TW202315884A - 使用衍生自患者之抗原特異性調節ｔ細胞的個體化細胞療法 - Google Patents

Abstract

用於治療第一型糖尿病（T1DM）自體免疫之包含前胰島素原之一或多個胜肽片段的組成物、使用這些組成物治療T1DM自體免疫的方法，及包含這些組成物用以診斷及／或治療T1DM自體免疫的套組。

Description

使用衍生自患者之抗原特異性調節T細胞的個體化細胞療法

本發明一般是有關自體免疫疾病之領域，且具體而言，是有關治療第一型糖尿病（type 1 diabetes mellitus，T1DM）、預防第一型糖尿病，或延緩第一型糖尿病之進程。本發明更特定地是有關對於（T1DM）自體免疫之免疫調節療法（immunomodulatory therapy）。

人類第一型糖尿病（T1DM）的發作（onset）為由T細胞介導（mediated）之自體免疫破壞之β-細胞失效的臨床表現。T1DM造成對每日胰島素注射的畢生依賴及急性與晚期併發症兩者。即使其治療已有顯著的進步，T1DM代表對個體及社會的嚴重負擔。T1DM對孩童及其等家庭特別有負擔，代表最嚴重的慢性兒童疾病之一。雖然T1DM的發病可在成年時發生，其主要為對孩童及年輕人的問題。T1DM發病具有雙模峰年齡，介於4-7歲及14-16歲。T1DM的全球發病率正在增加，而5歲以下的孩童具有最大增加率。因此，對於改善此疾病存在有急迫且增加的需求。

T1DM為孩童中常見的內分泌疾病（endocrine disease）且高達80%具有T1DM的孩童亦具有糖尿病酮酸中毒（diabetic ketoacidosis，DKA），其與短期風險及長期結果皆有關連。短期而言，且時常是致命的，包括低血糖及高血糖發作的併發症通常伴隨酸中毒（acidosis）發生。長期併發症可代表進一步、顯著的發病率和死亡率。患者可能同時面對大血管及微血管併發症、心血管併發症、高血壓、視網膜病變、腎病及神經病變，其等可能使人衰弱並危及生命。這些可藉由改善照護而減低，但無法於T1DM患者中消除。更嚴重的併發症包括腎衰竭、失明及截肢。

儘管其治療已有顯著的進展，自體免疫關聯之糖尿病對受影響的個體以及社會都施加重擔。胰島素依賴T1DM為一種自體免疫疾病，其中胰島炎（insulitis）導致胰腺β細胞的破壞。在T1DM的臨床發病上，顯著數量的生產胰島素之β細胞被破壞，僅留下約15%至40%仍然能夠生產胰島素（McCulloch et al., Diabetes,40:673-679 (1991)）。此β細胞的失效導致畢生對每日胰島素注射的依賴並發展該疾病的急性及晚期併發症。基於該疾病的自然歷史，剩餘的功能性β細胞群體不可避免地死亡，使患者終生依賴外源性胰島素。因此，阻止甚至減緩 β 細胞的進一步破壞是該領域中未滿足的需求，實現此一需求將導致長期緩解並延遲糖尿病相關併發症。

在各種態樣及實施例中，本發明提供第一型糖尿病（T1DM）的自體免疫療法，包括治療劑、療法、診斷劑（diagnostics）、套組（kits）及其製造方法。舉例而言，本揭露內容提供包含治療有效量之前胰島素原的一或多個胜肽片段的組成物。該組成物可用於治療T1DM。除了作為免疫調節（例如，相對於免疫抑制（immunosuppressive）），根據本發明之某些治療劑並非具有代謝活性（例如，不具有類胰島素活性），且因此對於使用而言為有益地安全的（即，不像高劑量之胰島素，高劑量的本發明之治療劑不會使患者致死或受傷）。

除了減輕臨床T1DM，於某些實施例中，所揭露之方法及組成物可預防臨床前（pre-clinical）T1DM的發展或進程。由於在各種態樣及實施例中，所揭露之方法及組成物可延緩T1DM的臨床發病，因此提供較長的無症狀期間，或甚至預防T1DM之臨床發病，因此為有益的。在診斷的時點，一T1DM患者可仍然具有可觀的胰島素產生量（例如，藉由C-胜肽等級量測之功能性貝塔細胞）。非常需要一種可以阻止或延遲 T1DM 中功能性殘留 β 細胞質量損失的干預措施（intervention），因為它可以在 T1DM 發病後提供更長的「緩解（remission）」期。再者，所揭露之方法及組成物可降低或延緩某些患者中之急性及慢性併發症的發展。

相似地，所揭露之方法及組成物可顯著地改善具有糖尿病之個體的每日管理（day-to-day management）。舉例而言，可以提供針對低血糖的保護並提供改善的代謝控制，從而延遲及／或減少糖尿病的微血管和大血管併發症。總而言之，保留殘留的 β 細胞功能是非常期待的，因為其可減少 T1DM 的短期和長期併發症。

在一第一態樣中，此處所揭露為包含治療有效量之前胰島素原之一或多個胜肽片段的組成物。

在前述態樣的一些實施例中，該前胰島素原之一或多個胜肽片段跨越SEQ ID NO: 1之至少85%、90%、95%，或99%。在一些情形中，該前胰島素原之一或多個胜肽片段跨越SEQ ID NO: 1之整個長度。在某些情形中，該跨越長度是非間斷的（uninterrupted）。

在一些實施例中，該前胰島素原之一或多個胜肽片段的各者為10至30個胺基酸之長度。在某些情形中，該前胰島素原之一或多個胜肽片段的各者為20個胺基酸之長度。

在前述態樣的一些實施例中，該前胰島素原之一或多個胜肽片段包含具有與SEQ ID NOs: 2-11之任一者的胺基酸序列至少85%之序列相等性的一胺基酸序列。在某些情形中，該前胰島素原之一或多個胜肽片段包含SEQ ID NOs: 2-11之任一者的胺基酸序列。

在一些實施例中，該前胰島素原之一或多個胜肽片段各包含一前胰島素原表位。在一些情形中，該前胰島素原表位不存在於胰島素中。在某些情形中，該前胰島素原表位在胰島素中非溶劑可及的（solvent accessible）但在前胰島素原中為溶劑可及的。在一些實施例中，該前胰島素原之一或多個胜肽片段不表現類胰島素代謝活性。

在上述態樣的一些實施例中，該組成物包含2、3、4、5、6、7、8、9，或10個胜肽片段。在這些情形的一些中，各胜肽片段與該等胜肽片段之另一者重疊。在某些情形中，各重疊之長度為介於5至20個胺基酸。在特定情形中，各重疊之長度為10個胺基酸。在一些情形中，各胜肽片段包含一相同長度，以及與一鄰近之胜肽片段相重疊的相同長度。

在上述態樣的一些實施例中，此處所揭露的組成物進一步包含一明礬佐劑或其他藥學可接受載體。在一些實施例中，該組成物進一步包含促進調節免疫反應的佐劑。在一些實施例中，該組成物進一步包含包括一油類及一乳化劑之一佐劑。在一些情形中，該組成物進一步包含一不完全費恩德佐劑（incomplete Freund's adjuvant，IFA）。在某些實施例中，該組成物為免疫調節的。在額外的實施例中，該組成物為非免疫抑制性的。在某些情形中，該組成物引發一Th2免疫反應。在額外的情形中，該組成物不引發一Th1免疫反應。

在另一態樣中，此處提供用於治療有需要之一個體中第一型糖尿病（type 1 diabetes mellitus，T1DM）自體免疫的方法，該方法是藉由：(i) 以足以產生包含對該組成物中之該前胰島素原之一或多個胜肽片段具有特異性的調節T（Treg）細胞之生成及／或擴展的反應之量投予此處以上所述的組成物至該個體。

在一些實施例中，該方法進一步包含：(ii) 自該個體採集一Treg細胞之群體，其中該Treg細胞之群體包含對該前胰島素原之一或多個胜肽片段有特異性的Treg細胞；(iii) 在體外擴增該Treg細胞之群體，其中該Treg細胞之群體包含對該前胰島素原之一或多個胜肽片段有特異性的Treg細胞；及／或(iv) 將經擴增之該Treg細胞之群體投予至該個體，其中該Treg細胞之群體包含對該前胰島素原之一或多個胜肽片段有特異性的Treg細胞。在這些實施例的一些中，步驟(iii)中擴增該Treg細胞之群體包含在體外（ in vitro）將細胞暴露於該前胰島素原之一或多個胜肽片段。

在一些實施例中，該方法進一步包含下列步驟：自該個體提取一生物樣品（例如，血液）；量測該生物樣品中之CD4初始T細胞（naïve T-cell）的等級及／或CD4中央記憶T細胞的等級；決定該生物樣品中CD4初始T細胞對中央記憶T細胞子群體（subpopulation）的比例；及若CD4初始T細胞對中央記憶T細胞子群體的比例低，及／或CD4中央記憶T細胞的等級高，將來自步驟(a)之該組成物及／或來自步驟(d)之經擴增之該Treg細胞群體投予至該個體。在某些實施例中，該CD4初始T細胞為CD45RO−CD62L+及／或該CD4中央記憶T細胞為CD45RO+CD62L+。在這些實施例的一些中，該CD4初始T細胞及／或CD4中央記憶T細胞之等級是藉由該生物樣品的免疫螢光分析法（例如，流式細胞術）而決定。在某些實施例中，該CD4初始T細胞之等級及／或CD4中央記憶T細胞之等級是在步驟(i)中投予該組成物後及／或在步驟(iv)中投予經擴增之該Treg細胞之群體後一日、一週、一個月或一年量測。在某些實施例中，該CD4初始T細胞之等級及／或CD4中央記憶T細胞之等級是每日、每週、每月或每年量測。

在一些實施例中，該方法進一步包含下列步驟：自該個體提取一生物樣品（例如，血液）；量測該生物樣品中之Treg細胞之等級及／或功能；及若該生物樣品中之該Treg細胞之等級及／或功能低，將來自步驟(a)之該組成物及／或來自步驟(d)之經擴增之該Treg細胞之群體投予該個體。在這些實施例的一些中，該Treg細胞為CD4+、CD25高、CR45RO+、Foxp3+、CD127低，或GITR+細胞。在某些情形中，Treg細胞之功能是藉由量測由該個體中之該等Treg細胞所誘發之致耐受反應（tolerogenic response）而量測。在這些情形的一些中，該致耐受反應包含：增加之一或多個抗發炎細胞激素的表現；增加之一或多個免疫調節介質（immunomodulatory mediators）的表現；增加之一或多個死亡受體的表現；增加之吲哚胺2,3-雙加氧酶（indoleamine 2,3-dioxygenase，IDO）及／或血紅素加氧酶1（heme oxygenase-1，HO-1）的表現；及／或降低之一或多個促炎細胞激素的表現。在特定情形中，該抗發炎細胞激素破解（compromises）下列之一或多者：介白素（interleukin，IL）-1受體拮抗劑、IL-4、IL-6、IL-10、IL-11、IL-13，及轉化生長因子-β（TGF-β）；該免疫調節介質破解下列之一或多者：程序性死亡配體（programmed death ligand，PDL）-1/-2、細胞毒性T-白血球關聯蛋白4（cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4，CTLA-4），及類免疫球蛋白轉錄本（immunoglobulin-like transcript，ILT）-3/4；該死亡受體包含下列之一或多者：Fas、腫瘤壞死因子α受體（tumor necrosis factor alpha receptor，TNFαR）、DR3、DR4及DR5；及／或該抗發炎細胞激素包含下列之一或多者：IL-1、IL-12、IL-18、腫瘤壞死因子α受體（TNFαR）、干擾素γ（IFNγ），及顆粒球-巨噬細胞群落刺激因子（granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GM-CSF）。在一些實施例中，該Treg細胞之等級及／或功能是由該生物樣品之免疫螢光分析（例如，流式細胞術）決定。在特定實施例中，該Treg細胞之等級及／或功能是在步驟(i)中投予該組成物及／或在步驟(iv)中投與經擴增之該Treg之群體後一日、一週、一個月，或一年量測。在特定實施例中，該Treg細胞之等級及／或功能是每日、每週、每月或每年量測。

在一些實施例中，該方法進一步包含下列步驟：自該個體提取一生物樣品（例如，血液）；使用該生物樣品以決定該個體之胰腺β細胞功能；以及若該胰腺β細胞功能下降及／或開始下降，投予來自步驟(i)之組成物及／或來自步驟(iv)之經擴增的Treg細胞群體至該個體。在這些實施例的一些中，該胰腺β細胞功能是由C-胜肽測試，諸如平均C胜肽血漿濃度（C-peptide plasma concentration，CPAVE）測試決定。在特定實施例中，該胰腺β細胞功能是在步驟(i)中投予該組成物後及／或在步驟(iv)中投與經擴增之Treg細胞之群體後一日、一週、一個月，或一年後決定。在某些實施例中，該胰腺β細胞功能是每日、每週、每個月，或每年決定。

在一些實施例中，此處以上所揭露之治療方法進一步包含投予至少一促調節白三烯素（proregulatory leukotriene）或細胞激素；及／或至少一抗發炎白三烯素或細胞激素。在某些實施例中，該方法進一步包含投予一或多個β細胞促進劑、抗發炎劑，及／或抗自體免疫劑。

在一些實施例中，該個體具有T1DM且該方法達到至少一臨床終點（clinical endpoint）。在某些實施例中，該個體具有T1DM且該方法緩解T1DM的至少一症狀。在其他實施例中，該個體具有臨床前T1DM且該方法預防或延緩至臨床T1DM的進程。在再其他實施例中，該個體易患（predisposed to developing）T1DM且該方法預防或延緩T1DM的發展。

在一些實施例中，此處以上所揭露之方法緩解對胰腺β細胞的自體免疫。

在此處以上所揭露之方法的一些實施例中，該投予步驟包含靜脈內、肌肉內或皮下投予。

在一些實施例中，該個體為人類，諸如人類成人或人類年少年。

在另一態樣中，此處提供用於治療第一型糖尿病（T1DM）自體免疫之套組，其包含：治療有效量的如此處以上所述的組成物；及投予該組成物至有需求之個體的指示。

在另一態樣中，此處提供用於診斷及治療第一型糖尿病（T1DM）自體免疫之套組，其包含：一T1DM自體免疫診斷；治療有效量的如此處以上所述的組成物；及用以診斷一個體且若該個體有需求則投予該組成物至該個體的指示。

於各種態樣及實施例中，本發明提供對於第一型糖尿病（T1DM）自體免疫的免疫調節療法，包括治療劑、療法、診斷劑（diagnostics）、套組（kits）及其製造方法。舉例而言，本揭露內容提供包含治療有效量之前胰島素原的一或多個胜肽片段的組成物。

