CN111447942A - 用于葡萄糖响应性胰岛素递送的经葡萄糖转运蛋白抑制剂修饰的胰岛素 - Google Patents

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Abstract

本文公开了一种基于经葡萄糖修饰的胰岛素与红细胞(或红血细胞、RBC)上的葡萄糖转运蛋白(GLUT)之间的相互作用的葡萄糖响应性胰岛素递送体系。在与葡萄糖转运蛋白的竞争性抑制剂缀合后，胰岛素能够有效地结合至RBC膜。在高血糖的情况下所述结合是可逆的，从而导致体内胰岛素的快速释放和随后的血糖(BG)水平下降。

Description

用于葡萄糖响应性胰岛素递送的经葡萄糖转运蛋白抑制剂修 饰的胰岛素
本申请要求2017年10月10日提交的美国临时专利申请号62/570,501的优先权权益，其全文以引用方式并入本文。
背景技术
糖尿病目前影响着全球4.15亿人口，并且预计到2040年这一数字将增加到6.42亿。胰岛素对于1型糖尿病的存活至关重要，并且通常也是治疗2型糖尿病所需的，以便控制血糖并预防并发症。然而，传统的外源性胰岛素施用无法与由朗格罕斯胰岛细胞内的β-细胞对血糖实现的精细调节相匹配，其中内源性胰岛素分泌通过新陈代谢与葡萄糖转运关联起来。血糖控制不良导致高糖尿病并发症风险，诸如截肢、失明和肾衰竭。此外，低血糖可导致行为和认知障碍、癫痫、昏迷、脑损伤或死亡。因此，为了改善糖尿病患者的血糖控制和生活质量，非常需要“智能的”葡萄糖响应性胰岛素递送装置或制剂，其可以模拟β-细胞的功能来调节胰岛素“分泌”。
这种“智能的”疗法通常整合了葡萄糖感测或转换模块以及感测/转换激活的胰岛素释放模块。例如，穿戴式闭环电子/机械泵结合连续葡萄糖监测电化学传感器和外部胰岛素输注泵。这些系统历来受到滞后的血糖与小间隙的平衡、进入循环的胰岛素吸收和生物污染的限制。自20世纪70年代以来也已经广泛地探索了基于合成材料的葡萄糖响应性制剂。经常利用三种经典策略，通常包括不同的葡萄糖感测部分：葡萄糖氧化酶、葡萄糖结合蛋白(GPB)(例如，ConA)(14)和苯基硼酸(PBA)，以实现葡萄糖触发。已经开发了各种制剂，诸如大块水凝胶、微凝胶、基于乳液的纳米颗粒和自组装囊泡，以对高血糖状态作出溶胀、收缩、降解或解离的响应，以便促进胰岛素的释放。尽管有这些颇具前景的策略，但是要呈现能对升高的血糖(BG)水平快速作出响应，从而严密地复制健康胰腺的动力学的系统仍然存在挑战。此外，那些合成系统的免疫响应、在生理环境中的稳定性和长期毒性需要进一步调查。
发明内容
本文公开了葡萄糖响应性胰岛素递送组合物，所述递送组合物可以用于控制受试者体内的葡萄糖水平。特别地，公开了一种组合物，所述组合物包含葡萄糖转运蛋白结合结构，该葡萄糖转运蛋白结合结构包含与葡萄糖转运蛋白的至少一种竞争性抑制剂缀合的胰岛素部分。在这些实施例中，该葡萄糖转运蛋白结合结构被配置成可逆地结合葡萄糖转运蛋白，并且胰岛素可逆地结合葡萄糖转运蛋白的竞争性抑制剂，使得经葡萄糖修饰的胰岛素在高糖条件下被内源性葡萄糖置换。这导致产生了经葡萄糖修饰的胰岛素分子的生物利用度，在此情况下它可以促进葡萄糖代谢。由于释放率取决于葡萄糖浓度，可以严格地调节葡萄糖水平。
胰岛素部分可以是任何生物活性形式的胰岛素，诸如人胰岛素或胰岛素同系物。胰岛素优选为重组蛋白。胰岛素可以是速效的(例如，赖脯胰岛素、门冬胰岛素、赖谷胰岛素)、短效的(普通胰岛素、velosulin、诺和灵)、中效的(NPH)或长效的(甘精胰岛素、地特胰岛素、德谷胰岛素)。在一些实施例中，所公开的组合物包含具有不同形式的胰岛素部分的经葡萄糖修饰的胰岛素分子的混合物。
据了解并在此设想，该竞争性抑制剂或葡萄糖转运蛋白可以是与葡萄糖转运蛋白结合的任何竞争性抑制剂，其亲和性和/或亲和力大于D-葡萄糖，并且能够在体内可逆地结合葡萄糖转运蛋白。例如，葡萄糖转运蛋白的竞争性抑制剂可以是毛喉素或In2。
在一些情况下，使用者在向受试者施用之前在适合于经葡萄糖修饰的胰岛素分子可逆地结合葡萄糖结合结构的条件下将包含经葡萄糖修饰的胰岛素分子的组合物与葡萄糖结合结构混合。在其他实施例中，所述组合物包含已结合到葡萄糖转运蛋白的竞争性抑制剂的胰岛素分子。
