CN114621925A - 一种点击化学介导的靶向方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种点击化学介导的靶向方法，通过单糖、胆碱或氨基酸的细胞代谢将点击化学基团代谢到第一细胞表面；将点击化学配对基团修饰的单糖、胆碱或氨基酸共价连接到生物大分子上，利用生物大分子的被动运输靶向第二细胞，再通过单糖、胆碱或氨基酸的细胞代谢将点击化学配对基团代谢到第二细胞表面，在第二细胞表面构建点击化学的人工靶点，使得两种细胞在点击化学基团的作用下发生生物正交反应，增强第一细胞对第二细胞的识别作用，从而引发相应的生物过程。本发明的方法能够增强免疫细胞对肿瘤细胞的识别与杀伤，在人工靶向技术领域有广阔的应用前景。

Description

一种点击化学介导的靶向方法
技术领域
本发明涉及人工靶向技术领域，特别涉及一种点击化学介导的靶向方 法。
背景技术
如何有效地预防和医治癌症已是科学研究中的当务之急。新型技术的 迅猛发展对肿瘤医学的进步产生了巨大影响，而纳米生物医学是随着的纳 米技术发展而发展起来的崭新的学科。在癌症、心血管、神经、代谢等重 大疾病的诊断与治疗方面纳米生物医学已经获得越来越多的认同。纳米材 料结构灵活多变，自1960年首次报道脂质体作为蛋白和药物载体以来，控 释聚合物、聚乙二醇化的脂质体、聚合物胶束、树枝状聚合物等众多的纳米材料或纳米器件被用来提高疾病诊断和治疗的效率。纳米载药系统结合 自身长循环、靶向、缓控释、透黏膜、透皮、物理响应等优势，可以克服 现有药物制剂生物利用率低、稳定性差、药理作用时间短、不良反应严重 等缺陷。然而，肿瘤治疗不可避免的是药物被动地随血流分布，无法有效 进入肿瘤内坏死及血管破坏区域，使肿瘤细胞不能有效接触到治疗药物。
免疫细胞(Immune cell)是指参与免疫应答或与免疫应答相关的细胞。 免疫细胞可以分为多种，在人体中各种免疫细胞担任着重要的角色，包括 先天性淋巴细胞、各种吞噬细胞和能识别抗原、产生特异性免疫应答的淋 巴细胞等。研究发现，在多种恶性肿瘤中，包括乳腺、卵巢癌、前列腺癌、 结直肠癌等局部微环境中均存在大量的免疫细胞，这些免疫细胞在肿瘤组 织中的分布、密度和功能状态等综合免疫学因素可以成为较准确的独立预后预测因素。最近，肿瘤免疫治疗成为最热门的研究领域之一，成为肿瘤 治疗的重要突破方式和重要发展方向。与手术、化疗和放疗不同，肿瘤免 疫治疗主要通过激活或提高人体免疫功能来达到治疗肿瘤的目的，对人体 的副作用小；同时免疫治疗具有长期抗肿瘤免疫功能，可以特异性识别肿 瘤细胞，从而有效抑制肿瘤的转移和复发。尽管各种免疫治疗能够有效激 活机体的免疫系统对恶性转化的肿瘤细胞产生抗肿瘤免疫应答，但是肿瘤 细胞具有一系列特殊机制来逃避机体免疫系统的攻击从而继续生长。免疫 细胞在肿瘤免疫识别方面有着非常明显的缺陷，无法特异性识别单一肿瘤 细胞，这也使得免疫细胞杀伤性和治疗效果有限。因而如何增强免疫细胞 对肿瘤组织的靶向性，提高其对肿瘤细胞的选择性识别是将其应用于临床 细胞治疗的关键。
人体内的免疫细胞包括T淋巴细胞，B淋巴细胞、巨噬细胞、中性粒 细胞等，在人体中各种免疫细胞担任着重要的角色，能在接受抗原刺激后 产生相应的抗体来帮助身体自动修复。免疫细胞是人体的保护神，身体内 免疫细胞充足，可以与疾病进行对抗，它们一方面发挥着清除细菌、病毒、 外来异物的功能，另一方面消除体内衰老细胞以及发生突变的细胞，为健 康奠定基础。然而，由于对于恶性肿瘤部位复杂的微环境及肿瘤细胞的异 质性，免疫细胞在天然识别的靶向作用中往往无法靶向到肿瘤组织，所以 才造成恶性肿瘤难以根治的结果。
