MX2014009900A - Agentes terapeuticos de ligacion a eritrocitos. - Google Patents

Agentes terapeuticos de ligacion a eritrocitos.

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MX2014009900A
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Jeffrey A Hubbell
Stephane Kontos
Karen Y Dane
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Abstract

Se describen péptidos que se ligan específicamente a eritrocitos. Estos se proporcionan como ligandos peptídicos que tienen secuencias que se ligan específicamente, o como anticuerpos o fragmentos de los mismos que proporcionan ligación específica, a eritrocitos. Los péptidos se pueden preparar como fusiones moleculares con agentes terapéuticos, antígenos tolerizantes, o péptidos objetivo. La inmunotolerancia se puede crear por el uso de fusiones y la elección de antígeno o sustancia de la cual la tolerancia se desea.

Description

AGENTES TERAPÉUTICOS DE LIGACIÓN A ERITROCITOS CAMPO DE LA INVENCION El campo téenico se refiere a composiciones médicas y usos para ligandos o anticuerpos que se ligan a eritrocitos. Los usos específicos incluyen inmunotolerización, administración de fármacos y terapias del cáncer.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El rechazo del tejido trasplantado y enfermedades autoinmunitarias son condiciones patológicas que implican un inmunorechazo de una. biomolécula extraña debido a su naturaleza antigénica. Muchos fármacos y procesos clínicos se implican en la supresión o tratamiento del inmunorechazo. Las vacunas toman ventaja de este proceso al estimular una respuesta inmunitaria a los antígenos en biomoléculas patogénicas para construir la respuesta del sistema inmunitario contra las proteínas y otras biomoléculas que llevan el antígeno.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN La tolerogénesis es un proceso para crear tolerancia inmunológica a una sustancia. Un paciente, ya sea humano o no humano, que se trata para crear tolerancia de una sustancia tendrá una respuesta inmunitaria adaptativa reducida a la sustancia. La reducción en una respuesta inmunitaria adaptativa se puede medir al analizar las cantidades de anticuerpos circulantes reactivos a la sustancia, o al analizar las reacciones de células T a la sustancia y al agente tolerizante. Las composiciones y métodos para la tolerización se proporcionan en la presente. Muchas de las modalidades implican la administración de una molécula de fusión que tiene un antigeno tolerizante combinado con una porción de ligación a eritrocitos. La molécula de fusión se liga a eritrocitos y comienza un proceso para presentar el agente tolerizante al sistema inmunitario en una manera que crea tolerancia.
Se han descubierto péptidos que se ligan específicamente a eritrocitos (también conocidos como glóbulos rojos). Estos ligandos peptídicos son porciones de ligación a eritrocitos que se ligan específicamente a eritrocitos aún en presencia de otros factores presentes en la sangre. Estos ligandos se pueden utilizar en una variedad de formas.
Una modalidad de la invención es una composición farmacéuticamente aceptable que comprende una fusión molecular que comprende un agente tolerogénico y una porción de ligación a eritrocitos que liga específicamente un eritrocito en el paciente, en donde la porción de ligación a eritrocitos se liga específicamente a una biomolécula elegida del grupo que consiste -de Band 3 (CD233), acuaporina-1, Glut-1, antigeno Kidd, RhAg/Rh50 (CD241), Rh (CD240), Rh30CE (CD240CE), Rh30D (CD240D), Kx, glicoforina B (CD235b), glicoforina C (CD235c), glicoforina D (CD235d), Kell (CD238), Duffy/DARCi (CD234), GR1 (CD35), DAF (CD55), Globósido, CD44, ICAM-4 (CD242), Lu/B-CAM (CD239), XG1/XG2 (CD99), EMMPRIN/neurotelina (CD 147), JMH, Glicosiltransferasa, Cartwright, Dombrock, C4 A/CAB, Scianna, MER2, estomatina, BA-1 (CD24), GPIV (CD36), CD 108, CD 139, y antigeno H (CD 173).
Una modalidad de la invención es una composición farmacéuticamente aceptable que comprende: una porción de ligación a eritrocitos unida a un dominio que liga específicamente un objetivo, por ejemplo, una proteína que comprende un agente tolerogénico. Uno o ambos de estos dominios puede ser un ligando peptídico o un anticuerpo o fragmento de anticuerpo.
Otra modalidad es una composición farmacéuticamente aceptable para el uso en el agotamiento del anticuerpo de otra manera la remoción de anticuerpo de la circulación en un paciente. La composición tiene una porción de ligación a eritrocitos unida ^a un antígeno, por ejemplo, un autoantigeno nativo o una antígeno para una proteína terapéutica.
BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS Las Figuras la y Ib muestran el esquema experimental y resultados para la fusión molecular de ERY1 y ovalbúmina (OVA), en donde la fusión ERYl-OVA liga la periferia ecuatorial de eritrocitos de ratón; con alta afinidad, esquemática del panel; Figura la, Esquemática de conjugación del péptido ERY1 a ovalbúmina (OVA), que da por resultado la ligación a la glicoforina-A de superficie de eritrocitos; Figura Ib, Ligación de cada conjugado OVA e intermediario, caracterizado por la citometría de flujo; histograma rellenado en negro, ERYl-OVA; histograma vacio, SMCC-OVA; histograma punteado, MIS-OVA; ERY1 - péptido de ligación a eritrocitos WMVLPWLPGTLD (SEQ ID NO: 1), MIS = péptido no coincidente PLLTVGMDLWPW (SEQ ID NO:2), SMCC sulfosuccinimidil-4-(N-maleimidometil)-ciclohexano-1-carboxilato, utilizado para conjugar ERY1 a OVA; Panel (c) Ligación de Equilibrio de ERYl-OVA a eritrocitos que muestran la constante de disociación baja de ERY1 -OVA (R2 = 0.97, ligación de un sitio), determinada por citometría de flujo.
Las Figuras 2a, 2b, 2c, 2d, 2e., 2f, 2g, 2h, 2i, 2j y 2k son un montaje de los resultados que muestran que la ligación a eritrocitos induce la tolerancia a la estimulación con antígeno: Figura 2a, El modelo de tolerancia de transferencia adoptiva de células T OTI CD8+, que muestra el protocolo experimental para experimentación asi como la estimulación y grupos de control sin tratamiento (n = 5); Figura 2b, Detección por citometria de flujo de poblaciones de células T OTI CD8+ (CD3+ CD8a+ CD45.2+); Figura 2c, cuantificación de población de células T OTI CD8+ en los ganglios linfáticos de drenaje (inguinales y poplíteos) 4 después de la estimulación con antigeno en ratones CD45.1+ (** P < 0.01); Figura 2d, Detección por citometria de flujo de células T OTI CD8+ que expresan IFNy; Panel (e) células T OTI CD8+ que expresan IFNy en los ganglios linfáticos de drenaje 4 d después de la estimulación con antígeno y re-estimulación con péptido SIINFEKL (SEQ ID NO:3) (** P < 0.01); Figura 2f, concentraciones de IFNy en el medio de cultivo de células de ganglios linfáticos 4 d después de la estimulación con péptido SIINFEKL (SEQ ID NO:3), determinado por el ELISA (** P < 0.01); Figura 2g, concentraciones de IL-10 en el medio de cultivo de células de ganglios linfáticos 4 d después de la re-estimulación con OVA, determinado por el ELISA (* P < 0.05). Los datos representan media ± mínimo a máximo; Figura 2h, títulos IgG de suero específicos de OVA en el día 19, (* P < 0.05) los datos representan media ± SE; Figura 2i, la combinación de modelo de tolerancia de tumor de timoma EL4 (E.G7-0VA) que expresa OTI y OVA que muestra el protocolo experimental para la experimentación así como los grupos de control (n— 4, 3, respectivamente); Figura 2j, Cuantificación de células T OTI CD8+ no de proliferación (generación 0) que circulan en la sangre 5 d después de la transferencia adoptiva; los da tos representan media ± mínima a máximo (** P < 0.01); Figura 2k, perfil de crecimiento de tumores E.G7-OVA, inyectados subcutáneamente 9 d después de la transferencia adoptiva OTI, los datos representan media + SE (* P < 0.05).
La Figura 3 es una gráfica de barrar que muestra como la ligación a eritrocitos atenúa las respuestas humorales específicas de antígeno en ratones C57BL/6. La detección de IgG específica de OVA en suero .19 días después de las dos administraciones de 1 yg OVA o 1 yg de ERY1-OVA 6 d aparte en los ratones C57BL/6 (* P < 0.05).
Las Figuras 4A y 4B presentan resultados experimentales en donde PEG-ERY1 de 8 brazos liga eritrocitos in vítro e in vivo; Figura 4A, PEG-ERY1 de 8 brazos (histograma rellenado en negro), pero no PEG-MIS de 8 brazos (histograma rellenado en gris) o PEG-piridildisulfuro de 8 brazos se liga a eritrocitos de ratón después de la incubación in vitro; Figura 4B, PEG-ERY1 de 8 brazos (histograma rellenado en negro), pero no PEG-MIS de 8 brazos (histograma rellenado en gris) se ligan a eritrocitos circulantes en la inyección intravenosa.
La Figura 5 presenta resultados experimentales que representan la vida media de la superficie celular de eritrocitos de PEG-ERY18 brazos (circuios rellanados) y PEG-MIS de 8 brazos (casillas vacias), determinadas por la citometria de flujo.
La Figura 6 presenta resultados experimentales como una gráfica de barra que muestra la ligación de ligandos peptídicos a eritrocitos humanos.
La Figura 7 presenta resultados experimentales como un histograma de citometria de flujo. Los eritrocitos de ratón se incubaron con TER119-SIINFEKL (histograma rellenado en gris) o albumen (histograma vacio). La señal fluorescente proviene del anticuerpo anti-6xHis-PE utilizado en la detección del scFv.
La Figura 8 es una gráfica de los resultados experimentales que muestran las células T OT-I CD8 proliferantes en el bazo después de la administración intravenosa de: solución salina, OVA, ERY1-0VA, o TER119-SIINFEKL. **P<0.01, ***P<0.001 La Figura 9 es una gráfica de resultados experimentales que muestran la caracterización fenotipica de células OTI CD8 T después de la transferencia adoptiva y la administración intravenosa de: solución salina, OVA, ERY1-0VA, o TER119-SIINFEKL. Panel izquierdo: inducción de células OTI apoptóticas marcada por ligación de Anexina-V en citometría de flujo; Panel derecho: inducción de células OTI exhaustas marcada por la expresión de PD-1 en citometria de flujo.
La Figura 10 es una gráfica de resultados experimentales que muestran la caracterización de células (IFNy+) OTI T inflamatorias en ganglios linfáticos que drenan el sitio de estimulación de ratones con tolerancia inducida con varias formulaciones de inyección, como se analizado por la citometría de flujo.
La Figura 11 es una gráfica de resultados experimentales que muestran títulos de IgG en suero específicos de asparaginasa (ASNasa) de ratones que reciben 2 o 6 dosis de ERYl-ASNasa o ASNasa de tipo natural, 21 días después de la administración, como se determina por el ELISA.
La Figura 12 es una gráfica de resultados experimentales que muestran la proliferación de células T CD4 del ratón N0DBDC2.5 transgénico en el co-cultivo con DCs esplénicas, con varios aditivos de medios.
La Figura 13 es una gráfica de resultados experimentales que muestran la cuantificación de células T N0DBDC2.5 CD4 no proliferantes después de la transferencia adoptiva y administración intravenosa de TERll9-ChrA, péptido 1040-p31 libre, o solución salina, como se determina por la citometría de flujo.
DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION Se proporcionan diseños moleculares para la tolerogénesis. La proteína u otro antígeno molecular al cual se busca la tolerancia se forma como un conjugado con una porción de litación a eritrocitos. La porción puede comprender un ligando peptídíco, un anticuerpo, un aptámero, o un fragmento de anticuerpo. El conjugado, también referido como una fusión molecular, puede ser una proteína de fusión o puede implicar un ligador, por ejemplo, un polímero o micela de polímero o conjugado de nanopartícula de polímero.
Los péptidos que se ligan específicamente a eritrocitos se describen en la presente. Estos se proporcionan como ligandos peptídicos que tienen secuencias que ligan específicamente, o como anticuerpos o fragmentos de los mismos que proporcionan ligación específica, a eritrocitos. Los péptidos se pueden preparar como fusiones moleculares con agentes terapéuticos, antígenos tolerizantes, o péptidos objetivo. Los agentes terapéuticos pueden tener ventajosamente una vida media circulante incrementada in vivo cuando son parte de la fusión. La inmunotolerancia se puede crear mediante el uso de las fusiones y elección de un antígeno en una sustancia para la cual se desea la tolerancia. El término antígeno, en este contexto, significa el antígeno de tamaño completo, un fragmento antigénico del mismo, o un mimético del antigeno tolerogénico. Las fusiones con péptidos objetivo dirigen las fusiones al objetivo, por ejemplo un tumor, donde los ligandos de ligación a eritrocitos reducen o eliminan completamente el flujo sanguíneo al tumor al reclutar eritrocitos al objetivo. Secuencias peptídicas que ligan específicamente eritrocitos Los péptidos que ligan específicamente eritrocitos se han descubierto y reportado por el solicitante en PCT/US2011/047078., incluyó un péptido referido como ERY1 que se liga específicamente a un eritrocito. Seis péptidos (ERY19, ERY59, ERY64, ERY123-, ERY141 y ERY162) que se ligan específicamente a eritrocitos humanos también se reportaron. El ejemplo 9 detalla como los ligandos peptídicos (ERY64, ERY123, y ERY141) se hicieron parte de una proteína de fusión con un reportero de proteína fluorescente y retuvieron sus propiedades de ligación específicas. Una modalidad de la invención es un polipéptido sustancialmente puro que comprende una secuencia de aminoácidos de ERY1, o uno de los péptidos de eritrocitos humanos, o una sustitución conservadora de los mismos, o un ácido nucleico que codifica los mismos. Tales polipéptidos ligan específicamente eritrocitos y son un ligando para los mismos. El ligando es un término que se refiere a una porción química que tiene ligación específica a una molécula objetivo. Un objetivo se refiere a una molécula predeterminada, tejido, o ubicación que el usuario propone ligar con el ligando. De esta manera la administración objetiva a un tejido se refiere a administrar una molécula u otro .material como una célula al tejido objetivo propuesto. Por consiguiente, las modalidades incluyen moléculas o composiciones que comprenden por lo menos uno de los ligandos descritos en la presente que se utilizan para ligarse a un eritrocito. La actividad de ligación de un polipéptido a un eritrocito se puede determinar simplemente al seguir los protocolos experimentales como se describe en la presente. La utilización de tales métodos, las resistencias de ligación de las variantes de polipéptido relativas a ERY1 o un péptido de ligación a eritrocito humano bajo condiciones fisiológicas dadas se puede determinar, por ejemplo, las secuencias fabricadas utilizando sustituciones conservadoras, adición o remoción de grupos de flanqueo, o cambios o adiciones para ajustar la solubilidad de secuencia en la solución acuosa. Los ligandos peptídicos se pueden generar específicamente para uno o más de los siguientes objetivos o grupos de objetivos; una molécula de superficie de eritrocitos (proteína, glicoproteína), Banda 3 (CD233), una glicoforina, más particularmente glicoforina A (CD235a), glicoforina B (CD235b), glicoforina (CD235c> y glicoforina D (CD235d), acuaporina-1, Glut-1, -antigeno Kidd, RhAg/Rh50 (CD241), Rh (CD240), Rh30CE (CD240CE), Rh30D (CD240D), Kx, Kell (CD238), Duffy/DARC (CD234), CR1 (CD35), DAF (CD55), Globósido, CD44, ICAM-4 (CD242), Lu/B-CAM (CD239), XG1/XG2 (CD99), EMMPRIN/neurotelina (CD147), JMH, Glicosiltransferasa, Cartwright, Dombrock, C4A/CAB, Scianna, MER2, estomatina, BD-1 (CD24), GPIV (CD36), CD108, CD139, y antígeno H (CD173).
Las proteínas de superficie celular de eritrocitos, ya sea preparaciones purificadas o una mezcla de ellas, se pueden clasificar para ligandos peptídicos. Las proteínas de superficie celular de eritrocitos se pueden expresar recombinantemente en su forma completa o corno dominios parciales fusionados a etiquetas que potencian la expresión o estabilidad de la proteína. El objetivo de proteína recombinante luego se puede inmovilizar sobre una placa o cuenta, y se utiliza como el objetivo de afinidad para el proceso de clasificación de bibliotecas. Las proteínas de superficie celular de eritrocitos también se puede aislar de preparaciones celulares de sangre entera, de la cual las mezclas purificadas o complejas de proteínas de membrana se pueden inmovilizar sobre una matriz sólida (cuenta, placa, u otras), y se utilizan como objetivos de afinidad para el proceso de clasificación. El proceso de clasificación completo se puede - llevar a cabo en presencia de una concentración alta de albúmina de suero (por ejemplo, 50 mg/mL) y a 37°C para reducir eventos de ligación específicos y para seleccionar péptidos con características de ligación favorables en el suero de sangre. Los ligandos peptídicos se seleccionan de manera más preferente de Banda 3 (CD233), glicoforina B (CD235b), glicoforina C (CD235c) y glicoforina D (CD235d).
Se observaron ligandos peptídicos que ligan las superficies celulares de eritrocitos sin alterar la morfología celular y sin translocación citoplásmica. Los ligandos se distribuyeron a través de la superficie celular y estuvieron libres de la agrupación. La glicoforina-A (GYPA) fue una proteína específica identificada como el objetivo de ERY-1. ERY-1 fue reactiva solo con especies de ratones y ratas. Los ligandos peptídicos que ligan específicamente eritrocitos humanos se determinaron por ser específicos para eritrocitos humanos y no a otra especie. Se reportó un clon fago que muestra un péptido de lata afinidad, WMVLPWLPGTLD (SEQ ID NO:l llamado en la presente ERY1) hacía la superficie celular de eritrocitos de ratón. Otros experimentos se identificaron ligandos de ligación para eritrocitos humanos como se muestra en las Tablas 1-2. Seis secuencias se ligaron específicamente a eritrocitos humanos. Una séptima secuencia, llamada ERY50, se ligó a eritrocitos humanos y también se ligó a células epiteliales/endotelial.
Tabla 1: Ligandos peptidicos que se ligan a eritrocitos humanos Las porciones de secuencia subrayadas indican secuencias ligadoras Tabla 2: Ligandos peptidicos que se ligan a eritrocitos de ratón o humanos *no especifico para eritrocitos **para ratón Las modalidades de la invención incluyen péptidos que se ligan específicamente a la superficie de los eritrocitos. Las secuencias no se utilizaron para la longitud mínima. Tal optimización está dentro de la experiencia de la téenica y se puede practicar utilizando técnicas descritas en la presente.
Por ejemplo, Kenrick y colaboradores (Protein Eng. Des. Sel. (2010) 23(1):9—17) clasificaron una biblioteca de 15 residuos y luego identificaron residuos de 7 secuencias de ligación mínima en longitud. Getz (ACS Chem. Biol., May 26, 2011 identificó dominios de ligación mínimos tan pequeños como 5 residuos en longitud. Los péptidos de ligación a eritrocitos pueden estar presentes en repeticiones de las mismas secuencias, por ejemplo, entre 2 y 20 repeticiones; los artífices apreciarán inmediatamente que todos los intervalos y valores dentro de los intervalos explícitamente establecidos se contemplan. Por otra parte, los péptidos pueden estar presentes en combinación, con dos o más secuencias distintas que están en el mismo péptido o son parte de una fusión molecular individual.
El número de residuos consecutivos que proporcionan la ligación específica se espera que esté entre aproximadamente 4 y 12 residuos. Por consiguiente, se describen todos los péptidos de cuatro residuos consecutivos en longitud encontrados en la Tabla 2, así como en todos los péptidos de, por ejemplo, 5, 6, 7, u 8 residuos consecutivos. Este número se basa en el número de residuos para otros ligandos de ligación a proteínas peptídicos. Las modalidades de la invención incluyen secuencias de longitud mínima para una de las SEQ IDs de ligación a eritrocitos expuesta en la presente, incluyendo Tabla 1. Por consiguiente, ciertas modalidades se dirigen a una composición que comprende un péptido o un péptido aislado (o purificado), que comprende un numero de secuencias de aminoácidos consecutivas entre 4 y 12 residuos de aminoácidos consecutivos de una secuencia elegida del grupo que consiste de SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID N0:15, SEQ ID N0:16, SEQ IDNO:17, SEQ ID NO:l, y sustituciones conservadoras de las mismas, en donde la secuencia se liga específicamente a un eritrocito. Alternativamente el número de residuos consecutivos se pueden elegir para estar entre aproximadamente 5 y aproximadamente 18; los artífices apreciaran inmediatamente que todos los intervalos y valores dentro de los intervalos explícitamente establecidos se contemplan, por ejemplo, 7, 8, 9, 10, o de 8 a 18. La secuencia de ligación a eritrocitos puede tener, por ejemplo, una sustitución conservadora de por lo menos uno o no más de dos aminoácidos de las secuencias, o 1, 2, o 3 sustituciones, o entre 1 y 5 sustituciones. Por otra parte, la sustitución de L-aminoácidos en la secuencia descubierta con los D-aminoácidos se puede lograr frecuentemente, como en Giordano. El péptido o composición puede, en algunas modalidades, consistir esencialmente de una secuencia elegida del grupo que consiste de SEQ ID-NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:l.
El péptido se puede limitar en longitud, por ejemplo, teniendo una variedad de residuos entre aproximadamente 10 and y aproximadamente 100; los artífices apreciarán inmediatamente que todos los intervalos y valores dentro de los intervalos explícitamente establecidos se contemplan, por ejemplo, de aproximadamente 10 a aproximadamente 50 o aproximadamente 15 a aproximadamente 80. Una porción de ligación a eritrocitos peptídica se puede proporcionar que comprende un ligando peptídico que tiene una constante de disociación de entre aproximadamente 10 mM y 0.1 nM como se determina por las mediciones de ligación de equilibrio entre el peptídico y los eritrocitos; los artífices apreciarán inmediatamente que todos los intervalos y valores dentro de los intervalos explícitamente establecidos se contemplan, por ejemplo, de aproximadamente 1 mM a aproximadamente InM. El péptido puede comprender además un agente terapéutico. El agente terapéutico puede ser, por ejemplo, una proteína, un producto biológico, un fragmento de anticuerpo, un ScFv, o un péptido. El péptido puede comprender además un antígeno tolerogénico, por ejemplo, una proteína humana utilizada en un humano deficiente de esta proteína (por ejemplo, factores de sangre tales como el factor VIII o factor IX), proteínas con glicosilación no humana, proteínas sintéticas no encontradas naturalmente en humanos, alérgenos alimenticios humanos, o antígenos autommunitarios humanos.
Los polipéptidos de varias longitudes se pueden utilizar como apropiados para la aplicación particular. En general, los polipéptidos que contienen las secuencias de ligando de polipéptido mostrarán ligación especifica si el polipéptido está disponible para interacción con los eritrocitos in vivo. Los péptidos que tienen el potencial para desplegarse se pueden someter a prueba utilizando métodos descritos en la presente. Por consiguiente, ciertas modalidades se dirigen a polipéptidos que tienen un ligando de polipéptido pero no se presenta en la naturaleza, y ciertas otras modalidades se dirigen a polipéptidos que tiene longitudes particulares, por ejemplo, de 6 a 3000 residuos, o 12-1000, o 12-100, o 10-50; los artífices apreciarán inmediatamente que cada valor e intervalo dentro de los límites explícitamente articulados se contemplan.
Ciertas modalidades proporcionan varias secuencias de polipéptidos y/o polipéptidos purificados o aislados. Un polipéptido es un término que se refiere a una cadena de residuos de aminoácidos, sin considerar la modificación pos-traduccional (por ejemplo, fosforilación o glicosilación) y/o formación en complejos con polipéptidos adicionales, síntesis en los complejos de múltiples subunidades, con ácidos nucleicos y/o carbohidratos, u otras moléculas. Los proteoglicanos por lo tanto también son referidos en la presente como polipéptidos. Como se utiliza en la presente, un "polipéptido funcional" es un polipéptido que es capaz de promover la función indicada. Los polipéptidos se pueden producir por una variedad de métodos, muchos de los cuales son bien conocidos en el campo. Por ejemplo, los polipéptidos se pueden obtener por extracción (por ejemplo, de células aisladas), por expresión de un ácido nucleico recombinante que codifica el polipéptido, o por sintesis química. Los polipéptidos se pueden producir por, por ejemplo, teenología recombinante, y vectores de expresión que codifican el polipéptido introducido en las células hospederas (por ejemplo, por transformación o transfección) para la expresión del polipéptido codificado.
Existe una variedad de cambios conservadores que se pueden hacer generalmente a una secuencia de aminoácidos sin alterar la actividad. Estos cambios son llamados sustituciones conservadoras o mutaciones; es decir, un aminoácido que pertenece a un agrupamiento de aminoácidos que tienen un tamaño o .característica particular se pueden sustituir para otro aminoácido. Los sustitutos para una secuencia de aminoácidos se pueden seleccionar de otros miembros de la clase a la cual el aminoácido pertenece. Por ejemplo, los aminoácidos no polares (hidrofóbicos) incluyen alanina, leucina, isoleucina, valina, prolina, fenilalanina, triptófano, metionina, y tirosina. Los aminoácidos neutros polares incluyen glicina, serina, treonina cisteína, tirosina, asparagina y glutamina. Los aminoácidos positivamente cargados (básicos) incluyen arginina, lisina e histidina. Los aminoácidos negativamente cargados (ácidos) incluyen ácido aspártico y ácido glutámico. Tales alteraciones no se espera que afecte sustancialmente el peso molecular evidente como se determina por la electroforesis en gel de poliacrilamida o el punto isoeléctrico. Las sustituciones conservadores también incluyen la sustitución de isómeros ópticos de las secuencias por otros isómeros ópticos, específicamente de D-aminoácidos para L-aminoácidos para uno o más residuos de una secuencia. Por otra parte, todos los aminoácidos en una secuencia pueden someterse a una sustitución de isómeros de D a L. Sustituciones conservadoras ejemplares incluyen, pero no se limitan a, Lis para Arg y viceversa para mantener una carga positiva; Glu para Asp viceversa para mantener una carga negativa; Ser para Thr de modo que se mantiene un OH libre; y Gln para Asn para mantener un NH2 libre. Por lo otra parte, las mutaciones puntuales, supresiones e inserciones de las secuencias de polipéptidos o secuencias de ácidos nucleicos correspondientes en algunos casos se pueden hacer sin una pérdida de función del fragmento de polipéptido o ácido nucleico. Las sustituciones pueden incluir, por ejemplo, 1, 2, 3, o más residuos. Los residuos de aminoácidos descritos en la presente emplean-ya sea el designador de aminoácido e una letra o la abreviación de tres letras. Las abreviaciones utilizadas en la presente están en consonancia con la nomenclatura del polipéptido estándar, J. Biol. Chem., (1969), 243, 3552-3559. Todas las secuencias de residuos de aminoácidos se representan en la presente por las formulas con orientación izquierda y derecha en la dirección convencional del amino-terminal para carboxi-terminal.
En algunos casos una determinación del porcentaje de identidad de un péptido o una secuencia expuesta en la presente puede ser requerida. En tales casos, el porcentaje de identidad se mide en términos de número de residuos de péptido, o una porción del péptido. Un polipéptido de, por ejemplo, 90% de identidad, también puede ser una porción del péptido más grande.
El término purificado como se utiliza en la presente con referencia a un polipéptido se refiere a un polipéptido que se ha sintetizado químicamente y de esta manera esta sustancialmente no contaminado por otros polipéptidos, o se ha separado o purificado .de otros componentes más celulares por los cuales se acompaña naturalmente (por ejemplo, otras proteínas celulares, polinucleótidos, o componentes celulares). Un ejemplo de un polipéptido purificado es uno que es por lo menos 70%, en peso seco, libre de las proteínas y moléculas orgánicas de origen natural con las cuales se asocia naturalmente. Una preparación de un polipéptido purificado por lo tanto puede ser, por ejemplo, por lo menos 80%, por lo menos 90%, o por lo menos 99%, en peso seco, el polipéptido. Los polipéptidos también se pueden diseñar para contener una secuencia de etiqueta (por ejemplo, una etiqueta de polihistidina, una etiqueta yc, o una etiqueta FLAGMR) que facilita el polipéptido a ser purificado o marcado (por ejemplo, capturado Sobre una matriz de afinidad, visualizado bajo un microscopio). De esta manera una composición purificada que comprende un polipéptido se refiere a un polipéptido purificado a menos que se indiqué de otra manera. El término aislado indica que los polipéptidos o ácidos nucleicos de la invención no están en su entorno natural. Los productos aislados de la invención de esta manera se pueden contener en un sobrenadante de cultivo, parcialmente enriquecido, producido de fuentes heterólogas, clonada en un vector o formulado con un vehículo, etc.
Los polipéptidos pueden incluir una modificación química, un término que, en este contexto, se refiere a un cambio en la estructura química de origen natural de los aminoácidos. Tales modificaciones se pueden hacer a una cadena lateral o a una terminal, por ejemplo, cambiar la amino-terminal o carboxi-terminal. En algunas modalidades, las modificaciones son útiles para crear grupos químicos que se pueden utilizar convenientemente para ligar los polipéptidos a otros materiales, o para unir un agente terapéutico.
Ligación específica, como ese término se utiliza comúnmente en las téenicas biológicas, se refiere a una molécula que se liga a un objetivo con una afinidad relativamente alta comparado con los tejidos no objetivo, e implica generalmente una pluralidad de interacciones no covalentes, tales como interacciones electrostáticas, interacciones de van der Waals, ligación de hidrógeno, y similares. Las interacciones de ligación específicas caracterizan la ligación de anticuerpo-antígeno, ligación de enzima-sustrato, e interacciones de proteína-receptor de ligación específica; mientras que tales moléculas pueden ligar tejidos además de sus objetivos de vez en cuando, tal como la ligación se dice que carece de especificidad y no es una ligación específica. El péptido ERY1 y sus derivados y los péptidos de ligación de eritrocitos humanos y sus derivados pueden ligar no eritrocitos en algunas circunstancias pero tal ligación se ha observado que no es específico, como es evidenciado por la ligación mucho más grande de los péptidos a los eritrocitos como es opuesto a otras células o proteínas.
De esta manera, los anticuerpos incluyen un ligando que se liga con especificidad a un eritrocito y no se liga específicamente a otros componentes de sangre, por ejemplo, uno o más de: proteínas de sangre, albúmina, fibronectina, plaquetas, glóbulos blancos, sustancialmente todos los componentes encontrados en una muestra de sangre tomada de un humano típico. En el contexto de una muestra de sangre, el término "sustancialmente todo" se refiere a los componentes que están típicamente presentes pero excluye componentes incidentales en concentraciones muy bajas de modo que no reducen de manera eficaz el titulo de los ligandos de otra manera biodisponibles.
Péptidos de anticuerpo Además de los péptidos que se ligan a eritrocitos, las proteínas también están presentes en la presente, específicamente anticuerpos y específicamente fragmentos de anticuerpo de cadena sencilla. Las téenicas para desarrollar un anticuerpo contra un antígeno son bien conocidas. El término antígeno, en este contexto, se refiere a un sitio reconocido por un sistema inmunitario hospedero que responde el antígeno. La selección de antígenos es conocida en las téenicas para desarrollar anticuerpos, entre otras técnicas. Las modalidades incluyen el uso de estos péptidos en una fusión molecular y otros métodos presentados en la presente. Los antigenos se pueden expresar recombinantemente en su forma completa o como dominios parciales fusionados a las etiquetas que potencian expresión o estabilidad de la proteina. El antigeno de proteina recombinante luego se puede inmovilizar sobre una placa o cuenta, y utilizar como el objetivo de afinidad para el proceso de clasificación de bibliotecas. Los antigenos también se pueden aislar de preparaciones celulares de sangre entera, de la cual las mezclas purificadas o formadas en complejo de las proteínas de membrana se pueden inmovilizar sobre una matriz sólida (cuenta, placa, u otra) y se utiliza como objetivos de afinidad para el proceso de clasificación.
