KR20180135411A - 다양한 세포로부터의 표면개질된 엑소좀의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 표면이 개질된 엑소좀의 제조방법 등에 관한 것으로, 본 발명에 따른 엑소좀 제조방법은 대사당쇄조작(Metabolic glycoengineering)과 생물 직교성 부동 클릭화학(Bioorthogonal coppper-free click chemistry)을 통해서 암세포 및 줄기세포 등의 다양한 세포 표면을 개질하여, 그로부터 단리된 엑소좀을 분리함으로써, 궁극적으로 공여세포 유래의 생리활성물질을 내포하면서도 개질된 표면에 의해 안정성이 증가하고 암 세포 특이적 표적능을 갖는 엑소좀을 제공할 수 있다. 이에, 본 발명에 따른 방법으로 제조된 엑소좀은 암 예방, 개선, 또는 치료 용도로도 유용하게 이용될 수 있다.

Description

다양한 세포로부터의 표면개질된 엑소좀의 제조방법{Method for producing surface-modified exosomes from various cells}

본 발명은 표면개질된 엑소좀의 제조방법 및 그 방법에 의해 제조된 엑소좀 등에 관한 것이다.

엑소좀은 세포로부터 방출되어지는 30-100 nm 크기를 가지는 막 소포체(membrane vesicles)로서 혈액, 소변 등을 포함한 대부분의 체액에 존재하며, 단백질, mRNA, miRNA 등의 생리활성물질을 통해 세포 간의 신호전달을 중개하는 것으로 알려져 있다. 또한, 엑소좀은 세포막과 함께 융합되면서 분비되어 두 층의 인지질 막으로 구성되어 체내의 혈장과 면역 성분들로부터 엑소좀 내부의 물질을 보호하고, 내포작용(endocytosis)과 융합을 통해 수용세포로의 물질전달을 가능하게 한다. 특히 단백질, 막 수용체 및 핵산 등과 같은 다양한 범위의 생물학적 물질들을 담지할 수 있어, 최근 약물전달시스템을 위한 신개념의 치료용 전달체로 부상하고 있다.

그러나, 엑소좀을 질병모델의 생체 내에 주입할 경우 간, 비장 및 신장에 대부분 축적되고 병변 부위에 대한 표적능이 매우 부족한 것으로 알려져 있다. 이는 인지질, 다당류, 단백질 등으로 구성된 엑소좀의 표면성질로 인한 것이며, 따라서, 생체분포 거동을 제어하기 위해서는 표면을 효과적으로 개질할 수 있는 기술이 요구된다. 최근에 융합(fusion) 또는 유전공학을 이용한 엑소좀 표면개질기술이 개발된 바 있으나, 공정이 복잡하고, 효율이 낮으며, 안정성이 우수하지 않을 뿐만 아니라 재현성의 문제로 응용이 제한적이다. 따라서 보다 간편하고 안정적인 화학적 도구를 이용하여 엑소좀을 정교하고 다양하게 제어할 수 있는 기술이 필요한 실정이다.

생물 직교성 부동 클릭화학은 세포 독성을 갖는 구리 촉매를 필요로 하지 않는 생접합 반응으로 매우 신속하고 선택적이며 효율이 높은 특징이 있으며, 바이러스, DNA, 펩티드, 항체, 리포좀, 나노입자와 같은 초분자(supramolecule)들의 표면을 개질하기 위한 도구로 각광을 받고 있으며, 주로 리포좀의 표면을 개질하는 기술이 알려져 있다(일본 등록특허 공보 제3321622호).

본 발명자들은 대사공학을 세포에 적용하여 클릭화학반응을 통해 표적성이 우수한 생체 고분자 및 리간드를 신속하고 높은 효율로 도입할 수 있는 기술을 기반으로, in vivo 상에서의 생체분포 거동 조절이 가능한 엑소좀을 제조할 수 있다는 것을 확인하였는바, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.

이에, 본 발명은 표면개질된 엑소좀의 제조방법 및 상기 방법으로 제조된 엑소좀을 제공하는 것을 목적으로 한다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (1) 세포의 세포막 구조를 개질하는 단계; 및 (2) 상기 세포에서 (표적형) 엑소좀을 수득하는 단계;를 포함하는 표면개질된 엑소좀의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 일 구현예로, 상기 (1) 단계는 (a) 대사당쇄조작이 가능하며 아지드기를 갖는 전구체를 세포에 처리하여 세포의 표면에 상기 아지드기를 도입하는 단계; 및 (b) 상기 아지드기와 생물 직교성 부동 클릭 화학반응을 수행할 수 있는 히알루론산을 세포에 처리하는 단계;를 포함한다.

