в данном документе уже было показано, что эту толерантность индуцировал ΕРΥ1ΟVΑ, он считается пригодной системой для характеристики иммунных событий. Было установлено, что связывание эритроцита с ΕРΥ1-ΟVΑ приводило к эффективной перекрестной презентации иммунодо- 40 028087 минантного эпитопа ΟνΑ (δΠNРΈΚ^), презентируемого МНС Ι, с помощью антигенпрезентирующих клеток (АРС) и соответствующему примированию реактивных Т-клеток перекрестно-реагирующим антигеном. ΕΌ8' Т-клетки ΟΤ-Ι (СЭ45.2'), меченные СРδΕ, адаптивно переносили мышам СЭ45.Е, и затем измеряли пролиферацию СЭ8' Т-клеток ΟΝ в течение 5 дней после внутривенного введения 10 мкг ΟνΑ, 10 мкг ΕΚΥ1-ΟνΑ, эквимолярной дозы ΤΕК119-δIINΡΈΚ^ или эквимолярной дозы δΙΙΝΡΕΙ<Υ. Пролиферация ΕΌ8' Т-клеток ΟΝ, определенная по разбавлению флуоресцентного средства СРδΕ, измеренному с помощью проточной цитометрии, значительно усиливалась у мышей, которым вводили ΤΕК119-δIINΡΕΚ^. по сравнению с теми, кому вводили ΕΚΥ1-ΟνΑ или ΟνΑ (фиг. 8), что указывало на то, что связывание с эритроцитами повышало примирование антиген-специфических СЭ8' Т-клеток перекрестно-реагирующим антигеном по сравнению с растворимым антигеном δΙΙΝΡΕΙ<Ν
Для разграничения между Т-клетками, разведенными до функционального эффекторного фенотипа, и разведенными и подвергнутыми делеции Т-клетками анализировали пролиферирующие СЭ8' Т-клетки СТ-Ι на связывание с аннексином ν как отличительный признак апоптоза, а значит, и делеции, а также маркер истощения и запрограммированной гибели-1 (ΡΌ-1). ΤΕК119-δIINΡΕΚ^ и ΕΚΥ1-ΟνΑ индуцировали пролиферацию гораздо большего количества аннексии-У и ΡΌ-1+ СЭ8' Т-клеток ΟΝΙ, чем ΟνΑ (фиг. 9).
С помощью достоверной модели стимуляции ΟΤ-I с выработкой толерантности (Ьш, Цоба, е! а1., 2002) была показана способность ΤΕК119-δIINΡΕΚ^ и ΕΚΥ1-ΟνΑ к предупреждению последующих иммунных ответов на опосредованную вакциной антигенную стимуляцию, даже если в стимуляции участвует очень сильный адъювант бактериального происхождения. С целью толеризации мышам ΕΌ45.Ε внутривенно вводили 10 мкг ΟνΑ или ΕΚΥ1-ΟνΑ или эквимолярную дозу ΕΚ119-δΙΙΝΡΕΙ<Ε спустя 1 и 6 дней после адаптивного переноса ΕΌ8' Т-клеток ΟΝΙ. Спустя 9 дополнительных дней, необходимых для обеспечения возможной делеции перенесенных Т-клеток, мышей-реципиентов подвергали стимуляции с помощью внутрикожной инъекции ΟνΑ, вводимого с липополисахаридом (ΕΡδ) в качестве адъюванта. Характеристика клеток дренирующих лимфатических узлов и селезенки, а также их воспалительные ответы спустя 4 дня после стимуляции позволили провести определение в отношении того, имела ли место деления на самом деле или нет.
Внутривенное введение ΤΕК119-δIΕNΡΈΚ^ или ΕΚΥ1-ΟνΑ приводило к выраженному сокращению популяций ΕΌ8' Т-клеток ΟΝΙ в дренирующих лимфатических узлах и селезенке по сравнению с мышами, которым вводили немодифицированный ΟνΑ перед антигенной стимуляцией с ΌΡδ, что указывает на делеционную толерантность. Дренирующие лимфатические узлы мышей, обработанных ΕΚΥ1-ΟνΑ, содержали более чем в 11 раз меньше СЭ8' Т-клеток ΟΤ-I по сравнению с таковыми у мышей, обработанных ΟνΑ, и в 39 раз меньше, чем у мышей из контрольной группы стимуляции, которые не получали внутривенные инъекции антигена; ответы клеток селезенки были сходными. Дренирующие лимфатические узлы мышей, обработанных ΤΕК119-δIINРΕΚ^. содержали более чем в 13 раз меньше СЭ8' Т-клеток ΟΤ-I по сравнению с таковыми у мышей, обработанных ΟνΑ, и более чем в 42 раза меньше, чем у мышей из контрольной группы стимуляции, которые не получали внутривенные инъекции антигена; ответы клеток селезенки были сходными. Эта эффективная клональная деления, проявляемая у мышей, которым вводили ΤΕК119-δIINΡΕΚ^ или ΕΚΥ1-ΟνΑ, подтвердила более ранние наблюдения усиленного примирования СЭ8' Т-клеток ΟΝΙ перекрестно-реагирующим антигеном (фиг. 8) и также показала, что примирование перекрестно реагирующим антигеном происходило в отсутствие презентации костимулирующих молекул с помощью АРС для активации делеционной толерантности.
Для дальнейшей оценки иммунного ответа после антигенной стимуляции характеризовали воспалительную природу резидентных клеток лимфатических узлов и селезенки с помощью экспрессии интерферона γ (ΙΡΝγ) СЭ8' Т-клетками ΟΤ-I (фиг. 10). После стимуляции с помощью ΟνΑ и ΕΡδ лимфатические узлы мышей, ранее обработанных ΕΚΥ1-ΟνΑ, содержали в 10 раз меньше клеток, экспрессирующих ΙΡΝγ по сравнению с таковыми у мышей из контрольной группы стимуляции (ранее не получавших антиген) и более чем в 4 раза меньше клеток, экспрессирующих ΙΡΝγ по сравнению с таковыми у мышей, ранее обработанных эквивалентной дозой ΟνΑ. После стимуляции с помощью ΟνΑ и ΕΡδ лимфатические узлы мышей, ранее обработанных ΤΕК119-δIINΡΈΚ^, содержали в 33 раза меньше клеток, экспрессирующих ΙΡΝγ по сравнению с таковыми у мышей из контрольной группы стимуляции (ранее не получавших антиген) и более чем в 14 раз меньше клеток, экспрессирующих ΙΡΝγ по сравнению с таковыми у мышей, ранее обработанных эквивалентной дозой ΟνΑ, что показывает важность связывания с эритроцитами в толерогенной защите в ответ на стимуляцию; ответы клеток селезенки были сходными.
Способы применения животных.
Все процедуры с животными ранее были одобрены ветеринарными учреждениями Швейцарии. Мышей линии С57БЕ/6-Тд(ТсгаТсгЬ) 1100М_)Ь (ОТ-Ι) Цасккоп ЕаЬк) разводили в условиях вивария ΕΡΡΕ, и самок в возрасте 6-12 недель использовали для выделения спленоцитов. Самок мышей линии Β6.δ1ΕΡίρ^саΡеρсЬ/Βοу (СЭ45.1) (СЬаг1ек Ктуег) в возрасте 8-12 недель применяли в качестве носителейреципиентов для адаптивного переноса СЭ8' Т-клеток ΟΤ-I и исследований по индукции толерантности.
- 41 028087
Способы разработки и синтеза пептидов.
Пептид ΕΚΥ1 (11А'-\У\1\4.Р\У1.РОТ1.1)ООЛОСКО-СС)М Μ (δΡ(') II) ΝΟ: 128) синтезировали с помощью Γ-тос-стратегии стандартного твердофазного синтеза на смоле ТОК (Nονа Вюсйет) в автоматизированной системе регулируемой подачи жидкостей (Сйетзрееб). Подчеркнутой последовательностью является последовательность ΕΚΥ1 из 12 мономеров, ранее описанная с помощью фагового дисплея как участок связывания с гликофорином А мыши (Коп!оз апб НиЬЬе11, 2010). Область ООЛО выполняла роль линкера для цистеинового остатка, применяемого для конъюгации; фланкирующий аргининовый остаток способствовал понижению рКа и, таким образом, увеличению реакционной способности цистеинового остатка (Ьи!о1Г, ТиеШ, е! а1., 2001). Пептид отделяли от смолы в течение 3 ч в растворе 95% трифторуксусной кислоты, 2,5% этандитиола, 2,5% воды и осаждали в охлажденном на льду диэтиловом эфире. Очистку проводили в системе для препаративной ВЭЖХ-МС (\а!егз) с помощью колонки с обращенной фазой С18 (Ретзрес!Ке Вюзуз!етз).
Способы конъюгации ΕΚΥ1 и антигена.
молярных эквивалентов сукцинимидил-4-Щ-малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилата (ЛМСС, ΟΑδ № 64987-85-5, Тйегто Лшепййс), растворенного в диметилформамиде, вводили в реакцию с 5 мг/мл ΟνΑ, не содержащим эндотоксинов (<1 МЕ/мг) (Нуд1оз ОтЬН), в РВЛ в течение 1 ч при комнатной температуре. После обессоливания на спин-колонке для обессоливания ΖΕВΑ на 2 мл (Тйегто 8аеп!тйс) добавляли 10 эквивалентов пептида ΕΚΥ1, растворенного в 3 М гуанидине-НС1, и предоставляли возможность протекания реакции в течение 2 ч при комнатной температуре. Конъюгат обессоливали с помощью спин-колонки для обессоливания ΖΕВΑ на 2 мл, 0,2 мкл фильтровали в стерильных условиях, распределяли в рабочие аликвоты и хранили при температуре -20°С. Концентрацию белка определяли с помощью ВСА-анализа (Тйегто 8с1еп!тйс). Реализация этой схемы приводила к конъюгации боковой цепи цистеина пептида с боковыми цепями лизина антигена.
Способы адаптивного переноса Т-клеток.
СЭ8+ Т-клетки из селезенок мышей ΟΠ (СО45.2+) выделяли с помощью набора магнитных гранул для отрицательной селекции СЭ8 (МП!епу1 Вю!ес) согласно инструкциям изготовителя. Свежевыделенные СЭ8' клетки ΟΠ ресуспендировали в РВЛ и метили 1 мкМ карбоксифлуоресцинсукцинимидиловым эфиром (ΟΡδΕ, Iην^!^οдеη) в течение 6 мин при комнатной температуре, а реакционную смесь гасили в течение 1 мин равным объемом РМЭМ с 10% РВЛ (ОЛсо). Перед инъекцией клетки отмывали, подсчитывали и ресуспендировали в чистой РМЭМ. 3х106 СЭ8+ клеток ΟΠ, меченных ΘΡδΕ, инъецировали внутривенно в хвостовую вену мышей-реципиентов СЭ45.1'. Для кратковременных исследований пролиферации 10 мкг ΕΚΥ1-ΟνΑ или ΟνΑ или эквимолярную дозу ТΕК119-δIINΡΕΚ^ в объеме 100 мкл инъецировали спустя 24 ч после адаптивного переноса. Спленоциты собирали спустя 5 дней после введения антигена и окрашивали для анализа с помощью проточной цитометрии.
Способы применения модели толерантности и стимуляции ΟТ-I.
3х105 СЭ8+ Т-клеток ΟΠ, меченных ΘΡδΕ, инъецировали мышам-реципиентам СЭ45.1', как описано ранее. Спустя 1 и 6 дней после адаптивного переноса мышам внутривенно вводили 10 мкг ΕΚΥ1ΟνΑ или ΟνΑ или эквимолярную дозу ТΕК119-δIINΡΕΚ^ в 100 мкл физиологического раствора в хвостовую вену. Спустя 15 дней после адаптивного переноса мышей подвергали стимуляции с помощью 5 мкг ΟνΑ и 25 нг ультрачистого ЬРЛ Εзсйе^^сй^а сой Опур'оОеп) путем внутрикожного введения 25 мкл в подушечки обеих задних лап (способ Носк, общая доза 10 мкг ΟνΑ и 50 нг ЬРЛ). Мышей умерщвляли через 4 дня после активации, и клетки селезенки и дренирующих лимфатических узлов выделяли для повторной стимуляции. Для анализа внутриклеточного цитокинеза с помощью проточной цитометрии клетки повторно стимулировали в присутствии 1 мг/мл ΟνΑ или 1 мкг/мл пептида δΠΝΡΕΚΡ (Оепзспр!) в течение 3 ч. Добавляли брефелдин Α (Л1дта, 5 мкг/мл), и повторную стимуляцию продолжали в течение дополнительных 3 ч перед окрашиванием и анализом с помощью проточной цитометрии.
Антитела и способы проточной цитометрии.
Для проточной цитометрии применяли следующие антитела к антигенам мыши: Растйс В1ие к СО16, РегСР-Су5.5 к СО3е, ΡΕ-Су7 к СЭ8а, РасШс В1ие к СО45.2, конъюгированное с АРС к ΞΕΝγ, ЛРСеР780 к СЭ8а (все от еВюзшепсе), в дополнение к красителю для фиксации живых/мертвых клеток Оп\а!годеп) и набору для мечения аннексинаА-С.’у5 (ВюГзюп). Образцы анализировали на проточном цитометре СуΑη Л^Ρ (Весктап Сои1!ег). Сначала клетки отмывали с помощью РВЛ, окрашивали в течение 20 мин на льду красителем для живых/мертвых клеток, блокировали в течение 20 мин на льду в гибридомной среде 24О2, подвергали поверхностному окрашиванию в течение 20 мин на льду, фиксировали в 2% параформальдегиде в течение 20 мин на льду, подвергали внутриклеточному окрашиванию в присутствии 0,5% сапонина в течение 45 мин на льду с последующей заключительной отмывкой перед анализом. Для окрашивания апоптических клеток за 5 мин до анализа добавляли аннексииА-Су5.
Пример 11. Формирование антиген-специфической иммунной толерантности к терапевтическим белкам посредством молекулы-гибрида, содержащей связывающийся с эритроцитами пептид и конъюгированный антиген.
Вариант аспарагиназы, связывающийся с эритроцитом (ΕКΥ1-ΑδNазе), создавали с помощью
- 42 028087 конъюгации с пептидом ЕКУ1 мыши, специфичным для эритроцитов (Койок апб НиЬЬе11, 2010). Для определения иммуногенности аспарагиназы, связывающейся с эритроцитами, по сравнению с аспарагиназой дикого типа было проведено исследование для оценки двух режимов, а именно применение режима с 2 дозами и 6 дозами конъюгата ЕКУ (ЕКУ1-АЗЫаке) или нативной формы (аспарагиназа медак, Мебас СтЬН; которую также применяли в качестве исходного материала для создания конъюгата ЕКУ1АЗЫаке). В каждом режиме 15 мкг ЕКУ1-АЗЫаке или АЗЫаке вводили внутривенно каждые 2 дня, и кровь забирали каждые 7 дней.
После воздействия терапевтических доз измеряли титры антител в различные моменты времени вплоть до 21 дня после заключительной инъекции. Результат явно указывал на значительное снижение иммуногенности в процессе конъюгации эритроцитов при полном отсутствии антител, наблюдаемых в сериях в режиме с 2 дозами и в режиме с 6 дозами (фиг. 11). В отличие от этого, нативная аспарагиназа дикого типа (применяемая в настоящее время в клинической практике в препарате аспарагиназа медак) индуцировала выраженный иммунитет даже после прохождения режима с 2 дозами.
Для определения того, индуцировала ли связывающаяся с эритроцитами аспарагиназа истинную иммунную толерантность к аспарагиназе дикого типа, было проведено профилактическое исследование. Мышей, которым ранее вводили аспарагиназу дикого типа для клинического применения, подвергали стимуляции с помощью дополнительной дозы после начала выработки гуморального иммунитета. После повторного введения белка уровни антител повышались или оставались высокими; это характерно для опасной клинической ситуации гиперчувствительности и шоковых реакций по отношению к терапевтическому средству. Мыши, ранее обработанные аспарагиназой, конъюгированной с ЕКУ1, не смогли индуцировать эффективный ответ с выработкой антител даже после шести стимуляций аспарагиназой дикого типа. Мыши, подвергнутые толеризации аспарагиназой, связывающейся с эритроцитами, вырабатывали в среднем примерно в 6000 раз меньше антител к аспарагиназе дикого типа для клинического применения.
Способ конъюгации ЕКУ1 и АЗЫаке.
молярных эквивалентов сукцинимидил-4-(Ы-малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилата (ЗМСС, САЗ № 64987-85-5, ТЬегто ЗсчепЬПс), растворенного в диметилформамиде, вводили в реакцию с 5 мг/мл аспарагиназой медак в РВЗ в течение 2 ч при комнатной температуре. После обессоливания на спин-колонке для обессоливания 2ЕВА на 2 мл (ТЬегто ЗсчепЬПс) добавляли 2,5 эквивалента пептида ЕКУ1, растворенного в 3 М гуанидине-НС1, и предоставляли возможность протекания реакции в течение 2 ч при комнатной температуре. Конъюгат обессоливали с помощью спин-колонки для обессоливания 2ЕВА на 2 мл, 0,2 мкл фильтровали в стерильных условиях, распределяли в рабочие аликвоты и хранили при температуре -20°С. Концентрацию белка определяли с помощью ВСА-анализа (ТЬегто ЗсчепрПс). Реализация этой схемы приводила к конъюгации боковой цепи цистеина пептида с боковыми цепями лизина белка.
Способ определения связывания с помощью проточной цитометрии.
Свежевыделенную кровь человека разбавляли в 100 раз в РВЗ с добавлением 20 мг/мл ВЗА. К 100 нМ аспарагиназы добавляли примерно 500000 эритроцитов и инкубировали при 37°С в течение 1 ч. После отмывания клетки инкубировали с антителами козы к аспарагиназе (АЬпоуа) в течение 30 мин на льду. После второго цикла отмывания клетки инкубировали с антителом к фС козы, конъюгированным с Л^ЕXЛР^υОК488 ОпуНгодеп), в течение 20 мин на льду. После заключительного отмывания клетки анализировали на проточном цитометре для выявления аспарагиназы, связанной с эритроцитами.