Los artífices que leen esta descripción serán capaces de crear anticuerpos que se ligan específicamente a eritrocitos. Los ejemplos 5-6 se relacionan a la fabricación de anticuerpos o fragmentos de los mismos. Numerosas técnicas paralelas se utilizan para descubrir nuevos anticuerpos o fragmento de anticuerpo o para elaborar composiciones que comprenden tales fragmentos activos hacia los eritrocitos, incluyendo pero no limitado a expresión en fago, expresión de levadura y expresión bacteriana. Los anticuerpos de ligación a eritrocitos adicionales o fragmento de anticuerpo, o scFvs se pueden generar específicamente para uno o más de los siguientes objetivos o grupo de objetivos (colectivamente referidos en la presente como El Grupo Objetivo de Eritrocitos) elegidos del grupo que consiste de Band 3 (CD233), acuaporina-1; Glut-1, antígeno Kidd, RhAg/Rh50 (CD241), Rh (CD240), Rh30CE (CD240CE), Rh30D (CD240D), Kx, glicoforina A (CD235a), glicoforina B (CD235b), glicoforina C (CD235c), glicoforina D (CD235d), Kell (CD238), Duffy/DARC (CD234), CR1 (CD35), DAF (CD55), Globósido, CD44, ICAM-4 (CD242), Lu/B-CAM (CD239), XG1/XG2 (CD99), EMMPRIN/neurotelina (CDÍ47), JMH, Glicosiltransferasa, Cartwright, Dombrock, C4A/CAB, Scianna, MER2, estomatina, BA-1 (CD24), GPIV (CD36), CD108, CD139, y antigeno H (CD173).
Adicionalmente, los nuevos anticuerpos específicos de eritrocitos se pueden generar por inmunización de ratones con eritrocitos humanos intactos o preparaciones de proteínas. Después de la inmunización con el objetivo formulado en el adyuvante, los ratones se sacrifican en puntos de tiempo predeterminados y sus repertorios de anticuerpos se secuencian y/o sus células B se aíslan para clasificación basada en hibridoma. Estos anticuerpos o fragmentos de anticuerpos se pueden optimizar por varias téenicas in vitro mencionadas en lo anterior, para parámetros de ligación y/o estabilidad mejorados. Los anticuerpos de ligación a eritrocitos adicionales o fragmentos de anticuerpos se pueden generar al utilizar clones de hibridoma de anticuerpos descubiertos previamente para ligarse a eritrocitos. Se pueden generar, por ejemplo, al utilizar el método utilizado para generar el TER119 scFv. Como una plantilla, o como una fuente de anticuerpos, los siguientes clones de hibridomas se pueden utilizar, entre otros. BRIC 4, 5, 6, 10, 14, 18, 39, 66, 68, 69, 87, 108, 110, 111, 125, 126, 128, 145, 155, 157, 163, 170, 198, 203, 216, 220, 221, 222, 229, 230, 231, 235, o 256; BRAC 17, 18; BGRL 1, 2, 11, 100; BRAD 3; BIRMA D6, DIO, K3, 84B; 6A7; COE; o KZl.
El término péptido se utiliza intercambiablemente con el término polipéptido en la presente. Los anticuerpos y fragmentos de anticuerpos son péptidos. El término fragmento de anticuerpos se refiere a una porción de un anticuerpo que retiene la función de ligación a antigeno del anticuerpo. El fragmento se puede fabricar literalmente de una porción de un anticuerpo más grande o alternativamente se puede sintetizar de novo. Los fragmentos de anticuerpo incluyen, por ejemplo, un fragmento variable de cadena sencilla (scFv). Un scFv es una proteína de fusión de las regiones variables de las cadenas pesadas (VH) y ligeras (VL) de inmunoglobulina, conectadas con un péptido ligador, por ejemplo, de aproximadamente 10 a aproximadamente 50 aminoácidos. El ligador puede conectar ya sea la N-terminal de la VH con la C-terminal de la VL, o viceversa. El término scFv incluye scFvs divalentes, diacuerpos, tricuerpos, tetracuerpos y otras combinaciones de fragmentos de anticuerpo. Los anticuerpos tienen porción de ligación a antigeno referida como el paratopo. El término ligando peptídico se refiere a un péptido que no es una parte de un paratopo.
La ligación de eritrocitos, por los anticuerpos y fragmentos de los mismos, por ligandos de ligación peptidica, y por aptámeros, se puede llevar a cabo sin la ligación covalente a los eritrocitos. La ligación se puede llevar a cabo ín vivo y sin un evento de ligación a eritrocitos ex vivo. Este evento de ligación, incluyendo la asociación resultante de un antigeno con el eritrocito, se puede llevar a cabo sin provocar que los eritrocitos sean apoptóticos. El proceso se puede llevar a cabo de modo que las moléculas superficiales de los eritrocitos no se reticulan entre sí por un agente de reticulación y/o el evento de ligación, y no se reticulan por ligaciones covalentes.
Constructos de proteína biespeci fíeos para ligar antígenos a eri trocitos Cuando se crean constructos de proteínas que se ligan a eritrocitos, una opción de diseño principal es para crear una proteina individual o fusión molecular que contenga tanto el antigeno de interés como la porción de ligación a eritrocitos .
Un diseño alternativo que puede ser más eficiente en la producción y uso es una proteina biespecífica o constructo molecular que contiene un dominio que se liga a eritrocitos fusionados a un dominio adicional que se liga directamente o indirectamente al antigeno de interés. El antigeno actual de interés no se excluye en esta fusión molecular, solo una porción que se liga directamente o indirectamente al antigeno de iteres. Como tal, no existe un requisito para modificar o diseñar el antigeno de interés. Un ejemplo de tal diseño es un anticuerpo biespecifico o fragmento de anticuerpo, con un dominio de anticuerpo especifico para eritrocitos fusionado recombinantemente a un segundo dominio de anticuerpo que liga específicamente una biomolécula que tiene el antígeno de interés. Se implementan múltiples constructos de anticuerpos biespecífíeos diferentes, incluyendo pero no limitado a scFvs en tándem, diacuerpos, y moléculas scFv-IgG en tándem (62). Otros andamios no proteínicos también se utilizan, incluyendo nanoparticulas poliméricas u otros conjugados de polímero multivalentes, que se diseñan para especificidad doble al alojar un dominio que se liga al antígeno de interés, y otro dominio que se liga a eritrocitos.
Las porciones de afinidad del constructo biespecifico puede ser cualquier combinación de dominios de péptido y/o dominio de fragmentos de anticuerpos. Los péptidos que se ligan a eritrocitos o al antigeno de:proteína objetivo se obtienen con téenicas de clasificación de bibliotecas de péptidos convencionales, incluyendo, por ejemplo, cuenta o clasificación de bibliotecas de péptidos multiplexada, expresión en fago, expresión bacteriana y expresión de levadura. El péptido diseñado se caracteriza para especificidad y afinidad a su objetivo de ligación utilizando ensayos bioquímicos estándares, por ejemplo ELISA, resonancia de plasmones superficiales, y métodos basados en citometría de flujo. Los anticuerpos o fragmento de anticuerpos que se ligan a eritrocitos o al antígeno de proteína objetivo se obtienen utilizando técnicas convencionales, por ejemplo, métodos de selección basados en hibridoma, expresión en fago, expresión de levadura, expresión bacteriana, expresión ribosómica, o métodos de secuenciación basados en genes de anticuerpo o proteómica directos de animales inmunizados. El anticuerpo diseñado o fragmento de anticuerpos se caracteriza por especificidad y afinidad a su objetivo de ligación utilizando ensayos bioquímicos estándares, por ejemplo, ELISA, resonancia de plasmones superficiales, y métodos basados en citometría de flujo.
Después del descubrimiento y caracterización de cada porción de afinidad (péptido, anticuerpo, y/o dominio de anticuerpo), se fusionan para formar un constructo moléculas biespecifico utilizando téenicas de ADN recombinantes estándares tal como PCR de ensamblaje o síntesis génica directa, luego la proteína de fusión se expresa en un hospedero adecuado. Los constructos biespecífíeos también se crean al conjugar químicamente dos porciones individuales juntas en cualquier combinación considerada adecuadas para la ligación biespecífica (péptido-péptido, péptido-fragmento de anticuerpo, etc.). Los dominios de anticuerpos se utilizan para crear anticuerpos biespecífíeos utilizando varias arquitecturas del estado de la técnica (1). Adicionalmente, un andamio polimérico sintético (PEG, PPG, u otros) se utiliza para crear ligaciones estables entre cada porción de ligación y mejorar la flexibilidad del constructo. Los polímeros ramificados también se utilizan para incrementar la afinidad de ligación al eritrocito, al antígeno de proteína, o ambos por efectos de avidez.
La caracterización de la eficacia de ligación del constructo biespecifico se lleva a cabo utilizando ensayos de afinidad de ligación bioquímicos in vitro estándares, tal como ELISA y resonancia de plasmones superficiales. El desempeño in vivo del constructo biespecifico se lleva a cabo al inyectar el constructo biespecifico o el constructo biespecífico y el antígeno en un modelo animal tales como ratones o ratas, luego muestrea la sangre y someter a prueba tanto la ligación de eritrocitos y antigeno utilizando ensayos in vi tro.
Las modalidades incluyen una composición farmacéuticamente aceptable que comprende: una porción de ligación a eritrocitos unida a un dominio que se liga específicamente a un objetivo. El objetivo puede comprender una proteína, con la proteína que comprende además un antígeno tolerogénico. La porción de ligación a eritrocitos puede comprender un ligando peptídico, un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo, un dominio de ligación a antígeno de cadena sencilla (ScFv) o un aptámero. El dominio se puede elegir del grupo que consiste de un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo, y un dominio de ligación a antígeno de cadena sencilla (ScFv), un ligando peptídico y un aptámero. Una modalidad es una composición que comprende un miembro del grupo elegido de una fusión molecular, un scFv en tándem, un diacuerpo, una molécula scFv-IgG en tándem, con la porción de ligación a eritrocitos y el dominio que es parte del miembro. Una proteína de fusión individual o ácido nucleico que codifica la misma puede comprender el dominio de ligación a eritrocitos y el otro dominio que-liga el objetivo.
Agotamiento terapéutico de anticuerpos específicos de antígeno utilizando antígenos de ligación a eritrocitos La inducción de los anticuerpos específicos de antígeno es perjudicial al tratamiento y puede provocar efectos secundarios peligrosos durante las terapias de reemplazo de proteínas, en la patogénesis de autoinmunidad, y durante el tratamiento biológico en general (63-68). Las intervenciones terapéuticas capaces de agotar los anticuerpos específicos de antígeno circulantes en la sangre tendrían impacto clínico positivo, en que el agotamiento de tales anticuerpos específicos de fármacos habilitaría el tratamiento futuro con el fármaco mientras que disminuye el riesgo de efectos secundarios inmunológicos adversos debido a los complejos de fármaco-anticuerpo. En el caso ejemplar de la hemofilia-A, aproximadamente 30% de pacientes inducen anticuerpos anti fármaco hacia el Factor VIII de fármaco de proteína terapéutico estándar, haciendo de esta manera el tratamiento adicional con el Factor VIII peligroso e ineficaz. Una intervención terapéutica que agota los anticuerpos circulantes específicos del Factor VIII en tal paciente vuelven a permitir que el régimen del tratamiento del Factor VIII terapéutico, y evitan la necesidad de cambiar al paciente a otras alternativas del tratamiento más costosas y menos eficaces. En el caso ejemplar de lupus eritematoso sistémico (SLE, lupus), una enfermedad autoinmunitaria mediada principalmente por la inducción de anticuerpos hacia autoantígeno nativo en el cuerpo, un tratamiento terapéutico capaz de agotar los anticuerpos específicos de autoantígeno que circulan en la sangre disminuirían en gran medida la patogénesis y progresión del inicio de la enfermedad.
A fin de agotar los anticuerpos específicos de antígeno, los antígenos se diseñan para ligarse a eritrocitos circulantes después de la administración. Los constructos moleculares de una porción de ligación a eritrocitos fusionada al antígeno dé interés se crean para formar el antígeno de ligación a eritrocitos. Alternativamente, un constructo biespecífico se puede implementar para crear una formulación de ligación a eritrocitos del antígeno, como se describe en lo anterior. De esta manera, en la inyección del antígeno de ligación a eritrocitos, cualquier anticuerpo circulante específico para el antígeno se ligará al antígeno diseñado, y de esta manera se asociará estrechamente con un eritrocito circulante in situ. Durante la asociación física cercana de un anticuerpo específico de antígeno a una célula naturalmente circulante tal como el eritrocito, los efectos inmunes inflamatorios peligrosos se inhiben por señales reguladoras presentes en. el eritrocito. Los eritrocitos expresan varias moléculas reguladoras sobre su superficie, incluyendo CD55 y CD59,· entre otras (67). De esta manera, los anticuerpos específicos de antígeno permanecen ligados a los eritrocitos y circulan a las zonas de eliminación natural de los eritrocitos, durante los cuales se eliminan también. El eritrocito decorado con antígeno sirve un auto-depósito celular y un portador de agotamiento para el anticuerpo específico de antígeno.
El agotamiento de los anticuerpos específicos de antígeno se caracteriza in vivo después de la administración del constructo de antígeno diseñado, por muestreo periódico de sangre de los animales de prueba y al llevar a cabo téenicas de titulación de anticuerpos específicos de antígeno, tal como ELISAs. La supresión o activación especifica de l célula inmune secretora de anticuerpos (célula B, célula plasmática, u otra) también se caracteriza por el aislamiento de las células inmune de la sangre, medula ósea, baso, o sistema linfático de ratones recipientes y llevar a cabo ensayos ELISpots de células B de re-estimulaciones in vitro específicas de antígeno, y citometría de flujo de múltiples parámetros. En estudios relacionados a autoinmunidad, los modelos de ratón relevantes de trastornos autoin unitarios se utilizan para caracterizar los efectos de los antígenos de ligación a eritrocitos en el agotamiento de autoantígenos.
Los usos de las composiciones incluyen la remoción de los anticuerpos de circulación y/o ligación de ellos a los glóbulos rojos. Una modalidad es una composición farmacéuticamente aceptable que comprende: una porción de ligación a eritrocitos unida a un antigeno. El antigeno puede ser un autoantígeno nativo, por ejemplo, un antigeno de lupus eritematoso. El antigeno puede ser alternativamente un antigeno para una proteína terapéutica que se administra a un paciente, por ejemplo, un-antígeno de Factor VIII.
Aptámeros para ligación específica de eri troci tos Además de los ligandos peptídicos que ligan eritrocitos, se enseñan ligandos de aptámero de nucleótidos para componentes de superficie de eritrocitos. Por consiguiente, los aptámeros se van a fabricar y a utilizar como se describe en la presente para otras porciones de ligación a eritrocitos. Los aptámeros de ADN y ARN se pueden utilizar para proporcionar ligación de eritrocitos no covalente. Ya que solo se componen de nucleótidos, los aptámeros son porciones objetivo biomolecular prometedoras en que las metodologías de clasificación son bien establecidas, se sintetizan de manera fácil químicamente, y poseen toxicidad de efectos secundarios limitada y/o inmunogenicidad debido a su eliminación rápida in vivo (Keefe, Pai, y colaboradores, 2010). Adicionalmente, debido al carácter no canónico de la interacción de nucleótido-proteina objetivo, cualquier señalización de agonista productivo en la ligación a objetivo in vivo es improbable, contribuyendo de esta manera a baja inmunogenicidad y toxicidad. Como tal, las numerosas moléculas basadas en aptámeros están actualmente en ensayos clínicos humanos para una variedad de indicaciones clínicas, incluyendo leucemia, degeneración macular, trombosis, y diabetes tipo 2 (Keefe, Pai, y colaboradores, 2010). Los aptámeros también se han utilizado como agentes de objetivo para administrar cargas de fármacos a tejidos específicos in vivo, en aplicaciones tales como quimioterapia de cáncer y téenicas de detección de tumor de fluorescencia o radiológicas (Rockey, Huang, y colaboradores, 2011; Savia, Taratula, y colaboradores, 2011).
Los aptámeros son ácidos oligonucleicos o péptidos que se ligan a una molécula objetivo específica. Los aptámeros se crean usualmente para ligarse a un objetivo de interés al seleccionarlos de una acumulación de secuencia aleatoria grande. Los aptámeros se pueden clasificar co o aptámeros de ADN, aptámeros de ARN, o aptámeros peptídicos. Los aptámeros de ácidos nucleicos son especies de ácidos nucleicos que se han diseñado a través de rondas repetidas de selección in vi tro o el método de Evolución Sistémica de Ligandos por Enriquecimiento Exponencial (SELEX) (Archemix, Cambridge, MA, US) (Sampson, 2003) para ligarse específicamente a objetivos tales como moléculas pequeñas, proteínas, ácidos nucleicos, células, tejidos y organismos. Los aptámeros peptídicos tienen típicamente un dominio de péptido variable corto, unido a ambos extremos a un andamio de proteína. Los aptámeros de péptidos son proteínas que se diseñan para interferir con otras interacciones de proteínas dentro de las células. Consisten de un bucle de péptido variable unido en ambos extremos a un andamio de proteína. Esta limitación estructural doble incrementa en gran medida la afinidad de ligación del aptámero de péptido para ser comparable con un anticuerpo. La longitud del bucle variable se compone típicamente de aproximadamente diez a aproximadamente veinte aminoácidos, el andamio es una proteína que tiene buena solubilidad y es compacto. Por ejemplo, la proteína bacteriana Tioredoxina-A es una proteína de andamio, con el bucle variable que se inserta dentro del sitio activo reductor, que es un bucle -Cys-Gly-Pro-Cys- en la proteína natural, las dos cadenas laterales de Cisterna son capaces de formar un puente de disulfuro.
Algunas téenicas para fabricar aptámeros se detallan por Lu y colaboradores, Chem Rev 2009:109(5):1948-1998, y también en E.U.A. 7,892,734, E.U.A.7,811,809,: E.U.A.2010/0129820, E.U.A.2009/0149656, E.U.A.2006/0127929, y E.U.A.200770111222.
El Ejemplo 8 detalla adicionalmente materiales y métodos para elaborar y utilizar aptámeros para el uso con las modalidades descritas en la presente.
Fusión molecular Una fusión molecular se puede formar entre un primer ligando de ligación a eritrocitos peptidico y un segundo péptido. La fusión comprende los polipéptidos conjugados directa o indirectamente entre sí. Los polipéptidos se pueden conjugar directamente entre sí o indirectamente a través de un ligador. El ligador puede ser un péptido, un polímero, o aptámero, un ácido nucleico, o una partícula. La partícula puede ser, por ejemplo, una mieropartícula, una nanopartícula, un polimerosoma, liposoma, o una micela. El polímero puede ser, por ejemplo, natural, sintético, lineal o ramificado. Una proteína de fusión que comprende el primer péptido y el segundo péptido es un ejemplo de una fusión molecular de los péptidos, con la proteína de fusión que comprende los péptidos unidos directamente entre sí o con las secuencias ligadoras de intervención y/o secuencias adicionales en uno o ambos extremos. La conjugación al ligador puede ser a través de ligaciones covalentes. Otras ligaciones incluyen ligaciones iónicas. Los métodos incluyen preparar una fusión molecular o una composición que comprende la fusión molecular, en donde la fusión molecular comprenden péptidos que se ligan específicamente a eritrocitos y un agente terapéutico, agente tolerizante u otra sustancia.
El término fusión molecular, o al término conjugado, se refiere a la asociación directa o indirecta por las ligaciones químicas, incluyendo covalente, iónica, electrostática, carga-carga. La conjugación crea una unidad que es sostenida por la ligación química. La conjugación directa se refiere a la ligación química al agente, con o sin ligadores intermedios o grupos químicos. La conjugación indirecta se refiere a la ligación química a un portador. El portador puede encapsular en gran medida el agente, por ejemplo, un polimerosoma, un liposoma o micela o algunos tipos de nanopartículas, o tienen el agente sobre su superficie, por ejemplo, nanopartícula metálica o cuenta, o ambas, por ejemplo, una partícula que incluye algo del agente en su interior así como sobre su exterior. El portador también puede encapsular un antígeno para inmunotolerancia. Por ejemplo, se puede fabricar un polimerosoma, liposoma, o una partícula que encapsule el antígeno. El término encapsular significa cubrir completamente, de manera eficaz sin ninguna porción que se exponga, por ejemplo, puede fabricar un polimerosoma que encapsule un antígeno o un agente. Ejemplos de agentes terapéuticos son fragmentos variables de cadena sencilla (scFv) fragmentos de anticuerpo, fármacos de molécula pequeña, péptidos bioactivos, proteínas bioactivas y biomoléculas bioactivas.
La conjugación se puede lograr por la ligación covalente del péptido a otra molécula, con o sin el uso de un ligador. La formación de tales conjugados está dentro de la experiencia de los artífices y varias téenicas conocidas para lograr la conjugación, con la elección de la técnica particular que es guiada por los materiales a ser conjugados. La adición de aminoácidos al polipéptido (C- o N-terminal) que contiene en cadenas laterales ionizables, es decir acido aspártico, ácido glutámico, lisina, arginina, cisteína, histidina, o tirosina, y no está en contenidos en la porción activa de la secuencia de polipéptidos, sirven en su estado no protonado como un nucleófilo potente para acoplarse en varias reacciones de bioconjugación con los grupos reactivos unidos a los polímeros, es decir PEG homo- o hetero-bifuncional (por ejemplo, Lutolf and Hubbell, Biomacromolecules 2003;4:713-22, Hermanson, Bioconj uga te Techníques, London. Academic Press Ltd; 1996). En algunas modalidades, se utiliza un ligador de polímero adecuado, y se puede administrar un paciente en forma farmacéuticamente aceptable. O un fármaco se puede encapsular en polimerosomas o vesículas o unir covalentemente al ligando peptídico.
Una modalidad en uunnaa conjugación de un agente terapéutico de proteína y un ligando peptidico, anticuerpo, fragmente de anticuerpo, o aptámero que se liga específicamente a un eritrocito. La aplicación de la metodología de péptido de ligación eritrocitos no se restringe a la terapéutica de polipéptidos; más bien se puede traducir en otras formulaciones de fármacos, tales como moléculas pequeñas y partículas poliméricas. En la larga historia de las moléculas pequeñas y su aplicación en la medicina, las vidas medias de circulación breves y biodisponibilidad deficiente han plagado consistentemente su eficacia in vivo. _ Las micelas poliméricas y las nanopartículas representan una generación relativamente más nueva de clase de fármacos, todavía su comportamiento farmacocinético permanece sub-optimo por razones que incluyen una velocidad de eliminación alta a través de la acción del sistema reticuloendotelial (Moghimi and Szebeni, 2003). El diseño de ligación eritrocito se puede extender a estas otras clases de fármacos para incrementar sus vidas medias de circulación y la eficacia clínica.
El conjugado puede comprender una partícula. El péptido de ligación eritrocito se puede unir a la partícula. Un antígeno, agente u otra sustancia puede estar en o sobre la partícula. Ejemplos de nanopartículas, micelas, y otras partículas en común se encuentran en, por ejemplo, US 2008/0031899, US 2010/0055189, US 2010/0003338, las aplicaciones que se incorporan en la presente a manera de referencia en su totalidad para todos los propósitos, incluyendo la combinación de las mismas con un ligando como se expone en la presente; en case de conflicto, sin embargo, la presente especificación lo controlará.
Las nanoparticulas se pueden preparar como colecciones de partículas que tienen un diámetro promedio de entre aproximadamente 10 nm y aproximadamente 200 nm, incluyendo todos los intervalos y valores entre las ligaciones explícitamente articuladas, por ejemplo, de aproximadamente 20 aproximadamente 200, y de aproximadamente 20 aproximadamente 40, aproximadamente 70 o aproximadamente 100 nm, dependiendo de la polidispersidad que se produce por el método preparativo. Varios sistemas de nanoparticulas se pueden utilizar, tales como aquellos formados de copolímeros de poli(etilenglicol) y poli(ácido láctico), aquellos formados de copolímeros de poli(óxido de etileno) y poli(beta-aminoéster) y aquellos formados de proteínas tales como albúmina de suero. Otros sistemas de nanoparticulas son bien conocidos por aquellas personas experiencia en estos campos. Ver también Devalapalli y colaboradores., Cáncer Chemother Pharmacol . , 07-25-06; Langer y colaboradores., International Journal of Pharmaceutics, 257:169-180 (2003); y Tobío y colaborades., Pharmaceutical Research, 15(2):270-275 (1998).
Las partículas más grandes de más de aproximadamente 200 mn de diámetro promedio que incorporan los ligandos de ligación a tejido de cártilago también se puede preparar, con esas partículas que son llamadas micropartículas en la presente puesto que comienzan a aproximarse a la escala de miera y se encuentran aproximadamente dentro del límite de la resolución óptica. Por ejemplo, ciertas téenicas para fabricar micropartículas son expuestas en las patentes de E.U.A. Números 5,227,165, 6,022,564, 6,090,925, y 6,224,794.
La funcionalización de las nanopartículas para emplear la capacidad objetivo requiere asociación de polipéptido objetivo con la partícula, por ejemplo, por la ligación covalente utilizando una técnica de bioconjugaciones, con la elección de una técnica particular que es guiada por la partícula o nanopartícula, u otro constructo, que el polipéptido se va a unir. En general, muchas técnicas de bioconjugación para unir péptidos a otros materiales son bien conocidas y la técnica más adecuada se puede elegir para un material particular. Por ejemplo, los aminoácidos adicionales se pueden unir a las frecuencias de polipéptidos tales como una cisteína en caso de la unión del polipéptido a moléculas de tiol-reactivas.
Para crear una molécula multimérica capaz de mostrar moléculas bioactivas diferentes múltiples, un dendrímero PEG de 8 brazos comercialmente disponible se modificó químicamente para incluir grupos reactivos para facilitar las reacciones de conjugación. El PEG-piridildisulfuro de 8 brazos contuvo el grupo piridildisulfuro que reacciona fácilmente con tiolatos de moléculas pequeñas y/o péptidos que contienen cisteina o proteínas, dando por resultado una ligación de disulfuro entre la porción bioactiva unida y el andamio PEG de 8 brazos. La arquitectura multimérica del PEG de 8 brazos permitió la conjugación de diferentes péptidos o moléculas al andamio, creando de esta manera una biomolécula heterofuncionalizada con múltiples actividades en virtud de sus porciones unidas. Los constructos de PEG de 8 brazos fluorescentes heterobiofuncionalizados, capaces de ligarse a eritrocitos in vitro (Figura 4A) e in vivo (Figura 4B) fueron creados. Esta ligación fue la secuencia específica al péptido ERY1, como los conjugados que alojan el péptido MIS especifico mostró poca o nada de ligación a los eritrocitos la ligación in vivo fue de vida prolongada, ya que el PEG-ERY1-ALEXAFLUOR647 de 8 brazos fluorescente se detectó en los eritrocitos circulantes 5 horas después de la administración intravenosa, y mostro una vida media de superficie celular de 2.2 h (Figura 5). Para mostrar la inducción de la tolerancia en un modelo de ratón diabético autoinmune, un PEG de 8 brazos conjugado con tanto ERY1 como la cromogranina-D de antígenos de diabetes (CrA) fue creado. La naturaleza modular del andamio de PEG-piridildisulfuro de 8 brazos hiso posible co-conjugar diferentes moléculas que contienen tiol al agregar secuencialmente cantidades estequiométricamente definidas de las moléculas.
La función molecular puede comprender un polímero. El polímero puede ser ramificado o lineal. La función molecular puede comprender un dendrímero. En general, los polímeros biocompatibles hidrofílico solubles se pueden utilizar para que el conjugado sea soluble y sea biodisponible después de la introducción en el paciente. Ejemplos de polímeros solubles son alcoholes polivinílíeos, y minas de polietileno, y polietilenglicoles (un término que incluye óxidos de polietileno) que tienen un peso molecular de por lo menos 100, 400, o entre 100 y 400,000 (con todos los intervalos y valores entre estos valores explícitos que se contemplan). La solubilidad en este contexto se refiere a una solubilidad en agua o solución salina fisiológica de por lo menos un gramo por litro. Los dominios de polímeros biodegradables también se pueden utilizar, por ejemplo, ácido poliláctico, ácido poliglicólico, copolímeros de ácido poliláctico y poliglicólico, policaprolactonas, ácido polihidroxibutírico, poliortoésteres, poliacetalos, polidihidropiranos y policianoacilatos.
En algunas modalidades, una asociación de polipéptido-polímero, por ejemplo, un conjugado, se prepara y se introduce en el cuerpo como una composición purificada en una condición farmacéuticamente aceptable, o con un recipiente farmacéutico. El sitio de introducción puede ser, por ejemplo, sistémico, o en un tejido o un sitio de trasplante.
Los artífices pueden preparar proteínas de fusión utilizando téenicas .conocidas en estos campos. Las modalidades incluyen preparar proteínas de fusión, aislarlas, y administrarlas en una forma farmacéuticamente aceptable con o sin otros agentes, por ejemplo, en combinación con una interleucina de TGF-beta. Las modalidades incluyen un vector para, y métodos de, transfectar una célula para diseñar de esta manera la célula para fabricar la proteína de fusión in vivo, con la célula que se transfecta in vitro, ex vivo, o in vivo, y con la célula que es un miembro de un implante de tejido o forma distinta. Las siguientes solicitudes de patente de E.U.A. se incorporan en la presente de manera de referencia en la presente para todos los propósitos, incluyendo los propósitos para fabricar proteínas de fusión, con la presente especificación que controla en caso de conflicto; 5227293, 5358857, 5885808, 5948639, 5994104, 6512103, 6562347, 6905688, 7175988, 7704943, E.U.A. 2002/0004037, E.U.A. 2005/0053579, E.U.A. 2005/0203022, E.U.A. 2005/0250936, E.U.A.2009/0324538.
Las modalidades de una fusión molecular incluyen, por ejemplo, una fusión molecular que comprende un antigeno tolerogénico y una porción de ligación eritrocitos que liga específicamente un eritrocito en el paciente y liga de esta manera el antigeno eritrocito, en donde la fusión molecular se administra en una cantidad efectiva para producir inmunotolerancia a una sustancia que comprende el antígeno tolerogénico. Las modalidades incluyen, por ejemplo, una composición que comprende una porción de ligación eritrocitos que liga específicamente un eritrocito unido a un portador elegido del grupo que consiste de un polímero, un polímero ramificado, y una partícula, en donde el portador se une a un agente terapéutico. La partícula puede ser, por ejemplo, una micropartícula, una nanopartícula, un polimerosoma, un liposoma, o una micela. La porción de ligación eritrocitos puede comprender un péptido que comprende por lo menos 5 residuos de aminoácidos consecutivos de una secuencia elegida del grupo de consiste de SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:1, y sustituciones conservadoras de las mismas, en donde la secuencia liga específicamente un eritrocito. La porción de ligación eritrocito puede comprender un anticuerpo, fragmento de anticuerpo, aptámero, scFv o ligando peptídico. Las modalidades de una fusión molecular incluyen una porción de ligación a eritrocito y un antigeno tolerogénico con un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo, un ScFv, un fármaco de molécula pequeña, una partícula, una proteína, un péptido o un aptámero.