天然杀伤细胞(Natural Killer cell，NK细胞)是人体内一种重要的免 疫细胞，是人体抵抗癌细胞和病毒的第一道防线，可非特异性直接杀伤肿 瘤细胞，作为一种天然杀伤细胞，其优势非常明显，非特异性和MHC限制 性在机体其它免疫细胞(如T细胞和B细胞)功能低下时就显得NK细胞 的作用非常重要。但NK细胞在肿瘤免疫识别方面也同样存在上述缺陷， 它无法特异性识别单一肿瘤细胞，因而相比其它肿瘤免疫细胞，NK细胞的 杀伤性和治疗效果有限。基于此，如何增强免疫细胞，如NK细胞对肿瘤 组织的靶向性，提高其对肿瘤细胞的选择性识别在临床应用的过程中就尤 显关键。
目前，现有技术中有用免疫细胞和单抗药(如免疫检查点抑制剂)来 诱导抗体特异的细胞毒性，还有利用抗原抗体反应修饰构建嵌合抗原受体 NK细胞(CAR-NK细胞)来提升NK细胞对肿瘤的识别能力的方法。但是 上述方法存在操作复杂、反应条件严苛、反应速度慢、可能改变细胞功能 特性的缺点，因为上述技术属于天然识别的靶向作用，对于恶性肿瘤部位 复杂的微环境及肿瘤细胞的异质性来说，只能针对相应的单一细胞进行靶 向识别，适用范围窄，靶向效果差。
发明内容
针对现有技术中的缺陷，本发明提出了一种点击化学介导的靶向方 法，通过单糖、胆碱或氨基酸的细胞代谢将点击化学基团代谢到第一细胞 表面；将点击化学配对基团修饰的单糖、胆碱或氨基酸共价连接到生物大 分子上，利用生物大分子的被动运输特异性的靶向第二细胞，再通过单 糖、胆碱或氨基酸的细胞代谢将点击化学配对基团代谢到第二细胞表面， 在第二细胞表面构建点击化学的人工靶点，使得两种细胞在点击化学基团 的作用下发生生物正交反应，增强第一细胞对第二细胞的识别作用，从而 引发相应的生物过程。
本发明提供一种点击化学介导的靶向方法，包括以下步骤：
通过第一细胞代谢的方法将点击化学基团代谢到第一细胞表面，得到 点击化学-第一细胞；通过第二细胞代谢的方法将点击化学配对基团代谢 到第二细胞表面，得到点击化学配对-第二细胞；
所述点击化学基团代谢到第一细胞表面之前还包括用所述点击化学 基团修饰能代谢在细胞上的单元材料，得到点击化学-能代谢在细胞上的 单元材料；所述点击化学配对基团代谢到第二细胞表面之前还包括用所述 点击化学配对基团修饰能代谢在细胞上的单元材料，然后将点击化学配对 基团修饰后的能代谢在细胞上的单元材料与生物大分子共价结合，得到点 击化学配对-能代谢在细胞上的单元材料-生物大分子；所述能代谢在细胞 上的单元材料为单糖、单糖类似物、胆碱、胆碱类似物、氨基酸中的任一 种；
所述点击化学-第一细胞和所述点击化学配对-第二细胞之间进行生 物正交反应，实现两种细胞的靶向结合。
进一步的，所述第一细胞代谢的方法是通过将所述点击化学-能代谢 在细胞上的单元材料与第一细胞共培育实现将点击化学基团代谢于第一 细胞表面；所述第二细胞代谢的方法是通过将所述点击化学配对-能代谢 在细胞上的单元材料-生物大分子与第二细胞共培育实现将点击化学配对 基团代谢于第二细胞表面。
点击化学配对基团修饰后的能代谢在细胞上的单元材料再与生物大 分子共价连接后的产物进入细胞后，生物大分子会被细胞内的酶分解掉， 只留下点击化学配对-能代谢在细胞上的单元材料，随后通过细胞代谢将 点击化学配对基团代谢到第二细胞表面。
进一步的，所述点击化学基团和/或所述点击化学配对基团为 (1R,8S,9r)-双环[6.1.0]壬-4-炔基-9-基甲醇、炔基类似物、叠氮、四嗪类似 物、二苯并环辛炔中的任一种。
进一步的，所述生物大分子为透明质酸、白蛋白、磷脂中的任一种。
生物大分子作为生物体内的天然活性成分，具有良好的内在生物化学 和生物物理特性，在半衰期、稳定性、安全性和制造易用性等方面均表现 出潜在的优势，还可凭借自身特异性靶向配体实现靶向作用，透明质酸可 以与细胞表面表达的CD44受体特异性结合。使用生物大分子可以在生物 体内更好的把小分子输送到细胞内。
进一步的，所述两种细胞的靶向结合步骤中的所述点击化学-第一细 胞与所述点击化学配对-第二细胞的摩尔比为1：0.2～5。
