CN108778318A - 葡萄糖响应性胰岛素递送组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

本文公开了一种葡萄糖响应性胰岛素递送系统，所述胰岛素递送系统基于经葡萄糖修饰的胰岛素与红血球(或红细胞，RBC)上的葡萄糖转运蛋白(GLUT)之间的相互作用。在与葡萄糖缀合之后，胰岛素可以有效地结合到RBC膜。所述结合在高血糖症的情况下是可逆的，导致胰岛素的快速释放以及随后体内血糖(BG)水平的下降。在一些实施方案中，递送媒介物可以包括：1)可静脉内注射的聚合物纳米颗粒(直径为约100nm)，所述纳米颗粒涂布有RBC膜并装载有经葡萄糖修饰的胰岛素，和/或2)无痛微针(MN)贴剂，所述无痛微针贴剂装载有GLUT和经葡萄糖修饰的胰岛素的复合物。

Description

葡萄糖响应性胰岛素递送组合物和方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2016年1月14日提交的美国临时申请号62/278,614的权益，所述申请特此以引用的方式整体并入本文。
关于联邦政府赞助的研究或开发的声明
本发明在政府以美国国立卫生研究院授予的资助号1UL1TR001111支持下进行。政府享有本发明的某些权利。
背景
糖尿病目前影响全球4.15亿人口，并且预计到2040年这一数字将增加到6.42亿。胰岛素对于1型糖尿病的存活至关重要，并且通常也是治疗2型糖尿病所需的，以便控制血糖并预防并发症。然而，传统的外源性胰岛素施用无法与由朗格罕斯胰岛细胞内的β-细胞对血糖实现的精细调节相匹配，其中内源性胰岛素分泌通过新陈代谢与葡萄糖转运关联起来。较差的葡萄糖控制会导致高糖尿病并发症风险，诸如截肢、失明和肾衰竭。此外，低血糖可导致行为和认知障碍、癫痫、昏迷、脑损伤或死亡。因此，非常需要“智能的”葡萄糖响应性胰岛素递送装置或制剂，其可以模拟β-细胞的功能来调节胰岛素“分泌”，目的是改善糖尿病患者的血糖控制和生活质量。
这种“智能的”疗法通常整合了葡萄糖感测或转换模块以及感测/转换激活的胰岛素释放模块。例如，穿戴式闭环电子/机械泵结合了连续葡萄糖监测电化学传感器和外部胰岛素输注泵。这些系统历来受到滞后的血糖与小间隙的平衡、进入循环的胰岛素吸收和生物污染的限制。从二十世纪七十年代开始也已经广泛地探索了基于合成材料的葡萄糖响应制剂。经常利用三种经典策略，通常包括不同的葡萄糖感测部分：葡萄糖氧化酶、葡萄糖结合蛋白(GPB)(例如，ConA)(14)和苯基硼酸(PBA)，以实现葡萄糖触发。已经开发了各种各样的制剂，诸如大块水凝胶、微凝胶、基于乳液的纳米颗粒和自组装囊泡，以对高血糖状态作出溶胀、收缩、降解或解离的响应，以便促进胰岛素的释放。尽管有这些颇具前景的策略，但是要呈现能对升高的血糖(BG)水平快速作出响应，从而严密地复制健康胰腺的动力学的系统仍然存在挑战。此外，那些合成系统的免疫响应、在生理环境中的稳定性和长期毒性需要进一步调查。
概述
本文公开了葡萄糖响应性胰岛素递送组合物，所述递送组合物可以用于控制受试者体内的葡萄糖水平。具体而言，公开了一种组合物，所述组合物包含经葡萄糖修饰的胰岛素分子，所述胰岛素分子包含例如通过至少一个连接子分子缀合到至少一个葡萄糖部分的胰岛素部分。在这些实施方案中，经葡萄糖修饰的胰岛素分子被配置成可逆地结合葡萄糖结合结构，使得经葡萄糖修饰的胰岛素在高葡萄糖条件下被内源性葡萄糖置换。这导致产生了经葡萄糖修饰的胰岛素分子的生物利用度，在此情况下它可以促进葡萄糖代谢。由于释放率取决于葡萄糖浓度，可以紧密地调节葡萄糖水平。
在一些实施方案中，经葡萄糖修饰的胰岛素分子包含通过不同的连接子分子缀合到胰岛素部分的2、3、4、5、6或更多个葡萄糖部分。例如，连接子分子可以是合成的。在一些实施方案中，连接子分子包含马来酰亚胺基团。在一些实施方案中，连接子分子包含聚乙二醇(PEG)基团。在一些情况下，连接子分子是肽连接子，诸如具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个氨基酸的肽。
胰岛素部分可以是任何生物活性形式的胰岛素，诸如人胰岛素或胰岛素同系物。胰岛素优选地是重组蛋白。胰岛素可以是速效的(例如，赖脯胰岛素、门冬胰岛素、赖谷胰岛素)、短效的(普通胰岛素、velosulin、诺和灵)、中效的(NPH)或长效的(甘精胰岛素、地特胰岛素、德谷胰岛素)。在一些实施方案中，所公开的组合物包含具有不同形式的胰岛素部分的经葡萄糖修饰的胰岛素分子的混合物。
在一些情况下，使用者在向受试者施用之前在适合于经葡萄糖修饰的胰岛素分子可逆地结合葡萄糖结合结构的条件下将包含经葡萄糖修饰的胰岛素分子的组合物与葡萄糖结合结构混合。在其他实施方案中，所述组合物包含已结合到葡萄糖结合结构的经葡萄糖修饰的胰岛素分子。
葡萄糖结合结构可以是能够在体内可逆地结合葡萄糖的任何生物相容性底物。例如，所述结构可以包含葡萄糖转运蛋白(GLUT)，所述葡萄糖转运蛋白是有助于葡萄糖转运到质膜上的膜蛋白。GLUT1是在红细胞(红血球)中以最高水平表达的葡萄糖转运蛋白。因此，在特定实施方案中，葡萄糖结合结构是红细胞(红血球)，诸如人红细胞。然而，在其他实施方案中，葡萄糖结合结构仅包括红细胞的质膜或包含GLUT蛋白的其他细胞。例如，质膜可以附着于生物相容性纳米颗粒。在一些实施方案中，合适的纳米颗粒的平均直径可以为约50至约150纳米，包括约50、60、70、80、90、100、110、120、130、140和150纳米。在一些实施方案中，纳米颗粒包含聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)共聚物。在一些实施方案中，纳米颗粒由葡聚糖形成。在一些实施方案中，纳米颗粒由透明质酸形成。在一些实施方案中，纳米颗粒是脂质体。
经葡萄糖修饰的胰岛素分子被配置成在高葡萄糖条件下从葡萄糖结合结构移出。在一些实施方案中，经葡萄糖修饰的胰岛素分子被配置成在葡萄糖水平达到或超过约200mg/dL时从葡萄糖结合结构移出。虽然应理解经葡萄糖修饰的胰岛素分子在低葡萄糖水平下仍然会从葡萄糖结合结构移出，但是它是在较低的速率下进行的。因此，在一些实施方案中，葡萄糖结合结构优选地在低葡萄糖生理环境，例如葡萄糖浓度为0至200mg/dL中结合经葡萄糖修饰的胰岛素。在优选的实施方案中，葡萄糖结合结构被配置成在这些低葡萄糖条件下在至少10、20、30、40或50天内稳定地结合经葡萄糖修饰的胰岛素。在一些实施方案中，可以通过连接子性质在激素与葡萄糖衍生物之间调整这些动力学性质。
还公开了一种使用所公开的葡萄糖响应性胰岛素递送组合物控制受试者体内的胰岛素水平的方法。具体而言，所公开的方法可以包括向经诊断患有糖尿病的受试者施用治疗有效量的所公开的组合物。在一些实施方案中，受试者患有I型糖尿病。在一些实施方案中，受试者患有II型糖尿病。在一些实施方案中，受试者患有妊娠糖尿病。所公开的方法在一些情况下可以用来取代胰岛素泵。此外，所公开的方法在一些情况下可以实现对葡萄糖监测的需求和/或频率的降低。
所公开的组合物可以适合于暴露于循环中的葡萄糖的任何方式施用。在一些实施方案中，所述组合物通过透皮贴剂来递送。例如，所述组合物可以通过微针阵列贴剂来递送。
附图和下面的描述中阐述了本发明的一个或多个实施方案的细节。根据说明书和附图以及权利要求书将清楚明白本发明的其他特征、目的和优点。
附图描述
图1A示出了基于红细胞的葡萄糖响应性胰岛素递送系统的示意图。合成的Glu-胰岛素通过与质膜上的葡萄糖受体/转运蛋白相互作用而附着于红细胞(红血球)。I和II：mRBC的收集和分离。Ⅲ：Glu-胰岛素结合到mRBC。
图1B示出了用于由高血糖状态触发来释放更多胰岛素的体内胰岛素递送的附着有胰岛素的红细胞的示意图。
图2示出了将葡萄糖缀合到胰岛素的合成步骤。