En un aspecto preferido de la invención se proporciona una fusión molecular que comprende un antígeno tolerogénico y una porción de ligación a eritrocitos seleccionada de la banda 3 (CD233), glicoforina B (CD235b), glicoforina C (CD235c) y glicoforina D (CD235d). La función molecular es particularmente para el uso en la producción de inmunotolerancia. Una fusión molecular preferida es una que comprende un antígeno tolerogénico seleccionado de: una proteína, una porción de una proteína, una proteína humana o porción de la misma, una proteína no humana o porción de la misma, un glicano, un glicano de una proteína que comprende glicosilación no humana, un antígeno autoinmunitario humano, un agente terapéutico de proteína para un humano o porción del mismo, y una porción de un alimento humano, proteínas deficientes por enfermedad genética, proteínas con glicosilación humana, proteínas no humanas, proteínas sintéticas encontradas no naturalmente en humanos, antígenos alimenticios humanos, antigenos de trasplante humanos y antígenos autoinmunitarios humanos; y una porción de ligación eritrocito seleccionada de banda 3 (CD233), glicoforina B (CD235b), glicoforina C (CD235c), glicoforina D (CD235d). Ligandos de ligación a eri troci tos para farmacocinetica mejorada .
Ya que muchos fármacos se administran sistémicamente al sistema circulatorio sanguíneo, la respuesta al problema de la efectividad de la administración de fármacos se enfoca frecuentemente en el mantenimiento del fármaco en la sangre durante periodos de tiempos prolongados. De esta manera, el desarrollo de agentes terapéuticos de circulación prolongada (vida media prolongada) que permanecen biológicamente disponibles en la sangre por periodos de tiempo prolongados representara una nueva generación de fármacos diseñados para eficacia, seguridad, y factibilidad económica.
Las modalidades de la invención incluyen funciones moleculares de un péptido de ligación a eritrocitos y un agente terapéutico. Las funciones moleculares entre los péptidos que se ligan específicamente a eritrocitos y un agente terapéutico u otras sustancias proporcionan un tiempo de circulación incrementado (vida media de circulación en la sangre in vivo) para el agente/sustancia. El incremento puede ser, por ejemplo de aproximadamente 1.5 veces a 20 veces de incremento en la vida media en suero, a los artífices apreciaran inmediatamente que todos los intervalos y valores dentro de los intervalos específicamente estables y se contemplan, por ejemplo, de aproximadamente 3 veces o aproximadamente 6 veces o entre aproximadamente 3 veces y aproximadamente 6 veces.
Las funciones moleculares se pueden lograr por, por ejemplo, adición recombinante del péptido o adición del péptido por conjugación química a un sitio reactivo en el agente terapéutico o molécula o partícula asociada. Ya que la síntesis de péptidos de fasé solida se puede utilizar para sintetizar alto rendimientos de péptido puro con grupos reactivos terminales variantes, existen múltiples estrategias de conjugación para la unión del péptido en el agente terapéutico. Aunque este método de funcionalización difiere con el método recombinante utilizado con las proteínas, el efecto (la ligación a eritrocitos que conduce a la vida media de circulación incrementada) se postula para hacer la misma.
Una modalidad de la invención implica la funcionalización de los agentes terapéuticos con ligandos peptídicos cortos que se ligan específicamente a eritrocitos como herramientas para las mejoras de los parámetros farmacocinéticos de los agentes terapéuticos. Esta metodología de extensión de vida media toma en consideración parámetros fundamentales en el diseño de fármaco terapéutico, particularmente la simplicidad en la fabricación, modularidad, y la capacidad de afinar el efecto de extensión. Utilizando téenicas de ADN recombinantes estándares, las proteínas se alteran fácilmente en nivel de aminoácido para contener funcionalidades nuevas o alteradas. Generalmente dependiendo del uso de los dominios de péptido más cortos para la función es preferible utilizar dominios de polipéptido más grandes, por razones que incluyen la facilidad de en la fabricación, plegamiento correcto en una proteína terapéutica funcional, y alteraciones biofísicas mínimas a la terapéutica original misma. Los polipéptidos, por ejemplo, ERY1, un ligando de ligación eritrocitos humano, o anticuerpos o fragmentos de anticuerpo se pueden diseñar para ligarse específicamente a eritrocitos y conjugar a un agente terapéutico para prolongar la disponibilidad como por ejemplo, como es medido por la vida media circulante de agente.
Los resultados reportados en la presente proporcionan oportunidades para fabricar funciones moleculares para mejorar los parámetros farmacocinéticos de los agentes terapéuticos tales como insulina, acetato de pramlintida, hormona de crecimiento, factor de crecimiento-1 similar a insulina, eritropoyetina, alfa- interferón tipo 1, interferón a2a, interferón a2b, interferón ía, interferón b?o, interferón ylb, b-glucocerebrosidasa, adenosina desaminasa, factor de estimulación de colonia de granulocitos, factor de estimulación de colonia de macrófagos de granulocitos, interleucina 1, interleucina 2, interleucina 11, factor Vlla, factor VIII, factor IX, exenatida, L-asparaginasa, rasburicasa, receptor de factor de necrosis tumoral, y enfuvirtida.
Los intentos por otros para crear métodos de mejora de vida media pasiva se enfocan en el incremento del radio hidrodinámico evidente del fármaco. El aparato de filtración glomerular del riñón es el sitio principal en el cuerpo donde se filtran los componentes de la sangre. El determinante principal de la filtración es el radio hidrodinámico de la molécula en la sangre; molécula más pequeñas (<80 kDa) se filtran de la sangre a un grado más alto que las moléculas más grandes. Los investigadores han investigado esta regla generalizada para modificar los fármacos para mostrar un radio hidrodinámico más grande y de esta manera vida media más prolongada, principalmente a través de la conjugación química a polímeros solubles en agua de peso molecular grande, tal como polietilenglicol (PEG). El éxito de este método es evidente en las numerosas terapias de proteínas PEGiladas y de moléculas pequeñas ofrecidas actualmente en la clínica (Pasut and Veronese, 2009; Fishburn, 2008). Aunque es efectiva en muchos casos incrementa la vida media de circulación, especialmente conforme el radio hidrodinámico del injerto o fusión se incrementa (Gao, Liu, y colaboradores, 2009), estos métodos ofrecen retos en la fabricación y mantenimiento de la función efectora biológica. Las heterogeneidades en las reacciones de conjugación pueden provocar mezclas de productos complejas con actividades biológicas variantes, debido-en su mayoría a la utilización de químicas de sitio no especifico. La caracterización bioquímica extensiva sigue frecuentemente métodos de purificación precisos para retener un agente terapéutico homogéneo (Huang, Gough, y colaboradores, 2009; Bailón, Palleroni, y colaboradores, 2001; Dhalluin, Ross, y colaboradores, 2005). Adicionalmente, la unión de grandes porciones, tales como PEGs, ramificados, para reactivar zonas de proteínas puede conducir afinidad de receptor disminuida (Fishburn, 2008).
Otro trabajo por otros ha proporcionado una proteína terapéutica que se liga a la albúmina para circulación incrementada del fármaco (Dennis, 2002; Walker, Dunlevy, y colaboradores, 2010). Considerando la misma regla mencionada en lo anterior general en la filtración del riñón, Dennis y colaboradores forman la hipótesis de que el incremento del tamaño evidente del producto terapéutico al diseñarlo para ligarse a otra proteina en la sangre (tal como albúmina de suero) disminuirla la velocidad de la eliminación del fármaco. De esta manera, el fármaco logra su tamaño molecular grande solo después de la administración en el torrente sanguíneo. La adición de péptidos de ligación albúmina de suero maduros por afinidad los fragmentos de anticuerpo incremento su tiempo de circulación 24 veces en los ratones (Dennis, 2002). Aunque es eficaz, este método se complica por la dinámica del recielaje de la albúmina por el receptor Fe neonatal (FcRn) y el uso de péptido cíclicos limitados por cisteína para funcionalidad. · Walker y colaboradores corroboran los resultados contribuidos por Dennis en 2002, particularmente que la impartición de la afinidad de albúmina de suero a una proteína incrementa su vida media. El método descrito por Walter y colaboradores implica la adición recombinante de fragmentos de anticuerpos grandes al fármaco de proteína, que puede provocar complicaciones estructurales así como de fabricación. Aunque elegante y eficaz, los métodos de Dennis y Walker se complican por el uso de dominios cíclicos o grandes complejos para funcionalidad. Aunque los péptidos descubiertos- por Dennis y colaboradores mostraron alta afinidad para albúmina, requieren la limitación física para formar correctamente una estructura cíclica antes del uso. Un procedimiento más voluminoso, el método de Walker para fusionar fragmentos de anticuerpos más grandes no puede ser apto para proteínas con una estructura de plegamiento y acompleja o rendimiento de expresión bajo. Anticuerpos de cadena sencilla Una modalidad de la invención es una fusión molecular de un scFv con un péptido que se liga específicamente a un eritrocito. Un scFv se puede utilizar como un agente terapéutico, y su combinación con un péptido de ligación a eritrocito se puede utilizar para prolongar su vida media circulante y proporcionar acceso a compartimientos corporales. Los anticuerpos recombinantes y los fragmentes de anticuerpos recombinantes tienen potencial como agentes terapéuticos en la industria biológica (Sheridan, 2010).
Los fragmentos de anticuerpos de fragmento variable de cadena sencilla (scFv) comprenden del dominio de la ligación antígeno completo de una IgG de longitud completa, pero carecen de las regiones de fragmento bisagra y constantes (Maynard and Georgiou,.2000). La construcción recombinante de un scFv implica fusionar el dominio pesado variable (VH) con el dominio ligero variable (VL) con un ligador de polipéptido corto que consiste .de repeticiones en tándem de glicina y serina (por ejemplo (GGGGS)4) (SEQ ID NO:18). Aunque la simplicidad de los scFvs es atractivo para aplicaciones terapéuticas, su desventaja principal son las vidas medias de circulación cortas que muestran, en virtud de su peso molecular relativamente pequeño de 26 - 28 kDa (Weisser and Hall, 2009). Ya que el hígado glicerina- serina común mente utilizado en de diseño de scFv no es funcional en carácter, más bien existe como un puente físico para asegurar el plegamiento de VH-VL correcto los dominios liqadores se sometieron a prueba en la presente mostrando una función de ligación a los eritrocitos en la sangre. De esta manera, el scFv diseñado puede ser multifuncional y biespecífico, muestra una afinidad á su antígeno nativo a través de los dominios VH-VL, y una afinidad a los eritrocitos en su dominio ligador. En la ligación a los eritrocitos, el scFv diseñado mostrara una vida media de circulación más prolongada, como se ha mostrado para otra proteína modelo con esta misma funcionalidad. Un fragmento de anticuerpo scFv puede tener un ligador como se describe en la presente, u otros ligadores se pueden proporcionar como he sabido por aquellas personas de experiencia en estos campos. Una modalidad alternativa proporciona un grupo de cisterna libre diseñado en la región ligadora de un scFv y este tiol de cisterna utilizado para ligarse por conjugación química a un ligando de ligación eritrocito.
El diseño de los anticuerpos scFv diseñados se enfocó en la importancia de la longitud del dominio ligador, asi co o el espaciamiento del péptido de ligación a eritrocitos. Ya que la variante de tipo natural se diseñó y se validó para la ligación antigeno con un ligador (GGGGS)4 (SEQ ID Numero 18), se diseñaron mutantes subsecuentes con una longitud de ligador mínima de 20 aminoácidos. Ya que el dominio ligador puede modular el plegamiento correcto del scFv en su estructura terciaria correcta, se diseñaron dos mutantes que contienen ERY1. El mutante REP contiene el péptido contiene el péptido ERY1 centrado en el dominio ligador, flanqueado por el número correcto de residuos de Gly y Ser para mantener la longitud del ligador de 20 aminoácidos precursor. En el posible caso donde la naturales hidrofóbica del péptido ERY1 no se alinee linealmente, pero se acumule en un dominio de ensamblado más corto, la longitud del hígado de REP sería más corta y puede impedir de esta manera el plegamiento correcto. Por tales razones, el mutante INS se diseñó para contener el péptido ERY1 agregado en el centro del dominio ligador precursor, alargando el ligador a 32 aminoácido como el péptido ERY1 se descubrió con una N-terminal libre, fue desconocido y su presencia en una conformación de polipéptido limitada afectaría o no la ligación de eritrocitos. Para enfrentar este comportamiento potencial, se creó una variante scFv por conjugación química con el péptido ERY1 sintético, mediante lo cual la N-terminal del péptido esta libre y C-terminal se conjuga al scFv.
De esta manera, el número de péptidos de ligación ¿i eritrocitos, y de esta manera la capacidad de ligación a eritrocitos de un scFv, se puede afinar estequiométricamente durante la reacción de conjugación. Por consiguiente, el ScFv se puede diseñar para comprender los péptidos de ligación a eritrocitos como en enseñado en la presente. Las modalidades incluyen un scFv que comprenden un número de ligandos que varían de 1 a 20; los artífices apreciarán inmediatamente que todos los intervalos y valores dentro de los intervalos explícitamente establecidos se contemplan, por ejemplo, entre 2 y 6.
Las modalidades incluyen scFv conjugado a un antígeno tolerogénico para hacer una fusión molecular que induzca la tolerancia, por ejemplo, como en el Ejemplo 6 que describe los detalles para crear la tolerancia como se ejemplifica con la creación de la tolerancia contra OVA que se une a un scFv. El Ejemplo 6 también detalla materiales y métodos para fabricar constructos de proteínas scFv fusionados recombinantemente a . un epítopo de reconocimiento inmunitario de un antígeno. El scFv se dirige al reconocimiento de eritrocitos. El antígeno es un antígeno como se describe en la presente, por ejemplo, un antígeno tolerogénico . Ejemplos de trabajo reportados en la presente describen resultados que utilizan modelos de murino, con el uso del TER119 scFv de murino utilizado como el dominio de anticuerpo en los constructos. El TER119 es un anticuerpo que se liga eritrocitos de ratón. El domino de anticuerpo TER119 se puede reemplazar por otros dominios de anticuerpo, por ejemplo dirigidos a un eritrocito en humano u otros animales. Por ejemplo, el domino de anticuerpo 10F7 se puede utilizar para crear constructos de anticuerpo-antígeno capaces de ligarse a eritrocitos humanos. Las fusiones adicionales de scFv de Ter-119 se hicieron con tres antigenos diferentes, como se reporta en el Ejemplo 6, incluyendo el epítopo MHC-I inmunodominante de OVA, el mimótopo de cromogranina-A 1040-p31, y proinsulina.
El Ejemplo 13 describe otras modalidades de los scFvs que se han fabricado, incluyendo modalidades para prueba en modelos animales y modalidades reactivas para humanos. Estos incluyen aquellos que se relacionan con el nivel de proteina: TER119-SIINFEKL, TER119-ChrA, u TER119-proinsulina. Estos también incluyen aquellos .que se refiere con el nivel genético: TER119-SIINFEKL, TER119-ChrA, TER119-proinsulina, TER119-uricasa, TER119-InsB9-23, TER119-ISQAVHAAHAEINEAGR (SEQ ID NO:80), TER119-H-2kb, TERll9-H-2kd, 10F7-SIINFEKL, 10F7-ChrA, 10F7-proinsulina, y 10F7-uricasa.
Ligación de eritrocitos a sitios particulares , tal como vasculatura tumoral Además de incrementar la vida media de un fármaco, la capacidad de un agente terapéutico diseñado para ligarse a eritrocitos es útil a fin de ligarse selectivamente y localizar eritrocitos a un sitio particular en el cuerpo. En el tratamiento de tumores sólidos, la quimioembolización trans-arterial (TACE) se puede utilizar para limitar el suministro de sangre al tumor, impidiendo de esta manera su acceso de nutrientes requeridos para crecimiento. El tratamiento TACE implica la inserción quirúrgica de microparticulas sólidas poliméricas corriente arriba del suministro de sangre tumoral. Conforme las microparticulas alcanzan el hecho vascular tumoral, se atrapan físicamente en la red de bazos sanguíneos creando de esa manera un bloqueo para el suministro de sangre al tumor (Vogl, Naguib, y colaboradores, 2009).
Conforme al tema TACE, una modalidad en la presente es para utilizar eritrocitos autólogos que circulan en la sangre como microparticulas naturales para la embolización del tumor al diseñar un agente terapéutico que se dirige al tumor para contener un péptido de ligación a eritrocitos. De esa manera, el agente terapéutico localiza el hecho vascular de tumor recluta los eritrocitos pasantes para ligarse al bazo, limitando de esta manera y bloqueando el flujo sanguíneo a la masa tumoral. Tal tratamiento es menos invasivo que el TACE clásico: el fármaco se inyectaría simplemente de manera intravenosa y usaría eritrocitos naturales ya presentes en la sangre como la partícula de embolización. El término ligación a tumor o que se dirige al tumor se refiere a un péptido que se liga a un componente accesible del compartimiento de sangre en la vasculatura tumoral o en las células tumorales.
El descubrimiento de los agentes terapéuticos que se dirigen al tumor, específicos, es conocido en el campo de la investigación de cáncer. El paradigma de la orientación de activa de los tumores depende de la ligación a los marcadores de proteína expresados específicamente en el entorno tumoral. Estos incluyen, pero no se limitan a: integrinas dirigidas a RGD, aminopeptidasa-A y -N, endosialina, nucleolina de superficie celular, Anexina-1 de superficie celular, receptor p32/gClq de superficie celular, plectina-1 de superficie celular, fibronectina EDA y EDB, receptor a de interleucina II, tenascina-C, endoglina/CD105, BST-2, galectina-1, VCAM-1, fibrina, y recepto de factor de tejido. (Fonsatti, Nicolay, y colaboradores, 2010; Dienst, Grunow, y colaboradores, 2005; Ruoslahti, Bhatia, y colaboradores, 2010; Thijssen, Postel, y colaboradores, 2006; Schliemann, Roesli, y colaboradores, 2010; Brack, Silacci, y colaboradores, 2006; Rybak, Roesli, y colaboradores, 2007). Un agente terapéutico dirigido hacia cualquiera de estas moléculas puede ser un vector para llevar un péptido de ligación a eritrocitos a la vasculatura tumoral para provocar la oclusión específica.
Una modalidad es un primer ligando que se liga específicamente a eritrocitos conjugados con un segundo ligando que se liga específicamente a una célula cancerosa o la vasculatura tumoral o. un componente de la vasculatura tumoral, tal como una proteína en el sub-endotelio (que se expone parcialmente en la sangre de un tumor) o una proteína sobre la superficie de una célula endotelial tumoral. El ligando puede ser parte de una composición farmacéuticamente aceptable que se introduce en un paciente, por ejemplo en el torrente sanguíneo. Los ligandos se ligan a eritrocitos y e 1 ligando que se dirige al tumor se liga a un sitio en o cerca del tumor en la vasculatura tumoral, o a una célula cancerosa. Los eritrocitos se recolectan en el sitio objetivo y bloquean el acceso del sitio objetivo a nutrientes, por ejemplo, al embolizar un vaso sanguíneo. Dado que la embolización es mecánica, se determina por el tamaño físico del eritrocito, la embolización puede ser súbita.
Los tumores sólidos dependen en gran medida en su suministro vascular, y los agentes terapéuticos biomoleculares así como los agentes terapéuticos materiales se han desarrollado para bloquear ya sea el crecimiento de su suministro vascular o para bloquear el flujo a su suministro vascular. Una modalidad es una formulación biomolecular o una formulación nanopartíeulas biomoleculares que se va a inyectar sistémicamente para ocluir rápidamente la vasculatura de los tumores sólidos, en el tumor primario o en la metástasis en ubicaciones conocidas o desconocidas.
La embolización tumoral se ha enfocado en una variedad de veces, incluyendo el uso de métodos basados en partículas biomoleculares. Las partículas biomateriales, incluyendo aquellas fabricadas de alcohol polivinílico, son de un diámetro mayor que la microvasculatura del tumor, por ejemplo 50-500 micrómetros en diámetro, y se han desarrollado para uso clínicamente en embolización arterial trans-catéter o TACE (Maluccio, Covey, y colaboradores, 2008). Un procedimiento paralelo incluye quimioterapéuticos cargados dentro de las partículas para liberación lenta en la quimioembolización transarterial (TACE) utilizada principalmente para el tratamiento de carcinoma hepatocelular (Gadaleta and Ranieri, 2010). En ambos casos, cando las partículas se inyectan en la circulación arterial, usualmente por un radiólogo de intervención bajo guía radiográfica, estas partículas pueden fluir e la vasculatura tumoral y ocluirlas, bloqueando el flujo (Maluccio, Covey, y colaboradores, 2008). Con estos procedimientos locales, solamente el tumor que se fija como objetivo directamente en la colocación del catéter se trata, y los otros tumores, tales como metástasis en ubicaciones conocidas o desconocidas, no se van a tratar puesto que las partículas no se fijan como objetivo fácilmente en los vasos. Más recientemente, se han explorado procedimientos moleculares, por ejemplo utilizando anticuerpos biespecífíeos que reconocen tanto un factor de trombosis como un marcador endotelial vascular tumoral no presente en la vasculatura normal. Después de la ligación específicamente a la vasculatura tumoral, el anticuerpo se acumula e inicia la formación de coágulos sanguíneos dentro de los vasos del tumor para bloquearlos; este efecto se indujo solamente cando el anticuerpo se orientó al tumor (Huang, Molema, y colaboradores, 1997). _ Estos procedimientos biomoleculares tienen un beneficio de fijar como objetivo tumores tanto primarios como secundarios de infusiones intravenosas y las firmas de las vasculatura tumorales específicas se pueden identificar; todavía iiene una desventaja de no proporcionar una oclusión mecánica súbita al tumor.
Las modalidades de la invención incluyen un método para embolizar un tumor en un paciente que comprende administrar una composición a un paciente que comprende una porción de ligación a eritrocitos acoplada a una porción objetivo, en donde la porción objetivo es un anticuerpo, fragmento de anticuerpo o péptido que se dirige a un objetivo elegido del grupo que consiste de un tumor y microvasculatura tumoral, y en donde la porción de ligación de eritrocitos comprende un péptido, un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo, o un aptámero que se liga específicamente a eritrocitos. El péptido puede ser, por.ejemplo, una secuencia como se expone en la presente.
Tolerancia inmunológica específica de antígeno Además de mejorar el comportamiento farmacocinético de un agente terapéutico, se ha descubierto que la afinidad de eritrocitos se puede utilizar en los métodos para crear tolerancia específica a antígeno. Ciertas modalidades de trabajo y proféticas se exponen en los ejemplos. La tolerogénesis, como se muestra en la presente, puede dar por resultado la eliminación de anticuerpos circulantes contra un antígeno, o reducción .de anticuerpos circulantes contra un antígeno por un factor de por lo menos 10, es decir, por lo menos 100, por lo menos 1000, o más de 10,000. La tolerogénesis puede prevenir, curar, o desacelerar la progresión de la enfermedad, reducir o eliminar el rechazo de un tejido trasplantado, y reducir o eliminar una reacción alérgica a una sustancia. · Los Ejemplos 3 y 10-12 detallan como la tolerancia se creó en modelos animales de ratón predictivos de comportamiento humano. El Ejemplo 3 mostró la creación de la tolerancia utilizando un antigeno de prueba (ovalbúmina) conectado a un ligando peptidico -que se liga a una superficie de eritrocitos. Los Ejemplos 10-12 corroboran los resultados del Ejemplo 3 y proporciona ejemplos de trabajo adicionales que muestran la creación de tolerancia utilizando una ovalbúmina unida a un scFv y asparaginasa unida a un ligando peptidico. Un ejemplo de trabajo que muestra la creación de tolerancia que revierte el rechazo inmunitario preexistente se proporciona en el Ejemplo 12. Por consiguiente, las modalidades incluyen una molécula de fusión para la tolerogénesis que comprende asparaginasa, un fragmento de asparaginasa antigénico, de un mimótopo antigénico de asparaginasa y una porción de ligación a eritrocitos, con la porción de ligación a eritrocitos que se liga específicamente, por ejemplo, a glicoforina A o un objetivo elegido del grupo que consiste de Banda 3, glicoforina B, glicoforina C u otros miembros de grupo objetivo de eritrocitos. La porción de ligación a eritrocitos puede ser, por ejemplo, elegida del grupo que consiste de anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, scFvs, ligandos peptídicos y aptámeros y/o del grupo que consiste de ERY19, ERY59, ERY64, ERY123, ERY141, ERY162, ERY19', ERY59', ERY64', ERY123', ERY141', y ERY162' y sustituciones conservadoras de los mismos. Estas moléculas de fusión se pueden aplicar profilácticamente antes de una primera administración de asparaginasa, durante un pulso de tratamiento con asparaginasa, y/o después de un curso de tratamiento con asparaginasa. Estas moléculas de fusión se pueden aplicar antes de que se observe una respuesta inmunitaria al fármaco de asparaginasa, o después de que tal respuesta se observa.
En el Ejemplo 3, se ha descubierto un péptido que se liga a eritrocitos de ratón, ERY1, una fusión molecular de ERY1 se hizo con un anfígeno de prueba, ovalbúmina (OVA). La ligación de fusión se liga específicamente a los eritrocitos in vivo y no se ligó a otras moléculas, incluyendo a aquellas en la sangre o la vasculatura. Se observó una vida media circulante más prolongada. La ligación de los eritrocitos de ERY1-0VA se observó para conducir a una presentación cruzada eficiente de epítopo MHC I inmunodominante OVA (SIINFEKL) por las células que presentan antígenos (APCs) y el cebado cruzado correspondiente de las células T reactivas. ERY1-OVA indujo números mucho más altos de células OT-I CD8+ T proliferantes de Anexina-V+ que OVA, sugiriendo un destino apoptótico que conduce eventualmente a la supresión clonal. Utilizando un modelo de estimulación-a-tolerancia OT-I establecido (Liu, Iyoda, y colaboradores, 2002) (Figura 2), ERY1-OVA mostró que previene las respuestas inmunes subsecuentes a la estimulación con antigeno mediada por vacuna aún con un adyuvante bacterialmente derivado muy potente. La administración intravenosa de ERY1-OVA dio por resultado reducciones profundas en las poblaciones de células OT-I CD8+ en los ganglios linfáticos de drenaje (Figura 2; la apertura en la Figura 12b) y los vasos comparados con los ratones administrados con OVA no modificado antes de la estimulación con antigeno con LPS (Figura 2c), que muestra tolerancia de supresión. Esta supresión clonal eficaz mostrada en los ratones administrados con ERY1-OVA suportó las observaciones anteriores del cebado cruzado de células T OT-I CD8+mejoradas y mostró además que el cebador cruzado se presentó en ausencia de la presentación de APC de moléculas co-estimuladoras para conducir a la tolerancia de supresión. Las administraciones intravenosas de ERY1-OVA provocaron niveles de IgG en suero especificas de OVA más bajos que 39.8 veces 19 d después de la primera administración de antigeno (Figura 3) como es comparado con los ratones tratados con OVA. Para validar adicionalmente la inducción de la tolerancia .inmunitaria especifica de antigeno, el modelo de estimulación a tolerancia OT-I se combinó con un modelo de injerto de tumor que expresa OVA (Figura 2), con resultados favorables. Los resultados detallados en este ejemplo muestran que la ligación a eritrocitos por ERY1-OVA induce una tolerancia inmunitaria especifica de antigeno. Esto se mostró en respuesta a una estimulación en gran medida con adyuvante asi como injertos celulares implantados que expresan un xeno-antigeno. Por otra parte, la tolerancia se logró por inactivación funcional y supresión de células T CD8+ reactivas a través de la interacción con el antigeno presente en los eritrocitos circulantes, independientemente de la regulación de células T.CD4+directa. Estos experimentos detallados con ERY1, un péptido de ligación a eritrocitos de ratón, son predictivos de los resultados similares en humanos utilizando péptidos de ligación a eritrocitos humanos, varios de los cuales se enseñan en la presente. Por otra parte, habiendo mostrado que los ligandos peptidicos son eficaces, se pueden hacer resultados similares utilizando conjugados con otros ligandos de ligación a eritrocitos, por ejemplo, anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, o aptámeros, en esas porciones que se ligan a una molécula de superficie de un eritrocito, por ejemplo, una de las proteínas de superficie o antígeno expuestos en la presente.
El Ejemplo 10 mostró adicionalmente la creación de la tolerancia a un antígeno tolerogénico al fusionar el antígeno tolerogénico a un scFv que se liga a un eritrocito, y al preparar la molécula de fusión como un medicamento para la administración a un paciente. El Ejemplo 10 muestra la inducción de tolerancia al dominio inmunodominante MHC-I de OVA que es el péptido SIINFEKL (SEQ ID NO:3). Este antigeno se fusionó al scFv TER-119, que es conocido por liarse a eritrocitos de ratón. La proliferación de células T OT-I CD8+, determinada por la dilución de flúor CFSE como es medido por la citometria de flujo, se potenció notablemente en los ratones administrados con TER119-SIINFEKL comparado con ERY1-OVA u OVA (Figura 8), que muestra que la ligación a eritrocitos incrementó el cebado cruzado de células T CD8+ especificas de antigeno comparado con el antigeno soluble SIINFEKL. Adicionalmente, estos datos muestran que los fragmentos de anticuerpos diseñados para ligarse a eritrocitos y mostrar epítopos inmunes se procesan eficientemente por las células inmunes para cebar de manera cruzada las células especificas de antigeno. Estos resultados en la presentación cruzada y el cebado cruzado son consistentes con otros estudios con respecto a la presentación de antigenos tolerogénicos en MHC I por APCs que envuelven al antigeno de las células apoptóticas (Albert 1998, Green 2009). TER119-SIINFEKL y ERYl-OVA indujeron números mucho más altos de células OT-I CD8+ T proliferantes de Anexina-V+ y PD-1+T que OVA (Figura 13), indicando un destino agotado y apoptótico que conduce a la supresión clonal. Este fenotipo de células CD8+ T proliferantes es consistente con otros modelos de transferencia adoptivos OT-I reportados en los cuales el acoplamiento del receptor de células T especificas de antígeno regulado por APCs no logra inducir respuestas inflamato.rias (Bursch, Rich, y colaboradores, 2009).
Con referencia al Ejemplo 10, la capacidad de TER119-SIINFEKL y ERY1-OVA para prevenir respuestas inmunes subsecuentes a un estimulo con antigeno mediado por vacuna se mostró - aún cuando se estimuló con un adyuvante bacterianamente derivado muy potente. Las moléculas de fusión con ya sea un scFv o un ligando peptidico para la ligación a un eritrocito fueron de esta manera eficaces para producir la tolerancia.
El Ejemplo 11 muestra que es posible inducir una tolerancia inmunitaria específica de antígeno hacia las proteínas terapéuticas y las proteínas con potencial terapéutico. Muchas proteínas terapéuticas inducen reacciones inmunes, haciendo su uso clínico peligroso o ineficaz. La asparaginasa es una enzima terapéutica microbianamente derivada utilizada para tratar leucemia linfoblástica aguda, que también induce respuestas inmunes peligrosas que evitan su uso repetido. Se utilizó el modelo de ratón. Una molécula de fusión de asparaginasa y una porción de ligación a eritrocitos (el péptido ERY1) se administró a ratones y se comparó con los ratones tratados con la asparaginasa de fármaco clínico. La asparaginasa de fármaco produjo anticuerpos pero la molécula de fusión no lo hizo; esta prueba estableció que los niveles de anticuerpos se podrían utilizar como una medida de tolerancia. La tolerancia luego se probó al administrar la molécula fusión a ratones seguido por la administración repetida de la asparaginasa de fármaco clínico, y al observar que no hubo respuesta a anticuerpos potente, aún después de una estimulación muy agresiva por dosificación repetida con el fármaco. En contraste, los ratones que recibieron el fármaco pero no la molécula de fusión fueron inmunoreactivos y peligrosamente hipersensibles.