參考及定義

所有公開內容（publications）、專利申請案、專利，及其他此處提及的參考文獻以其整體併入此處作為參考。此處所參照的該專利及科學文獻建立對本發明所屬技術領域中具有通常知識者可得的知識。此處引用的授與之美國發明專利、獲准的申請案、公開之外國申請案，及參考文獻，以其整體併入此處作為參考，如同其各自被具體及獨立地被指出被併入做為參考的程度。

本發明的態樣可以不同形式實施且不應被建構為受限於此處所述的實施例。反而是，這些實施例被提供使得本揭露內容將為透徹且完整的，且將完全將本揭露內容的範圍傳達給本發明所屬技術領域中具有通常知識者。舉例而言，對於一個實施例例示之特徵可被併入其他實施例，且對於一特定實施例所例示的特徵可自該實施例刪除。除此之外，對此處所建議之實施例的數種變化及添加基於本揭露內容對本發明所屬技術領域中具有通常知識者而言為顯見的，其不背離本揭露內容。

除非另外定義，此處所使用的所有技術及科學用語具有由本揭露內容相關之領域中具有通常知識者所一般理解的相同意義。此處用於說明的用語僅是為了敘述特定實施例，且並非意欲限制，除非上下文另有規定。

如說明書及所附之申請專利範圍中所使用的，該單數形式「一（a）」、「一（an）」及「該」包括複數指稱，除非上下文另有規定。因此，舉例而言，對「前胰島素原之一胜肽片段」、「一組成物」或「一額外治療劑」的參照可包括二或多個這些前胰島素原之胜肽片段、組成物，或額外治療劑的混合物等。

如此處所使用的，除非特別另外指明，該用語「或」是用於「及／或（and/or）」的廣義概念且非「不是此／即是此（either/or）」的狹義概念。該用語「及／或」涵蓋其中兩者或任一連結特徵為真實或存在的實施例。

該用語「約」或「大約」一般是指在給定之值或範圍的10%內、較佳5%內，或更佳1%內，除非上下文另有規定。

該等用語「包含（comprises）」、「包含（comprising）」、「包括（includes）」、「包括（including）」、「具有（having）」及其等詞性變化表示「包括但不限於」。

本揭露內容的各種實施例可以範圍格式表示。應注意的是當一參數的值或範圍值被記載，所記載之值之間的值與範圍意欲為此揭露內容的部分。應了解的是呈範圍格式的敘述僅是為了便利及簡明而不應被建構為對本揭露內容之範圍的無彈性的限制。因此，範圍的敘述應被認為已具體揭露所有可能的次範圍，以及該範圍內的獨立數值。舉例而言，諸如自1-10之範圍的敘述應被考量已具體揭露諸如自1至3、自1至4、自1至5、自1至6、自1至7、自1至8、自1至9、自2至4、自2至6、自2至8、自2至10、自3至6等，以及在該範圍內的獨立數字，舉例而言，1、2、3、4、5、6、7、8、9及10。此適用於任何廣度的範圍。當此處指出一數值範圍，是指包括該指出之範圍內任何所記載的數字（分數或整數）。此處使用之該等用語「範圍為／介於範圍內（ranging/ranges between）」第一指示數字及第二指示數字之間及「範圍為第一指示數字「至」第二指示數字之間／自第一指示數字至第二指示數字的範圍（ranging/ranges from）」為互換使用，且指包括第一及第二指示數字以及其等之間的所有分數及整數數字。

如此處所使用的，該用語「方法」是指用以達成給定之任務的方式、手段、技術及程序，但不限於已知的，或從已知方式、手段、技術及程序由化學、藥理學、生物學、生化和醫學技藝之從業者研發者。

如此處所使用的，該等用語「可擇地（optional）」或「可擇地（optionally）」代表隨後敘述的事件或條件可或可不發生，且該敘述包括其中該事件或條件發生的情形，及其中該事件或條件不發生的情形。

如此處所使用的，該用語「個體」可為一脊椎動物，諸如一哺乳類、魚、鳥類、爬蟲類，或兩棲動物。因此，此處所揭露之方法的個體可為人類、非人類之靈長類、馬、豬、兔、狗、綿羊、山羊、牛、貓、豚鼠或齧齒動物。該用語並不表示特定的年齡或性別。因此，成年或新生之個體，及胚胎，無論雄性或雌性意欲被涵蓋於其中。在一個態樣中，該個體為哺乳類。於具體的態樣中，該個體為人類。

一「患者」是指顯現第一型糖尿病（T1DM）之症狀及／或併發症、被診斷有T1DM、在臨床醫生（clinician）例如，針對T1DM之醫生的治療下、具有臨床前T1DM，及／或處於發生T1DM的風險下的個體。該用語「患者」包括人類及獸醫學個體。在本發明中對個體的任何參照應被了解包括該個體為一「患者」的任何可能性，除非上下文另有規定。

如此處所使用的，該用語「治療」是指一個體，諸如患者以治癒、減緩、穩定或預防第一型糖尿病（T1DM）之目的之醫療管理。此用語包括主動治療（直接改善T1DM的治療）、因果治療（causal treatment，針對 T1DM 病因的治療）、姑息治療（palliative treatment，旨在緩解與 T1DM 相關的症狀或併發症的治療）、預防性治療（旨在延遲、最小化或部分或完全抑制 T1DM 發展或發作的治療）；及支持治療（用於補充另一種治療的治療）。治療亦包括治癒、抑制、降低、減輕及／或改善與 T1DM 相關的一或多種症狀及／或併發症。在一些實施例中，治療可包括達到T1DM的至少一臨床終點，諸如改善的C胜肽分分泌、降低胰島素使用、改善之HbAlc、接近正常血糖等級、較低血糖等級浮動等。在一些實施例中，治療可包括降低或消除T1DM的至少一症狀。

舉例而言，治療可包括降低低血糖／高血糖的頻率、降低糖尿、降低住院之等級／次數，及降低併發症，諸如腎病、神經病及視網膜病的等級／次數。特別是，處理可包括降低T1DM之至少一症狀至少5%，例如5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或更高，如相對於適當控制組而決定的。適當的控制組可為一控制個體中之相似症狀，諸如在接受此處所述治療方法之前的一測試個體，或具有與測試個體具有相似症狀，且並未接受此處所述之治療的一不同個體或一群個體。

治療亦可包括預防及／或延遲症狀及/或與T1DM關聯之併發症的發作。治療亦包括減少 T1DM 的程度；延遲或減緩 T1DM 的進展；預防、延遲或減緩臨床前 T1DM 向臨床 T1DM 的進展；預防、延遲或減緩有發展為 T1DM 風險的個體的 T1DM 發展；改善或緩解 T1DM；及緩解（無論是部分還是全部），無論是可偵測的還是不可偵測的。

「改善（ameliorating）」或「緩和（palliating）」TIDM表示與沒有治療之程度或時程相比，進程之程度及／或不欲的T1DM之臨床表現被減少及／或進程之時程被拉長。治療不需要完全改善症狀、併發症或疾病且包括減輕症狀及／或潛在風險因素的實施例。

「治療」亦可表示與若不接受治療所預期的存活期相比，延長的存活期。需要治療者包括已經具有T1DM者，以及那些容易患有該病情（condition）或病症（disorder）或需要預防該病情或病症的人。該用語「預防」不需要100%消除該事件的可能性。反而是，其表示在化合物或方法存在的情形下，事件發生的可能性已降低。於各種態樣中，該用語涵蓋一個體的任何治療，包括哺乳類（例如，人類），且包括：(i)預防T1DM在可能易患該疾病但尚未被診斷為患有該疾病的個體中發生；(ii)抑制T1DM，諸如阻止其發展；或(iii) 緩解 T1DM，例如導致 T1DM 退化（regression）。

如此處所使用的，該用語「預防（prevent）」或「預防（preventing）」是指排除、避免、除去、阻止、停止或阻礙某事發生，尤指藉由預先行動。應了解的是當此處使用降低、抑制或預防，除非特別另外指明，其他兩個字彙的使用亦被表達性的揭露。

如此所使用的，該用語「診斷」代表已經受到由一專業人員，舉例而言，醫師進行的體檢，且發現可被診斷或是可由此處所揭露之組成物及方法治療的病情。在所揭露之方法的一些態樣中，在投予步驟前，該個體已被診斷需要對T1DM進行治療。如此處所使用的，需要治療的個體可指基於治療T1DM的需求而辨識或選擇的個體。可以預期的是，該辨識在一個態樣中可藉由與進行診斷的人員不同的人員進行。亦可預期的是，在另一態樣中，該投予可藉由先前進行診斷者進行。

如此處所使用的，該用語「投予（administering）」及「投予（administration）」是指任何提供藥學製劑（pharmaceutical preparation）至個體的方法。這些方法對所屬技術領域中具有通常知識者為已知的且包括，但不限於，口服投予、經皮投予、吸入投予、經鼻投予、局部投予、陰道內投予、眼部投予、耳內投予、腦內投予、直腸投予及腸胃外投予，包括注射投予諸如靜脈內投予、動脈內投予，肌內投予和皮下投予。投予可以是連續的或間歇的。在各種態樣中，製劑可被治療性地投予，諸如被投予以治療已存在的疾病或病情，諸如T1DM。在另一態樣中，製劑可被預防性的（prophylactically）投予，諸如被投予用以預防疾病或病情，諸如T1DM。

如此處所使用的，該用語「有效量」或「有效之量」或「治療性有效量」是指足以達到所欲結果或具有對不欲之病情有效果的量。舉例而言，一「治療性有效量」可指足以達到所欲的治療結果或對不欲的症狀有效果，但通常不足以導致不良副作用。對於任何特定患者之具體治療有效劑量等級將取決於各種因素，包括所治療的疾病和疾病的嚴重程度；使用的具體組成物；患者的年齡、體重、一般健康狀況、性別和飲食；投予時間；投予途徑；所用特定化合物的排泄率；治療的持續時間；與所使用的特定化合物以組合或同時使用的藥物及醫學領域眾所周知的類似因素。

舉例而言，在本技術領域內已知的是，始於低於所需以達到所欲治療效果之等級的治療劑的起始劑量，並逐漸增加該劑量直到所欲效果被達成。若希望的話，基於投予的目的，有效每日劑量可被分成複數個劑量。同時，單一劑量組成物可包含此量或其約數（submultiples）以構成每日劑量。如果有任何禁忌症，可以由個別的醫師調整劑量。劑量可變化，且可以每日或數日間，每日投予一或多個劑量而被投予。對於給定類別的藥品，可以在文獻中找到適當劑量的指導。在其他各種態樣中，一製劑可以預防性有效量，諸如用於預防疾病ˋ病情，諸如T1DM之有效量被投予。

在一些實施例中，治療有效量之前胰島素原胜肽片段可為5微克（micrograms）至10微克之前胰島素原胜肽片段、0.5至4.0微克之前胰島素原胜肽片段，或其等之間的任何值。在一些實施例中，治療有效量之前胰島素原胜肽片段可為5、10、25、50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、350、400、450、500、600、700、800或900微克之前胰島素原胜肽片段，或其等之間的任何值。在一些實施例中，治療有效量之前胰島素原胜肽片段可為1.0、1.25、1.5、1.75、2.0、2.25、2.5、2.75、3.0、3.25、3.5、3.75、4.0、4.25、4.5、4.75、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5或10微克之前胰島素原胜肽片段，或其等之間的任何值。另外或替代地，治療有效量之前胰島素原胜肽片段可為能引發個體中之所欲免疫反應（例如，所欲等級織抗原特異Treg細胞、細胞毒性T細胞功能的抑制、致耐受反應的生成、Th2/Treg的生成等）的量。在進一步或替代情形中，治療有效量之前胰島素原胜肽片段為可達到個體中至少一臨床終點（例如，改善之C-胜肽分泌、較少血糖等級變化等）的量。額外或替代地，治療有效量之前胰島素原胜肽片段可為可以減緩T1DM之至少一症狀的量（例如，低血糖／高血糖的頻率、減少的糖尿、住院的等級／次數和併發症如腎病的等級／次數，神經病和視網膜病）。

如此處所使用的，對於前胰島素原胜肽片段或包含其的組成物，該用語「單位劑量形式（unit dosage form）」是指適合以單一劑量投予至個體的一或多個前胰島素原胜肽片段及／或組成物。在一些實施例中，此處所述之一或多個前胰島素原胜肽片段及／或組成物（例如，一藥學組成物）的單位劑量可符合該前胰島素原胜肽片段及／或組成物的治療有效量。

該用語「藥學可接受」敘述了生物學上期望的材料，諸如不導致無法接受等級之不良的生物學效果或以有害的方式發生交互作用。

如此處所使用的，對於一參數，該用語「降低（reduce）」或「降低（reducing）」或「減少（decrease）」或「減少（decreasing）」或「減低（alleviate）」或「減低（alleviating）」是指與比較控制組，例如，參數之經確立之正常或參考等級，或經確立之標準控制組相比，可偵測（例如，至少約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、99%，或更高）之參數的負改變。舉例而言，如此處所使用的，降低或減少或減低與T1DM關聯之症狀及／或併發症是指與一控制個體（例如，在接受此處所述之處理方法前的相同個體；或具有與該測試個體相似症狀而並未接收此處所述之治療的不同個體或個體之組群）中之與T1DM關聯之症狀及／或併發症相比，可偵測（例如，至少約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、99%，或更高）之測試個體（例如，受到此處所述之治療方法的個體）中與T1DM相關聯之症狀及／或併發症的負改變。

如此處所使用的，一「控制組（control）」或「控制個體（control subject）」是指未接受本發明之組成物及方法的個體。如此處所使用的，一「測試個體」是指已接受本發明之組成物及方法的個體。如此處所使用的，針對一參數，一「合適控制組」可指一控制個體（例如，在接受此處所述之治療方法之前的測試個體；或具有如同該測試個體相似症狀而未接受此處所述之治療的一不同個體或個體之組群）中的參數。舉例而言，如此處所使用的，參照與T1DM關聯之症狀及／或併發症，一「合適控制組」可指一控制個體（例如，在接受此處所述之治療方法之前的測試個體；或具有如同該測試個體相似症狀而未接受此處所述之治療的一不同個體或個體之組群）中與T1DM關聯之症狀及／或併發症。

如此處可互換地使用，該用語「胜肽片段」或「前胰島素原之胜肽片段」或「前胰島素原胜肽片段」是指前胰島素原蛋白，例如，人類前胰島素原蛋白的片段。對前胰島素原胜肽片段的參照可指用已用於此處所述之方法或組成物之一的前胰島素原胜肽片段之集合或組成物，諸如一治療性組成物，且具體而言是指包括於該組成物中前胰島素原胜肽片段之選擇的身分（例如，序列），除非上下文另有規定。