进一步的，所述第一细胞为免疫细胞。所述免疫细胞为天然杀伤细胞、 T细胞、巨噬细胞、中性粒细胞中的任一种。
进一步的，所述第二细胞为癌症相关的肿瘤细胞系。所述肿瘤细胞系 为Raji、MCF-7、HepG2、K562、A549、MB49中的任一种。
本发明的方法在原理上适用于任何细胞类型的靶向，并不局限于肿瘤 细胞和免疫细胞的靶向，因为只要是活生命体，都可以通过单糖、胆碱或 氨基酸的细胞代谢把点击化学基团代谢到细胞表面，从而通过点击化学的 快速配对反应实现被修饰的细胞的结合和靶向。操作的过程也并非只有在 肿瘤细胞和免疫细胞中才可以实现。
本发明还提供所述的点击化学介导的靶向方法在细胞识别方面的应 用。
综上，与现有技术相比，本发明达到了以下技术效果：
本发明利用生物大分子的被动运输可以在生物体内更好的把小分子输 送到细胞内，还能精准靶向到细胞，增加靶向性。本发明的方法能够针对 多种细胞进行靶向识别，并不限制细胞类型，适用范围广。本发明的方法 以点击化学反应介导，点击化学的快速配对反应能够提高反应速度，加快 实验流程，点击化学基团的表面修饰并不影响细胞的功能特性，细胞仍可 进行正常的生理生化反应。本发明的方法操作简便，反应温和，重现性 好。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需 要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些 实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲， 在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明提出的点击化学介导的人工靶向方法的流程示意图。
图2为激光共聚焦及流式分析Raji细胞分别代谢Ac4ManNAz和 HA-Ac3ManN-BCN。
图3为激光共聚焦分析修饰后的NK细胞(N3-NK细胞)及修饰后的 Raji细胞(BCN-Raji细胞)共孵育后由生物正交反应介导的细胞靶向识别。
图4为荧光倒置显微镜分析钙黄绿素/碘化丙啶(Calcein-AM/PI)细胞 染色结果。
图5为N3-NK细胞在小鼠体内的肿瘤组织靶向性与生物分布。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明 实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述， 显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施 例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动 的前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
点击化学，也译作链接化学、速配接合组合式化学、动态组合化学， 是由2001年诺贝尔化学奖获得者美国化学家Sharpless首次提出。点击化学 的主旨是通过小单元的拼接，来快速可靠地完成形形色色分子的化学合成。 目前点击化学的发展极为迅速，涉及到了各个领域，特别是在功能聚合物、 表面修饰、生物大分子、DNAs，生物与化学传感器等方面取得了瞩目的成 就。点击化学已经应用在临床的很多方面，例如在肿瘤的表面修饰点击化 学基团，利用配对基团的修饰实现纳米诊疗一体化试剂、分子探针等化学 试剂的肿瘤靶向。本发明中的将其作为细胞之间识别和靶向的应用还没有 报道，目前现有技术中针对细胞识别，常用作抗原抗体识别，其结合力低 于点击化学反应，反应系数高达108，且抗体改造筛选花费时间长，操作困 难。因点击化学具有应用范围广、产率高、副产物无害、反应条件简单、 合成反应快速等优点将其作为本发明中的方法，利用点击化学的人工靶向 方法靶向效果更强更特异。