본 발명의 다른 구현예로, 상기 (a) 단계에서 아지드기를 갖는 전구체는 N-아자이도아세틸마노자민(N-azidoacetylmannosamine), N-아자이도아세틸갈락토사민 (N-azidoacetylgalactosamine), N-아자이도아세틸글루코사민 (N-azidoacetylglucosamine), 및 6-아자이도푸코오스 (6-azidofucose)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 포함할 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 (b) 단계에서 히알루론산은 말단이 다이벤조사이클로옥타인(Dibenzocyclooctyne)기로 개질된 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 (b) 단계에서 히알루론산은 폴리에틸렌글리콜(PEG)이 접합된 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 (b) 단계에서 히알루론산은 폴리에틸렌글리콜(PEG)이 접합된 것으로서 말단이 다이벤조사이클로옥타인(Dibenzocyclooctyne)기로 개질된 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 (a) 단계는 12 내지 60 시간 동안 수행될 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 (b) 단계는 0.5 내지 2 시간 동안 수행될 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 (1) 단계는 (b) 단계 이후에 소태아혈정이 없는 세포 배양액에서 상기 세포를 12 내지 36 시간 동안 배양시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 (2) 단계는 상기 엑소좀의 수득은 상기 세포를 배양한 배양액을 원심분리하여 최종 펠렛을 수득하는 것에 의해 달성될 수 있다.

한편, 본 발명에서 엑소좀을 공여하는 세포는 진핵세포라면 제한되지 아니하며, 상기 세포는 암세포 및 줄기세포를 포함한다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 엑소좀을 제공한다.

본 발명의 일 구현예로, 상기 엑소좀은 그 표면이 히알루론산으로 개질됨과 동시에 그 내부에 생체활성물질을 포함할 수 있다.

본 발명의 일 구현예로, 상기 엑소좀은 암 세포 표면에 과발현된 CD44 수용체를 표적으로 할 수 있다.

본 발명의 다른 구현예로, 상기 암은 편평상피세포암, 자궁암, 자궁경부암, 전립선암, 두경부암, 췌장암, 뇌종양, 유방암, 간암, 피부암, 식도암, 고환암, 신장암, 대장암, 직장암, 위암, 방광암, 난소암, 담관암 및 담낭암으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 암일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 엑소좀이 내포하는 생체활성물질은 mRNA, miRNA, HIF1α, VEGF, TGFβ, MMP2, EGFR, 미토콘드리아 DNA, HSP70, HSP 84, 및 HSP90으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 엑소좀의 제조 방법은, 생물 직교성 부동 클릭 화학반응을 통해 대사공학적으로 표면개질된 공여세포로부터 분비된 엑소좀을 수득하여, 궁극적으로 생물학적 물질들을 미리 내포하면서도 우수한 생체 내 안정성과 표적능을 갖도록 표면개질된 엑소좀을 제조하는 것에 그 특징이 있다. 본 발명에 사용되는 클릭화학 반응은 제조 과정 중 독성을 유발할 수 있는 금속이온계 촉매의 사용이 없고, 복잡한 유전적 개질과정이 필요하지 않은 장점이 있다. 본 발명은 필요한 생체 고분자 또는 리간드를 간단하고 고효율로 엑소좀에 도입하여 표면을 개질할 수 있으며, 본 발명에 따라 제조된 엑소좀은 생체 내에서 그 분포 거동을 조절할 수 있는바, 표적 진단 및 치료용 엑소좀으로 사용될 수 있다.

이와 같이, 본 발명의 제조 방법에 따른 엑소좀은 대사당쇄조작(Metabolic glycoengineering)과 생물 직교성 부동 클릭화학(Bioorthogonal coppper-free click chemistry)을 통해서 표면이 개질되어, 안정성이 증가하고, 암 세포를 표적할 수 있는 효과가 우수한바, 본 발명에 따른 방법으로 제조된 엑소좀은 암 예방, 개선, 치료, 또는 진단 용도로도 유용하게 이용될 수 있다.

도 1a 내지 도 1d는 본 발명에서 엑소좀의 표면개질을 위해 사용하는 화합물의 1H-NMR 데이터를 나타낸 것으로, 도 1a는 디벤조사이클로옥타인-아민(DBCO-amine), 도 1b는 히알루론 산(HA), 도 1c는 HA-DBCO, 및 도 1d는 PEG-HA-DBCO 화합물의 NMR 데이터를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 제조방법을 나타낸 모식도로, (a)는 대사당쇄조작과 생물 직교성 부동 클릭화학을 이용한 세포 표면개질 과정을 모식화하여 나타낸 것이고, (b)는 공여세포로부터 표적형 엑소좀의 제조과정을 모식화하여 나타낸 것이다.
도 3a 및 도 3b은 본 발명의 방법에 따라 표면 개질된 엑소좀의 물리·생화학적 특성을 분석 평가한 결과를 나타낸 도면이다.
도 4a 내지 도 4c는 본 발명의 방법에 따라 표면 개질된 MDAMB231 암세포 유래 엑소좀의 세포 흡수 거동 및 세포 독성을 평가한 결과를 나타낸 것으로, 도 4a는 표면개질된 엑소좀의 세포흡수 거동 평가 결과이고, 도 4b는 엑소좀 세포흡수 거동 평가에서 엑소좀의 형광량을 정량화한 값을 나타낸 것이며, 도 4c는 표면개질된 엑소좀의 입자수에 따른 세포독성을 평가한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 방법에 따라 표면 개질된 인간지방유래 줄기세포 엑소좀의 경쟁적 세포 흡수 거동을 나타낸 것으로, (a)는 표면개질된 엑소좀의 세포흡수 거동 평가 결과이며, (b)는 그 형광량을 정량화한 값을 나타낸 것이다.
도 6a 내지 도 6c는 정상동물모델과 질병동물모델에서의 엑소좀의 생체내 분포 거동 및 표적 효능을 평가한 결과를 나타낸 것으로, 도 6a는 시간에 따른 엑소좀의 생체 분포를 확인한 결과이고, 도 6b는 엑소좀 주사 24시간 후 장기에서의 엑소좀 생체 분포를 확인한 결과이며, 도 6c는 장기에서 엑소좀의 형광량 그래프를 나타낸 결과이다.

