CN111718904A - 一种点击化学介导的靶向方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种点击化学介导的靶向方法，通过单糖、胆碱或氨基酸的细胞代谢将点击化学基团代谢到第一细胞表面，在第一细胞表面构建点击化学的人工靶点，再通过单糖、胆碱或氨基酸的细胞代谢将点击化学配对基团代谢到第二细胞表面，使得两种细胞在点击化学基团的作用下发生生物正交反应，增强第一细胞对第二细胞的识别作用，从而引发相应的生物过程。本发明的方法能够增强免疫细胞对肿瘤的识别与杀伤，在人工靶向技术领域有广阔的应用前景。

Description

一种点击化学介导的靶向方法
技术领域
本发明涉及人工靶向技术领域，特别涉及一种点击化学介导的靶向方法。
背景技术
细胞免疫治疗疗法，是采集人体自身免疫细胞，经过体外培养，使其数量成千倍增多，靶向性杀伤功能增强，然后再回输到人体来杀灭血液及组织中的病原体、癌细胞、突变的细胞，打破免疫耐受，激活和增强机体的免疫能力，具有兼顾治疗和保健的双重功效。2013年，《科学》杂志将免疫治疗列为年度十大科学突破之首，2018年诺贝尔生理学或医学奖“发现负性免疫调节治疗癌症的疗法”让细胞免疫疗法再次成为全球研发的热点。
人体内的免疫细胞包括T淋巴细胞，B淋巴细胞、巨噬细胞、中性粒细胞等，在人体中各种免疫细胞担任着重要的角色，能在接受抗原刺激后产生相应的抗体来帮助身体自动修复。免疫细胞是人体的保护神，身体内免疫细胞充足，可以与疾病进行对抗，它们一方面发挥着清除细菌、病毒、外来异物的功能，另一方面消除体内衰老细胞以及发生突变的细胞，为健康奠定基础。然而，由于对于恶性肿瘤部位复杂的微环境及肿瘤细胞的异质性，免疫细胞在天然识别的靶向作用中往往无法靶向到肿瘤组织，所以才造成恶性肿瘤难以根治的结果。
天然杀伤细胞(Natural Killer cell，NK细胞)是人体内一种重要的免疫细胞，是人体抵抗癌细胞和病毒的第一道防线，可非特异性直接杀伤肿瘤细胞，作为一种天然杀伤细胞，其优势非常明显，非特异性和MHC限制性在机体其它免疫细胞(如T细胞和B细胞)功能低下时就显得NK细胞的作用非常重要。但NK细胞在肿瘤免疫识别方面也同样存在上述缺陷，它无法特异性识别单一肿瘤细胞，因而相比其它肿瘤免疫细胞，NK细胞的杀伤性和治疗效果有限。基于此，如何增强免疫细胞，如NK细胞对肿瘤组织的靶向性，提高其对肿瘤细胞的选择性识别在临床应用的过程中就尤显关键。
目前，现有技术中有用免疫细胞和单抗药(如免疫检查点抑制剂)来诱导抗体特异的细胞毒性，还有利用抗原抗体反应修饰构建嵌合抗原受体NK细胞(CAR-NK细胞)来提升NK细胞对肿瘤的识别能力的方法。但是上述方法存在操作复杂、反应条件严苛、反应速度慢、可能改变细胞功能特性的缺点，因为上述技术属于天然识别的靶向作用，对于恶性肿瘤部位复杂的微环境及肿瘤细胞的异质性来说，只能针对相应的单一细胞进行靶向识别，适用范围窄，靶向效果差。
发明内容
针对现有技术中的缺陷，本发明采用一种点击化学介导的人工靶向方法，通过单糖、胆碱或氨基酸的细胞代谢将点击化学基团代谢到第一细胞表面，在第一细胞表面构建点击化学的人工靶点，再通过单糖、胆碱或氨基酸的细胞代谢将点击化学配对基团代谢到第二细胞表面，使得两种细胞在点击化学基团的作用下发生生物正交反应，增强第一细胞对第二细胞的识别作用，该方法操作简便，反应温和，重现性好，反应迅速，适用范围广，能够增强免疫细胞对肿瘤细胞的靶向作用。
一种点击化学介导的靶向方法，包括以下步骤：
(1)通过细胞代谢的方法将点击化学基团代谢到第一细胞表面，得到点击化学-第一细胞；
(2)通过细胞代谢的方法将点击化学配对基团代谢到第二细胞表面，得到点击化学配对-第二细胞；
(3)所述点击化学-第一细胞和所述点击化学配对-第二细胞之间进行生物正交反应，实现两种细胞的结合。