纳米材料可以作为药物载体，以纳米颗粒为基础的诊疗平台可通过主 动和被动靶向进行精确诊断和有效给药，但是纳米材料的毒性和不可降解 性也限制了其作为药物载体的应用。生物大分子作为生物体内的天然活性 成分，具有良好的内在生物化学和生物物理特性，在半衰期、稳定性、安 全性和制造易用性等方面均表现出潜在的优势；将生物大分子与纳米材料 相结合可以显著提高纳米材料的生物相容性，并且生物大分子可通过识别 特异性受体而实现主动靶向功能。因此，生物大分子在纳米药物载体的构 建、靶向纳米药物的制备等方面均具有良好的发展前景。蛋白质、多糖及 脂类是目前应用最广泛的生物大分子，作为载体应用于纳米药物不仅能改 善化疗药物的水溶性、稳定性，还能进一步实现通过温度、pH或空间控制 的方式智能释药，除此之外还可凭借自身特异性靶向配体实现靶向给药。
透明质酸(HA)是一种常见的生物大分子，是经5β-胆汁酸修饰的酸 性黏糖，广泛存在于细胞基质中。HA由D-葡萄糖醛酸和N-乙酰基-D-葡萄 糖胺交替单元组成，通过交替的β-1，4和β-1，3糖苷键连接在一起，其 分子中有4个化学修饰位点，分别是羧基、羟基、N-乙酰氨基和还原末端， 羟基和羧基是常用的修饰位点，可利用酯化、酰胺化、静电作用等方法对 其修饰，从而改善其性能。HA降解速度很快，机体通过透明质酸酶可将基 质中的HA降解为无毒的CO2和H2O。HA无抗原性，可存在于任何一种生 物体内，无物种和组织差异性，最重要的是HA可以与许多肿瘤细胞表面 过表达的CD44受体特异性结合。因此，目前HA已被作为靶向配体用于癌 症治疗。此外，HA可在纳米粒子表面形成亲水层，保护其不被降解，从而延长HA修饰纳米粒子的体内循环时间。Teijeiro-Valino等将HA与肿瘤归 巢穿膜肽Lyp1(tLyp1)结合作为纳米外壳，包埋油性核，并证实该纳米载 体所负载的药物在原位肿瘤及淋巴系统均出现富集，在扼制原位肿瘤生长 的同时，也抑制了肿瘤的淋巴转移。除了通过特异性识别CD44受体实现靶 向功能外，由于HA可被透明质酸酶水解，一些学者利用该原理构建基于 HA的纳米载体，实现肿瘤微环境的药物释放。近年来，能够对温度、pH、 氧化还原反应、光辐照、酶及特定物质(如过氧化氢)等外界和内部刺激 作出反应的智能药物递送纳米系统被认为是最理想的药物载体，封装在这 些系统中的药物可以在指定的地点和时间，以期望的速度进行释放。Xu等 成功开发了一种新型的多功能纳米探针金纳米棒(GNRs)-HA-光敏剂5-氨基 乙酰丙酸(ALA)/显像剂(Cy7.5)-HER2，实现了双靶向给药、三重刺激药物 释放、近红外成像联合PDT/PTT治疗HER2阳性乳腺癌；该纳米探针在血 液循环中表现出良好的稳定性，GNRs、HA、ALA及Cy7.5所构建的纳米 平台能够应对pH、GSH和透明质酸酶三重刺激触发的药物释放行为。HA 作为细胞外基质的主要成分之一，在医学领域展现了较好的应用潜能，但 大多数研究仍处于体外试验阶段，体内研究报道较少，而且HA生产工艺 复杂，工业化难度大。因此，HA作为药物载体的产业化和广泛临床应用仍 需进一步研究。本发明中采用生物大分子如HA与点击化学配对基团修饰 的单糖、单糖类似物、胆碱、胆碱类似物、氨基酸共价结合，通过细胞实 验证明引入能与肿瘤细胞特异性结合的生物大分子可以显著提高免疫细胞 对肿瘤细胞的靶向性。
生物正交反应指的是那些在活体细胞或组织中能够在不干扰生物自身 生化反应条件下可以进行的化学反应。点击化学的快速配对反应即为生物 正交反应。