El Ejemplo 12 muestra que es posible la inmunoreversión. Los ratones que fueron inmunoreactivos a una proteína se trataron para ser tolerantes de la proteína. Se utilizó el modelo de ratón de asparaginasa del Ejemplo 11. Los ratones que fueron inmunoreactivos a la asparaginasa de fármacos se trataron con la molécula de fusión (ligador de asparaginasa y eritrocitos) y fue tolerante de la asparaginasa de fármaco.
En contraste, los reportes anteriores enseñan que el rechazo inmunitario se crea al unir un antígeno a una superficie de un eritrocito para hacer de esta manera una vacuna, y otros reportes ha utilizado antigenos encapsulados dentro de eritrocitos para crear vacunas. Por ejemplo cuando el antigeno o se encapsula dentro de un eritrocito, se fabrica de esta manera una vacuna (Murray y colaboradores, Vaccine 24: 6129-6139 (2006)). O los antigenos conjugados a una superficie de eritrocitos fueron inmunogénicos y se propusieron como vacunas (Chiarantini y colaboradores, Vaccine 15(3): 276-280 (1997)). Estas referencias muestran que la administración de eritrocitos se aproxima a una respuesta inmunitaria tan buena co o aquella obtenida con vacunas normales con adyuvantes. Otros han reportado que la colocación dentro de un eritrocito es necesaria para inducir la tolerancia, como en 1a solicitud de patente WO 2011/051346, que también enseña varios medios por los cuales altera la superficie de eritrocitos para potenciar la eliminación por las células de Kupffer en el hígado. Esta misma solicitud enseña la ligación de los anticuerpos a las proteínas de superficie de eritrocitos tal como glicoforina ?, pero el propósito de fabricar complejos inmunes en el eritrocito para potenciar su eliminación por las células de Kupffer.
Las modalidades expuestas en la presente proporcionan un método para producir inrnunotolerancia, el método que comprende administrar una composición que comprende una fusión molecular que comprende un agente tolerogénico y una porción de ligación a eritrocitos que se liga específicamente a un eritrocito en el paciente y liga de esta manera el antígeno al eritrocito, en donde la fusión molecular se administra en una cantidad efectiva para producir inmunotolerancia a una sustancia que comprende el antígeno tolerogénico. El eritrocito, y el paciente, pueden estar libres de tratamientos que provocan otras alteraciones a los eritrocitos, y libres de reticulación de eritrocitos, conjugaciones covalentes químicas, recubrimientos, y otras alteraciones diferentes a la ligación específica del péptido. La fusión molecular puede comprender, o consistir de, la porción de ligación a eritrocitos ligada directamente de manera covalente al antígeno. La fusión molecular puede comprender la porción de ligación a eritrocitos unida a una partícula que se une al antígeno. La partícula puede comprender una micropartícula, una nanopartícula, un liposoma, una polimerosoma o una micela. El antígeno tolerogénico puede comprender una porción de una proteína terapéutica, por ejemplo, un factor de sangre administrado a un paciente que sufre de una falta de producción del factor. Las modalidades incluyen los casos en donde: el paciente es un humano y el antígeno tolerogénico es una proteína humana de la cual el paciente es genéticamente deficiente; en donde el paciente es un humano y el antigeno tolerogénico comprende una porción de una proteina no humana; en donde el paciente es un humano y el antigeno tolerogénico, comprende una porción de una proteina terapéutica diseñada no encontrada naturalmente en un humano; en donde el paciente es un humano y el antigeno tolerogénico comprende una porción de una proteina que comprende glicosilación no humana; en donde el antigeno tolerogénico comprende una porción de una proteina de enfermedad autoinmunitaria humana; en donde el antigeno tolerogénico es un antigeno en un trasplante de haloinjertos; en donde el antigeno tolerogénico comprende una porción o una sustancia elegida del grupo que consiste de alimento humano; y/o en donde la porción de ligación a eritrocitos se elige del grupo que consiste de un péptido, un anticuerpo y un fragmento de anticuerpo. Las modalidades incluyen materiales de tolerización y métodos en donde la porción de ligación a eritrocitos comprende un péptido que comprende por lo menos 5 residuos de aminoácido consecutivos de una secuencia elegida del grupo que consiste de SEQ ID N0:11, SEQ ID N0:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:l, y sustituciones conservadoras de las mismas, en donde la secuencia se liga específicamente a un eritrocito.
La fusión molecular se puede elegir para colocar el antigeno en el interior o exterior del eritrocito. Sin que se limite a un mecanismo particular de acción, se presenta la siguiente teoría. En los hombres, aproximadamente 1% de eritrocitos son apoptóticos (eriptóticos) y se eliminan cada día, un gran número de células, y sus proteínas se procesan en una manera para mantener la tolerancia a los autoantígenos de eritrocitos. Un antígeno diseñado para ligarse a eritrocitos a través del uso del péptido ERY1 o un péptido de ligación de eritrocitos humano, un anticuerpo de cadena sencilla de ligación a eritrocitos o anticuerpo, un aptámero de ligación a eritrocitos, u otro agente de ligación a eritrocitos también puede inducir la mism respuesta tolerogénica. Dado que el método del estado de la téenica actual desarrollado por Miller y colaboradores (véase lo anterior) es difícil, en que requiere la recolección y reacción de esplenocitos donadores para la re-administración, el método de ligación a eritrocitos no covalente de los inventores proporciona una alternativa más simple. Conforme el ERYl-eritrocitos o péptido-eritrocito de ligación a eritrocitos humano u otra biomolécula de afinidad (anticuerpo de cadena sencilla, anticuerpo ó aptámero, por ejemplo) se presenta la interacción· espontáneamente después de la introducción del conjugado de antígeno o fusión in vivo , el antígeno diseñado se administra simplemente por inyección, y se presenta la ligación situ.
En algunos casos, el antigeno tolerogénico se deriva de una proteina de agente terapéutico para lo cual se desea tolerancia. Ejemplos son fármacos de proteínas en su tipo natural, par ejemplo, factor VIII humano o factor IX, al cual los pacientes no establecieron tolerancia central debido a que fueron deficientes en esas proteínas; o fármacos de proteínas no humanos, utilizados en un humano. Otros ejemplos son fármacos de proteínas que se glicosilan en formas no humanas debido a la producción, o fármacos de proteínas diseñados, por ejemplo, que tienen secuencias no nativas que pueden provocar una respuesta inmunitaria no deseada. Ejemplos de antígenos tolerogénicos que son proteínas terapéuticas diseñadas no se encuentran naturalmente en humanos incluyendo proteínas humanas con mutaciones diseñadas, por ejemplo, mutaciones para mejorar las características farmacológicas. Ejemplos de antígenos tolerogénicos que comprenden glicosilación no humana incluyen proteínas producidas en células de levadura o insecto.
Las modalidades incluyen administrar una proteína en alguna frecuencia X o dosis Y, y también al administrar un antígeno de esa proteína en .una frecuencia y/o dosis menor, por ejemplo, una frecuencia que no es más que 0.2X o dosis que no es más que 0.2Y; los artífices apreciaran inmediatamente que todos los intervalos y valores dentro de los intervalos explícitamente establecidos se contemplan, por ejemplo, 0.01 o 005 X o algún intervalo entre los mismos.
Modalidades incluyen la elección del antígeno tolerogénico de las proteínas que se administran a humanos que son deficientes en la proteína. Deficiente significa que el paciente que recibe la proteína no produce naturalmente suficiente de la proteína. Por otra parte, las proteínas pueden ser proteínas por los cuales un paciente es genéticamente deficiente. Tales proteínas incluyen, por ejemplo, antitrombina-III, proteína C, factor VIII, factor IX, hormona de crecimiento, somatotropina, insulina, acetato de pramlintida, mecasermina (IGF-1), b-gluco cerebrosidasa, alglucosidaseaa, laronidasa (a-L-iduronidasa), idursufasa (iduronato-2-sulfatasa), galsulfasa, agalsidasa-b (a-galactosidasa), inhibidor de a-l proteinasa, y albúmina. Por consiguiente, las modalidades incluyen una molécula de fusión para la tolerogénesis que comprende una porción de ligación a eritrocitos y por lo menos un antígeno, fragmento antigénico, o mimótopo antigénico de una o más de esas proteínas, con la porción de ligación a eritrocitos que se liga específicamente, por ejemplo, a glicoforina A o a un objetivo elegido del grupo que consiste de Banda 3, glicoforina B, glicoforina C u otros miembros del Grupo Objetivo de Eritrocitos. La porción de ligación a eritrocitos puede ser, por ejemplo, elegida del·grupo que consiste de anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, scFvs, ligandos de peptídicos y aptámeros.
Las modalidades incluyen la elección del antigeno tolerogénico de anticuerpos terapéuticos y moléculas similares a anticuerpos, incluyendo fragmento de anticuerpo y proteínas de fusión con anticuerpos y fragmentos de anticuerpos. Estos incluyen anticuerpos no humanos (tal como ratón), anticuerpos quiméricos, y anticuerpos humanizados. Las respuestas inmunes a anticuerpos aún humanizados se han observado en humanos (Getts, 2010). Por consiguiente, las modalidades incluyen una molécula de fusión para tolerogénesis que comprende una porción de ligación a eritrocitos y por lo menos un antígeno, fragmento antigénico, o mimótopo antigénico de uno o más de estas proteínas, con la porción de ligación a eritrocitos que se liga específicamente, por ejemplo, a glicoforina A o un objetivo elegido de grupo que consiste de Banda 3, glicoforina B, glicoforina C u otros miembros del Grupo Objetivo de Eritrocitos. La porción de ligación a eritrocitos puede ser, por ejemplo, elegida del grupo que consiste de anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, scFvs, ligandos peptídicos y aptámeros.
Las modalidades incluyen .la elección del antígeno tolerogénico de proteínas que no son humanas. Ejemplos de tales proteínas incluyen adenosina desaminasa, lipasa pancreática, amilasa pancreática, lactasa, toxina botulínica tipo A, toxina botulínica tipo B, colagenasa, hialuronidasa, papaína, L-Asparaginasa, rasburicasa, lepirudina, estreptocinasa, anistreplasa (complejo activador de plasminógeno estreptocinasa anisoilado), antitimocito, globulina, Fab inmune polivalente de crotalidae, Fab de suero inmune de digoxina, L-arginasa, y L-metionasa.
Las modalidades incluyen .la elección del antígeno tolerogénico de antígenos de trasplante de haloinjertos humanos. Ejemplos de estos antígenos son las subunidades de las diversas proteínas de haplotipo de MHC clase I y MHC clase II, y los polimorfismos de aminoácido individual en los antígenos de grupo sanguíneo menor incluyendo RhCE, Kell, Kidd, Duffy y Ss.
En algunos casos, el antígeno tolerogénico es un auto antígeno contra el cual el paciente ha desarrollado una respuesta autoinmune o puede desarrollar una respuesta autoinmune. Ejemplos son proinsulina (diabetes), colágenos (artritis reumatoide) proteína básica de mielina (esclerosis múltiple).
Por ejemplo, la diabetes mellitus Tipo 1 (T1D) es una enfermedad autoinmunitaria mediante la cual las células T que reconocen las proteínas de los islotes se han regulado de la liberación inmune y la señal del sistema inmunitario para destruir el tejido pancrático. Los antígenos de proteínas numeroso que son objetivos de tales células T diabetogénicas se han descubierto, incluyendo insulina, GAD65, cromogranina-A, entre otras. En el tratamiento o prevención de T1D, sería útil inducir tolerancia inmunitaria específica de antígeno hacia antígenos :diabetogénicos definidos para inactivar o suprimir funcionalmente los clones de células T diabetogénicos. El Ejemplo 14 detalla como una molécula de fusión que presenta el mimótopo de cromogranina-A (ChrA) como un antígeno tolerogénico creó exitosamente la tolerogénesis a ChrA, basado en los datos de células T que se estableció como predictivo en los otros Ejemplos. Por consiguiente, las modalidades incluyen una molécula de fusión para la tolerogénesis que comprende cromogranina-A, un antígeno o porción antigénica del mismo, o un mimótopo del mismo con una porción de ligación a éritrocitos, con la porción de ligación a eritrocitos que se liga específicamente, por ejemplo, glicoforina A o un objetivo elegido d grupo que consiste de Banda 3, glicoforina B, glicoforina C u otros miembros de Grupo Objetivo de Eritrocitos. La porción de ligación a eritrocitos puede ser, por ejemplo, elegida de grupo que consiste de anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, scFvs, ligandos peptidicos y aptámeros 7/o del grupo que consiste de ERY19, ERY59, ERY64, ERY123, ERY141, ERY162, ERYl9', ERY59', ERY64', ERY123', ERY141', ERY162' y sustituciones conservadoras de los mismos.
Por consiguiente, la tolerancia y/o retardo del inicio o progresión de las enfermedades autoinmunitarias se pueden lograr para varias de las muchas proteínas gue son proteínas autoinmunitarias humanas, un término que se refiere a varias enfermedades autoinmunitarias en donde la proteina o proteínas que provocan la enfermedad son conocidas o se pueden establecer por prueba de rutina.
Las modalidades incluyen someter a prueba a un paciente para identificar una proteína autoinmune y crear un antígeno para el uso en una fusión molecular y crear inmunotolerancia a la proteína. Las modalidades incluyen un antígeno, o elección de un antígeno de, una o más de las siguientes proteínas. En la diabetes mellitus tipo 1, varios antígenos principales se han identificado: insulina, proinsulina, preproinsulina, ácido glutámico descarboxilasa-65 (GAD-65), GAD-67, proteína 2 asociada a insulinoma (IA-2), y proteína 2b asociada a insulinoma (IA-2b); otros antígenos incluyen ICA69, ICA12 (SOX-13), carboxipeptidasa H, Imogen 38, GLIMA 38, cromogranina-D, HSP-60, carboxipeptidasa E, periferina, transportador de glucosa 2, proteína asociada a hepatocarcinoma-intestino-páncreas/pancreática, XIOOb, proteína ácida fibrilar glial, gen II de regeneración, homeosecuencia 1 duodenal pancreática, distrofia miotónica sinasa, proteína relacionada a subunidad catalítica de glucosa-6-fosfatasa específica de islotes, y receptores 1-5 acoplados a SST G-proteína. En enfermedades autoinmunitarias de la tiroides, incluyendo tiroiditis de Hashimoto y enfermedad de Graves, los antígenos principales incluyen tiroglobulina (TG), tiroide (TPO) y receptor de tirotropina (TSHR); otros antígenos incluyen un simportador de yoduro de sodio (NIS) y megalina. En la oftalmopatía asociada a tiroides y dermopatía, además de autoantígenos de la tiroides incluyendo TSHR, un antígeno es el receptor de factor de crecimiento 1 similar a insulina. En el hipoparatiroidismo, un antígeno principal es el receptor sensible al calcio. En la enfermedad de Addison, los antígenos principales incluyen 21-hidroxilasa, 17a-hidroxilasa, y la enzima de escisión de cadena lateral P450 (P450scc); otros antígenos incluyen el receptor ACTH, P450c21 y E450cl7. En la insuficiencia ovárica prematura, los antígenos principales incluyen el receptor FSH y a-enolasa. hipofisitis autoinmune, o enfermedad autoinmunitaria :pituitaria, los antígenos principales incluyen el factor de proteína específica de glándula pituitaria (PGSF) la y 2; otro antigeno es la yodotironina desyodinasa tipo 2. En esclerosis múltiple, los antigenos principales incluyen proteína básica de mielina, glicoproteína de oligodendrocitos de mielina y proteína de proteolípidos. En la artritis reumatoide, un antígeno principal es colágeno II. En la inmunogastritis, un antígeno principal es H+, K+-ATPasa. En la anemia perniciosa, un antígeno principal es el factor intrínseco. En enfermedad celiaca, los antígenos principales son transglutaminasa y gliadina del tejido. En el vitÍligo, un antígeno principal es tirosinasa, y proteína 1 y 2 relacionada a tirosinasa. En la miastenia gravis, un antígeno principal es el receptor de acetilcolina. En el receptor pemfigus vulgaris y variantes, los antígenos principales son desmogleina 3, 1 y 4; otros antígenos incluyen pemfaxina, desmocolinas, placoglobina, perplaquina, desmoplaquinas, y receptor de acetilcolina. En el pemfigoide hulloso; los antígenos principales incluyen BP180 y BP230; otros antígenos incluyen plectina y laminina 5. En la dermatitis herpetiformis Duhring, los antígenos principales incluyen endomisio y tejido transglutaminasa. En epidermolisis hullosa acquisita, un antígeno principal es colágeno VII. En la esclerosis sistémica, los antígenos principales incluyen matriz metaloproteinasa 1 y 3, la proteína 47 de choque térmico chaperona molecular específica del colágeno, fibrilina-1, y receptor PDGF; otros antígenos incluyen Scl-70, U1 RNP, Th/To, Ku, Jol, NAG-2, proteínas de centrómero, topoisomerasa I, proteínas nucleolares, ARN polimerasa I, II y III, PM-Slc, fibrilarina, y B23. En enfermedad del tejido conjuntivo mezclada, un antígeno principal es UlsnRNP. En el síndrome de Sjogren, los antígenos principales son antígenos nucleares SS-A y SS-B; otros antígenos incluyen fodrina, poli(ADP-ribosa) polimerasa y topoisomerasa. En el lupus eritematoso sistémico, los antígenos principales incluyen proteínas nucleares que incluyen SS-A, cuadro de grupo de alta movilidad 1 (HMGB1), nucleosomas, proteínas de histona y ADN de doble hebra. En el síndrome de Goodpasture, los antígenos principales incluyen proteínas de membrana básales glomerulares incluyendo colágeno IV. En enfermedad cardiaca reumática, un antígeno principal es miosina cardiaca. Otros autoantígenos revelados en el síndrome poliglandular autoinmune tipo 1 incluyen L-aminoácido descarboxilasa aromática, histidina descarboxilasa, ácido sulfínico cisteína descarboxilasa, triptófano hidroxilasa, tirosina hidroxilasa, fenilalanina hidroxilasa, citocromos P450 hepáticos P4501A2 y 2A6, SOX-9, SOX-10, proteína receptora detectora de calcio, y el interferón-alfa de interferones tipo 1, beta y omega. El Ejemplo 15 proporciona la guía detallada para la tolerogénesis para tales proteínas, y describe específicamente el proceso con insulina como un ejemplo.
En algunos casos, el antígeno tolerogénico es un antígeno extraño contra el cual un paciente ha desarrollado una respuesta inmunitaria no deseada. Ejemplos son antígenos alimenticios. Las modalidades incluyen someter a prueba un paciente para identificar el antígeno extraño y crear una fusión molecular que comprende el antígeno y tratar al paciente para desarrollar inmunotolerancia al antígeno o alimento. Se proporcionan ejemplos de tales alimentos y/o antígenos. Ejemplos son de cacahuate: conaraquina (Ara h 1), alérgeno II (Ara h 2), arachis aglutinina, conglutina (Ara h 6); de manzana: homólogo de proteína de resistencia a alérgeno/enfermedad principal 31 kda (Mal d 2), precursor de transferencia de lípidos (Mal d 3), alérgeno principal Mal d 1.03D (Mal d 1); de leche: a-lactalbúmina (ALA), lactotransferrina; de kiwi: actinidina (Act c 1, Act d 1), fitocistatina, proteína similar· a taumatina (Act d 2), kiwelina (Act d 5); de mostaza: 2S albúmina (Sin a 1), 11S aglobulina (Sin a 2), proteína de transferencia de lípidos (Sin a 3), profilina (Sin a 4); de apio: profilina (Api g 4), glicoproteína de peso molecular alto (Api g 5); de camarón: alérgeno Pen a 1 (Pen a 1), alérgeno Pen m 2 (Pen m 2), isoforma de ayune de tropomiosina; de trigo y/u otros cereales: glutenina de peso molecular alto, glutenina de peso molecular bajo, alfa y gama-gliadina, hordeina, secalina, avenina; de fresa: alergia a la fresa mayor Fra a 1-E (Fra a 1), de plátano: profilina (Mus xp 1).
Muchos fármacos de proteínas que se utilizan en la medicina humana y veterinaria inducen respuestas inmunes que, lo cual crea riesgos para el paciente y limita la eficacia del fármaco. Esto puede presentarse con proteínas humanas que se han diseñado, con proteínas humanas utilizadas en pacientes con deficiencias congénitas en la producción de esa proteína, y con proteínas no humanas. Sería ventajoso inducir la tolerancia a un recipiente para estos fármacos de proteínas antes de la administración inicial, y sería ventajoso inducir la tolerancia a un recipiente para estos fármacos de proteínas después de la administración inicial y desarrollo de la respuesta inmunitaria. En pacientes con autoinmunidad, el autoantígeno(s) al cual la autoinmunidad se desarrolla es conocido. En estos casos, sería ventajoso inducir tolerancia a sujetos en riesgo antes del desarrollo del autoinmunidad, y sería ventajoso inducir tolerancia a sujetos en el momento de o después del desarrollo de indicadores biomoleculares de la autoinmunidad insipiente. Por ejemplo, en la diabetés mellitus Tipo 1, los indicadores inmunológicos de la autoinmunidad están presentes antes de la amplia destrucción de las células beta en el páncreas y en el inicio de la enfermedad clínica implicada en la hemostasis de la glucosa. Sería ventajoso inducir tolerancia a un sujeto después de la detección de estos indicadores inmunológicos antes del inicio de la enfermedad clínica.
El trabajo reciente encabezado por Miller y colaboradores ha mostrado que conjugar covalentemente un antígeno a los esplenocitos alogénicos ex vivo crea tolerancia inmunitaria específica de antígeno cuando se administra intravenosamente en los ratones (Godsel, Wang, y colaboradores, 2001; Luo, Pothoven, y colaboradores, 2008). El proceso implica recolectar células que presentan antígenos esplénicas donadoras y hacer reaccionarlas clínicamente en un esquema de reacción de . reticulación de amina-ácido carboxílico. La téenica ha probado ser eficaz en la inducción de tolerancia específica de antígeno para modelos de ratón de esclerosis múltiple (Godsel, Wang, y colaboradores, 2001), diabetes tipo 1 del nuevo inicio (Fife, Guleria, y colaboradores, 2006), y trasplantes de islotes alogénicos (Luo, Pothoven, y colaboradores, 2008). Aunque el mecanismo exacto responsable por la respuesta tolerogénico no es conocido, se propone que un requisito mayor impliqué la presentación a antígenos sin la expresión de las moléculas co-estimuladoras en las células acopladas a antígeno apoptóticas (Miller, Turley, y colaboradores, 2007). También se ha contemplado encapsular a antígenos dentro de fantasmas de eritrocitos, procesar los eritrocitos ex vivo y volver a inyectarlos, como en W02011/051346.
Administración Muchas modalidades de la invención expresas en la presente describen composiciones que se pueden administrar a un humano u otro paciente animal. Las modalidades de la invención incluyen, por ejemplo, fusiones moleculares, proteínas de fusión, ligandos peptídicos, anticuerpos, scFv, que reconocen antigenos en los eritrocitos o tumores o vasculatura tumoral, así como combinaciones de los mismos. Estas composiciones se pueden preparar como composiciones farmacéuticamente aceptables y con portadores excipientes farmacéuticamente aceptables adecuados.
Las composiciones que ligan eritrocitos pueden hacerlo con especificidad. Esta especificidad proporciona la ligación in vivo de las composiciones con los eritrocitos, así como procesos ex vivo alternativos. Por consiguiente, las composiciones se pueden inyectar directamente en una vasculatura del paciente. Una alternativa es la inyección en un tejido, por ejemplo, muscular, dérmica, o subcutánea, para el contacto y captación de eritrocitos subsecuente. Una modalidad de la invención es un método para inducir la tolerogénesis en un paciente que comprende administrar un antigeno tolerizante al paciente en asociación con una porción de ligación a eritrocitos para unir de esta manera el antigeno a un eritrocito in vivo; la unión in vivo de esta manera se puede llevar a cabo sin procesamiento ex vivo de eritrocitos. Este proceso-se puede llevar a cabo en donde el eritrocito no se fabrica para ser apoptótico como resultado del proceso. Este proceso se puede llevar a cabo de modo que está libre de (no implica) exponer los eritrocitos a uno o más de: un agente de reticulación; un agente de reticulación que retícula las moléculas de superficie de un eritrocito; un agente de reticulación que comprende por lo menos dos grupos funcionales; un agente de reticulación que forma una ligación covalente con un eritrocito; grupos funciones que forman una ligación covalente con un eritrocito; y un antigeno y/o sustancia antigénica que se liga covalentemente al eritrocito. El proceso se puede llevar a cabo de modo que los eritrocitos y/o los antigenos están libres de l-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida) (EDC; también EDAC o EDCI) y también pueden estar libres de cualquiera de las reacciones con una carbodiimida. Este proceso se puede llevar a cabo con eritrocitos autólogos y puede estar libre de eritrocitos ctlogénicos.
Los portadores o excipientes farmacéuticamente aceptables se pueden utilizar para administrar modalidades como se describe en la presente. El excipiente se refiere a una sustancia inerte utilizada como un diluyente o vehículo para un agente terapéutico. Los portadores farmacéuticamente aceptables se utilizan, en general, con un compuesto para fabricar el compuesto útil para una terapia o como un producto. En general, para cualquier sustancia, un portador farmacéuticamente aceptable es un material que se combina con la sustancia para la administración a un animal. Los portadores farmacéuticos convencionales, bases acuosas, en polvo o aceitosas, espesantes y similares pueden ser necesarios o deseables. En algunos casos, el portador es esencial para la administración, por ejemplo para solubilizar un compuesto insoluble para administración liquida; una solución amortiguadora para el control del pH de la sustancia para conservar su actividad; o un diluyente para prevenir la pérdida de la sustancia .en el vaso de almacenamiento. En otros casos, sin embargo, el portador es para conveniencia, por ejemplo, un líquido para administración más conveniente. Las sales farmacéuticamente aceptables de los compuestos descritos en la presente se pueden sintetizar de acuerdo con los métodos conocidos por aquellas personas expertas en los campos. De esta manera las composiciones farmacéuticamente aceptables se purifican en gran medida para ser libre de contaminantes, son biocompatibles y no toxicas, son adecuadas para administración a un paciente. En el caso del agua como el portador, el agua se purifica y se procesa en gran medida para estar libre de contaminantes, por ejemplo, endotoxinas.
Los compuestos descritos en la presente se van administrar típicamente en mezcla con diluyentes, excipientes, extendedores, o portadores farmacéuticos adecuados (llamados en la presente como un portador farmacéuticamente aceptable, o un portador) seleccionados adecuadamente con respecto a la forma propuesta de administración y como consistente con las practicas farmacéuticas convencionales. De esta manera el compuesto administrable puede estar fabricado en una forma adecuada para administración oral, rectal, tópica, intravenosa, por inyección, inyección intraarticular, o parenteral. Los portadores incluyen sólidos o líquidos, y el tipo de portador se elige basado en el tipo de administración que se utiliza. Aglutinantes, lubricantes, agentes desintegrantes, agentes colorantes, agentes de sabor, agentes inductores de flujo y agentes de fusión adecuados se pueden incluir como portadores, por ejemplo, para pastillas. Por ejemplo, un componente activo se puede combinar con un portador inerte, farmacéuticamente aceptable, no tóxico, oral tal como lactosa, gelatina, agar, almidón, sacarosa, glucosa, metilcelulosa, estearato de magnesio, fosfato de dicalcio, sulfato de calcio, manitol, sorbitol y similares. Los compuestos se pueden administrar oralmente en formas de dosificación sólidas tales como cápsulas, comprimidos, y polvos, o en formas de dosificación liquidas, tales como elixires, jarabes y suspensiones. Los compuestos activos también se pueden administrar parenteralmente, en formas de dosificación liquidas estériles. Las soluciones amortiguadoras para lograr un pH fisiológico u osmolaridad también se pueden utilizar.
EJEMPLOS Ejemplo 1: Caracterización del Objetivo Molecular de la Ligación a Eritrocitos de Ratón Resultados: Para investigar un objetivo molecular para el péptido ERY1, se emplearon téenicas de disminución por afinidad utilizando un péptido soluble biotinilado; este método reveló la glicoforina-A (GYPA) como el ligando ERY1 en la membrana de eritrocitos. Cuando los eritrocitos completos se incubaron con el péptido ERY1 funcionalizado con biotina y un reticulador fotoactivable, se conjugó una sola proteina de 28 kDa con el complejo del péptido-biotina, como es detectado por un análisis de Western blot de estreptavidina . El U sado de reacción se lavó extensivamente y se purificó utilizando cuentas magnéticas de estreptavidina para asegurar las proteínas no etiquetadas del U sado de eritrocitos que permaneció. Como se espera, el péptido coincidente no logró conjugarse a cualquiera de las proteínas de eritrocitos. El péptido coincidente, PLLTVGMDLWPW (SEQ ID NO:2), se designó para contener los mismos residuos de aminoácidos como ERY1, para coincidir su topografía de hidrofobicidad . La evidencia del tamaño evidente de la proteína de interacción sugirió varias proteínas de membrana de pase individual, más pequeñas como probablemente ligandos, particularmente las glicoforinas. El análisis de Western blotting Anti-GYPA de· las mismas muestras purificadas de la reacción de reticulación confirmó que la proteína biotinilada candidato fue GYPA.
La co-localización del fago ERY1 con GYPA se analizó por microscopía confocal de alta resolución. La GYPA se expresa y se presenta naturalmente como parte de un complejo comprendido de varias proteínas de membrana y citoesquelét icas (Mohandas and Gallagher, 2008). Esto es visualmente evidente en la tinción de GYPA, donde el etiquetado no uniforme se observó en la periferia ecuatorial de la célula. El etiquetado con el fago ERY1 produjo topografías de tinción extremadamente similares.
Un coeficiente de solapamiento alto de 0.97 en el análisis de co-localización, corroboró la conclusión de que el fago ERY1 y anti-GYPA se liga a la misma proteina. La agrupación GYPA también se observó en los eritrocitos etiquetados con el fago de biblioteca, sin embargo no fue evidente la ligación del fago de esta manera sin co-localización.
Método: el ERYl (H2N-WMVLPWLPGTLDGGSGCRG-CONH2) (SEQ ID NO:19) y los péptidos coincidentes (H2N-PLLTVGMDLWPWGGSGCRG-CONH2) (SEQ ID NO:20) se sintetizaron utilizando la química f-moc de fase sólida estándar en la resina TGR. El péptido de escindió de la resina en 95% de ácido trifluoroacético, 2.5% de etanoditiol, 2.5% de agua, y se precipitó en éter dietílico helado. La purificación se condujo en una HPLC-MS preparativa Waters utilizando una columna de fase inversa C18.
El péptido ERYl y coincidente se conjugaron a la Mts-Atf-biotina (Thermo Scientific) como se sugirió por el fabricante. En breve, los péptidos se solubilizaron en PBS/DMF y reaccionaron con.1.05 equivalentes de Mts-atf-biotina durante la noche a 4°C. Después de la clarificación de la reacción por centrifugación, el péptido biotinilado se incubó con eritrocitos en PBSA-50 durante 1 h a 37°C, las células se lavaron dos veces en PBS fresco, y se irradiaron con UV a 365 nm durante 8 rain a temperatura ambiente. Las celias se U saron por sonicación y el U sado se purificó utilizando cuentas magnéticas recubiertas con estreptavidina (Invitrogen). El eluato se ejecutó sobre un SDS-PAGE y se transfirió a una membrana de PVDF, y se inmunotiñó con estreptavidina-HRP (R&D Systems) o GYPA anti-ratón.