葡萄糖转运蛋白的竞争性抑制剂可以是能够在体内可逆地结合葡萄糖转运蛋白的任何生物相容性分子或底物。据了解并在此设想，葡萄糖转运蛋白可以包含任何葡萄糖转运蛋白(GLUT)蛋白质家族成员(包括但不限于GLUT1、GLUT2、GLUT3、GLUT4、GLUT5、GLUT6、GLUT7、GLUT8、GLUT9、GLUT10、GLUT11、GLUT12、GLUT13和GLUT14)，它们是促进葡萄糖在质膜上运输的膜蛋白。GLUT1是在红血细胞(红细胞)中以最高水平表达的葡萄糖转运蛋白。因此，在特定实施例中，该葡萄糖结合结构是红血细胞(红细胞)，诸如人红血细胞。然而，在其他实施例中，该葡萄糖结合结构仅包含红细胞的质膜或包含GLUT蛋白的其他细胞。例如，该质膜可以附着于生物相容性纳米颗粒。在一些实施例中，合适的纳米颗粒的平均直径为约50至约150纳米，包括约50、60、70、80、90、100、110、120、130、140和150纳米。在一些实施例中，该纳米颗粒包含聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)共聚物。在一些实施例中，该纳米颗粒由葡聚糖形成。在一些实施例中，该纳米颗粒由透明质酸形成。在一些实施例中，该纳米颗粒是脂质体。
该葡萄糖转运体蛋白结合结构被配置为在高浓度葡萄糖条件下将葡萄糖转运蛋白的竞争性抑制剂从葡萄糖转运蛋白置换，而胰岛素从葡萄糖转运蛋白的竞争性抑制剂置换。在一些实施例中，该葡萄糖转运蛋白结合结构被配置成当葡萄糖水平达到或超过约200mg/dL时，该葡萄糖转运蛋白的竞争性抑制剂从该葡萄糖转运蛋白置换并释放胰岛素。虽然该葡萄糖转运蛋白的竞争性抑制剂仍然可以在低葡萄糖水平下从葡萄糖转运蛋白中置换，但是它是在较低的速率下进行的。因此，在一些实施例中，该葡萄糖转运蛋白的竞争性抑制剂优选地在低浓度葡萄糖生理环境，例如，葡萄糖浓度为0至200mg/dL中结合葡萄糖转运蛋白。在优选的实施例中，该葡萄糖转运蛋白的竞争性抑制剂被配置成在这些低浓度葡萄糖条件下稳定地结合该葡萄糖转运蛋白至少10、20、30、40或50天。在一些实施例中，可以通过接头性质在激素与葡萄糖衍生物之间调整这些动力学。
本文还公开了一种控制受试者血糖水平的方法，该方法包括：向患有糖尿病的受试者施用治疗有效量的组合物，所述组合物包含葡萄糖转运蛋白结合结构，所述葡萄糖转运蛋白结合结构包括与葡萄糖转运蛋白的至少一种竞争性抑制剂结合的胰岛素部分，其中所述葡萄糖转运蛋白结合结构被配置为可逆地结合葡萄糖转运蛋白，其中该葡萄糖结合结构在高浓度葡萄糖条件下释放经葡萄糖修饰的胰岛素的一部分。
所公开的组合物可以适合于暴露于循环中的葡萄糖的任何方式施用。在一些实施例中，所述组合物通过透皮贴剂来递送。例如，所述组合物可以通过微针阵列贴剂来递送。在其他方面，所述组合物可以口服。
在附图和以下说明中阐述了本发明的一个或多个实施例的细节。本发明的其他特征、目的和优点在说明和附图以及权利要求中将显而易见。
附图说明
图1显示了基于活细胞上的GLUT的葡萄糖响应性胰岛素递送系统的示意图。
图2显示了毛喉素-NH2的合成路线。
图3显示了In2-NH2的合成路线。
图4显示了用游离胰岛素、胰岛素-毛喉素或胰岛素-In2治疗的1型糖尿病小鼠的血糖水平。以PBS为对照。胰岛素结合物的剂量设置为300IU/kg，游离胰岛素的剂量设置为150IU/kg，以避免严重低血糖。误差线表示三个独立实验(n＝3)的S.D。
图5显示了葡萄糖或细胞松弛素B抑制胰岛素-F在红细胞血影上的葡萄糖结合。
图6显示了皮下注射胰岛素或胰岛素-F的糖尿病小鼠的活体图像。将胰岛素或胰岛素-F用Cy5标记。
图7显示了多重葡萄糖耐受性试验。皮下注射胰岛素-F。胰岛素结合物的剂量设置为400IU/kg。误差线表示三个独立实验(n＝5)的S.D。
具体实施方式
定义
本申请中使用的术语应解释为对本领域普通技术人员具有普通和典型含义。然而，申请人希望以下术语具有以下具体定义。
如本说明书和权利要求书中所用，单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数指代物，除非上下文另外明确规定。例如，术语“一个单元”包括多个单元，其中包括它们的混合物。