本发明引入一种新型的点击化学介导的人工靶向技术增强免疫细胞对 肿瘤细胞及组织的特异性识别能力，对肿瘤组织的糖类、胆碱类及氨基酸 代谢进行标记，由于上述代谢是普适性修饰，能够从根本上改变肿瘤的异 质性，在肿瘤细胞表面构建均一、稳定的人工点击化学基团靶点，引入人 工靶点可使肿瘤细胞消除微环境对肿瘤免疫的影响，改变肿瘤微环境；同 时用点击化学配对基团修饰的糖类、胆碱类及氨基酸改造免疫细胞，在免疫细胞表面无损标记点击化学配对基团；通过点击化学的快速配对反应(生 物正交反应)增强免疫细胞对肿瘤的识别与靶向；基于以上识别，免疫细 胞在肿瘤区域富集，进而增强免疫细胞的杀伤和治疗能力。尤其特别的是 本发明中利用生物大分子如透明质酸的被动运输可以精准靶向到细胞，透 明质酸可以与细胞表面过表达的CD44受体特异性结合，所以利用生物大分 子如透明质酸能够显著增加免疫细胞对肿瘤细胞的靶向性。但是需要指出的是，CD44受体在正常细胞上面也有表达，所以本发明的方法对于细胞类 型并没有限定，其他细胞类型也可以使用本发明的靶向方法。
具体的，本发明的点击化学介导的靶向方法可以分为如下步骤，如图1 所示：
(1)采用点击化学基团(例如叠氮、(1R,8S,9r)-双环[6.1.0]壬-4-炔基-9- 基甲醇、四嗪、二苯并环辛炔)修饰单糖、胆碱或氨基酸，形成单糖-点击 化学类似物、胆碱-点击化学类似物或氨基酸-点击化学类似物。
(2)将以上单糖-点击化学类似物、胆碱-点击化学类似物或氨基酸-点 击化学类似物与第一细胞(免疫细胞，包括NK细胞、T细胞、巨噬细胞、 中性粒细胞)共培育，使得第一细胞表面表达点击化学基团，得到点击化 学-第一细胞。
(3)参照步骤(1)，将点击化学配对基团(例如(1R,8S,9r)-双环[6.1.0] 壬-4-炔基-9-基甲醇、叠氮、四嗪、二苯并环辛炔)修饰单糖、胆碱或氨基 酸，形成点击化学配对-单糖类似物或点击化学配对-胆碱类似物或点击化 学配对-氨基酸类似物。点击化学的配对基团能够与点击化学基团之间发生 生物正交反应。
(4)点击化学配对-单糖类似物或点击化学配对-胆碱类似物或点击化 学配对-氨基酸类似物通过共价键与生物大分子(生物大分子包括透明质 酸HA、白蛋白HSA、磷脂)相结合形成点击化学配对-单糖类似物-生物 大分子或点击化学配对-胆碱类似物-生物大分子或点击化学配对-氨基酸- 生物大分子。
(5)参照步骤(2)，将步骤(4)中的点击化学配对-单糖类似物-生 物大分子或点击化学配对-胆碱类似物-生物大分子或点击化学配对-氨基 酸-生物大分子与第二细胞(肿瘤细胞，包括Raji、MCF-7、HepG2、K562、 A549、MB49细胞)共培育，使得第二细胞表面表达点击化学配对基团， 得到点击化学配对-第二细胞。需要指出的是，点击化学配对-单糖类似物 -生物大分子或点击化学配对-胆碱类似物-生物大分子或点击化学配对-氨 基酸-生物大分子进入细胞之后，生物大分子会被细胞中的酶分解，酶解 后产生点击化学配对-单糖类似物或点击化学配对-胆碱类似物或点击化 学配对-氨基酸，然后通过细胞代谢的方法将点击化学配对基团代谢到第 二细胞表面。
(6)将具有免疫功能的点击化学-第一细胞与点击化学配对-第二细胞 混合，利用点击化学基团与点击化学配对基团之间的快速反应，实现第一 细胞和第二细胞的特异性快速识别及靶向，促进第一细胞和第二细胞的相 互作用，从而增强免疫细胞的杀伤效果。
以上操作步骤中，得到点击化学-第一细胞和得到点击化学配对-第二细 胞的顺序不分先后，先获得哪一种都可以。
以下实施例中的点击化学基团以(1R,8S,9r)-双环[6.1.0]壬-4-炔基-9-基 甲醇(BCN)和叠氮为例，炔基类似物、四嗪类似物、二苯并环辛炔(DBCO) 等均为点击化学中的基团，都能够进行糖类、胆碱类和氨基酸的修饰，都 能够通过细胞代谢的方法代谢到细胞表面，因此本领域技术人员能够推及 炔基类似物、四嗪类似物、DBCO均可适用以下的方案。