본 발명자들은 단백질, 막 수용체 및 핵산 등과 같은 다양한 범위의 생물학적 물질들을 미리 담지할 수 있는 치료용 전달체로 주목받고는 있으나, 생체 내로 주입될 경우 안정성이 떨어지거나 표적능이 떨어지는 단점을 가지는 엑소좀의 표면 개질 방법을 예의 연구한 결과, 대사당쇄조작(Metabolic glycoengineering)과 생물 직교성 부동 클릭화학(Bioorthogonal coppper-free click chemistry)을 통해서 표면이 개질된 엑소좀에 우수한 생체 내 안정성과 표적능이 있다는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

즉, 본 발명은 엑소좀을 공여하는 세포의 막 구조를 개질한 후, 개질된 막 구조를 갖는 세포로부터 단리된 엑소좀을 수득하는 것에 의해, 생체활성물질을 내포하면서도 개질된 표면구조를 갖는 엑소좀을 제공할 수 있다.

본 발명에서는 안정적이고, 간단하고, 효율적으로 공여세포의 막 구조를 개질하기 위하여, 대사당쇄조작과 생물 직교성 부동 클릭 화학반응을 이용하였다.

구체적으로, 본 발명의 표면개질된 엑소좀의 제조방법은 하기의 단계를 포함한다:

(1) 세포의 세포막 구조를 개질하는 단계; 및 (2) 상기 세포에서 엑소좀을 수득하는 단계.

상기 (1) 단계는 (a) 대사당쇄조작이 가능하며 아지드기를 갖는 전구체를 세포에 처리하여 세포의 표면에 상기 아지드기를 도입하는 단계; 및 (b) 상기 아지드기와 생물 직교성 부동 클릭 화학반응을 수행할 수 있는 히알루론산을 세포에 처리하는 단계;를 포함한다.

상기 아지드기를 갖는 전구체는 세포 막에 아지드기(-N₃)를 도입할 수 있는 화합물이라면 제한되지 아니하나, 바람직하게는 아자이도 당류(azido sugar 류)일 수 있다. 아자이도 당류의 비-제한적인 예로는 N-아자이도아세틸마노자민(N-azidoacetylmannosamine: ManNAz), N-아자이도아세틸갈락토사민(N-azidoacetylgalactosamine: GalNAz), N-아자이도아세틸글루코사민(N-azidoacetylglucosamine: GlcNAz), 및 6-아자이도푸코오스(6-azidofucose: 6AzFuc) 등이 있다.

본 발명의 일실시예에서는, N-아자이도아세틸마노자민을 공여 세포에 처리하여 상기 세포의 막에 아지드기(-N₃)를 도입하고, 다이벤조사이클로옥타인기로 말단이 개질된 히알루론산을 전처리한 후 배양하여 직교성 부동 클릭 화학반응이 일어나도록 하였다. 이후 상기 세포의 배양액을 원심분리하여 상층액을 회수하여, 상기 세포로부터 분비된 엑소좀을 분리 및 정제하였다(실시예 1 참조).

본 발명의 다른 실시예에서는, 상기와 같이 표면 개질된 엑소좀에 우수한 안정성이 있다는 것을 확인하였고(실시예 2 참조), 상기 엑소좀에 형광표지하여 암세포에 전달한 결과 강한 형광 신호를 나타내었고(실시예 3 참조), 또한, 정상동물모델과 질병동물모델에 엑소좀을 주입한 결과, 질병 모델에서 상대적으로 강한 형광신호를 보인다는 것을 확인하였는바(실시예 4 참조), 암세포의 표면을 표적하여 전달이 가능하다는 것을 확인하였다.

이에, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 표면개질된 엑소좀의 제조방법을 제공한다:

(1) 세포의 세포막 구조를 개질하는 단계; 및 (2) 상기 세포에서 엑소좀을 수득하는 단계.

이때, 상기 (2) 단계는 세포로부터 분비/단리된 물질의 획득하기 위한 공지의 방법에 의해 수행될 수 있으며, 가장 간단하게는 상기 세포의 배양액을 원심분리하여 잔여 펠렛(pellet)을 취하는 것에 의해 수행될 수 있다.