进一步的，所述步骤(1)和/或所述步骤(2)中的所述细胞代谢的方法是使用点击化学基团修饰单糖、单糖类似物、胆碱、胆碱类似物、氨基酸中的任一种。
进一步的，所述步骤(1)和/或所述步骤(2)中的所述点击化学基团为(1R,8S,9r)-双环[6.1.0]壬-4-炔基-9-基甲醇、炔基类似物、叠氮、四嗪类似物、二苯并环辛炔中的任一种。
进一步的，所述步骤(1)中的所述点击化学-第一细胞通过将点击化学基团与第一细胞共培育获得，所述步骤(2)中的所述点击化学配对-第二细胞通过将点击化学配对基团与第二细胞共培育获得。
进一步的，所述共培育的时间为48-72h。
进一步的，所述步骤(1)中的所述第一细胞为癌症相关的肿瘤细胞系。
进一步的，所述肿瘤细胞系为Raji、MCF-7、HepG2、K562、A549、MB49中的任一种。
进一步的，所述步骤(2)中的所述第二细胞为NK细胞、T细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、点击化学基团的纳米颗粒中的任一种。
进一步的，所述步骤(3)中的所述点击化学-第一细胞与所述点击化学配对-第二细胞的摩尔比为1：0.2～5。
本发明还提供所述的点击化学介导的靶向方法在细胞识别方面的应用，尤其是免疫细胞和肿瘤细胞识别方面的应用。
综上，与现有技术相比，本发明达到了以下技术效果：
1.本发明能够实现免疫细胞和肿瘤细胞的人工靶向。
2.本发明操作简便，反应温和，重现性好。
3.本发明的方法以点击化学反应介导，反应迅速。
4.本发明的方法能够针对多种细胞进行靶向识别，适用范围广。
5.本发明方法能够对肿瘤细胞和免疫细胞进行表面修饰，点击化学基团的表面修饰不影响细胞的功能特性。
6.由于糖、胆碱和氨基酸代谢的普适性修饰，能够从根本上改变肿瘤的异质性，能够在肿瘤表面均一稳定的引入点击化学-人工靶点，并利用体内的生物正交识别增强免疫细胞对肿瘤的靶向及杀伤。
附图说明
了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为以甘露糖为例合成四乙酰化的BCN单糖类似物(Ac4ManN-BCN)的合成路线。
图2为实施例2中激光共聚焦及流式细胞仪分析NK-92MI细胞和Raji细胞分别代谢Ac4ManNAz和Ac4ManN-BCN的示意图。图2A为NK-92MI细胞代谢叠氮基团的共聚焦显微镜成像图。图2B为Raji细胞代谢BCN基团的共聚焦显微镜成像图。图2C为NK-92MI细胞代谢叠氮基团的流式细胞结果图。图2D为Raji细胞代谢BCN基团的流式细胞结果图。
图3为实施例2中激光共聚焦分析修饰后的NK细胞(N3-NK细胞)及修饰后的Raji细胞(BCN-Raji细胞)共培育后通过生物正交反应介导的细胞靶向识别。
图4为实施例3中荧光倒置显微镜分析钙黄绿素/碘化丙啶(Calcein-AM/PI)细胞染色结果。
图5为实施例4中N3-NK细胞在小鼠体内的肿瘤组织靶向性与生物分布图。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
点击化学，也译作链接化学、速配接合组合式化学、动态组合化学，是由2001年诺贝尔化学奖获得者美国化学家Sharpless首次提出。点击化学的主旨是通过小单元的拼接，来快速可靠地完成形形色色分子的化学合成。目前点击化学的发展极为迅速，涉及到了各个领域，特别是在功能聚合物、表面修饰、生物大分子、DNAs，生物与化学传感器等方面取得了瞩目的成就。点击化学已经应用在临床的很多方面，例如在肿瘤的表面修饰点击化学基团，利用配对基团的修饰实现纳米诊疗一体化试剂、分子探针等化学试剂的肿瘤靶向。本发明中的将其作为细胞之间识别和靶向的应用还没有报道，目前现有技术中针对细胞识别，常用作抗原抗体识别，其结合力低于点击化学反应，反应系数高达108，且抗体改造筛选花费时间长，操作困难。因点击化学具有应用范围广、产率高、副产物无害、反应条件简单、合成反应快速等优点将其作为本发明中的方法，利用点击化学的人工靶向方法靶向效果更强更特异。