Способ введения аспарагиназы.
Желаемые дозы ЕКУ1-АЗЫаке или АЗЫаке получали в стерильном 0,9% физиологическом растворе, и 100 мкл раствора инъецировали в хвостовую вену подвергнутых анестезии мышей линии С57ВЬ/6. Кровь забирали в предварительно определенные моменты времени через прокол щеки или надрезы на хвосте.
Способ определения антител к аспарагиназе в сыворотке.
Сыворотку, взятую в экспериментальных группах, подвергали последовательному разведению в РВЗ и инкубировали в течение 2 ч при КТ в планшетах для ЕЫЗА, покрытых АЗЫаке. В качестве детекторного антитела применяли антитело к фС мыши, конъюгированное с НКР (ЗойЬет ВюЧесй).
Пример 12. Иммунная реверсия для формирования толерантности после иммунной реакции.
В клинической практике в случае, если у пациента уже индуцирован иммунитет (подтвержденный присутствием антител к лекарственному средству) к терапевтическому белку или к белку, представляющему интерес, желательной является реверсия иммунного ответа на лекарственное средство с обеспечением, таким образом, возможность дальнейшего применения терапевтического средства. Также клинически доступный микробный фермент аспарагиназу применяли в этом примере для демонстрации индукции толерантности к терапевтическому белку у мышей с предсуществующим иммунитетом к аспарагиназе. Вариант аспарагиназы, связывающийся с эритроцитами (ЕКУ1-АЗЫаке), создавали с помощью конъюгации с пептидом ЕКУ 1 мыши, специфичным для эритроцитов.
Для определения того, могла ли связывающаяся с эритроцитами аспарагиназа вызвать реверсию иммунного ответа на аспарагиназу для клинического применения, было проведено перекрестное иссле- 43 028087 дование. Мышам внутривенно вводили несколько доз аспарагиназы дикого типа с интервалами в два дня. Спустя 21 день после введения в сыворотке выявляли высокие уровни антител к аспарагиназе. Затем иммунизированных мышей подвергали терапевтической обработке связывающейся с эритроцитами аспарагиназой в режимах с различными дозами. В обоих режимах дозирования аспарагиназа, конъюгированная с ΕКΥ, снижала уровни антител примерно в 10 раз, таким образом, вызывая реверсию предсуществующего гуморального иммунитета.
Способ конъюгации ΕКΥ1 и А8№§е.
молярных эквивалентов сукцинимидил-4-(№малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилата (8МСС, СА8 № 64987-85-5, Τйе^тο Зшепййс), растворенного в диметилформамиде, вводили в реакцию с 5 мг/мл аспарагиназой медак в РВ8 в течение 2 ч при комнатной температуре. После обессоливания на спин-колонке для обессоливания ΖΕВΑ на 2 мл (Ίΐ^ο Зшепййс) добавляли 2,5 эквивалента пептида ΕКΥ1, растворенного в 3 М гуанидине-НС1, и предоставляли возможность протекания реакции в течение 2 ч при комнатной температуре. Конъюгат обессоливали с помощью спин-колонки для обессоливания ΖΕВΑ на 2 мл, 0,2 мкл фильтровали в стерильных условиях, распределяли в рабочие аликвоты и хранили при температуре -20°С. Концентрацию белка определяли с помощью ВСА-анализа 8с1епййс).
Реализация этой схемы приводила к конъюгации боковой цепи цистеина пептида с боковыми цепями лизина белка.
Способ определения связывания с помощью проточной цитометрии.
Свежевыделенную кровь человека разбавляли в 100 раз в РВ8 с добавлением 20 мг/мл В8А. К 100 нМ аспарагиназы добавляли примерно 500000 эритроцитов и инкубировали при 37°С в течение 1 ч. После отмывания клетки инкубировали с антителами козы к аспарагиназе (ΑЬηοуа) в течение 30 мин на льду. После второго цикла отмывания клетки инкубировали с антителом к Ι§Ο козы, конъюгированным с АЬЕХАЕйиОК488 (Iηу^к^οдеη), в течение 20 мин на льду. После заключительного отмывания клетки анализировали на проточном цитометре для выявления аспарагиназы, связанной с эритроцитами.
Способ введения аспарагиназы.
Желаемые дозы ΕКΥ1-ΑδNаδе или ΑδNаδе получали в стерильном 0,9% физиологическом растворе, и 100 мкл раствора инъецировали в хвостовую вену подвергнутых анестезии мышей линии С57ВЙ/6. Кровь забирали в предварительно определенные моменты времени через прокол щеки или надрезы на хвосте.
Способ определения антител к аспарагиназе в сыворотке.
Сыворотку, взятую в экспериментальных группах, подвергали последовательному разведению в ΡВδ и инкубировали в течение 2 ч при КТ в планшетах для ЕЬША, покрытых ΑδNаδе. В качестве детекторного антитела применяли антитело к Ι§Ο мыши, конъюгированное с НКР (δοιιΐΗΕτη Вюкесй).
Пример 13. Разработка антител и фрагментов антител, которые связываются с эритроцитами мыши и/или человека.
Было создано несколько конструктов на основе связывающихся с эритроцитами антигенов. Они включают таковые, относящиеся к белковому уровню: ТЕКП^ПОТЕКЬ, ТЕК119-СйгА и ТЕК119проинсулин. Также они включают таковые, относящиеся к генетическому уровню: ТЕК119^П№ЕКЙ, ТЕК119-СйгА, ТЕК119-проинсулин, ТЕК119-уриказу, ТЕК119-1п8В9-23, ТЕК119Ιδ(Ρ\\Α 1ААНА14\ЕА(. ПК ^ЕО ΙΌ ^: 80), ТЕК119-Н-2кЬ, ТЕК119-Н-2кб, 10Е7^ПОТЕКЬ, 10Е7-СйгА, 10Е7-проинсулин и 10Е7-уриказу.
Способы.
мРНК из гибридомного клона ТЕК-119 получали в подарок от проф. δίοζο Ιζυΐ из Университета Женевы, Швейцария. Для создания комплементарной ДНК (кДНК) клона выполняли стандартную ПЦР с обратной транскриптазой (ОТ-ПЦР) с помощью системы синтеза первой цепи δυΡΕКδСКIΡΤ ΙΙΙ (ΙηνίΚοдеп). Затем проводили ПЦР с помощью следующего набора праймеров для специфической амплификации последовательностей ДНК, соответствующих вариабельным участкам тяжелой ^Н) и легкой (νΕ) цепи антитела.
Название праймера Последовательность праймера (от 5’к 3’) 8РС ГО ΝΟ
УЬ-РОК1 АОС ССС ССА ТСС ССС ΑΥΑ ТСС АСС ТСА СТС АСС С 8РС ГО N0:81
УЬ-РОК2 АСС ССС ССА ТСС ССС ΑΥΑ ТТС ТТС ТСА ССС АСТ С 8РС ГО N0:82
УЬ-РОКЗ АСС ССС ССА ТСС ССС ΑΥΑ ТТС ТСМ ТМА СТС АСТ С 8РС ГО N0:83
УЬ-РОК4 АСС ССС ССА ТСС ССС ΑΥΑ ТТС ΤΟΥ ТКА САС АСТ С 8РС ГО N0:84
- 44 028087
УЬ-РОК5 АОС ССС ССА ТСС ССС ΑΥΑ ТТС ТКА ТСА СМС АСТ С δ1±) ГО N0:85
УЬ-РОКб АСС ССС ССА ТСС ССС ΑΥΑ ТТМ АСА ТКА МСС АСТ С δ1±) ГО N0:86
УБ-РОК7 АСС ССС ССА ТСС ССС ΑΥΑ ТТС АСА ТСА УГ)С АСТ С δ1±) ГО N0:87
УБ-РОК8 АСС ССС ССА ТСС ССС ΑΥΑ ТУС АСА ТСА САС АСА С δ1±) ГО N0:88
УБ-РОК9 АСС ССС ССА ТСС ССС ΑΥΑ ТТС ТТС ТСА \УСС АСТ С δ1±) ГО N0:89
УЬ-РОКЮ АСС ССС ССА ТСС ССС ΑΥΑ ТТС ХУСС? ΤδΑ ССС ААТ С δ1±) ГО N0:90
УЬ-РОКП АСС ССС ССА ТСС ССС ΑΥΑ ΤΤδ ТКА ТСА ССС АКТ С δ1±) ГО N0:91
УБ-РОК12 АСС ССС ССА ТСС ССС ΑΥΚ ТТК ТСА ТСА ССС АКА С δ1±) ГО N0:92
УБ-РОК13 АСС ССС ССА ТСС ССС ΑΥΑ ТТС ТСА ТСА СВ С АСК С δ1±) ГО N0:93
УБ-РОК14 АСС ССС ССА ТСС ССС ΑΥΑ ТТС ТСА ТАА СУС АСС А δ1±) ГО N0:94
УБ-РОК15 АСС ССС ССА ТСС ССС ΑΥΑ ТТС ТСА ТСА ССС ЛС\У Т δ1±) ГО N0:95
УБ-РОК16 АСС ССС ССА ТСС ССС ΑΥΑ ТТС ТСА ТСА САС ААС С δ1±) ГО N0:96
УБ-РОК17 АСС ССС ССА ТСС ССС ΑΥΑ ТТТ ТСС ТСА СТС АСТ С δ1±) ГО N0:97
УБ-РОК18 АСС ССС ССА ТСС ССС АКС СТС ТТС ТСА СТС АСС ААТ С δ1±) ГО N0:98
УЬ-КРУ1 САТ ССТ ССС ССС ССА СТА ССТ ТТС АТТ ТСС АСС ТТС С δ1±) ГО N0:99
УЬ-КЕУ2 САТ ССТ ССС ССС ССА СТА ССТ ТТТ АТТ ТСС АСС ТТС С δΡΟ ГО N0:100
VI.-КРУЗ САТ ССТ ССС ССС ССА СТА ССТ ТТТ АТТ ТСС ААС ТТТ С δΡΟ ГО N0:101
УЬ-КЕУ4 САТ ССТ ССС ССС ССА СТА ССТ ТТС АСС ТСС АСС ТТС С δΡΟ ГО N0:102
VI.-КРУ? САТ ССТ ССС ССС ССА СТА ССТ АСС АСА СТС АСТ ТТС С δΡΟ ГО N0:103
- 45 028087
УР-КЕУ6 ОАТ СОТ ОСО ОСС ОСА ОТА ССТ АОО АСА ОТО АСС ТТО О 8ЕЦ ГО N0:104
УН-РОК1 ОТТ АТТ ОСТ АОС ООС ТСА ОСС ООС ААТ ООС ОСА КОТ КМА ОСТ ТСА ОСА ОТС 5ЕЦ ГО N0:105
УН-РОК2 ОТТ АТТ ОСТ АОС ООС ТСА ОСС ООС ААТ ООС ОСА СОТ ВСА ОСТ ВСА ОСА ОТС 8ЕЦ ГО N0:106
УН-РОКЗ ОТТ АТТ ОСТ АОС ООС ТСА ОСС ООС ААТ ООС ОСА СОТ ОСА ОСТ ОАА О5А 8ТС 8ЕЦ ГО N0:107
УН-РОК4 ОТТ АТТ ОСТ АОС ССС ТСА ОСС ССС ААТ ООС ОСА СОТ ССА КСТ ОСА АСА КТС 8ЕЦ ГО N0:108
УН-РОК5 ОТТ АТТ ОСТ АОС ООС ТСА ОСС ООС ААТ ООС ОСА СОТ УСА ОСТ ВСА ОСА КТС 5ЕЦ ГО N0:109
УН-РОК6 ОТТ АТТ ОСТ АОС ООС ТСА ОСС ООС ААТ ООС ОСА СОТ УСА КСТ ОСА ОСА ОТС 8ЕЦ ГО N0:110
УН-РОК7 ОТТ АТТ ОСТ АОС ООС ТСА ОСС ООС ААТ ООС ОСА ООТ ССА СОТ ОАА ОСА ОТС 8ЕЦ ГО N0:111
УН-РОК8 ОТТ АТТ ОСТ АОС ООС ТСА ОСС ООС ААТ ООС ОСА ООТ ОАА 88Т ООТ ОСА АТС 8ЕЦ ГО N0:112
УН-РОК9 ОТТ АТТ ОСТ АОС ООС ТСА ОСС ООС ААТ ООС ОСА УОТ ΟΛΑ ΟΥΤ ООТ ОСА ОТС 8ЕЦ ГО N0:113
УН-РОКЮ ОТТ АТТ ОСТ АОС ООС ТСА ОСС ООС ААТ ООС ОСА ООТ ОСА О5К ООТ ОСА ОТС 8ЕЦ ГО N0:114
УН-РОК11 ОТТ АТТ ОСТ АОС ООС ТСА ОСС ООС ААТ ООС ОСА КОТ ОСА МСТ ООТ ОСА ОТС 8ЕЦ ГО N0:115
УН-РОК12 ОТТ АТТ ОСТ АОС ООС ТСА ОСС ООС ААТ ООС ОСА ООТ ОАА ОСТ ОАТ ОСА КТС 8ЕЦ ГО N0:116
УН-РОК13 ОТТ АТТ ОСТ АОС ООС ТСА ОСС ООС ААТ ООС ОСА ООТ ОСА КСТ ТОТ ТОА ОТС 5ЕЦ ГО N0:117
УН-РОК14 ОТТ АТТ ОСТ АОС ООС ТСА ОСС ООС ААТ ООС ОСА КОТ КАА ОСТ ТСТ СОА ОТС 8ЕЦ ГО N0:118
УН-РОК15 ОТТ АТТ ОСТ АОС ООС ТСА ОСС ООС ААТ ООС ОСА АОТ ОАА К8Т ТОА ОСА ОТС 8ЕЦ ГО N0:119
УН-РОК16 ОТТ АТТ ОСТ АОС ООС ТСА ОСС ООС ААТ ООС ОСА ООТ ТАС ТСТ КАА ЛОА ОТ8 ТО 8ЕЦ ГО N0:120
УН-РОК17 ОТТ АТТ ОСТ АОС ООС ТСА ОСС ООС ААТ ООС ОСА ООТ ССА АСТ УСА ОСА КСС 8ЕЦ ГО N0:121
УН-РОК18 ОТТ АТТ ОСТ АОС ООС ТСА ОСС ООС ААТ ООС ОСА ТОТ ОАА СТТ ОСА АОТ ОТС 8ЕЦ ГО N0:122
УН-РОК19 ОТТ АТТ ОСТ АОС ООС ТСА ОСС ООС ААТ ООС ОСА ООТ ОАА ООТ САТ СОА ОТС 8ЕЦ ГО N0:123
УН-КЕУ1 ССС ТТО ААО СТТ ОСТ ОАО ОАА АСО ОТО АСС ОТО ОТ 8ЕЦ ГО N0:124
УН-КЕУ2 ССС ТТО ААО СТТ ОСТ ОАО ОАО АСТ ОТО АСА ОТО ОТ 8ЕЦ ГО N0:125
УН-КРУЗ ССС ТТО ААО СТТ ОСТ ОСА ОАО АСА ОТО АСС АСА ОТ 8ЕЦ ГО N0:126
УН-КЕУ4 ССС ТТО ААО СТТ ОСТ ОАО ОАО АСО ОТО АСТ ОАО ОТ 8ЕЦ ГО N0:127
Затем амплифицированные гены Vн и Ук расщепляли с помощью рестрикционных эндонуклеаз (№οΣ и для V^, Ше4 и НтбШ для VН), фрагменты гена очищали после электрофореза в агарозном геле с помощью стандартного набора (Ζутο Не^еагсН, Ориндж, Калифорния, США) и лигировали в клонирующую плазмиду ρΜΑΖ360. Затем клонирующую плазмиду секвенировали для определения последовательности ДНК генов VН и У2 ТЕК119.
ДНК-конструкты, соответствующие конъюгатам ТЕК119-антиген и 10Р7-антиген, разрабатывали и
- 46 028087 синтезировали коммерческим путем и получали из ^NΛ2.0 (Менло-Парк, Калифорния, США).
Каждый полностью сформированный ген 5сРу расщепляли с помощью ЗШ и ΧΡοΙ (№О, Ипсуич, Массачусетс, США) и лигировали в те же самые сайты в плазмиде для экспрессии у млекопитающих рЗесТадА Диуйгодеи, Карлсбад, Калифорния, США).
Пример 14. Индукция толерантности к диабетогенным антигенам с помощью связывающихся с эритроцитами антигенов диабета.
Пептидный мимотоп хромогранина А (обозначаемый 1040-р31 или 0йгА) сконструировали связывающимся с эритроцитами мыши путем рекомбинантной гибридизации пептида с 8сРу ТЕК119, специфичным для эритроцитов. Полученный 5сРу, обозначаемый в данном документе ТЕК119-0йгА, прочно связывался с эритроцитами мыши (данные не показаны). Для изучения поведения Т-клеток по отношению к вариантам антигена хромогранина А применяли трансгенную мышь линии NО^В^С2.5, которая содержит специфические Т-клетки для распознавания антигена хромогранина А. Для определения того, подвергался ли процессингу и был ли представлен ТЕК119-0йгА молекулами главного комплекса гистосовместимости ΙΙ класса (ΜΗС-II) в достаточной степени для примирования Т-клеток 6002.5, антиген добавляли в систему совместной культуры дендритных клеток селезенки ВО02.5 и 004+ Т-клеток. Как показано на фиг. 12, ТЕК119-0йгА подвергался эффективному процессингу, и соответствующий антигенный домен был представлен молекулами ΜΗС-II для примирования антиген-специфической пролиферации трансгенных 004+ Т-клеток ВО02.5 ίη уйго, которая является необходимой для формирования толерантности Т-клеток ίη У1уо.