以下实施例中的免疫细胞以NK细胞为例，肿瘤细胞以Raji细胞为例， 但是其他免疫细胞如T细胞、巨噬细胞、中性粒细胞都能够在其表面表达 点击化学基团，其他肿瘤细胞如MCF-7、HepG2、K562、A549、MB49细 胞都能都能够在其表面表达点击化学配对基团，因此本领域技术人员能够 推及其他免疫细胞如T细胞、巨噬细胞、中性粒细胞，其他肿瘤细胞如MCF-7、HepG2、K562、A549、MB49细胞均可适用以下的方案。
以下实施例中的生物大分子以HA为例，但是白蛋白(HAS)、磷脂均 可以与肿瘤细胞表面过表达的受体特异性结合，能够显著增加免疫细胞对 肿瘤细胞的靶向性，因此本领域技术人员能够推及白蛋白(HAS)、磷脂均 可适用以下的方案。
以下实施例以合成的BCN单糖类似物(HA-Ac3Man-BCN)及相应的 点击化学基团叠氮修饰的甘露糖类似物(AC4ManNAz)为例，实现促进免 疫细胞对肿瘤细胞的靶向识别功能，增强免疫细胞的治疗效果。
实验操作和验证效果的流程如下：
(1)BCN单糖类似物-生物大分子(HA-Ac3Man-BCN)在肿瘤细胞中 的代谢
将肿瘤细胞孵育过夜，将含HA-Ac3Man-BCN的二甲基亚砜溶液加入 肿瘤细胞的培养基中，使其终浓度在10-200μmol/L，混合液在培养箱中共 孵育48-72小时，获得表面修饰BCN基团的肿瘤细胞。
(2)叠氮修饰的甘露糖类似物(AC4ManNAz)在免疫细胞(如NK细 胞)中的代谢
将免疫细胞孵育过夜，将含Ac4ManNAz的二甲基亚砜溶液加入免疫细 胞的培养基中，使其终浓度在10-200μmol/L，混合液在培养箱中共孵育 48-72小时，获得表面修饰叠氮基团的免疫细胞。
(3)点击化学人工靶向介导的免疫细胞对肿瘤细胞的识别及杀伤
将BCN-A细胞与N3-B细胞按照一定比例(1：0.2～5)混合，通过共 聚焦显微镜、time laps、毒性评价等实验检测两种细胞之间的相互作用，以 没有携带BCN及N3基团的肿瘤细胞和免疫细胞作为对照，确认其在代谢 点击化学正交反应基团后能更好的增强其靶向识别功能。
(4)点击化学人工靶向介导的免疫细胞对动物模型实体瘤的治疗效果
当NOD/SCID荷瘤小鼠的肿瘤体积达到100-200mm3时，对注射N3-NK 细胞组的小鼠提前瘤内注射HA-Ac3Man-BCN(1-4mg/kg)，连续瘤内注射 2-4天，使小鼠肿瘤标记BCN基团。通过尾静脉给药分别注射标记有探针 (如细胞膜染料DIR等)的NK及N3-NK cells，通过小动物成像及肿瘤组 织大小监测等手段，以没有点击化学修饰的组作为对照，来确定通过点击 化学人工靶向手段能促进NK细胞在肿瘤组织部位更好的靶向富集及发挥 更强的杀伤及治疗效果。
实施例1
(1)BCN单糖类似物(HA-Ac3ManN-BCN)在B淋巴瘤细胞(Raji 细胞)中的代谢
将适量Raji细胞培育在6孔板中，孵育过夜，将HA-Ac3Man-BCN的 二甲基亚砜溶液加入Raji细胞的培养基中，使其终浓度在20-50μmol/L， 混合液在培养箱中共孵育48-72小时，使Raji细胞表面充分代谢上BCN基 团。共孵育结束后，获得表面修饰BCN基团的Raji细胞(BCN-Raji cell)。 如图2所示，Hoechst通道应为蓝色荧光，DBCO-543通道应为绿色荧光， Cy5.5通道应为红色荧光，Merge通道为前面两个通道的叠加。
HA-Ac3Man-BCN糖修饰的Raji细胞表面显示红色的Tz-cy5荧光信号，图 中以灰度表示，而没有经过糖修饰的Raji细胞表面几乎检测不到荧光信号； 同样，流式细胞分析结果显示HA-Ac3Man-BCN糖修饰的Raji细胞检测到 更多更强的荧光信号，与共聚焦成像的结果一致。这些结果证明，-BCN被 成功的修饰到了Raji细胞的表面。
(2)叠氮修饰的甘露糖类似物(Ac4ManNAz)在免疫细胞(NK细胞) 中的代谢