Ejemplo 2: Caracterización de la Ligación a Eritrocitos Humanos Resultado: Para caracterizar los péptidos seleccionados que se ligan a los eritrocitos humanos, las bacterias que muestran cada péptido individual se sometieron a ensayos de ligación con múltiples tipos de células. Seis (ERY19, ERY59, ERY64, ERY123, ERY141 y ERY162) de siete péptidos se ligaron específicamente a eritrocitos humanos como es comparado con la ligación hacia células 293T epiteliales humanas y HUVECs endoteliales humanas. Adicionalmente, los péptidos se ligaron a la sangre humana tipo A y B, pero no a la sangre de ratón indicando que estos péptidos fueron específicos a la sangre humana, pero no dependientes de los antígenos del grupo sanguíneo común. Los péptidos se sintetizaron utilizando química f-moc de fase sólida estándar, se conjugaron las nanopartículas, y se analizaron para la ligación a tipos de células individuales como en lo anterior. La ligación a las superficies de eritrocitos se estudió utilizando tanto microscopía como citometría de flujo.
Ejemplo 3: Inducción de Tolerancia Inmunológica Específica de Antígeno A través de la Ligación a Eritrocitos No covalentes con antígeno conjugado con Péptido ERY1 o Antígeno conjugado con Péptido de Ligación a Eritrocitos Humanos Para obtener la ligación biofísica potente y específica de un antígeno a los eritrocitos, se utilizó un péptido de 12 aminoácidos sintético (ERY1) que se descubrió por la expresión en fago para ligarse específicamente a la glicoforina-A de ratón (Kontos and Hubbell, 2010). En esta investigación, el antígeno modelo OVA se utilizó con una cepa de ratón transgénico (OT-I) cuya población de células CD8+ T expresa el receptor de célula T específico para el péptido OVA inmunodominante MHC I SIINFEKL (SEQ ID NO:3). El péptido ERY1 se conjugó químicamente al OVA para crear una variante de OVA (ERY1-0VA) que se liga a los eritrocitos de ratón con alta afinidad y especificidad (Figura la). La microscopía confocal de alta resolución confirmó las observaciones anteriores con respecto a la ligación de ERY1 (Kontos y Hubbell, 2010), particularmente la localización a la periferia ecuatorial de la membrana celular, sin translocación intracelular de la proteína conjugada con ERY1. La ligación mediada por ERY1- a la glicoforina-A fue especifica de secuencia, como una variante OVA conjugada con un péptido coincidenté (MIS-OVA), gue contiene aminoácidos idénticos a ERY1 pero mezclados en la secuencia primaria, mostraron ligaciones insignificantes. (Figura Ib). El OVA se conjugó con solo la molécula de reticulación utilizada para conjugar el péptido que no mostró ninguna afinidad medible hacia los eritrocitos, confirmando que la ligación de ERY1-OVA resultó de la interacción no covalente entre el péptido ERY1 y la glicoforina-A en la superficie de eritrocitos. Adicionalmente, el ERY1-OVA se ligó a los eritrocitos con alta afinidad, mostrando una constante disociación similar a anticuerpos (Kd) de 6.2 i 1.3 nM, como es determinado por las mediciones de ligación de equilibrio (Figura le).
La ligación de ERYl-OVA se validó in vivo para los eritrocitos circulant.es después de la administración intravenosa en ratones. Muestras de sangre entera tomadas 30 min después de la inyección de 150 mg de ya sea OVA o ERYl-OVA confirmaron la capacidad de ligación a eritrocitos especifica de ERYl-OVA incluso en medio del entorno heterógeno completo de la sangre y la vasculatura. Consistente con la asociación de glicoforina-A, el ERYl-OVA se ligó a los eritrocitos (CD45~) pero no a los leucocitos (CD45+). La ligación de ERY1-0VA se sesgó para el estado apoptótico de los eritrocitos, ligándose en gran medida a las poblaciones de anexina-V+ y anexina-V CD45. Los estudios farmacocinéticos del conjugado OVA mostraron que la ligación de eritrocitos ERY1-0VA fue de larga vida in vivo, mostrando una vida media de superficie celular de 17.2 h. ERY1-0VA permaneció ligado a los eritrocitos tanto co o 72 h después de la administración; durante este marco de tiempo, aproximadamente 13% de los eritrocitos se eliminaron en el ratón (Khandelwal y Saxena, 2006). La cuantificación del ERY1-OVA ligado a eritrocitos in vivo mostró una carga relativamente alta de 0.174 ± 0.005 ng de OVA por 106 de eritrocitos.
Para excluir cualquiera de los efectos fisiológicos potenciales de la carga de OVA en la función del eritrocito, los parámetros hematológicos se caracterizaron en puntos de tiempo variantes después de la administración intravenosa de ya sea ERY1-OVA u OVA. La ligación de eritrocitos por ERY1-OVA no indujo diferencias detectables en los hematocritos, volumen corpuscular, o contenido de hemoglobina de eritrocitos, como es cómo es comparado con la administración de OVA. Estos resultados muestran que la ligación de eritrocitos mediada por glicoforina-A con el antigeno no alteró sus parámetros hematológicos.
Para revelar los objetivos celulares del antígeno ligado a eritrocitos en la administración, los ratones se inyectaron intravenosamente con proteina aloficocianina sumamente fluorescente, se conjugaron a ya sea péptido ERY1 (ERY1-aloficocianina) o MIS (MIS-aloficocianina). El análisis de citometría de flujo de poblaciones DC esplénicas 12 y 36 h después de la administración mostraron 9.4 veces captación mejorada de ERY1—aloficocianina por MHCII+ CDllb CDllc+ DCs como es comparado con la MIS-aloficocianina, todavía similar a la captación de ERYl-aloficocianina y MIS-aloficocianina por MHCII+ CDllb+ CDllc+ DCs. Adicionalmente, las DCs esplénicas, MHCII+ CD8a+ CDllc+ CD205+ se encontraron para captar la ERYl-aloficocianina a un grado mayor a 3.0 veces que la MIS-aloficocianina, aunque la magnitud absoluta fue notablemente menor que para las otras poblaciones DC en el vaso. Tal objetivo del antigeno hacia DCs esplénica no activadas y CD8a+ .CD205+ podría fortalecer el potencial tolerogénico de la ligación de eritrocitos, ya que estas poblaciones se han implicado extensivamente en la tolerogénesis conducidas por células apoptóticas (Ferquson, Choi, y colaboradores, 2011; Yamazaki, Dudziak, y colaboradores, 2008). En el hígado, la ERYl-aloficocianina también potenció en gran medida la captación por hepatocitos (CD45 MHCII CDld; por 78.4 veces) y las células estrelladas hepáticas (CD45 MHCII+ CDld+; por 60.6 veces) como es comparado con la MIS-aloficocianina; ambas poblaciones se han reportado como células que presentan antigeno que desencadenan la tolerancia de supresión de células CD8+ T (Holz, Warren, y colaboradores, 2010; Ichikawa, Mucida, y colaboradores,_ 2011; Thomson y Knolle, 2010).
Interesantemente, tal captación no se observó en las DCs de hígado (CD45+ CDllc+) o células de Kupffer (CD45+ MHCII+ F4/80+), que sirven como miembros del sistema reticuloendotelial que ayudan en la eliminación de eritrocitos y las partículas recubiertas con complemento. La captación incrementada del antígeno ligado a eritrocitos por la DC esplénica tolerogénica y las poblaciones de células de hígado sugiere el potencial para un mecanismo interconectado complejo de la supresión de células T específicas de antígeno conducida por la diafonía de células esplénicas canónicas y células de hígado no linfoides.
La ligación de eritrocitos de ERY1-OVA se observó para conducir la presentación cruzada eficiente del epítopo MHC I inmunodominante OVA (SIINFEKL) (SEQ ID NO:3) por las APCs y el cebado cruzado correspondiente de las células T reactivas. Las células T OT-I CD8+ etiquetadas con CFSE (CD45.2+) se transfirieron adoptivamente en ratones CD45.1+. Las mediciones se hicieron de la proliferación de las células T OT-I CD8+ durante 5 d después de la administración intravenosa de 10 mg de OVA, 10 pg de ERY1-OVA, o 10 pg de un antigeno de ligación a eritrocitos irrelevante, ERY1-glutationa-S-transferasa (ERY1-GST). La proliferación de células T OT-I CD8+, determinada por la dilución del CFSE de flúor como es medido por la citometría de flujo, se potenció notablemente en ratones administrados con ERYl-OVA comparados con OVA, mostrando que la ligación a eritrocitos incrementó el cebado cruzado de células T CD8+ especificas de antigeno comparado con el antigeno soluble. Resultados similares también se obtuvieron por la administración de una dosis de antigeno 10 veces más baja de 1 mg, mostrando que el intervalo dinámico amplio de eficacia de la proliferación de células T OT-I CD8+ inducida por el antigeno ligado a eritrocitos. Los resultados en la presentación cruzada y el cebado cruzado son consistentes con otros estudios con respecto a la presentación de antigeno tolerogénico en MHC I por las APCs que envuelven el antigeno de las células apoptóticas (Albert, Rearce, y colaboradores, 1998; Green, Ferquson, y colaboradores, 2009).
Para distinguir las células T que se expanden en un fenotipo efector funcional de aquellas que se expanden y suprimen, las células T OT-I CD8+ proliferantes para la anexina-V se analizaron como un sello distintivo de la apoptosis y de esta manera a la supresión. El ERY1-GVA indujo números mucho más altos de células T OT-I CD8+ proliferantes de anexina-V+ que el OVA (Figura 12d), sugiriendo un destino apoptótico que conducirá eventualmente a la supresión clonal. Las mismas células T OT-I CD8+ proliferantes inducidas por la administración de ERYl-OVA mostraron un fenotipo experimentado por antigeno en dosis de tanto 1 como 10 pg, mostrando CD44 regulada por incremento CD62L regulada por decremento. Este fenotipo de células T CD8+ proliferantes es consistente con otros modelos de transferencia adoptivos OT-I reportados en los cuales el acoplamiento del receptor de células T especifico de antigeno regulado por APCs no logra inducir las respuestas inflamatorias (Bursch, Rich, y colaboradores, 2009).
Utilizando un modelo de estimulación a tolerancia OT-I establecido (Liu, Iyoda, y colaboradores, 2002) (Figura 2a), el ERYl-OVA mostró que previene respuestas inmunes subsecuentes a la estimulación con antigeno mediada por vacuna, aun con un adyuvante bacterialmente derivado muy potente. Para inducir tolerancia, los inventores administraron intravenosamente.10 mg de ya sea OVA o ERYl-OVA 1 y 6 d después de la transferencia adoptiva de células T OT-I CD8+ (CD45.2+) a ratones CD45.1+. Después de 9 días adicionales para permitir la supresión potencial de las células T transfectadas, los inventores estimularon ratones recipientes con OVA con adyuvante con lipopolisacárido (LPS) por inyección intradérmica. La caracterización del nodo linfático de drenaje y las células del bazo asi como sus respuestas inflamatorias 4 d después de la estimulación permitió a los inventores determinar si la supresión se llevó a cabo actualmente.
La administración intravenosa de ERY1-OVA dio por resultado reducciones profundas en las poblaciones de células T OT-I CD8+ en los ganglios linfáticos de drenaje (Figura 2; apertura en la Figura- 2b) y los bazos comparados con los ratones administrados con OVA no modificado antes de la estimulación con antigeno con LPS (Figura 2c), mostrando tolerancia de supresión. Los ganglios linfáticos de drenaje de ratones tratados con ERY1-OVA contuvieron más de 11 veces menos células T OT-I CD8+ como son comparadas con los ratones tratados con OVA, y 39 veces menos que los ratones de control de estimulación que no recibieron inyecciones intravenosas de antigeno; las respuestas en las células del bazo fueron similares. Esta supresión clonal eficaz mostrada en los ratones administrados con ERY1-0VA soportó las observaciones anteriores del cebador cruzado de células T OT-I CD8+ mejorado y además muestra que el cebado cruzado se presentó en ausencia de la presentación de APC de moléculas co- estimuladoras para conducir a la tolerancia de supresión.
Para evaluar adicionalmente la respuesta inmunitaria después de la estimulación con antigeno, la naturaleza inflamatoria del nodo linfático residente y las células del bazo se caracterizaron por la expresión del interferón-g (IFNy) por las células T OT-I CD8+ (Figura 2d). Después de la estimulación con OVA y LPS, los ganglios linfáticos de los ratones tratados previamente con ERY1-0VA alojaron 53 veces menos células que expresan IFNy comparados con los ratones de control de estimulación (que no reciben previamente antígenos), y más de 19 veces menos de células que expresan IFNy comparado con los ratones tratados previamente con una dosis equivalente de OVA (Figura 2e), mostrando la importancia de la ligación de eritrocitos en la protección tolerogénica a la estimulación; las respuestas en las células del bazo fueron similares. Además, de la población de células T OT-I CD8+ pequeña presente en los ganglios linfáticos y los bazos de los ratones tratados previamente con ERYl-OVA, un porcentaje más bajo expresó IFNy, sugiriendo la inactivación clonal. Adicionalmente, la magnitud de los niveles de IFNy totales producidas por las células aisladas de los ganglios linfáticos de drenaje en la estimulación SIINFEKL se redujo sustancialmente en los ratones tratados previamente con ERYl-OVA (Figura 2f), la ligación de eritrocitos reduciendo los niveles IFNy 16 veces comparado con la administración OVA y más de 115 veces comparado con los controles de estimulación. Cabe destacar, que el fenómeno sorpresivo también se co-relacionó con la expresión de interleucina-10 regulada por decremento (IL-10), ya que las células de ganglios linfáticos de ratones previamente tratados con ERY1-0VA expresaron 38% y 50% menos IL-10 como son comparados con los ratones de control previamente tratados con OVA y de estimulación, respectivamente (Figura 2g). Se consideró típicamente una citoquina expresada de células T CD4+ reguladoras en el contexto de la comunicación de células APC-T para amortiguar las respuestas Thl (Darrah, Hegde, y colaboradores, 2010; Lee y Kim, 2007), la expresión de IL-10 fue dispensable para la desensibilización a la estimulación. La regulación por decremento de la IL-10 .similar se ha implicado en la tolerogénesis mediada por células T CD8+ (Fife, Guleria, y colaboradores,_ 2006; Arnaboldi,_ Roth-Walter,_ y colaboradores,2009; Saint-Lu, Tourdot, y colaboradores, 2009). La ligación a eritrocitos también atenuó sustancialmente las respuestas inmunes humorales contra el antígeno, ya que los ratones tratados con ERY1-OVA mostraron títulos IgG de suero específicos de antígeno 100 veces más bajos comparados con los ratones tratados con OVA soluble (Figura 2h). Una reducción similar en la reducción del título IgG específico de OVA como resultado de la ligación a eritrocitos se observó en ratones C57BL/6 (CD45.2+) no adaptivamente transferidos. Después de las dos administraciones intravenosas de 1 mg de OVA o ERY1-OVA 7 d aparte, ratones tratados con ERYl-OVA mostraron 39.8 veces menores niveles de IgG en suero específico de OVA 19 d después de la primera administración del antígeno (Fig.3). Esta reducción evidente en la activación de células B, después de la ligación de los eritrocitos por el antígeno, corrobora la hipótesis actual con respecto a la presentación de antígenos no inflamatorios durante la inducción de tolerancia (Miller, Turlcy, y colaboradores, 2007; Green, Ferguson, y colaboradores, 2009; Mueller, 2010).
Para validar adicionalmente la inducción de la tolerancia inmunitaria específica de antígeno, el modelo de estimulación a tolerancia OT-I se combinó con un modelo de injerto de tumor que expresa OVA (Figura 2i). Similar al diseño experimental previo, los ratones se les indujeron tolerancia por dos administraciones intravenosas de 10:pg de ERYl-OVA o después de la transferencia adoptiva de células La supresión de células T marcadas se detectó 5 d después de la primera administración del antígeno, ya que los ratones inyectados con ERYl-OVA alojaron 2.9 veces enos- células T OT-I CD8+ no proliferantes (generación 0) en la sangre (Figura 2j). Para determinar la sensibilidad funcional de las células T OT-I CD8+ proliferantes en ausencia de un adyuvante exógenamente administrado potente, células de timoma EL-4 que expresan OVA (E.G7-0VA) se inyectaron intradérmicamente en la piel del lomo de los ratones 9 d después de la transferencia adoptiva. Para evaluar la eficacia tolerogénica del antigeno ligado a eritrocitos, ratones que llevan tumor se estimularon con OVA con adyuvante LPS 6 d después del injerto del tumor, análogo en dosis y programa al modelo de estimulación a tolerancia. El crecimiento tumoral consistente se observó continuamente en ratones tratados con ERY1-OVA como es comparado con los ratones de control tratados con OVA o no tratados a los 8 d después del injerto del tumor (Figura 2k), confirmando que la proliferación de células T OT-I CD8+ conducida por ERY1-OVA indujo nada de sensibilidad inmune funcional al OVA. El tamaño del tumor se detuvo a un estado permanente 8 d después del injerto que puede ser indicativo de células T OT-I CD8+ residuales que se hablan sometido ya a la tolerancia de supresión conducida por ERY1-OVA.
Animales Autoridades Veterinaria Suizas aprobaron previamente todos los procedimientos animales. Ratones C57BL/6 hembras de 8-12 semanas de edad· (Charles River) se utilizaron para estudios de ligación in vivo y como hospederos del tumor E.G7-0VA. Los ratones C57BL/6-Tg(TcraTcrb) llOOMjb (OT-I) de la izquierda (Jackson Labs) se criaron en la Instalación Animal EPFL Animal, y las hembras se utilizaron para aislamiento de esplenocitos a 6-12 semanas de edad. Ratones B6.SJL-PtprcaPepcVBoy (CD45.1) hembras de 8-12 semanas de edad (Charles River) se utilizaron como hospederos recipientes para estudios de transferencia adoptiva e inducción de tolerancia de células T OT-I CD8+.
Diseño y síntesis del péptido Los péptidos ERY1 (H2N-WMVLPWLPGTLDGGSGCRG-CONH2) (SEQ ID NO:19) y coincidente (H2N-PLLTVGMDLWPWGGSGCRG-CONH2) (SEQ ID NO:20) se sintetizaron utilizando la química f-moc de fase sólida estándar utilizando resina TGR (Nova Biochem) en un manipulador de líquidos automatizado (CHEMSPEED). La secuencia subrayada es la secuencia ERY1 12-mer que se descubrió previamente por la expresión en fago como un ligador de glicoforina-A de ratón (Kontos and Hubbell, 2010). La región GGSG sirvió como un ligador al residuo de cisteína utilizado para conjugación; el residuo de arginina de flanqueo sirvió para reducir la pKa y de esta manera incrementar la reactividad del residuo de cisteína (Lutolf, Tirelli, y colaboradores, 2001). El péptido se escindió de la resina durante 3 h en 95% de ácido trifluoroacético, 2.5% etanoditiol, 2.5% de agua, y se precipitó en éter dietilico helado. La purificación se condujo sobre una HPLC-MS preparativa (atersj utilizando una columna de fase inversa C18 (PerSpective Biosystems).
Conjugación de ERYl -antígeno conj ugación 10 equivalentes molares de succinimidil-4- {N-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato (SMCC, CAS# 64987-85-5, Thermo Scientific) disuelto en dimetilformamida se hicieron reaccionar con 5 mg/mL de OVA sin endotoxina (<1 EU/mg) (Hyglos GmbH) en PBS durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de la desalación sobre una columna giratoria ZEBA Desalt de 2 mL (Thermo Scientific), 10 equivalentes de péptido ERY1 o MIS disueltos en guanidina HCL 3 M se agregaron y se dejaron reaccionar durante 2 horas a temperatura ambiente. El conjugado se desaló utilizando columnas giratorias ZEBA Desalt de 2 mL, se filtraron estériles en 0.2 mm, se dispensaron en alícuotas de trabajo, y se almacenaron a -20°C. La concentración de proteínas se determinó a través del ensayo BCA (Thermo Scientific). El esquema da por resultado la conjugación de la cadena lateral de cisteína en el péptido a las cadenas laterales de lisina en el antígeno. La glutationa-S-transferasa (GST) se expresó en BL21 Escherichia coli y se purificó utilizando cromatografía de afinidad de glutationa estándar. La remoción de endotoxina en la columna se llevó a cabo por el lavado con Triton-X114 (Sigma Aldrich), y la remoción de la endotoxina se confirmó con células THP-1X Blue (InvivoGen). El mismo procedimiento de reacción se utilizó para conjugar ERY1 a GST. La aloficocianina activada con Maleimida (Innova Biosciences) se disolvió en PBS, y se conjugó con ERY1 o MIS como se describe en lo anterior.
Microscopía a la ligación a eritroci tos 5xl05 de eritrocitos de ratón recientemente aislados se expusieron a 100 nM de ERY1-OVA u OVA en PBS que contiene 10 mg/mL de BSA durante 1 hora a 37°C. Después de la centrifugación y lavado, las células se etiquetaron con glicoforina-A anti-ratón de cabra diluido 1:200 (Santa Cruz) y anti-OVA de conejo (AbD SEROTEC) durante 20 minutos sobre hielo. Después de la centrifugación y lavado, las células se etiquetaron con IgG anti-cabra ALEXAFLU0R4 88 1:200 (Invitrogen) e IgG anti-conejo AlexaFluor54 6 (Invitrogen) durante 20 minutos sobre hielo. Después de un ciclo de giro/lavado final, las células se endurecieron y se montaron y se formaron en imágenes sobre un microscopio confocal invertido Zeiss LSM700 con un objetivo de inmersión en aceite 63x. El análisis de imagen se condujo en IMAGEJ (N1H), con procesamiento idéntico para ambas imágenes.
Ligación y biodistribución in vivo 150 mg de ERY1-OVA u OVA en 0.9% de solución salina (B. Braun) en un volumen de 100 mL se inyectó intravenosamente en la cola de ratones C57BL/6 hembras de 8-12 semanas de edad mientras estuvieron bajo anestesia con isofluorano. cuidado para asegurar que los ratones se mantuvieran con una almohadilla térmica durante la experimentación. En los puntos de tiempo predeterminados, 5 pL de sangre se tomaron de una incisión pequeña en la cola, se diluyeron 100 veces en EDTA 10 mM en PBS, se lavaron tres veces con PBS con 10 mg/mL de BSA, y se analizaron para el contenido de OVA por citometría de flujo y ELISA. El OVA se cuantificó por el ELISA de intercalación, utilizando un anticuerpo anti-OVA monoclonal de ratón (Sigma) para captura, un anticuerpo anti-OVA de conejo policlonal (AbD SEROTEC) para detección, un anticuerpo anti-conejo-IgG-HRP de cabra (BioRadj para la detección final, seguido por el substrato TMB (GE Life Sciences). La caracterización hematológica se llevó a cabo en un Sistema de Hematología ADVIVA 2120 (Siemens). El ERY1-GST ligado a eritrocitos se detectó al incubar células etiquetadas con anti-GST de cabra (GE Healthcare Life Sciences), seguido por incubación por anti-cabra de mono AlexaFluor488 (Invitrogen), y se analizó por citometría de flujo. Para los estudios de biodistribución, 20 pg de ERY1- APC o MIS-APC se inyectaron intravenosamente en la vena de la cola de ratones C57BL/6 hembras de 8-12 semanas de edad como se describe en lo anterior. Los ratones se sacrificaron en puntos de tiempo predeterminados, y el bazo, sangre y el hígado se removieron. Cada órgano se digirió con colagenasa D (Roche) y se homogenizó para obtener una suspensión de células individuales para la tinción de citometría de flujo. Transferencia adoptiva de células T Células T CD8+ de bazos de ratón OT-I (CD45.2+) se aislaron utilizando un kit de selección negativo de cuentas magnéticas CD8 (Miltenyi Biotec) conforme las instrucciones del fabricante. Las células OT-I CD8+ recientemente aisladas se volvieron a suspender en PBS y se etiquetaron con 1 mM de éster succinimidílico de carboxif luoresceina (CFSE, Invitrogen) durante 6 minutos a temperatura ambiente, y la reacción se enfrió rápidamente durante 1 minuto con un volumen igual de IMDM con 10% de FBS (Gibco). Las células se lavaron, se contaron, y se re-suspendieron en IMDM puro antes de la inyección. 3xl06 de células CD8+ OT-I etiquetadas con CFSE se inyectaron intravenosamente en la vena de la cola de ratones CD45.1+ recipiente. Para estudios de proliferación de corto plazo, 10 mg de ERY1-OVA u OVA en 100 mL de volumen se inyectaron 24 horas después de la transferencia adoptiva. Los esplenocitos se recolectaron 5 d después de la administración de antigenos y se tiñó para análisis por citometría de flujo.
Tolerancia OT-I y modelo de estimulación 3xl05 de células T OT-I CD8+ etiquetadas con CFSE se inyectaron en ratones recipientes CD45.1+ como se describe en lo anterior. 1 y 6 d después de la transferencia adoptiva, los ratones se les administró intravenosamente 10 mg de ERY1-OVA u OVA en 100 mL de solución salina en la vena de la cola. 15 d después de la transferencia adoptiva, los ratones se estimularon con 5 pg de OVA y 25 ng de LPS de Escherichia coli ultra-pura (InvivoGen) en 25 pL intradérmicamente en cada almohadilla plantar trasera (método Hock, dosis total de 10 pg de OVA y 50 ng de LPS). Los ratones se sacrificaron 4 d después de la estimulación, y las células del bazo y del nodo linfático de drenaje se aislaron para re-estimulación. Para el análisis de citometría de flujo de citoquinas intracelulares, las células se re-estimularon en presencia de 1 mg/mL de OVA o 1 mg/mL del péptido SIINFEKL (SEQ ID NO:3) (Genscript) durante 3 horas. Brefeldin-A (Sigma, 5 pg/mL) se agregó y la re-estimulación se reanudó durante 3 horas adicionales antes de la tinción y el análisis de citometría de flujo. Para las mediciones de ELISA de los factores secretados, las células se re-estimularon en presencia de 100 pg/mL de OVA o 1 pg/mL del péptido SIINFEKL (SEQ ID NO:3) durante 4 d. Las células se hicieron girar y el medio se recolectó para el análisis ELISA utilizando kits Ready-Set-Go de IFNy e IL-10 (eBiosciences) conforme las instrucciones del fabricante. La IgG de suero especifica de OVA se detectó al incubar suero de ratón en diluciones variantes sobre placas recubiertas con OVA, seguido por una incubación final con IgG-HRP anti-ratón de cabra (Southern Biotech). - lxlO6 de células T OT-I CD8+ etiquetadas con CFSE se inyectaron en ratones C57BL/6 hembras de 8-12 semanas de edad como se describe en lo anterior. 1 y 6 d después de la transferencia adoptiva, a los ratones se les administró intravenosamente 10 pg.de ERY1-OVA o 10 mg de OVA en 100 pL de solución salina en la vena de la cola. La sangre se extrajo 5 d después de la transferencia adoptiva para la caracterización de .la proliferación de células T OT-I CD8+ por cito etría de flujo. Las células de timoma EL-4 que expresan OVA (E.G7-OVA, ATCC CRL-2113) se cultivaron conforme las directrices ATCC. En breve, las células se cultivaron en un medio RPMI 1640 complementado con 10% de suero bobino fetal, HEPES 10 mM, piruvato de sodio 1 mM, b-mercaptoetanol 0.05 mM, 1% de puromicina/estreptomicina (Invitrogen Gibco), y 0.4 mg/mL de G418 (PAA Laboratories). Justo antes de la inyección, las células se expandieron en un medio sin G418 y se volvieron a suspender en la recolección en HBSS (Gibco).9 d después de la transferencia adoptiva, los ratones se anestesiaron con isofluorano, el área del lomo se rasuró, y lxlO6 de E.G7-OVA se inyectaron intradérmicamente entre los omoplatos. 4 d después del injerto de E.G7-0VA, las dimensiones del tumor se midieron cada 24 horas con un calibrador digital, y el volumen del tumor se calculó como un elipsoide (n=(p/b) 1 · w · h) , donde V es el volumen, 1 es longitud, w es ancho, y h .es la altura del tumor). 15 d después de la transferencia adoptiva, los ratones se estimularon con 5 mg de OVA y 25 ng de LPS de Eschcrichia coli ultra-pura (InvivoGen) en 25 mL intradérmicamente en cada almohadilla plantar frontal (dosis total de 10 pg de OVA y 50 nc de LPS).
Anticuerpos y ci tometría de flujo Los siguientes anticuerpos anti-ratón se utilizaron para la citometría de flujo: Azul Pacífico CDld, CD3s PerCP-Cy5.5, CD8a PE-Cy7, CDllb PE-Cy7, Azul Pacífico CDllc, CD45 biotinilado, Azul Pacífico CD45.2, Azul Pacífico CD45, IFNy- APC, CD8a APC-eF780, CD44 PE-Cy5.5, CD62L PE, CD205 PE-Cy7, F4/80 PE, I-A/I-E MHCII FITO (todos de eBioscience), además de tinte vivo/muerto fijable (Invitrogen), kit de etiquetado de Anexina-V-Cy5 (BioVision), Anaranjado Pacífico de estreptavidina (Invitrogen), y anti-OVA-FITC (Abcam). Las muestras se analizaron sobre un citómetro de flujo CyAn ADP (Beckman Coulter). Las células se lavaron primero con PBS, se tiñeron durante 20 minutos sobre hielo con tinte vivo/muerto, seguido por 20 minutos sobre hielo con medio de hibridoma 24G2, la superficie se tiñó durante 20 minutos sobre hielo, se fijó en 2% de paraformaldehido durante 20 minutos sobre hielo, se tiñó intracelular ente en presencia de 0.5% de saponina durante 45 minutos sobre hielo, seguido por un lavado final antes del análisis. Para la tinción de la apoptosis, se agregó anexina-V-Cy5 5 minutos antes del análisis. Para la tinción de CD45, las células se tiñeron con Anaranjado Pacifico de estreptavidina durante 20 minutos sobre hielo, se lavaron y se analizaron.
Implementación con partículas El péptido ERY1 también se implemento para tolerogénesis en la forma de nanoparticulas, a las cuales el péptido ERY1 y el antigeno tolerogénico se conjugaron.
Para formar los conjugados de ERY1 con una nanoparticula de polímero, que también se conjuga al péptido o antígeno de proteína, las cantidades estequiométricas de cada componente se pueden agregar consecutivamente para controlar las conversiones de conjugación. Para formar una nanoparticula conjugada con tanto OVA como ERYl o el péptido coincidente, los péptidos primero se disolvieron en guanidina GCL 3M acuosa, y 0.5 equivalentes se agregaron a las nanopartículas que contienen un grupo de piridildisulfuro reactivo con tiol. Las mediciones de la absorbancia se tomaron a 343 nm para monitorear la conversión de reacción, ya que la reacción crea especies de piridina-2-tiona no reactivas con una alta absorbancia en esta longitud de onda. Después de 2 horas a temperatura ambiente, la absorbancia a 343 nm se había estabilizado y el OVA se disolvió en guanidina HCl 3M acuosa, y se agregó a la solución de nanopartículas en un exceso molar de 2 veces. Después de 2 horas a temperatura ambiente, la absorbancia 343 nm se había estabilizado a través a un volumen más alto y las concentraciones de tanto el péptido como OVA en la solución se calcularon. Las nanopartículas biofuncionalizadas se purificaron de componentes no reaccionados de filtración en gel sobre una columna empacada Sepharose CL6B. Cada fracción de 0.5 mL se analizó para la presencia de proteína .y/o péptido por fluorescamina, y el tamaño de nanopartículas se evaluó por dispersión de luz dinámica (DLS).
El antígeno no debe contener ninguno de los grupos tiol libres para llevar a cabo tal reacción, se pueden introducir por teenología de ADN recombinante para crear un mutante que luego se podría expresar y purificar recombinantemente. Alternativamente, la reticulación de amina-ácido carboxílico se podría llevar a cabo entre la nanopartícula y el antígeno utilizando l-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC).