한편, 상기 (1) 단계는 하기의 단계를 포함하는 것일 수 있다:

(a) 대사당쇄조작이 가능하며 아지드기를 갖는 전구체를 세포에 처리하여 세포의 표면에 상기 아지드기를 도입하는 단계; 및 (b) 상기 아지드기와 생물 직교성 부동 클릭 화학반응을 수행할 수 있는 히알루론산을 세포에 처리하는 단계.

상기 히알루론산은 말단이 다이벤조사이클로옥타인(Dibenzocyclooctyne)기로 개질된 것일 수 있으며, 상기 히알루론산에는 폴리에틸렌글리콜(Polyethylene glycol, PEG)이 접합된 것일 수 있다.

본 발명에 따라 표면이 개질된 엑소좀을 공여하는 세포는 진핵세포라면 제한되지 아니하며, 암세포 및 줄기세포를 포함한다.

본 발명에서 상기 엑소좀은 히알루론산에 의해 개질된 표면을 가지며, 상기 히알루론산은 CD44 수용체에 특이적으로 결합할 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 엑소좀은 CD44 수용체를 과발현하는 세포를 표적으로 하여 약물의 전달 및/또는 질병의 진단에 이용될 수 있다. 한편, CD44 수용체를 과발현하는 세포로서 암세포가 알려져 있으며, 상기 암으로는 편평상피세포암, 자궁암, 자궁경부암, 전립선암, 두경부암, 췌장암, 뇌종양, 유방암, 간암, 피부암, 식도암, 고환암, 신장암, 대장암, 직장암, 위암, 방광암, 난소암, 담관암 또는 담낭암 등일 수 있다.

이에, 본 발명에 따른 엑소좀은 암 세포를 표적으로 하는 약물 전달 시스템으로서 이용될 수 있으며, 상기 암 세포는 CD44를 과발현하는 세포라면 제한되지 아니하나, 예를 들어, 편평상피세포암, 자궁암, 자궁경부암, 전립선암, 두경부암, 췌장암, 뇌종양, 유방암, 간암, 피부암, 식도암, 고환암, 신장암, 대장암, 직장암, 위암, 방광암, 난소암, 담관암 또는 담낭암 등을 포함할 수 있다.

본 발명의 엑소좀이 암 세포를 표적으로 하는 약물 전달 시스템으로 이용되는 경우, 공지의 암 치료용 약물 중 하나 이상을 내포할 수 있다.

또한, 본 발명의 엑소좀은 CD44 과발현 암세포 특이적 표적능을 가지는바, 공지의 추적 가능한 물질을 하나 이상 포함하여 생체 내에서 암세포의 분포를 확인하기 위한 용도로 제공될 수 있다.

한편, 본 발명에 따른 방법으로 수득한 엑소좀은 표면 개질된 세포막으로부터 단리된 것으로서, 세포 내 생체활성물질을 다량 내포할 수 있으며, 상기 생체활성물질은 공여 세포 유래의 활성물질이라면 제한되지 아니하나, 바람직하게는 mRNA, miRNA, HIF1α(Hypoxia-inducible factor 1-alpha), VEGF(Vascular endothelial growth factor), TGFβ(Transforming growth factor beta), MMP2(matrix metalloproteinase-2), EGFR(epidermal growth factor receptor), 미토콘드리아 DNA(mitochondrial DNA: mtDNA), HSP70(heat shock protein 70), HSP 84(heat shock protein 84), 및 HSP90(heat shock protein 90) 등을 포함할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어, "치료"란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 암에 의한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.

본 발명에서 사용되는 용어, "엑소좀(exosome)"이란, 혈액, 소변, 및 세포의 배양액을 포함하는 거의 모든 진핵세포액에 존재하는 세포유래 소포(vesicles)로서, 평균적으로 30 내지 100 nm의 직경을 갖는 것으로 알려져 있다. 엑소좀은 세포의 다소포체(multivesicular body)가 원형질막에 융합되어 분비되거나 원형질막으로부터 직접적으로 분비되며, 응집, 세포 내 신호전달, 세포 노폐물 관리 등의 과정에서 중요한 특정 기능을 수행한다고 보고되어 왔기 때문에 임상적으로 특정 질환의 바이오마커, 진단, 치료 용도로 주목받고 있다. 본 발명에 있어서, 엑소좀은 진핵세포를 배양함으로써 상기 세포로부터 자연적으로 분비된 것일 수 있으며, 상기 세포는 암세포 및 줄기세포를 포함하며, 보다 구체적으로 암세포는 인간 유방암 세포일 수 있다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 표면개질된 엑소좀을 유효성분으로 포함하며, 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 상기 약학적으로 허용 가능한 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 사이클로덱스트린, 덱스트로즈 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올, 리포좀 등을 포함하지만 이에 한정되지 않으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액 등 다른 통상의 첨가제를 더 포함할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제, 윤활제 등을 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립, 또는 정제로 제제화할 수 있다. 적합한 약학적으로 허용되는 담체 및 제제화에 관해서는 각 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 제형에 특별한 제한은 없으나 주사제, 흡입제, 피부 외용제, 또는 경구 섭취제 등으로 제제화할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 피부, 비강, 기도에 적용)할 수 있으며, 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 시간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.