Для определения последствий связывания эритроцитов с аутоантигеном при пролиферации 004+ клеток ίη У1уо проводили аналогичное исследование пролиферации с применением 004+ Т-клеток В00'2.5, меченных флуоресцентной молекулой 0РЗЕ. После адаптивного переноса меченых 004+ Тклеток ВО02.5 мышам NО^, ранее не использовавшимся в подобном исследовании, внутривенно вводили 10 мкг ТЕК119-0йгА или эквимолярную дозу свободного растворимого пептида 1040-р31. Как показано на фиг. 13, мыши, обработанные ТЕК119-0йгА, содержали гораздо меньше непролиферирующих 004+ Т-клеток ВО02.5 в лимфатических узлах селезенки и поджелудочной железы (рй-Ν) по сравнению с мышами, обработанными растворимым пептидом 1040-р31. Эти данные показывают, что связывающийся с эритроцитами антиген активирует эффективные антиген-специфическую передачу сигналов 004+ Т-клеткам и их примирование способом, функционально отличающимся от такового в случае растворимого антигена, подобным описанному авторами изобретения во всесторонних исследованиях делеционной толерантности 008+ Т-клеток. Такое выраженное системное (селезенка) и локальное (лимфатический узел поджелудочной железы) уменьшение количества диабетогенных Т-клеток является четким положительным свидетельством благоприятного результата контроля начала заболевания.
Пример 15. Индукция толерантности к инсулину.
Как уже показано в данном документе (например, см. пример 14), толерантность можно сформировать по отношению к различным антигенам. В данном примере описывается, как можно сформировать толерантность к инсулину. Для индукции толерантности к инсулину, который является другим антигеном островковых клеток, распознаваемым диабетогенными Т-клетками, инсулин сконструировали связывающимся с эритроцитами мыши путем рекомбинантной гибридизации с 8сРу ТЕК119, специфичным для эритроцитов мыши. Полученный 5сРу, обозначаемый в данном документе как ТЕК119-проинсулин, применяли в традиционной мышиной модели спонтанного начала Т1Й, а именно на мышах NО^/Зй^^ΐ. Мышей NО^/Зй^^ΐ спонтанно подвергали опосредованному клетками иммунной системы разрушению инсулинпродуцирующей ткани поджелудочной железы, индуцируя, таким образом, гипергликемию и начало клинических проявлений заболевания. Аналогично, для формирования толерантности к инсулину у людей можно применять инсулин человека и факторы, связывающиеся с эритроцитами человека.
Для демонстрации толерантности в этой устойчивой мышиной модели спонтанного аутоиммунного заболевания молодым мышам (в возрасте ~3 недель) необходимо вводить ТЕК119-проинсулин в различные временные интервалы и в различных дозах с целью функциональной инактивации и/или делеции инсулин-реактивных Т-клеток. Для оценки гипергликемии и начала клинических проявлений заболевания контролируют уровни глюкозы у обработанных мышей. ТЕК119-проинсулин также применяют в терапевтическом режиме с целью индукции ремиссии заболевания. В таком исследовании ТЕК119проинсулин вводят мышам с впервые выявленной гипергликемией в различных дозах и при различных временных интервалах, и уровни глюкозы контролируют для оценки снижения интенсивности гипергликемии и восстановления гомеостаза, что демонстрирует, таким образом, ремиссию начальных клинических проявлений ТШ.
Пример 16. Формирование толерантности к клеточным имплантатам и трансплантатам с помощью связывающихся с эритроцитами молекул ΜΗС.
В качестве примера предложен способ формирования толерантности к имплантатам. Разработаны молекулы ΜΗС, связывающиеся с эритроцитами, путем химической конъюгации пептидов, связывающихся с эритроцитами, с растворимыми доменами ΜΗС. Альтернативно, молекула ΜΗС может экспрессироваться рекомбинантным путем в виде гибрида с 8сРу, специфичным для эритроцитов.
Для демонстрации толерантности к молекулам ΜΗС путем связывания с эритроцитами проводят
- 47 028087 исследования на мышиных моделях клеточных имплантатов, таких как опухолевые имплантаты, кожные имплантаты, трансплантаты островковых клеток и трансплантаты гемопоэтических клеток. В каждом исследовании мышь-носителя подвергают толеризации к молекулам класса МНС донора путем введения молекул МНС, связывающихся с эритроцитами, до или во время процедуры имплантации. Приживление имплантата контролируют с помощью способов, пригодных для каждого исследования; т.е. измерения роста опухоли в опухолевых имплантатах, контроля некроза или роста тканей в кожном трансплантате, контроля массы островковых клеток и гликемии в трансплантатах островковых клеток и характеристики химеризма в трансплантатах гемопоэтических клеток.
Дополнительное раскрытие
Вариантом осуществления является способ выработки иммунотолерантности, при этом способ включает введение композиции, содержащей гибридную молекулу, которая содержит толерогенный антиген и связывающийся с эритроцитами фрагмент, который специфически связывается с эритроцитами пациента и соединяется, таким образом, с антигеном эритроцита, где гибридная молекула вводится в количестве, эффективном для выработки иммунотолерантности к веществу, которое содержит толерогенный антиген. Вариантом осуществления является способ, в котором гибридная молекула содержит по меньшей мере один связывающийся с эритроцитами фрагмент, непосредственно ковалентно связанный с антигеном: например, гибридный белок, содержащий этот фрагмент и антиген. Вариантом осуществления является способ, где гибридная молекула содержит по меньшей мере один связывающийся с эритроцитами фрагмент, присоединенный к частице, которая присоединена к антигену или содержит его, например, где частица выбрана из группы, включающей микрочастицу, наночастицу, липосому, полимерсому и мицеллу. Вариантом осуществления является случай, в котором толерогенный антиген содержит часть терапевтического белка, например белок содержит фактор νΜ или фактор IX. Вариантом осуществления является случай, в котором толерогенный антиген содержит часть белка, отличного от белка человека. Вариантом осуществления является случай, в котором белок включает в себя аденозиндезаминазу, Ь-аспарагиназу, расбуриказу, антитимоцитарный глобулин, Ь-аргиназу и Ь-метионазу. Вариантом осуществления является способ, в котором пациентом является человек, а толерогенный антиген содержит часть белка, не встречающегося в природе. Вариантом осуществления является случай, в котором пациентом является человек, а толерогенный антиген содержит гликан белка, имеющего гликозилирование, отличное от гликозилирования у человека. Вариантом осуществления является случай, в котором толерогенный антиген содержит по меньшей мере часть трансплантационного антигена человека. Вариантом осуществления является случай, в котором толерогенный антиген содержит часть белка, характерного для аутоиммунного заболевания человека, например, выбранного из группы, включающей препроинсулин, проинсулин, инсулин, ОАЭ65, ОАЭ67, !А-2, !Λ-2β, тиреоглобулин, тиреоидную пероксидазу, рецептор тиреотропина, основной белок миелина, миелиновый олигодендроцитарный гликопротеин, протеолипидный белок, коллаген II, коллаген Ж, ацетилхолиновый рецептор, матриксный металлопротеин 1 и 3, белок теплового шока 47 типа молекулярного шаперона, фибриллин-1, α-рецептор РЭОР, βрецептор Р1)СР и ядерный белок ЗЗ-А. Вариантом осуществления является случай, в котором толерогенный антиген представляет собой часть пищи человека, например, выбран из группы, включающей конарахин (Ага й 1), аллерген II (Ага й 2), арахисовый агглютинин (Ага й 6); α-лактальбумин (АГА), лактотрансферрин, глютенин, низкомолекулярный глютенин, α- и γ-глиадин, гордеин, секалин и авенин. Вариантом осуществления является случай, в котором связывающийся с эритроцитами фрагмент выбран из группы, включающей пептидный лиганд, антитело, фрагмент антитела и одноцепочечный антигенсвязывающий домен (зсРу). Вариантом осуществления является случай, в котором связывающийся с эритроцитами фрагмент включает в себя антитело, фрагмент антитела или зсРу, полученные из гибридомы, которая вырабатывает антитело к эритроциту, при этом гибридома выбрана из группы, включающей
ВМС 4, ВМС 5, ВМС 6, ВМС
10, ВМС 14, ВМС 18, ВМС 39, ВМС 66, ВМС 68, ВМС 69, ВМС 87, ВМС 108,
ВМС 110, ВМС 111, ВМС 125, ВМС 126, ВМС 128, ВМС 145, ВМС 155, ВМС 157, ВМС 163, ВМС 170, ВМС 198, ВМС 203, ВМС 216, ВМС 220, ВМС 221,
ВМС 222, ВМС 229, ВМС 230, ВМС 231, ВМС 235, ВМС 256, ВКАС 17, ВКАС 18, ВСЮ. 1, ВСМ. 2, ВСЮ. 11, ВСЮ. 100, ΒΚΛΙ) 3, ΒΙΚΜΑ ϋ6, ΒΙΚΜΑ ϋΐο,
ΒΙΚΜΑ КЗ, ΒΙΚΜΑ КЗ, 84В; 6Α7; СОЕ или ΚΖ1.
Вариантом осуществления является случай, в котором связывающийся с эритроцитами фрагмент специфически связывается с биомолекулой, выбранной из группы, включающей белок полосы 3 (СЭ233), аквапорин-1, О1и1-1, антиген Κίάά, РйАд/Рй50 (СП241), Рй (СП240), РЙ30СЕ (СЭ240СЕ), Рй30Э ΑΏ240ό), Кх, гликофорин А, гликофорин В (СЭ235Ь), гликофорин С (СЭ235с), гликофорин О (СО235б), Ке11 (СП238), I )иПу/1 Ί (СП234), СР1 (СП35), ЭАР (СП55), глобозид, СП44, (САМ-4 (СЭ242), Ьи/В-САМ (СП239), ΧΘ1/ΧΘ2 (СП99), ЕММРРШ/нейротелин (СШ47), 1МН, гликозилтрансферазу, Саг1^г1§й1, ЭотЬгоск, С4А/САВ, Зшаппа, МЕР2, стоматин, ВА-1 (СЭ24), (ΐΐ^ν (СЭ36), СЭ108, СЭ139 и антиген Н (СЭ173). Толерогенный антиген может содержать мимотоп. Вариантом осуществле- 48 028087 ния является случай, в котором 8сΕν включает в себя некоторую часть или весь 10Ε7, например, один или несколько фрагментов легкой цепи 10Ε7 и/или тяжелой цепи 10Ε7 и/или вариант легкой цепи 10Ε7 и/или тяжелой цепи 10Ε7 с более высокой аффинностью. Вариантом осуществления является способ, в котором связывающийся с эритроцитами фрагмент включает в себя пептидный лиганд, содержащий по меньшей мере 5 последовательных аминокислотных остатков последовательности, выбранной из группы, включающей XX ΙΌ N0: 11, XX ΙΌ N0: 13, XX ΙΌ N0: 14, ХП ΙΌ N0: 15, XX ΙΌ N0: 16, XX ΙΌ N0: 17, ВЕС) ΙΌ N0: 1 и их консервативные замены, где указанная последовательность специфически связывается с эритроцитом.
Вариантом осуществления является композиция, содержащая гибридную молекулу, которая содержит толерогенный антиген и связывающийся с эритроцитами фрагмент, который специфически связывается с эритроцитом пациента и, таким образом, связывает антиген с эритроцитом. Примером является случай, в котором связывающийся с эритроцитами фрагмент ковалентно связывается с антигеном. Другим примером является случай, в котором гибридная молекула содержит связывающийся с эритроцитами фрагмент, прикрепленный к частице, которая прикреплена к антигену, например, к микрочастице, наночастице, липосоме, полимерсоме или мицелле. Примерами толерогенного антигена являются: часть терапевтического белка, часть белка, отличного от белка человека, часть белка, в естественных условиях не встречающегося у человека (включая полную часть, т.е. весь белок), гликан белка, имеющего гликозилирование, отличное от гликозилирования у человека, часть аутоиммунного антигена человека, часть пищи человека. Вариантом осуществления является композиция, в которой связывающийся с эритроцитами фрагмент выбран из группы, включающей пептидный лиганд, антитело, фрагмент антитела и одноцепочечный антигенсвязывающий домен ^Εν), например, весь 10Ε7 или его часть. Связывающийся с эритроцитами фрагмент может включать в себя пептидный лиганд, содержащий по меньшей мере 5 последовательных аминокислотных остатков последовательности, выбранной из группы, включающей ВЕС) ΙΌ N0: 11, ВЕХ ΙΌ N0: 13, ВЕХ ΙΌ N0: 14, ВЕХ ΙΌ N0: 15, ВЕХ ΙΌ N0: 16, ВЕХ ΙΌ N0: 17, ВЕХ ΙΌ N0: 1 и их консервативные замены, где указанная последовательность специфически связывается с эритроцитом. Связывающийся с эритроцитами фрагмент может включать в себя пептидный лиганд, который имеет константу диссоциации от приблизительно 10 мкМ до 0,1 нМ, определенную с помощью измерений равновесного связывания между пептидом и эритроцитами. Вариантом осуществления является случай, в котором связывающийся с эритроцитами фрагмент включает в себя антитело, фрагмент антитела или 8сΕν, полученные из гибридомы, которая вырабатывает антитело к эритроциту, при этом гибридома выбрана из группы, включающей
ВМС 4, ВМС 5, ВМС 6, ВМС 10, ВМС 14, ВМС 18, ВМС 39, ВМС 66, ВМС 68, ВМС 69, ВМС 87, ВМС 108, ВМС 110, ВМС 111, ВМС 125, ВМС 126,
ВМС 128, ВМС 145, ВМС 155, ВМС 157, ВМС 163, ВМС 170, ВМС 198, ВМС 203, ВМС 216, ВМС 220, ВМС 221, ВМС 222, ВМС 229, ВМС 230, ВМС 231,
ВМС 235, ВМС 256, ВКАС 17, ВКАС 18, ВСЕХ 1, ВСЕХ 2, ВСЕХ 11, ВСЕХ 100, В ΚΑΏ 3, ΒΙΚΜΑ ϋ6, ΒΙΚΜΑ ϋΙΟ, ΒΙΚΜΑ КЗ, ΒΙΚΜΑ КЗ, 84В; 6А7; СОЕ или ΚΖ1.
Вариантом осуществления является случай, при котором связывающийся с эритроцитами фрагмент специфически связывается с биомолекулой, выбранной из группы, включающей белок полосы 3 (СБ233), аквапорин-1, О1и1-1, антиген Κΐάά, КЬАд/Кк50 (СО241), КЬ (СО240), Кк30СЕ (СО240СЕ), Кк30Б (СП240Б), Кх, гликофорин А, гликофорин В (СБ235Ь), гликофорин С (СБ235с), гликофорин Ό (СБ235Ь), Ке11 (СО238), Ои££у/ОАКС1 (СО234), СК1 (СЭ35), ΕΜΕ (СЭ55), глобозид, СО44, ГСАМ-4 (СБ242), Ьи/В-САМ (СО239), ХО1/ХО2 (СП99), ЕММРКШ/нейротелин (СО147), ХНЕ гликозилтрансферазу, ΟιιΧνπμΙΧ ^οтЬ^οск, С4А/САВ, ЗПаппа, МЕК2, стоматин, ВА-1 (СБ24), ОРГУ (СБ36), СБ108, СЕ)139 и антиген Н (СБ173). Толерогенный антиген может содержать мимотоп.
Толерогенные композиции можно применять для лечения патологического состояния, например патологического состояния, выбранного из группы, включающей отторжение трансплантата, аутоиммунное заболевание, пищевую аллергию и иммунный ответ на терапевтическое средство.
Вариантом осуществления является фармацевтически приемлемая композиция для применения при иммунной реверсии иммунного ответа на вещество, содержащее молекулу-гибрид, которая содержит связывающийся с эритроцитами фрагмент и антиген вещества. Композиция может содержать толерогенный антиген, выбранный, например, из группы, включающей белок, часть белка, белок человека или его часть, белок, отличный от белка человека, или его часть, гликан, гликан белка, имеющего гликозилирование, отличное от гликозилирования у человека, аутоиммунный антиген человека, белок, являющийся терапевтическим для человека, или его часть и часть пищи человека. Композиция может содержать толерогенный антиген, выбранный, например, из группы, включающей белки, для которых характерна недостаточность в связи с генетическим заболеванием, белки с гликозилированием, отличным от гликозилирования у человека, белки, отличные от белков человека, синтетические белки, в естественных условиях
- 49 028087 не встречающиеся у людей, антигены пищи человека, трансплантационные антигены человека и аутоиммунные антигены человека. Можно предложить связывающийся с эритроцитами фрагмент, который специфически связывается с биомолекулой, выбранной из группы, включающей белок полосы 3 (СО233), аквапорин-1, О1и!-1, антиген Είάά, КИАд/КЬ50 (СЭ241), НИ (СО240), КИ30СЕ (СО240СЕ), ΚΙι30Ι) (СО240О), Кх, гликофорин А, гликофорин В (СО235Ь), гликофорин С (СО235с), гликофорин Ό (СО235Й), Ке11 (СО238), ОийуГОАКа (СО234), СК1 (СЭ35), ЭАР (СЭ55), глобозид, СО44, ЮАМ-4 (СО242), Еи/В-САМ (СО239), ХО1/ХО2 (СЭ99), ЕММРКШ/нейротелин (СЭ147), 1МН, гликозилтрансферазу, Саг1\упд1и, ^οтЬ^οск, С4А/САВ, 8с^аηηа, МЕК2, стоматин, ВА-1 (СЭ24), СРГУ (СЭ36), СО108, СО139 и антиген Н (С1Х173). Связывающийся с эритроцитами фрагмент можно выбрать из группы, включающей пептидный лиганд, антитело, фрагмент антитела и одноцепочечный антигенсвязывающий домен (зсРу). Связывающийся с эритроцитами фрагмент можно получить так, чтобы он содержал антитело, фрагмент антитела или зсРу, полученные из гибридомы, которая вырабатывает антитело к эритроциту, при этом гибридома выбрана из группы, включающей
ВМС 4, ВМС 5, ВМС 6, ВМС 10, ВМС 14, ВМС 18, ВМС 39, ВМС 66, ВМС 68, ВМС 69, ВМС 87, ВМС 108, ВМС 110, ВМС 111, ВМС 125, ВМС 126,
ВМС 128, ВМС 145, ВМС 155, ВМС 157, ВМС 163, ВМС 170, ВМС 198, ВМС 203, ВМС 216, ВМС 220, ВМС 221, ВМС 222, ВМС 229, ВМС 230, ВМС 231,
ВМС 235, ВМС 256, ВКАС 17, ВКАС 19, ВСК1. 1, ВСК1. 2, ВСК1. 11, ВСМ.