如本领域的普通技术人员所理解的，术语“约”和“大约”被定义为“接近”。在一个非限制性实施例中，术语被定义为在10％以内。在另一个非限制性实施例中，术语被定义为在5％以内。在另一个非限制性实施例中，术语被定义为在1％以内。
蛋白质的“活性”，包括与“生物活性”有关的那些，其中包括例如转录、翻译、细胞内易位、分泌、激酶磷酸化、蛋白酶切割和/或与其他蛋白质的同嗜性和异嗜性结合。
术语“给药”是指口服、局部、静脉内、皮下、经皮、透皮、肌肉内、关节内、肠胃外、小动脉内、皮内、脑室内、颅内、腹膜内、病灶内、鼻内、直肠、阴道给药，通过吸入或通过植入型储存器。可使用透皮微针-阵列贴片进行给药。术语“肠胃外”包括皮下、静脉内、肌肉内、关节内、滑膜内、胸骨内、鞘内、肝内、病灶内和颅内注射或输注技术。
“生物相容的”通常是指材料及其任何代谢物或降解产物通常对接受者无毒并且不对受试者造成任何显著的副作用。
“组合物”意图包括活性剂与另一种惰性(例如，可检测的试剂或标记)或活性(诸如助剂)化合物或组合物的组合。
如本文所用，术语“包含”旨在表示组合物和方法包括所述的元素，但是不排除其他元素。当用于定义组合物和方法时，“基本上由…组成”应指排除对组合具有任何重要意义的其他元素。因此，基本上由本文所定义的元素组成的组合物不排除来自分离和纯化方法的痕量污染物和药学上可接受的载体，诸如磷酸盐缓冲盐水、防腐剂等等。“由…组成”应指排除多于其他成分的痕量元素和用于施用本发明的组合物的实质性方法步骤。由这些过渡术语中的每个所定义的实施例都在本发明的范围内。
“对照”是在实验中用于比较目的的替代受试者或样本。对照可为“阳性对照”或“阴性对照”。
如本文所用，“缀合”是指不可逆的结合相互作用。
如本文所用，“置换”指代通过对特定蛋白质结构域具有亲和力而对被置换的肽、化学物质或核酸不具有亲和力的化学物质、肽或核酸而中断例如蛋白质结构域与肽、蛋白质结构域与化学物质、蛋白质结构域与核酸序列之间的分子或化学相互作用。
“有效量”是足以影响有益或所需结果的量。有效量可以一种或多种施用方法、应用或剂量来施用。
如本文所用，术语“高浓度葡萄糖条件”指代葡萄糖浓度大于或等于200mg/dL的环境。例如，“高血糖水平”指代血流中的葡萄糖水平大于或等于200mg/dL。在一些实施例中，高浓度葡萄糖条件是200-400mg/dL。在其他实施例中，高浓度葡萄糖条件是300-400mg/dL。
如本文所用，“接头”是指连接相邻分子的分子。一般来讲，除连接相邻分子或保持它们之间的一些最小距离或其他空间关系之外，接头无特定的生物活性。在一些情况下，可选择接头以影响或稳定相邻分子的某些特性，诸如分子的折叠、净电荷或疏水性。
如本文所用，术语“低浓度葡萄糖条件”指代葡萄糖浓度为0至200mg/dL的环境。例如，“低血糖水平”指代血流中的葡萄糖水平小于200mg/dL。
术语“肽”、“蛋白质”和“多肽”可互换使用，是指包含两个或更多个氨基酸的天然或合成分子，所述氨基酸通过一个氨基酸的羧基与另一个氨基酸的α-氨基连接。
术语“载体”或“药学上可接受的载体”意指可用于制备通常安全且无毒的药物或治疗组合物的载体或赋形剂，并且包括兽医和/或人类药用或治疗用的药物可接受的载体。如本文所用，术语“载体”或“药学上可接受的载体”包括磷酸盐缓冲盐水溶液、水、乳液(诸如油/水或水/油乳液)和/或各种类型的润湿剂。如本文所用，术语“载体”包括任何赋形剂、稀释剂、填充剂、盐、缓冲液、稳定剂、增溶剂、脂质或本领域中熟知的用于药物制剂的其他材料，并且如下文所详述。
如本文所用，术语“聚合物”是指相对高分子量的天然或合成有机化合物，其结构可由重复的小单元、单体(例如，聚乙烯、橡胶、纤维素)表示。合成聚合物通常由单体的加成或缩聚形成。如本文所用，术语“共聚物”是指由两种或更多种不同的重复单元(单体残基)形成的聚合物。以举例的方式并且非限制性地，共聚物可为交替共聚物、无规共聚物、嵌段共聚物或接枝共聚物。还可设想，在某些方面，嵌段共聚物的各种嵌段链段本身可包含共聚物。