图3A示出了葡萄糖-胰岛素缀合物的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。葡萄糖与胰岛素的摩尔比为(1)0:1，(2)1:1，(3)10:1和(4)100:1。当与葡萄糖缀合时，胰岛素的分子量增加，使得它们可以在SDS-PAGE中与天然胰岛素区分开来。此外，当葡萄糖与胰岛素之比增加至100:1时，获得的产物主要是葡萄糖-胰岛素缀合物。
图3B示出了天然胰岛素和葡萄糖-胰岛素缀合物的基质辅助激光解吸/电离质谱(MALDI MS)测定的结果。天然胰岛素的分子量为约5806，并且葡萄糖-胰岛素缀合物为约6813。
图4A示出了天然胰岛素和葡萄糖-胰岛素缀合物的CD谱。
图4B示出了天然胰岛素和葡萄糖-胰岛素缀合物在相同的胰岛素浓度(5mg/kg)下在STZ诱导的1型糖尿病小鼠中的体内生物活性比较的结果。
图5A示出了附着于mRBC的Glu-胰岛素的共焦显微镜图像。(比例尺＝10μm)。
图5B示出了在不同实验设置下孵育的mRBC的流式细胞术数据，显示出胰岛素在细胞膜上的成功结合。
图5C示出了未经过和经过400mg/dL葡萄糖溶液处理的附着有Glu-胰岛素的mRBC的共焦显微镜图像。(比例尺＝50μm)。
图5D示出了在不同的时间点用400mg/dL葡萄糖溶液处理的附着有Glu-胰岛素的单个mRBC的共焦显微镜图像。(比例尺＝5μm)。
图5E示出了用不同浓度的葡萄糖溶液处理的附着有胰岛素的mRBC的流式细胞术数据。
图5F示出了FITC-胰岛素-mRBC的对应的平均荧光强度(MFI)定量。
图5G示出了在如所指示的若干种葡萄糖浓度下在37℃下来自mRBC的体外累积的Glu-胰岛素释放。
图5H示出了来自mRBC的体外累积的Glu-胰岛素释放。黑色箭头表示施用时间点。
图5I示出了mRBC的脉冲式Glu-胰岛素释放曲线。
图6A示出了天然mRBC、装载有葡萄糖-胰岛素缀合物的mRBC和用FITC-膜联蛋白V染色的红色重影的流式细胞术结果的直方图数据。红色重影是通过使用在4℃下孵育5分钟的裂解缓冲液(5mMNaH2PO3/Na2HPO3，pH8)获得的阳性对照。
图6B示出了图6A所示的流式细胞术结果的条形图概述。
图7A示出了用来确定血液样品中的工程化的mRBC-胰岛素(在FITC中呈阳性)的百分比的流式细胞术实验的结果。
图7B示出了小鼠体内的胰岛素-mRBC的血液循环曲线。甚至是在注射之后72小时，所有收集的mRBC中的RBC(已注射)的百分比似乎是稳定的。误差条是基于三重样品的SD。
图8A示出了用游离的胰岛素+mRBC、Glu-胰岛素、胰岛素-mRBC和PBS对照治疗之后STZ诱导的糖尿病小鼠体内的BG水平。黑色箭头表示施用时间。
图8B示出了STZ-糖尿病小鼠的体内葡萄糖耐量测试的结果。在时间0处静脉内注射胰岛素-mRBC，并且在胰岛素施用之后1.5小时进行IPGTT。黑色箭头表示施用时间点。
图8C示出了响应数据，所述响应数据是基于图8B的从90到200分钟的曲线下面积而计算的。基线被设定为第90分钟的BG读数。
图8D示出了血浆胰岛素水平和葡萄糖水平在IPGTT之后的变化。
图8E示出了随时间施用胰岛素-mRBC的健康小鼠的BG变化。黑色箭头表示施用时间点。
图8F是条形图，其示出了低血糖指数的定量，所述定量由初始与最低点BG读数之间的差除以达到最低点所处的时间计算。误差条是基于每组五只小鼠的SD。(P值：*P<0.05)
图9是幼龄和老龄红细胞作为胰岛素递送载体的比较。黑色箭头表示施用时间点。
图10A比较了人与小鼠RBC的葡萄糖响应性胰岛素装载和释放。将1x 108RBC与0.5mg/mL Glu-胰岛素在500μL PBS中孵育过夜。hRBC显示出比mRBC高得多的Glu-胰岛素装载量。小鼠和人RBC的胰岛素装载效率的比较。hRBC显示出比mRBC高得多的葡萄糖-胰岛素装载效率。将近60％的葡萄糖-胰岛素附着于hRBC膜，而在mRBC上仅检测到约20％的葡萄糖-胰岛素。
图10B示出了在若干种葡萄糖浓度下在37℃下来自hRBC的体外累积的胰岛素释放。观察到以葡萄糖依赖性方式从hRBC进行胰岛素释放。
图11是胰岛素-PLGA-RM纳米颗粒的制作的示意图。I：RBC膜的分离。II：将RM涂布到PLGA纳米颗粒。Ⅲ：Glu-胰岛素结合到PLGA-RM纳米颗粒。
图12A示出了PLGA-RM纳米颗粒的TEM图像。插图：放大图像。(比例尺＝200nm)。
图12B示出了PLGA-RM纳米颗粒的动态光散射(DLS)表征。
图12C示出了在如所指示的若干种葡萄糖浓度下在37℃下来自PLGA-RM的体外累积的胰岛素释放。
图12D示出了用游离的胰岛素+PLGA-RM NP、胰岛素-PLGA-RM NP和PBS对照治疗之后STZ诱导的糖尿病小鼠的体内BG水平。黑色箭头表示施用时间点。
图12E示出了针对糖尿病小鼠进行的体内葡萄糖耐量测试。在时间0处静脉内注射胰岛素-PLGA-RM纳米颗粒，并且在胰岛素施用之后1.5小时进行IPGTT。黑色箭头表示施用时间点。
图12F示出了响应数据。响应是基于120分钟内的曲线下面积(AUC)而计算的，其中基线设定为第90分钟的BG读数。
图12G示出了血浆胰岛素水平和葡萄糖水平在IPGTT之后的变化。误差条是基于每组五只小鼠的标准偏差(SD)。(P值：*P<0.05)
图13A示出了在mRBC膜修饰之前的PLGA NP的TEM图像。
图13B示出了在mRBC膜修饰之后的PLGA NP的TEM图像。
图13C示出了在mRBC膜修饰之前的PLGA NP的动态光散射(DLS)。
图13D示出了在mRBC膜修饰之后的PLGA NP的动态光散射(DLS)。PLGA NP显示通过DLS测量的直径从145nm略微增加到160nm。(比例尺＝200nm)(比较图13C至图13D)。
图14示出了实施来验证GLUT4存在于涂布RM的PLGA NP上的蛋白质印迹的结果。如图所示，在硝酸纤维素(NC)膜上仅可见一条大小约为60kDa的条带。
图15示出了附着有胰岛素的RM-PLGA NP的共焦显微镜图像。胰岛素和GLUT4信号是共定位的。(比例尺＝10μm)。
图16A示出了随时间施用胰岛素-RM-PLGA NP的健康小鼠的血糖变化。
图16B示出了低血糖指数的定量，所述定量由图16A所示的初始与最低点血糖读数之间的差除以达到最低点所处的时间计算。误差条是基于每组五只小鼠的标准偏差(SD)。(P值：*P<0.05)
图17示出了在若干种葡萄糖浓度下在37℃下来自GLUT-胰岛素缀合物的累积的胰岛素释放。
图18A-H示出了MN阵列贴剂用于1型糖尿病治疗的体内研究的数据和图像。图18A是具有MN阵列的智能胰岛素贴剂的照片。图18B是MN阵列的SEM图像(比例尺：200微米)。图18C是装载GULT1-胰岛素，由FITC标记胰岛素的MN的荧光显微镜图像(比例尺：200微米)。图18D是示出用空白MN、装载游离的胰岛素的MN和装载GLUT1-胰岛素的MN治疗之后的STZ诱导的糖尿病小鼠的体内血糖(BG)水平的曲线图。黑色箭头表示施用时间点。图18E是示出针对糖尿病小鼠进行的体内葡萄糖耐量测试的结果的曲线图，其中在时间0处注射GLUT1-胰岛素MN并且在胰岛素施用之后1.5小时进行IPGTT。黑色箭头表示施用时间点。图18F示出了血浆胰岛素水平和葡萄糖水平在IPGTT之后的变化。图18G是示出在施用GLUT1-胰岛素MN之后1小时通过另外施用MN阵列贴剂治疗的糖尿病小鼠的BG水平的曲线图。图18H是示出随时间施用空白MN、装载游离的胰岛素的MN和装载GLUT1-胰岛素的MN的健康小鼠的BG变化的曲线图。误差条是基于每组五只小鼠的标准偏差(SD)。(P值：*P<0.05)
图19是示出装载GLUT1-胰岛素的MN的机械行为的曲线图。