본 발명에 따른 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명에 따른 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

구체적으로, 본 발명에 따른 조성물의 유효량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로는 체중 1 kg 당 0.001 내지 150 mg, 바람직하게는 0.01 내지 100 mg을 매일 또는 격일 투여하거나 1일 1 내지 3회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 투여 경로, 비만의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 표면개질된 엑소좀을 유효성분으로 포함하는, 암 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.

본 발명에서 사용되는 용어, "개선"이란, 치료되는 상태와 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 적어도 감소시키는 모든 행위를 의미한다.

본 발명의 건강기능식품 조성물에서 유효성분을 식품에 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합량은 그의 사용 목적에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에 본 발명의 조성물은 원료에 대하여 15 중량% 이하, 바람직하게는 10 중량% 이하의 양으로 첨가된다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있다.

본 발명의 건강기능식품 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 유효성분을 함유하는 것 외에 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 수크로오스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 사이클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 당업자의 선택에 의해 적절하게 결정될 수 있다.

상기 외에 본 발명의 건강기능식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율 또한 당업자에 의해 적절히 선택될 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 표면개질된 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암 예방 또는 치료방법을 제공한다.

본 발명에서 "개체"란 질병의 치료를 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는 인간 또는 비-인간인 영장류, 생쥐(mouse), 쥐(rat), 개, 고양이, 말, 및 소 등의 포유류를 의미한다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

실시예 1. 생물 직교성 부동 클릭화학 반응을 이용하여 대사공학적으로 표면 개질된 엑소좀의 제조

히알루론산(HA) 200mg을 50ml의 탈이온화수에 녹인 후, 404.25mg의 1-에틸-3-(3-디메틸-아미노프로필) 카보디이미드 (1-ethyl-3-(3-dimethyl-aminopropyl) carbodiimide; EDC)을 탈이온화수에 녹이고 284.94mg의 1-히드록시벤조트리아졸 (1-hydroxybenzotriazole; HOBt)을 메탄올(methanol)에 녹여 적하한 뒤, 30분 동안 히알루론산의 주쇄에 있는 카르복시기(-COOH)를 활성화시켜주었다. 상기 반응액에 폴리에틸렌글리콜 아민(Polyethylene glycol amine : PEG-NH₂) 263mg을 탈이온화수에 녹여 적하한 뒤 pH를 6.8로 맞춘 후 24시간 동안 상온에서 교반한다. 이후 반응물을 2일간 투석하여 미 반응된 물질을 제거한 후, 동결건조를 통해 PEG가 접합된 히알루론산접합체(PEG-HA)를 제조하였다.

생물 직교성 부동클릭 화학반응을 이용하여 엑소좀의 표면개질을 위해, DBCO기로 개질된 폴리머를 제조하였다. 우선 20mg의 HA와 PEG-HA를 각각 준비하였고, 46mg의 디벤조사이클로옥타인-아민 (Dibenzocyclooctyne-amine : DBCO-amine)을 N,N-디메틸포름아마이드 (N,N-Dimethylformamide : DMF)와 탈 이온화수 1:1로 섞인 공용매에 녹인 후 10mg의 시아노수소화붕소(sodium cyanoborohydride)를 천천히 적하하였으며, 35℃에서 5일간 교반을 진행하였다. 이후, 상기의 반응물들을 3일간 투석하여 미반응 물질들을 제거한 후, 동결건조를 하여 화합물의 말단이 DBCO로 개질된 히알루론산, PEG가 접합된 히알루론산접합체를 제조하였다. 상기의 화합물들(DBCO-amine, HA, HA-DBCO, PEG-HA-DBCO)을 ¹H-NMR을 통해 확인한 결과, DBCO-amine에 있는 아민기(-NH₂, 5.1ppm), 메틸렌(-CH₂-, 3.2)등 다양한 NMR값들 중 HA, PEG와 중첩되지 않는 벤젠(-CH-, 7.4 ppm)의 NMR값을 이용하였고(도 1a), HA에서는 N-아세틸기에 있는 메틸기(-CH₃, 2.0ppm)의 NMR값을 이용하였고, 최종적으로 HA와 PEG-HA가 DBCO-amine와 결합한 화합물인 HA-DBCO(도 1c)와 PEG-HA-DBCO(도 1d)을 얻어냈다. HA-DBCO에서 얻은 NMR값들에서 HA의 메틸기(-CH₃)와 DBCO-amine의 벤젠(-CH-)을 확인할 수 있었고, PEG-HA-DBCO에서도 역시 PEG의 메틸렌(-CH₂-, 3.2ppm) 와 HA의 (-CH₃, 2.0), DBCO-amine의 벤젠(-CH-, 7.4ppm) NMR값을 확인하여, PEG-HA-DBCO가 합성된 것을 확인할 수 있었다.