在一些實施例中，（組成物中之）前胰島素原胜肽片段可累積跨越該前胰島素原序列（例如，SEQ ID NO: 1）的至少75%（例如，至少75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%，或100%）。在一些實施例中，一或多個前胰島素原胜肽片段（可擇地，各前胰島素原胜肽片段）可包含具有與SEQ ID NOs: 2-11之任一者的胺基酸序列至少75%（例如，至少75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%，或100%）之序列相等性的胺基酸片段。在特定實施例中，本發明之前胰島素原個胜肽片段可為表1中所述之胜肽1、胜肽2、胜肽3、胜肽4、胜肽5、胜肽6、胜肽7、胜肽8、胜肽9及、胜肽10的一或多者（例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或全部）。在一些實施例中，前胰島素原為重疊片段。舉例而言，各胜肽片段可與前一個或後一個胜肽片段重疊約5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30個胺基酸。在特定實施例中，所有胜肽片段與至少一個其他胜肽片段重疊（例如，除兩個胜肽片段外，所有胜肽片段都與至少兩個其他胜肽片段重疊）。

如此處所使用的，「抗原特異性Treg細胞」可指由自體抗原所誘發之Treg細胞及／或對一自體抗原特異的Treg細胞。本發明中之該目標自體抗原為前胰島素原。因此，如此處所使用的，「自體抗原特異性Treg細胞」可指前胰島素原特異性Treg細胞，即，由前胰島素原之一或多個胜肽片段誘發之Treg細胞及／或對前胰島素原之一或多個胜肽片段或由其表現之一或多個表型具特異性的Treg細胞。

如此處所使用的，該用語「細胞療法」是指以自體抗原特異性Treg細胞進行之療法或治療。特別是，「細胞療法」是指以前胰島素原特異性Treg細胞，即由前胰島素原之一或多個胜肽片段誘發及／或對前胰島素原之一或多個胜肽片段或對由其所表現之一或多個表型具特異性之Treg細胞進行的療法或治療。舉例而言，「細胞療法」可指藉由投予該個體前胰島素原特異性Treg細胞之群體以治療個體中T1DM的方法。這些前胰島素原特異性Treg細胞可藉由下列誘發、生成及／或擴增：以足以生成包含對前胰島素原之一或多個胜肽片段或由其所表現之一或多個表型具有特異性的Treg細胞之活化、生成，及／或擴增之反應的量，投予（例如，由靜脈內、肌肉內或皮下途徑）包含前胰島素原之一或多個胜肽片段之組成物至一個體；自該個體採集Treg細胞之群體，其中該Treg細胞之群體包含對前胰島素原之一或多個胜肽片段或由其表現之一或多個表型具有特異性的Treg細胞；以及體外（ in vitro）擴增Treg細胞群體，其中可擇地，該擴增包含在體外進一步將Treg細胞之群體暴露於一或多個胜肽片段。對於療法或治療目的，可在需要時將此經擴增之前胰島素原特異性Treg細胞再次誘發於個體中。

除非另外表示性的敘述，並未意欲使此處所述之任何方法建構為其步驟必須以特定順序進行。因此，當一方法請求項未實際記載其步驟遵循的順序，或其並未另外具體於請求項或說明書中記載該等步驟被限制於一具體順序，在任何方面，並非意欲使一順序被推斷。此適用於任何可能的非明確解釋基礎，包括：與步驟或操作流程安排有關的邏輯問題；源自語法組織或標點符號的簡單含義；以及說明書中描述的實施例的數量或類型。

應當理解，為了清楚起見，在單獨實施例的上下文中描述的本發明的某些特徵也可以在單個實施例中組合地提供。相反地，為了簡潔起見，在單個實施例的上下文中描述的本發明的各種特徵也可以單獨提供或以任何合適的子組合（sub-combination）或適合於本公開的任何其他描述的實施例來提供。在各種實施例的上下文中描述的某些特徵不應被認為是那些實施例的基本特徵，除非實施例在沒有這些元件的情形下是無效的。

胰島素及前胰島素原

對抗胰島素之自體抗體（autoantibodies）頻繁地發現於新診斷之糖尿患者者中。胰島素是在胰島 β 細胞（pancreatic islet β-cells）中由其前驅物前胰島素原合成的。胰島素在胰臟β 細胞中生產及降解。前胰島素為110個胺基酸之對有生物學活性之內分泌激素胰島素的非生物活性前驅物。前胰島素原藉由訊號肽酶（signal peptidases）轉化成胰島素原（proinsulin），該訊號肽酶自前胰島素原的N端移除訊號胜肽。最後，胰島素原藉由移除其連接胜肽（C-胜肽）而轉化成生物活性激素胰島素。

β細胞外幾乎沒有前胰島素原存在，由於移除訊號胜肽並非為分離的步驟而是與蛋白轉位（translocation）至內質網（endoplasmic reticulum，ER）緊密相連。基於相同理由，不像做為成熟產物之胰島素以及穩定的ER中間物胰島素原，前胰島素原幾乎未被用於醫學上。

此處提供包含前胰島素原的一或多個胜肽片段之組成物。在一些實施例中，該前胰島素原為人類前胰島素原（GenBank Accession No: NP_000198.1）。在一些實施例中，該前胰島素原是110個胺基酸的蛋白質。該前胰島素原可包含具有與SEQ ID NO: 1之胺基酸序列至少75%（例如，至少75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%）之序列相等的胺基酸序列。舉例而言，該前胰島素原可包括SEQ ID NO: 1之胺基酸序列。在這些情形中，此處所提供的組成物可包含SEQ ID NO: 1之一或多個胜肽片段。

於一些實施例中，本發明不只考慮到SEQ ID NO: 1，亦考慮其同源物或類似物。舉例而言，此處所揭露之前胰島素原序列可結構性地及／或功能性地與SEQ ID NO: 1同源。同源性可包括至少70%（例如，71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%，或99%）之同源性。類似序列可包括來自非人類種族之前胰島素序列，以及包含一或多個前胰島素表位或交叉反應表位的合成胜肽序列。在一些實施例中，類似序列可包括包含一或多個突變或多態性（polymorphisms）的人類前胰島素原序列。

胰島素生物合成的第一步驟涉及新合成之前胰島素原至該內質網（ER）的定位（targeting）及轉位（translocation）。此程序是由前胰島素原在其N端之訊號胜肽主導。前胰島素原具有24個殘基訊號胜肽，其包含三個區域：帶正電之n區域；中央核心疏水h區域；及包含SPase之切割位的極性c區域。位於前胰島素原訊號胜肽中已被報導導致糖尿病的突變包括，但不限於L13R、A24D、R6C，及R6H（Liu et al., Vitam Horm,95: 35-62 (2014); Rapoport, Nature,450: 663-669 (2007); Liu et al., Mol Aspects Med,42: 3-18 (2015)）。與這些突變體關聯之該臨床糖尿病表型的範圍自由L13R或A24D導致之嚴重的新生兒胰島素缺乏型糖尿病，到與R6C或R6H關聯之輕微成年發作糖尿病，表明不同的細胞缺陷或分子機制可能是這些患者糖尿病發病和發展的基礎（Liu et al., Mol Aspects Med,42: 3-18 (2015)）。在一些實施例中，本發明之一前胰島素原序列為包含L13R、A24D、R6C，及／或R6H突變之一或多者的人類前胰島素原序列。

胰島素生源（biogenesis）始於粗糙ER（rough ER）中前胰島素原的合成及前胰島素原至胰島素原的轉化。前胰島素原在轉位到粗糙內質網腔後不久（或期間）轉化為胰島素原。接著，胰島素原被運輸到高爾基體的扁囊成熟面處（trans-cisternae），在該處其被導向新生的、未成熟的分泌顆粒。藉由蛋白水解裂解（proteolytic cleavage）將胰島素原轉化為胰島素和C胜肽發生在分泌顆粒內，並且取決於其通過ATP依賴性質子泵的酸化。胰島素原由B鏈、C胜肽及A鏈組成。 C胜肽被切斷，B鏈及A鏈末端通過二硫鍵連接形成胰島素。分泌顆粒經歷成熟過程，其中胰島素內容物與鋅及鈣一起結晶為緻密核心顆粒。這些新的、成熟的緻密核心胰島素顆粒形成兩個不同的細胞內池（intracellular pools），即易釋放池 （readily releasable pools ，RRP）及保留池。這兩個密集核心顆粒群可能是胰島素釋放的雙相性質的原因。RRP顆粒與質膜（plasma membrane）相關，並經歷導致第一階段胰島素分泌的急性鈣依賴性釋放。這些顆粒內容物回應適當的刺激，主要是葡萄糖，通過胞吐作用排出。這個過程代表經調節的分泌途徑，超過99%的胰島素原在健康個體的β細胞中被定向。相對地，第二階段胰島素分泌需要將保留的顆粒池運輸（trafficking）到質膜，且涉及產物從高爾基體快速轉移到質膜以立即釋放。胰島素顆粒與質膜融合的最初觸發因素是細胞內鈣的升高，在葡萄糖刺激的情形下，ATP產生增加、ATP敏感鉀通道關閉且細胞去極化。反過來，這會打開電壓依賴性鈣通道，從而增加細胞外鈣的流入。鈣可能與功能上抑制融合抑制蛋白複合物的融合調節蛋白的成員－突觸標籤蛋白（synaptogamin）結合。

簡言之，前胰島素原為β細胞特異性抗原，且因此，可形成根據本發明之用於T1DM之免疫調節組成物及療法的基礎。

前胰島素原之胜肽片段

在各種實施例中，本發明通過將前胰島素原序列或其一部分分成代謝無活性的重疊前胰島素多肽片段來利用前胰島素原，以捕獲作為β細胞限制性抗原的前胰島素原的免疫調節潛力。藉由將前胰島素原分成重疊的胜肽，免疫系統可以呈現胜肽序列，這些胜肽序列包含前胰島素原獨有，但不存在於胰島素或C胜肽中（兩者都存在於循環中）的序列。

在一些實施例中，本發明提供包含治療性有效量之前胰島素原之一或多個胜肽片段的組成物。舉例而言，此處所述之組成物可包含治療性有效量之1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100個前胰島素原之胜肽片段。於特定情形中，此處所述之組成物包含治療性有效量之10個前胰島素原之胜肽片段。

前胰島素原之一或多個胜肽片段可各自為約5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30個胺基酸之長度。在特定情形中，前胰島素原之一或多個胜肽片段可各自為約5-10、5-15、5-25、10-20或10-30個胺基酸之長度。舉例而言，前胰島素原之一或多個胜肽片段可各自為約20個胺基酸之長度。在特定情形中，此處所述之組成物包含一致長度的二或多個胜肽片段。舉例而言，本發明之組成物可包含前胰島素原之一或多個胜肽片段，其中各胜肽片段為20個胺基酸長。在一些實施例中，根據本發明之組成物可包括一致長度之片段（例如，都是約20個胺基酸之長度），以及不同長度的分布。片段長度，或其分布可被選擇以使免疫調節效果最佳化。

在一些實施例中，該一或多個前胰島素原胜肽片段可包含具有與SEQ ID NOs: 2-11之任一者的胺基酸序列至少75%（例如，至少75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%，或100%）之序列相等性的胺基酸片段。在特定情形中，前胰島素原之一或多個胜肽片段可包含SEQ ID NOs: 2-11之任一胺基酸序列。特別是，本發明之組成物可包含一或多個（例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或全部）表3中所述之胜肽1、胜肽2、胜肽3、胜肽4、胜肽5、胜肽6、胜肽7、胜肽8、胜肽9及、胜肽10。表3中之胜肽1-10累積跨域SEQ ID NO: 1的全長，各自為20個胺基酸的長度，且若出現時，各自與先前或後續的胜肽重疊（基於SEQ ID NO: 1內的位置）10個胺基酸。

在一些實施例中，此處所述的組成物可為用以治療獨立個體及／或用以治療個體之選擇群體。舉例而言，為了治療獨立個體及／或用以治療個體之選擇群體，此處所述的組成物可包含表1中之胜肽1、胜肽2、胜肽3、胜肽4、胜肽5、胜肽6、胜肽7、胜肽8、胜肽9及胜肽10的一或多個（例如，1、2、3、4’5、6、7、8、9或全部）。胜肽之選擇（例如，敘述於表1中的胜肽1、胜肽2、胜肽3、胜肽4、胜肽5、胜肽6、胜肽7、胜肽8、胜肽9及胜肽10的一或多個（例如，1、2、3、4’5、6、7、8、9或全部））可基於一個體特異性概廓，使得該治療對於該獨立個體或群體個人化。該選擇可基於，例如，個體對於與T1DM相關之一或多個基因的基因型（例如，與個體對前胰島素原之抗原特異自體免疫反應有關）及／或基於個體對一或多個具體胜肽之免疫回應（例如，如藉由刺激測定所量測者）。

在一些實施例中，本發明的組成物包含前胰島素原之重疊胜肽片段。舉例而言，此處所述之組成物可包含二或多個胜肽片段，其中各片段與另一胜肽片段重疊。在一些情形中，各重疊是約5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30個胺基酸的重疊。在一些情形中個重疊違約5-10、5-15、5-20、5-25或5-30個胺基酸的重疊。舉例而言，各重疊可為約10個胺基酸的重疊。在特定情形中，此處所述的組成物包含一致重疊的前胰島素原胜肽片段（例如，都是約10個胺基酸），以及變化的重疊。再次地，重疊長度或其分布可被選擇以將免疫調節效果最佳化。

此處所述之一或多個胜肽片段可跨越該前胰島素原序列的至少75%（例如，至少75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%，或100%）。舉例而言，此處所述之一或多個胜肽片段可累積跨越SEQ ID NO: 1的至少75%。在一些情形中，該一或多個胜肽片段累積跨越該前胰島素原序列的整體長度。因此，包含預定組之胜肽片段（例如，各自為10個胺基酸長的一百個片段）之組成物可包含整個前胰島素原序列（即110個胺基酸）。在特定情形中，該一或多個胜肽片段跨越SEQ ID NO: 1的整體長度。特別是，該跨越長度可為非打斷的。在其他情形中，該胜肽片段不涵蓋整個前胰島素原序列，且可被限制於前胰島素原表位的一集合或次集。此處所述之一或多個胜肽片段可包含至少一個內部前胰島素原表位（internal preproinsulin epitope）。一內部前胰島素原表位為一般在胰島素中非溶劑可及的表位。舉例而言，一內部前胰島素原表位可包含在胰島素中非為溶劑可及，但在前胰島素原中為溶劑可及的表位。另外，一內部前胰島素原表位可包含在蛋白質3D結構中皺起及／或隱蔽於內部，但在該自體免疫過程中被暴露的表位。因此，不像外部表位，內部前胰島素原表位對免疫系統可能是不容易可及的，例如在針對非變性完全折疊蛋白的免疫反應的情形下。然而，一內部前胰島素原表位可在驅動自體免疫之免疫反應中扮演主要的角色，特別是當大部分的細胞碎片是由自體免疫反應所生產時。