图20示出了用MN-阵列贴剂经皮处理的小鼠背部和相关皮肤(左上角图)，其中台盼蓝染色的图像示出了对小鼠皮肤的MN-阵列贴剂穿透(右上角图)。(比例尺：2mm。)(底部图)由一个MN阵列贴剂穿透的小鼠皮肤的经过H&E染色的切片。(比例尺：100μm)。
图21示出了在处理后5分钟(左图)和6小时(右图)的皮肤穿刺痕迹的照片。
详述
本文公开了用于治疗糖尿病的组合物和方法。所述组合物包括经葡萄糖修饰的胰岛素分子，所述胰岛素分子包括缀合到至少一个葡萄糖部分的胰岛素部分。经葡萄糖修饰的胰岛素分子的胰岛素和葡萄糖部分通过至少一个连接子分子来缀合。在一些实施方案中，所述组合物还包括至少一个葡萄糖结合结构。葡萄糖结合结构被配置成在高葡萄糖条件下可逆地结合经葡萄糖修饰的胰岛素分子的葡萄糖部分，从而释放经葡萄糖修饰的胰岛素。治疗糖尿病的方法包括向受试者施用包括经葡萄糖修饰的胰岛素分子和葡萄糖结合结构的组合物，其中经葡萄糖修饰的胰岛素分子结合到葡萄糖结合结构。在一些实施方案中，将药学有效量的组合物施用于患有糖尿病的受试者。
贯穿本申请使用的术语应被解释为具有本领域的普通技术人员所理解的普通含义和典型含义。然而，申请人希望以下术语给出如下定义的特定定义。
除非上下文另外明确规定，否则如在说明书和权利要求书中所用，单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数个提及物。例如，术语“一个细胞”包括复数个细胞，包括其混合物。
如本领域的普通技术人员所理解，术语“约”和“大约”被定义为“接近于”。在一个非限制性实施方案中，所述术语被定义为在10％以内。在另一个非限制性实施方案中，所述术语被定义为在5％以内。在另一个非限制性实施方案中，所述术语被定义为在1％以内。
蛋白质的“活性”(包括与“生物活性”相关的那些)包括例如转录、翻译、细胞内易位、分泌、通过激酶磷酸化、通过蛋白酶裂解和/或与其他蛋白质的同嗜性和异嗜性结合。
术语“施用”指代口服、局部、静脉内、皮下、经皮、透皮、肌内、关节内、肠胃外、小动脉内、真皮内、心室内、颅内、腹膜内、病灶内、鼻内、直肠、阴道、通过吸入或经由植入贮器实现的施用。可以使用透皮微针阵列贴剂进行施用。术语“胃肠外”包括皮下、静脉内、肌内、关节内、滑膜内、胸骨内、鞘内、肝内、病灶内以及颅内注射或输注技术。
“可生物相容的”通常指代通常对接受者无毒而且不会对受试者造成任何显著副作用的物质以及其任何代谢物或降解产物。
“组合物”意图包括活性剂与另一种惰性(例如，可检测的试剂或标记)或活性(诸如助剂)化合物或组合物的组合。
如本文所用，术语“包含”意图表示组合物和方法包括所述要素，但不排除其他要素。“基本上由…组成”在用于定义组合物和方法时将意指排除对于组合具有任何重要意义的其他要素。因此，基本上由如本文所定义的要素组成的组合物应当不排除来自分离和纯化方法的微量杂质和药学上可接受的载体，诸如磷酸盐缓冲盐水、防腐剂等等。“由…组成”应意指对于施用本发明的组合物排除超过微量的其他成分的元素，以及实质性的方法步骤。由这些过渡术语的各者定义的实施方案在本发明的范围内。
“对照”是出于比较目的而用于实验中的替代受试者或样品。对照可以是“阳性的”或“阴性的”。
如本文所用，“缀合的”指代不可逆的结合相互作用。
如本文所用，“置换”指代通过对特定蛋白质结构域具有亲和力而对被置换的肽、化学物质或核酸不具有亲和力的化学物质、肽或核酸而中断例如蛋白质结构域与肽、蛋白质结构域与化学物质、蛋白质结构域与核酸序列之间的分子或化学相互作用。
“有效量”是足以影响有益或所需结果的量。有效量可以一种或多种施用方法、应用或剂量来施用。
如本文所用，术语“高葡萄糖条件”指代葡萄糖浓度大于或等于200mg/dL的环境。例如，“高血糖水平”指代血流中的葡萄糖水平大于或等于200mg/dL。在一些实施方案中，高葡萄糖条件是200-400mg/dL。在其他实施方案中，高葡萄糖条件是300-400mg/dL。
如本文所用的“连接子”指代连接相邻分子的分子。一般而言，连接子除了连接相邻分子或保持其间一定程度的最小距离或其他空间关系外，不具有特定生物活性。在一些情况下，可以对连接子进行选择以影响或稳定相邻分子的某些性质，诸如分子的折叠、净电荷或疏水性。
如本文所用，术语“低葡萄糖条件”指代葡萄糖浓度为0至200mg/dL的环境。例如，“低血糖水平”指代血流中的葡萄糖水平小于200mg/dL。
术语“肽”、“蛋白质”和“多肽”可互换使用来指代包含通过一个氨基酸的羧基连接到另一个氨基酸的α氨基的两个或更多个氨基酸的天然或合成分子。
术语“载体”或“药学上可接受的载体”意指可用于制备通常安全且无毒的药物或治疗组合物的载体或赋形剂，并且包括对于兽医和/或人类药物或治疗应用而言可接受的载体。如本文所用，术语“载体”或“药学上可接受的载体”涵盖/可以包括磷酸盐缓冲液、水、乳剂(诸如水包油或油包水型乳剂)和/或各种类型的润湿剂。如本文所用，术语“载体”涵盖任何赋形剂、稀释剂、填料、盐、缓冲剂、稳定剂、增溶剂、脂质、稳定剂或本领域熟知的用于药物配制的和如下文进一步所描述的其他物质。
如本文所用，术语“聚合物”指代天然或合成的相对高分子量有机化合物，它的结构可以由重复的小单元、即单体表示(例如，聚乙烯、橡胶、纤维素)。合成的聚合物通常通过加成或缩聚单体来形成。如本文所用，术语“共聚物”指代由两种或更多种不同的重复单元(单体残基)形成的聚合物。作为举例但不带限制性，共聚物可以是交替共聚物、无规共聚物、嵌段共聚物或接枝共聚物。还应预期，在某些方面，嵌段共聚物的各种嵌段片段本身可以包含共聚物。
“引物”是短的多核苷酸，通常具有游离的3'-OH基团，其通过与靶标杂交而结合到感兴趣样品中可能存在的靶标或“模板”，并且之后促进与靶标互补的多核苷酸的聚合。“聚合酶链式反应”(“PCR”)是使用由“上游”和“下游”引物组成的“引物对”或“引物组”、以及聚合催化剂，诸如DNA聚合酶，通常是热稳定聚合酶来产生靶多核苷酸的复制拷贝的反应。用于PCR的方法是本领域熟知的，并且例如在"PCR:A PRACTICAL APPROACH"(M.MacPherson等，IRL Press at Oxford University Press(1991))中教导了所述方法。产生多核苷酸的复制拷贝的所有过程，诸如PCR或基因克隆在本文中被统称为“复制”。引物也可以用作杂交反应，诸如DNA或RNA印迹分析中的探针。Sambrook等，(同上)。
范围在本文中可以表述为从“约”一个具体值和/或到“约”另一个具体值。当表述这种范围时，另一个实施方案包括从所述一个特定值和/或到所述另一个特定值。类似地，在通过使用先行词“约”将值表述为近似值时，将理解具体值形成另一个实施方案。将进一步理解，范围中的每一个的端点相对于另一个端点以及独立于另一个端点都是有意义的。还应理解，本文公开了多个值，并且每个值在本文中除所述值本身之外也公开为“约”所述特定值。例如，如果公开了值“10”，那么也公开了“约10”。
术语“治疗有效量”或“治疗有效剂量”指代由研究者、兽医、医生或其他临床医师在一般时间段内所寻求的将引起组织、系统、动物或人体的生物学或医学反应的组合物，诸如结合到葡萄糖结合结构的经葡萄糖修饰的胰岛素的量。在一些实施方案中，所需反应是对I型糖尿病的控制。在一些实施方案中，所需反应是对II型糖尿病的控制。在一些情况下，所需的生物学或医学反应在数天、数周或数年的时段内向受试者施用多剂量的组合物之后实现。
术语“受试者”在本文中被定义为包括动物诸如哺乳动物，包括但不限于：灵长类动物(例如，人)、奶牛、绵羊、山羊、马、狗、猫、兔、大鼠、小鼠等等。在一些实施方案中，所述受试者为人。