“引物”是短的多核苷酸，通常具有游离的3'-OH基团，其通过与靶标杂交而结合到感兴趣样品中可能存在的靶标或“模板”，并且之后促进与靶标互补的多核苷酸的聚合。“聚合酶链式反应”(“PCR”)是使用由“上游”和“下游”引物组成的“引物对”或“引物组”、以及聚合催化剂，诸如DNA聚合酶，通常是热稳定聚合酶来产生靶多核苷酸的复制拷贝的反应。用于PCR的方法是本领域熟知的，并且例如在“PCR:A PRACTICAL APPROACH”(M.MacPherson等人，IRL Press at Oxford University Press(1991))中教导了所述方法。产生多核苷酸的复制拷贝的所有过程，诸如PCR或基因克隆在本文中被统称为“复制”。引物也可作为杂交反应的探针，诸如Southern或Northern杂交分析。Sambrook等人，同上。
范围可在本文中被表示为从“约”一个特定值和/或至“约”另一个特定值。当表达此类范围时，另一个实施例包括从一个特定值和/或至另一个特定值。相似地，在利用前词“约”将值表示为近似值时，应当理解，该特定值形成另一个实施例。还应当理解，每个范围的端点在相对于另一个端点和独立于另一个端点方面都是显著的。还应当理解，本文公开了许多值，并且每个值在本文中除值本身之外还被公开为“约”该特定值。例如，如果公开了值“10”，则还公开了“约10”。
术语“治疗有效量”或“治疗有效剂量”指代由研究者、兽医、医生或其他临床医师在一般时间段内所寻求的将引起组织、系统、动物或人体的生物学或医学反应的组合物，诸如结合到葡萄糖结合结构的经葡萄糖修饰的胰岛素的量。在一些实施例中，所需反应是对I型糖尿病的控制。在一些实施例中，所需反应是对II型糖尿病的控制。在一些情况下，所需的生物学或医学反应在数天、数周或数年的时段内向受试者施用多剂量的组合物之后实现。
术语“受试者”在本文中被定义为包括动物诸如哺乳动物，包括但不限于：灵长类动物(例如，人)、奶牛、绵羊、山羊、马、狗、猫、兔、大鼠、小鼠等等。在一些实施例中，受试者是人。
用DNA“转化”细胞有机体意指将DNA引入有机体中，使得DNA的至少一部分可作为染色体外因子或借助染色体整合而复制。用DNA“转染”细胞有机体指代细胞或有机体接纳DNA，例如表达载体，而不管实际上是否表达任何编码序列。术语“经转染的宿主细胞”和“经转化的”指代其中引入DNA的细胞。所述细胞被称为“宿主细胞”并且它可以是原核的或真核的。典型的原核宿主细胞包括各种大肠杆菌菌株。典型的真核宿主细胞是哺乳动物，诸如中国仓鼠卵巢或人源细胞。引入的DNA序列可以来自与宿主细胞相同的物种或与宿主细胞不同的物种，或者它可以是含有一些外源和一些同源DNA的杂种DNA序列。
如本文所用，术语“治疗”、“治疗过程”、“治疗方法”及其语法变体包括部分或完全延迟、缓解、减轻或减小疾病或病症的一种或多种伴随症状的强度和/或缓解、减轻或阻止一种或多种疾病或病症的原因。根据本发明的治疗可以预防地、防御地、姑息地或矫正地应用。预防性治疗是在发病前(例如，在出现明显的癌症迹象之前)、在早期发作期间(例如，在癌症的初始体征和症状之后)或在癌症的确定发展之后向受试者施用。预防性给药可在感染症状出现之前数天至数年发生。
在一些情况下，术语“治疗(treat/treating/treatment)”以及其语法变型包括与治疗受试者之前相比较或与这类症状在普通或研究人群中的发生率相比较控制血糖水平并且降低糖尿病症状的严重程度。
当提及多肽(包括抗体)或受体时如本文所用的术语“特异地结合”指代对于蛋白质和其他生物产物的异源群体中的蛋白质或多肽或受体的存在来说起到决定作用的结合反应。因此，在指定条件(例如，在抗体情况下为免疫测定条件)下，当指定的配体或抗体未以显著量结合到存在于样品中的其他蛋白质，或结合到配体或抗体在有机体中可能会接触的其他蛋白质时，所述指定的配体或抗体“特异地结合”至其特定“靶标”(例如，抗体特异地结合到内皮细胞抗原)。通常，“特异地结合”第二分子的第一分子对该第二分子具有大于约105M-1(例如，106M-1、107M-1、108M-1、109M-1、1010M-1、1011M-1和1012M-1或更大)的亲和常数(Ka)。
组合物和方法
本文公开了用于治疗糖尿病的组合物和方法。所述组合物包括葡萄糖转运蛋白结合结构，所述葡萄糖转运蛋白结合结构包括与葡萄糖转运蛋白的至少一种竞争性抑制剂缀合的胰岛素部分。