100, ΒΚΛΙ) 3, ΒΙΚΜΑ ϋ6, ΒΙΚΜΑ ϋ10, ΒΙΚΜΑ КЗ, ΒΙΚΜΑ КЗ, 84В; 6А7; СОЕ или ΚΖ1.
Варианты осуществления включают молекулу-гибрид, содержащую связывающийся с эритроцитами фрагмент и антиген аспарагиназы. Как видно из многочисленных раскрытий связывающихся с эритроцитами фрагментов, существует множество их возможных вариантов, в том числе зсРу, который связывается с эритроцитом человека, или пептидный связывающий лиганд, выбранные из группы, включающей 8ΙΧ,) ГО N0: 11, 8Ер ГО N0: 12, 8ЕН ГО N0: 13, 8ЕН ГО N0: 14, 8Ер ГО N0: 15, 8ЕН ГО N0: 16, 81X) ГО N0: 17 и их консервативные замены, где указанная последовательность специфически связывается с эритроцитом. Такую композицию, содержащую молекулу-гибрид, можно применять для индукции толерантности к аспарагиназе.
Варианты осуществления включают молекулу-гибрид, содержащую связывающийся с эритроцитами фрагмент и антиген хромогранина А. Антиген может являться мимотопом или некоторой частью молекулы хромогранина А или всей таковой. Как видно из многочисленных раскрытий связывающихся с эритроцитами фрагментов, существует множество их возможных вариантов, в том числе зсРу, который связывается с эритроцитом человека, или пептидный связывающий лиганд, выбранные из группы, включающей 81X.) ГО N0: 11, 8Ер ГО N0: 12, 8ЕН ГО N0: 13, 8ЕН ГО N0: 14, 8Ер ГО N0: 15, 8ЕН ГО N0: 16, 81X) ГО N0: 17 и их консервативные замены, где указанная последовательность специфически связывается с эритроцитом. Такую композицию, содержащую молекулу-гибрид, можно применять для индукции толерантности к хромогранину А и/или для предупреждения сахарного диабета или снижения темпов прогрессировать заболевания, являющегося сахарным диабетом.
Другим примером является композиция, содержащая связывающийся с эритроцитами фрагмент, который специфически связывается с эритроцитом, соединенный с частицей, выбранной из группы, состоящей из синтетического полимера, разветвленного синтетического полимера и частицы. Частица может быть, например, микрочастицей, наночастицей, липосомой, полимерсомой и мицеллой. Композиция может дополнительно содержать толерогенный антиген, терапевтическое средство или лиганд, наводящийся на опухоль.
Вариантом осуществления является одноцепочечный антигенсвязывающий домен (зсРу), содержащий пептидный лиганд, который специфически связывается с эритроцитом. Пептид можно присоединять к зсРу или располагать в линкерной части. Можно включать один или несколько пептидных лигандов.
Все заявки на патенты, патенты и публикации, упомянутые в данном документе, настоящим включены в данный документ посредством ссылки для всех целей; в случае конфликта контрольным документом является настоящее описание.
- 50 028087
Список литературы
1. Ра§и1 С & Уегопезе РМ (2009) РЕО соп)и§а1е§ ϊη сНтса1 беуе1ортеп1 ог изе аз апйсапсег адеШз: ап ονεΓνϊβνν. Α6ν ϋηι§ ϋεΐίν Εεν 6 1(13):1177-1188.
2. ПзЬЪигп Οδ (2008) ТЬе рЬагтасо1оду οί РЕСу1айоп: Ьа1апст§ Ρϋ χνίΐΐι ΡΚ ίο §епега1е ηονεΙ Шегареийсз. 1 РЬагт δει 97(10):4167-4183.
3. Оао ЗУ, Пи ЗУ, Маскау ΙΑ, 2а1и1§ку МЕ, Тоопе Е1, & СЬбкой А (2009) 1п зЬи §Γ0\νΐΚ οί а зЮсЬютейпс РЕС-Нке соп)и§а1е а1 а ргсбет'з ЬПегттиз \νΐΐΗ 81§тйсапЙу шгргоуеб рЬагтасоктейсз. Ргос ИаЙ Асаб δει υδΑ 106(36): 1523115236.
4. Ниапд Ь, СоидЬ РС, & ϋείεΐΐρρΐδ МЕ (2009) СЬагасШпгайоп οί ро1у(е1Ьу1епед1усо1) апб РЕОу1а1еб ргобис18 Ьу ЕС/Μδ \νΐΦ ро81со1итп аббЫоп о£ аттез. Апа1 СЬет 81(2):567-577.
5. Вабоп Р, Ра11егот А, 8сКаГГег С А, 8репсе СЕ, Рипд ЗУ1, РоПег ΙΕ, ЕЬгЬсЬ СК, Рап ЗУ, Хи ΖΧ, Μο6ί МЗУ, Рапб А, ВеПЬо1б ЗУ, & Огауез М (2001) Еайопа1 без1дп о£ а ροϊεηί, 1опд-1азбпд ίοπη οί т1ег1егоп: а 40 кОа ЬгапсЬеб ро1уе1Ьу1епе §1усо1-соп|'ида1еб т1ег!егоп а1рЬа-2а 1ог 1Ье 1геа1теп1 οί Ьераййз С. Вюсоп|'и§ СЬет 12(2): 195-202.
6. ОЬа11шп С, Еозз А, Ееибю1б ЬА, Розег δ, Озе11 В, Ми11ег Р, & δεηη Н (2005) δίπιοίιιπιΐ апб ЪюрЬуз1са1 сЬагасШпгайоп οί 1Ье 40 кОа РЕС-т1ег1егоп-а1рЬа2а апб Ьз тб1У1биа1 розШопа11зотегз. Вюсофид СЬет 16(3):504-517.
7. ϋεηηίδ М (2002) А1Ъитт Βίη6ίη§ аз а Сепега1 81га1еду 1ог 1тргоутд 1Ье РЬагтасоктебсз οί Рго1етз. 1оигпа1 οί Вю1од1са1 СЬегшзйу 277(38):35035-35043.
8. ЗУа1кег А, Оип1еуу С, Еусгой ϋ, Тор1еу Р, НоЬ Ы, НегЬеП Т, Оау1ез М, Соок Р, Но1тез δ, 1езрегз Б, & Нетпд С (2010) Апй-зегит а1Ъитт ботат апйЪоб1ез ϊη 1Ье беуе1ортеп1 οί Ь1§Ыу ροϊεηί, еГйсасюиз апб 1опд-асйпд т1ег!егоп. Рго1ет Епдтеейпд Оез1дп апб 8е1есйоп.
9. На11 δδ, Мйгадо1й δ, & ОаидЬейу Ρδ (2007) Иепййсайоп οί рерйбе Ьдапбз Гасбйабпд папорагйс1е айасЬтеп! 1о егу1Ьгосу1ез. Вю1есЬпо1 Ргод 23(3):749-754.
10. Собзе! ЕМ, ЗУапд К, 8сЬобт ВА, ίεοη ϊδ, МШег δϋ, & Епдтап ΏΜ (2001) Ргеуепйоп οί аиЮттипе туосагбШз ШгоидЬ 1Ье тбисйоп οί апйдеп-зресШс рейрЬега1 шшшпе 1о1егапсе. СйсШайоп 103(12): 1709-1714.
11. Еио X, Робюуеп КЕ, МсСайЬу ϋ, ОеСи1ез М, Магйп А, Сейз ϋΕ, Х1а С, Не 1, гЬапд X, Каийпап ΏΒ, & МШег δϋ (2008) ЕСОЕйхеб а11одепе1с 8р1епосу1е8 тбисе бопог-зресШс 1о1егапсе 1ог 1опд-1егт зигу1уа1 οί ϊδίεί 1гап8р1ап18 У1а ί\νο б18йпс1 тесЬатзтз. Ргос Νηίΐ Асаб δει υδΑ 105(38):14527-14532.
12. Рйе ВТ, Си1ейа I, СиЬЬе1з Вирр М, Еадаг Т, Тапд Ц, Воиг-Пгбап Н, Уадйа Н, Агиша М, 8ауедЬ МН, & В1ие81опе 1А (2006) ИзиЬп-тбисеб гегтззюп ϊη пе\уопзе! ΝΟϋ гшсе ϊδ тат1атеб Ьу Ше Ρϋ-Ι-ΡΟ-Ы рабжау. 1 Ехр Меб
- 51 028087
203(12):2737-2747.
13. МШег δϋ, Тиг1еу ϋΜ, & Рос1ор1 Ж (2007) Апй£еп-8ресШс 1о1егапсе 81га1е§1е§ Гог 1Ье ргеуепОоп апс11геа1теп1 о£ аи!о1ттипе сИзеазе. ΝβΙ Кеу 1ттипо1 7(9):665-677.
14. Ма1иссю МА, Соуеу АМ, Рога! ЬВ, ЗсЬиЬеП 1, В году ЬА, 8о£ос1еоиз СТ, Сетуй тап ΟΙ, 1агпа§т ЗУ, Оетайео К, В1ит§ай ЬН, Ροη£ Υ, & Вгохуп КТ (2008) Тгапзса1Ье1ег айейа1 етЬоНгайоп χνίΐΓι оп1у райЮез Гог 1Ье 1геа1теп1 о£ ипгезес!аЫе Ьера1осе11и1аг сагстота. 1 Уазе 1п1егу Каско! 19(6):862-869.
15. Сас1а1е!а СО & Катей О (2010) Тгапз-айейа1 сЬетоетЬоНгайоп аз а Шегару Гог Нуег Штоигз: Νεχν сИтса1 с1еуе1ортеп18 апс1 зи££ез1юпз Гог сотЫпайоп χνϊΐΗ ап£Ю£епез1з тЫЪйогз. Сй1 Кеу Опсо1 Нета1о1.
16. Ниап£ X, Мо1ета О, Κϊη£ δ, 3¥а1ктз Ь, Εά£Ϊη£ΐοη Τδ, & ТЬогре РЕ (1997) Титог тГагсйоп ϊη гтсе Ьу апйЬойу-ййес1ей 1аг£ейп£ оГ йззие Гас1ог 1о 1итог уазси1а!иге. δοϊεηοε 275(5299):547-550.
17. δΗβΓκΕιη С (2010) РгезЬ Ггот 1Ье Ыо1о£1с р1ре1те-2009. Иа1 Вю1есЬпо1 28(4):307-310.
18. МаупагО 1 & Оеог£юи О (2000) АпЬЬойу еп£теейп£. Аппиа1 Γβνϊεχν оГ ЪютесЬса1 еп£теейп£ 2:339-376.
19. 3¥е1ззег ΝΕ & На111С (2009) АррНсайопз оГ зт£1е-сЬат уапаЫе Гга£теп1 апйЪосИез ϊη Шегареийсз апй сИа£позНсз. Вю1есЬпо1 Αάν 27(4):502-520.
20. Μθ£ΐώηϊ δΜ & δζεΗεηϊ 1 (2003) ’^1еаЬЬ Нрозотез апй 1οη£ сЬси1аЬп£ папорайЮез: сгШса1 ϊδδιιεδ ϊη рЬагтасоктейсз, орзот/айоп апй рго1ет-Ътйт£ ргорегйез. Рго£ Γύρΐά Кез 42(6):463-478.
21. Уо£1 ΤΙ, Ха£шЬ ΝΝ, ΝοιίΓ-ΕΙύϊη ΝΕ, Као Р, Етагт АН, гап£оз δ, ЫаЫ1 М, & АЬйе1кайег А (2009) Κενϊεχν оп 1гапзайейа1 сЬетоетЬоЬгаЬоп ϊη Ьера1осе11и1аг сагстота: раШайуе, сотЪтей, пеоафиуап!, Ьйй£т£, апй зутр1отайс ЬкЪсаЬопз.
- 52 028087
Еиг 1Кайю172(3):505-516.
22. ЕопзаШ Е, №со1ау Ш, А11отоп1е М, Соуге А, & Маю М (2010) Таг§е1т§ сапсег уазси1а1иге У1а епйо§1т/СОЮ5: а ηονεΙ апйЬойу-Ьазей Й1а§позйс апй Шегареийс §1га1е§у ϊη 5оПй 1итоигз. Сагйюуазс Кез 86(1):12-19.
23. ϋϊεηδΐ А, Сгипоху А, ЕГпгиЬ М, КаЪаизсЬ В, Νογ ΙΕ, Ейез Т\¥, & ΟοΙΙδΙεϊη С (2005) ЗресШс осс1изюп о£ тигте апй Ьитап 1итог уазси1а1иге Ьу УСАМ-11аг§е1ей гесотЫпап! Гизюп ргсаетз. СапсегЗресПит Кпоху1ей§е Епуйоптеп! 97(10):733-747.
24. ВиозННи Е, В Каи а 3Ν, & ЗаПог М1 (2010) Таг§е1т§ о£ йги§8 апй папорагйс1е5 1о 1итог8. 1 Се11 Βΐοΐ 188(6):759-768.
25. ТКрззеп УЬ, Роз1е1 К, Вгапйхуцк Ю, ϋϊη§8 КР, ИезтеЬуа I, 8аи,п 8, УегЬо£81ай Ν, ИакаЬерри Υ, Вайт ЕС, Ваккегз 1, Мауо КН, Ротег Е, & СпП'юеп ААУ (2006) Са1есйп-1 Ϊ8 е88епйа1 ϊη 1итог ап§1о§епе818 апй Ϊ8 а 1аг§е1 Гог апйап§ю§епе818 Шегару. Ргос ИаЙ Асай 8εϊ ЕГ8А 103(43):15975-15980.
26. ЗсЬЬетапп С, КоезЬ С, Катайа Н, Вог§1а В, Еи§тапп Т, К1аррег АУ, & Νεή Ό (2010) Ιη νίνο Ъю1ту1а1юп о£ 1Ье уазси1а!иге ϊη В-се111утрЬота Мепййез В8Т2 аз а 1аг§е1 £ог апйЬойу-Ьазей Йюгару. В1оой 115(3):736-744.
27. Вгаск 88, 8йасс1 М, ВйсЫег Μ, & Νεή ϋ (2006) Титог-1аг§е1т§ ргорегйез οί ηονεί апйЬоШез зресШс 1о 1Ье 1аг§е ϊδοίοπη о£ 1епа8ст-С. С1т Сапсег Рез 12(10):3200-3208.
28. РуЪак 1, Роезй С, Казраг М, УШа А, & Νβή ϋ (2007) ТЬе ех!га-йотат А о£ йЬгопесйп Ϊ8 а уазсикг тагкег о£ зоЬй 1итог8 апй те1а81а8е8. Сапсег Рез 67(22):10948-10957.
29. МоКапйаз N & Сайа§Ьег РС (2008) Рей сей тетЬгапе: раз!, ргезеп!, апй ГиШге. В1оой 112(10):3939-3948.
30. Рюе Л & Оаи§Ьейу Р8 (2008) Ойес1ей еуо1ийоп о£ а Ъйегтта! Ьас1ейа1
- 53 028087 сЙ8р1ау зсаП'оЮ епЬапсез ГЬе Ш§р1ау οί сПуегзе рерЬЬез. Рго1ет Εη§ Лез 3е1 21(7):435-442.
31. Лапе ΚΥ, СЬап ЛА, Кюе Л, & Лаи§ЬегГу РЗ (2006) 18о1аЬоп οί се11 зресШс рерЬЬе П§апс1з ιΐδϊη§ ГЬюгезсепГ ЬасГейа1 сЙ8р1ау ЬЪгайез. 1 1ттипо1 МеГЬоЬз 309(1-2): 120-129.
32. уап с1ег УЬез А1, Ο'ΝεϊΙ СР, Назе§а\уа и, НаттопО Ν, & НиЬЬе111А (2010) ЗупГЬезгз οί руп0у1сПзи1Л<1е-Гипс1юпаП/е<1 папорагЛс1ез Гог соп)и§аГт§ 1Ью1соп1атт§ зта11 то1еси1ез, рерООез, апс1 ргоГетз. Вюсоп]'и§ СЬет 21(4):653-662.
33. Ο'ΝείΙ СР, уап с1ег УНез А1, Уе11иГо Л, \¥апс1геу С, ЛетигГаз Л, ЛиЬосЬеГ 1, & НиЬЬе11 1А (2009) ЕхГгасе11и1аг тайгх ЪтсЬп§ гтхей гтсеПез Гог с1ги§ йейуегу аррЬсайопз. 1 СопГго1 Ке1еазе 137(2): 146-151.
34. Уе11иГо Л, ЛетигГаз Л, & НиЬЬе111А (2008) РЕС-Ь-ΡΡδ сЬЫоск соро1утег ১ге§аГез Гог ЬуОгорЬоЫс с1ги§ 8о1иЪШгайоп апс1 ге1еа8е: сус1о5рогт А аз ап ехатр1е. Мо1 РЬагт 5(4):632-642.
35. КесЮу ЗТ, КеЬог А, ЗсНтоеке1 НС, НиЬЬе11 1А, & 8\уагГг МА (2006) 1п νϊνο Гаг§ейп§ οί йепйпйс сеПз ϊη 1утрЬ пойез \уЬН ро1у(ргору1епези1Лс1е) папорагйСез. 1 СопГго1 Ке1еа5е 112(1):26-34.