用DNA“转化”细胞有机体意指将DNA引入有机体中，使得DNA的至少一部分可作为染色体外因子或借助染色体整合而复制。用DNA“转染”细胞有机体指代细胞或有机体接纳DNA，例如表达载体，而不管实际上是否表达任何编码序列。术语“经转染的宿主细胞”和“经转化的”指代其中引入DNA的细胞。所述细胞被称为“宿主细胞”并且它可以是原核的或真核的。典型的原核宿主细胞包括各种大肠杆菌菌株。典型的真核宿主细胞是哺乳动物，诸如中国仓鼠卵巢或人源细胞。引入的DNA序列可以来自与宿主细胞相同的物种或与宿主细胞不同的物种，或者它可以是含有一些外源和一些同源DNA的杂种DNA序列。
如本文所用的术语“治疗(treat/treating/treatment)”以及其语法变型包括部分或完全延迟、减缓、减轻病症或病状的一种或多种伴随性症状或减小其强度，和/或减缓、减轻或阻碍病症或病状的一种或多种病因。根据本发明的治疗可以预防地、防御地、姑息地或矫正地应用。防御性治疗在发作之前(例如，在有明显的癌症迹象之前)、在早期发作期间(例如，在有初始癌症迹象和症状之后)、或在确证癌症发展之后施用于受试者。防御性施用可以在显现感染症状之前的几天至几年进行。
在一些情况下，术语“治疗(treat/treating/treatment)”以及其语法变型包括与治疗受试者之前相比较或与这类症状在普通或研究人群中的发生率相比较控制血糖水平并且降低糖尿病症状的严重程度。
当提及多肽(包括抗体)或受体时如本文所用的术语“特异地结合”指代对于蛋白质和其他生物产物的异源群体中的蛋白质或多肽或受体的存在来说起到决定作用的结合反应。因此，在指定条件(例如，在抗体情况下为免疫测定条件)下，当指定的配体或抗体未以显著量结合到存在于样品中的其他蛋白质，或结合到配体或抗体在有机体中可能会接触的其他蛋白质时，所述指定的配体或抗体“特异地结合”至其特定“靶标”(例如，抗体特异地结合到内皮细胞抗原)。一般而言，“特异地结合”第二分子的第一分子对所述第二分子具有大于约105M-1(例如，106M-1、107M-1、108M-1、109M-1、1010M-1、1011M-1和1012M-1或更大)的亲和常数(Ka)。
本文公开了用于治疗糖尿病的组合物和方法。所述组合物包括经葡萄糖修饰的胰岛素分子，所述胰岛素分子包括缀合到至少一个葡萄糖部分的胰岛素部分。经葡萄糖修饰的胰岛素分子的胰岛素和葡萄糖部分通过至少一个连接子分子来缀合。经葡萄糖修饰的胰岛素分子被配置成在高葡萄糖条件下可逆地结合葡萄糖结合结构，从而释放经葡萄糖修饰的胰岛素。在一些实施方案中，所述组合物还包括至少一个葡萄糖结合结构。治疗糖尿病的方法包括提供包括经葡萄糖修饰的胰岛素分子和葡萄糖结合结构的组合物，其中经葡萄糖修饰的胰岛素分子结合到葡萄糖结合结构。所述方法还包括向患有糖尿病的受试者施用治疗有效量的组合物。
本发明包括一种用于基于经葡萄糖修饰的胰岛素(Glu-胰岛素)与葡萄糖结合结构之间的可逆相互作用而进行葡萄糖响应性胰岛素递送的组合物。这种结合是可逆的并且胰岛素在高葡萄糖条件下可以从RBC释放。用于这种释放的潜在机制是Glu-胰岛素因为游离的葡萄糖的竞争相互作用而被GLUT置换。人RBC作为血管中氧的天然载体具有100至120天的寿命。因此，这些固有的生物相容性天然载体可以延长药物在血液中的循环。(21-27)在以下实施例中，与经化学诱导的I型小鼠体内的游离的胰岛素相比较，与Glu-胰岛素偶联的小鼠RBC(mRBC)的静脉内(i.v.)输注已显示可延长胰岛素的治疗效果以维持血糖(BG)水平处于正常范围内。体内葡萄糖响应行为通过葡萄糖耐量测试来观察。替代的施用策略包括：1)静脉内注射聚合物纳米颗粒(直径为约100nm)，所述聚合物纳米颗粒涂布有RBC膜并且装载有经葡萄糖修饰的胰岛素，以及2)微针(MN)35-58贴剂平台，所述贴剂平台装载有外源表达的GLUT和Glu-胰岛素的复合物。
在一些实现方式中，经葡萄糖修饰的胰岛素分子可以包含两个或更多个葡萄糖部分。在一些实现方式中，经葡萄糖修饰的胰岛素分子包含两个葡萄糖部分。在一些实现方式中，每个葡萄糖部分通过不同的连接子分子缀合到胰岛素部分。连接子分子可以是用于将葡萄糖部分附着于胰岛素部分的任何天然或合成分子。在一些实例中，连接子分子包括马来酰亚胺基团、或马来酰亚胺-硫醇加成物。在特定实例中，马来酰亚胺基团添加到葡萄糖分子，并且硫醇基团添加到胰岛素分子。马来酰亚胺-葡萄糖和硫醇化胰岛素之后发生反应来形成经葡萄糖修饰的胰岛素分子，其中马来酰亚胺-硫醇加成物充当连接子分子。可替代地或另外，连接子分子可以包括间隔基。间隔基可以是聚合物链，诸如聚(乙二醇)(PEG)链或任何其他合适的聚合物链。
经葡萄糖修饰的胰岛素分子被配置成可逆地结合葡萄糖结合结构。可逆结合可以通过葡萄糖与一个或多个葡萄糖结合部分之间的非共价结合来实现。在一些实现方式中，葡萄糖结合部分是葡萄糖结合蛋白。因此，在一些实现方式中，葡萄糖结合结构可以是包含一种或多种葡萄糖结合蛋白的任何结构。在一些实现方式中，葡萄糖结合结构是单一葡萄糖结合蛋白。在一些实现方式中，葡萄糖结合蛋白是葡萄糖转运蛋白，并且非共价结合是受体-配体结合相互作用。葡萄糖结合蛋白的非限制性实例是GLUT或SLC2A家族的所有成员，包括GLUT1、GLUT2、GLUT3、GLUT4、GLUT5、GLUT6、GLUT7、GLUT8、GLUT9、GLUT10、GLUT11、GLUT12以及SLC2A13。
包含一个或多个葡萄糖结合部分的葡萄糖结合结构包括但不限于：诸如细胞、细胞膜、纳米颗粒和微粒的结构。因此，在一些实现方式中，葡萄糖结合结构是细胞。细胞可以是任何细胞类型，人、哺乳动物的细胞。在一些实例中，用作葡萄糖结合结构的细胞是人红细胞。有利地，可以从受试者抽取自体来源细胞，在低葡萄糖(结合)条件下将所述细胞暴露于经葡萄糖修饰的胰岛素，并且之后递送回到同一个受试者。然而，对于组合物来说，细胞不需要是自体来源的，以发挥在高葡萄糖条件下释放结合的经葡萄糖修饰的胰岛素的功能。
在其他实现方式中，葡萄糖结合结构是附着于纳米颗粒或微粒的红细胞膜。纳米颗粒可以具有任何适当的测量值。例如，纳米颗粒的直径大小可以是在5至500纳米的范围内。在一些实现方式中，纳米颗粒的直径大小测出为在50-150纳米之间。纳米颗粒还可以具有任何适当的材料或物质，并且在一些实现方式中是聚丙交酯-共-乙交酯(PLGA)纳米颗粒。例如，PLGA纳米颗粒(NP)可以使用与下文描述的那些类似的方法用RBC膜进行涂布(RM-PLGA)。与完整的mRBC一样，Glu-胰岛素同样可以特异性地结合到RM-PLGA NP，并且来自这些纳米颗粒的胰岛素释放以BG介导的方式自我调节。与mRBC相比较，人RBC(hRBC)在所描述的系统中显示出更好的胰岛素装载和葡萄糖响应性释放性能，这可能归因于有利的葡萄糖转运蛋白在hRBC上比在mRBC上更为密集而且更具亲和力(28)。作为PLGA的替代方案或除此之外，可以使用其他纳米材料或纳米颗粒。其他可能的纳米材料或纳米颗粒可以包括聚合物材料(例如，葡聚糖或透明质酸)、脂质体和/或无机纳米颗粒。
经葡萄糖修饰的胰岛素被配置成在高葡萄糖条件下释放葡萄糖结合结构。当例如血糖水平升高到超过某一阈值时，这有助于释放经葡萄糖修饰的胰岛素的一部分。例如，在高葡萄糖条件下，可能会从葡萄糖结合结构释放从10％到95％的任意百分比的经葡萄糖修饰的胰岛素分子，包括10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的经葡萄糖修饰的胰岛素。如本文所用，高葡萄糖条件被认为大于或等于200mg/dL。在一些实施方案中，高葡萄糖条件是200-400mg/dL。在其他实施方案中，高葡萄糖条件是300-400mg/dL。低葡萄糖条件被认为小于200mg/dL。
在一些实施方案中，在低葡萄糖条件下，葡萄糖结合结构被配置成在至少50天内结合经葡萄糖修饰的胰岛素。在一些实现方式中，如果葡萄糖条件保持很低，葡萄糖结合结构可以在甚至更长的时间段内结合经葡萄糖修饰的胰岛素。例如，红细胞具有100至120天的寿命。由红细胞携带的经葡萄糖修饰的胰岛素可以在低葡萄糖条件下在细胞载体的寿命的持续时间内保持结合。