Para formar conjugados de ERYl con una micela de polímero, que también se conjuga al péptido o antígeno de proteína, se podrían utilizar reacciones similares como se describe con las nanopartículas poliméricas. La micela se podría formar para contener grupos funcionales deseados para el esquema de conjugación apropiado. Dado que las nanopartículas y las micelas de los inventores se pueden sintetizar para contener muchas funcionalízaciones de grupo químico diferentes, existen numerosas posibilidades de esquemas de conjugación para emplear en la creación del complejo de nanopartícula/micela-antígeno-ERYl.
Ejemplo 4: Desarrollo de anticuerpo y fragmentos de anticuerpos con aquellos que se ligan a los eritrocitos de ratón y/o humanos Como otro método para ligar no covalentemente eritrocitos, un anticuerpo de ligación a eritrocitos también se puede utilizar para inducir la tolerancia inmunológica específica de antígeno. Los anticuerpos que muestran alta afinidad hacia las proteínas de superficie de eritrocitos se pueden aislar al clasificar bibliotecas de anticuerpos utilizando las plataformas de expresión del estado de la téenica, incluyendo pero no limitado a expresión bacteriófago, expresión de superficie de levadura y E. coli en el descubrimiento del anticuerpo de ligación de eritrocitos novedoso, la caracterización de química similar de la ligación se puede evaluar cómo se llevó a cabo con el péptido ERY1. A fin de crear mutantes de afinidad más alta, con características de ligación mejoradas, la maduración por afinidad se conduce en los fragmentos de anticuerpos descubiertos para ligarse a eritrocitos de la clasificación de bibliotecas inicial. Utilizando las técnicas de ADN recombinante estándares, tal PCR propensa a errores y la mutagénesis dirigida al sitio, se crea una nueva biblioteca de la secuencia de ligación precursora. La biblioteca de maduración por afinidad luego se expresa utilizando plataformas de expresión de estado de la técnica, como se describe en lo anterior, para otros fragmentos de anticuerpos con afinidad mejorada para los eritrocitos como es comparada con la secuencia de ligación precursora.
La maduración por afinidad también se lleva a cabo en anticuerpos existentes que se ligan ya sea a los eritrocitos de ratón o a los eritrocitos humanos. El anticuerpo del clon TER-119 monoclonal de rata (Kina y colaboradores, Br J Haematol, 2000) se liga a los eritrocitos de ratón en un sitio que sin embargo se determina completamente, todavía su especificidad ha conducido a su uso común en la renovación de eritrocitos de las poblaciones celulares heterógenas. La maduración por afinidad se lleva a cabo en el anticuerpo TER-119, ya sea como un anticuerpo de longitud completa o como un fragmento de anticuerpo de longitud completa o como un fragmento de anticuerpo tal como un scFv, para descubrir nuevos anticuerpos con afinidad incrementada hacia los eritrocitos de ratón. El anticuerpo del clon 10F7 monoclonal de ratón (Langlois et al, J Immunol 1984) se liga a la glicoforina-A humana en la superficie celular de los eritrocitos humanos. La maduración por afinidad se lleva a cabo en el anticuerpo 10F7, ya·sea como un anticuerpo de longitud completa o como un fragmento de anticuerpo tal como un scFv, para descubrir nuevos anticuerpos con afinidad incrementada hacia los eritrocitos humanos.
Para determinar la secuencia primaria del anticuerpo TER-119, los inventores clonaron el ADNc aislado especifico de anticuerpo del hibridoma TER-119 en un plásmido que permite la secuenciación fácil de los fragmentos de gen. Un conjunto especifico de cebadores se utilizaron para el proceso de amplificación de PCR de los genes de anticuerpo que permite la amplificación de múltiples dominios variables de los segmentos del gen (Krebber y colaboradores, 1997; Reddy y colaboradores, 2010). La secuencia de ADN de los dominios de anticuerpo permitió a los inventores determinar las regiones variables de las cadenas pesadas y ligeras del anticuerpo TER-119 IgG. Para construir una versión de scFv de la TER-119 IgG, se utilizó la PCR de ensamblaje para crear un gen que comprende la cadena pesada variable de TER-119, seguido por un ligador (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)4 (SEQ ID NO:18), seguido por la cadena ligera variable de TER-119.
La PCR de transcriptasa inversa estándar (RT-PCR) se llevó a cabo en el ARNm de clon de hibridoma TER-119 utilizando el Sistema de Síntesis de Primera hebra Superscript III (Invitrogen) para crear el ADN complementario (ADNc) del clon. La PCR luego se condujo utilizando el siguiente conjunto de cebadores para amplificar específicamente las secuencias de ADN de las regiones pesadas variables (VH) y ligeras variables (VL) del anticuerpo: Los genes VH y VL amplificados luego se digirieron con endonucleasas de restricción (Ncol y Notl para VL, Ndel y HindIII para VH), ·los fragmentos de gen se purificaron después de la electroforesis de agarosa utilizando un kit estándar (Zymo Research, Orange, CA, EUA), y se ligaron en un plásmido de clonación pMAZ360. El plásmido que contiene ya sea el gen VH o VL se secuenció, y un nuevo gen se construyó utilizando la PCR de ensamblaje para crear la secuencia TER-119 scFv: 5'-GAGGTGAAGCTGCAGGAGTGTGGAGGAGGCTTGGTGCAACCTGGGGGGTCTCTGAAAC TCTCCTGTGTAGCCTCAGGATTCACTTTCAGGGACCACTGGATGAATTGGGTCCGGCAGGC TCCCGGAAAGACCATGGAGTGGATTGGAGATATTAGACCTGATGGCAGTGACACAAACTAT GCACCATCTGTGAGGAATAGATTCACAATCTCCAGAGACAATGCCAGGAGCATCCTGTACC TGCAGATGAGCAATATGAGATCTGATTACACAGCCACTTATTACTGTGTTAGAGACTCACC TACCCGGGCTGGGCTTATGGATGCCTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACTGTCTCCTCAGCC GGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTTCTGGCGGCGGCGGCTCCGGTGGTGGTGGATCCG ACATTCAGATGACGCAGTCTCCTTCAGTCCTGTCTGCATCTGTGGGAGACAGAGTCACTCT CAACTGCAAAGCAAGTCAGAATATTAACAAGTACTTAAACTGGTATCAGCAAAAGCTTGGA GAAGCTCCCAAAGTCCTGATATATAATACAAACAATTTGCAAACGGGCATCCCATCAAGGT TCAGTGGCAGTGGATCTGGTACAGATTTCACACTCACCATCAGTAGCCTGCAGCCTGAAGA TTTTGCCACATATTTCTGCTTTCAGCATTATAC.TTGGCCCACGTTTGGAGGTGGGACCAAG CTGGAAATCAAACGTACT-3' (SEQ ID NO:69), que codifica la región VH del clon TER-119 en la N-terminal de la proteina traducida, seguido por un dominio ligador (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)4 (SEQ ID NO:18), seguido por la región VL del clon TER-119 en la C-terminal de la proteina traducida. El gen TER-119 scFv se construyó al amplificar el ADNc TER-119 con los cebadores SK07 y SK08, específicos para la región VH, y SK09 y SK10, específicos para la región VL: Cada producto de gen scFv completado final se dirigió con Sfil y Xhol (NEB, Ipswich, MA, EUA), y se ligó en los mismos sitios en el plásmido de expresión de mamífero (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA).
Para madurar para afinidad el d 10F7 scFv que se liga a la glicoforina-A humana, el gen se sintetizó comercialmente y se obtuvo de DNA2.0 (Menlo Park, CA, EUA) como la siguiente secuencia: 5'-GTTATTACTCGCGGCCCAGCCGGCCATGGCGGCGCAGGTGAAACTGCAGCAGAGCGGC GCGGAACTGGTGAAACCGGGCGCGAGCGTGAAACTGAGCTGCAAAGCGAGCGGCTATACCT TTAACAGCTATTTTATGCATTGGATGAAACAGCGCCCGGTGCAGGGCCTGGAATGGATTGG CATGATTCGCCCGAACGGCGGCACCACCGATTATAACGAAAAATTTAAAAACAAAGCGACC CTGACCGTGGATAAAAGCAGCAACACCGCGTATATGCAGCTGAACAGCCTGACCAGCGGCG ATAGCGCGGTGTATTATTGCGCGCGCTGGGAAGGCAGCTATTATGCGCTGGATTATTGGGG CCAGGGCACCACCGTGACCGTGAGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGC GGCGGCGGCAGCGATATTGAACTGACCCAGAGCCCGGCGATTATGAGCGCGACCCTGGGCG AAAAAGTGACCATGACCTGCCGCGCGAGCAGCAACGTGAAATATATGTATTGGTATCAGCA GAAAAGCGGCGCGAGCCCGAAACTGTGGATTTATTATACCAGCAACCTGGCGAGCGGCGTG CCGGGCCGCTTTAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCAGCTATAGCCTGACCATTAGCAGCGTGG AAGCGGAAGATGCGGCGACCTATTATTGCCAGCAGTTTACCAGCAGCCCGTATACCTTTGG CGGCGGCACCAAACTGGAAATTAAACGCGCGGCGGCGGCCTCGGGGGCCGAGGGCGGCGGT TCT-3' (SEQ ID NO:74).
La maduración por afinidad similar utilizando las téenicas de ADN recombinantes descritas en lo anterior para TER-119 se lleva a cabo en el gen 10F7 para obtener una biblioteca de mutantes para permitir la clasificación para la ligación mejorada hacia los eritrocitos humanos.
Ejemplo 5: Inducción de Tolerancia Inmunológica Especifica de Antigeno a Través de la Ligación de Eritrocitos no Covalentes con Antigeno Conjugado con Anticuerpo El anticuerpo se puede conjugar con el antígeno utilizando reacciones de reticulación estándares como se menciona en el Ejemplo 3 y en cualquier lugar en la presente. El conjugado de anticuerpo-antigeno purificado mostrará la inducción de la tolerancia hacia el antigeno en modelos de ratón estándares de diabetes tipo 1, esclerosis múltiple, trasplante de islotes y antigeno modelo OVA.
A fin de mostrar la inducción de la tolerancia hacia OVA, e] conjugado de OVA-anticuerpo o conjugado de OVA-nanopartícula-anticuerpo se puede administrar ya sea intravenosamente o extravascularmente a los ratones. En un número predeterminado de días después de la administración, los ratones se van a sacrificar y los ganglios linfáticos, el bazo, y la sangre se recolectan para análisis. Los esplenocitos y las células derivadas de ganglios linfáticos se colocan en placas y se re-estimulan durante 3 dias ex vivo co el péptido OVA y/o SIINFEKL, y su regulación por decremento de la expresión de IFNy, IL-17a, IL-2, e IL-4, y la regulación por incremento de TGF- b?, que son evidencia establecida de tolerancia, se miden por el ELISA. La tinción intracelular de IFNy, IL-17a, IL-2, e IL-4 se lleva a cabo utilizando la citometría de flujo en los esplenocitos y las células derivadas de ganglios linfáticos después de 6 h de estimulación ex vivo con el péptido OVA y/o SIINFEKL. Adicionalmente, la citometría de flujo se utiliza para caracterizar los perfiles de expresión de CD4, CD8, y las células T reguladoras del nodo linfático, las células derivadas del bazo, y sangre. Adicionalmente, las muestras de sangre se toman de ratones en punto de tiempo variante para medir las respuestas de anticuerpos humorales hacia el antigeno OVA. Un experimento variante de la re-estimulación ex vivo se lleva a cabo para determinar si la tolerancia sistémica se ha establecido. Los ratones se les administró con conjugado de OVA-anticuerpo o conjugado de OVA-anticuerpo-nanopartícula como se describe en lo anterior, el OVA se vuelve a administrar 9 dias después co un adyuvante (lipopolisacárido, adyuvante de Freud completo, alúmina, u otro), y la sensibilidad dé los esplenocitos al antigeno OVA se evalúa por el ELISA y/o por la citometría de flujo como se describe en lo anterior. El conjugado de OVA-anticuerpo y/o formulación de OVA-anticuerpo-nanoparticula volverá a los esplenocitos no sensibles a la segunda estimulación con OVA y al adyuvante, que es un método para mostrar el establecimiento eficaz de la tolerancia sistémica. Después de la administración inicial con el conjugado de OVA-anticuerpo y/o formulaciones de OVA-anticuerpo-nanoparticula, se pueden conducir experimentos con estimulación in vivo similares con lineas de células transgénicas como una demostración adicional de tolerancia, tal como transferencia adoptiva con células T OT-I, similares a los estudios descritos con detalle en el Ejemplo 3. Para mostrara la tolerancia inmunitaria en los modelos de ratón de autoinmunidad o desinmunización de las moléculas terapéuticas, se pueden fabricar conjugados de anticuerpos análogos a los antigenos relevantes cómo se describió en la presente con el OVA.
Ejemplo 6: Inducción de la Tolerancia Inmunológica Especifica de Antigeno a través de la Ligación de Eritrocitos no Covalentes con el Antigeno Fusionado a Anticuerpo de Cadena sencilla Fragmentos de anticuerpo de cadena sencilla (scFv's) se pueden utilizar como ligadores no covalentes para los eritrocitos. Los ScFv's que muestran alta afinidad hacia las proteínas de superficie de eritrocitos se pueden aislar al clasificar bibliotecas de scFv utilizando plataformas de expresión de estado de·la téenica. En el descubrimiento del fragmento de anticuerpo de ligación a eritrocitos novedoso, la caracterización bioquímica similar de la ligación se va a evaluar cómo se llevó a cabo con el péptido ERY1. Como el scFv tiene una cadena de polipéptido, se fusionará al antígeno en una manera recombinante específica de sitio utilizando técnicas de ADN recombinantes estándares. Dependiendo del carácter del socio de fusión de antígeno, el scFv se fusiona a la N- o C-terminal del antígeno para crear las especies de proteínas bifuncionales. En el caso donde la secuencia de reconocimiento de péptido de complejo de histocompatibilidad mayor (MHC) es conocido para el antigeno, el péptido también se inserta en el dominio ligador del scFv, creando de esta manera un nuevo constructo de anticuerpo/antígeno bifuncional que contiene la terminal nativa del scFv.
A fin de mostrar la inducción de la tolerancia hacia el OVA, un conjugado de OVA-scFv u OVA-nanopartícula-scFv se puede administrar ya sea intravenosamente o extravascularmente a los ratones. En un número predeterminado de días después de la administración, los ratones van a ser sacrificados y los ganglios linfáticos, el bazo, y la sangre se van a recolectar para análisis. Los esplenocitos y las células derivadas de ganglios linfáticos se van a colocar en placas y se van a re-estimular durante 3 dias ex vivo con OVA y/o péptido SIINFEKL (SEQ ID NO:3), y su regulación por decremento de la expresión de IFNy, IL-17a, IL-2, e IL-4, y la regulación por incremento de TGF-bI, que son evidencia establecida de tolerancia, se van a medir, por ejemplo, por el ELISA. La tinción intracelular de IFNy, IL-17a, IL-2, e IL-4 se lleva a cabo utilizando la citometría de flujo en los esplenocitos y las células derivadas de ganglios linfáticos después de 6 horas de re-estimulación ex vivo con OVA y/o péptido SIINFEKL (SEQ ID NO:3). Adicionalmente, la citometria de flujo se puede utilizar para caracterizar los perfiles de expresión de CD4, CD8, y las células T reguladoras de las células derivadas de ganglios linfáticos, bazo y sangre. Adicionalmente, las muestras de sangre se toman de ratones en puntos de tiempo variantes para medir las respuestas de anticuerpo humorales hacia el antigeno OVA. Un experimento variante de la re-estimulación ex vivo se lleva a cabo para determinar la tolerancia sistémica se ha establecido. Los ratones se les administró con OVA-scFv o conjugado de OVA-nanopartícula-scFv como se describe en lo anterior, el OVA se vuelve administrar 9 días después con un adyuvante (lipopolisacárido, adyuvante de Freud completo, alumbre u otro), y la sensibilidad de los esplenocitos al antigeno OVA se evalúa por el ELISA y/o por la citometria de flujo como se describe en lo anterior. El OVA-scFv y/o la formulación de OVA-scFv-nanoparticula volverán los esplenocitos no sensibles a la segunda estimulación con OVA y el adyuvante, ilustrando de esta manera el establecimiento eficaz de la tolerancia sistémica. Después de la administración inicial con OVA-scFv y/o formulaciones de OVA-scFv-nanoparticula se pueden conducir experimentos de experimentos de estimulación in vivo similares con lineas de células transgénicas para mostrar la tolerancia, tal como la transferencia adoptiva con células T OT-I similar a los estudios descritos con detalle en el Ejemplo 3. Para mostrar la tolerancia inmunitaria en los modelos de ratón en la autoinmunidad o desinmunización de las moléculas terapéuticas, se pueden fabricar fusiones de scFv análogas a los antigenos relevantes como se describió en la presente con el OVA.
Las téenicas de ADN recombinante estándares se utilizaron para crear un constructo de anticuerpo que liga tanto eritrocitos de ratón como expresa el epitopo MHC-I inmunodominante del OVA (SGLEQLESIINFEKL) (SEQ ID NO:75). Utilizando la POR de . extensión de solapamiento, los inventores primero crearon un fragmento de ADN que codifica el dominio 3' terminal, incluyendo el péptido SGLEQLESIINFEKL(SEQ ID NO:75) con un dominio 5' solapante que es complementario a la terminal 3' de la secuencia TER119. Este fragmento de ADN se utilizó como un cebador inverso, junto con un cebador 5' delantero complementario, en una PCR estándar para crear el fragmento de ADN completo que codifica TERl19-SGLEQLESIINFEKL (SEQ ID NO:75): 5'- GAGGTGAAGCTGCAGGAGTCTGGAGGAGGCTTGGTGCAACCTGGGGGGTCTCTGAAACTCT CCTGTGTAGCCTCAGGATTCACTTTCAGGGACCACTGGATGAATTGGGTCCGGCAGGCTCC CGGAAAGACCATGGAGTGGATTGGAGATATTAGACCTGATGGCAGTGACACAAACTATGCA CCATCTGTGAGGAATAGATTCACAATCTCCAGAGACAATGCCAGGAGCATCCTGTACCTGC AGATGAGCAATATGAGATCTGATTACACAGCCACTTATTACTGTGTTAGAGACTCACCTAC CCGGGCTGGGCTTATGGATGCCTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACTGTCTCCTCAGCCGGT GGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTTCTGGCGGCGGCGGCTCCGGTGGTGGTGGATCCGACA TTCAGATGACGCAGTCTCCTTCAGTCCTGTCTGCATCTGTGGGAGACAGAGTCACTCTCAA CTGCAAAGCAAGTCAGAATATTAACAAGTACTTAAACTGGTATCAGCAAAAGCTTGGAGAA GCTCCCAAAGTCCTGATATATAATACAAACAATTTGCAAACGGGCATCCCATCAAGGTTCA GTGGCAGTGGATCTGGTACAGATTTCACACTCACCATCAGTAGCCTGCAGCCTGAAGATTT TGCCACATATTTCTGCTTTCAGCATTATACTTGGCCCACGTTTGGAGGTGGGACCAAGCTG GAAATCAAACGTACTCATCATCACCATCATCACGGTGGCGGTTCTGGCCTGGAGCAGCTGG AGTCTATTATTAATTTCGAAAAACTG-3' (SEQ ID NO:76). La secuencia subrayada indica el segmento de gen que codifica SGLEQLESIINFEKL. El fragmento de ADN se insertó en un vector de expresión de mamífero y procariótico para la expresión recombinante.
Las téenicas de ADN recombinante estándares se utilizaron para crear un constructo de anticuerpo que liga tanto eritrocitos de ratón como expresa el mimetopo de cromogranina-A 1040-p31 (YVRPLWVRME) (SEQ ID NO:77). Utilizando la PGR de extensión de solapamiento, se creó un fragmento de ADN que codificó el dominio 3' terminal, incluyendo el péptido YVRPLWVRME (SEQ ID NO:77) con un dominio 5' de solapamiento que es complementario a la terminal 3' de la secuencia TER119. Este fragmento de ADN se utilizó como un cebador, junto con un cebador 5' delantero complementario, en una PCR estándar para crear el fragmento de ADN completo que codifica TER1.19-YVRPLWVRME: 5'- GAGGTGAAGCTGCAGGAGTCAGGAGGAGGCTTGGTGCAACCTGGGGGGTCTCTGAAACTCT CCTGTGTAGCCTCAGGATTCACTTTCAGGGACCACTGGATGAATTGGGTCCGGCAGGCTCC CGGAAAGACCATGGAGTGGATTGGGGATATTAGACCTGATGGCAGTGACACAAACTATGCA CCATCTGTGAGGAATAGATTCACAATCTCCAGAGACAATACCAGGAGCATCCTGTACCTGC AGATGGGCAATATGAGATCTGATTACACAGCCACTTATTACTGTGTTAGAGACTCACCTAC CCGGGCTGGGCTTATGGATGCCTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACTGTCTCCTCAGCCGGT GGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTTCTGGCGGCGGCGGCTCCGGTGGTGGTGGATCCGACA TTCAGATGACGCAGTCTCCTTCAGTCCTGTCTGCATCTGTGGGAGACAGAGTCACTCTCAA CTGCAAAGCAAGTCAGAATATTAACAAGTACTTAAACCGGTATCAGCAAAAGCTTGGAGAA GCTCCCAAAGTCCTGGTATATAATACAAACAATTTGCAAACGGGCATCCCATCAAGGTTCA GTGGCAGTGGATCTGGCACAGATTTCACACTCACCATCAGTAGCCTGCAGCCTGAAGATTT TGCCACATATTTCTGCTTTCAGCATTATACTTGGCCCACGTTTGGAGGTGTGACCAAGCTG GAAATCAAACGTACTCATCATCACCATCATCACGGTGGCGGTTATGTCAGACCTCTGTGGG TCAGAATGGAA-3'(SEQ ID NO:78). La secuencia subrayada indica el segmento de gen que codifica el mimetopo cromogranina-A (1040-p31) (YVRPLWVRME) (SEQ ID NO:77). El fragmento de ADN se insertó en un vector de expresión de mamífero y procariótico para la expresión recombinante.
Téenicas de ADN recombinantes estándares se utilizaron para crear un constructo.de anticuerpo que se liga tanto eritrocitos de ratón como expresa la pro-insulina de ratón, un autoantígeno de diabetes mayor en el;ratón NOD. Utilizando la PCR de extensión de solapamiento, los inventores primero crearon un fragmento de ADN que codificó el dominio 3' terminal, incluyendo la proteina proinsulina completa, con un dominio 5' solapante que es complementario a la terminal 3' de la secuencia TER119. Este fragmento de ADN se utilizó como un cebador, junto con un cebador 5' delantero complementario, en una PCR estándar para crear el fragmento de ADN completo que codifica la TER119-proinsulina: 5'- GAGGTGAAGCTGCAGGAGTCAGGAGGAGGCTTGGTGCAACCTGGGGGGTCTCTGAAACTCT CCTGTGTAGCCTCAGGATTCACTTTCAGGGACCACTGGATGAATTGGGTCCGGCAGGCTCC CGGAAAGACCATGGAGTGGATTGGAGATATTAGACCTGATGGCAGTGACACAAACTATGCA CCATCTGTGAGGAATAGATTCACAATCTCCAGAGACAATGCCAGGAGCATCCTGTACCTGC AGATGAGCAATATGAGATCTGATTACACAGCCACTTATTACTGTGTTAGAGACTCACCTAC CCGGGCTGGGCTTATGGATGCCTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACTGTCTCCTCAGCCGGT GGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTTCTGGCGGCGGCGGCTCCGGTGGTGGTGGATCCGACA TTCAGATGACGCAGTCTCCTTCAGTCCTGTCTGCATCTGTGGGAGACAGAGTCACTCTCAA CTGCAAAGCAAGTCAGAATATTÁACAAGTACTTAAACTGGTATCAGCAAAAGCTTGGAGAA GCTCCCAAAGTCCTGATATATAATACAAACAATTTGCAAACGGGCATCCCATCAAGGTTCA GTGGCAGTGGATCTGGTACAGATTTCACACTCACCATCAGTAGCCTGCAGCCTGAAGATTT TGCCACATATTTCTGCTCTCAGCATTATACTTGGCCCACGTTTGATGGTGGGACCAAGCTG GAAATCAAACGTACTCATCATCACCATCATCACGGTGGCGGTTTTGTGAAACAGCATCTGT GCGGTCCGCATCTGGTGGAAGCGCTGTATCTGGTGTGCGGCGAACGTGGCTTTTTTTATAC CCCGAAAAGCCGTCGTGAAGTGGAAGATCCGCAGGTGGAACAGCTGGAACTGGGCGGCAGC CCGGGTGATCTGCAGACCCTGGCCCTGGAAGTGGCGCGTCAGAAACGTGGCATTGTGGATC AGTGCTGCACCAGCATTTGCAGCCTGTATCAGCTGGAAAACTATTACAAC-3' (SEQ ID NO:79). La secuencia subrayada indica el segmento del gen de proinsulina del constructo. El fragmento de ADN se insertó en un vector de expresión de mamífero y procariótico para la expresión recombinante.
Ejemplo 7: Síntesis de Polímero. Ramificados que Comprenden ligandos de ligación a Eritrocitos y Otras Funciones Para la síntesis de PEG-tioacetato de 8 brazos, PEG-OH de 8 brazos (Nektar) se disolvió en tolueno y se hizo reaccionar durante 18 h con 10 equivalentes de trietilamina (Sigma Aldrich, CAS# 121-44-8] y 10 equivalentes de cloruro de metanosulfonilo (Sigma Aldrich, CAS# 124-63-0) a temperatura ambiente bajo argón. El residuo se filtró y el material filtrado se concentró bajo presión reducida, se disolvió en dimetilformamida (DMF), y se agregaron 10 equivalentes de tioacetato de potasio (Sigma Aldrich, CAS# 10387-40-3). Después de 18 horas a temperatura ambiente, el residuo se filtró, el material filtrado se concentró bajo presión reducida y se precipitó en éter dietílico. El precipitado se filtró y se secó bajo presión reducida para obtener el producto final.
Para la síntesis de PEG-piridildisulfuro de 8 brazos, PEG-tioacetato de 8 brazos se disolvió en dimetilformamida (DMF) y se desprotegió con 1.05 equivalentes de metóxido de sodio (Sigma Aldrich, CAS# 124-41-4) durante 1 horas a temperatura ambiente bajo argón en un tubo Schlenk. Para reducir los tioles desprotegidos a tiolatos, 2 equivalentes de clorhidrato de Tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP, Thermo Scientific, CAS# 51805-45-9) y 2 equivalentes de agua destilada se agregaron a la solución. Después de 2 horas a temperatura ambiente, se agregaron 12 equivalentes de 2,2'-ditiodipiridina (Aldrithiol-2, Sigma Aldrich, CAS# 2127-03-9) y la solución se agitó a temperatura ambiente durante 24 horas. La mezcla de re reacción luego se digitalizó contra 5 L de agua destilada en una tubería de diálisis MWCO 3,500 Da durante 48 horas, durante lo cual el agua destilada se cambió 4 veces. La carga de piridildisulfuro sobre el PEG de 8 brazos se cuantificó por reducción en TCEP 25 mM en HEPES 100 mM, pH 8.0, y los espectros de UV-vis se midieron a 343 nm para monitorear la presencia de grupo saliente de piridina-2-tiona.
Para la síntesis de PEG-piridildisulfuro-ALEXAFLUOR647 de 8 brazos, PEG-tioacetato de 8 brazos se disolvió en DMF y se desprotegió con 1.05 equivalentes de metóxido de sodio (Sigma Aldrich, CAS# 124-41-4) durante 1 horas a temperatura ambiente bajo argón en un tubo Schlenk. Para reducir los toles desprotegidos a tiolatos, 2 equivalentes de clorhidrato de Tris(2-carboxietil).fosfina (TCEP, Thermo Scientific, CAS# 51805-45-9) y un volumen igual de HEPES 100 mM pH 8.0 se agregaron a la solución.·Después de 2 horas a temperatura ambiente, 0.125 equivalentes (equivalente a 1 brazo de 8) de AlexaFluor647-C2-maleimida (Invitrogen) se agregaron a la solución. Después de 2 horas a temperatura ambiente, se agregaron 12 equivalentes de 2,2'-ditiodipiridina (Aldrithiol-2, Sigma Aldrich, CAS# 2127-03-9) y la solución se agitó a temperatura ambiente durante 24 horas. La mezcla de reacción luego se dializó contra 5 L de agua destilada en una tubería de diálisis MWCO 3,500 Da durante 48 horas, durante lo cual el agua destilada se cambión 4 veces. La carg a de piridildisulfuro sobre el PEG de 8 brazos se cuantificó por la reducción en TCEP 25 mM en HEPES 100 mM, pH 8.0, y los espectros UV-vis se diluyeron a 343 nm para monitorear la presencia del grupo saliente de piridina-2-tiona.
Los péptidos que -contienen tiol se conjugaron al PEG-piridildisulfuro de 8 brazos al agregar cantidades estequiométricas del péptido, disueltos en guanidina-HCl 3 M acuosa (Sigma Aldrich, CAS# 50-01-10), a la solución acuosa de PEG-piridildisulfuro de 8 brazos a temperatura ambiente. La conversión de reacción se monitoreó al medir los espectros UV-vis a 343 nm para cuantificar la presencia del grupo saliente de piridina-2-tiona. Si más de una molécula estuvo para ser conjugada al PEG-piridildisulfuro de 8 brazos, el procedimiento de reacción se repitió con la nueva molécula en el mismo punto. Una vez qué la conjugación se terminó, la mezcla de reacción se desaló en una columna de desalación ZEBASPIN (Thermo Scientific), y el producto purificado se almacenó bajo condiciones estériles apropiadas.
La inducción de la tolerancia hacia OVA podría ser mostrada para el conjugado de PEG-ERY1/MIS-SIINFEKL de 8 brazos (SIINFEKL: SEQ ID NO:3) al administrarlo ya sea intravenosamente o extravascularmente a los ratones. Esta prueba también indicaría la inducción de la tolerancia en humanos utilizando ligandos específicos de humanos. En tal demostración, un número predeterminado de días después de la administración, los ratones se sacrificarían y los ganglios linfáticos, el bazo, y la sangre se recolectarían para el análisis. Los esplenocitos y células derivadas de ganglios linfáticos se colocan en placas y se re-estimulan durante 3 días ex vivo con OVA y/o péptido SIINFEKL (SEQ ID NO:3), y su regulación por decremento de la expresión de IFNy, IL-17a, IL-2, e IL-4, y la regulación por incremento de TGF-bI, que son evidencia establecida de tolerancia, se miden por el ELISA. La tinción intracelular de IFNy, IL-17a, IL-2, e IL-4 se lleva a cabo utilizando la citometría de flujo sobre los esplenocitos y las células derivadas de ganglios linfáticos después de 6 horas de la re-estimulación ex vivo con OVA y/o péptido SIINFEKL (SEQ ID N0:3). Adicionalmente, la citometría de flujo se utilizó para caracterizar los perfiles de expresión de CD4, CD8, y las células T reguladoras de células derivadas de ganglios linfáticos, bazo y sangre. Adicionalmente, las muestras de sangre se toman de ratones en puntos de tiempo variantes para medir las respuestas de anticuerpo humorales hacia el antígeno OVA. Un experimento variante de la re-estimulación ex vivo se lleva a cabo para determinar si la tolerancia sisté ica se ha establecido. Los ratones se les administra con conjugados de PEG-ERY1/MIS-SIINFEKL de 8 brazos (SIINFEKL: SEQ ID NO:3) como se describe en lo anterior, el OVA se re-administra 9 días después con un adyuvante (lipopolisacárido, adyuvante de Freud completo, alumbre, u otro), y la sensibilidad de los esplenocitos al antígeno OVA se avalúa por el ELISA y/o por la citometría de flujo como se describe en lo anterior. La formulación del conjugado PEG-ERY1-SIINFEKL de 8 brazos (SIINFEKL: SEQ ID NO:3) volverá los esplenocitos no sensibles a la segunda estimu ación con OVA y adyuvante, que es un método para ilustrar establecimiento efectivo de la tolerancia sistémica. Después de la administración inicial de las formulaciones de conjugado de PEG-ERY1/MIS-SIINFEKL de 8 brazos (SIINFEKL: SEQ ID NO:3), se podrían conducir experimentos de estimulación in vivo similares con líneas de células transgénicas para mostrar adicionalmente la tolerancia, tal como transferencia adoptiva con células T OT-I, similar a los estudios descritos con detalle en el Ejemplo 3. Para mostrar la tolerancia inmunitaria en los modelos de ratón de auto-inmunidad o desinmunización de las moléculas terapéuticas, se pueden fabricar constructos de PEG de 8 brazos análogos a los antígenos relevantes co o se describió en la presente con SIINFEKL (SEQ ID NO:3).