36. КесЮу 8Т, уап с1ег УНез А1, Зтеот Е, Ап§еЬ V, Капс1о1рК ΟΙ, Ο'ΝεϊΙ СР, Еее ЬК, 8\уайг МА, & НиЬЬе11 1А (2007) Ехр1оШп§ 1утрЬайс Ггапзрой апс1 сотр1етепГ асйуайоп ϊη папорагйс1е уасстез. ИаГ ΒϊοίεοΗηοΙ 25(10):1159-1164.
37. Κοηίοδ δ & НиЬЬе11 ΙΑ (2010) 1тргоут§ ргоГет рЬагтасоктейсз Ьу еп§теегт§ егуГЬгосуГе аГйпЬу. Мо1. РЬагтасеийсз 7(6):2141-2147.
38. ККапс1е1\уа1 δ & Захепа КК (2006) АззеззтепГ οί 8игу1уа1 οί а§т§ егуГЬгосуГе ϊη спсиЬйюп апс1 айепйапГ сЬап§ез ϊη δϊζε апс1 СЛ147 ехргеззюп Ьу а ηονεΙ йуо зГер Ъюйпу1айоп теГЬоЬ. Ехр СегопГо1 41(9):855-861.
39. Еег§изоп ТА, СЬо! 1, & Сгееп ЛК (2011) АгтеЬ гезропзе: Ьолу с!ут§ сеПз
- 54 028087 тйиепсе Т-се11 Рипсйопз. 1ттипо1 Κεν 241(1):77-88.
40. УатагаИ 8, Бисклак ϋ, НеМкатр ОР, Рюгезе С, Βοηϊίο АР 1паЬа К, Νηδδεηζ\νεϊ§ МС, & 81еттап КМ (2008) СО8+ СО205+ δρίεηϊε άεηάήΐϊε εεΙΙδ аге вреааПгеО ίο ίηάιιεε РохрЗ+ ге§и1а!огу Т εεΙΙδ. 1оигпа1 о Г 1ттипо1о§у (ВаШтоге, Μϋ:1950) 181(10):6923-6933.
41. Ηοΐζ РЕ, Раггеп А, Ρε Сои1еиг ϋθ, Βοννεη ϋθ, & ΒεΠοΙϊηο Р (2010) СО8+ Т се11 1о1егапсе Γο11ο\νίη§ апО§еп гесо§пШоп оп Ьера1осу1ев. 1оигпа1 ок Аи1опптит1у 34(1): 15-22.
42. 1с1Рка\уа 8, МисЫа ϋ, Тугтк АР КгопепЬег§ М, & СКегоиГге Н (2011) НераОс δίεΙΕηε εεΙΙδ ГипсОоп ав ге§и1а!огу Ъув1ап4оге. 1оигпа1 о Г Ш1типо1о§у (ВаШтоге, Μϋ: 1950) 186(10):5549-5555.
43. ΤΗοπίδοη Αλ¥ & Кпо11е РА (2010) АпО§еп-ргевеп1т§ се11 ГипсОоп ϊη Оле 1о1его§етс 1Еег епуЕоптеШ. Иа1 Κεν 1ттипо1 10(11):753-766.
44. ΑΙΡεΠ МР, Ргагсг 8Р, Ρπιηείδεο РМ, ЗаиШг В, Коу Р, δϋνεΓδΙεϊη КЬ, & В1лагс1\уа|' N (1998) 1тта1иге άεηάήΐϊε εεΐΐδ рКа§осуЮвг арорШйс εεΐΐδ У1а а1рЬауЬ81а5 апс1 СО36, апс1 εΓΟδδ- ρτεδεηΐ атщгпз Ιο суЮЮх1с Т 1утр1лосуге8. I Ехр Μεά 188(7):1359-1368.
45. Огеоп ϋΚ, ΡεΓ§ιΐδοη Т, ΖϊΙνο§ε1 Р, & Кгоотог О (2009) 1ттипо§ото ап4 Ιο1εΓθ§εηϊε εεΐΐ ОоаШ. Иа1 Κεν 1ттипо1 9(5):353-363.
46. ΒιίΓδεΙι Ь5, ΚίεΗ ВЕ, & Ηο§ςιιϊδΙ КА (2009) Рап£8гЬапв εεΐΐδ аге по! гецшгеО ког άιε СО8 Т εεΐΐ τεδροηδε Ιο орЮогта1 во1к-апО£опв. 11ттипо1 182(8):4657-4664.
47. Рш К, 1уо4а Т, ЗаШгпив М, Ктига Υ, 1паЬа К, & ЗШттап КМ (2002) 1ттипо Ιοίεπιηεε акгег 4ε 1 Рогу ок 4ут§ εεΐΐδ Ιο άεηάήΐϊε εεΐΐδ ϊη δίΐιι. I Εχρ Μεά 196(8):1091-1097.
48. ОаггаЬ ΡΑ, Ηε§άε δΤ, ΡηίεΙ ϋΤ, РтОвау Κ\¥Β, ΡΚεη Ь, ΚοεάεΓεΓ Μ, & δεάεΓ ΚΑ (2010) ΙΡ-10 ρΓοάηεάοη ОИРггепОаПу ϊηϋηεηεεδ άιε πκΐ£ηίΐιιάε, циаПгу, ап4
- 55 028087 рго!ес1ке сарасду о£ ТЫ гезропзез дерепдтд оп Ше уассте ркаГогт. I Ехр Мед 207(7):1421-1433.
49. Бее Μδ & Κϊπι Υ-1 (2007) 31дпа1тд райжауз до\упз1геат о£ радегпгесодтйоп гесер1ог§ апд Шей сг 1а1к. Ат. Κεν. ВюсЬет. 76:447-480.
50. АгпаЪокй РМ, ВоШ-\УаЬег Е, & Мауег Б (2009) Зирргеззюп о£ ТЫ апд ТЫ7, Ьи1 ηοΐ ТЬ2, гезропзез ϊη а СО8(+) Т сей-тед1а1ед тоде1 о£ ога1 ййегапсе. Мисоза11ттипо1 2(5):427-438.
51. ЗадП-Би Ν, Тоигдо! δ, Ва/аГтдгашда А, Мазсагед Б, Βεηοηί Ν, СЬаЬге Н, Бошзе А, Уап ΟνεΠνεΙί Б, & Мотдеоп Р (2009) Тагдейпд Ше айегдеп ίο ога1 депдййс сейз \νίίΚ тисоадЬезке сЬдозап рагйс1ез епкапсез 1о1егапсе тдисйоп. АПегду 64(7):1003-1013.
52. МиеПег ОБ (2010) МесЬатзтз тапйаттд рейрЬега1 1о1егапсе. Иа1 1ттипо1 11(1):21-27.
53. БиЮЙ МР, ТйеШ Ν, СеггйеШ δ, СауаШ Б, & НиЬЬей 1А (2001) ЗузШтайс тоди1айоп о£ М1сЬае1-1уре геасйуйу о£ Шю1з ШгоидЬ Ше изе о£ сЬагдед атто ас1дз. Вюсощид СЬет 12(6): 1051-1056.
54. 31етег ϋ, Еоггег Р, & Р1искШип А (2008) ЕГЛает зе1есйоп о£ ОАКРтз \νίΐΗ зиЪ-папото1аг аГйпЫез изтд ЗКР рЬаде д1зр1ау. 1оигпа1 о£Мо1еси1аг Вю1оду 382(5):1211-1227.
55. Рагтедд1ат Е, РеЙагт К, Багзеп АР, УагадатзеПу С, Зштрр Μ, ΖεΦε О, СаШзсЬ А, & Р1искШип А (2008) Оез1дпед агтадШо гереа! ргскетз аз депега1 рерйде-Ыпдтд зсаЙЫдз: сопзепзиз дез1дп апд сотри1айопа1 орйпдгайоп о£ Ше ЬудгорЬоЫс соге. 1оигпа1 о£Мо1еси1аг Вю1оду 376(5): 1282-1304.
56. Наске1 В1, Карда А, & \Уд1гир Κϋ (2008) Р1сото1аг аГйпйу йЬгопесйп дотатз епдтеегед ийЬгтд Ιοορ 1епдШ дкегзйу, гесигзке ти1адепез1з, апд Ιοορ зЬиййпд. 1 Μοί Βΐοΐ 381(5): 1238-1252.
- 56 028087
57. δίΐνειτηηη АР, Εενίη АМ, БаИЪ 1Б, & СосЬгап Ж (2009) Еп§теегей сузйпекпо! рерййез Ша1 Ътй а1рЬа(у)Ье!а(3) т1е§гт \уйН апйЬойу-йке айппйез. 1оигпа1 о£ Мо1еси1аг Вю1о§у 385(4):1064-1075.
58. Кее Ге Αϋ, Ра1 δ, & Ε11ϊη§ίοη А (2010) АрГатегз аз Шегареийсз. №ΐ Κεν Бги§ ϋΐδεον 9(7):537-550.
59. Коскеу \УМ, Ниап§ Б, К1оеррт§ КС, ВаитЪоуег N1, С1ап§гапйе РН, & δείηιΐίζ МК (2011) ЪутНезБ апй гаШо1аЬейп§ о£ сИе1а1ог-КЫА арГатег Ыосоп1и§а1е§ \νίΐΗ соррег-64 Гог 1аг§е1ей то1еси1аг 1та§т§. Вюог§ Мей СЬет 19(13):4080-4090.
60. 8ау1а К, Тага1и1а О, ОагЬигепко О, & Мтко Т (2011) Титог 1аг§е1ей сцлаШит йойтист 1 арГатег-йохогиЫст соп|'и§а1е Гог ίπκι§ίη§ апй йеайпепГ о£ сапсег. 1 Сопйо1 Ке1еазе 153(1):16-22.
61. 8атрзоп Т (2003) АрГатегз апй δΕΡΕΧ: Ше ГесЪпо1о§у. ХУойй РаГеп! 1пГогтайоп (25): 123-129.
62. Сейз БК, Сейз МТ, МсСагШу ΏΡ, СЬазйпп ЕМБ, & МШег δϋ (2010). Науе \уе оуегезйтаГей Ше ЪепейГ оГ Нитапйгей) апйЪоШез? тАЪз 2(6):682-694.
63. СЬап АС, Сайег 1 (2010) ТЬегареийс апйЪоШез Гог аийпттипйу апй тйаттайоп. ЫаШге РиЫБНШ§ Огоир 10:301-316.
64. Сейз ΏΚ, Сейз МТ, МсСагШу ΏΡ, СЬазГат ЕМБ, МШег δϋ (2010) Науе ννε оуегезйтаГей Ше ЬепейГ оГ Нитапйгей) апйЪоШез? МАЪз 2:682-694.
65. Лзкоо! XV, уап 8сЫе КМР, СагзГепз МО, 8сЪе11екепз Н (2009) 1ттипо1о§1са1 йзк о£ пуесГаЫе йги§ йейуегу зузГетз. РЪагт Кез 26:1303-1314.
66. \Уап§ 1 е1 а1. (2008) ЫеийаН/Ш§ апйЪосИез ίο Шегареийс епгутез: сопзШегайопз Йог 1езйп§, ргеуепйоп апй йеайпепй Иа1 Вю1есЪпо1 26:901-908.
67. Сайгоп 1Р, Сойп Υ (2001) 8йисй1га1 апй йтсйопа1 Шуегзйу о£ Ъ1оой §гоир апй§епз. ТгапзГиз С1т Βΐοΐ 8:163-199.
- 57 028087
Перечень последовательностей
<110> Эколь Политекник Федераль де Лозан
<120> СВЯЗЫВАЮЩИЕСЯ С ЭРИТРОЦИТАМИ ТЕРАПЕВТИЧЕСКИЕ СРЕДСТВА
<130> 2968.07ВДО02
<150> <151> 13/206034 2011-08-09
<160> 128
<170> Райепй1п версия 3.5
<210> <211> <212> <213> 1 12 БЕЛОК Искусственная последовательность
<220> <223> пептид, связывающийся с эритроцитами
<400> 1
Тгр Мей Ча1 Ьеи Рго Тгр Ьеи Рго С1у ТЬг Ьеи Азр
1 5 10
<210> <211> <212> <213> 2 12 БЕЛОК Искусственная последовательность
<220> <223> контрольный пептид
<400> 2
Рго Ьеи Ьеи ТЪг Уа1 С1у Мей Азр Ьеи Тгр Рго Тгр
1 5 10
<210> <211> <212> <213> 3 8 БЕЛОК Искусственная последовательность
<220> <223> Эпитоп
<400> 3
Зег Не 11е Азп РЪе 61и Ьуз Ьеи 1 5
- 58 028087 <210> 4 <211> 28 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> пептид, связывающийся с эритроцитами <400> 4
С1у С1п Зег С1у 1 С1п 5 Рго Аз η Зег Агд Тгр 10 11е Туг МеЬ Тйг Рго 15 Ьеи
Зег Рго С1у 11е Туг Агд С1у Зег Зег С1у С1у Зег
20 25
<210> 5
<211> 26
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> пептид, ΐ связывающийся [ с эритроцитами
<400> 5
С1у С1п Зег С1у С1п Зег Тгр Зег Агд А1а 11е Ьеи Рго Ьеи РЬе Ьуз
1 5 10 15
11е С1п . Рго Уа1 С1у Зег Зег С1у С1у Зег
20 25
<210> 6
<211> 26
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная : последовательность
<220>
<223> пептид, связывающийся с эритроцитами
<400> 6
С1у С1п ι Зег С1у С1п Туг 11е Суз ТЬг Зег А1а С1у Рйе С1у С1и Туг
1 5 10 15
Суз Рйе 11е Азр С1у Зег Зег С1у С1у Зег 20 25 <210> 7 <211> 26 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность
- 59 028087 <220>
<223> пептид, связывающийся с эритроцитами <400> 7
61у 61п Зег С1у С1п ТЬг Туг РЬе Суз ТЬг 10 Рго ТЬг Ьеи Ьеи С1у С1п 15
1 5
Туг Суз Зег Уа1 С1у Зег Зег С1у С1у Зег
20 25
<210> 8
<211> 22
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> пептид, связывающийся [ с эритроцитами
<400> 8
С1у С1п Зег С1у ΗΪ3 Тгр Нтз Суз С1п С1у Рго РЬе А1а Азп Тгр Уа1
1 5 10 15
С1у Зег Зег С1у С1у Зег
20
<210> 9
<211> 26
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная : последовательность
<220>
<223> пептид, связывающийся [ с эритроцитами
<400> 9
С1у С1п 1 Зег С1у С1п РЬе Суз ТЬг Уа1 Не Туг Аз η ТЬг Туг ТЬг Суз
1 5 10 15
Уа1 Рго Зег Зег С1у Зег Зег С1у С1у Зег 20 25 <210> 10 <211> 26 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> пептид, связывающийся с эритроцитами
- 60 028087 <400> 10
С1у С1п 1 Зег С1у С1п 5 Зег Уа1 Тгр Туг Зег 10 Зег Агд С1у Азп Рго 15 Ьеи
Агд Суз ТЬг С1у С1у Зег Зег С1у С1у Зег
20 25
<210> 11
<211> 17
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> пептид, ί связывающийся с эритроцитами
<400> 11
Рго Азп Зег Агд Тгр Не Туг МеЬ ТЬг Рго Леи Зег Рго С1у 11е Туг
1 5 10 15
Агд
<210> 12
<211> 15
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> пептид, связывающийся с эритроцитами
<400> 12
Зег Тгр Зег Агд А1а 11е Ьеи Рго Ьеи РЬе Ьуз 11е С1п Рго Уа1
1 5 10 15
<210> 13
<211> 15
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> пептид, связывающийся с эритроцитами
<400> 13
Туг 11е Суз ТЬг Зег А1а С1у РЬе С1у С1и Туг Суз РЬе 11е Азр
1 5 10 15
<210> 14 <211> 15
- 61 028087 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220> ,
<223> пептид, связывающийся с эритроцитами
<400> 14
Тйг Туг Рйе Суз Тйг Рго Тйг Ьеи Ьеи С1у С1п Туг Суз Зег Уа1
1 5 10 15
<210> 15
<211> 12
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220> <223> пептид, связывающийся с эритроцитами
<400> 15
ΗΪ3 Тгр ί ΗΪ5 Суз С1п С1у Рго Рйе А1а Азп Тгр Уа1
1 5 10
<210> 16
<211> 15
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220> <223> пептид, связывающийся с эритроцитами
<400> 16
Рйе Суз ί Тйг Уа1 Не Туг Азп Тйг Туг Тйг Суз Уа1 Рго Зег Зег
1 5 10 15
<210> 17
<211> 15
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220> <223> пептид, связывающийся с эритроцитами
<400> 17
Зег Уа1 Тгр Туг Зег Зег Агд С1у Азп Рго Ьеи Агд Суз Тйг С1у
1 5 10 15
<210> 18
<211> 20
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
- 62 028087 <220>
<223> пептидный линкер <400> 18
С1у С1у С1у С1у Зег С1у С1у С1у С1у Зег С1у С1у С1у С1у Зег С1у 15 10 15
С1у С1у С1у Зег 20 <210> 19 <211> 19 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> пептид, связывающийся с эритроцитами <400> 19
Тгр Мер Уа1 Ьеи Рго Тгр Ьеи Рго С1у ТНг Ьеи Азр С1у С1у Зег С1у 15 10 15
Суз Агд С1у <210> 20 <211> 19 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> контрольный пептид <400> 20
Рго Ьеи Ьеи ТНг Уа1 С1у МеЬ Азр Ьеи Тгр Рго Тгр С1у С1у Зег С1у 15 10 15
Суз Агд С1у
<210> 21
<211> 34
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> праймер для ПЦР
- 63 028087 <400> 21 адссддссай ддсддауайс садсйдасйс адсс 34 <210> 22 <211> 34 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> праймер для ПЦР <400> 22 адссддссай ддсддауайй дййсйсмссс адйс 34 <210> 23 <211> 34 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> праймер для ПЦР <400> 23 адссддссай ддсддауайй дЕдшЕтасйс адйс 34 <210> 24 <211> 34 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> праймер для ПЦР <400> 24 адссддссай ддсддауайй дйдуйгасас адйс 34 <210> 25 <211> 34 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> праймер для ПЦР <400> 25 адссддссай ддсддауайй дйгайдастс адйс 34 <210> 26
- 64 028087 <211> 34 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> праймер для ПЦР <400> 26 адссддссак ддсддауак·); тадакгатсс адЪс 34 · <210> 27 <211> 34 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> праймер для ПЦР <400> 27 адссддссак ддсддауаЕД садакдаубс адкс 34 <210> 28 <211> 34 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> праймер для ПЦР <400> 28 адссддссак ддсддауаку садакдасас адас 34 <210> 29 <211> 34 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> праймер для ПЦР <400> 29 адссддссак ддсддауаРЕ дЕТсксамсс адЪс 34 <210> 30 <211> 34 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> праймер для ПЦР
- 65 028087 <400> 30 адссддссай ддсддауайй дмдсйзассс аайс 34 <210> 31 <211> 34 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> праймер для ПЦР <400> 31 адссддссай ддсддауайй зйгайдассс агйс 34 <210> 32 <211> 34 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> праймер для ПЦР <400> 32 адссддссай ддсддаугйй кйдайдассс агас 34 <210> 33 <211> 34 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> праймер для ПЦР <400> 33 адссддссай ддсддауайй дйдайдасЪс адкс 34 <210> 34 <211> 34 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> праймер для ПЦР <400> 34 адссддссай ддсддауайй дйдайаасус адда 34
- 66 028087 <210> 35 <211> 34 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> праймер для ПЦР <400> 35 адссддссаЪ ддсддауаРР дСдаРдассс адмР 34 <210> 36 <211> 34 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> праймер для ПЦР <400> 36 адссддссаР ддсддауаРР дЦдаНдасас аасс 34 <210> 37 <211> 34 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> праймер для ПЦР <400> 37 адссддссаР ддсддауаРР РТдсРдасРс адРс 34 <210> 38 <211> 37 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> праймер для ПЦР <400> 38 адссддссаР ддсддагдсР дРРдРдасРс аддааРс 37 <210> 39 <211> 37 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
- 67 028087 <223> праймер для ПЦР <400> 39 дайддйдсдд ссдсадйасд ккйдаЫАсс адсййдд 37 <210> 40 <211> 37 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> праймер для ПЦР <400> 40 дайддйдсдд ссдсадйасд ЬЫзйаЦйЪсс адсййдд 37 <210> 41 <211> 37 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> праймер для ПЦР <400> 41 дайддйдсдд ссдсадйасд ййййай-Ьйсс аасйййд 37 <210> 42 <211> 37 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> праймер для ПЦР <400> 42 даРддйдсдд ссдсадйасд Рййсадсйсс адсййдд 37 <210> 43 <211> 37 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> праймер для ПЦР <400> 43 дайддйдсдд ссдсадйасс Раддасадйс адйййдд 37