舉例而言，前胰島素原之一或多個胜肽片段可包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100，或更多前胰島素原表位。於特定情形中，一或多個胜肽片段的各者包含一內部前胰島素原表位。該等表位可被選擇以使免疫調節效果最佳化。

在一些實施例中，前胰島素原之一或多個胜肽不展現類似胰島素之代謝活性（例如，在人類個體中）。這些實施例可為有益的，由於其可允許投予較所偏好或最大容忍量之胰島素劑量更高的胜肽片段濃度。在各種實施例中，該等片段包含未存在於胰島素中的至少一表位。這些實施例可有益地限制根據本發明之組成物對包含前胰島素原之細胞的效果。

在一實施例中，各重疊的胜肽片段包含一前胰島素原表位。此處所述之前胰島素原表位可包括已知表位，諸如B鏈B9-23及A鏈1-15表位。前胰島素原表位可包括隱蔽表位（cryptic epitopes），其在正常條件下產生的量不足以被胸腺（thymus）缺失或外周無反應的 T 細胞識別。請參，例如，Lanzavecchia, Exp Med. 1995 Jun 1;181(6):1945-8（doi: 10.1084/jem.181.6.1945），其以其整體併入此處作為參考。隱蔽前胰島素原表位可作為分段（fragmenting）前胰島素原暴露的結果（即，在原生、折疊之前胰島素原中非溶劑可及的表位）。在切割及處理期間，去除信號胜肽序列後，前胰島素原被分解為A鏈、C胜肽及 B鏈。在此過程中，C胜肽兩端的兩個胺基酸（即，總共四個胺基酸）丟失並且不存在於任何其他胜肽中。因此，C胜肽的邊界區域和該區域中的一些表位在胰島素中不被表現。然而，這些區域及／或表位是「新的」並且在病理疾病環境中可能具有免疫原性（例如，在自身免疫條件下的破壞過程中產生的碎片中）。在一些實施例中，本發明的一或多個胜肽片段包含一或多個此種隱蔽的前胰島素原表位。前胰島素原表位可以包括跨越信號胜肽和B鏈的連接處、B鏈和C胜肽的連接處、或C胜肽和A鏈的連接處的表位，因此其並非存在於胰島素中。前胰島素原表位可以包括存在於前胰島素原序列（或其類似物）中的整套表位。表位還可以包括一種或多種β細胞特有的表位（即，T1DM 中自身免疫的特異性標靶）。在一些實施例中，本發明的胜肽片段包含一或多個胰島素A鏈1-15表位、B鏈9-23表位、B鏈11-27表位、C胜肽C3-27表位、 C胜肽C13-32 表位及C胜肽 C13-20表位。前胰島素原胜肽片段、其組成物、以及使用或製備方法可以是揭示於 2016 年 12 月 15 日公開，Orban等人的美國專利申請公開第US 2016/0361397號之任一者，其以其整體被併入此處作為參考。

不希望受任何特定理論的束縛，對主要自身抗原（antoantigen）－胰島素的自身耐受性的喪失可能釋放自身攻擊性T細胞並引發自身免疫。因此，生產胰島素之細胞的破壞可以於T1DM臨床發作之前開始。在某些個體的臨床診斷中，仍有約20-50%的自身胰島素產生，在幾年內無需醫療干預即可完全破壞。破壞過程是由T細胞介導的，可能涉及CD4+細胞。然而，能夠抑制自身攻擊性T細胞群的調節性T細胞（Tregs）也可能發揮關鍵作用。Treg細胞包括天然存在的CD4+CD25+細胞和抗原誘導的類CD4+ Th2調節細胞。自身攻擊性和調節性T細胞群集之間的不平衡可能是自身免疫的核心。因此，可以通過刪除自身攻擊性細胞及／或增加調節群體來實施成功的干預，以重新建立控制並創造健康的平衡。

再次地，不希望受任何特定理論的束縛，自身免疫環境中的抗原攻擊可刺激T細胞亞群（例如，Th2與Th1）、細胞激素之生產及／或Treg細胞誘導中的有益變化。實務上，自身免疫性疾病的抗原特異性治療方案可能使用與疾病發病機制有所牽連的假定自身抗原（putative self-antigens）。胰島素是一種β細胞特異性主要蛋白質，且單獨使用時也具有中等免疫原性。然而，當使用胰島素時，除了其他副作用外，還擔心低血糖的發生。因此，與人用胰島素相比，胰島素相關胜肽可能是更安全的選擇，因為其等不一定具有降血糖作用。在一些實施例中，本發明的組成物包含一或多個胜肽片段，其在施用於各體（例如，人）時不具有降血糖作用。

自身抗原的延長外周呈遞（Prolonged peripheral presentation）可導致低親和力自身反應性T細胞（low-avidity auto reactive T cells）分化成抑制自身反應性細胞毒性T淋巴細胞 (CTL) 和自身抗原呈遞的類記憶自身調節性 T 細胞（memory-like auto regulatory T cells），因此，保護β細胞免受進一步損傷。T1DM 中的自身免疫過程選擇性地殺死胰島中的β細胞，並且不會破壞其他內分泌細胞，如產生胰高血糖素的α細胞。這種選擇性表明成為自身抗原的自體抗原可能僅限於β細胞。 前胰島素原是胰島素的前體，是唯一存在於 β 細胞而非任何其他細胞中的胜肽。相對地，胰島素和C胜肽是分泌產物，其等會離開β細胞並在血液中循環。在一些實施例中，本發明所述的組成物包含一或多個存在於β細胞中而不存在於任何其他細胞中的胜肽片段。在一些情形下，此處所述的組成物包含一或多個不存在於循環中（例如，在人類各體中）的胜肽片段。

簡言之，主要自身抗原，例如佐劑中的前胰島素原胜肽片段的外周再引入（peripheral reintroduction），可以在 T1DM患者中誘發調節性免疫反應並重建免疫耐受性。如果即使在這個晚期階段也可以阻止自身免疫過程，β細胞可以被保存且可能允許其等的再生。這是一種獨特的、T1DM 特異性、有目標性（targeted）且非免疫抑制的途徑，因此特別適合患有T1DM的兒童及年輕成人以及高危險人類個體的預防。

佐劑

據本發明之組成物可包括促進調節免疫反應（例如，人類個體中）的佐劑。在一些實施例中，該組成物包括包含與水混合之一油類及乳化劑的佐劑。在一些實施例中，該組成物包括一不完全費恩德佐劑（IFA）。在一些實施例中，該組成物可以包括明礬佐劑、角鯊烯（squalene）、滅活細菌（killed bacteria）、類毒素、無機化合物、脂質體、樹枝狀聚合物（dendrimer）、奈米乳液及／或類似者。

一IFA（商業上可取得，例如，來自法國Seppic公司的佐劑Montanide ICA 51）通常由兩個組分所組成，一油類及一乳化劑。IFAs可與抗原使用以引發細胞介導的免疫及產生保護性同種型抗體（小鼠中的 IgG2a 和靈長類動物中的 IgG1）。不同種類的佐劑具有相似的副作用，例如注射部位的反應及致熱性（pyrogenicity）。明礬是人類疫苗常用的佐劑，也可能在注射部位產生明顯的肉芽腫反應（granulomatous response）。

不完全費恩德佐劑的作用模式可涉及非特異性及特異性免疫反應（例如於人類個體中）。IFAs亦可作為抗原載體及緩釋或長期抗原呈遞裝置。此可能為IFA的一個重要特徵，由於自身抗原的延長外周呈遞可導致低親和力自身反應性T細胞分化為抑制自身反應性CTL及抗原呈遞細胞（APC）自身的類記憶自身調節性T細胞。IFA 對抗原免疫原性的特異性增強作用可能導致體液免疫增加（例如，優先產生保護性抗體；人類為 IgG1，小鼠為 IgG2a）並引發特異性細胞介導的免疫（例如，Th2型）。由於保護的可靠性及持續時間，在T1DM中使用自身抗原特異性免疫治療可能是有利的。在一些情形下，此處所述的組成物是免疫調節的。另外或可擇地，該組成物可以不是免疫抑制的。在一些情形下，此處所述的組成物引發Th2免疫反應（例如，在給予該組成物之人類個體中）。另外或可擇地，該組成物可能不會引發Th1免疫反應（例如，在給予該組成物之人類個體中)。

組合療法

根據本發明的組成物可包括除了以上所述的一或多個前胰島素原胜肽片段之外的一或多個治療劑。該額外的治療劑可以是用於T1DM及／或另一種相關或共存病症的治療劑。此類額外治療劑的實例包括但不限於促調節白三烯素（pro-regulatory leukotrienes）、細胞激素（例如，IL-10、TGFβ等）或用於促進或增強調節反應或恢復自身耐受性的其他物質。其他治療方法的其他例子包括阻斷自身免疫反應的抗炎白三烯及細胞激素（例如，IL-1 拮抗劑）。其他治療劑的其他實例包括促進β細胞再生及／或生長的試劑（例如，艾塞那肽（Exenatide））及／或其他抗炎／抗自身免疫劑（例如，維生素D及其類似物）。

一或多個另外的治療劑可以是組成物的一部分。或者，一或多個額外的治療劑可以與組成物分開。在一些此種情形下，一或多個額外的治療劑可以與組成物組合投予。或者，可以將一或多個額外的治療劑與組成物分開投予。在一些此種情形下，一或多個額外的治療劑可以與組成物同時施用。或者是，該一或多個額外的治療劑可在投予該組成物之前投予。舉例而言，該一或多個額外的治療劑可在該組成物之投予前約5分鐘、10分鐘、15分鐘、20分鐘、25分鐘、30分鐘、45分鐘、1小時、1.5小時、2小時、2.5小時、3小時、3.5小時、4小時、4..5小時、5小時、5.5小時、6小時、7小時、8小時、9小時、10小時、11小時、12小時、18小時、24小時、30小時、36小時、42小時、48小時、54小時、60小時、72小時、96小時、5天、6天、1週、2週、3週、4週、1個月、2個月、3個月、4個月、5個月、6個月，或1年投予。或者是，該一或多個治療劑可在該組成物的投予後隨後投予。舉例而言，該一或多個治療劑可在該組成物的投予後隨後約5分鐘、10分鐘、15分鐘、20分鐘、25分鐘、30分鐘、45分鐘、1小時、1.5小時、2小時、2.5小時、3小時、3.5小時、4小時、4..5小時、5小時、5.5小時、6小時、7小時、8小時、9小時、10小時、11小時、12小時、18小時、24小時、30小時、36小時、42小時、48小時、54小時、60小時、72小時、96小時、5天、6天、1週、2週、3週、4週、1個月、2個月、3個月、4個月、5個月、6個月，或1年投予。

藥學組成物及套組

在一些實施例中，本發明的一組成物被調配成藥學組成物。於某些情形中，藥學組成物包含本發明之組成物及藥學可接受之載體。舉例而言，此處所述之藥學組成成物可包含在一藥學可接受載體中的前胰島素原之一或多個胜肽片段。或者是，此處所述之藥學組成物可包含在一藥學可接受之載體中的前胰島素原之一或多個胜肽片段及一或多個額外治療劑。

特別是，此處所述之藥學組成物可包含在藥學可接受之載體中有效量之前胰島素原之一或多個胜肽片段。或者是，此處所述之藥學組成物可包含在一藥學可接受之載體中的有效量之前胰島素原之一或多個胜肽片段及一或多個額外治療劑。在一些實施例中，治療有效量可為5毫克至10毫克、0.5至4.0毫克，或其等之間的任意值。在一些實施例中，治療有效量可為5、10、25、50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、350、400、450、500、600、700、800或900毫克，或其等之間的任意值。在一些實施例中，治療有效量可為1.0、1.25、1.5、1.75、2.0、2.25、2.5、2.75、3.0、3.25、3.5、3.75、4.0、4.25、4.5、4.75、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5或10毫克，或其等之間的任意值。另外或替代地，治療有效量可以是可個體中引發期望的免疫回應的量（例如，期望等級之抗原特異性Treg細胞、細胞毒性T細胞功能的抑制、致耐受反應的產生、 Th2/Treg 反應）。在進一步或替代的情形下，治療有效量是可在個體中實現至少一個臨床終點的量（例如，改善的C胜肽分泌、減少的胰島素使用、改善的HbA1c、更接近正常血糖等級、更少的血糖等級波動、等）。另外或替代地，治療有效量可以是可以減輕T1DM的至少一種症狀的量（例如，低血糖／高血糖的頻率、減少的糖尿、住院的等級／次數和併發症如腎病的等級／次數，神經病和視網膜病）。

藥學上可接受的載體可以指無菌水性或非水性溶液、分散液、懸浮液或乳液，以及用於在使用前重建為無菌可注射溶液或分散體的無菌粉末。合適的水性和非水性載體、稀釋劑、溶劑或載體的實例包括水、乙醇、多元醇（例如甘油、丙二醇、聚乙二醇等）、羧甲基纖維素及其合適的混合物、植物油（例如橄欖油）及可注射的有機酯，例如油酸乙酯。本發明的組成物或其中的一或多個組分（例如，前胰島素原的一或多個胜肽片段）可以根據例行技術與藥學上可接受的載體或稀釋劑以及任何其他已知的佐劑和賦形劑一起配製，例如Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 第 19 版, Gennaro, Ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1995 中揭露者。

在一些實施例中，此處所揭露的藥學組成物可包含前胰島素原之一或多個胜肽片段、一藥學可接受之載體，及可擇地一或多個額外治療劑，及佐劑。此處所揭露之藥學組成物可包括適合用於口服投予、直腸投予、局部投予、吸入及腸胃外（包括皮下、肌內和動脈內、靜脈內）投予，儘管在任何給定情況下最合適的途徑將取決於特定宿主以及正在服用活性成分所針對的病症的性質和嚴重程度。藥學組成物可以方便地以單位劑型存在並通過藥學領域熟知的任何方法製備。

本揭露內容的適合用於腸外投予之藥學組成物可被調配為該活性成分之水中的溶液或懸浮液（例如，具有或不具有一或多個額外治療劑之前胰島素原之一或多個胜肽片段）。可包括適合的表面活性劑，諸如，例如，羥丙基纖維素。分散液亦可於甘油、液體聚乙二醇及其在油中的混合物中被調配。再者，可包括防腐劑以預防微生物有害的增長。

本揭露內容的適合用於注射之藥學組成物可包括無菌水性溶液或分散液。再者，該等組成物可呈此無菌注射溶液或分散液的用於臨時準備（extemporaneous preparation）之無菌粉末。在所有情形中，該最終可注射形式較佳為用於易於注射之無菌且有效的液體。該等藥學組成物較佳在製造及儲存的條件下為穩定的；因此，較佳地，應被保存於對抗諸如細菌及黴菌之微生物的污染行為。該載體可為包含，例如，水、乙醇、多元醇（例如，甘油、丙二醇和液態聚乙二醇）、植物油，及其等之合適的混合物之溶劑或分散介質。