本文还公开了使用经葡萄糖修饰的胰岛素组合物来治疗糖尿病的方法。治疗糖尿病的方法包括首先施用诸如以上描述的那些中的任一者的组合物。在一些实现方式中，向患有或怀疑患有糖尿病的受试者施用结合到葡萄糖结合结构的治疗有效量的经葡萄糖修饰的胰岛素分子。在一些实现方式中，可以经由透皮贴剂，诸如微针阵列贴剂施用结合到葡萄糖结合结构的治疗有效量的经葡萄糖修饰的胰岛素分子。所述方法在一些实现方式中还可以包括将经葡萄糖修饰的胰岛素暴露于葡萄糖结合部分或葡萄糖结合结构，诸如红细胞、纳米颗粒或微粒。有利地，可以从受试者抽取自体来源细胞，诸如红细胞，在低葡萄糖(结合)条件下将所述细胞暴露于经葡萄糖修饰的胰岛素，并且之后递送回到同一个受试者。然而，对于组合物来说，细胞不需要是自体来源的，以发挥在高葡萄糖条件下释放结合的经葡萄糖修饰的胰岛素的功能。
要呈现葡萄糖响应型胰岛素递送制剂的快速响应、长期持久性和生物相容性的组合具有挑战性。本文描述的经葡萄糖修饰的胰岛素策略呈现了有效的方法。在一些实例中，这些策略可以扩展到个性化细胞疗法，和/或与各种治疗剂整合来用于治疗不同疾病，伴有长期持续释放和生理信号介导的受控释放的优点。
实施例
实施例1-4中所使用的方法
材料.除非另外指明，否则所有化学制品购自Sigma-Aldrich并且按原样使用。人重组胰岛素(Zn盐，27.5IU/mg)购自Life Technology。
Glu-胰岛素的合成.Glu-胰岛素缀合物通过两步过程来合成。简而言之，胰岛素(或胰岛素-FITC)通过在4℃下在PBS(pH＝8.0)中以1:5的摩尔比与特劳特氏试剂(Traut’sReagent)(2-亚氨基四氢噻吩，Pierce)反应2小时而硫醇化。在反应2小时后，使用离心过滤装置(分子量截留MWCO＝3kDa)来去除过量的特劳特氏试剂，以纯化SH-胰岛素。同时，将D-(+)-葡萄糖胺与磺基琥珀酰亚胺-4-(N-马来酰亚胺基甲基)-环己烷-1-羧酸酯(磺基-SMCC，Pierce)以1:1的摩尔比在PBS(pH＝7.4)中在室温下混合2小时。最后，将SMCC活化的葡萄糖和胰岛素-SH以胰岛素:葡萄糖＝1:100的摩尔比在PBS(pH＝8.0)中混合。在4℃下反应24小时之后，使用离心过滤装置(MWCO＝3kDa)去除过量葡萄糖。将获得的Glu-胰岛素在4℃下储存直至使用。
装载胰岛素的RBC的制备.从B16小鼠或从人志愿者收集全血(研究方案由北卡罗来纳州立大学设立的伦理审查委员会批准)。通过离心(1000g，10分钟)将RBC与全血分离，并且用冷PBS(300mOsm，pH＝8.0)洗涤三次以在细胞内去除葡萄糖。为了将胰岛素装载到RBC膜，将Glu-胰岛素(0.5mg/ml)与500μl RBC(1x 108)在温和搅拌下于4℃孵育过夜。用冷PBS(300mOsm，pH 8)将RBC洗涤三次以去除未缀合的Glu-胰岛素。通过ELISA测定来确定结合的胰岛素。
胰岛素-PLGA-RM纳米颗粒的制备.将PLGA聚合物溶解于15mg mL-1丙酮中。将1mLPLGA溶液添加到玻璃小瓶中的4mL ddH2O中，并且将玻璃小瓶在真空下保持过夜以去除丙酮并获得PLGA-NP的水溶液。为了对RBC膜进行涂布，将RBC重悬于0.2mM EDTA水溶液中以诱导膜破裂10分钟，并且之后调整为PBS。将细胞溶液以10000g离心10分钟。将细胞膜洗涤数次直至上清液没有红色颜色为止。将PLGA-NP与囊泡溶液混合以获得比率为75mL血液/mgPLGA-NP的最终PLGA-RM纳米颗粒。为了将胰岛素装载到PLGA-RM，将Glu-胰岛素与PLGA-RMNP在温和搅拌下于4℃孵育过夜。用冷PBS(pH 8)通过离心将PLGA-RM NP洗涤三次以去除未缀合的Glu-胰岛素。将获得的胰岛素-PLGA-RM纳米颗粒在4℃下储存直至使用(负荷容量：2％)。
GLUT 1-胰岛素缀合物的制备.从质粒prGT3(Addgene 15993)扩增编码GLUT1的基因，并且用引物GLUT1-s(5’-GCAAATGGGTCGCGGATCCATGGAGCCCAGCAGC-3’，SEQ ID NO:1)和rGLUT-a(5’-CGAGTGCGGCCGCAAGCTTTCACACTTGGGAGTCAG-3’，SEQ ID NO:2)将所述基因亚克隆到pET-28a载体(Novagen)中。将获得的pET28a-GLUT1转化到大肠杆菌Rosetta(DE3)pLysS细胞中以用于GLUT1表达。简而言之，将新鲜的大肠杆菌菌落接种到5mL LB培养基(补充有10μg/mL卡那霉素和34μg/mL氯霉素)中。在37℃培养过夜之后，接着将细胞培养物用新鲜的LB培养基稀释100倍并且继续另外培养2-3小时(OD600 0.6-0.8)。然后，添加0.5mM异丙基β-D-1-吡喃半乳糖苷(IPTG)以在20℃下诱导GLUT1表达，持续8小时。通过以4000×g离心15分钟来收集细胞，并且将所述细胞重悬于缓冲液A(20mM Tris-HCl pH 8.0，0.15MNaCl，10mM咪唑，5％甘油，1mM PMSF，0.5mg/mL溶菌酶，0.4mg/mL DNA酶I和2％DDM)中。将悬浮液在室温下孵育30分钟并且在冰上再孵育30分钟。然后通过超声处理来裂解细胞，并且通过离心(20000×g，10分钟)去除细胞碎片。将澄清的裂解物添加到含有1mL Ni-NTA树脂(Qiagen)的柱中。在用缓冲液B(20mM Tris-HCl pH 8.0，0.15M NaCl，25mM咪唑，5％甘油和0.05％DDM)洗涤柱之后，用缓冲液C(20mM Tris-HCl pH 8.0，0.15M NaCl和500mM咪唑，5％甘油以及0.05％DDM)洗脱GLUT1。通过Bradford测定(Bio-Rad)对纯化的GLUT1进行定量，并且通过SDS-PAGE进行分析。
将经葡萄糖修饰的胰岛素与GLUT1蛋白以1.2:1的摩尔比在4℃下混合12小时。通过离心过滤装置(MWCO＝10kDa)去除游离的Glu胰岛素。将获得的Glu-胰岛素在4℃下储存直至使用。我们首先检查了游离的GLUT1蛋白和Glu-胰岛素在体外的特异性结合亲和力。我们将GLUT1与Glu-胰岛素孵育过夜，通过离心过滤装置(MWCO＝10kDa)去除游离的Glu-胰岛素。已清楚地发现，如果与GLUT1蛋白共孵育，则可以在上清液中检测到胰岛素信号。
蛋白质印迹.通过以10000rpm离心10分钟来收集PLGA-RM的总蛋白质。随后，在12％十二烷基硫酸钠(SDS)Bis-Tris-聚丙烯酰胺凝胶上分离30μg总蛋白质，并且之后将其电转移(在250mA下持续75分钟)到硝酸纤维素膜(BioRad，0.45μm)上。在此之后，将膜在含有3％牛血清白蛋白(BSA)的TBST(BioRad)中在室温下封闭1小时，并且之后在含有3％BSA和抗GLUT4的一级抗体(1:500,Thermo Scientific,USA)的TBST中在4℃下孵育过夜。在用一级抗体孵育之后，将膜用TBST洗涤三次，并且用山羊的抗兔IgG-HRP二级抗体(1:5000,Thermo Scientific,USA)在室温下孵育1小时。最终，在用TBST洗涤三次之后，通过1-StepTMTMB-印迹底物溶液(Thermo Scientific)对膜进行染色。
丙烯酸酯修饰的HA(m-HA)的合成和表征.在4℃下将1.0g HA溶解于50mL去离子水中，向其中逐滴添加0.8mL甲基丙烯酸酐(MA)。通过添加5N NaOH将反应溶液调节为pH 8-9并且在4℃下搅拌24小时。通过在丙酮中沉淀，之后用乙醇洗涤数次来获得所得聚合物。将产物重新溶解于去离子水中，并且将溶液用去离子水透析两天。通过冻干法实现m-HA，其中产率为87.5％。在执行标准反卷积算法来分离紧密间隔的峰之后，通过比较在5.74和6.17ppm处的质子峰(甲基丙烯酸酯质子)与在1.99ppm处的峰(HA的N-乙酰葡萄糖胺)下方的面积比来将修饰度计算为15％。