将适量NK-92MI细胞培育在6孔板中，孵育过夜，将Ac4ManNAz的 二甲基亚砜溶液加入NK细胞的培养基中，使其终浓度在20-50μmol/L，混 合液在培养箱中共孵育48-72小时，使NK细胞表面充分代谢上叠氮(-N3) 基团。共孵育结束后，将混合液收集，离心，用PBS清洗细胞，离心，收 集细胞，获得表面修饰叠氮基团的NK细胞(N3-NK cells)。如图2所示，Ac4ManNAz糖修饰的NK-92MI细胞表面显示红色的DBCO-cy5荧光信号， 图中以灰度显示，而没有经过糖修饰的NK细胞表面几乎检测不到荧光信 号；同样，流式细胞分析结果显示AC4ManNAz糖修饰的NK细胞检测到更 多更强的荧光信号，与共聚焦成像的结果一致。这些结果证明，-N3被成功 的修饰到了NK细胞的表面。
(3)两种细胞的靶向识别与结合作用
将适量BCN-Raji细胞与N3-NK细胞按照1：1比例混合，通过共聚焦 显微镜、timelaps、毒性评价等实验检测两种细胞之间的相互作用，以没有 携带BCN及N3基团的Raji细胞和NK细胞作为对照，如图3所示，结果 显示N3-NK细胞能快速的聚集在BCN-Raji细胞周围，说明两种细胞发生了 靶向识别。
实施例2叠氮甘露糖类似物(HSA-Ac3ManAz)修饰后的免疫细胞(NK 细胞)对BCN单糖类似物(HSA-Ac3Man-BCN)修饰的B淋巴瘤细胞杀 伤增强
将适量BCN-Raji细胞接种到24孔板上，分别将BCN-Raji与N3-NK 细胞按比例为1:0.5，1:1加入一定量的N3-NK细胞，共孵育24h。结束后 细胞用钙黄绿素/碘化丙啶(Calcein-AM/PI)进行活/死细胞染色，随后用 荧光倒置显微镜对染色后的Raji细胞进行成像分析。钙黄绿素/碘化丙啶(Calcein-AM/PI)细胞染色结果如图4所示，N3-NK组的Raji细胞较其 他组(未经点击化学人工靶向修饰的细胞组)出现大量的红色荧光，表明 Raji细胞大量死亡，说明叠氮甘露糖类似物(HSA-Ac3ManAz)修饰后的 免疫细胞(NK细胞)对BCN单糖类似物(HSA-Ac3Man-BCN)修饰的B 淋巴瘤细胞杀伤增强。
实施例3叠氮甘露糖类似物(Ac4ManNAz)修饰后的免疫细胞N3-NK细 胞在体内肿瘤组织区域靶向研究
当NOD/SCID荷瘤小鼠的肿瘤体积达到100-200mm3时，将小鼠分为 两组，通过尾静脉给药分别注射由细胞膜染料(如DIR)染色的NK和N3-NK 细胞。注射N3-NK的小鼠提前瘤内注射Ac4ManN-BCN，使小鼠肿瘤标记 BCN基团。用小动物活体成像系统对给药小鼠进行荧光成像。处理72h后， 将其主要器官(心，肝，脾，肺，肾)和肿瘤取出，用小动物活体成像系 统进行荧光成像，如图5所示，结果表明N3-NK组NK细胞在肿瘤区域富 集更多，说明叠氮修饰改造后的NK细胞对肿瘤识别能力增强，从而有更 多的NK细胞富集在肿瘤区域，证明其靶向性更好。
综上，本发明引入一种新型的点击化学介导的人工靶向技术增强免疫 细胞对肿瘤细胞及组织的特异性识别能力，对肿瘤组织的糖类、胆碱类及 氨基酸代谢进行标记，由于上述代谢是普适性修饰，能够从根本上改变肿 瘤的异质性，在肿瘤细胞表面构建均一、稳定的人工点击化学基团靶点， 引入人工靶点可使肿瘤细胞消除微环境对肿瘤免疫的影响，改变肿瘤微环 境；同时用点击化学配对基团修饰的糖类、胆碱类及氨基酸改造免疫细胞， 在免疫细胞表面无损标记点击化学配对基团；通过点击化学的快速配对反 应(生物正交反应)增强免疫细胞对肿瘤的识别与靶向；基于以上识别， 免疫细胞在肿瘤区域富集，进而增强免疫细胞的杀伤和治疗能力。尤其特 别的是本发明中利用生物大分子如透明质酸的被动运输可以精准靶向到细 胞，透明质酸可以与许多肿瘤细胞表面过表达的CD44受体特异性结合，所 以利用生物大分子如透明质酸能够显著增加免疫细胞对肿瘤细胞的靶向性。但是需要指出的是，CD44受体在正常细胞上面也有表达，所以本发明 的方法对于细胞类型并没有限定，其他细胞类型也可以使用本发明的靶向 方法。