Ejemplo 8: Inducción de tolerancia Inmunológica específica de antígeno a través de la Ligación de Eritrocitos no Covalentes con el Antígeno conjugado a Aptámero Los métodos se püeden llevar a cabo utilizando otros reactivos de bioactividad no de anticuerpo para medir su capacidad de inducir tolerancia inmunológica a través de la ligación de eritrocitos no covalentes. Otras porciones de afinidad basadas en proteína, tales como proteínas de repetición de anquirina diseñadas (DARPins) (Steiner, Forrer, y colaboradores, 2008), proteínas de repetición de armadillo diseñadas (Parmeggiani, Pellarin, y colaboradores, 2008), dominios de fibronectina (Hackel, Kapila, y colaboradores, 2008), y andamios de afinidad de cisteina-nudo (knottin) (Silverman, Levin, y colaboradores, 2009) se clasifican para aquellos que muestran afinidad de.ligación a eritrocitos.
La clasificación de bibliotecas para descubrir los aptámeros de ADN/ARN de alta afinidad hacia los eritrocitos se conduce utilizando el método de evolución sistémica de Ligandos por Enriquecimiento Exponencial (SELEX) bien establecido (Archemix, Cambridge, MA, EUA) (Sampson, 2003). En el descubrimiento de las secuencias de ADN/ARN novedosos que se ligan a eritrocitos con ala afinidad, se sintetizan químicamente para incluir un grupo reactivos químico adicional sobre ya sea su terminal 3' o 5' para conjugación a una micela/nanopartícula de antígeno y/o polímero. El aptámero químicamente sintetizado, por ejemplo, aloja un grupo NH2 reactivo, que se conjuga a través de la química de conjugación EDC/NHS con los grupos COOH presentes en ya sea nanoparticula o antígeno o en el complejo de nanopartícula-antigeno, para crear un solo bioconjugado que comprende el aptámero de ligación a eritrocitos y el antígeno o antígeno-nanopartícula. Varias téenicas de conjugación química se intentan al alterar los grupos reactivos ortogonales y los esquemas de conjugación en tanto el aptámero, antígeno, como y/o antígeno-nanopartícula.
A fin de mostrar la inducción de la tolerancia hacia el OVA, el OVA-aptámero o conjugado de OVA-nanopartícula-aptámero se administra ya sea intravenosamente o extravascular ente a los ratones. En un número predeterminado de dias después de la administración, los ratones se sacrifican y los ganglios linfáticos, el bazo, y la sangre se recolectan para análisis. Los esplenocitos y las células derivadas de ganglios linfáticos se colocan en placas y se re-estimulan durante 3 dias ex vivo con OVA y/o péptido SIINFEKL (SEQ ID N0:3), y su regulación por decremento de la expresión de IFNy, IL-17a, IL-2, e IL-4, y la regulación por incremento de TGF-bI, que es evidencia establecida de tolerancia, se mide por el ELISA. La tinción intracelular de IFNy, IL-17a, IL-2, e IL-4 se lleva a cabo utilizando citometria de flujo sobre los esplenocitos y las células derivadas de ganglios linfáticos después de 6 horas de re-estimulación ex vivo con OVA y/o péptido SIINFEKL (SEQ ID NO:3). Adicionalmente, la citometria de flujo se utiliza para caracterizar los perfiles de expresión de CD4, CD8, y las células T reguladoras de células derivadas de ganglios linfáticos, bazo y sangre. Adicionalmente, las muestras de sangre se toman de ratones en puntos de tiempo variantes para medir las respuestas de anticuerpos humorales hacia el antigeno OVA. Un experimento variante de la re-estimulación ex vivo se lleva a cabo para determinar si la tolerancia sistémica se ha establecido. A los ratones se les administra con OVA-anticuerpo o conjugado de OVA-anticuerpo-nanopartí cula como se describe en lo anterior, el OVA vuelve administrar 9 dias después con un adyuvante (lipopolisacárido, adyuvante de Freud completo, alumbre, u otro), y la sensibilidad de los esplenocitos al antigeno OVA se evalúa por el ELISA y/o citometria de flujo como se describe en lo anterior. El OVA-anticuerpo y/o formulaciones de OVA-anticuerpo-nanoparticula se espera que vuelvan los esplenocitos no sensibles a la segunda estimulación con OVA y adyuvante, ilustrando de esta manera el establecimiento efectivo de la tolerancia sistémica. Después de la administración inicial con el OVA-aptámero y/o formulaciones de OVA-aptámero-nanoparticula, se conducirán experimentos de estimulación in vivo similares con lineas de células transgénicas para mostrar la tolerancia, tal como transferencia adoptiva con células T OT-I, similar a los estudios descritos con detalle en el Ejemplo 3. Para mostrar la tolerancia inmunitaria en los modelos de ratón de autoinmunidad o desinmunización de moléculas terapéuticas, se fabrican constructos de aptámero análogos a los antigenos relevantes como se describe en la presente con el OVA.
Ejemplo 9: Caracterización de 1a Ligación a Eritrocitos Humanos Para caracterizar los péptidos bacterialmente expresados seleccionados que se ligan a los eritrocitos humanos en un contexto expresado ño de células, los péptidos se sintetizaron químicamente y se conjugaron a la proteína fluorescente aloficocianina (APC). De esta manera, la capacidad de ligación a eritrocitos de cada péptido se caracterizó en un contexto soluble, es decir como un conjugado de proteína. Como se mostró en la Figura 6, los péptidos ERY64, ERY123, y ERY141 se ligaron a los eritrocitos humanos como conjugados de APC Método de conjugación de APC-péptido Los péptidos se ordenaron y se sintetizaron a la medida a través de la síntesis de péptidos de fase sólida fmoc estándar del Grupo PolyPeptide (Strasbourg, France). 10 equivalentes de péptido disuelto en guanidina HCl 3 M se agregaron a 2 mg/mL de APC activado con maleimida (InnovaBiosciences, Cambridge, UK) en PBS. Después de 4 horas de incubación a 4°C, la reacción se desaló sobre una columna de desalación ZEBA de 2 mL (Thermo Scientific) y se almacenó a 4°C.
Cuantificación de la ligación a eritrocitos por el método de citometría de flujo Sangre humana recientemente aislada se disolvió 100 veces en PBS complementado con 20 mg/mL de BSA. 5xl05 de eritrocitos se agregaron a 150 mL de 1 mM de conjugado de APC-péptido y se incubaron a 37°C durante 45 minutos. Las células se lavaron extensivamente en PBS + 20 mg/mL de BSA, y se analizaron para fluorescencia para APC sobre un citometro de flujo CyAn ADP (Beckman Coulter).
Ejemplo 10: Inducción de la Tolerancia inmunológica especifica de Antige.no a Través de la Ligación de Eritrocitos con Antigeno Fusionado a Anticuerpo de Cadena sencilla Se creó una fusión recombinante de un scFv al dominio inmunodominante MHC-I de OVA, SIINFEKL. El scFv resultante (en la presente llamado TER119-SIINFEKL) se ligó a eritrocitos de ratón, como se muestra por la citometria de flujo en la Figura 7.
Puesto que el ERY1-0VA ha mostrado en la presente que induce esta tolerancia, es un sistema útil para caracterizar eventos inmunológicos. Se determinó que la ligación a eritrocitos de ERY1-OVA condujo a la presentación cruzada eficiente de epitopo MHC I inmunodominante OVA (SIINFEKL) por las células que presentan antigeno (APCs) y el cebado cruzado correspondiente de las células T reactivas. Las células T OT-I CD8+ etiquetadas con CFSE (CD45.2+) se transfirieron adoptivamente en ratones CD45.1+, y luego la proliferación de las células T OT-I CD8+ durante 5 dias se midió después de la administración intravenosa de 10 mg de OVA, 10 pg de ERY1-OVA, un dosis equimolar de TER119-SIINFEKL, o una dosis equimolar de SIINFEKL. La proliferación de células T OT-I CD8+, determinada por dilución de CFSE de flúor como se mide por la citometria de flujo, se potenció notablemente en los ratones administrados con TER119-SIINFEKL comparado con ERY1-OVA u OVA (Figura 8), mostrando que la ligación a eritrocitos incrementó el cebado cruzado de células T CD8+ especificas de antigeno comparado con el antigeno soluble SIINFEKL.
Para distinguir las células T que se expanden en un fenotipo efector funcional de aquellos que se expanden y suprimen, las células T OT-I CD8+·proliferantes se analizaron para la anexina V, como una marca distintiva de la apoptosis y de esta manera lá supresión, asi como la muerte-1 programada por marcador de agotamiento (PD-1). TER119- SIINFEK - A indujeron números; mucho más altos de células proliferantes de Anexina-V+ y PD-1+ que el OVA (Figura 9).
Utilizando un modelo de estimulación a tolerancia OT-I establecido (Liu, Iyoda, y colaboradores, 2002), la capacidad del TERl19-SIINFEKL y ERYl-OVA para prevenir las respuestas inmunes subsecuentes a la estimulación con antigeno mediado por vacuna se mostró, aún con Una estimulación que implica un adyuvante bacterialmente derivado muy potente. Para inducir tolerancia, 10 mg de ya sea OVA o ERY1-OVA, o una dosis equimolar de TER119-SIINFEKL se administraron intravenosamente a 1 y 6 dias después de la transferencia adoptiva de células T OT-I CD8+ .(CD45.2+) a ratones CD45.1+. Después de 9 dias adicionales para permitir la supresión potencial de las células T transferidas, los ratones recipientes luego se estimularon con OVA adyuvante con lipopolisacárido (LPS) por inyección intradérmica . La caracterización de células de ganglios linfáticos de drenaje y bazo asi como sus respuestas inflamatorias 4 d después de la estimulación permitieron una determinación en cuanto si la supresión se lleva a cabo actualmente o no.
La administración intravenosa de TER119-SIINFEKL o ERY1-OVA dio por resultado reducciones profundas en las poblaciones de células T OT-I CD8+ en los ganglios linfáticos de drenaje y bazos comparados con los ratones suministrados con OVA no modificado antes de la estimulación con antigeno con LPS, mostrando tolerancia de supresión. Los ganglios linfáticos de drenaje de ratones tratados con ERY1-0VA contuvieron más de 11 veces menos células T OT-I CD8+ como es comparado con ratones tratados con OVA, y 39 veces menos que los ratones de control de estimulación que no recibieron inyecciones intravenosas de antígeno, las respuestas en las células del bazo fueron similares. Los ganglios linfáticos de drenaje de ratones tratados con TER119-SIINFEKL contuvieron más de 13 veces menos células T OT-I CD8+ como son comparados con los ratones tratados con OVA y más de 42 veces menos que los ratones de control de estimulación que no recibieron inyecciones intravenosa de antígeno; las respuestas en las células del bazo fueron similares. Esta supresión clonal eficaz mostrada en los ratones administrados con TER119-SIINFEKL o ERY1-0VA soportó las observaciones anteriores del cebado cruzado de células T OT-I CD8+ mejorado (Figura 8) y muestra adicionalmente que el cebado cruzado se presentó en ausencia de la presentación de APC de moléculas co estimuladoras para conducir a la tolerancia de supresión.
Para evaluar adicionalmente la respuesta inmunitaria después de la estimulación con antígeno, el carácter inflamatorio de las células de nodo linfático y bazo residentes se caracterizó por la expresión del interferón-g (IFNy) por células T OT-I CD8+ (Figura 10). Después de la estimulación con OVA y LPS, los ganglios linfáticos de los ratones tratados previamente con ERYl-OVA alojaron 10 veces menos células que expresan IFNy comparados con los ratones de control de estimulación (que no reciben previamente antígenos), y más de 4 veces menos células que expresan IFNy comparados con los ratones previamente tratados con una dosis equivalente de OVA. Después de la estimulación con OVA y LPS, los ganglios linfáticos de los ratones tratados previamente con TER119-SIINFEKL alojaron 33 veces menos que expresan IFNy comparados con los ratones de control de estimulación (que no reciben previamente antigeno), más de 14 veces menos células que expresan IFNy comparados con los ratones tratados previamente con una dosis equivalente de OVA, mostrando la importancia de la ligación a eritrocitos en la protección tolerogénica a la estimulación; las respuestas en las células del bazo fueron similares.
Métodos Animales Autoridades veterinarias suizas aprobaron previamente todos los procedimientos animales. Ratones C57BL/6-Tg(TcraTcrb) llOOMjb (OT-I) (Jackson Labs) se criaron en 1a instalación animal EPFL, y las hembras se utilizaron para aislamiento de esplenocitos a las 6-12 semanas de edad. Ratones B6 .SJL-PtprcaPepcVBoy (CD45.1) hembras de 8-12 semanas de edad (Charles River) se utilizaron como hospederos recipientes para estudios de inducción de transferencia tolerancia adoptivas de células - Diseño del péptido y métodos de El péptido ERYl (H2N-WMVLPWLPGTLDGGSGCRG-CONH2) (SEQ ID NO:128) se sintetizó utilizando la química f-moc de fase sólida estándar que utiliza resina TGR (Nova Biochem) en un manipulador de líquidos automatizado (Chemspeed). La secuencia subrayada es la secuencia ERY1 12-mer que los inventores descubrieron previamente por la expresión en fago como un ligador de glicoforina-A de ratón (Kontos y Hubbell, 2010). La región GGSG sirvió como un ligador al residuo de cisteína utilizado para conjugación; el residuo de arginina de flanqueo sirvió para reducir la pKa y de esta manera incrementar la actividad del residuo de cisteína (Lutolf, Tirelli, y colaboradores, 2001). El péptido se escindió de la resina durante 3 horas en 95% de ácido trifluoroacético, 2.5% de etanoditiol, 2.5% de agua, y se precipitó en éter dietílico helado. La purificación se condujo sobre una HPLC-MS preparativa (Waters) ·utilizando una columna de fase inversas C18 (PerSpective Biosystems).
Métodos de conjugación de ERYl-antigeno 10 equivalentes molares de succinimidil-4-( N-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato (SMCC, CAS# 64987-85-5, Thermo Scientific) disueltos en dimetilformamida se hicieron reaccionar con 5 mg/mL de OVA sin endotoxina (<1 EU/mg) (Hyglos GmbH) en PBS durante 1 horas a temperatura ambiente. Después de la desalación sobre una columna giratoria ZEBA Desalt de 2 mL (Thermo Scientific), 10 equivalentes de péptido ERY1 disueltos en guanidina-HCl 3 M se agregaron y se dejaron reaccionar durante 2 horas a temperatura ambiente. El conjugado se desaló utilizando columnas giratorias Zeba Desalt de 2 mL, se filtraron estériles a 0.2 mm, se dispensaron en alícuotas de trabajo y se almacenaron a -20°C. La concentración de proteínas se determinó a través del ensayo BCA (Thermo Scientific). El esquema da por resultado la conjugación de la cadena lateral de cisteína en las cadenas laterales de péptido a lisina en el ántígeno.
Método de transferencia adoptiva de células T Células T CD8+ del bazo de ratón OT-I (CD45.2+) se aislaron utilizando un kit de selección negativo de cuentas magnéticas CD8 (Miltenyi Biotec) conforme a las instrucciones del fabricante. Las células T CD8+ OT-I recientemente aisladas se volvieron a suspender en PBS y se etiquetaron con 1 mM de éster de succimidilo de carboxifluoresceína (CFSE, Invitrogen) durante 6 min a temperatura ambiente, y la reacción se enfrió rápidamente durante 1 min con un volumen igual de IMDM con 10% FBS (Gibco). Las células se lavaron, se contaron, y se volvieron a suspender en IMDM puro antes de la inyección. 3xl06 de células CD8+ OT-I etiquetadas con CFSE se inyectaron intravenosamente en la vena de la cola de ratones CD45.1+ recipientes. Para estudios de proliferación a corto plazo, 10 mg de ERY1-OVA u OVA, o una dosis equimolar de TER119-SIINFEKL en un volumen de 100 mL se inyectaron 24 h después de la transferencia adoptiva. Los esplenocitos se recolectaron 5 d después de la administración del antígeno y se tiñeron para análisis por citometria de flujo. Tolerancia OT-I y métodos de modelo de estimulación 3xl05 de células T OT-I CD8+ etiquetadas con CFSE se inyectaron en ratones recipientes CD45.1+ como se describe en lo anterior.1 y 6 d después de la transferencia adoptiva, a los ratones se les administró intravenosamente 10 mg de ERY1-OVA u OVA, o una dosis equimolar de TER119-SIINFEKL en 100 pL de solución salina en la vena de la cola.15 de después de la transferencia adoptiva, los ratones se estimularon con 5 pg de OVA y 25 ng de LPS de Escherichia coli ultra pura (InvivoGen) en 25 pL intradérmicamente en cada almohadilla plantar trasera (método de Hock, dosis total de 10 pg de OVA y 50 ng de LPS). Los ratones se sacrificaron 4 d después de la estimulación, y las células del bazo y de los ganglios linfáticos de drenaje se aislaron para re-estimulación. Para el análisis de citometria de flujo de las citoquinas intracelulares, las células se re-estimularon en presencia de 1 mg/mL de OVA o 1 mg/mL del péptido SIINFEKL (Genscript) durante 3 h. Se agregó brefeldina-A (Sigma, 5 pg/mL) y la re-estimulación se reanudo durante 3 h adicionales antes de la tinción y el análisis de citometria de flujo.
Anticuerpos y metodos de citometria de flujo Los siguientes anticuerpos anti-ratón se utilizaron para la citometria de flujo: Azul Pacifico CDld, CD3s PerCP-Cy5.5, CD8a PE-Cy7, Azul Pacifico CD45.2, IFNy-APC, CD8a APC-eF780, (todos de eBioscience) además del tinte vivo/muerto fijable (Invitrogen), y el kit etiquetado de anexina-V-Cy5 (BioVision). Las muestras se analizaron en un citómetro do flujo CyAn ADP (Beckman Coulter). Las células se lavaron primero con PBS, se tiñeron durante 20 min sobre hielo con tinte vivo/muerto, se bloquearon durante 20 min sobre hielo con medio de hibridoma 24G2, se tiñeron sobre la superficie durante 20 min sobre hielo, se fijaron en 2% de paraformaldehido durante 20 min sobre hielo, se tiñeron intracelularmente en presencia de 0.5% de saponina durante 45 min sobre hielo, seguido un lavado final antes del análisis, para tinción del apoptosis, se agregó anexina-V-Cy5 5 min antes del análisis.
Ejemplo 11: Creación de la Tolerancia Inmunológica Especifica de Antigeno Hacia Proteínas Terapéuticas A través de la Molécula de Fusión del Péptido de Ligación a Eritrocitos y el Antígeno Conjugado Una variante de ligación a eritrocitos de ratón de asparaginasa (ERYl-ASNasa) se creó al conjugar el péptido ERY1 específico de eritrocitos de ratón (Kontos y Hubbell, 2010). Para determinar la inmunogenicidad de la ligación a eritrocitos versus asparaginasa de tipo natural, se llevó a cabo un estudio para evaluar dos regímenes, particularmente la exposición a un régimen de 2 dosis y 6 dosis del conjugado ERY (ERYl-ASNasa) o la forma nativa (ASPARAGINASE MEDAC, Medac GmbH; que también se utilizó como la materia prima para el conjugado de ERYl-ASNasa). En cada régimen, 15 mg de ERYl-ASNasa o ASNasa se administraron intravenosamente cada 2 días, y la sangre se extrajo cada 7 días.
Después de las exposiciones en las dosis terapéuticas, los títulos en el anticuerpo se midieron en varios puntos de tiempo, hasta 21 días después de la inyección final. El resultado es claro en mostrar la vasta reducción en la inmunogenicidad a través de la conjugación de eritrocitos, sin anticuerpos observables en todas las series régimen de 2 dosis y régimen de 6 dosis (Fig. 11). En contraste, la asparaginasa nativa, de tipo natural (como se utiliza actualmente de manera clínica, en el producto ASPARAGINASE MEDAC), indujo inmunidad vigorosa a un después del régimen de 2 dosis.
Un estudio de profilaxis se llevó a cabo para determinar si la asparaginasa de ligación a eritrocitos indujo la tolerancia inmunitaria bona-fide hacia la asparaginasa de tipo natural. Los ratones administrados previamente con la asparaginasa clínica de tipo natural se estimularon con una dosis adicional después del inicio de la inmunidad humoral. Los niveles de anticuerpos se incrementaron o permanecieron altos después de la re-administración de la proteína; esto es representativo de una situación clínica peligrosa de hipersensibilidad y reacciones de choque hacia el agente terapéutico. Los ratones previamente tratados con asparaginasa conjugada ERY1 no lograron inducir las respuestas a anticuerpos potentes aun después de seis estimulaciones con asparaginasa de tipo natural. En promedio, los ratones se les indujo tolerancia con asparaginasa de ligación a eritrocitos desarrollaron aproximadamente 6000 veces menos anticuerpos hacia la asparaginasa de tipo natural clínica.
Método de conjugación de ERYl -ASNasa 10 equivalentes molares de succinimidil-4 - (N-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato (SMCC, CAS# 64987-85-5, Thermo Scientific) disueltos en dimetilformamida se hicieron reacción con 5 mg/mL de Asparaginasa Medac en PBS durante 2 h a temperatura ambiente. Después de la desalación sobre una columna giratoria ZEBA Desalt de 2 mL (Thermo Scientific), 2.5 equivalentes de péptido ERY1 disueltos en guanidina-HCl de 3 M se agregaron y se dejaron reaccionar durante 2 h a temperatura ambiente. El conjugado se desaló utilizando columnas de giratorias Zeba Desalt de 2 mL, se filtraron estériles en 0.2 mm, se dispensaron en alícuotas de trabajo, y se almacenaron a -20 C. La concentración de proteínas se determinó a través del ensayo BCA (Thermo Scientific). El esquema da por resultado la conjugación de la cadena lateral de cisteína en las cadenas laterales de péptido a lisina en la protelna.
Detección de citométría de flujo del método de ligación Sangre humana recientemente aislada se diluyó 100 veces en PBS complementado con 20 mg/mL de BSA. Aproximadamente 500,000 eritrocitos se agregaron a 100 nM de asparaginasa y se incubaron a 37 C durante 1 h. Después del lavado, las células se incubaron con anti-asparaginasa de cabra (Abnova) durante 30 in sobre hielo. Después de una segunda corrida de lavado, las células se incubaron con anticuerpo IgG anti cabra conjugado con ALEXAFLUOR488 (Invitrogen) durante 20 min sobre hielo. Después de un lavado final, las células se analizaron en un cítómetro de flujo para detectar la asparaginasa ligada a eritrocitos.
Método de administración de la Asparaginasa Dosificaciones deseadas de ERYl-ASNasa o ASNasa se prepararon en 0.9% de solución salina estéril, y 100 mL de la solución se inyectó en la vena de la cola de ratones C57BL/6 anestesiados. La sangre se extrajo en punto de tiempos predeterminados ya sea por punción en la mejilla o incisiones en la cola. Detección de anticuerpos anti-asparaginasa del metodo de suero Sueros de grupos experimentales se diluyó en serie en PBS y se incubó durante 2 h RT sobre placas de ELISA recubiertas con ASNasa. La IgG anti-ratón conjugada con HRP (Southern Biotech) se utilizó como el anticuerpo de detección.
Ejemplo 12: Reversión Inmunitaria para Crear Tolerancia después de la Reacción inmunitaria En el caso clínico donde la inmunidad (ejemplificada por la presencia de anticuerpos anti-fármacos) hacia una proteína terapéutica o proteína de interés ya sea inducido en el paciente, es deseable revertir la respuesta inmunitaria hacia el fármaco, habilitando de esta manera el uso adicional del agente terapéutico. Nuevamente, la enzima microbiana clínicamente disponible de asparaginasa se utilizó en este ejemplo para mostrar la inducción de la tolerancia hacia una proteína terapéutica en los ratones con inmunidad pre existente hacia la asparaginasa..Una variante de ligación a eritrocitos de ratón de asparaginasa (ERYl-ASNasa) se creó al conjugar el péptido ERY1 específico de eritrocitos de ratón.
Un estudio cruzado se llevó a cabo para determinar si la asparaginasa de ligación a eritrocitos podría revertir la inmunidad hacia la asparaginasa clínica. A los ratones se les administró intravenosamente múltiples dosis de asparaginasa de tipo natural en dos días diferentes.21 días después de la administración, altos niveles de anticuerpos anti-asparaginasa se detectaron en el suero. Los ratones inmunizados luego se trataron terapéuticamente con regímenes de asparaginasa de ligación a eritrocitos en dosis variantes. En ambos regímenes de dosificación, la asparaginasa conjugada a ERY redujo los niveles de anticuerpos aproximadamente 10 veces, revirtiendo de esta manera la inmunidad humoral pre existente.
Método de conjugación de la ERYl-ASNasa 10 equivalentes molares de succinimidil-4- (N-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato (SMCC, CAS# 64987-85-5, Thermo Scientific) disueltos en dimetilformamida se hicieron reaccionar con 5 mg/mL de ASPARAGINASE MEDAC en PBS durante 2 h a temperatura ambiente. Después de la desalación sobre una columna giratoria ZEBA Desalt de 2 mL (Thermo Scientific), 2.5 equivalentes de péptido ERY1 disueltos en guanidina-HCL 3 M se agregaron y se dejaron reaccionar durante 2 h a temperatura ambiente. El conjugado se desaló utilizando columnas giratorias ZEBA Desalt de 2 mL, se filtraron estériles en 0.2 mm, se dispensaron en alícuotas de trabajo, y se almacenaron a -20 C. La concentración de proteínas se determinó a través del Ensayo BCA (Thermo Scientific). El esquema da por resultado la conjugación de la cadena lateral de cisteína en las cadenas laterales de péptido a U sina en la proteína.
Detección de citometría de flujo del método de ligación Sangre humana recientemente aislada se diluyó 100 veces en PBs complementado con 20 mg/mL de BSA. Aproximadamente 500,000 eritrocitos se agregaron a 100 nM de asparaginasa y se incubaron a 37 C durante 1 h. Después del lavado, las células se incubaron con anti-asparaginasa de cabra (Abnova) durante 30 in sobre hielo. Después de una segunda corrida de lavado, las células se incubaron con anticuerpo IgG anti cabra conjugado con ALEXAFLUOR488 (Invitrogen) durante 20 in sobre hielo. Después de un lavado final, las células se analizaron sobre un citómetro de flujo para detectar la asparaginasa ligada a eritrocitos.
Método de administración de asparaginasa Dosis deseadas de ERYl-ASNasa o ASNasa se prepararon en 0.9% de solución salina estéril, y 100 mL de la solución se inyectó en la vena de la cola de los ratones C57BL/6 anestesiados. La sangre se extrajo en puntos d tiempos predeterminados ya sea por punción en la mejilla o incisiones en la cola.
Detección de anticuerpos anti-asparaginasa del metodo de suero El suero de grupos experimentales se diluyó en serie en PBS y se incubó durante 2 h a RT sobre placas ELISA recubiertas con ASNasa. El IgG anti-ratón conjugado con HRP (Southern Biotech). se utilizó como el anticuerpo de detección.
Ejemplo 13: Desarrollo de anticuerpos y fragmentos de anticuerpos que se ligan a los eritrocitos de ratón y/o humanos Se han creado varios constructos de antigeno de ligación a eritrocitos. Estos incluyen aquellos que se relacionan con el nivel de proteína: TER119-SIINFEKL, TER119-ChrA, y TER119-proinsulina. Estos también incluyen aquellos que se relacionan con el nivel genético: TER119-SIINFEKL, TER119- ChrA TER119-proinsulina, TERll9-uricasa, TERll9-InsB9-23, TER119-ISQAVHAAHAEINEAGR (SEQ ID NO:80), TERll9-H-2kb, TER119-H-2kd, 10F7-SIINFEKL, 10F7-ChrA, 10F7-proinsulina, y 10F7-uricasa.
Métodos El ARNm del clon de hibridoma TER-119 se obtuvo como un regalo de Prof. Shozo Izui en la Universidad de Génova, Suiza. La PCR de transcriptasa inversa estándar (RT-PCR) se llevó a cabo utilizando SUPERSCRIPT III FIRST STRAND SYNTHESIS SYSTEM (Invitrogen) para crear el ADN complementario (ADNc) del clon. La PCR luego se condujo utilizando el siguiente conjunto de cebadores para amplificar específicamente las secuencias de ADN de las regiones pesadas variables (VH) y ligeras variables (VL) del anticuerpo: Los genes VH y VL amplificados luego se digirieron con endonucleasas de restricción (Ncol y Notl para VL, Ndel y HindIII para VH), los fragmentos del gen se purificaron después de la electroforesis de agarosa utilizando un kit estándar (Zymo Research, Orange, GA, USA), y se ligaron en un plásmido de clonación pMAZ360. El plásmido de clonación luego se secuenció para determinar la secuencia de ADN de los genes VH y VL de TER119.
Constructos de ADN de antigeno TER119 y 10F7 se diseñaron y se sintetizaron comercialmente y se obtuvieron de DNA2.0 (Menlo Park, CA, USA).
Cada gen de scFv complementado final se digirió con Sfil y Xhol (NEB, Ipswich, MA, USA), y se ligó en los mismos sitios del plásmido de expresión de mamífero pSecTagA (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA).
Ejemplo 14: Inducción de Tolerancia Hacia Antígenos Diabetogénicos Utilizando Antígenos de Diabetes de Ligación a Eritrocitos El péptido mimótopo cromogranina-A (llamado 1040-p31 o ChrA) se diseñó para ligarse a eritrocitos de ratón al fusionar recombinantemente el péptido al scFv TER119 específico de eritrocitos de ratón. El scFv resultante, en la presente llamado TER119-ChrA, se ligó estrechamente a eritrocitos de ratón (datos no mostrados). Para estudiar el comportamiento de las células T hacia las variantes de antígeno de cromogranina-A, se utilizó el ratón transgénico NODBDC2.5, que aloja células T específicas para el reconocimiento del antígeno de cromogranina-A. Para determinar si el TER119-ChrA se procesó y se mostró sobre complejos de histocompatibilidad-II mayor (MHC-II) en una manera suficiente para el cebado de células T BDC2.5, el antigeno se agregó a un sistema de cultivo con células dendriticas esplénicas BDC2.5 y células T CD4. Como se muestra en la Figura 12, el TER119-ChrA se procesó eficientemente y el dominio antigénico correcto se mostró en MHC-II para cebar la proliferación especifica de antigeno de las células T BDC2.5 CD4 transgénicas in vitro, que es un requisito para la tolerancia de células T in vivo .