대사당쇄조작을 이용한 세포 표면에 아지드(-N₃)기 발현 과정은 다음과 같다. 인간 유방암 세포인 MDAMB-231와 인간지방유래 줄기세포(Adipose derived stem cells) 에 각각 50μM과 20μM의 N-아자이도아세틸마노자민(N-azidoacetylmannosamine: Ac₄ManNAz)이 함유된 30ml의 RPMI 배양액(10% 소태아혈청(FBS)과 1% 페니실린-스트렙토미신 함유)을 처리 한 후, 37℃, 5% CO₂에서 48시간 동안 배양시켰다. 이후, 배양액을 제거한 뒤 DPBS로 1~2회 세척 후, DBCO로 개질된 HA와 PEG-HA를 RPMI 배양액(1% 페니실린-스트렙토미신 함유)에 녹여 세포에 1시간 내지　1시간 30분 배양해준 후, DPBS로 2회 세척 후 소태아혈청이 제거된(depleted FBS) 엑소좀 배양액에 24시간 배양시켜 생접합 반응이 일어나도록 하였다(도 2(a)). 24시간 후, 배양된 세포로부터 배양액만을 추출하여, 3000rpm에서 10분간 원심분리 후 200nm의 다공성필터를 이용하여 죽은 세포와 오염물을 제거하고, 상층액만 모아 초원심분리기로 100,000g 70분 동안 돌려준 뒤 상층액을 제거해주었다. 이후, 추가적인 정제 과정을 위해 남아있는 펠렛(엑소좀 및 잔여물)을 DPBS에 다시 분산시켜 초원심분리기로 100,000g, 70분 동안 돌려준 후 최종적으로 가라앉은 펠렛(엑소좀)을 -80℃ 냉동고에 사용 전까지 보관하였다(도 2(b)).

실시예 2: 표면 개질된 엑소좀의 물리·생화학적 특성 분석 평가

제조된 엑소좀의 크기 및 수용액 상에서의 안정성을 확인하기 위해, 동적 빛산란 분석 장치(DLS) 기기를 이용하였다. 엑소좀을 1ml의 PBS에 분산 후, 지정된 시간마다 빛의 산란 정도를 통한 엑소좀의 크기를 6일간 측정하여 안정성을 측정하였다. 실험군으로, 히알루론산, PEG가 접합된 히알루론산, PEG로 표면 개질된 엑소좀 또한 상기와 같은 조건에서 안정성 평가를 진행하였다. 그 결과를 도 3a의 (a)에 나타낸 것과 같이 엑소좀은 135nm, HA로 개질된 엑소좀은 172nm, PEG-HA로 개질된 엑소좀은 202nm, PEG로 개질된 엑소좀은 191nm의 크기를 갖는 것을 관찰되었으며, 이러한 개질 전후의 다른 엑소좀의 크기를 통해, 엑소좀 표면이 HA, PEG-HA 및 PEG로 개질되었다는 것을 확인하였다. 제조된 엑소좀의 개수를 정량화하기 위하여, NanoSight를 이용한 나노입자 추적 분석(Nanoparticles Tracking Analysis)을 진행하였고, 그 결과를 도 3a의 (b)에 나타낸 것과 같이, 평균적으로 1ml에 10⁸ ~ 10⁹ 입자 수를 가지는 것을 확인하였다. 엑소좀과 표면 개질된 엑소좀의 형태를 확인하기 위해 투과전자현미경(Tranmission Electron Microscope : TEM)을 이용하였으며, 도 3a의 (c)에서 확인할 수 있는 것과 같이 엑소좀들의 형태는 컵 모양의 둥근 형태를 띠고 있는 것으로 관찰하였다. 이러한 표면개질 특징은 인간지방유래 줄기세포에서 추출한 엑소좀의 특성분석에서도 확인하였으며, 그 결과 도 3b와 같이, 표면이 HA로 개질된 엑소좀의 경우 둥그런 형태로 160 nm의 크기를 가지는 것으로 측정되었다. 이는 개질 전의 엑소좀의 크기인 130 nm 보다 크기가 증가함을 의미하며, 개질 전후의 나노입자 추적 분석을 통한 엑소좀의 개수 측정을 통해, 본 발명에서 도입하고자 하는 엑소좀의 표면개질 기술이 엑소좀의 개수에 크게 영향을 주지 않는 것을 확인하였다. 또한, 상기로부터 본 발명에 따른 엑소좀을 공여하는 세포는 다양할 수 있음을 알 수 있다.