本揭露內容之藥學組成物可於適合局部使用（topical use），諸如，例如氣凝膠、乳膏、軟膏、乳液、除塵粉、漱口水、含漱劑（gargles）等的形式。再者，該等組成物可為適合用於經皮裝置的形式。這些調配物可利用此處所揭露之活性成分（例如，具有或不具有一或多個額外治療劑之前胰島素原之一或多個胜肽片段）或其藥學可接受之鹽類，經由傳統處理方法而製備。作為實例，乳膏或軟膏藉由將疏水材料及水混合，伴隨約5 wt%至約10 wt%之活性成分混合而製備，用以生產具有所欲稠度（consistency）的乳膏或軟膏。

本揭露內容之藥學組成物可為呈適合直腸投予的形式，其中該載體為固體。較佳的是該混合物形成單一劑量栓劑。合適的載體包括可可脂及本領域常用的其他材料。該等栓劑可藉由首先混合該組成物與軟化或融化之載劑隨後冷卻並於模具中塑型而方便地形成。

使用之藥學載體可為，例如，固體、液體或氣體。固體載具的實例包括乳糖、白土（terra alba）、蔗糖、滑石、明膠、瓊脂（agar）、果膠（pectin）、阿拉伯膠（acacia）、硬脂酸鎂及硬脂酸。液體載體的實例是糖漿、花生油、橄欖油及水。氣體載體的實例包括二氧化碳及氮氣。

在製備用於口服劑量形式之組成物時，任何方便之藥學介質可被使用。舉例而言，水、乙二醇、油類、醇類、調味劑、防腐劑、著色劑等可用於形成口服液體製劑，例如懸浮液、酏劑（elixir）及溶液；而載體如澱粉、糖、微晶纖維素、稀釋劑、製粒劑、潤滑劑、黏合劑、崩解劑等可用於形成口服固體製劑如粉劑、膠囊和錠劑。由於其等易於投予，錠劑及膠囊為使用固體藥學載體時較佳的口服劑量單元。可擇地，錠劑可以通過標準的水性或非水性技術進行包膜（coated）。包含本揭露內容的組成物的錠劑可以通過壓縮或模塑製備，可擇地具有一或多個輔助成分或佐劑。壓製錠劑可以通過在合適的機器中壓製自由流動形式的活性成分來製備，例如粉末或顆粒，可擇地與黏合劑、潤滑劑、惰性稀釋劑、表面活性劑或分散劑混合。模壓錠劑可通過在合適的機器中模壓粉末狀化合物的混合物與惰性液體稀釋劑潤濕而製成。

除了前述載體成分，以上所述之藥學製劑適當時可包括一或多個額外載劑成分，諸如稀釋劑、緩衝劑、調味劑、黏合劑、表面活性劑、增稠劑、潤滑劑、防腐劑（包括抗氧化劑）等。再者，其他佐劑可被包括以使該製劑與意欲接收者的血液為等滲的。包含前胰島素原之一或多個胜肽片段及可擇地一或多個額外治療劑的組成物亦可被製備呈粉末或液體濃縮物之形式。

在一些實施例中，用於前胰島素原之一或多個胜肽片段及一或多個額外治療劑的單元劑量被共同調劑（co-formulated）。在這些實施例中，用於前胰島素原之一或多個胜肽片段的單元劑量形式及用於一或多個額外治療劑之單元劑量形式可被共同調劑用於口服投予、吸入、局部投予，及／或腸內投予。

在其他實施例中，用於前胰島素原之一或多個胜肽片段之單元劑量形式及用於一或多個額外治療劑之單元劑量形式被分開調劑。在這些實施例中，用於前胰島素原之一或多個胜肽片段之單元劑量形式可針對口服投予被調劑且用於一或多個額外治療劑之單元劑量形式可針對腸內投予被調劑。或者，用於前胰島素原之一或多個胜肽片段之單元劑量形式可針對腸內投予被調劑，而用於一或多個額外治療劑之單位劑量形式可針對口服投予而調劑。或者是，用於前胰島素原之一或多個胜肽片段之單元劑量形式可針對局部投予而調劑而用於一或多個額外治療劑之單元劑量形式可針對腸內投予而調劑。或者是，用於前胰島素原之一或多個胜肽片段之單元劑量形式可針對腸內投予而調劑而用於一或多個額外治療劑之單元劑量形式可針對局部投予而調劑。或者是，用於前胰島素原之一或多個胜肽片段之單元劑量形式可針對口服投予而調劑而用於一或多個額外治療劑之單元劑量形式可針對吸入而調劑。或者是，用於前胰島素原之一或多個胜肽片段之單元劑量形式可針對吸入而調劑，而用於一或多個額外治療劑之單元劑量形式可針對口服投予而調劑。或者是，用於前胰島素原之一或多個胜肽片段之單元劑量形式可針對局部投予而調劑，而用於一或多個額外治療劑之單元劑量形式可針對吸入而調劑。或者是，用於前胰島素原之一或多個胜肽片段之單元劑量形式可針對吸入而調劑，而用於一或多個額外治療劑之單元劑量形式可針對局部投予而調劑。

在一些實施例中，此處所述之藥學組成物可被調配以在投予後立即或是使用經控制或緩釋配方而在投予後任何預定時間期間內釋放具有一或多個額外治療劑之一或多個前胰島素原之一或多個胜肽片段。當組成物，無論是單獨或組合，具有(i)窄治療指數（例如，導致有害副作用或毒性反應的血漿濃度與導致治療效果的血漿濃度很小；通常，治療指數Tl定義為中位致死劑量（LD50）與中位有效劑量（ED50）的比值）； (ii) 釋放地點的吸收窗口狹窄； (iii) 生物半衰期短，因此需要在一天中頻繁投予以維持治療等級時，被控制或呈延長釋放製劑之藥學組成物的投予是有用的。

可以採用許多策略來獲得控制或延長釋放，其中釋放速率超過（outweighs）藥物組成物的代謝速率。例如，控制釋放可以通過適當選擇製劑參數及成分來獲得，包括，例如，合適的控制釋放組成物和披覆物（coatings）。合適的製劑是本領域具有通常知識者已知的。實例包括單或多單元錠劑或膠囊組成物、油溶液、懸浮液、乳劑、微膠囊、微球、奈米顆粒、貼劑（patches）及脂質體。

該藥學組成物可藉由傳統滅菌技術而滅菌，或可被無菌地過濾。得到的水溶液可以按原樣包裝（packaged for use as is）使用或凍乾（lyophilized）。該凍乾製劑可呈粉末形式被投予或在投予前與一滅菌水性載體混合。該等製劑之pH通常為介於3及11之間，較佳介於5及9或6及8之間，且最佳地介於7及8之間，諸如7至7.5之間。呈固體形式之所得之藥學組成物可，舉例而言，被包裝於多個單一劑量單元，各自包含固定量之前胰島素原之一或多個胜肽片段，及可擇地一或多個額外治療劑，諸如於錠劑或膠囊之密封包裝中，或以能夠以一或多個劑量投予之合適地乾燥粉末吸入劑（dry powder inhaler，DPI）。

該等藥學組成物可使用本技術領域中已知之標準方法，藉由混合具有所欲等級之純度的活性成分（例如，前胰島素原之一或多個胜肽片段及可擇地一或多個額外治療劑）與可擇地藥學可接受載體、賦形劑或穩定劑（Remington's Pharmaceutical Sciences (20th edition), ed. A. Gennaro, 2000, Lippincott, Williams & Wilkins, Philadelphia, PA）而製備。可接受之載劑，包括鹽水或諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽及其他有機酸之緩衝劑；包括抗壞血酸之抗氧化劑；低分子量（低於10個殘基）之多肽；蛋白質，諸如血清白蛋白（serum albumin）、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物如聚乙烯吡咯烷酮，胺基酸如甘胺酸、麩醯胺酸、天門冬醯胺酸、精胺酸或離胺酸；單醣、二糖及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，例如 EDTA；糖醇，例如甘露醇或山梨糖醇；成鹽的反離子（counterions），例如鈉；及／或非離子表面活性劑，例如 TWEEN™、PLURONICS™ 或 PEG。

可擇地，但較佳的，該調配物（formulation）包含藥學可接受之鹽類，較佳為氯化鈉，且較佳為約生理濃度之濃度。可擇地，本揭露內容之該調配物可包含藥學可接受之防腐劑。在一些實施例中，該防腐劑濃度為介於0.1至2.0%，通常為v/v之範圍內。合適的防腐劑包括藥學領域中已知者。芐醇、苯酚、間甲酚、對羥基苯甲酸甲酯及對羥基苯甲酸丙酯是較佳的防腐劑。可擇地，本揭露內容的調配物可以包括濃度為0.005至0.02%的藥學可接受之表面活性劑。

此處亦提供用於治療T1DM自體免疫之套組，其包括(i)根據本發明之治療有效量之組成物；以及(ii)用於將該組成物投予於有需要之個體的指示。

另外，此處所提供者為用於診斷及治療T1DM自體免疫之套組，其包括：(i)一T1DM自體免疫診斷（例如，自體抗體測試－抗胰島素IAA、抗GAD65、抗IA2－胰島素瘤抗原2、抗Zn8-zink轉運蛋白8抗體、T細胞生物標記等）；(ii)以上所述之一治療有效量之組成物；及(iii)用於診斷一個體，且若該個體有需要的話，將該組成物投予有需要之個體的指示。

製造方法

此處亦提供製造根據本發明之用以治療T1DM之組成物的方法。本發明技術領域中具有通常知識者將理解該等多肽片段可使用已知多肽合成方法論而合成。一個顯示實例提供於以下實例1中。在包含前胰島素原胜肽片段之特定選擇的各種實施例中，如此處及其他處所述，如本發明技術領域中具有通常知識者能夠理解的，被選擇之該等獨立胜肽片段可在任何合適的製造過程之階段被組合。舉例而言，可以在摻入藥學調配物之前將單獨的胜肽片段組合，或者可以將已經部分或完全摻入藥學組成物的胜肽片段的單獨組成物以適當的量組合（例如，混合）以形成新的最終藥學組成物，該組成物包含所選擇的胜肽片段。

使用方法

此處進一步提供用以治療有需要之個體中T1DM的方法，其中投予包含一或多個前胰島素原胜肽片段至該個體產生或擴展自身抗原特異性（例如，前胰島素原特異性）CD4+調節T（Treg）細胞。這些細胞具有「容納（home）」胰腺β細胞的能力，在該處其等釋放調節細胞激素並進行其他細胞對細胞之調節功能。因此，此處所述之方法及組成物可用於預防T1DM的發展或進展，或預防或延緩殘留β細胞團（cell mass）的損失，提供更長的緩解期（remission period）並延緩或預防通常進展的T1DM相關併發症在生命的後期的發作。另外，此處所述之方法可被用於預測一個體，例如具有正在進行之抗胰島素自體免疫，是否及／或何時將進展成T1DM，以評估個體對治療干預的反應或決定個體是否應該接收自體抗原調配物（即，包含一或多個前胰島素原胜肽片段）之加強投予（booster administration）或細胞療法的投予，如此處及其他處所述者。

因此，此處所述的方法包括向個體投予（例如，通過靜脈內、肌肉內或皮下途徑）包含此處所述的一或多個前胰島素原胜肽片段的組成物，其量足以產生包括活化、生成及／或擴展對該自身抗原特異的Treg細胞的反應。如此處所使用的，自身抗原特異性Treg細胞可指前胰島素原特異性Treg細胞，即，對前胰島素原的一或多個胜肽片段及／或由此表現出的一或多個胜肽特異的Treg細胞。在一些實施例中，一旦Treg細胞被刺激，該等方法進一步包含自該個體採集Treg細胞（即，包含字體抗原特異性Treg細胞的Treg細胞群體）、體外擴增該等細胞，並將該等細胞再次投予至該個體。本發明之組成物（即，包含前胰島素原之一或多個胜肽片段）的投予即／或該自體抗原特異性Treg細胞對個體之投予可消除對胰腺β細胞的自體免疫及／或在個體中產生致耐受反應。

在一些情形中，該方法進一步包含監控Treg細胞隨時間之等級及／或功能。在某些實施例中，如此處及其他處所述，Treg細胞之等級及／或功能在投予本發明之組成物（即，包含前胰島素原之一或多個胜肽片段之組成物）後及／或細胞療法之投予至個體的3小時、6小時、12小時、18小時、1日、2日、3日、4日、5日、6日、1週、2週、3週、4週、1個月、2個月、3個月、4個月、5個月、6個月、7個月、8個月、9個月、10個月、11個月、1年、2年、3年、4年、5年、6年、7年、8年、9年、10年或更久量測。在某些情形中，Treg細胞之等級及／或功能被每日、每月或每年量測。在一些實施例中，該等方法進一步包含投予（例如，藉由腸內、肌內或皮下途徑）一或多個（例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多）劑量，即，該組成物及／或細胞療法的加強劑量以維持自體抗原特異Treg細胞之等級及／或功能。在一些實施例中，該方法進一步包含在投予該組成物及／或細胞療法後，決定自體抗原特異Treg細胞之等級及／或功能，如此處及其他處所述者，並隨時間監控該等級及／或功能以決定何時投予該組成物及／或細胞療法的加強劑量，例如，在Treg等級開始下滑時。在一些實施例中，加強劑量可在大約1週、2週、3週、4週、1個月、2個月、3個月、4個月、5個月、6個月、7個月、8個月、9個月、10個月、11個月、1年、2年、3年、4年、5年，或6年的間隔下被投予。舉例而言，加強劑量可在約6個月至2年的重複間隔下被投予。在某些實施例中，該間隔可為每週、每月、每季、半年、或一年。對於該組成物之加強劑量的投予，該組成物可基於一獨立個體及／或個體之選擇群體而建構（即，由表1中所述之胜肽1、胜肽2、胜肽3、胜肽4、胜肽5、胜肽6、胜肽7、胜肽8、胜肽9及胜肽10的一或多者（例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或所有））。該組成物之加強劑量中該胜肽之選擇（即，由表1中所述之胜肽1、胜肽2、胜肽3、胜肽4、胜肽5、胜肽6、胜肽7、胜肽8、胜肽9及胜肽10的一或多者（例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或所有））可基於一個體特異概廓，使得該加強劑量對個體或群體為個人化的。該選擇可基於，例如，對與T1DM相關之一或多個基因之個體的基因型（例如，與對前胰島素原之個體抗原特異自體免疫反應）及／或基於個體對一或多個特定胜肽之免疫反應（如刺激測定所量測者）。