Para determinar las consecuencias de la ligación de eritrocitos del autoantígeno en la proliferación CD4 in vivo, se condujo un estudio de proliferación similar utilizando células T BDC2.5 CD4 etiquetadas con molécula fluorescente CFSE. Después de la transferencia adoptiva de las células T BDC2.5 CD4 etiquetadas en ratones NOD sin tratamiento, ya sea 10 mg de TER119-ChrA o una dosis equimolar de péptido 1040-p31 soluble libre se administró intravenosamente. Como se muestra en la Figura 13, los ratones tratados con TERll9-ChrA alojaron mucho menos células T BDC2.5 CD4 no proliferantes en tanto el bazo como los ganglios linfáticos pancreáticos (pLN) comparado con los ratones tratados con el péptido 1040-p31 soluble. Estos datos muestran que el antigeno de ligación a eritrocitos conduce la señalización y cebado de células T CD4 específicas de antígeno potentes en una manera funcionalmente distinta del antígeno soluble, similar a los inventores a través de las investigaciones de la tolerancia de supresión de células T CD8. Tal reducción marcada en las células T díabetogénicas sistémicas (bazo) y locales (nodo linfático pancreático) es una indicación positiva clara de un resultado favorable para el control del inicio de la enfermedad.
Ejemplo 15: Inducción de la Tolerancia Hacia la Insulina Como ya es mostrado en la presente (por ejemplo, ver Ejemplo 14), la tolerancia se puede crear hacia varios antígenos. Este ejemplo describe como la tolerancia a la insulina se puede crear. A fin de inducir la tolerancia hacia la insulina, que es otro antígeno de islote reconocido por las células T díabetogénicas, la insulina se diseña para ligarse a eritrocitos de ratón por fusión recombinante al scFv TER119 específico de eritrocitos de ratón. El scFv resultante, en la presente llamado TER119-proinsulina, se implementa en el modelo de ratón convencional del inicio espontaneo de T1D, particularmente el ratón NOD/ShiLt. El ratón NOD/ShiLt se somete espontáneamente a la destrucción mediada por células inmunes del tejido pancreático productor de insulina, induciendo de esta manera hiperglicemia y el inicio clínico de la enfermedad. Similarmente, la insulina humana y los factores de ligación a eritrocitos humanos se pueden utilizar para crear la tolerancia a la insulina en humanos.
Para mostrar la tolerancia en este modelo de ratón espontáneamente autoinmune robusto, el TER119-proinsulina se va administrar a ratones jóvenes (~3 semanas de edad) en intervalos de tiempo variantes y dosis a fin de inactivar funcionalmente y/o suprimir las células T reactivas a la insulina. Los niveles de glucosa de los ratones tratados se monitorean para evaluar la hiperglicemia y el inicio clínico de la enfermedad. El TERll9-proinsulina también se utiliza en un modo terapéutico para inducir la remisión de la enfermedad. En tal estudio, la TER119-proinsulina se administra a ratones hiperglicémicos de nuevo inicio en varias dosis e intervalos de tiempo, y los niveles de glucosa se monitorean para evaluar la reducción de la hiperglicemia y regresar a la homeostasis, mostrando de esta manera la remisión del inicio clínico de T1D.
Ejemplo 16: Creación de Tolerancia Hacia injertos celulares y trasplantes al utilizar moléculas MHC de ligación a eritrocitos Un proceso para creare tolerancia de injertos se proporciona a manera de ejemplo. Las moléculas MHC de ligación a eritrocitos se diseñan al conjugar uímicamente los péptidos de ligación a eritrocitos a los dominios MHC solubles. Alternativamente, la molécula MHC se puede expresar recombinantemente como una fusión con un scFv especifico de eritrocitos.
A fin de mostrar la tolerancia hacia las moléculas MHC por la ligación de eritrocitos, los modelos de ratón de injerto celular, tales como injertos tumorales, injertos de piel, trasplantes de islotes, y trasplantes de células hematopoyéticas son conducidos. En cada estudio, el ratón hospedero se le induce tolerancia hacia la clase MHC donadora mediante la administración de MHC de ligación a eritrocitos antes o durante el procedimiento de injerto. La aceptación del injerto se monitorea utilizando métodos apropiados para cada estudio; es decir, medición del crecimiento del tumor en los injertos tumorales, monitorear la necrosis del tejido o crecimiento en el trasplante de la piel, monitorear la masa de islotes y glicemia en los trasplantes de islotes, y caracterizar el quimerizmo en los trasplantes de las células hematopoyéticas.
DESCRIPCIÓN ADICIONAL Una modalidad es un método para producir mono tolerancia, el método que comprende administrar una composición que comprende una fusión molecular que comprende un antigeno tolerogénico y una porción de ligación a eritrocitos que liga específicamente un eritrocito en el paciente y liga de esta manera el antígeno al eritrocito, en donde la función molecular se administra en una cantidad efectiva para producir inmunotolerancia a una sustancia que comprende el antígeno tolerogénico. Una modalidad es el método en donde la fusión molecular consiste de por lo menos una porción de ligación a eritrocitos directamente ligada covalentemente al antígeno: por ejemplo, una proteína de fusión que comprende la porción y el antígeno. Una modalidad es el método en donde la fusión molecular comprende por lo menos una porción de ligación a eritrocitos unida a una partícula que se une a o contiene el antígeno, por ejemplo, en donde la partícula se elige del grupo que consiste de una micropartícula, una nanopartícula, un liposoma, un polimerosoma, y una micela. Una modalidad es el caso en donde el antígeno tolerogénico comprende una porción de una proteína terapéutica, pop ejemplo, la proteína comprende el factor VIII o factor IX. Una modalidad es el caso en donde el antígeno tolerogénico Comprende una porción de una proteína no humana. Una modalidad es el caso en donde la proteína comprende adenosina desaminasa, L-asparaginasa, rasburicasa, globulina anti-timocitos, L-arginasa, y L-metionasa. Una modalidad es el método den donde el paciente es un humano y el antigeno tolerogénico comprende una porción de una proteina no encontrada en la naturaleza. Una modalidad es el caso en donde el paciente es un humano y el antigeno tolerogénico comprende un glicano de una proteina que comprende la glicosilación no humana. Una modalidad es el caso en donde el antigeno tolerogénico comprende por lo menos una porción de un antígeno de trasplante humano. Una modalidad es el caso en donde el antigeno tolerogénico comprende una porción de una proteína de enfermedad autoinmunitaria humana, por ejemplo, elegida de grupo que consiste de preproinsulina, proinsulina, insulina, GAD65, GAD67, IA-2, IA-2b, ,tiroglobulina, tiroides peroxidasa, receptor de tirotropina, proteína básica de mielina, glicoproteina de oligodendrocitos de mielina, proteína de proteolípidos, colágeno II, colágeno IV, receptor de acetilcolina, metaloproteína de matriz 1 y 3, proteína de choque térmico chaperona molecular 47, fibrilina-1, receptor a PDGF, receptor b PDGF,· y SS-A de proteína nuclear. Una modalidad es el caso en donde el antígeno tolerogénico comprende una porción de un alimento humano, por ejemplo, se elige del grupo que consiste de conaraquina (Ara h 1), alérgeno II (Ara .h 2), arachis aglutinina (Ara h 6), a-lactalbúmina (ALA), lactotransferrina, gluteina, gluteina de peso molecular bajo, OÍ- y g-gliadina, hordeina, secalina, y avenina. Una modalidad es el caso en donde la porción de ligación a eritrocitos se elige del grupo que consiste de un ligando de peptidico, un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo, un dominio de ligación a antigeno de cadena sencilla (ScFv). Una modalidad es el caso en donde la porción de ligación a eritrocitos comprende un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo o un ScFv derivado de un hibridoma que produce un anticuerpo contra un eritrocito, con el hibridoma que se elige del grupo .que consiste de BRIC 4, BRIC 5, BRIC 6, BRIC 10, BRIC 14, BRIC 18, BRIC 39, BRIC 66, BRIC 68, BRIC 69, BRIC 87, BRIC 108, BRIC 110, BRIC 111, BRIC 125, BRIC 126, BRIC 128, BRIC 145, BRIC 155, BRIC 157, BRIC 163, BRIC 170, BRIC 198, BRIC 203, BRIC 216, BRIC 220, BRIC 221, BRIC 222, BRIC 229, BRIC 230, BRIC 231, BRIC 235, BRIC 256, BRAC 17, BRAC 18, BGRL 1, BGRL 2, BGRL 11, BGRL 100, BRAD 3, BIRMA D6, BIRMA DIO, BIRMA K3, BIRMA K3, 84B; 6A7; COE; o KZ1. Una modalidad es el caso en donde la porción de ligación a eritrocitos se liga específicamente a una biomolécula elegida del grupo que consiste de Banda 3 (CD233), acuaporina-1, Glut-1, antigeno Kidd, RhAg/Rh50 (CD241), Rh (CD240), Rh30CE (CD240CE), Rh30D (CD240D), Kx, glicoforina A, glicoforina B (CD235b), glicoforina C (CD235c), glicoforina D (CD235d), Kell (CD238), Duffy/DARCi (CD234), CRl (CD35), DAF (CD55), Globósido, CD44, ICAM-4 (CD242), Lu/B-CAM (CD239), XG1/XG2 (CD99), EMMPRIN/neurotelina (CD147), JMH, Glicosiltransferasa, Cartwright, Dombrock, C4A/CAB, Scianna, MER2, estomatina, BA-1 (CD24), GPIV (CD36), CD108, CD139, y antígeno H (CD173). El antigeno tolerogénico puede comprender un mimótopo. Una modalidad es el caso en donde scFv comprende algo o todo de 10F7, por ejemplo, uno o más de una cadena ligera de 10F7 y/o cadena pesada de 10F7 y/o una variante de afinidad más alta de una cadena ligera de 10F7 y/o una cadena pesada de 10F7. Una modalidad es el método en donde la porción de ligación a eritrocitos comprende un 1igando peptidico que comprende por lo menos 5 residuos de aminoácidos consecutivos de una secuencia elegida de grupo que consiste de SEQ ID .NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:l, y sustituciones conservadoras de las mismas, en donde la secuencia liga específicamente a un eritrocito.
Una modalidad es una composición que comprende una fusión molecular que comprende un antígeno tolerogénico y una porción de ligación a eritrocitos que liga específicamente un eritrocito en el paciente y liga de esta manera el antígeno al eritrocito. Un ejemplo es el .caso en donde la porción de ligación a eritrocitos se liga covalentemente al antígeno. Otro caso es el caso en donde la fusión molecular comprende la porción de ligación a eritrocitos unida a una partícula que se une a un antígeno, por ejemplo, una microparticula, una nanopartícula, un liposoma, un polimerosoma, o una mácela. Ejemplos de un antígenos tolerogénicos son: una porción de una proteína terapéutica, unan porción de una proteína no humana, una porción (incluyendo la porción completa, es decir, todo) de una proteína no encontrada naturalmente en un humano, un glicano de una proteína que comprende glicosilación no humana, una porción de un antígeno autoinmunitario humano, una porción de un alimento humano. Una modalidad es la composición en donde la porción de ligación a eritrocitos se elige de grupo que consiste de un ligando peptídico, un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo, y un dominio de ligación a antígeno de cadena sencilla (ScFv), por ejemplo, todo o una porción de 10F7. La porción de ligación a eritrocitos puede comprender un ligando peptídico que comprende por lo menos 5 residuos de aminoácidos consecutivos de una secuencia elegida de grupo que consiste de SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:l, v sustituciones conservadoras de las mismas, en donde la secuencia liga específicamente un eritrocito. La porción de ligación a eritrocitos puede ser una que comprende un ligando peptídico que tienen una constante disociación de entre aproximadamente 10 mM y 0.1 nM como se determina por las mediciones de ligación·de equilibrio entre el péptido y los eritrocitos. Una modalidad es el caso en donde la porción de ligación a eritrocitos comprende un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo o un ScFv derivado de un hibridoma que produce un anticuerpo contra un eritrocito, con el hibridoma que se elige de grupo que consiste de BRIC 4, BRIC 5, BRIC 6, BRIC 10, BRIC 14, BRIC 18, BRIC 39, BRIC 66, BRIC 68, BRIC 69, BRIC 87, BRIC 108, BRIC 110, BRIC 111, BRIC 125, BRIC 126, BRIC 128, BRIC 145, BRIC.155, BRIC 157, BRIC 163, BRIC 170, BRIC 198, BRIC 203, BRIC 216, BRIC 220, BRIC 221, BRIC 222, BRIC 229, BRIC 230, BRIC 231, BRIC 235, BRIC 256, BRAC 17, BRAC 18, BGRL 1, BGRL 2, BGRL 11, BGRL 100, BRAD 3, BIRMA D6, BIRMA DIO, BIRMA K3, BIRMA K3, 84B; 6A7; COE; o KZ1. Una modalidad es el caso en donde la porción de ligación a eritrocitos se liga específicamente a una biomolécula elegida de grupo que consiste de Banda 3 (CD233), acuaporina-1, Glut-1, antígeno Kidd, RhAg/Rh50 (CD241), Rh (CD240), Rh30CE (CD240CE), Rh30D (CD240D), Kx, glicoforina A, glicoforina B (CD235b), glicoforina C (CD235c), glicoforina D (CD235d), Kell (CD238), Duffy/DARCi (CD234), CR1 (CD35), DAF (CD55), Globosida, CD44, ICAM-4 (CD242), Lu/B-CAM (CD239), XG1/XG2 (CD99), EMMPRIN/neurotelina (CD147), JMH, Glicosiltransferasa, Cartwright, Dombrock, C4A/CAB, Scianna, MER2, estomatm a, BA-G (CD24), GPIV (CD36), CD108, CD139, y antígeno H (CD173). El antigeno tolerogénico puede comprender un mimótopo.
Las composiciones tolerogénicas se pueden utilizar en el tratamiento de una condición patológica, por ejemplo una condición patológica elegida de grupo que consiste de rechazo de trasplante, enfermedad autoinmunitaria, alergia a alimentos, y respuesta inmunitaria contra un agente terapéutico.
Una modalidad es una composición farmacéuticamente aceptable para el uso én la inmunoreversión de una respuesta inmunitaria contra una sustancia que comprende una molécula de fusión que comprende una porción de ligación a eritrocitos y un antigeno de la sustancia. La composición puede tener el antigeno tolerogénico elegido de, por ejemplo, el grupo que consiste de una proteina, una porción de una proteina, una proteina humana o porción de la misma, una proteína no humana o porción de la misma, un glicano, un glicano, un glicano de una proteína que comprende glicosilación no humana, un antígeno anti-inmune humano, un agente terapéutico de proteina para un humano o una porción del mismo, y una porción de un alimento humano. La composición puede detener el antígeno tolerogénico elegido de, por ejemplo, el grupo que consiste de prpteínas deficientes por enfermedad genética, proteínas con glicosilación no humana, proteínas no humanas, proteínas sintéticas no encontradas naturalmente en humanos, antigenos alimenticios humanos, antígenos de trasplante humanos, y antígenos autoinmunitarios humanos. La porción de ligación a eritrocitos puede ser con la condición de que se ligue específicamente a una biomolécula elegida del grupo que consiste de Banda 3 (CD233), acuaporina-1, Glut-1, antígeno Kidd, RhAg/Rh50 (CD241), Rh (CD240), Rh30CE (CD240CE), Rh30D (CD240D), Kx, glicoforina A, glicoforina B (CD235b), glicoforina C (CD235c), glicoforina D (CD235d), Kell (CD238), Duffy/DARCi (CD234), CR1 (CD35), DAF (CD55), Globósido, CD44, ICAM-4 (CD242), Lu/B-CAM (CD239), XG1/XG2 (CD99), EMMPRIN/neurotelina (CD147), JMH, Glicosiltransferasa, Cartwright, Do brock, C4A/CAB, Scianna, MER2, estomatina, BA-1 (CD24), GPIV (CD36), CD108, CD139, y antígeno H (CD173). La porción de ligación de eritrocitos se puede elegir del grupo que consiste de un ligando peptídico, un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo y un dominio de ligación a antígeno de cadena sencilla (ScFv). La porción de ligación a eritrocitos se· puede preparar de modo que comprenda un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo, o un ScFv derivado de un hibridoma que produzca un anticuerpo contra un eritrocito, con el hibridoma que se elige del grupo que consiste de BRIC 4, BRIC 5, BRIC 6, BRIC 10, BRIC 14, BRIC 18, BRIC 39, 3RIC 66, BRIC 68, BRIC 69, BRIC 87, BRIC 108, BRIC 110, BRIC 111, BRIC 125, BRIC 126, BRIC 128, BRIC 145, BRIC 155, BRIC 157, BRIC 163, BRIC 170, BRIC 198, BRIC 203, BRIC 216, BRIC 220, BRIC 221, BRIC 222, BRIC 229, BRIC 230, BRIC 231, BRIC 235, BRIC 256, BRAC 17, BRAG 18, BGRL 1, BGRL 2, BGRL 11, BGRL 100, BRAD 3, BIRMA D6, BIRMA DIO, BIRMA K3, BIRMA K3, 84B; 6A7; COE; o KZ1.
Las modalidades incluyen una molécula de fusión que comprende una porción de ligación a eritrocitos y un antigeno de asparaginasa. Como es evidente de las múltiples descripciones de las porciones de ligación a eritrocitos, existen muchas opciones para las mismas, incluyendo: un scFv que se liga a un eritrocito humano o un ligando de ligación peptidico elegido del grupo que consiste de SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, y sustituciones conservadoras de las mismas, en donde la secuencia se liga específicamente a un eritrocito. Tal composición que comprende la molécula de fusión se puede utilizar para inducir tolerancia a la asparaginasa.
Las modalidades incluyen una molécula de fusión que comprende una porción de ligación a eritrocitos y un antigeno de cromogranina-A. El antígeno puede ser un mimótopo o algo o todo de una cromogranina-A. Como es evidente de las múltiples descripciones de las porciones de ligación a eritrocitos, existen muchas opciones para las mismas, incluyendo: un scFv que se liga a un eritrocito humano o un ligando de ligación peptidico elegido del grupo que consiste de SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, y sustituciones conservadoras de las mismas, en donde la secuencia se liga específicamente a un eritrocito. Tal composición que comprende la molécula de fusión se puede utilizar para inducir tolerancia a cromogranina-A y/o para prevenir la diabetes o reducir la progresión de una enfermedad de diabetes.
Otro caso es una composición que comprende una porción de ligación a eritrocitos que se liga específicamente a un eritrocito unido a una entidad elegida y grupo que consiste de un polímero sintético, un polímero sintético ramificado y una partícula. La partícula puede ser, por ejemplo, una micropartícula, una . nanopartícula, un liposoma, un polimerosoma, y una micela. La composición puede comprender además un antígeno tolerogénico, un agente terapéutico, o un ligando que se dirige al tumor.
Una modalidad es un dominio de ligación a antígeno de cadena sencilla (scFv) que comprende un ligando peptidico que se liga específicamente a un eritrocito. El péptido se puede unir al scFv o colocar en una porción ligadora. Uno o más de los ligandos peptídicos se pueden incluir.
Todas las solicitudes de patente, patentes y publicaciones mencionadas en la presente se incorporan en este documento a manera de referencia en la presente para todos los propósitos; en caso de conflicto, la presente especificación lo controlará.
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Claims (39)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN Habiendo descrito la presente invención, se considera como novedad, y por lo tanto se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes: REIVINDICACIONES
1. Una composición farmacéuticamente aceptable, caracterizada porque comprende: una fusión molecular que comprende un antigeno tolerogénico y una porción de ligación a eritrocitos que se liga específicamente a un eritrocito en el paciente, en donde la porción de ligación a eritrocitos se liga específicamente a una biomolécula elegida del grupo que consiste de Banda 3- (CD233), acuaporina-1, Glut-1, antígeno Kidd, RhAg/Rh50 (CD241), Rh (CD240), Rh30CE (CD240CE), Rh30D (CD240D), Kx, glicoforina B (CD235b), glicoforina C (CD235c), glicoforina D (CD235d), Kell (CD238), Duffy/DARCi (CD234), CRl (CD35), DAF (CD55), Globósido, CD44, ICAM-4 (CD242), Lu/B-CAM (CD239), XG1/XG2 (CD99), EMMPRIN/neurotelina (CD147), JMH, Glicosiltransferasa, Cartwright, Dombrock, C4A/CAB, Scianna, MER2,· estomatina, BA-1 (CD24), GPIV (CD36), CD108, CD139, y antígeno H (CD173).
2. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la porción de ligación a eritrocitos se liga covalentemente al antígeno.
3. La composición de conformidad con la reivindicación 1 o 2, caracterizada porque la porción de ligación a eritrocitos se elige del grupo que consiste de un ligando peptidico, un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo, y un dominio de ligación a antigeno de cadena sencilla (ScFv).
4. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, caracterizada porque la porción de ligación a eritrocitos comprende un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo o un ScFv derivado de un hibridoma que produce un anticuerpo contra un eritrocito, con el hibridoma que se elige del grupo que consiste de BRIC 4, BRIC 5, BRIC 6, BRIC 10, BRIC 14, BRIC 18, BRIC 39, BRIC 66, BRIC 68, BRIC 69, BRIC 87, BRIC 108, BRIC 110, BRIC 111, BRIC 125, BRIC 126, BRIC 128, BRIC 145, BRIC 155, BRIC 157, BRIC 163, BRIC 170, BRIC 198, BRIC 203, BRIC 216, BRIC 220, BRIC 221, BRIC 222, BRIC 229, BRIC 230, BRIC 231, BRIC 235, BRIC 256, BRAC 17, BRAC 18, BGRL 1, BGRL 2, BGRL 11, BGRL 100, BRAD 3, BIRMA D6, BIRMA DIO, BIRMA K3, BIRMA K3, BIRMA 84B; 6A7; COE; y KZ1.
5. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, caracterizada porque el antigeno tolerogénico comprende un mimótopo de una proteina.
6. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, caracterizada porque el antigeno tolerogénico se elige del grupo que consiste de una proteina, una porción de una proteina, una proteina humana o porción de la misma, una proteina no humana o porción de la misma, un glicano, un glicano de una proteina que comprende giicosilación no humana, un antigeno autoinmunitario humano, un agente terapéutico de proteina para un humano o una porción del mismos, y una porción de un alimento humano.
7. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, caracterizada porque el antigeno tolerogénico se elige del grupo que consiste de proteínas deficientes por enfermedad genética, proteínas con glicosilación no humana, proteínas no humanas, proteínas sintéticas no encontradas naturalmente en humanos, antígenos alimenticios humanos, antígenos de trasplante humanos y antígenos autoinmunitarios humanos.
8. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, caracterizada porque el antígeno tolerogénico comprende un antígeno elegido del grupo que consiste de factor VIII, factor IX, adenosina desaminasa, L-asparaginasa, rasburicasa, globulina antitimocito, L-arginasa, L-metionasa, preproinsulina, proinsulina, insulina, GAD65, GAD67, IA-2, IA-2b, tiroglobulina, tiroides peroxidasa, receptor de tirotropina, proteína básica de mielina, glicoproteína de oligodendrocitos de mielina, proteina de proteolipidos, colágeno II, colágeno IV, receptor de acetilcolina, metaloproteína de matriz 1 y 3, proteína de choque térmico chapona molecular 47, fibrilina-1, receptor a de PDGF, receptor b de PDGF, proteína nuclear SS-A, conaraquina (Ara h 1), alérgeno II (Ara h 2), arachis aglutinina (Ara h 6), a-lactalbúmina (ALA), lactotransferrina, gluteína, gluteína de peso molecular bajo, a-gliadina, g-gliadina, hordeina, secalina, y avenina.
9. La composición de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada porque el antígeno es un mimótopo.
10. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-9, caracterizáda porque para el uso en el tratamiento de una condición patológica elegida del grupo que consiste de rechazo de trasplante, enfermedad autoinir.unitaria, alergia a alimentos, y respuesta inmunitaria contra un agente terapéutico.
11. Una fusión. molecular, caracterizada porque comprende un antígeno tolerogénico y una porción de ligación a eritrocitos seleccionada de Banda 3 (CD233), glicoforina B (CD235b), glicoforina C (CD235c) y glicoforina D (CD235d).
12. La fusión molecular de conformidad con la reivindicación 11, caracterizada porque es para el uso en la producción de inmunotolerancia.
13. Una fusión molecular, caracterizada porque comprende un antigeno tolerogénico seleccionada de: una proteína, una porción de un proteína, una proteína humana o porción de la misma, una pro.teína no humana o porción de la misma, un glicano, un glicano de una proteína que comprende glicosilación no humana, un antígeno autoinmunitario humano, un agente terapéutico de proteína para un humano o una porción del mismo y una porción de un alimento humano, proteínas deficientes por enfermedad genética, proteínas con glicosilación no humana/ proteínas no humanas, proteínas sintéticas no encontradas naturalmente en humanos, antígeno alimenticios humanos, antígenos de trasplante humanos, antígenos autoinmunitarios humanos; y una porción de ligación a eritrocitos seleccionada de Banda 3 (CD233), glicoforina B (CD235b), glicoforina C (CD235c), glicoforina D (CD235d).
14. Un método para producir inmunotolerancia, caracterizado porque el método comprende administrar una composición que comprende una fusión molecular que comprende un antígeno tolerogénico y una porción de ligación de eritrocitos que se liga específicamente a un eritrocito en un paciente, en donde la fusión molecular se administra una cantidad efectiva para producir inmunotolerancia a una sustancia que comprende el antígeno tolerogénico.
15. Una composición farmacéuticamente, caracterizada porque es para el uso en la inmunoreversión de una respuesta inmünitaria contra una sustancia que comprende una molécula de fusión que comprende una porción de ligación a eritrocitos y un antigeno de la sustancia.
16. La composición de conformidad con la reivindicación 15, caracterizada porque el antigeno tolerogénico se elige del grupo que consiste de una proteina, una porción de una porción de una proteina, una proteina humana o una porción de la misma, una proteina no humana o porción de la misma, un glicano, un glicano de una proteina que comprende glicosilación humana, un antigeno autoinmunitario humano, un agente terapéutico de proteina para un humano o una porción del mismo, o una porción de un alimento humano.
17. La composición de conformidad con la reivindicación 15, caracterizada porque el agente tolerogénico se elige del grupo que consiste de proteínas deficientes por la enfermedad genética, proteínas con glicosilación no humana, proteínas no humanas, proteínas sintéticas no encontradas naturalmente en humanos, antígenos alimenticios humanos, antígenos de trasplante humanos y antígenos autoinmunitarios humanos.
18. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 15-17, caracterizada porque la porción de ligación de eritrocitos se liga específicamente a una biomolécula elegida del grupo que consiste de Banda 3 (CD233), acuaporina-1, Glut-1, antígeno Kidd, RhAg/Rh50 (CD241), Rh (CD240), Rh30CE (CD240CE), Rh30D (CD240D), Kx, glicoforina A, glicoforina B (CD235b), glicoforina C (CD235c), glicoforina D (CD235d), Kell (CD238), Duffy/DARCi (GD234), CR1 (CD35), DAF (CD55), Globósido, CD44, ICAM-4 (CD242), Lu/B-CAM (CD239), XG1/XG2 (CD99), EMMPRIN/neurotelina (CD147), JMH, Glicosiltransferasa, Cartwright, Dombrock, C4A/CAB, Scianna, MER2, stomatin, BA-1 (CD24), GPIV (CD36), CD108, CD139, y antigeno H (CD173).
19. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 15-17, caracterizada porque la porción de ligación a eritrocitos se elige del grupo que consiste de un ligando peptidico como un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo y un dominio de ligación a antigeno de cadena sencilla (ScFv).
20. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 15-17, caracterizada porque la porción de ligación a eritrocitos comprende un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo o un ScFv derivado de un hibridoma que produce un anticuerpo contra un eritrocito, con el hibridoma que se elige del grupo que consiste de BRIC 4, BRIC 5, BRIC 6, BRIC 10, BRIC 14, BRIC 18, BRIC 39, BRIC 66, BRIC 68, BRIC 69, BRIC 87, BRIC 108, BRIC 110, BRIC 111, BRIC 125, BRIC 126, BRIC 128, BRIC 145, BRIC 155, BRIC 157, BRIC 163, BRIC 170, BRIC 198, BRIC 203, BRIC 216, BRIC 220, BRIC 221, BRIC 222, BRIC 229, BRIC 230, BRIC 231, BRIC 235, BRIC 256, BRAC 17, BRAC 18, BGRL 1, BGRL 2, BGRL 11, BGRL 100, BRAD 3, BIRMA D6, BIRMA DIO, BIRMA K3, BIRMA K3, BIRMA 84B; 6A7; COE; y KZ1.
21. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 15-20, caracterizada porque el antigeno tolerogénico comprende un mimótopo de una proteina.
22. Una molécula de fusión, caracterizada porque comprende una porción de ligación a eritrocitos un antigeno de asparaginasa.
23. La molécula de fusión de conformidad con la reivindicación 22, caracterizada porque la porción de ligación a eritrocitos comprende un scFv que se liga a un eritrocito humano o un ligando de ligación peptídico elegido del grupo que consiste de SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, y sustituciones conservadoras de las mismas, en donde la secuencia se liga específicamente a un eritrocito.
24. Una composición, caracterizada porque comprende la molécula de fusión de conformidad con la reivindicación 22 o 23 utilizada para inducir la tolerancia a la asparaginasa.
25. Una molécula de fusión, caracterizada porque comprende una porción de ligación a eritrocitos y un antigeno de cromogranina-A.
26. La molécula de fusión de conformidad con la reivindicación 25, caracterizada porque la porción de ligación a eritrocitos comprende un scFv que se liga a un eritrocito humano o un ligando de ligación peptidico elegido del grupo que consiste de SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, y sustituciones conservadoras de las mismas, en donde la secuencia liga específicamente un eritrocito.
27. Una composición, caracterizada porque comprende la molécula de fusión de conformidad con la reivindicación 25 o 26 utilizada para inducir tolerancia a cromogranina-A.
28. Una composición farmacéuticamente aceptable, caracterizada porque comprende: una porción de ligación a eritrocitos unida a un dominio que se liga específicamente a un objetivo.
29. La composición de conformidad con la reivindicación 28, caracterizada porque el objetivo comprende una proteína, con la proteína que comprende además un agente tolerogénico.
30. La composición de conformidad con la reivindicación 28 o 29, caracterizada porque la porción de ligación a eritrocitos comprende un ligando peptidico.
31. La composición de conformidad con la reivindicación 28 o 29, caracterizada porque la porción de ligación a eritrocitos se elige del grupo que consiste de un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo, y un dominio de ligación a antígeno de cadena sencilla (ScFv).
32. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 28-31, caracterizada porque el dominio se elige del grupo que consiste de un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo, y un dominio de ligación a antigeno de cadena sencilla (ScFv).
33. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 28-32, caracterizada porque la composición comprende un miembro elegido de una fusión molecular, un scFv en tándem, un diacuerpo, y una molécula scFv-IgG en tándem, con la porción de ligación a eritrocitos y el dominio que es parte del miembro.
34. Una composición farmacéuticamente aceptable, caracterizada porque comprende: una porción de ligación a eritrocitos se liga a un antigeno.
35. La composición de conformidad con la reivindicación 34, caracterizado porque el antigeno es un autoantigeno nativo.
36. La composición de conformidad con la reivindicación 34 o 35, caracterizado porque el autoantigeno se elige del grupo que consiste de antigenos de lupus eritematoso.
37. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 34-36/ caracterizada porque el antigeno es para una proteína terapéutica.
38. La composición de conformidad con la reivindicación 37, caracterizada porque el antígeno es un antigeno de Factor VIII.
39. Un uso de la composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 34-37, para la remoción de anticuerpos no deseados de la circulación.
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