실시예 3: 표면 개질된 엑소좀의 세포 흡수 거동 및 세포 독성 평가

표면 개질 유무에 따른 엑소좀의 세포 흡수 거동 차이를 확인하기 위하여, MDA-MB-231세포를 10%의 소태아혈청과 1%의 페니실린-스트렙토미신을 포함한 RPMI배지에 37℃, 5% CO₂ 조건에서 배양하였다. 본 실험에 필요한 형광 표지된 엑소좀은 상기 실시예 1의 조건을 바탕으로, HA와 PEG-HA에 형광 물질인 Cy5.5를 화학적으로 접합시킨 후, 최종적으로 Cy5.5-HA, Cy5.5-PEG-HA, Cy5.5-PEG로 표면 개질된 엑소좀을 제조하였다. 상기의 조건에서 배양한 세포들을 (1 x 10⁵cells/well) 6well plate에 젤라틴 코팅이 된 커버글라스 위에 심고, 대조군으로는 Cy5.5-엑소좀을, 실험군으로는 Cy5.5-표면 개질된 엑소좀들을 각각의 well에 처리를 해서 37℃, CO₂ 배양기에 1시간 동안 배양하였다. 또한 CD44에 의한 경쟁적 억제 연구를 확인하기 위해, 히알루론산을 5mg/ml로 녹인 후 세포들에 1시간동안 미리 처리한 뒤, Cy5.5-히알루론산 표면 개질된 엑소좀을 처리해 37℃, 5% CO₂ 배양기에 1시간동안 배양하였다. 1시간 동안의 배양 후 세포들을 DPBS로 2번 세척하고 4%의 포름알데하이드 용액을 통해 세포 고정하였고, 4,6-다이아미드노-2-페닐인돌(4,6-diamidino-2-phenylindole : DAPI)를 이용해 세포를 염색시킨 뒤, 세포들의 형상을 Confocal laser microscopy를 통해 확인하였다. 히알루론산으로 표면 개질된 엑소좀은 표면의 히알루론산이 암세포 표면에 과발현되있는 CD44 수용체와 특이적으로 결합할 수 있기 때문에, MDA-MB-231 암세포에서 Cy5.5-엑소좀이나 Cy5.5-PEG 표면 개질된 엑소좀보다 Cy5.5-HA 엑소좀과 Cy5.5-PEG-HA 엑소좀이 상대적으로 강한 형광 신호를 나타내었다. 또한 경쟁적 억제 연구 결과를 통해, 히알루론산으로 표면이 개질된 엑소좀은 히알루론산을 미리 처리하지 않고 엑소좀을 처리한 실험군에 비해 세포 내 형광이 적음에 따라 CD44 수용체를 이용한 내포작용이 억제되었음을 관찰한 결과를 도 4a에 나타내었다. 엑소좀 및 표면개질된 엑소좀의 세포흡수 거동을 확인한 뒤, 정확한 형광량의 정량값을 도 4b에 그래프로 나타내었다.

상기 도 4b를 통해 확인할 수 있는 것과 같이, 엑소좀에 비해 HA표면 개질된 엑소좀이 약 2배 이상 더 많이 세포 흡수 거동을 보였으며, PEG-HA 표면 개질된 엑소좀도 더 많은 양의 엑소좀이 세포 흡수된 것을 확인할 수 있었다. PEG는 암세포 표면의 CD44 수용체에 특이적으로 결합하기 힘들어 HA를 이용해 표면개질한 엑소좀 보다 약한 형광량을 나타내었다. 경쟁적 억제 연구를 위해 히알루론산을 미리 배양했던 실험군에서는 HA 표면 개질된 엑소좀이 거의 세포 내로 들어가지 않았음을 그래프를 통해 알 수 있었다. 이러한 뚜렷한 세포 흡수거동의 차이는 엑소좀 표면이 HA로 성공적으로 개질되었다는 것을 보여준다.

표면 개질 전후의 엑소좀의 세포 독성을 확인하기 위하여, 세포들을(1 x 10⁴cells/well) 96well plate에 심고, 24시간 동안 배양한 후, 다양한 입자 수(10⁶ ~ 10⁸ 입자 수)의 엑소좀을 처리하고 37℃, 5% CO₂ 조건에서 24시간 추가로 배양한 후, CCK-8(Cell Count Kit 8) 분석을 통해 살아있는 세포의 양을 측정하므로써 엑소좀 및 표면개질된 엑소좀들의 세포 독성을 관찰한 결과를 도 4c에 나타내었다.

도 4c에서 확인할 수 있는 것과 같이, 엑소좀 및 표면 개질된 엑소좀들의 10⁶ ~ 10⁸ 모든 입자 수 범위 내에서 높은 세포 생존을 보임에 따라 개질 유무에 따른 엑소좀의 농도별 세포 독성은 거의 없는 것을 확인하였다.

상기의 표면개질 엑소좀의 CD44 수용체 특이적 세포 흡수 거동은 도 5(a)와 (b)와 같이, 인간지방유래 줄기세포에서 추출하여 엑소좀을 이용하여 관찰하였다. 표면개질된 엑소좀의 경우(HA-Exo)에 경쟁적 세포 흡수거동을 보이는 것을 확인하였으며, 경쟁적 억제를 한 그룹 (Free HA+HA-Exo) 대비 2.1배 높은 흡수 거동을 보이는 것을 관찰하였다.