在一些實施例中，誘發之Treg細胞為CD4+。在一些實施例中，Treg細胞亦為CD25高、FoxP3+、CD127低，及／或GITR+。該等Treg細胞可分泌IL-10或TGF-β兩者，回應於前胰島素原胜肽片段之刺激。在某些情形中，該自體抗原特異Treg細胞為CD4+、CD25高、CR45RO+，及Foxp3+細胞。在特定情形中，該等抗原特異Treg細胞為CD4+、CD25高、CR45RO+、Foxp3+、CD127低及GITR+細胞。在這些情形的一些中，Treg細胞之等級藉由使用本技術領域中熟知的方法，例如，就由流式細胞術、免疫螢光染色法等，量測CD4+、CD25高、CR45RO+、Foxp3+、CD127低、GITR+細胞之等級而監控。在某些情形中，Treg細胞的功能藉由量測由個體中Treg細胞所誘發的致耐受反應而監控。致耐受反應可藉由使用本技術領域中熟知的方法，例如，藉由流式細胞術、免疫螢光染色、ELISA、即時定量聚合酶鏈反應（real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）等量測。

在一些實施例中，所欲等級之抗原特異Treg細胞為足以抑制細胞毒性T細胞功能的量。在一些實施例中，所欲等級之抗原特異Treg細胞為足以於個體中生成致耐受反應的量。該致耐受反應可包括Treg細胞（例如，CD4+、CD25高、CR45RO+、Foxp3+細胞，諸如CD4+、CD25高、CR45RO+、Foxp3+、CD127低、CITR+細胞）之增加的表現。在某些情形中，該致耐受反應包括對前胰島素原之一或多個胜肽片段有特異性的CD4+、CD25高、CR45RO+、Foxp3+Treg細胞的增加之表現。在特定情形中，該致耐受反應包括對前胰島素原之一或多個胜肽片段有特異性的CD4+、CD25高、CR45RO+、Foxp3+、CD127低、GITR+Treg細胞的增加之表現。額外且替代地，該致耐受反應可包含一或多個抗發炎細胞激素地增加之表現。在某些情形中，該等抗發炎細胞激素包含下列之一或多者：介白素（interleukin，IL）-1受體拮抗劑、IL-4、IL-6、IL-10、IL-11、IL-13，及轉化生長因子-β（TGF-β）。額外且替代地，該致耐受反應可包含一或多個免疫調節介質的增加之表現。在某些情形中，該免疫調節介質包含程序性死亡配體（programmed death ligand，PDL）-1/-2、細胞毒性T-白血球關聯蛋白4（cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4，CTLA-4），及類免疫球蛋白轉錄本（immunoglobulin-like transcript，ILT）-3/4。額外或替代地，該致耐受反應可包含一或多個死亡受體，諸如一或多個Fas、腫瘤壞死因子α受體（tumor necrosis factor alpha receptor，TNFαR）、DR3、DR4及DR5的增加之表現。額外或替代地，該致耐受反應可包含吲哚胺2,3-雙加氧酶（indoleamine 2,3-dioxygenase，IDO）及／或血紅素加氧酶1（heme oxygenase-1，HO-1）的增加之表現。額外或替代地，該致耐受反應可包含一或多個促發炎細胞激素的降低之表現。在某些情形中，該促發炎細胞激素包含IL-1、IL-12、IL-18、腫瘤壞死因子α（TNF-α）、干擾素γ（IFNγ），及顆粒球-巨噬細胞群落刺激因子（granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GM-CSF）。

在一些實施例中，本發明之方法進一步包含敘述於Orban之美國專利申請案公開第2019/0137483中的方法，公開於2019年5月9日，其在此處以其整體被併入作為參考。這些方法可被用於預測：個體，例如，具有進行中抗胰島素自體免疫之個體，是否及／或何時將進展至T1DM；用以評估個體對以上所述之治療干預（例如，以包含一或多個前胰島素原胜肽片段之組成物進行的治療干預，或包含細胞療法之治療干預，如此處及其他處所述者）的反應；及／或用以決定個體是否應該接收該自體抗原調配物（即，包含一或多個前胰島素原胜肽片段之組成物）的加強投予或細胞療法之投予，如此處及其他處所述。因此，在一些實施例中，本發明之方法進一步包含評估T1DM 自身胰島素產量下降的標誌物。

在某些實施例中，此處所述之方法進一步包含量測中央記憶T細胞亞群等級及／或量測CD4初始T細胞對中央記憶（CD45RO+CD62L+）T細胞亞群的比例，為了以下目的：診斷T1DM、診斷前-T1DM（pre-T1DM，例如臨床前T1DM）、診斷對T1DM的易感性，或評估此處以上所述之治療干預的有效性（例如，以包含一或多個前胰島素原胜肽片段之組成物進行的治療干預，或包含一細胞療法之治療干預，如此處及其他處所述者）。在特定實施例中，中央記憶T細胞可被界定為CD45RO+CD62L+T細胞及／或CD4初始細胞可被界定為CD4+CD45RO−CD62L+ T細胞。

舉例而言，用於診斷T1DM、診斷前T1DM，或診斷對T1DM之易感性的方法可包含下列步驟：選擇具有或被懷疑具有T1DM，或對T1DM易感的個體；自該個體提取一生物樣品（例如，血液、血清、尿液、組織、細胞等）；可擇地藉由免疫螢光分析（例如，藉由流式細胞術、免疫組織化學染色法等）決定樣品之CD4初始（CD45RO−CD62L+）T細胞之等級；藉由免疫螢光分析（例如，藉由流式細胞術、免疫組織化學染色法等）決定該樣品之CD4中央記憶（CD45RO−CD62L+）T細胞之等級；及量測CD4初始（CD45RO−CD62L+）T細胞對中央記憶（CD45RO+CD62L+）T細胞亞群的比例，及／或樣品中CD4中央記憶T細胞之等級，其中CD4初始T細胞對CD4中央記憶T細胞的低／降低之比例，或CD4中央記憶T細胞的高／增加之等級將指出T1DM、前T1DM，或對T1DM的易感性。被決定（例如，藉由前述方法）具有T1DM、前T1DM、對T1DM有易感性的個體可被選擇用以以以上所述之治療干預（例如，以包含一或多個前胰島素原胜肽片段之組成物進行治療干預，及／或包含細胞療法之治療干預，如此處及其他處所述者）治療。或者是，在上述方法中CD4初始T細胞對CD4中央記憶T細胞之高／增加之比例，或CD4中央記憶T細胞之低／降低之比例將指示該個體不具有T1DM、前T1DM，或對T1DM之易感性。在這些情形中，這樣的個體將被決定不需要此處所術之治療干預，至少在該時點下。可以根據需要定期重新評估該主題。

額外或替代地，用於決定此處所述之治療干預（例如，以包含一或多個前胰島素原胜肽片段之組成物進行的治療干預，或包含一細胞療法之治療干預，如此處及其他處所述者）之有效性方法可包括下列步驟：在個體中起始該治療（例如，藉由投予包含一或多個前胰島素原胜肽片段之組成物，或投予一細胞療法，如此處及其他處所述者）；自該個體提取一生物樣品（例如，血液、血清、血漿、尿液、組織、細胞等）；可擇地藉由免疫螢光分析（例如，藉由流式細胞術、免疫組織化學染色法等）決定樣品之CD4初始（CD45RO−CD62L+）T細胞的等級；藉由免疫螢光分析（例如，藉由流式細胞術、免疫組織化學染色法等）決定樣品之CD4中央記憶（CD45RO+CD62L+）T細胞之等級；及量測樣品中CD4初始（CD45RO−CD62L+）T細胞對中央記憶（CD45RO+CD62L+）T細胞亞群之比例，其中在治療期間，CD4初始T細胞對中央記憶T細胞亞群之高／增加之比例，及／或CD4中央記憶T細胞等級之低／降低之等級指示該治療的有效性。再者，在治療期間CD4初始T細胞對中央記憶T細胞亞群之高／增加之比例，及／或CD中央記憶T細胞之低／降低之等級亦可指出該個體不是立即需要該自體抗原調配物（即，包含一或多個前胰島素原胜肽片段之組成物）的加強劑量，及／或細胞治療的加強劑量，如此處及其他處所述者。或是，治療期間的CD初始T細胞對中央記憶T細胞亞群的低／降低之比例，及／或CD4中央記憶T細胞之高／增加之等及指出該治療的無效性及／或指出該治療的效果降低或衰退。再者，治療期間CD4初始T細胞對中央記憶T細胞亞群的低／降低之比例，及／或CD4中央記憶T細胞之高／增加之等級亦可指出該個體將需要該自體抗原調配物（即，包含一或多個前胰島素原胜肽片段之組成物）之一或多個加強劑量，及／或一細胞療法之一或多個加強劑量的劑量，如此處及其他處所述者。在這些情形的一些中，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多的加強劑量可被投予（例如，藉由腸內、肌內或皮下途徑）。在某些情形中，加強劑量可在大約1週、2週、3週、4週、1個月、2個月、3個月、4個月、5個月、6個月、7個月、8個月、9個月、10個月、11個月、1年、2年、3年、4年、5年，或6年的間隔下投予。舉例而言，加強劑量可以約6個月至2年的間隔重複投予。在某些實施例中，該間隔可為每週、每月、每季、半年或一年。

額外或替代地，用以決定此處所述之治療干預（例如，以包含一或多個前胰島素原胜肽片段進行之治療干預，或包含一細胞療法之治療干預，如此處及其他處所述者）之有效性的方法可包括下列步驟：在個體中起始該治療（例如，藉由投予包含一或多個前胰島素原胜肽片段之組成物，或投予一細胞療法，如此處及其他處所述者）；自該個體提取一生物樣品（例如，血液、血清、血漿、尿液、組織、細胞等）；以及使用該樣品決定個體之胰腺β細胞功能（例如，藉由C胜肽測試，諸如平均C胜肽血漿濃度（C-peptide plasma concentration，CPAVE）測試），其中治療期間穩定的胰腺β細胞功能指出該治療的有效性。再者，治療期間穩定的胰腺β細胞功能亦可指出該個體不是立即需要該自體抗原調配物（即，包含一或多個前胰島素原胜肽片段之組成物）的加強劑量，及／或細胞治療的加強劑量，如此處及其他處所述者。或者是，治療期間胰腺β細胞功能的降低可指出治療的無效性及／或可指出該治療的效果降低或衰減。再者，治療期間胰腺β細胞功能的降低亦可指出該個體將需要該自體抗原調配物（即，包含一或多個前胰島素原胜肽片段之組成物）的加強劑量及／或細胞治療的加強劑量，如此處及其他處所述者。在這些情形的一些中，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多的加強劑量可被投予（例如，藉由腸內、肌內或皮下途徑）。在某些情形中，加強劑量可在大約1週、2週、3週、4週、1個月、2個月、3個月、4個月、5個月、6個月、7個月、8個月、9個月、10個月、11個月、1年、2年、3年、4年、5年，或6年的間隔下投予。舉例而言，加強劑量可以約6個月至2年的間隔重複投予。在某些實施例中，該間隔可為每週、每月、每季、半年或一年。

為了決定由此處以上所述之方法進行治療干預（例如，以包含一或多個前胰島素原胜肽片段進行之治療干預，或包含一細胞療法之治療干預，如此處及其他處所述者）的有效性，可自個體提取樣品，例如，在治療起始前（或在治療起始後但在細胞群體之改變發生前）自個體提取樣品；及／或在治療進行大約3小時、6小時、12小時、18小時、1日、2日、3日、4日、5日、6日、1週、2週、3週、4週、1個月、2個月、3個月、4個月、5個月、6個月、7個月、8個月、9個月、10個月、11個月、1年、2年、3年、4年、5年、6年、7年、8年、9年、10年或更多下進行。

治療干預的有效性可藉由前述方法，在投予該治療（即，投予本發明之組成物及／或投予細胞療法，如此處及其他處所述）至個體後3小時、6小時、12小時、18小時、1日、2日、3日、4日、5日、6日、1週、2週、3週、4週、1個月、2個月、3個月、4個月、5個月、6個月、7個月、8個月、9個月、10個月、11個月、1年、2年、3年、4年、5年、6年、7年、8年、9年、10年或更多決定。在一些情形中，該治療的有效性是藉由前述方法每日、每週、每月或每年量測。 細胞療法方法

此處所述者為可被用於治療、延緩或預防個體中T1DM之發展或進程的細胞療法方法。如此處所使用的，細胞療法方法可包含藉由投予該個體前胰島素原特異性Treg細胞之群體而治療個體中的T1DM的方法。這些前胰島素原特異性Treg細胞可藉由下列被誘發、生成及／或擴增：以足以產生包含對前胰島素原之胜肽片段或對由其表現之一或多個表行有特異性之Treg細胞的活化、生成及／或擴增的量，投予（例如，腸內、肌內或皮下途徑）包含前胰島素原之一或多個胜肽片段之組成物至個體；自該個體採集Treg細胞之群體，其中Treg細胞之群體包含對前胰島素原之一或多個胜肽片段或對由其表現之一或多個瞟型有特異性的Treg細胞；及體外（ in vitro）或離體（ ex vivo）擴增Treg細胞的群體，其中Treg細胞之群體包含對前胰島素原之一或多個胜肽片段或對由其表現之一或多個瞟型有特異性的Treg細胞。在某些實施例中，該擴增包含進一步將Treg細胞之群體在體外暴露於一或多個胜肽片段。為了本發明的目的，Treg細胞可離體被擴增，使用組合之T細胞受體（TCR）／CD3刺激與CD28，在外源添加重組人類IL-2（rhIL-2）及／或重組人類IL-15（rhIL-15）的存在下，如，例如Peters et al., PloS one3, e2233 (2008)中所述者。在某些情形中，對於離體擴增，Treg細胞的群體（例如，包含對前胰島素原之一或多個胜肽片段或尤其表現之一或多個表型有特異性的Treg細胞之Treg細胞之群體）可自個體採集，且在rhIL-2及／或rhIL-15存在下以抗CD3+抗-CD28微珠刺激。舉例而言，對於離體擴增，Treg細胞之群體可自個體採集，並在rhIL-2及／或rhIL-15存在下以與抗CD-3、抗CD-28及抗CD-137抗原共軛之DYNABEADS ^®（THERMOFISHER SCIENTIFIC）刺激。對於療法或治療目的，這些經擴增之Treg細胞的群體（例如，包含前胰島素原特異性Treg細胞者）可在需要時被再次導入至個體。舉例而言，需要的話，剛剛經擴增之Treg細胞群體（例如，包含前胰島素原特異性Treg細胞者）可被再次導入至個體中。或者是，經擴增之Treg細胞群體（例如，包含前胰島素原特異性Treg細胞者）可被儲存（例如，於液態氮中）供未來使用，且在需要時被再次導入個體中。