- 68 028087 <210> 44 <211> 37 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> праймер для ПЦР <400> 44 дакддкдсдд ссдсадЪасс каддасадкд ассккдд 37 <210> 45 <211> 51 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> праймер для ПЦР <400> 45 дккаккдска дсддсксадс сддсаакддс ддакдргшад скксаддадк с 51 <210> 46 <211> 51 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> праймер для ПЦР <400> 46 дРРаРРдска дсддсксадс сддсаакддс ддаддРЬсад сРЬсадсадк с 51 <210> 47 ' <211> 51 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> праймер для ПЦР <400> 47 дккаккдска дсддсксадс сддсаакддс дсаддкдсад скдаадзазк с 51 <210> 48 <211> 51 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность
- 69 028087 <220>
<223> праймер для ПЦР <400> 48 дййаЪйдсйа дсддсйсадс сддсаайддс ддаддйссаг сйдсаасагй с 51 <210> 49 <211> 51 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> праймер для ПЦР <400> 49 дййаййдсйа дсддсйсадс сддсаайддс дсаддйусад сйЬсадсагй с 51 <210> 50 <211> 51 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> праймер для ПЦР <400> 50 дййаййдсйа дсддсйсадс сддсаайддс дсаддйусад сРЬсадсагк с 51 <210> 51 <211> 51 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> праймер для ПЦР <400> 51 дййаййдсйа дсддсйсадс сддсаайддс дсаддйусаг сйдсадсадр с 51 <210> 52 <211> 51 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> праймер для ПЦР <400> 52 дййаййдсйа дсддсйсадс сддсаайддс дсаддйссас дйдаадсадй с 51
- 70 028087 <210> 53 ' <211> 51 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> праймер для ПЦР <400> 53 дДДаДДдсДа дсддсДсадс сддсааДддс ддаддДдааз зДддДддааД с 51 <210> 54 <211> 51 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> праймер для ПЦР <400> 54 дДДаДДдсДа дсддсДсадс сддсааДддс ддаνдДдаνд уДддДддадД с 51 <210> 55 <211> 51 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> праймер для ПЦР <400> 55 дДДаДДдсДа дсддсДсадс сддсааДддс ддаддДдсад зкддДддадД с 51 ' <210> 56 <211> 51 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> праймер для ПЦР <400> 56 дДДаДДдсДа дсддсДсадс сддсааДддс ддакдДдсаш сДддкддадД с 51 <210> 57 <211> 51 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность
- 71 028087 <220>
<223> праймер для ПЦР <400> 57 дССаЖдсСа дсддсИсадс сддсаакддс ддаддИдаад скдаИддагк с 51 <210> 58 <211> 51 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> праймер для ПЦР <400> 58 дЪЪаЪЪдсЪа дсддсйсадс сддсааЪддс ддаддйдсаг сЦЪдЪЪдадЪ с 51 <210> 59 <211> 51 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220> .
<223> праймер для ПЦР <400> 59 дЦЦаИЦдсЦа дсддсйсадс сддсаайддс ддагдйгаад сИйсИсдадЦ с 51 <210> 60 <211> 51 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> праймер для ПЦР <400> 60 дНаРРдсЬа дсддсйсадс сддсаайддс ддаадйдааг зНдаддадй с 51 <210> 61 <211> 53 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> праймер для ПЦР <400> 61
- 72 028087 дГГаЪГдсРа дсддсРсадс сддсаарддс дсаддГГасР сРгааадмдР зкд 53 <210> 62 <211> 51 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> праймер для ПЦР <400> 62 дРРаРГдсРа дсддсРсадс сддсаарддс дсаддГссаа сГусадсагс с 51 <210> 63 <211> 51 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> праймер для ПЦР <400> 63 дРРаГГдсРа дсддсРсадс сддсаайддс ддаРдРдаас РРддаадРдР с 51 <210> 64 <211> 51 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220> .
<223> праймер для ПЦР <400> 64 дГГаГГдсГа дсддсРсадс сддсааГддс ддаддГдаад дРсаРсдадР с 51 <210> 65 <211> 35 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> праймер для ПЦР <400> 65 сссРГдаадс РРдсГдадда аасддрдасс дрддр 35 <210> 66 <211> 35
- 73 028087 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> праймер для ПЦР <400> 66 сссййдаадс ййдсйдадда дасйдйдада дйддй 35 <210> 67 <211> 35 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> праймер для ПЦР <400> 67 сссййдаадс ййдсйдсада дасадйдасс ададй 35 <210> 68 <211> 35 , <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> праймер для ПЦР <400> 68 сссййдаадс ййдсйдадда дасддйдасй даддй 35 <210> 69 <211> 747 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> зсГу Тег 119.
<400> 69 даддйдаадс йдсаддадйс йддаддаддс ййддйдсаас сйддддддйс йсйдааасйс 60 йссйдйдйад ссйсаддайй сасйййсадд дассасйдда йдааййдддй ссддсаддсй 120 сссддааада ссайддадйд даййддадай аййадассйд айддсадйда сасааасйай 180 дсассайсйд йдаддаайад аййсасаайс йссададаса айдссаддад сайссйдйас 240
- 74 028087
сйдсадайда 300 дсаайаЬдад аЬсЬдаБЬас асадссасБЬ аЪЬасЬд'ЬдЬ ЬададасЬса
ссЬасссддд 360 сйдддсЬЬаЬ ддаЬдссйдд ддйсааддаа ссЬсадЬсас ЬдЬсЕссйса
дссддйддЬд 420 дЬддЬЬсЬдд ЬддЬддЕддЬ ЬсЬддсддсд дсддсЬссдд ЬддЬддЬдда
ЪссдасаЬЬс 480 адайдасдса дЬсЬссЪЬса дБссЬдЬсйд сайсЬдЬддд адасададйс
асЬсйсаасЬ 540 дсааадсаад ЕсадааСаЕЕ аасаадЬасЬ ЬааасЬддЬа Ьсадсаааад
сБЬддадаад 600 сйсссааадЬ ссЬдаЬаЬаЬ аайасаааса аЕЬЬдсааас дддсакссса
БсааддЬЬса 660 дЬддсадЬдд аЬсЬддйаса даЕЁЕсасас ЬсассаЬсад БадссЬдсад
ссЬдаадаЬЬ 720 ЬйдссасаЬа СЕЕсБдс1±Е садсаЬйайа сБЬддсссас дБЫзддаддЬ
дддассаадс 747 ЬддаааЬсаа асдЦасЬ
<210> 70 <211> 45 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> праймер для ПЦР <400> 70 асйсдсддсс садссддсса РддсддаддЪ даадсЬдсад дадЕс 45 <210> 71 <211> 65 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> праймер для ПЦР <400> 71 ддадссдссд ссдссадаас сассассасс адаассасса ссассддсйд аддадасадй 60 дасйд <210> 72
- 75 028087 <211> 50 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> праймер для ПЦР <400> 72 ддсддсддсд дсйссддйдд йддйддайсс дасаййсада йдасдсадйс 50 <210> 73 <211> 41 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> праймер для ПЦР <400> 73 дасйасйадд сссссдаддс садйасдЫЛ дайййссадс Р 41 <210> 74 <211> 793 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 5θΡν 10Г7 <400> 74
дЬкайЦасйс 60 дсддсссадс сддссайддс ддсдсаддйд ааасйдсадс
ддаасйддйд 120 ааассдддсд сдадсдйдаа асйдадсйдс ааадсдадсд
ЬаасадсРай 180 йРЪайдсайй ддардаааса дсдсссддйд садддссЪдд
сайдаййсдс 240 ссдаасддсд дсассассда ййайаасдаа ааайййаааа
ссйдассдйд 300 дайаааадса дсаасассдс дйайайдсад сйдаасадсс
сдайадсдсд 360 дйдйайЪайй дсдсдсдсйд ддааддсадс йаййайдсдс
дддссадддс 420 ассассдйда ссдйдадсад сддсддсддс ддсадсддсд
сддсддсддс 480 ддсадсдайа ййдаасйдас ссададсссд дсдаййайда
ададсддсдс дсйайассРЬ аайддаРйдд асааадсдас йдассадсдд йддаййаййд дсддсддсад дсдсдасссй
- 76 028087
дддсдааааа 540 дРдассаРда ссРдссдсдс дадсадсаас дРдаааРаРа РдРаРРддРа
Рсадсадааа 600 адсддсдсда дсссдааасР дРддаРРРаР РаРассадса ассРддсдад
сддсдрдссд 660 ддссдсРРРа дсддсадсдд садсддсасс адсРаРадсс РдассаРРад
садсдрддаа 720 дсддаадард сддсдассРа РРаРРдссад садРРРасса дсадсссдРа
РассРРРддс ддсддсасса аасРддаааР Рааасдсдсд дсддсддсср сдддддссда
780 дддсддсддр РсР 793 <210> 75 <211> 15 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Эпитоп <400> 75
Зег С1у Ьеи С1и С1п Ьеи С1и Зег Не 11е Азп РНе С1и Ьуз Ьеи 15 10 15 <210> 76 <211> 819 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> гибридный белок <400> 76 даддрдаадс РдсаддадРс Рддаддаддс РРддРдсаас сРддддддРс РсРдааасРс 60
РссРдРдРад ссРсаддаРР сасРРРсадд дассасРдда РдааРРдддР ссддсаддсР 120 сссддааада ссарддадрд даРРддадаР аРРадассРд аРддсадРда сасааасРаР 180 ' дсассаРсРд РдаддааРад аРРсасааРс Рссададаса аРдссаддад саРссРдРас 240 сРдсадаРда дсааРаРдад аРсРдаРРас асадссасРР аРРасРдРдР РададасРса 300
- 77 028087
ссбасссддд 360 сбдддсббаб ддабдссбдд ддбсааддаа ссбсадбсас бдбсбссбса
дссддбддбд 420 дбддббсбдд бддбддбддб бсбддсддсд дсддсбссдд бддбддбдда
бссдасаббс 480 адабдасдса дбсбссббса дбссбдбсбд сабсбдбддд адасададбс
асбсбсаасб 540 дсааадсаад бсадаабабб аасаадбасб бааасбддба бсадсаааад
сббддадаад 600 сбсссааадб ссбдабабаб аабасаааса абббдсааас дддсабссса
бсааддббса 660 дбддсадбдд абсбддбаса дабббсасас бсассабсад бадссбдсад
ссбдаадабб 720 ббдссасаба бббсбдсббб садсаббаба сббддсссас дбббддаддб
дддассаадс 780 бддааабсаа асдбасбсаб сабсассабс абсасддбдд сддббсбддс
сбддадсадс бддадбсбаб баббаабббс дааааасбд
819 <210> 77 <211> 10 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> часть антитела <400> 77
Туг Уа1 Агд Рго беи Тгр Уа1 Агд Меб С1и 1 5 10 <210> 78 <211> 804 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> гибридный белок <400> 78 даддбдаадс бдсаддадбс аддаддаддс ббддбдсаас сбддддддбс бсбдааасбс 60 бссбдбдбад ссбсаддабб сасбббсадд дассасбдда бдааббдддб ссддсаддсб 120
- 78 028087
сссддааада 180 ссабддадбд даббддддаб аббадассбд абддсадбда сасааасбаб
дсассабсбд 240 бдаддаабад аббсасаабс бссададаса абассаддад сабссбдбас
сбдсадабдд 300 дсаабабдад абсбдаббас асадссасбб аббасбдбдб бададасбса
ссбасссддд 360 сбдддсббаб ддабдссбдд ддбсааддаа ссбсадбсас бдбсбссбса
дссддбддбд 420 дбддббсбдд бддбддбддб бсбддсддсд дсддсбссдд бддбддбдда
бссдасаббс 480 адабдасдса дбсбссббса дбссбдбсбд сабсбдбддд адасададбс
асбсбсаасб 540 дсааадсаад бсадаабабб аасаадбасб бааассддба бсадсаааад
сббддадаад 600 сбсссааадб ссбддбабаб аабасаааса абббдсааас дддсабссса
бсааддббса 660 дбддсадбдд абсбддсаса дабббсасас бсассабсад бадссбдсад
ссбдаадабб 720 ббдссасаба бббсбдсббб садсаббаба сббддсссас дбббддаддб
дбдассаадс бддааабсаа асдбасбсаб сабсассабс абсасддбдд 780 адассбсбдб дддбсадааб ддаа 804 <210> 79 <211> 1026 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220> <223> гибридный белок <400> 79 сддббабдбс
даддбдаадс 60 бдсаддадбс аддаддаддс ббддбдсаас сбддддддбс бсбдааасбс
бссбдбдбад 120 ссбсаддабб сасбббсадд дассасбдда бдааббдддб ссддсаддсб
сссддааада 180 ссабддадбд даббддадаб аббадассбд абддсадбда сасааасбаб
дсассабсбд 240 бдаддаабад аббсасаабс бссададаса абдссаддад сабссбдбас
- 79 028087
скдсадаЪда 300 дсааЪакдад аЪскдаНас асадссасН аНасЪдкдТ ЪададасЪса
сскасссддд 360 скдддсНаР ддабдссЕдд ддбсааддаа ссРсадксас ТдТсЕссЪса
дссддЪддкд 420 дРддНскдд рддкддкддр Есбддсддсд дсддскссдд Рддкддкдда
ЬссдасаЬЬс 480 адаЪдасдса дЬскссПса дкссРдксЪд саЪскдкддд адасададЪс
асбсксаасТ 540 дсааадсаад ЬсадааЬаН аасаадкасЕ ЪааасТддЪа Тсадсаааад
сНддадаад 600 сРсссааадк ссСдаСаСак аакасаааса аРНдсааас дддсакссса
ЬсааддЬЬса 660 дрддсадкдд акскддЪаса даЪЪЕсасас ЕсассаЕсад ЕадссЕдсад
ссЬдаадаЪЬ 720 ЬРдссасаЪа МГОсЪдсЕсЬ садсаЪЕаЬа сНддсссас дСНдаЬддЪ
дддассаадс 780 бддааабсаа асдЪасксаЪ саксассаЪс аЪсасддЪдд сддНПдЬд
ааасадсаЪс 840 Ъдкдсддксс дсаксРддЪд даадсдсбдГ аксЪддкдЪд сддсдаасдк
ддс'Ь'ЬЕНЬ'Ь 900 аЕассссдаа аадссдксдр даадкддаад акссдсаддЪ ддаасадсрд
даасбдддсд 960 дсадсссддд ЕдаЪсРдсад ассскддссс Еддаад-Ьддс дсдксадааа
сдЪддсаНд Ъддаксадбд сЪдсассадс аЕЬЪдсадсс ЕдкаЕсадсЪ ддааааска1;
1020 касаас
1026 <210> 80 <211> 17 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> зсГу <400> 80
Не Зег С1п А1а Уа1 ΗΪ8 А1а А1а ΗΪ3 А1а С1и 11е Азп С1и А1а С1у 15 10 15
Агд
- 80 028087 <210> 81 <211> 34 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> праймер <400> 81 адссддссай ддсддауайс садсйдасйс адсс 34 <210> 82 <211> 34 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> праймер <400> 82 адссддссаЪ ддсддауайй дййсйсмссс адйс 34 <210> 83 <211> 34 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> праймер <400> 83 адссддссай ддсддауайй дйдпгЬтасйс адйс 34 <210> 84 <211> 34 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> праймер <400> 84 адссддссай ддсддауайй дйдуйгасас адйс
34
<210> 85
<211> 34
<212> ДНК
- 81 028087 <213> Искусственная последовательность <220>
<223> праймер <400> 85 адссддссаб ддсддауабб дбгабдастс адбс 34 <210> 86 <211> 34 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> праймер <400> 86 адссддссаб ддсддауабб тадабгатсс адбс 34 <210> 87 <211> 34 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> праймер <400> 87 адссддссаб ддсддауабб садабдаубс адбс 34 <210> 88 <211> 34 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> праймер <400> 88 адссддссаб ддсддауабу садабдасас адас 34 <210> 89 <211> 34 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> праймер <400> 89
- 82 028087 адссддссак ддсддауакк дкксксамсс адкс 34 <210> 90 <211> 34 <212> ДНК ' <213> Искусственная последовательность <220>
<223> праймер <400> 90 адссддссак ддсддауакк дмдскзассс аакс 34 <210> 91 <211> 34 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> праймер <400> 91 адссддссак ддсддауакк зкгакдассс агкс 34 <210> 92 <211> 34 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> праймер <400> 92 адссддссак ддсддаугкк ккдакдассс агас 34 <210> 93 <211> 34 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> праймер <400> 93 адссддссак ддсддауакк дкдакдасЬс адкс 34 <210> 94 <211> 34
- 83 028087 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> праймер <400> 94 адссддссаД ддсддауаДД дДдаДаасус адда 34 <210> 95 <211> 34 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> праймер <400> 95 адссддссаД ддсддауаДД дДдаДдассс адмД 34 <210> 96 <211> 34 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> праймер <400> 96 адссддссаД ддсддауаДД дДдаДдасас аасс 34 <210> 97 <211> 34 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> праймер <400> 97 адссддссаД ддсддауаДД ДДдсДдасДс адДс 34 <210> 98 <211> 37 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> праймер
- 84 028087 <400> 98 адссддссай ддсддагдсй дййдйдасйс аддаайс 37 <210> 99 <211> 37 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> праймер <400> 99 дайддйдсдд ссдсадйасд ЪййдаЪйЪсс адсййдд 37 <210> 100 <211> 37 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> праймер <400> 100 дайддйдсдд ссдсадйасд ййййаЪЪйсс адсййдд 37 <210> 101 <211> 37 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> праймер <400> 101 · дайддйдсдд ссдсадйасд ййййаРРРсс аасЪййд 37 <210> 102 <211> 37 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> праймер <400> 102 даЪддйдсдд ссдсадйасд Рййсадсйсс адсййдд 37 <210> 103