胰岛素部分可以是任何生物活性形式的胰岛素，诸如人胰岛素或胰岛素同系物。胰岛素优选为重组蛋白。胰岛素可以是速效的(例如，赖脯胰岛素、门冬胰岛素、赖谷胰岛素)、短效的(普通胰岛素、velosulin、诺和灵)、中效的(NPH)或长效的(甘精胰岛素、地特胰岛素、德谷胰岛素)。在一些实施例中，所公开的组合物包含具有不同形式的胰岛素部分的经葡萄糖修饰的胰岛素分子的混合物。
据了解并在此设想，该葡萄糖转运蛋白的竞争性抑制剂可以是与葡萄糖转运蛋白结合的任何竞争性抑制剂，其亲和性和/或亲和力大于D-葡萄糖，并且能够在体内可逆地结合葡萄糖转运蛋白。例如，该葡萄糖转运蛋白的竞争性抑制剂可以是细胞松弛素B、根皮素、毛喉素或In2。葡萄糖转运蛋白的竞争性抑制剂可以是能够在体内可逆地结合葡萄糖转运蛋白的任何生物相容性分子或底物。据了解并在此设想，葡萄糖转运蛋白可以包含任何葡萄糖转运蛋白(GLUT)蛋白质家族成员(包括但不限于GLUT1、GLUT2、GLUT3、GLUT4、GLUT5、GLUT6、GLUT7、GLUT8、GLUT9、GLUT10、GLUT11、GLUT12、GLUT13和GLUT14)，它们是促进葡萄糖在质膜上运输的膜蛋白。
在一些情况下，使用者在向受试者施用之前在适合于经葡萄糖修饰的胰岛素分子可逆地结合葡萄糖结合结构的条件下将包含经葡萄糖修饰的胰岛素分子的组合物与葡萄糖结合结构混合。在其他实施例中，所述组合物包含已结合到葡萄糖转运蛋白的竞争性抑制剂的胰岛素分子。
包含葡萄糖转运蛋白的一种或多种竞争性抑制剂和胰岛素的葡萄糖转运蛋白结合结构包括但不限于诸如细胞、细胞膜、纳米颗粒和微粒等结构。因此，在一些实施方式中，该葡萄糖结合结构是细胞。该细胞可以是任何细胞类型、人类、哺乳动物。在一些实例中，用作葡萄糖结合结构的细胞是人红血细胞。有利的是，可从受试者中提取自体衍生细胞，在低浓度葡萄糖(结合)条件下暴露于经葡萄糖修饰的胰岛素，然后将其送回同一受试者。然而，在高浓度葡萄糖条件下，这些细胞不需要自身衍生，就可以发挥释放葡萄糖转运蛋白-胰岛素结合竞争性抑制剂的功能。
GLUT1是在红血细胞(红细胞)中以最高水平表达的葡萄糖转运蛋白。因此，在特定实施例中，该葡萄糖结合结构是红血细胞(红细胞)，诸如人红血细胞。然而，在其他实施例中，该葡萄糖结合结构仅包含红细胞的质膜或包含GLUT蛋白的其他细胞。例如，该质膜可以附着于生物相容性纳米颗粒。在其他实施方式中，该葡萄糖转运蛋白结合结构是附着于纳米颗粒或微粒的红血细胞膜。该纳米颗粒可以有任何适当的测量。例如，纳米颗粒的直径可以从5至500纳米不等。在一些实施方式中，纳米颗粒的直径在50-150纳米之间。在一些实施例中，合适的纳米颗粒的平均直径为约50至约150纳米，包括约50、60、70、80、90、100、110、120、130、140和150纳米。该纳米颗粒也可以是任何适当的材料或物质，并且在一些实施方式中，是聚乳酸-乙醇酸(PLGA)纳米颗粒。例如，PLGA纳米颗粒(NP)可以使用如下所述的类似方法涂覆RBC膜(RM-PLGA)。与完整的mRBC一样，葡萄糖转运蛋白-胰岛素的竞争性抑制剂也能与RM-PLGA NP特异性结合并从这些纳米颗粒中释放胰岛素，并且所述释放可以通过BG介导的方式自我调节。其他纳米材料或纳米颗粒可以用作PLGA的替代品或添加物。其他可能的纳米材料或纳米颗粒可包括聚合材料(例如，葡聚糖或透明质酸)、脂质体、和/或无机纳米颗粒。
在一些实施方式中，该葡萄糖转运蛋白结合结构可包含葡萄糖转运蛋白的两个或更多竞争性抑制剂。在一些实施方式中，每个葡萄糖转运蛋白竞争性抑制剂通过不同的接头分子与胰岛素部分缀合。该接头分子可以是任何天然或合成分子，用于将葡萄糖部分附着于胰岛素部分。在一些实例中，该接头分子包括马来酰亚胺基团或马来酰亚胺-硫醇加合物。在特定实例中，马来酰亚胺基团被添加到葡萄糖分子，硫醇基团被添加到胰岛素分子。然后马来酰亚胺葡萄糖和硫基化胰岛素反应形成葡萄糖修饰胰岛素分子，其中马来酰亚胺硫醇加合物充当接头分子。或者，或者另外，该接头分子可以包括间隔物。该间隔物可以是聚合物链，诸如聚乙二醇(PEG)链或任何其他合适聚合物链。