如此處以上所使用的，前胰島素原特異性Treg細胞是指對前胰島素原之一或多個胜肽片段或對由其所表現之一或多個表型有特異性的Treg細胞。在某些實施例中，經刺激的Treg細胞可自個體分離，在體外擴增，並再次導入（例如，藉由腸內、肌內，或皮下途徑）至相同或不同的個體。這些Treg細胞可自然存在於個體中（例如，自已存在之群體擴增），但其等亦可藉由投予自體抗原（例如，前胰島素原），諸如投予包含前胰島素原之一或多個胜肽片段的組成務至該個體而被刺激或生成。該方法進一步包含監控經誘發之前胰島素原特異性Treg細胞在個體中的等級（及，可擇地，功能），並將該組成物及／或本發明之經擴增之前胰島素原特異性Treg細胞的群體做為加強劑於適當的時間再次投予，以進一步誘發前胰島素原特異性Treg細胞並維持這些經誘發之T細胞的等級及功能，藉此影響T1DM的進程。

若該Treg細胞自個體分離，並再次導入至相同個體（即自體移植），不需要免疫抑制。若該等細胞被導入不同個體（即異體移植），可建議進行免疫抑制，而供體及受體之間良好的HLA匹配為較佳的。若該HLA是實質上匹配的，該免疫系統較不容易有負面反應。HLA蛋白質的匹配越高，被移植之器官越不容易由受體排斥。

一個獨立個體具有A、B、Cw、DQ及DR等位基因（aleeles）各者的兩個，其中A、B、Cw、DQ及DR的一組（一「單倍型（haplotype）」）是承襲於各母體。獨立個體可對於A、B、Cw、DQ及DR單倍型為同基因型組合（homozygous）或異基因型組合（heterozygous）。供體細胞被考量為HLA對意欲受體為「匹配」或「組織相容的（histocompatible）」，條件在於該等供體細胞不表現對該受體為外來的HLA產物。舉例而言，對於HLA-A1、-Cw7、-B8或HLA-A29、-Cw7、-B8之單倍型為同基因型組合的一供體細胞將與具有與HLA-A1、-Cw7、-B8及HLA-A29、-Cw7、-B8之單倍型兩者有異基因型組合的HLA概廓的受體相互匹配。請見Hui et al; Handbook of HLA Typing Techniques, p. 194 (CRC Press, 1993)，其等在此處以其整體被併入作為參考。

此處所述的轉移方法可包括分離此處所述之前胰島素原特異性Treg細胞，及將該等細胞轉移至個體中的步驟，如此一來哺乳類（例如，人類，諸如一T1DM患者）。轉移可涉及，例如，藉由將一細胞懸浮液注射至該個體中、手術移植細胞團至個體之組織或器官中，或用細胞懸液灌注組織或器官（例如胰腺）而將該等細胞轉移至個體中。轉移細胞或移植的途徑將取決於細胞駐留在特定組織或器官中的需要以及細胞找到所需靶組織（target tissue）或器官並被其保留的能力。在移植細胞位於特定位置的情況下，可通過手術將其放入組織或器官中，或者如果細胞具有遷移到所需目標器官的能力，則可以簡單地注入血流中。

在一些實施例中，此處所述之Treg細胞被轉移至仍然保有一些功能性β細胞的個體中。舉例而言，該等細胞可自新診斷之患者分離。

在一些實施例中，此處所述之Treg細胞做為胰島移植程序的一部分進行移植，以預防或延緩被移植之細胞的自體免疫破壞之發生或再次發生。用於進行這些程序的方法為本技術領域中已知者，例如，埃德蒙頓協議（Edmonton Protocol）。請見，例如，Ryan et al., Diabetes 50:710-719 (2001)；Shapiro et al., N. Eng. J. Med. 355:1318-1330 (2006)，其等各自以其整體被併入此處作為參考。

決定適當劑量之Treg細胞通常由臨床醫生，例如，使用本技術領域中已知的參數或因素進行，以影響治療或預測能影響治療。一般而言，劑量起始於比最佳劑量少的量，且在此之後被以小幅度增加直到相對於任何負面副作用達到所欲或最佳的效果。舉例而言，包含至少約10 ⁴、10 ⁵、10 ⁶、10 ⁷、10 ⁸、10 ⁹、10 ¹⁰或更多純化及擴增之此處所述之Treg細胞的細胞群體可被投予，例如於一或多個劑量中投予。

因此，此處所述之方法包含分離如此處所述之一或多個前胰島素原特異性Treg細胞、可擇地培養該（等）細胞以將其等依需求擴增以獲得前胰島素原特異性Treg細胞的群體，以及將經擴增之細胞轉移至個體，諸如哺乳類（例如，人類，諸如患者）中的步驟。 個體

在一些實施例中，本發明提供用以治療T1DM自體免疫的方法，包括(i)選擇需要對於T1DM治療的個體；及(ii)投予治療有效量之此處所述之組成物至該個體。有需要治療之患者的選擇可包括由醫師及／或實驗室檢測進行的體檢。

以上所述的個體可為哺乳類個體，諸如人類。在某些情形中，該個體為人類患者，諸如具有T1DM的患者或存在於發展T1DM的風險之個體。在一個實施例中，該個體為人類成人。在另一實施例中，該個體為人類青少年。

在一些情形中，該個體具有T1DM且該治療達到至少一臨床終點（例如，改良之C胜肽分泌、降低胰島素使用、改良之HbAlc、較接近正常血糖等級、較少血糖等級變動等）。額外或替代地，該個體可具有T1DM且該治療可緩解T1DM的至少一症狀（例如，低血糖／高血糖的頻率、降低糖尿、住院次數／等級以及腎病、神經病變及視網膜病變等併發症的等級／次數）。

在一些實施例中，該個體具有臨床前T1DM且該治療預防或延緩到臨床T1DM的進程。舉例而言，本發明之組成物及方法可延緩臨床前T1DM的進程約1個月、2個月、3個月、4個月、5個月、6個月、7個月、8個月、9個月、10個月、11個月、1年、2年、3年、4年、5年、6年、7年、8年、9年、10年或更久。

在一些實施例中，該個體是易患（predisposed to developing）T1DM，且該治療預防或延緩 T1DM 的發展。舉例而言，本發明之組成物及方法可延緩T1DM的進程約1個月、2個月、3個月、4個月、5個月、6個月、7個月、8個月、9個月、10個月、11個月、1年、2年、3年、4年、5年、6年、7年、8年、9年、10年或更久。

被選擇進行以本發明之方法治療的人類患者可被分類成下列群組：

(a) 新診斷有 T1DM 的患者

此群組中的患者通常在診斷時具有大約20%殘餘的β細胞功能（Staeva-Vieira et al., Clin. and Exp. Immunol.,148:17-31 (2007),）且包含最有可能顯示對本發明之組成物及方法有快速益處的方法。在美國，發病率為每年30,000至35,000新T1DM患者。由於以該組成物進行之治療預期為畢生的（life-ling），這個群集的患者因此將在美國以每年至少30,000擴增，還不包括T1DM發病率之預計每年3%的增長率。

成人中該發病率/100,000之T1DM是與孩童及年青人（1-4歲=10.3；15-29歲=6.8；30-49歲=7.3）相似，且許多成人由於將T1DM誤解為僅發生於孩童的疾病而被誤診為第二型疾病（Mobak et al., Diabet Med,11: 650-655 (1994); Bruno et al., Diabetes Care,28 (11):2613-2619 (2005)），使用預測性自體抗體標記，英國一項前瞻性研究表明，30% 被診斷患有第2型糖尿病的年輕患者實際上可能有潛在的自身免疫組分，並且通常在3年內進程為胰島素依賴（Turner et al., Lancet350:1288-1293 (1997); Devendra et al., BMJ328:750-754 (2004)）。此與10% 的35歲以上被診斷患有表型第2型糖尿病的人實際上患有潛在的自身免疫性糖尿病的估計一致（Stenstrom et al., Diabetes 54:S68-S72 (2005); Leslie et al., Clinical Rev. 91:1654-1659 (2006)），其等全部都是此處所述之T1DM的候選者，與那些具有成人潛伏性自身免疫性糖尿病（latent autoimmune diabetes in adults，LADA）者不同。此群組被誤分類之患者及LADA患者亦可被預期由以此處所述之方法進行治療而獲得很大的益處，特別是由於其等的疾病進程較慢發展。由此處所述之方法誘發或活化之該前胰島素原特異Treg細胞，如同其他抗原特異Treg細胞，可影響其它藉由稱為「感染耐受度」及／或「旁觀者」效應影響其他抗原特異性的效應-自身攻擊性T細胞（effector-autoaggressive T cells），這在LADA患者的情況下可能特別有益。這些患者的正確診斷／鑑定可以通過本領域已知的方法來完成，例如通過根據AMA指南進行的血清自身抗體測定（可從Quest Diagnostics及ARUP實驗室取得）。

(b) 具有已確立 T1DM 的患者

2003年美國估計有180 萬（所有年齡組）T1DM患者（不包括 10% 被診斷患有第2型糖尿病但患有潛在LADA的患者）。儘管這些患者的胰島素產生不足且必須維持面對持續的抗β胰島細胞自身免疫反應，一些胰島素治療甚至診斷多年後仍具有可測量等級的β細胞。重要的是，這些患者保留了再生功能性β細胞活性的能力，並且已經提出干預（intervention）可以使β細胞補充，可能達到生理上有意義的等級（Staeva-Vieira et al., (2007), supra）。在活動性疾病狀態下，這種潛力不足以克服由於自身免疫反應而導致的β細胞持續損失；然而，控制對β細胞的自身免疫攻擊將允許胰腺β細胞再生並同時恢復具有臨床意義的胰島素產生。由於β細胞自身免疫破壞的潛在機制在疾病的所有階段都是相同的，因此患有T1DM的患者有可能受益於此處所述的治療方法誘導的自身免疫反應的下調。

另外，此處所述之方法可用於接收胰島β細胞移植的患者。如果存在針對β細胞的持續自身免疫反應，這種沒有免疫抑制的移植不太可能成功。此外，出於類似的原因，此處所述的方法在與胰島細胞再生療法一起使用時將是有益的，例如艾塞那肽（exanatide）的給藥。

(c) 具有發展 T1DM 之高度風險的個體

如果兒童的父母或兄弟姐妹中的任何一方患有該疾病，兒童患 T1DM 的平均風險為 6%，而普通人群的風險為 0.4%（Tillil and Kobberling, Diabetes,36:93-99 (1987)）。此代表2007 年美國估計有360,000名15歲以下的高風險人群，以及130萬美國所有年齡組的高風險人群。早期干預已被建議作為提高成功治療概率的策略（Staeva-Vieira et al., (2007), supra）。篩查（screening）高風險人群的胰島素 （IAA）、麩胺酸脫羧酶（GAD）及胰島素瘤相關抗原（IA-2A）之抗體提供了預測 T1DM 發展的可靠方法（Leslie et al., Diabetologia ,42:3-14 (1999); Bingley, Diabetes Care,24:398 (2001); Achenbach, Curr Diabetes Rep,5:98-103 (2005)），其可用於鑑定本發明的治療方法的候選者，以在顯著的β細胞破壞之前預防或潛在地逆轉自身免疫病理學。這些個體的鑑定可以使用本領域已知的方法來完成，例如通過根據AMA指南進行的血清自身抗體測定（例如，自Quest Diagnostics及Labs可得之測定）。

如此處所使用的，「T1DM」亦包括LADA（成人潛伏性自身免疫性糖尿病），且可使用此處所數之方法治療之個體亦包括患有LADA者。 實例

列實例被包括以顯示此處所揭示之發明的態樣。有鑑於本揭露內容及所屬技術領域中的通常等級之知識，所屬技術領域中具有通常知識者理解下列實例意欲僅為例示性的，且無數改變、修飾及替換可在不背離本揭露內容之範圍下使用。

實例1

多肽合成

重疊的前胰島素原20個胺基酸胜肽片段被設計成使得每個胜肽片段與前面的胜肽序列重疊10個胺基酸。這些胜肽被製成單組分HPLC（C18管柱）純化胜肽，在蛋白質核心實驗室中使用來自 Applied Biosystems的PROTEIN SYNTHESIZER MODEL 433A 合成，使用來自Peptide International的胺基酸製劑。這是一個標準的固相胜肽合成（standard solid-phase peptide synthesis，SPPS）程序，主要步驟如下：

鏈組裝（ Chain Assembly ）

蛋白質合成中使用的組裝策略是ABI(Applies Biosystem Inc.)-Fmoc/Thr。Fmoc基團保護胺基酸的α-胺基。胜肽從C端向N端組裝，起始胺基酸的α-羧基連接到固體支持物（樹脂）上。用於組裝的樹脂是聚苯乙烯珠，一種直徑為400-1000微米的不溶性載體，用NMP（N-甲基吡咯烷酮）洗滌後膨脹。樹脂預加載了 C 端的第一個胺基酸（Thr）。

鏈組裝的第一步是去保護或去除保護基團。使用22%哌啶去除Fmoc保護基。通過用哌啶／NMP去除Fmoc基團形成的胺基甲酸鹽的電導反饋可用於顯示偶合功效。

在去保護之後，下一個胺基酸被活化並與生長胜肽的去保護胺基末端偶合並形成胜肽鍵。使用HBTU/HOBt可達成活化傳入的胺基酸羧基。

在偶合之間，管柱用甲醇和NMP（N-甲基吡咯烷酮）洗滌，這會使樹脂溶脹並洗掉殘留物。重複該循環直到獲得所需長度的胜肽。

然後用DCM（dichloromethane，二氯甲烷）洗滌樹脂，從樹脂中除去NMP，然後用高揮發性甲醇徹底洗滌樹脂，這是一種容易除去的溶劑，並蒸發／乾燥。

樹脂上裂解及側鏈保護基團的去除

製備裂解混合物（0.75　g結晶苯酚+0.25　g乙二硫醇+0.5　ml硫代苯甲醚+0.5　ml去離子H ₂O+10　ml三氟乙酸）。將乾燥的胜肽-樹脂在冰浴（10 ml混合物/100-150 mg胜肽-樹脂）中的冷燒瓶中培養1.5小時。然後在高真空下通過玻璃漏斗過濾從反應混合物中分離胜肽。然後用冷的甲基叔丁基醚（methyl t-butyl ether ，MTBE）沉澱胜肽並真空乾燥。

無菌條件下純化

該步驟使用反相HPLC進行。緩衝液 A=0.1%三氟乙酸 （trifluoroaceticacid，TFA）及緩衝液B=70%乙腈、30% H ₂O、0.09%三氟乙酸（TFA）。通過使用C18管柱，樣品的流析基於疏水性（親水樣品較早流析）。通過在 214 nm 處測量胜肽鍵的吸光度進行峰檢測，並通過質譜法進行鑑定。將所需級分匯集在無菌小瓶中並凍乾，取樣品用於AAA（胺基酸分析）分析rpHPLC 及質譜分析以確認序列。