- 85 028087 <211> 37 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> праймер <400> 103 дакддкдсдд ссдсадкасс Даддасадкс адДДкдд 37 <210> 104 <211> 37 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> праймер <400> 104 дакддкдсдд ссдсадБасс Даддасадкд ассББдд <210> 105 <211> 51 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> праймер <400> 105 дДДаДБдсБа дсддсБсадс сддсаакддс ддакдДгтад скксаддадк с 51 <210> 106 <211> 51 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> праймер <400> 106 дккаккдска дсддсксадс сддсаакддс ддаддкЪсад сБЬсадсадк с 51 <210> 107 <211> 51 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> праймер
- 86 028087 <400> 107 дРЪаРРдсРа дсддсксадс сддсааРддс дсаддрдсад сРдаадзазР с 51 <210> 108 <211> 51 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> праймер <400> 108 дЪГаРРдсРа дсддсРсадс сддсааРддс ддаддРссаг сРдсаасагР с 51 <210> 109 <211> 51 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> праймер <400> 109 дРРаРРдсЪа дсддсЪсадс сддсааГддс дсаддйусад сРЬсадсагР с 51 <210> 110 <211> 51 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> праймер <400> 110 дРРаРРдсРа дсддсРсадс сддсааРддс дсаддйусаг сРдсадсадР с 51 <210> 111 <211> 51 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> праймер <400> 111 дГГаГРдсЪа дсддсРсадс сддсааГддс дсаддйссас дРдаадсадГ с 51
- 87 028087 <210> 112 <211> 51 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> праймер <400> 112 дййаййдсйа дсддсйсадс сддсаайддс ддаддйдааз зйддйддаай с 51 <210> 113 <211> 51 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> праймер <400> 113 дййаййдсйа дсддсйсадс сддсаайддс ддаудйдамд уйддйддадй с 51 <210> 114 <211> 51 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> праймер <400> 114 дййаййдсйа дсддсйсадс сддсаайддс ддаддйдсад зкддйддадй с 51 <210> 115 <211> 51 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> праймер <400> 115 дййаййдсйа дсддсйсадс сддсаайддс ддакдйдсаш сйддйддадй с 51 <210> 116 <211> 51 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
- 88 028087 <223> праймер <400> 116 дЬбайбдсба дсддсбсадс сддсаабддс ддаддбдаад сРдабддагб с 51 <210> 117 <211> 51 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> праймер <400> 117 дРРаббдсба дсддсбсадс сддсаабддс ддаддбдсаг сббдррдадб с 51 <210> 118 <211> 51 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> праймер <400> 118 дббаббдсба дсддсбсадс сддсаабддс ддагдбгаад сббсбсдадб с 51 <210> 119 <211> 51 <212> ДНК ' <213> Искусственная последовательность <220>
<223> праймер <400> 119 дРРаРРдсРа дсддсбсадс сддсаабддс ддаадрдааг зРРдаддадР с 51 <210> 120 <211> 53 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> праймер <400> 120 дббаббдсРа дсддсбсадс сддсаабддс дсаддббасб сбгааадмдб збд 53
- 89 028087 <210> 121 <211> 51 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> праймер <400> 121 дЪйаЪЪдсйа дсддсйсадс сддсаайддс ддайдйдаас ЪйддаадЪдЪ с 51 <210> 122 <211> 51 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> праймер <400> 122 дййаййдсйа дсддсйсадс сддсаайддс ддайдйдаас ййддаадйдй с 51 <210> 123 <211> 51 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> праймер <400> 123 дййаййдсйа дсддсйсадс сддсаайддс ддаддйдаад дйсайсдадй с 51 <210> 124 <211> 35 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> праймер <400> 124 сссййдаадс ййдсйдадда аасддйдасс дйддй 35 <210> 125 <211> 70 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность
- 90 028087 <220>
<223> праймер <400> 125 сссййдассс ййдаадсййд сйдсададас адйдассада дйадсййдсй даддадасйд 60 йдададйддй <210> 126 <211> 35 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> праймер <400> 126 сссййдаадс ййдсйдсада дасадйдасс ададй 35 <210> 127 <211> 35 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> праймер <400> 127 .
сссййдаадс ййдсйдадда дасддйдасй даддй <210> 128 <211> 19 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Лиганд <400> 128
Тгр Мей \7а1 Ьеи Рго Тгр Ьеи Рго С1у ТЬг Ьеи Азр С1у С1у Зег С1у 15 10 15
Суз Агд С1у

Claims (27)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Фармацевтически приемлемая композиция, содержащая связывающийся с эритроцитами фрагмент, линкер и толерогенный антиген, которые рекомбинантно гибридизированы или химически конъюгированы, при этом указанный связывающийся с эритроцитами фрагмент представляет собой антитело, фрагмент антитела или фрагмент одноцепочечного антигенсвязывающего домена (зсРД, который специфически связывается с белком полосы 3, гликофорином А, гликофорином В, гликофорином С или гликофорином Ό на эритроците человека т зйи в крови;
    указанный линкер представляет собой пептид, линейный или разветвленный полимер, ковалентную связь или ионную связь;
    указанный толерогенный антиген представляет собой антиген, к которому у субъектов, подверженных действию антигена, развивается нежелательный иммунный ответ, при этом толерогенный антиген представляет собой пищевой антиген, терапевтическое средство, аутоантиген, фрагмент любого из таких антигенов или мимотоп любого из таких антигенов; и при этом при введении субъекту, композиция способна индуцировать одно или несколько из: (ί) пролиферации СЭ8 Т-клеток, имеющих фенотип истощения или апоптический фенотип, (ίί) делеции
    - 91 028087
    СЭ4 и/или СЭ8' Т-клеток. специфичных для толерогенного антигена. и (ίίί) способности индуцировать фенотипы регуляторных клеток.
  2. 2. Фармацевтически приемлемая композиция по п.1. отличающаяся тем. что указанный связывающийся с эритроцитами фрагмент содержит фрагмент антитела или фрагмент 8сΡν. который специфически связывается с гликофорином А.
  3. 3. Фармацевтически приемлемая композиция по п.1. отличающаяся тем. что указанный связывающийся с эритроцитами фрагмент выделен из клона 10Р7.
  4. 4. Фармацевтически приемлемая композиция по п.1. отличающаяся тем. что толерогенный антиген содержит аутоантиген. его фрагмент или его мимотоп. выбранный из группы. включающей инсулин. проинсулин. препроинсулин. декарбоксилазу-б5 глутаминовой кислоты (САЭ-65). САЭ-67. инсулиномаассоциированный белок 2 (1А-2). инсулинома-ассоциированный белок 2β (1А-2в). 1СА69. 1СА12 (§ОХ13). карбоксипептидазу Н. 1тодеп 38. СЫМА 38. хромогранин А. Н8Р-60. карбоксипептидазу Ε. периферин. переносчик глюкозы 2. панкреатит-ассоциированный белок. экспрессирующийся в гепатокарциноме. кишечнике и поджелудочной железе. 8100β. глиофибриллярный кислый белок. ген регенерации II. панкреатический дуоденальный гомеобокс 1. киназу гена миотонической дистрофии. специфичный для островковых клеток белок. родственный каталитической субъединице глюкозо-б-фосфатазы. и рецепторы 1-5. связанные с С-белком ССТ;
    аутоантиген. его фрагмент или его мимотоп. выбранный из группы. включающей основной белок миелина. миелиновый олигодендроцитарный гликопротеин и протеолипидный белок;
    пищевой антиген. его фрагмент или его мимотоп. выбранный из группы. включающей конарахин (Ага И 1). аллерген II (Ага И 2). арахисовый агглютинин. конглютин (Ага И б). α-лактальбумин (АРА). лактотрансферрин. аллерген Реп а 1 (Реп а 1). аллерген Реп т 2 (Реп т 2). быстрая изоформа тропомиозина. глиадин. высокомолекулярный глютенин. низкомолекулярный глютенин. альфа- и гамма-глиадин. гордеин. овальбумин. секалин и авенин.
  5. 5. Фармацевтически приемлемая композиция по любому одному из пп.1-4. отличающаяся тем. что толерогенный антиген содержит мимотоп пищевого антигена. терапевтического средства. аутоантигена или фрагментов любого из таких антигенов.
  6. 6. Фармацевтически приемлемая композиция по любому одному из пп.1-3 и 4. 5. отличающаяся тем. что указанный линкер представляет собой разветвленный полимер. который повышает аффинность связывания с эритроцитом вследствие эффектов авидности.
  7. 7. Фармацевтически приемлемая композиция по п.б. отличающаяся тем. что указанный разветвленный полимер конъюгирован с более чем одним связывающимся с эритроцитом фрагментом.
  8. 8. Фармацевтически приемлемая композиция по любому одному из пп.1-3. отличающаяся тем. что толерогенный антиген представляет собой терапевтические средство. выбранное из группы. включающей фактор УШ. фактор IX. аспарагиназу и уриказу. фрагмент любого из таких антигенов или мимотоп любого из таких антигенов.
  9. 9. Применение терапевтически эффективного количества фармацевтически приемлемой композиции для лечения нежелательного иммунного ответа. при этом композиция содержит связывающийся с эритроцитом фрагмент. линкер и толерогенный антиген. при этом связывающийся с эритроцитом фрагмент. линкер и толерогенный антиген рекомбинантно гибридизированы или химически конъюгированы. причем указанный связывающийся с эритроцитами фрагмент представляет собой антитело. фрагмент антитела или фрагмент одноцепочечного антигенсвязывающего домена ЦсЕу). который специфически связывается с белком полосы 3. гликофорином А. гликофорином В. гликофорином С или гликофорином Ό на эритроците человека ш δΐίιι в крови;
    указанный линкер представляет собой пептид. линейный или разветвленный полимер. ковалентную связь. ионную связь. аптамер. нуклеиновую кислоту или частицу;
    указанный толерогенный антиген представляет собой антиген. к которому у субъектов. подверженных действию антигена. развивается нежелательный иммунный ответ. при этом толерогенный антиген представляет собой пищевой антиген. терапевтическое средство. аутоантиген. фрагмент любого из таких антигенов или мимотоп любого из таких антигенов; и при этом при введении субъекту композиция способна индуцировать одно или несколько из: (ί) пролиферации СЭ8' Т-клеток. имеющих фенотип истощения или апоптический фенотип. (ίί) делеции СЭ4 и/или СЭ8' Т-клеток. специфичных для толерогенного антигена. и (ίίί) способности индуцировать фенотипы регуляторных клеток.
  10. 10. Применение по п.9. отличающееся тем. что указанный связывающийся с эритроцитом фрагмент содержит фрагмент антитела или фрагмент 8сΡν. который специфически связывается с гликофорином А.
  11. 11. Применение по п.9. отличающееся тем. что указанный связывающийся с эритроцитами фрагмент выделен из клона 10Р7.
  12. 12. Применение по любому одному из пп.9-11. отличающееся тем. что указанную композицию вво- 92 028087 дят субъекту перед нежелательным иммунным ответом на антиген, причем указанная композиция снижает нежелательный иммунный ответ.
  13. 13. Применение по любому одному из пп.9-11, отличающееся тем, что указанную композицию вводят субъекту с нежелательным иммунным ответом на антиген, причем указанная композиция реверсирует или снижает нежелательный иммунный ответ.
  14. 14. Применение по любому одному из пп.9-13, где нежелательный иммунный ответ связан с заболеванием, выбранным из следующей группы: сахарный диабет 1 типа; рассеянный склероз; ревматоидный артрит; целиакия; витилиго; вульгарная пузырчатка и ее варианты; буллезный пемфигоид; гемофилия и рак.
  15. 15. Применение по любому одному из пп.9-13, отличающееся тем, что толерогенный антиген содержит аутоантиген, его фрагмент или его мимотоп, выбранный из группы, включающей инсулин, проинсулин, препроинсулин, декарбоксилазу-65 глутаминовой кислоты (ОАЭ^), ОАЭ^, инсулиномаассоциированный белок 2 ^А^), инсулинома-ассоциированный белок 2β ЦА^в), ЮА69, ЮА12 (80Х13), карбоксипептидазу Н, Iтοдеη 38, ОЫМА 38, хромогранин А, Н8Р-60, карбоксипептидазу Е, периферин, переносчик глюкозы 2, панкреатит-ассоциированный белок, экспрессирующийся в гепатокарциноме, кишечнике и поджелудочной железе, 81008, глиофибриллярный кислый белок, ген регенерации II, панкреатический дуоденальный гомеобокс 1, киназу гена миотонической дистрофии, специфичный для островковых клеток белок, родственный каталитической субъединице глюкозо-6-фосфатазы, и рецепторы 1-5, связанные с О-белком ССТ;
    аутоантиген, его фрагмент или его мимотоп, выбранный из группы, включающей основной белок миелина, миелиновый олигодендроцитарный гликопротеин и протеолипидный белок; или коллаген II типа, его фрагмент или его мимотоп; тканевую трансглутаминазу, ее фрагмент или ее мимотоп;
    аутоантиген, его фрагмент или его мимотоп, выбранный из группы, включающей тирозиназу и тирозиназа-родственный белок 1 и 2;
    аутоантиген, его фрагмент или его мимотоп, выбранный из группы, включающей десмоглеин 3, десмоглеин 1, десмоглеин 4, пемфаксин, десмоколлины, плакоглобин, перплакин, десмоплакины и ацетилхолиновый рецептор;
    аутоантиген, его фрагмент или его мимотоп, выбранный из группы, включающей ВР180, ВР230, плектин и ламинин 5;
    пищевой антиген, его фрагмент или его мимотоп, выбранный из группы, включающей конарахин (Ага И 1), аллерген II (Ага И 2), арахисовый агглютинин, конглютин (Ага И 6), α-лактальбумин (АРА), лактотрансферрин, аллерген Рсп а 1 (Рсп а 1), аллерген Рсп т 2 (Рсп т 2), быструю изоформу тропомиозина, глиадин, высокомолекулярный глютенин, низкомолекулярный глютенин, альфа- и гамма-глиадин, гордеин, овальбумин, секалин и авенин; или терапевтическое средство, его фрагмент или его мимотоп, выбранный из группы, включающей фактор VIII, фактор ЕХ, аспарагиназу и уриказу.
  16. 16. Применение по п.9, где нежелательный иммунный ответ связан с целиакией, и при этом толерогенный антиген представляет собой тканевую трансглутаминазу, высокомолекулярный глютенин, низкомолекулярный глютенин, альфа- или гамма-глиадин.