本发明包括基于葡萄糖转运蛋白的竞争性抑制剂和葡萄糖转运蛋白之间的可逆相互作用的葡萄糖响应性胰岛素递送的组合物。这种结合是可逆的，在高浓度葡萄糖条件下，胰岛素可以从红细胞中释放出来。因此，本文公开了葡萄糖响应性胰岛素系统，其中葡萄糖转运蛋白的竞争性抑制剂被配置成可逆地结合葡萄糖转运蛋白，在高浓度葡萄糖条件下释放葡萄糖转运蛋白的竞争性抑制剂。这种释放的潜在机制是，由于游离葡萄糖与GLUT的竞争性相互作用，葡萄糖转运蛋白-胰岛素(CIG-Ins)的竞争性抑制剂被置换。人RBC作为血管中氧的天然载体，其寿命为100-120天。因此，这些天然的生物相容性载体可以延长药物在血液中的循环。在下面的实例中，静脉(i.v.)注射小鼠RBC(mRBC)和CIG-In与化学诱导的I型小鼠的游离胰岛素相比，能延长胰岛素维持血糖水平(BGL)在正常范围内的治疗效果。通过葡萄糖耐受性试验观察体内葡萄糖响应行为。另一种施用策略包括：1)涂有RBC膜并装载经葡萄糖修饰的胰岛素可注射聚合物纳米颗粒(直径约100纳米)；以及2)装载外源性表达的GLUT和葡萄糖转运蛋白结合结构的复合物的微针(MN)贴剂平台。
如上所述，葡萄糖转运蛋白的竞争性抑制剂可被配置成可逆地结合葡萄糖转运蛋白结合结构。类似地，该胰岛素部分可以被配置成可逆地结合葡萄糖转运蛋白的竞争性抑制剂。可逆结合可以通过葡萄糖和一个或多个葡萄糖结合部分之间的非共价结合来实现。在一些实施方式中，该葡萄糖转运蛋白通过非共价结合(诸如受体-配体结合相互作用)与葡萄糖转运蛋白的竞争性抑制剂结合。葡萄糖转运蛋白的非限制性实例是GLUT或SLC2A家族的所有成员，包括GLUT1、GLUT2、GLUT3、GLUT4、GLUT5、GLUT6、GLUT7、GLUT8、GLUT9、GLUT10、GLUT11、GLUT12、GLUT13、GLUT14和SLC2A13。
该葡萄糖转运体蛋白结合结构被配置为在高浓度葡萄糖条件下将葡萄糖转运蛋白的竞争性抑制剂从葡萄糖转运蛋白置换，而胰岛素从葡萄糖转运蛋白的竞争性抑制剂置换。在一些实施例中，该葡萄糖转运蛋白结合结构被配置成当葡萄糖水平达到或超过约200mg/dL时，该葡萄糖转运蛋白的竞争性抑制剂从该葡萄糖转运蛋白置换并释放胰岛素。虽然该葡萄糖转运蛋白的竞争性抑制剂仍然可以在低葡萄糖水平下从葡萄糖转运蛋白中置换，但是它是在较低的速率下进行的。因此，在一些实施例中，该葡萄糖转运蛋白的竞争性抑制剂优选地在低浓度葡萄糖生理环境，例如，葡萄糖浓度为0至200mg/dL中结合葡萄糖转运蛋白。在优选的实施例中，该葡萄糖转运蛋白的竞争性抑制剂被配置成在这些低浓度葡萄糖条件下稳定地结合该葡萄糖转运蛋白至少10、20、30、40或50天。在一些实施例中，可以通过接头性质在激素与葡萄糖衍生物之间调整这些动力学。
该葡萄糖转运蛋白结合结构被配置成在高浓度葡萄糖条件下释放葡萄糖转运蛋白的竞争性抑制剂。这有助于释放一部分葡萄糖转运蛋白-胰岛素的竞争性抑制剂，例如，当血糖水平上升到一定阈值以上。例如，在高浓度葡萄糖条件下，10％-95％的经葡萄糖修饰的胰岛素分子可从葡萄糖结合结构中释放，包括10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的经葡萄糖修饰的胰岛素。如本文所用，高浓度葡萄糖条件被认为大于或等于200mg/dL。在一些实施例中，高浓度葡萄糖条件是200-400mg/dL。在其他实施例中，高浓度葡萄糖条件是300-400mg/dL。低浓度葡萄糖条件被认为低于200mg/dL。虽然该葡萄糖转运蛋白的竞争性抑制剂仍然可以在低葡萄糖水平下从葡萄糖转运蛋白中置换，但是它是在较低的速率下进行的。因此，在一些实施例中，该葡萄糖转运蛋白的竞争性抑制剂优选地在低浓度葡萄糖生理环境，例如，葡萄糖浓度为0至200mg/dL中结合葡萄糖转运蛋白。在优选的实施例中，该葡萄糖转运蛋白的竞争性抑制剂被配置成在这些低浓度葡萄糖条件下稳定地结合该葡萄糖转运蛋白至少10、20、30、40或50天。在一些实施例中，可以通过接头性质在激素与葡萄糖衍生物之间调整这些动力学。
在一些实施方式中，在低浓度葡萄糖条件下，该葡萄糖转运蛋白结合结构被配置成结合该葡萄糖转运蛋白至少50天。在一些实施方式中，如果葡萄糖条件保持较低，该葡萄糖转运蛋白结合结构可以结合葡萄糖转运蛋白更长的时间。例如，红血细胞的寿命为100-120天。在低浓度葡萄糖条件下，红血细胞携带的葡萄糖转运蛋白-胰岛素的竞争性抑制剂可能在细胞载体的寿命期间保持结合。