生物正交反应指的是那些在活体细胞或组织中能够在不干扰生物自身生化反应条件下可以进行的化学反应。点击化学的快速配对反应即为生物正交反应。
本发明引入一种新型的点击化学介导的人工靶向技术增强免疫细胞对肿瘤细胞及组织的特异性识别能力，对肿瘤组织的糖类、胆碱类及氨基酸代谢进行标记，由于上述代谢是普适性修饰，能够从根本上改变肿瘤的异质性，在肿瘤细胞表面构建均一、稳定的人工点击化学基团靶点，引入人工靶点可使肿瘤细胞消除微环境对肿瘤免疫的影响，改变肿瘤微环境；同时用点击化学配对基团修饰的糖类、胆碱类及氨基酸改造免疫细胞，在免疫细胞表面无损标记点击化学配对基团；通过点击化学的快速配对反应(生物正交反应)增强免疫细胞对肿瘤的识别与靶向；基于以上识别，免疫细胞在肿瘤区域富集，进而增强免疫细胞的杀伤和治疗能力。
具体的，本发明的点击化学介导的靶向方法可以分为如下步骤：
(1)采用点击化学基团(例如叠氮、(1R,8S,9r)-双环[6.1.0]壬-4-炔基-9-基甲醇、四嗪、二苯并环辛炔等)修饰单糖、胆碱或氨基酸，形成单糖-点击化学类似物、胆碱-点击化学类似物或氨基酸-点击化学类似物。
(2)将以上叠氮、四嗪类似物与第一细胞(免疫细胞，包括NK细胞、T细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、点击化学基团的纳米颗粒)共培育，使得第一细胞表面表达点击化学基团，得到点击化学-第一细胞。
(3)参照步骤(1)，将点击化学配对基团(例如(1R,8S,9r)-双环[6.1.0]壬-4-炔基-9-基甲醇、叠氮、四嗪、二苯并环辛炔等)修饰单糖、胆碱或氨基酸，形成点击化学配对-单糖或点击化学配对-胆碱类似物或点击化学配对-氨基酸类似物。点击化学的配对基团能够与点击化学基团之间发生生物正交反应。
(4)参照步骤(2)，将步骤(3)中的(1R,8S,9r)-双环[6.1.0]壬-4-炔基-9-基甲醇、二苯并环辛炔等类似物与第二细胞(肿瘤细胞，包括Raji、MCF-7、HepG2、K562、A549、MB49等细胞)共培育，使得第二细胞表面表达点击化学配对基团，得到点击化学配对-第二细胞。
(5)将具有免疫功能的点击化学-第一细胞对应点击化学配对-第二细胞混合，利用点击化学基团与点击化学配对基团之间的快速反应，实现第一细胞和第二细胞的特异性快速识别及靶向，促进第一细胞和第二细胞的相互作用，从而增强免疫细胞的杀伤效果。
以下实施例中的点击化学基团以(1R,8S,9r)-双环[6.1.0]壬-4-炔基-9-基甲醇(BCN)和叠氮为例，炔基类似物、四嗪类似物、二苯并环辛炔(DBCO)等均为点击化学中的基团，都能够进行糖类、胆碱类和氨基酸的修饰，都能够通过细胞代谢的方法代谢到细胞表面，因此本领域技术人员能够推及炔基类似物、四嗪类似物、DBCO均可适用以下的方案。
实施例1：以合成的BCN单糖类似物(Ac4ManN-BCN)及相应的生物正交反应基团叠氮修饰的甘露糖类似物(AC4ManAz)为例，促进免疫细胞B(NK细胞)对肿瘤细胞A的靶向识别功能。具体步骤如下：
(1)以甘露糖合成四乙酰化的BCN单糖类似物(Ac4ManN-BCN)，合成路线如图1所示。
(2)BCN单糖类似物(Ac4ManN-BCN)在肿瘤细胞A中的代谢
将肿瘤细胞A孵育过夜，将含Ac4ManN-BCN的二甲基亚砜溶液加入A细胞的培养基中，使其终浓度在10-200μmol/L，混合液在培养箱中共孵育48-72小时，获得表面修饰BCN基团的肿瘤细胞A。
(3)叠氮修饰的甘露糖类似物(AC4ManNAz)在免疫细胞B(如NK细胞)中的代谢
将免疫细胞B孵育过夜，将含Ac4ManNAz的二甲基亚砜溶液加入B细胞的培养基中，使其终浓度在10-200μmol/L，混合液在培养箱中共孵育48-72小时，获得表面修饰叠氮基团的B细胞。