실시예 4: 정상동물모델과 질병동물모델에서의 엑소좀의 생체내 분포 거동 및 표적 효능 평가

표면 개질 유무에 따른 엑소좀의 in vivo 생체 분포 거동 및 표적 효능을 평가하기 위해, 1 x 10⁷개의 MDA-MB-231 세포들을 배양액 (100μl)에 분산시켜 누드마우스의 표피층에 주사하여 쥐에 암을 이식하였다. 암의 부피가 100-150mm³ 정도 되었을 때, 동일한 형광량을 띄는 엑소좀을 포함한 200μl의 용액을 쥐의 꼬리정맥을 통해 주사하였다. 시간에 따른 엑소좀의 생체 분포와 표적 효능은 근적외선형광기기를 통하여 관찰하여 도 6a에 나타내었고, 장기에서 엑소좀의 분포는 엑소좀의 꼬리정맥 주사 후 24시간이 지났을 때 각각의 집단의 누드마우스를 해부하여 주요 장기와 암들을 잘라내어 그 형광을 확인하여 그 결과를 도 6b에 나타내었다.

그 결과 도 6b에서 확인할 수 있는 것과 같이, 기존 엑소좀의 생체분포는 시간이 지남에 따라 대부분 간에서 이뤄지는 반면, 표면 개질된 엑소좀들은 상대적으로 암 조직에서의 형광 신호가 강하게 관찰되었다. 특히 PEG-HA로 개질된 엑소좀의 경우, 상대적으로 다른 집단 보다 암 조직에서의 신호가 강한 것을 확인하였으며, 이는 PEG로 인한 증가된 반감기와 더불어 HA가 암 조직에서의 CD44 수용체를 이용하여 내포 작용이 증가 되었음을 보여준다. 각각의 장기에서 나타나는 형광량 그래프로 수치화시켰을 때, 대조군으로 사용된 엑소좀에 비해, 표면개질된 엑소좀들의 간에서 나타내는 형광량은 감소하였음을 확인할 수 있었고, 암조직에서의 형광량은 최대 약 2배까지 늘어나는 것을 확인 할 수 있었다.

상기 진술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims (12)

1. (1) 세포의 세포막 구조를 개질하는 단계; 및
   (2) 상기 세포에서 엑소좀을 수득하는 단계;를 포함하는 표면개질된 엑소좀의 제조방법으로서,
   상기 (1) 단계는 하기의 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 엑소좀의 제조방법:
   (a) 대사당쇄조작이 가능하며 아지드기를 갖는 전구체를 세포에 처리하여 세포의 표면에 상기 아지드기를 도입하는 단계; 및
   (b) 상기 아지드기와 생물 직교성 부동 클릭 화학반응을 수행할 수 있는 히알루론산을 세포에 처리하는 단계.
   
2. 제1항에 있어서,
   상기 (a) 단계에서 아지드기를 갖는 전구체는 N-아자이도아세틸마노자민 (N-azidoacetylmannosamine), N-아자이도아세틸갈락토사민 (N-azidoacetylgalactosamine), N-아자이도아세틸글루코사민 (N-azidoacetylglucosamine), 및 6-아자이도푸코오스 (6-azidofucose)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는, 제조방법.
   
3. 제1항에 있어서,
   상기 (b) 단계에서 히알루론산은 말단이 다이벤조사이클로옥타인(Dibenzocyclooctyne)기로 개질된 것을 특징으로 하는, 제조방법.
   
4. 제1항에 있어서,
   상기 (b) 단계에서 히알루론산은 폴리에틸렌글리콜(PEG)이 접합된 것을 특징으로 하는, 제조방법.
   
5. 제1항에 있어서,
   상기 (a) 단계는 12 내지 60 시간 동안 수행되는 것을 특징으로 하는, 제조방법.
   
6. 제1항에 있어서,
   상기 (b) 단계는 0.5 내지 2 시간 동안 수행되는 것을 특징으로 하는, 제조방법.
   
7. 제1항에 있어서,
   상기 (1) 단계는 (b) 단계 이후에 소태아혈정이 없는 세포 배양액에서 상기 세포를 12 내지 36 시간 동안 배양시키는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 제조방법.
   
8. 제1항에 있어서,
   상기 세포는 암세포 및 줄기세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 세포인 것을 특징으로 하는, 제조방법.
   
9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 제조방법으로 제조된 엑소좀으로서, 상기 엑소좀은 히알루론산으로 표면이 개질됨과 동시에 생체활성물질을 내포하는 것을 특징으로 하는, 엑소좀.
   
   
10. 제9항에 있어서,
    상기 엑소좀은 암 세포 표면의 CD44 수용체를 표적하는 것을 특징으로 하는, 엑소좀.
    
11. 제10항에 있어서,
    상기 암은 편평상피세포암, 자궁암, 자궁경부암, 전립선암, 두경부암, 췌장암, 뇌종양, 유방암, 간암, 피부암, 식도암, 고환암, 신장암, 대장암, 직장암, 위암, 방광암, 난소암, 담관암 및 담낭암으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 엑소좀.
    
12. 제9항에 있어서,
    상기 생체활성물질은 mRNA, miRNA, HIF1α(Hypoxia-inducible factor 1-alpha), VEGF(Vascular endothelial growth factor), TGFβ(Transforming growth factor beta), MMP2(matrix metalloproteinase-2), EGFR(epidermal growth factor receptor), 미토콘드리아 DNA, HSP70(heat shock protein 70), HSP 84(heat shock protein 84), 및 HSP90(heat shock protein 90)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는, 엑소좀.

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