本文还公开了使用葡萄糖转运蛋白-胰岛素组合物的竞争性抑制剂治疗糖尿病的方法。治疗糖尿病的方法包括首先施用如上述的任何一种组合物，即，治疗糖尿病的方法包括提供包括葡萄糖转运蛋白结合结构的组合物，其中葡萄糖转运蛋白的竞争性抑制剂与胰岛素结合。在一些实施方式中，对患有或怀疑患有糖尿病的受试者施用治疗有效量的结合到葡萄糖结合结构上的经葡萄糖修饰的胰岛素分子。在一些实施方式中，包含与葡萄糖转运蛋白的至少一种竞争性抑制剂缀合的胰岛素部分的治疗有效量的葡萄糖转运蛋白结合结构可经由透皮贴剂(诸如微针阵列贴剂)施用。在其他方面，该组合物可以口服。
要呈现葡萄糖响应型胰岛素递送制剂的快速响应、长期持久性和生物相容性的组合具有挑战性。本文描述的经葡萄糖修饰的胰岛素策略呈现了有效的方法。在一些实例中，这些策略可以扩展到个性化细胞疗法，和/或与各种治疗剂整合来用于治疗不同疾病，伴有长期持续释放和生理信号介导的受控释放的优点。
实例
理想的胰岛素制剂应能根据BGL释放胰岛素，并对其进行严格地调节，同时避免致命的低血糖。因此，模拟β-细胞功能的葡萄糖响应性胰岛素制剂适合治疗糖尿病。近年来，基于葡萄糖氧化酶(GOx)、苯硼酸(PBA)和葡萄糖结合蛋白的葡萄糖响应性递送系统得到了广泛的研究。然而，这些方法遇到了一些挑战，包括生物相容性差、胰岛素装载效率和含量低、响应速率延迟和操作过程复杂。
膜上的GLUT有助于葡萄糖从细胞外基质运输到细胞内。因此，GLUT被认为是治疗2型糖尿病和癌症的靶点。葡萄糖转运蛋白几乎分布在所有活细胞上以维持能量供应。包括D-葡萄糖在内的其他小分子，如细胞松弛素B、毛喉素或根皮素等都是GLUT的底物，具有明显高于D-葡萄糖的亲和力，在GLUT和细胞代谢研究中得到了广泛的应用。最重要和有趣的是，在GLUT上的几种抑制剂的结合被发现可以被D-葡萄糖以竞争的方式置换。
本文提出了一种利用原位活细胞作为胰岛素载体的新策略。如图1所示，胰岛素首先通过共价键与GLUT抑制剂(毛喉素和In2)结合，共价键可以赋予胰岛素在体内和原位与GLUT结合的能力。另外，在胰岛素上引入水不溶性抑制剂，可以大大降低其在pH 7.4时的水溶性。皮下注射后，胰岛素结合物在皮肤下形成一个储仓，可以缓慢地将胰岛素结合物释放到血液中。然后，胰岛素结合物在血液循环中到达活细胞上的GLUT，包括脂肪细胞、肌肉细胞和血细胞，从而建立胰岛素池。值得注意的是，活细胞上的GLUT池还可以在注射后的初期缓冲血液中的高胰岛素水平，并充当胰岛素的贮存器，以平滑血液中的胰岛素水平。胰岛素结合物在细胞膜上的吸附与胰岛素结合物在正常血糖状态下在间质液和血液中的吸附是动态平衡的。在高血糖状态下，活细胞膜上的胰岛素结合物可以以葡萄糖触发的方式释放，这是由于葡萄糖水平升高引起的竞争性结合。
为了使GLUT抑制剂与GLUT缀合，GLUT抑制剂首先与氨基结合以促进其与胰岛素的结合(图2和图3)。对于毛喉素，引入氨基和烷基链可以增强其与GLUT的结合亲和力。对于抑制剂2(In2)，通过Michael加成反应引入氨基，同时保持其主要结构不变。为了将胰岛素与毛喉素和抑制剂2缀合，胰岛素首先与Traut试剂反应引入巯基，直接用于缀合抑制剂，其然后与SMCC交联剂预先反应。所得的结合物毛喉素和胰岛素-In2在pH 7.4下不溶，其结构经MALDI-TOF质谱确证。利用红细胞血影作为葡萄糖转运蛋白的模型，发现胰岛素-F能够与膜结合(图4)。此外，这种结合可能被报告的葡萄糖转运蛋白抑制剂、细胞松弛素B和葡萄糖所抑制(图5)，表明这种结合是GLUT特异性的。
评价胰岛素结合物对STZ诱导的1型糖尿病小鼠模型的体内治疗效果。将糖尿病小鼠分为四组，分别用胰岛素结合物或天然胰岛素治疗。以PBS为对照。所有治疗组的BGL在0.5h内降至200mg/dL以下，表明胰岛素结合物的活性保持(图4)。此外，胰岛素结合物治疗的小鼠血糖水平维持在正常范围内(<200mg/dL)超过10小时，远远超过与游离胰岛素相关的三小时。此外，在用胰岛素结合物治疗的小鼠中观察到可忽略的低血糖。胰岛素结合物与活细胞上GLUT的结合有助于降低血胰岛素水平，降低低血糖发生的可能性。使用活体成像进一步证实胰岛素-F的长期行为(图6)。此外，多重腹腔葡萄糖耐受性试验进一步证实了胰岛素-F的长期血糖调节能力(图7)。这种血糖水平从高血糖到正常血糖的快速调节可能是由于高血糖触发的葡萄糖转运蛋白释放胰岛素-F。