  17. 17. Применение терапевтически эффективного количества фармацевтически приемлемой композиции для изготовления лекарственного средства для лечения нежелательного иммунного ответа, при этом композиция содержит связывающийся с эритроцитом фрагмент, линкер и толерогенный антиген, при этом связывающийся с эритроцитами фрагмент, линкер и толерогенный антиген рекомбинантно гибридизированы, связывающийся с эритроцитами фрагмент представляет собой фрагмент антитела или фрагмент одноцепочечного антигенсвязывающего домена ЦсРу), который нековалентно и специфически связывается с белком полосы 3, гликофорином А, гликофорином В, гликофорином С или гликофорином Ό на эритроците человека ίη δίΐιι в крови;
    указанный линкер представляет собой пептид, линейный или разветвленный полимер, ковалентную связь, ионную связь, аптамер, нуклеиновую кислоту или частицу; и указанный толерогенный антиген представляет собой чужеродный антиген, к которому у субъектов, подверженных действию антигена, развивается нежелательный иммунный ответ.
  18. 18. Фармацевтически приемлемая композиция, содержащая связывающийся с эритроцитами фрагмент и толерогенный антиген, которые рекомбинантно гибридизированы или химически конъюгированы, при этом указанный связывающийся с эритроцитами фрагмент представляет собой антитело, фрагмент антитела или фрагмент 8сРν, который специфически связывается с гликофорином А на эритроците человека
    - 93 028087 т 81!и в крови;
    указанный толерогенный антиген представляет собой антиген, к которому у субъектов, подверженных действию антигена, развивается нежелательный иммунный ответ; и при этом толерогенный антиген представляет собой пищевой антиген, терапевтическое средство, аутоантиген или фрагмент любого из таких антигенов.
  19. 19. Фармацевтически приемлемая композиция по п.18, отличающаяся тем, что указанный связывающийся с эритроцитами фрагмент представляет собой зсРу.
  20. 20. Фармацевтически приемлемая композиция по п.18, отличающаяся тем, что указанный связывающийся с эритроцитами фрагмент представляет собой фрагмент антитела.
  21. 21. Фармацевтически приемлемая композиция по любому одному из пп.18-20, отличающаяся тем, что пищевой антиген выбран из группы, включающей глиадин, α-глиадин, γ-глиадин, фрагмент таких антигенов и мимотоп любого из таких антигенов.
  22. 22. Фармацевтически приемлемая композиция по любому одному из пп.18-20, отличающаяся тем, что аутоантиген выбран из группы, включающей инсулин, проинсулин, препроинсулин, декарбоксилазу65 глутаминовой кислоты (САЭ-65), САЭ-67, специфичный для островковых клеток белок, родственный каталитической субъединице глюкозо-6-фосфатазы, фрагмент таких антигенов и мимотоп любого из таких антигенов.
  23. 23. Применение фармацевтически приемлемой композиции по любому одному из пп.18-22 для изготовления лекарственного средства для лечения нежелательного иммунного ответа.
  24. 24. Применение фармацевтически приемлемой композиции по п.21 для изготовления лекарственного средства для лечения целиакии.
  25. 25. Применение фармацевтически приемлемой композиции по п.22 для изготовления лекарственного средства для лечения сахарного диабета 1 типа.
  26. 26. Фармацевтически приемлемая композиция по любому одному из пп.18-20, отличающаяся тем, что аутоантиген выбран из группы, включающей основной белок миелина, миелиновый олигодендроцитарный гликопротеин и протеолипидный белок, фрагмент таких антигенов и мимотоп любого из таких антигенов.
  27. 27. Применение фармацевтически приемлемой композиции по п.26 для изготовления лекарственного средства для лечения рассеянного склероза.
EA201491524A 2012-02-15 2013-02-15 Связывающиеся с эритроцитами терапевтические средства EA028087B1 (ru)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US13/397,202 2012-02-15
US13/397,202 US9517257B2 (en) 2010-08-10 2012-02-15 Erythrocyte-binding therapeutics
PCT/IB2013/000684 WO2013121296A1 (en) 2012-02-15 2013-02-15 Erythrocyte-binding therapeutics

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA201491524A1 EA201491524A1 (ru) 2014-12-30
EA028087B1 true EA028087B1 (ru) 2017-10-31

Family

ID=48326347

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201790862A EA035931B1 (ru) 2012-02-15 2013-02-15 Связывающиеся с эритроцитами терапевтические средства
EA201491524A EA028087B1 (ru) 2012-02-15 2013-02-15 Связывающиеся с эритроцитами терапевтические средства

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201790862A EA035931B1 (ru) 2012-02-15 2013-02-15 Связывающиеся с эритроцитами терапевтические средства

Country Status (15)

Country Link
EP (1) EP2814500B1 (ru)
JP (4) JP6692602B2 (ru)
KR (1) KR20150010699A (ru)
CN (3) CN110075283A (ru)
AU (2) AU2013220079B2 (ru)
BR (1) BR112014020304A8 (ru)
CA (1) CA2864432A1 (ru)
EA (2) EA035931B1 (ru)
ES (1) ES2781773T3 (ru)
HK (1) HK1202051A1 (ru)
IL (1) IL234056B (ru)
MX (1) MX2014009900A (ru)
NZ (2) NZ628851A (ru)
SG (2) SG11201404943PA (ru)
WO (1) WO2013121296A1 (ru)

Families Citing this family (31)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2476435B1 (en) 2006-08-11 2017-12-20 Life Sciences Research Partners VZW Immunogenic peptides and their use in immune disorders
EP2244733B1 (en) 2008-02-14 2015-06-17 Life Sciences Research Partners VZW Immunotherapy targeting intracellular pathogens
ES2627882T3 (es) 2008-02-14 2017-07-31 Life Sciences Research Partners Vzw Control inmunogénico de tumores y células tumorales
JP6017422B2 (ja) 2010-08-10 2016-11-02 エコール・ポリテクニーク・フェデラル・ドゥ・ローザンヌ（ウペエフエル）Ｅｃｏｌｅ Ｐｏｌｙｔｅｃｈｎｉｑｕｅ Ｆｅｄｅｒａｌｅ ｄｅ Ｌａｕｓａｎｎｅ （ＥＰＦＬ） 赤血球結合療法
US9850296B2 (en) 2010-08-10 2017-12-26 Ecole Polytechnique Federale De Lausanne (Epfl) Erythrocyte-binding therapeutics
US9517257B2 (en) 2010-08-10 2016-12-13 Ecole Polytechnique Federale De Lausanne (Epfl) Erythrocyte-binding therapeutics
ES2869155T3 (es) 2010-11-25 2021-10-25 Imnate Sarl Péptidos inmunogénicos para su uso en la prevención y/o tratamiento de enfermedades infecciosas, enfermedades autoinmunitarias, respuestas inmunitarias a alofactores, enfermedades alérgicas, tumores, rechazo de injerto y respuestas inmunitarias contra vectores virales usados para terapia génica o vacunación génica
EP2945964A2 (en) * 2013-01-18 2015-11-25 Glycotope GmbH Fusion peptides for enhancing protein expression
GB201309469D0 (en) 2013-05-28 2013-07-10 Imcyse Sa Detection of CD4+ T lymphocytes
CA2930665A1 (en) 2013-11-18 2015-05-21 Rubius Therapeutics, Inc. Synthetic membrane-receiver complexes
US10953101B2 (en) 2014-02-21 2021-03-23 École Polytechnique Fédérale De Lausanne (Epfl) Glycotargeting therapeutics
AU2015233084B2 (en) 2014-02-21 2020-12-17 Anokion Sa Glycotargeting therapeutics
US10046056B2 (en) 2014-02-21 2018-08-14 École Polytechnique Fédérale De Lausanne (Epfl) Glycotargeting therapeutics
US10946079B2 (en) 2014-02-21 2021-03-16 Ecole Polytechnique Federale De Lausanne Glycotargeting therapeutics
CA2944492A1 (en) 2014-04-01 2015-10-08 Rubius Therapeutics, Inc. Methods and compositions for immunomodulation
US10729791B2 (en) * 2015-05-18 2020-08-04 Imcyse Sa Animal models for evaluating pharmaceutical compounds
EP3349784A1 (en) * 2015-09-19 2018-07-25 Ecole Polytechnique Fédérale de Lausanne Glycotargeting therapeutics
EP3352782B1 (en) 2015-09-25 2021-03-31 ImCyse SA Improved methods and compounds for eliminating immune responses to therapeutic agents
WO2017070494A1 (en) * 2015-10-23 2017-04-27 Immix Biopharma, Inc. Methods and related compositions for the treatment of cancer
CN108778318B (zh) * 2016-01-14 2022-05-03 北卡罗莱纳州立大学 葡萄糖响应性胰岛素递送组合物和方法
EP3445390A1 (en) 2016-04-19 2019-02-27 ImCyse SA Novel immunogenic cd1d binding peptides
CA3023092A1 (en) * 2016-05-03 2017-11-09 Sqz Biotechnologies Company Intracellular delivery of biomolecules to induce tolerance
BR112018074716A2 (pt) 2016-06-02 2019-03-12 Sanofi conjugados de um agente farmacêutico e porção capaz de ligar-se a uma proteína sensível à glicose
WO2018232176A1 (en) 2017-06-16 2018-12-20 The University Of Chicago Compositions and methods for inducing immune tolerance
CA3079014A1 (en) * 2017-10-20 2019-04-25 Csl Ltd. Method
WO2019106122A1 (en) 2017-12-01 2019-06-06 Sanofi Novel conjugates of a pharmaceutical agent and a moiety capable of binding to a glucose sensing protein
EP4058049A1 (en) 2019-11-11 2022-09-21 CSL Behring Lengnau AG Polypeptides for inducing tolerance to factor viii
WO2021222772A2 (en) * 2020-05-01 2021-11-04 The Johns Hopkins University Compositions and methods for coronavirus detection
JP2023545520A (ja) 2020-10-14 2023-10-30 ビリジアン セラピューティクス， インコーポレイテッド 甲状腺眼疾患を治療するための組成物及び方法
EP4373517A1 (en) * 2021-06-17 2024-05-29 Phaim Pharma Ltd Individualized cell therapy using patient-derived antigen-specific regulatory t cells
CN116731962B (zh) * 2023-08-14 2023-11-03 天津中新科炬生物制药股份有限公司 全血中分离红细胞的试剂盒及方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012021512A2 (en) * 2010-08-10 2012-02-16 Ecole Polytechnique Federale De Lausanne Erythrocyte-binding therapeutics
US20120178139A1 (en) * 2010-08-10 2012-07-12 Hubbell Jeffrey A Erythrocyte-binding therapeutics

Family Cites Families (30)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5358857A (en) 1989-08-29 1994-10-25 The General Hospital Corp. Method of preparing fusion proteins
US5227293A (en) 1989-08-29 1993-07-13 The General Hospital Corporation Fusion proteins, their preparation and use
US5227165A (en) 1989-11-13 1993-07-13 Nova Pharmaceutical Corporation Liposphere delivery systems for local anesthetics
GB9223084D0 (en) 1992-11-04 1992-12-16 Imp Cancer Res Tech Compounds to target cells
US6090925A (en) 1993-03-09 2000-07-18 Epic Therapeutics, Inc. Macromolecular microparticles and methods of production and use
EP0743856B1 (en) * 1994-02-28 2003-07-16 The University Of Virginia Patent Foundation Antigen-based heteropolymers for treating autoimmune diseases
US6512103B1 (en) 1995-12-08 2003-01-28 Schering Corporation Mammalian chemokine reagents
EP0930874A2 (en) 1996-10-09 1999-07-28 Takeda Chemical Industries, Ltd. A method for producing a microparticle
US5994104A (en) 1996-11-08 1999-11-30 Royal Free Hospital School Of Medicine Interleukin-12 fusion protein
US5948639A (en) 1997-04-10 1999-09-07 Millennium Pharmaceuticals, Inc. TGF-β pathway genes
ES2289778T3 (es) 1997-04-18 2008-02-01 Biogen Idec Ma Inc. Proteinas de fusion de la region constante de la inmunoglobulina/receptor tgf-beta tipo ii.
AU2903999A (en) 1998-03-12 1999-09-27 Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services, The Methods and compositions of chemokine-tumor antigen fusion proteins as cancer vaccines
US6224794B1 (en) 1998-05-06 2001-05-01 Angiotech Pharmaceuticals, Inc. Methods for microsphere production
AU4572899A (en) 1998-06-16 2000-01-05 Biogen, Inc. Variant type ii tgf-beta receptor fusion proteins and methods
WO2000020449A2 (en) 1998-10-07 2000-04-13 Stryker Corporation MODIFIED TGF-β SUPERFAMILY PROTEINS
EP2267026A1 (en) 2000-04-12 2010-12-29 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
GB0019302D0 (en) 2000-08-08 2000-09-27 Univ Nottingham Trent Biological materials and the use thereof for the treatment of disease
US7470420B2 (en) 2000-12-05 2008-12-30 The Regents Of The University Of California Optical determination of glucose utilizing boronic acid adducts
US7175988B2 (en) 2001-02-09 2007-02-13 Human Genome Sciences, Inc. Human G-protein Chemokine Receptor (CCR5) HDGNR10
AU2002335973A1 (en) 2001-10-23 2003-05-06 Centre For Translational Research In Cancer A synthetic chimeric fusion protein with immuno-therapeutic uses
WO2005051174A2 (en) 2003-11-21 2005-06-09 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Nucleic acid aptamer-based compositions and methods
WO2006034081A2 (en) 2004-09-17 2006-03-30 Massachusetts Institute Of Technology Polymers for analyte detection
US7811809B2 (en) 2005-06-15 2010-10-12 Saint Louis University Molecular biosensors for use in competition assays
US7892734B2 (en) 2005-08-11 2011-02-22 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Aptamer based colorimetric sensor systems
US8021689B2 (en) 2006-02-21 2011-09-20 Ecole Polytechnique Federale de Lausanne (“EPFL”) Nanoparticles for immunotherapy
CN108948177B (zh) 2007-05-11 2022-04-22 阿尔托生物科学有限公司 融合分子与il-15变异体
US8852640B2 (en) 2008-07-03 2014-10-07 Ecole Polytechnique Federale De Lausanne (Epfl) Micelles for delivery of nitric oxide
US8323696B2 (en) 2008-08-29 2012-12-04 Ecole Polytechnique Federale De Lausanne Nanoparticles for immunotherapy
US8268977B2 (en) 2008-11-20 2012-09-18 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Strongly quenching oligomeric excimer/quencher pairs for detection schemes
CA2778669C (en) * 2009-10-27 2019-04-16 Erytech Pharma Composition to induce specific immune tolerance

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012021512A2 (en) * 2010-08-10 2012-02-16 Ecole Polytechnique Federale De Lausanne Erythrocyte-binding therapeutics
US20120178139A1 (en) * 2010-08-10 2012-07-12 Hubbell Jeffrey A Erythrocyte-binding therapeutics

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"EPFL School of Life Sciences - Annual Report SV 2011", 1 January 2011 (2011-01-01), pages 156 pp., XP009170907, Retrieved from the Internet <URL:http://issuu.com/epfl-sv-ar/docs/sv2011annualreportcomplete> [retrieved on 20130705] *
KONTOS S: "Engineering Erythrocyte Affinity for Improved Pharmacokinetics and Immune Tolerogenesis", THESIS, no. 5075, 23 June 2011 (2011-06-23), pages 105 pp., XP009170901 *
KONTOS STEPHAN; HUBBELL JEFFREY A: "Improving protein pharmacokinetics by engineering erythrocyte affinity.", MOLECULAR PHARMACEUTICS, ACS PUBLICATIONS, USA, vol. 7, no. 6, 6 December 2010 (2010-12-06), USA, pages 2141 - 2147, XP009170761, ISSN: 1543-8392, DOI: 10.1021/mp1001697 *
Kontos, Stephane: "Engineering Erythrocyte Affinity for Improved harmacokinetics and Immune Tolerogenesis", École polytechnique fédérale de Lausanne, EPFL, 27 April 2011 (2011-04-27), XP002700436, Retrieved from the Internet: URL:http://infoscience.epfl.ch/record/165397 [retrieved on 2013-07-04], the whole document *
S. KONTOS, I. C. KOURTIS, K. Y. DANE, J. A. HUBBELL: "PNAS Plus: Engineering antigens for in situ erythrocyte binding induces T-cell deletion", PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES, NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES, vol. 110, no. 1, 2 January 2013 (2013-01-02), pages E60 - E68, XP055068885, ISSN: 00278424, DOI: 10.1073/pnas.1216353110 *

Also Published As

Publication number Publication date
ES2781773T3 (es) 2020-09-07
AU2013220079A1 (en) 2014-09-04
WO2013121296A1 (en) 2013-08-22
IL234056B (en) 2020-04-30
EP2814500A1 (en) 2014-12-24
AU2017276218B2 (en) 2019-10-31
JP6716619B2 (ja) 2020-07-01
JP6692602B2 (ja) 2020-05-13
AU2017276218A1 (en) 2018-01-18
BR112014020304A2 (pt) 2017-07-04
IL234056A0 (en) 2014-09-30
KR20150010699A (ko) 2015-01-28
SG10201609500QA (en) 2016-12-29
CN110075283A (zh) 2019-08-02
EA201790862A1 (ru) 2017-08-31
SG11201404943PA (en) 2014-10-30
AU2013220079B2 (en) 2017-10-05
JP2018127458A (ja) 2018-08-16
BR112014020304A8 (pt) 2018-01-16
EP2814500B1 (en) 2020-01-08
HK1202051A1 (en) 2015-09-18
CN110075284A (zh) 2019-08-02
CA2864432A1 (en) 2013-08-22
NZ722352A (en) 2022-05-27
JP2020147591A (ja) 2020-09-17
EA201491524A1 (ru) 2014-12-30
JP2015508770A (ja) 2015-03-23
MX2014009900A (es) 2015-06-02
EA035931B1 (ru) 2020-09-02
JP2022184955A (ja) 2022-12-13
CN104271148A (zh) 2015-01-07
NZ628851A (en) 2017-03-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA028087B1 (ru) Связывающиеся с эритроцитами терапевтические средства
JP6648184B2 (ja) 赤血球結合療法
US20210079077A1 (en) Erythrocyte-binding therapeutics
US10265415B2 (en) Compositions for inducing antigen-specific tolerance