m-HA：1HNMR(D2O,300MHz,δppm):1.85-1.96(m,3H,CH2＝C(CH3)CO),1.99(s,3H,NHCOCH3),5.74(s,1H,CH1H2＝C(CH3)C0),6.17(s,1H,CH1H2＝C(CH3)CO)。
体外释放研究.在制备胰岛素-RBC或胰岛素-PLGA-RM NP之后，将各种溶液(含0、100、200或400mg dL-1葡萄糖的500μL PBS)添加到每个管中，并且在37℃下孵育来评估胰岛素的释放。在通过离心用PBS洗涤三次之后，通过ELISA测定(Calbiotech,USA)来确定上清液中释放的胰岛素。对于来自GLUT1-胰岛素缀合物的胰岛素释放，用各种溶液(含0、100、200或400mg dL-1葡萄糖的500μL PBS)处理GLUT1-胰岛素缀合物，使用离心过滤装置(MWCO＝10kDa)来分离释放的胰岛素。通过ELISA测定(Calbiotech,USA)来确定离心管中释放的胰岛素。
MN的制作和表征.本研究中的所有MN都使用来自Blueacre Technology Ltd.的六个均一的(聚)硅氧烷模具来制作，所述(聚)硅氧烷模具通过直接激光烧蚀来机械加工以形成圆柱孔阵列。每个MN具有沿600μm的高度成锥形的300μm×300μm的圆形底部，其中尖端半径为约5μm。MN以15×15阵列排列，其中尖端到尖端的间距为600μm。在制备GLUT1-胰岛素缀合物之后，将所有制备的GLUT1-胰岛素(1mg/kg)在水浴超声仪中与N,N’-亚甲基双丙烯酰胺(MBA，w/v＝20％)和光引发剂(Irgacure 2959，w/v＝0.05％)预混合的3mL m-HA(w/v＝40％)分散数分钟。将溶液添加到制备的微模具贮器中。在此之后，将微模具转移到HettichUniversal 32R离心机，以2000rpm离心20分钟，以将溶液压缩到MN空腔中。最终的装置在真空干燥器中在25℃下进行6-8小时干燥。在干燥完成之后，将MN阵列与(聚)硅氧烷模具小心地分离，并且在紫外线下(波长：320-450nm)暴露30秒。针座可以进行定制以适应注射器。可以将所得的产物在4℃下在密封的六孔容器中储存长达30天。用由FITC标记的胰岛素制成的纳米颗粒制作荧光MN。在FEI Verios 460L场发射扫描电子显微镜(FESEM)上表征MN的形态。通过Olympus 1X70多参数荧光显微镜来拍摄MN的荧光图像。使用Dymax BlueWave 75UV固化聚光灯来实施UV交联过程。
机械强度测试.对MN的机械强度测量已在环境和等距测试条件下在拉伸负荷框架上实施。在不锈钢板沿着y方向压缩MN阵列时在应力-应变仪上连续监测拉力。MN尖端与不锈钢板之间的初始隔距被设定为2.00mm，测压元件负荷容量(load cell capacity)被设定为10.00N。顶部不锈钢板移向MN阵列贴剂的速度为0.1mm/秒。在针开始弯曲时，记录MN的失效力。
皮肤穿透效果测试.将MN阵列施加到小鼠皮肤的背部，持续30分钟并移除。将小鼠安乐死并将皮肤样品包埋在OCT化合物(Sakura Finetek)中并在干冰上在异戊烷浴中快速冷冻。将冷冻的组织切片(10-μm厚度)，固定在显微镜载玻片上，并且在-80℃下储存。在北卡罗来纳州立大学兽医学院的组织学实验室(Histology Laboratory at NC StateCollege of Veterinary Medicine)中对所述样品进行苏木精和伊红(H&E)染色。在单独的实验中，用台盼蓝对受激皮肤的表面部位染色5分钟。在用干燥的棉纸从皮肤表面擦去残余染料之后，通过光学显微术(Leica EZ4 D立体显微镜)对皮肤样品进行成像。
使用STZ诱导的糖尿病小鼠进行的体内研究.STZ诱导的雄性C57B6糖尿病小鼠购自Jackson Labs(USA)，并且在由北卡罗来纳州立大学设立的实验动物管理和使用委员会(Institutional Animal Care and Use Committee at North Carolina StateUniversity)批准的方案下使用。对于胰岛素-RBC的体内循环行为，在装载胰岛素之后将mRBC与FITC偶联，对3只小鼠静脉内注射自体胰岛素-mRBC。然后在不同的时间点从尾静脉提取约3μL血液，并且之后将所述血液分散在具有抗凝剂的0.5mL PBS中。施加流式细胞术测量来确定血液样品中的胰岛素-mRBC(在FITC中呈阳性)的百分比。对于使用胰岛素-RBC或胰岛素-PLGA-RM纳米颗粒的糖尿病治疗效果，对每组选择5只小鼠以用于静脉内注射200μLPBS、游离的胰岛素、RBC/胰岛素或装载胰岛素的mRBC、或胰岛素-PLGA-RM纳米颗粒，其中每只小鼠的胰岛素剂量为1mg/kg。对于使用MN阵列贴剂的糖尿病治疗，对每组选择五只小鼠以用空白MN、装载有胰岛素的MN或装载有GLUT1-胰岛素缀合物的MN进行经皮治疗，其中每只小鼠的胰岛素剂量为1mg/kg。使用皮肤粘合剂将MN贴剂固定到小鼠背部。使用ClarityGL2Plus血糖仪(Clarity Diagnostics)在不同的时间点从小鼠的尾静脉血液样品(约3μL)测量BG水平。为了测量体内胰岛素浓度，在不同的时间点从小鼠收集血浆并且在-80℃下冷冻储存直至测定。使用人胰岛素ELISA试剂盒(Calbiotech,USA)来测定血浆胰岛素浓度。
统计学分析.使用GraphPad Prism(5.0)来评估统计学分析。用配对的学生t检验和双向ANOVA计算统计显著性。0.05或更小的P值被认为是显著的。
实施例1.经葡萄糖修饰的胰岛素(Glu-胰岛素)的合成与表征
葡萄糖经由双功能马来酰亚胺连接子缀合到胰岛素(图2)。通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和基质辅助激光解吸/电离质谱(MALDI MS)清楚地鉴别Glu-胰岛素(图3A-B)。如通过MALDI-MS所计算，两个葡萄糖分子缀合到每个胰岛素分子(葡萄糖与胰岛素的进料摩尔比:100:1)。天然胰岛素和Glu-胰岛素的圆二色(CD)谱实际上是可叠加的，这表明这些物质的二级结构即使基本上不相同也是相似的(图4A)。最重要的是，在链脲佐菌素(STZ)诱导的1型糖尿病小鼠体内施用之后，Glu-胰岛素缀合物和天然胰岛素在其生物活性特征方面并没有显示出任何显著差异(图4B)。简而言之，相对于未修饰的胰岛素，用葡萄糖修饰胰岛素对生物活性不具有统计上显著的影响。
GLUT是膜蛋白，其有助于葡萄糖沿浓度梯度运输穿过质膜(Mueckler,M.Eur.J.Biochem.219,713-725(1994))。葡萄糖转运蛋白1(GLUT1)是人RBC上的主要葡萄糖转运蛋白；而葡萄糖转运蛋白4(GLUT4)是成年小鼠的RBC中的主要葡萄糖转运蛋白(Vrhovac,I等，Period.Biol.116,131-138(2014)；Montel-Hagen,A等，Curr.Opin.Hematol.16,165-172(2009)；Montel-Hagen A等，Blood 112,4729-4738(2008))。将mRBC与Glu-胰岛素孵育过夜，并且使用共焦荧光显微镜来成像以确定Glu-胰岛素是否可以经由特异性葡萄糖-GLUT结合而结合到mRBC。如所预测，Glu-胰岛素已结合到mRBC(图5A)。此外，胰岛素和GLUT4的信号很好地共定位在mRBC膜上。流式细胞术结果进一步表明Glu-胰岛素对mRBC的附着借助于特异性葡萄糖-GLUT相互作用。在有葡萄糖修饰的情况下，胰岛素比天然胰岛素更容易附着于mRBC。另外，在存在过量的游离葡萄糖的情况下，Glu-胰岛素结合到mRBC的量降低(图5B)。通过ELISA测定来确定装载到mRBC的胰岛素。mRBC可以容易地与Glu-胰岛素偶联，高达每个细胞5*10-13g。此外，膜联蛋白V结合测定证实胰岛素结合不会对mRBC造成显著损害(图6A-B)。