总之，已经合成了皮下注射葡萄糖响应性胰岛素与GLUT的抑制剂的结合物。另外，它在pH 7.4时不溶于PBS，在正常葡萄糖水平下释放基础胰岛素。一旦皮下注射，胰岛素结合物在皮肤下形成储仓，不断释放胰岛素到血液和全身循环。在血糖正常的情况下，活细胞上的GLUT可以捕获并结合胰岛素结合物，缓冲初始高水平的胰岛素，使低血糖可以忽略不计。此外，这种胰岛素池可以在高血糖状态下将胰岛素从细胞膜释放到循环中，从而实时调节血糖水平。体内动物实验表明，该胰岛素结合物能有效调节BGL。
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Claims (17)

1.一种葡萄糖响应性胰岛素系统，包括：
a)葡萄糖转运蛋白结合结构，所述葡萄糖转运蛋白结合结构包含与葡萄糖转运蛋白的至少一种竞争性抑制剂缀合的胰岛素部分，并且
b)其中所述葡萄糖转运蛋白结合结构被配置为可逆地结合葡萄糖转运蛋白，并且
c)其中所述葡萄糖转运蛋白结合结构在高浓度葡萄糖条件下释放所述胰岛素的一部分。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述葡萄糖转运蛋白的所述竞争性抑制剂包括毛喉素或抑制剂2(In2)。
3.根据权利要求1或2所述的组合物，其中所述竞争性抑制剂对所述葡萄糖转运蛋白的亲和力大于对右旋葡萄糖的亲和力。
4.根据权利要求1-3所述的组合物，其中所述葡萄糖转运蛋白包括GLUT蛋白。
5.根据权利要求4所述的组合物，其中所述GLUT蛋白是GLUT1蛋白。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的组合物，其中高浓度葡萄糖条件大于或等于200mg/dL。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的组合物，其中所述葡萄糖转运蛋白结合结构在低浓度葡萄糖条件下结合所述葡萄糖转运蛋白，其中低浓度葡萄糖条件是从0mg/dL最高至200mg/dL。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的组合物，其中所述葡萄糖转运蛋白结合结构在生理条件下难溶。
9.一种控制受试者的血糖水平的方法，所述方法包括：
a)向患有糖尿病的受试者施用治疗有效量的组合物，所述组合物包含：
b)葡萄糖转运蛋白结合结构，所述葡萄糖转运蛋白结合结构包含与葡萄糖转运蛋白的至少一种竞争性抑制剂缀合的胰岛素部分，
c)其中所述葡萄糖转运蛋白结合结构被配置为可逆地结合葡萄糖转运蛋白，并且
d)其中所述葡萄糖结合结构在高浓度葡萄糖条件下释放所述经葡萄糖修饰的胰岛素的一部分。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述葡萄糖转运蛋白在红血细胞上表达。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述红血细胞是人红血细胞。
12.根据权利要求9-11中任一项所述的方法，其中高浓度葡萄糖条件大于或等于200mg/dL。
13.根据权利要求9-12中任一项所述的方法，其中所述葡萄糖转运蛋白结合结构在低浓度葡萄糖条件下结合所述葡萄糖转运蛋白，其中低浓度葡萄糖条件是从0mg/dL最高至200mg/dL。
14.根据权利要求9-13中任一项所述的方法，其中使用透皮贴剂向所述受试者施用所述组合物。
15.根据权利要求9-14中任一项所述的方法，其中使用微针阵列贴片向所述受试者施用所述组合物。
16.根据权利要求9-15中任一项所述的方法，其中所述受试者患有I型糖尿病。
17.根据权利要求9-15中任一项所述的方法，其中所述受试者患有II型糖尿病。
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