以上实施例中的免疫细胞以NK细胞为例，肿瘤细胞系以Raji为例， 但是本发明的方法在原理上适用于任何细胞类型的靶向，并不局限于肿瘤 细胞和免疫细胞的靶向，因为只要是活生命体，都可以通过单糖、胆碱或 氨基酸的细胞代谢把点击化学基团代谢到细胞表面，从而通过点击化学的 快速配对反应实现被修饰的细胞的结合和靶向。以上的实验操作也并非只 有在肿瘤细胞和免疫细胞中才可以实现。
本发明的方法可以应用于免疫细胞和肿瘤细胞之间的靶向，点击化学 基团修饰后的免疫细胞能够增强对肿瘤细胞的识别能力。此外，第二细胞 除了可以为免疫细胞外，还可以是点击化学基团的纳米颗粒，运用本发明 的靶向方法，可以使点击化学基团的纳米颗粒靶向肿瘤组织，纳米颗粒中 中可以包载抗肿瘤药物，实现对肿瘤的靶向治疗。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发 明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在 本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种点击化学介导的靶向方法，其特征在于，包括以下步骤：
通过第一细胞代谢的方法将点击化学基团代谢到第一细胞表面，得到点击化学-第一细胞；通过第二细胞代谢的方法将点击化学配对基团代谢到第二细胞表面，得到点击化学配对-第二细胞；
所述点击化学基团代谢到第一细胞表面之前还包括用所述点击化学基团修饰能代谢在细胞上的单元材料，得到点击化学-能代谢在细胞上的单元材料；所述点击化学配对基团代谢到第二细胞表面之前还包括用所述点击化学配对基团修饰能代谢在细胞上的单元材料，然后将点击化学配对基团修饰后的能代谢在细胞上的单元材料与生物大分子共价结合，得到点击化学配对-能代谢在细胞上的单元材料-生物大分子；所述能代谢在细胞上的单元材料为单糖、单糖类似物、胆碱、胆碱类似物、氨基酸中的任一种；
所述点击化学-第一细胞和所述点击化学配对-第二细胞之间进行生物正交反应，实现两种细胞的靶向结合。
2.根据权利要求1所述的点击化学介导的靶向方法，其特征在于，所述第一细胞代谢的方法是通过将所述点击化学-能代谢在细胞上的单元材料与第一细胞共培育实现将点击化学基团代谢于第一细胞表面；所述第二细胞代谢的方法是通过将所述点击化学配对-能代谢在细胞上的单元材料-生物大分子与第二细胞共培育实现将点击化学配对基团代谢于第二细胞表面。
3.根据权利要求1所述的点击化学介导的靶向方法，其特征在于，所述点击化学基团和/或所述点击化学配对基团为(1R,8S,9r)-双环[6.1.0]壬-4-炔基-9-基甲醇、炔基类似物、叠氮、四嗪类似物、二苯并环辛炔中的任一种。
4.根据权利要求1所述的点击化学介导的靶向方法，其特征在于，所述生物大分子为透明质酸、白蛋白、磷脂中的任一种。
5.根据权利要求1所述的点击化学介导的靶向方法，其特征在于，所述两种细胞的靶向结合步骤中的所述点击化学-第一细胞与所述点击化学配对-第二细胞的摩尔比为1：0.2～5。
6.根据权利要求1所述的点击化学介导的靶向方法，其特征在于，所述第一细胞为免疫细胞。
7.根据权利要求6所述的点击化学介导的靶向方法，其特征在于，所述免疫细胞为天然杀伤细胞、T细胞、巨噬细胞、中性粒细胞中的任一种。
8.根据权利要求1所述的点击化学介导的靶向方法，其特征在于，所述第二细胞为癌症相关的肿瘤细胞系。
9.根据权利要求8所述的点击化学介导的靶向方法，其特征在于，所述肿瘤细胞系为Raji、MCF-7、HepG2、K562、A549、MB49中的任一种。
10.权利要求1-9任一项所述的点击化学介导的靶向方法在细胞识别方面的应用。
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