为了检查葡萄糖响应性胰岛素释放性能，将附着Glu-荧光素(FITC)-胰岛素的mRBC在含有不同浓度的葡萄糖的PBS中孵育。如在共焦成像中所观察(图5C-D)，与未经处理的胰岛素-mRBC相比较，当用含400mg/dL葡萄糖的PBS处理30分钟后，由于胰岛素从mRBC脱离，mRBC膜上的胰岛素的荧光信号显著减少(图5C)。此外，将单个装载胰岛素的mRBC在共焦成像中随时间推移跟踪并且观察。如所预期，当用含400mg/dL葡萄糖的PBS处理时，与未经处理的胰岛素-mRBC相比较，mRBC膜上的胰岛素的荧光信号在30分钟内出现减少(图5D)。流式细胞术结果进一步证实mRBC上的胰岛素的信号随着葡萄糖浓度的增加而减少。在经过400mg/dL葡萄糖处理的mRBC上仅检测到少约50％的胰岛素信号(图5E-F)。接着，评价对变化的葡萄糖水平有响应的胰岛素释放特征，包括典型的高血糖水平(400mg/dL)、正常血糖水平(100和200mg/dL)和对照水平(0mg/dL)。通过ELISA测定来确定来自mRBC的胰岛素的释放量。如图5G所示，在2小时内从用400mg/dL葡萄糖孵育的mRBC释放了约50％的胰岛素，这显著高于与正常葡萄糖水平相关联的样品。这些结果也与上述流式细胞术数据一致。
重要的是，记录到胰岛素在暴露于高葡萄糖之后的快速释放(图5H)，这表明临床效果的潜力。另外，当葡萄糖浓度在数个循环内在正常与高血糖水平之间周期性地变化时，实现了胰岛素的脉冲式释放动力学性质(图5I)。释放率在前10分钟内增加到最大值，并且之后逐渐减小，这可以归因于与GLUT相互作用的Glu-胰岛素的逐渐耗竭。
实施例2.使用RBC进行的葡萄糖响应性胰岛素递送的体内研究
接着，在体内检查缀合了Glu-胰岛素的mRBC(胰岛素-mRBC)的葡萄糖响应性能。为了评价细胞载体的血液循环行为，对与FITC偶联的mRBC(含5x 107RBC的500μL PBS)装载Glu-胰岛素，并且之后静脉内注射到健康小鼠体内。在不同的时间点从尾部提取约3μL血液，并且之后将所述血液分散在具有抗凝剂的0.5mL PBS中。施加流式细胞术测量来确定血液样品中的胰岛素-mRBC(在FITC中呈阳性)的百分比。甚至是在注射后72小时(半衰期＝85.6小时)，所有收集的mRBC中的mRBC(已注射)的百分比似乎是稳定的，这表明了胰岛素-mRBC的稳定性(图7A-B)。
还评价了胰岛素-mRBC治疗STZ诱导的1型糖尿病小鼠的高血糖症的功效(例如，AA等，Science 193,415-417(1976))。通过静脉内注射胰岛素-mRBC、游离的胰岛素加mRBC、单独的Glu-胰岛素和PBS对照(各自为5mg/kg胰岛素或体积对照的剂量)来处理动物组。然后随时间监测经过处理的小鼠的BG水平。如图8A所示，对于用游离的胰岛素加mRBC和用Glu-胰岛素处理的小鼠，BG水平在1小时内稳定下降到低血糖水平(<70mg/dL)，并且在24小时内快速恢复到高血糖范围(约500mg/dL)。相比之下，用胰岛素-mRBC处理的小鼠体内的BG水平在至少24小时内降低并维持在约200mg/dL，并且在4天内逐渐增加，这表明了mRBC载体在循环中的高稳定性和持续的葡萄糖依赖性胰岛素释放。
为了进一步理解体内胰岛素释放的动力学性质，在施用胰岛素-mRBC之后1.5小时进行腹膜内葡萄糖耐量测试(IPGTT)(图8B)。如所示，在IPGTT之后，对照健康小鼠展现出BG水平的快速增加以及在2小时内到正常BG水平的恢复。在糖尿病小鼠中，经过胰岛素-mRBC处理的小鼠的BG水平显示出BG水平的延迟的增加，然后下降到约200mg/dL并且在2小时内维持正常血糖状态。在用游离的胰岛素+mRBC或用Glu-胰岛素处理的STZ-糖尿病小鼠体内，BG水平仅展现出短暂的响应。为了对葡萄糖对各种胰岛素制剂的响应定量(Yu J等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.112,8260-8265(2015)；Chou DH-C等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.112,2401-2406(2015))，对每个组计算了在90与200分钟之间的曲线下面积。与经过游离的胰岛素处理的小鼠相比较，经过胰岛素-mRBC处理的小鼠显示出对IPGTT的增强的响应性(图8C)。另外，在IPGTT之后通过ELISA随时间推移监测糖尿病小鼠的血浆胰岛素水平(图8D)。随着BG水平的增加，血清胰岛素水平紧随葡萄糖升高和降低到正常。
接着，在正常血糖条件下在健康小鼠中研究胰岛素-mRBC诱导低血糖症的潜力(图8E)。如所示，与经过胰岛素-mRBC处理的小鼠(胰岛素，1mg/kg)相比较，经过天然胰岛素+mRBC和Glu-胰岛素处理的小鼠显示出显著降低的BG水平。计算对应的低血糖指数来评价低血糖症的风险(Yu J等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.112,8260-8265(2015)；Chou DH-C等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.112,2401-2406(2015))。与对照组相比较，胰岛素-mRBC的处理显著降低了低血糖指数(图8F)。
就其胰岛素递送能力而言将来自幼龄(4周)相对于老龄(1年)小鼠的红细胞媒介物进行比较(图9)。有趣的是，幼龄mRBC比老龄mRBC具有更有效和更长久的抗糖尿病功效。这一结果可能归因于幼龄mRBC在循环中比老龄mRBC更稳定和更长的寿命(Shemin,D等，J.Biol.Chem.166,627-636(1946))。
实施例3.涂布RBC膜的PLGA纳米颗粒的葡萄糖响应性胰岛素递送
制作PLGA纳米颗粒并且对其涂布mRBC膜(RM)。图11示出了合成过程的示意图。如通过透射电子显微术(TEM)和动态光散射(DLS)所揭示，获得的RM-PLGA纳米颗粒是单分散的。TEM图像显示大多数PLGA NP以100nm的直径很好地涂布有mRBC膜(图12A-B和图13A-B)。在RM涂布之后，PLGA NP在DLS测量的直径中显示出略微增加，从145nm增加至160nm(图13C-D)。实施蛋白质印迹分析来验证GLUT4存在于涂布有RM的PLGA NP上(图14)。接着，可能经由特异性葡萄糖-GLUT相互作用将Glu-胰岛素附着于RM-PLGA NP。也通过共焦成像(图15)和ELISA测定证实了附着(负荷容量：2％)。如所预期，RM-PLGA纳米载体也以葡萄糖响应方式释放胰岛素(图12C)。进一步的体内研究表明，与游离的胰岛素+RM-PLGA NP相比较，胰岛素-RM-PLGA NP延长了维持BG水平的胰岛素效果并且降低注射后低血糖症的风险(图12D-G和图16A-B)。
实施例4.小鼠相对于人RBC作为Glu-胰岛素载体的比较
hRBC表达比mRBC更高水平的GLUT1。事实上，GLUT1占人红细胞膜中的总蛋白质量的10％(Vrhovac,I等，Period.Biol.116,131-138(2014))。因此，hRBC可能具有比mRBC更好的胰岛素递送能力。在多项测定中比较hRBC和mRBC以测试该假设。首先，检查胰岛素装载容量。将近60％的Glu-胰岛素附着于hRBC膜，而在mRBC上仅检测到20％的Glu-胰岛素(图10A)。其次，验证来自hRBC的葡萄糖响应性胰岛素释放(图10B)。更值得注意的是，胰岛素释放在PBS对照和低葡萄糖培养基中最少，这表明具有Glu-胰岛素的hRBC在正常血糖环境中比胰岛素-mRBC更稳定(图5F)并且有望用于临床研究。