實例2

包含前胰島素原胜肽片段的組成物

A. 含有胰島素原胜肽片段的組成物是水溶性、20個胺基酸長、重疊的胰島素原胜肽片段及不完全弗氏佐劑溶液的組合。注射劑／乳液（最終藥物產品）在投予前立即在層流保護罩（lamina-flow protected hood）中製備，在無菌條件下，使用高壓無菌注射器作為人胰島素原肽混合溶液的50/50(w/w)乳液(0.5 m1)與Montanide ISA51(0.5 ml)(Seppic Inc.)混合。

B. 含有胰島素原胜肽片段的組成物是水溶性、20個胺基酸長、重疊的胰島素原肽片段及不完全弗氏佐劑溶液的組合。注射劑／乳劑（例如，最終藥物產品）是預先製備好的（例如，在製造環境中），並且可以延長保質期（例如，數年）。

C. 含有胰島素原肽片段的組成物是水溶性、20個胺基酸長、重疊的胰島素原肽片段及不完全弗氏佐劑溶液的組合。注射劑／乳劑（例如，最終藥物產品）以試劑盒形式製備；兩種主要成分（例如，胜肽片段及佐劑）在具有內件機構的不同密封隔間中，可在短時間內（例如，幾天／幾週）製備新鮮混合物。

D. 含有前胰島素原胜肽片段的組成物是水溶性、20個胺基酸長、重疊的前胰島素原胜肽片段及不完全弗氏佐劑溶液的組合，其中不完全弗氏佐劑溶液不是Montanide ISA51。

E.　含有前胰島素原胜肽片段的組成物是水溶性、20個胺基酸長、重疊的前胰島素原胜肽片段和除了不完全弗氏佐劑溶液之外的免疫佐劑（例如角鯊烯；滅活細菌及類毒素；鋁鹽-明礬／無機化合物等或脂質體、基於脂質的奈米顆粒、奈米乳液、奈米凝膠、樹枝狀聚合物等）。

實例3

以前胰島素原胜肽片段進行治療

A. 將根據本發明的組成物投予於已被診斷患有第1型糖尿病（T1DM）（例如，臨床診斷及至少一種陽性T1DM）的個體（例如，任何年齡及／或任何疾病持續時間）特異性自身抗體，例如IAA、GAD65、Ia2、Zn 轉運蛋白8或T1DM特異性T細胞標記物陽性）。

B. 將根據本發明的組成物投予於沒有T1DM臨床診斷但具有至少一種陽性T1DM特異性自身抗體（例如IAA、GAD65、Ia2、Zn轉運蛋白8）或T1DM特異性T細胞標記的個體。該個體可具有通過口服葡萄糖耐量試驗測試的正常葡萄糖狀態或受損的葡萄糖耐量。此類個體可以通過對T1DM患者的家庭篩查（family screening）或通過篩查更大的人群來識別。

在此使用的章節標題僅用於組織目的並且不應被解釋為以任何方式限制所描述的主題。

雖然結合各種實施例描述了申請人的教示內容，但並非意欲將申請人的教示限於這些實施例。相對地，如本發明所屬技術領域中具有通常知識者將理解的，申請人的教示包括各種替代、修改和等效範圍。 表3. 序列總表

SEQ ID NO	說明	序列 (NH2-COOH)
1	人類前胰島素原(NP_000198.1)	MALWMRLLPLLALLALWGPDPAAAFVNQHL CGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKTRREAED LQVGQVELGGGPGAGSLQPLALEGSLQKRG IVEQCCTSICSLYQLENYCN
2	胜肽1	MALWMRLLPLLALLALWGPD
3	胜肽2	LALLALWGPDPAAAFVNQHL
4	胜肽3	PAAAFVNQHLCGSHLVEALY
5	胜肽4	CGSHLVEALYLVCGERGFFY
6	胜肽5	LVCGERGFFYTPKTRREAED
7	胜肽6	TPKTRREAEDLQVGQVELGG
8	胜肽7	LQVGQVELGGGPGAGSLQPL
9	胜肽8	GPGAGSLQPLALEGSLQKRG
10	胜肽9	ALEGSLQKRGIVEQCCTSIC
11	胜肽10	IVEQCCTSICSLYQLENYCN
12	前胰島素原 – 訊號胜肽	MALWMRLLPLLALLALWGPDPAAA
13	前胰島素原– B鏈	FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKT
14	前胰島素原– C胜肽	EAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQPLALEGSLQ
15	前胰島素原– A鏈	GIVEQCCTSICSLYQLENYCN

(無)

(無)

（無）

Claims (59)

1. 一種包含治療有效量之前胰島素原之一或多個胜肽片段的組成物。
2. 如請求項1所述之組成物，其中該前胰島素原之一或多個胜肽片段跨越SEQ ID NO: 1之至少85%、90%、95%，或99%。
3. 如請求項2所述之組成物，其中該前胰島素原之一或多個胜肽片段跨越SEQ ID NO: 1之整個長度。
4. 如請求項3所述之組成物，其中該跨越長度是非間斷的（uninterrupted）。
5. 如請求項1至4之任一項所述之組成物，其中該前胰島素原之一或多個胜肽片段的各者為10至30個胺基酸之長度。
6. 如請求項5所述之組成物，其中該前胰島素原之一或多個胜肽片段的各者為20個胺基酸之長度。
7. 如請求項1至6之任一項所述之組成物，其中該前胰島素原之一或多個胜肽片段包含具有與SEQ ID NOs: 2-11之任一者的胺基酸序列至少85%之序列相等性的一胺基酸序列。
8. 如請求項7所述之組成物，其中該前胰島素原之一或多個胜肽片段包含SEQ ID NOs: 2-11之任一者的胺基酸序列。
9. 如請求項1至8之任一項所述之組成物，其中該前胰島素原之一或多個胜肽片段各包含一前胰島素原表位。
10. 如請求項9所述之組成物，其中該前胰島素原表位不存在於胰島素中。
11. 如請求項9或10所述之組成物，其中該前胰島素原表位在胰島素中非溶劑可及的（solvent accessible）但在前胰島素原中為溶劑可及的。
12. 如請求項1至11之任一項所述之組成物，其中該前胰島素原之一或多個胜肽片段不表現類胰島素代謝活性。
13. 如請求項1至12之任一項所述之組成物，其中該組成物包含2、3、4、5、6、7、8、9，或10個胜肽片段。
14. 如請求項13所述之組成物，其中各胜肽片段與該等胜肽片段之另一者重疊。
15. 如請求項14所述之組成物，其中各重疊之長度為介於5至20個胺基酸。
16. 如請求項15所述之組成物，其中各重疊之長度為10個胺基酸。
17. 如請求項13至16之任一項所述之組成物，其中各胜肽片段包含一相同長度，以及與一鄰近之胜肽片段相重疊的相同長度。
18. 如請求項1至17之任一項所述之組成物，進一步包含一明礬佐劑或其他藥學可接受載體。
19. 如請求項1至18之任一項所述之組成物，進一步包含促進調節免疫反應的佐劑。
20. 如請求項1至19之任一項所述之組成物，進一步包含包括一油類及一乳化劑之一佐劑。
21. 如請求項1至20之任一項所述之組成物，進一步包含一不完全費恩德佐劑（incomplete Freund's adjuvant，IFA）。
22. 如請求項1至21之任一項所述之組成物，其中該組成物為免疫調節者。
23. 如請求項1至22之任一項所述之組成物，其中該組成物為非免疫抑制性的。
24. 如請求項1至23之任一項所述之組成物，其中該組成物引發一Th2免疫反應。
25. 如請求項1至24之任一項所述之組成物，其中該組成物不引發一Th1免疫反應。
26. 一種用於治療有需要之一個體中第一型糖尿病（type 1 diabetes mellitus，T1DM）自體免疫的方法，該方法包含： (a) 以足以產生包含對該組成物中之該前胰島素原之一或多個胜肽片段具有特異性的調節T（Treg）細胞之生成及／或擴展的反應之量投予請求項1至25之任一項所述的組成物至該個體。
27. 如請求項26所述之方法，進一步包含： (b) 自該個體採集一Treg細胞之群體，其中該Treg細胞之群體包含對該前胰島素原之一或多個胜肽片段有特異性的Treg細胞； (c) 在體外擴增該Treg細胞之群體，其中該Treg細胞之群體包含對該前胰島素原之一或多個胜肽片段有特異性的Treg細胞；及/或 (d) 將經擴增之該Treg細胞之群體投予至該個體，其中該Treg細胞之群體包含對該前胰島素原之一或多個胜肽片段有特異性的Treg細胞。
28. 如請求項27所述之方法，其中步驟(c)中擴增該Treg細胞之群體包含在體外將細胞暴露於該前胰島素原之一或多個胜肽片段。
29. 如請求項26至28之任一項所述之方法，進一步包含下列步驟： (e) 自該個體提取一生物樣品； (f) 量測該生物樣品中之CD4初始T細胞（naïve T-cell）的等級及／或CD4中央記憶T細胞的等級； (g) 決定該生物樣品中CD4初始T細胞對中央記憶T細胞子群體（subpopulation）的比例；及 (h) 若CD4初始T細胞對中央記憶T細胞子群體的比例低，及／或CD4中央記憶T細胞的等級高，將來自步驟(a)之該組成物及／或來自步驟(d)之經擴增之該Treg細胞群體投予至該個體。
30. 如請求項29所述之方法，其中該CD4初始T細胞為CD45RO−CD62L+及／或該CD4中央記憶T細胞為CD45RO+CD62L+。
31. 如請求項29或30所述之方法，其中該CD4初始T細胞及／或CD4中央記憶T細胞之等級是藉由該生物樣品的免疫螢光分析法而決定。
32. 如請求項29至31之任一項所述之方法，其中該CD4初始T細胞之等級及／或CD4中央記憶T細胞之等級是在步驟(a)中投予該組成物後及／或在步驟(d)中投予經擴增之該Treg細胞之群體後一日、一週、一個月或一年量測。
33. 如請求項29至32之任一項所述之方法，其中該CD4初始T細胞之等級及／或CD4中央記憶T細胞之等級是每日、每週、每月或每年量測。
34. 如請求項26至33之任一項所述之方法，進一步包含下列步驟： (i) 自該個體提取一生物樣品； (j) 量測該生物樣品中之Treg細胞之等級及／或功能；及 (k) 若該生物樣品中之該Treg細胞之等級及／或功能低，將來自步驟(a)之該組成物及／或來自步驟(d)之經擴增之該Treg細胞之群體投予該個體。
35. 如請求項34所述之方法，其中該Treg細胞為CD4+、CD25高、CR45RO+、Foxp3+、CD127低，或GITR+細胞。
36. 如請求項34或35所述之方法，其中Treg細胞之功能是藉由量測由該個體中之該等Treg細胞所誘發之致耐受反應（tolerogenic response）而量測。
37. 如請求項36所述之方法，其中該致耐受反應包含：增加之一或多個抗發炎細胞激素的表現；增加之一或多個免疫調節介質（immunomodulatory mediators）的表現；增加之一或多個死亡受體的表現；增加之吲哚胺2,3-雙加氧酶（indoleamine 2,3-dioxygenase，IDO）及／或血紅素加氧酶1（heme oxygenase-1，HO-1）的表現；及／或降低之一或多個促炎細胞激素的表現。
38. 如請求項37所述之方法，其中該抗發炎細胞激素破解（compromises）下列之一或多者：介白素（interleukin，IL）-1受體拮抗劑、IL-4、IL-6、IL-10、IL-11、IL-13，及轉化生長因子-β（TGF-β）。
39. 如請求項37所述之方法，其中該免疫調節介質破解下列之一或多者：程序性死亡配體（programmed death ligand，PDL）-1/-2、細胞毒性T-白血球關聯蛋白4（cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4，CTLA-4），及類免疫球蛋白轉錄本（immunoglobulin-like transcript，ILT）-3/4。
40. 如請求項37所述之方法，其中該死亡受體包含下列之一或多者：Fas、腫瘤壞死因子α受體（tumor necrosis factor alpha receptor，TNFαR）、DR3、DR4及DR5。
41. 如請求項37所述之方法，其中該抗發炎細胞激素包含下列之一或多者：IL-1、IL-12、IL-18、腫瘤壞死因子α（TNF-α）、干擾素γ（IFNγ），及顆粒球-巨噬細胞群落刺激因子（granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GM-CSF）。
42. 如請求項34至41之任一項所述之方法，其中該Treg細胞之等級及／或功能是由該生物樣品之免疫螢光分析決定。
43. 如請求項34至42之任一項所述之方法，其中該Treg細胞之等級及／或功能是在步驟(a)中投予該組成物及／或在步驟(d)中投與經擴增之該Treg細胞之群體後一日、一週、一個月，或一年量測。
44. 如請求項34至43之任一項所述之方法，其中該Treg細胞之等級及／或功能是每日、每週、每月或每年量測。
45. 如請求項31或42所述之方法，其中該免疫螢光分析法包含流式細胞術。
46. 如請求項29至45之任一項所述之方法，其中該生物樣品為血液。
47. 如請求項26至46之任一項所述之方法，進一步包含投予至少一促調節白三烯素（proregulatory leukotriene）或細胞激素；及／或至少一抗發炎白三烯素或細胞激素。
48. 如請求項26至47之任一項所述之方法，進一步包含投予一或多個β細胞促進劑、抗發炎劑，及／或抗自體免疫劑。
49. 如請求項26至48之任一項所述之方法，其中該個體具有T1DM且該方法達到至少一臨床終點。
50. 如請求項26至49之任一項所述之方法，其中該個體具有T1DM且該方法緩解T1DM的至少一症狀。
51. 如請求項26至48之任一項所述之方法，其中該個體具有臨床前T1DM且該方法預防或延緩至臨床T1DM的進程。
52. 如請求項26至48之任一項所述之方法，其中該個體易患（predisposed to developing）T1DM且該方法預防或延緩T1DM的發展。
53. 如請求項26至52之任一項所述之方法，其中該方法緩解對胰腺β細胞的自體免疫。
54. 如請求項26至53之任一項所述之方法，其中該投予步驟包含靜脈內、肌肉內或皮下投予。
55. 如請求項26至54之任一項所述之方法，其中該個體為人類。
56. 如請求項55所述之方法，其中該個體為人類成人。
57. 如請求項55所述之方法，其中該個體為人類少年。
58. 一種用於治療第一型糖尿病（T1DM）自體免疫之套組，其包含： (a) 治療有效量的如請求項1至25之任一項所述的組成物；及 (b) 投予該組成物至有需求之個體的指示。
59. 一種用於診斷及治療第一型糖尿病（T1DM）自體免疫之套組，其包含： (a) 一T1DM自體免疫診斷；治療有效量的如請求項1至25之任一項所述的組成物；及 (b) 用以診斷一個體且若該個體有需求則投予該組成物至該個體的指示。