实施例5.经由微针阵列贴剂递送GLUT1-Glu-胰岛素复合物
将GLUT1-胰岛素蛋白复合物装载到微针阵列(MN)贴剂中。为了测试葡萄糖触发的胰岛素释放，在含有如前所述的不同浓度的葡萄糖的PBS中孵育Glu-胰岛素和GLUT1的蛋白缀合物。在不同的时间点用离心过滤装置(MWCO＝10kDa)分离释放的胰岛素。如图17所示，在不存在葡萄糖的情况下，只会分离出很少的胰岛素。形成鲜明对比的是，当将游离的葡萄糖添加到系统中时，记录到葡萄糖浓度和时间依赖性胰岛素释放。接着，使用微模制方法来制作面积为9x 9mm2的呈15×15阵列的基于透明质酸(HA)的MN贴剂(Yu J等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.112,8260-8265(2015))。每个针具有圆锥形形状，具有600μm的高度并且尖端逐渐变细到5-μm的曲率半径，图18A-C。MN的机械强度被测定为0.65N/针，这足以在不断裂的情况下进行皮肤穿透，图19。
在使用STZ小鼠的体内研究中进一步研究了智能胰岛素贴剂(图18和图20)。与空白和装载游离的胰岛素的MN相比较，装载有GLUT1-胰岛素缀合物的MN极大地延长了维持BG水平的胰岛素效果(图18D)。葡萄糖耐量测试还表明大多数葡萄糖可以快速从血液中清除，这类似于与健康小鼠相关联的记录(图18E)。另外，在IPGTT之后观察到血浆胰岛素水平的峰值，这表明在体内实现了葡萄糖响应性胰岛素释放特征(图18F)。
为了进一步评价MN的体内葡萄糖控制能力，进行了MN的额外施用。与装载游离的胰岛素的MN相比较，额外的GLUT1-胰岛素MN施用并未导致BG下降到低血糖水平。相反，与一个剂量的MN施用相比较，它延长了响应于升高的BG而实现的治疗效果(图18G)。关于用GLUT1-胰岛素MN贴剂处理的健康小鼠的研究还证明了由GLUT1-胰岛素MN贴剂诱导的低血糖症的风险最小(图18H)。由MN贴剂处理的皮肤可以在MN移除之后8小时内快速恢复，而不会有任何明显的炎症(图21)。总而言之，GLUT1-胰岛素MN贴剂可以有助于胰岛素贮器的缓慢且受控的释放，以便在体内调节BG水平，而具有最低的低血糖症风险。
序列表
<110> 北卡罗来纳州立大学
<120> 葡萄糖响应性胰岛素递送组合物和方法
<130> 10620-014WO1
<150> US 62/278,614
<151> 2016-01-14
<160> 2
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 1
gcaaatgggt cgcggatcca tggagcccag cagc 34
<210> 2
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 2
cgagtgcggc cgcaagcttt cacacttggg agtcag 36

Claims (35)

1.一种组合物，所述组合物包含：
经葡萄糖修饰的胰岛素分子，所述胰岛素分子包含通过至少一个连接子分子缀合到至少一个葡萄糖部分的胰岛素部分，并且
其中所述经葡萄糖修饰的胰岛素分子被配置成可逆地结合葡萄糖结合结构，
其中所述葡萄糖结合结构在高葡萄糖条件下释放所述经葡萄糖修饰的胰岛素的一部分。
2.如权利要求1所述的组合物，所述组合物还包含所述葡萄糖结合结构，其中所述葡萄糖结合结构结合到所述经葡萄糖修饰的胰岛素分子。
3.如权利要求1或2所述的组合物，其中所述经葡萄糖修饰的胰岛素分子包含两个或更多个葡萄糖部分，其中每个葡萄糖部分通过不同的连接子分子缀合到所述胰岛素部分。
4.如权利要求3所述的组合物，其中所述经葡萄糖修饰的胰岛素分子包含两个葡萄糖部分。
5.如权利要求1-4中任一项所述的组合物，其中所述连接子分子是合成的。
6.如权利要求1-5中任一项所述的组合物，其中所述连接子分子包含马来酰亚胺基团。
7.如权利要求1-6中任一项所述的组合物，其中所述连接子分子包含聚乙二醇(PEG)基团。
8.如权利要求1-7中任一项所述的组合物，其中所述葡萄糖结合结构是红细胞。
9.如权利要求8所述的组合物，其中所述红细胞是人的。
10.如权利要求1-7中任一项所述的组合物，其中所述葡萄糖结合结构包含附着于纳米颗粒的红细胞膜。
11.如权利要求10所述的组合物，其中所述纳米颗粒的直径为50-150纳米。
12.如权利要求10或11所述的组合物，其中所述纳米颗粒包含PLGA。
13.如权利要求1-7中任一项所述的组合物，其中所述葡萄糖结合结构包含GLUT蛋白。
14.如权利要求13所述的组合物，其中所述GLUT蛋白为GLUT1蛋白。
15.如权利要求1-14中任一项所述的组合物，其中高葡萄糖条件大于或等于200mg/dL。
16.如权利要求1-15中任一项所述的组合物，其中所述葡萄糖结合结构在低葡萄糖条件下结合所述经葡萄糖修饰的胰岛素，其中低葡萄糖条件是从0直至200mg/dL。
17.如权利要求16所述的组合物，其中所述葡萄糖结合结构被配置成在低葡萄糖条件下在至少50天内结合所述经葡萄糖修饰的胰岛素。
18.一种控制受试者体内的葡萄糖水平的方法，所述方法包括：
向患有糖尿病的受试者施用治疗有效量的组合物，所述组合物包含：
经葡萄糖修饰的胰岛素分子，所述胰岛素分子包含通过至少一个连接子分子缀合到至少一个葡萄糖部分的胰岛素部分，
其中所述经葡萄糖修饰的胰岛素分子结合到葡萄糖结合结构，并且
其中所述葡萄糖结合结构在高葡萄糖条件下释放所述经葡萄糖修饰的胰岛素的一部分。
19.如权利要求18所述的方法，其中所述经葡萄糖修饰的胰岛素分子包含两个或更多个葡萄糖部分，其中每个葡萄糖部分通过不同的连接子分子缀合到所述胰岛素部分。
20.如权利要求19所述的方法，其中所述经葡萄糖修饰的胰岛素分子包含两个葡萄糖部分。
21.如权利要求18-20中任一项所述的方法，其中所述连接子分子是合成的。
22.如权利要求18-21中任一项所述的方法，其中所述连接子分子包含马来酰亚胺基团。
23.如权利要求18-22中任一项所述的方法，其中所述连接子分子包含聚乙二醇(PEG)基团。
24.如权利要求18-23中任一项所述的方法，其中所述葡萄糖结合结构是红细胞。
25.如权利要求24所述的方法，其中所述红细胞是人的。
26.如权利要求18-23中任一项所述的方法，其中所述葡萄糖结合结构包含附着于纳米颗粒的红细胞膜。
27.如权利要求26所述的方法，其中所述纳米颗粒的直径为50-150纳米。
28.如权利要求26或27所述的方法，其中所述纳米颗粒包含PLGA。
29.如权利要求18-28中任一项所述的方法，其中高葡萄糖条件大于或等于200mg/dL。
30.如权利要求18-29中任一项所述的方法，其中所述葡萄糖结合结构在低葡萄糖条件下结合所述经葡萄糖修饰的胰岛素，其中低葡萄糖条件是从0直至200mg/dL。
31.如权利要求30所述的方法，其中所述葡萄糖结合结构被配置成在低葡萄糖条件下在至少50天内结合所述经葡萄糖修饰的胰岛素。
32.如权利要求18-31中任一项所述的方法，其中所述组合物使用透皮贴剂来施用于所述受试者。
33.如权利要求18-32中任一项所述的方法，其中所述组合物使用微针阵列贴剂来施用于所述受试者。
34.如权利要求18-33中任一项所述的方法，其中所述受试者患有I型糖尿病。
35.如权利要求18-33中任一项所述的方法，其中所述受试者患有II型糖尿病。
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