(4)点击化学人工靶向介导的NK细胞对肿瘤细胞的识别及杀伤
将BCN-A细胞与N3-B细胞按照一定比例(1：0.2～5)混合，通过激光共聚焦显微镜、time laps时间间隔拍照、毒性评价等实验检测两种细胞之间的相互作用，以没有携带BCN及N3基团的A细胞和B细胞作为对照，确认其在代谢点击化学正交反应基团后能更好的增强其靶向识别功能等。
(5)点击化学人工靶向介导的NK细胞对动物模型实体瘤的治疗效果
当NOD/SCID荷瘤小鼠的肿瘤体积达到100-200mm3时，通过尾静脉给药分别注射标记有探针(如细胞膜染料DIR等)的NK及N3-NK细胞，对注射N3-NK细胞组的小鼠提前瘤内注射2-4天Ac4ManN-BCN(1-4mg/kg)，使小鼠肿瘤标记BCN基团。通过小动物成像及肿瘤组织大小监测等手段，以没有点击化学修饰的组作为对照，来确定通过点击化学人工靶向手段能促进NK细胞在肿瘤组织部位更好的靶向富集及发挥更强的杀伤及治疗效果。
实施例2
(1)叠氮修饰的甘露糖类似物(Ac4ManNAz)在免疫细胞(NK细胞)中的代谢
将适量NK-92MI细胞培育在6孔板中，孵育过夜，将Ac4ManNAz的二甲基亚砜溶液加入NK细胞的培养基中，使其终浓度在20-50μmol/L，混合液在培养箱中共孵育48-72小时，使NK细胞表面充分代谢上叠氮(-N3)基团。共孵育结束后，将混合液收集，离心，用PBS清洗细胞，离心，收集细胞，获得表面修饰叠氮基团的NK细胞(N3-NK细胞)。如图2A所示，图2A为NK-92MI细胞代谢叠氮基团的共聚焦显微镜成像图。图片以灰度显示，Hoechst通道应为蓝色荧光，DBCO-cy5通道应为红色荧光，Merge通道为前面两个通道的叠加。实验结果显示Ac4ManNAz糖修饰的NK-92MI细胞表面显示红色的DBCO-cy5荧光信号，而没有经过糖修饰的NK细胞表面几乎检测不到荧光信号；同样，图2C的NK-92MI细胞代谢叠氮基团的流式细胞分析结果显示AC4ManNAz糖修饰的NK细胞检测到更多更强的荧光信号，与共聚焦成像的结果一致。这些结果证明，-N3被成功的修饰到了NK细胞的表面。
(2)BCN单糖类似物(Ac4ManN-BCN)在B淋巴瘤细胞(Raji细胞)中的代谢
将适量Raji细胞培育在6孔板中，孵育过夜，将Ac4ManN-BCN的二甲基亚砜溶液加入Raji细胞的培养基中，使其终浓度在20-50μmol/L，混合液在培养箱中共孵育48-72小时，使Raji细胞表面充分代谢上BCN基团。共孵育结束后，获得表面修饰BCN基团的Raji细胞(BCN-Raji cell)。如图2B所示，图2B为Raji细胞代谢BCN基团的共聚焦显微镜成像图，图片以灰度显示，Hoechst通道应为蓝色荧光，Tz-cy5通道应为红色荧光，Merge通道为前面两个通道的叠加。结果显示Ac4ManN-BCN糖修饰的Raji细胞表面显示红色的Tz-cy5荧光信号，而没有经过糖修饰的Raji细胞表面几乎检测不到荧光信号；同样，图2D的Raji细胞代谢BCN基团的流式细胞结果显示AC4ManN-BCN糖修饰的Raji细胞检测到更多更强的荧光信号，与共聚焦成像的结果一致。这些结果证明，-BCN被成功的修饰到了Raji细胞的表面。
(3)两种细胞的靶向识别与结合作用
将适量BCN-Raji细胞与N3-NK细胞按照1：1比例混合，通过激光共聚焦显微镜、time laps时间间隔拍照、毒性评价等实验检测两种细胞之间的相互作用，以没有携带BCN及N3基团的Raji细胞和NK细胞作为对照，如图3所示，结果显示2h时两组细胞均只有少量细胞聚集，4h时修饰后的N3-NK细胞能快速的聚集在BCN-Raji细胞周围，修饰后的N3-NK细胞对Raji-BCN细胞靶向识别增强，从而增强杀伤效果。
实施例3：叠氮甘露糖类似物(Ac4ManNAz)修饰后的免疫细胞(NK细胞)对BCN单糖类似物(Ac4ManN-BCN)修饰的B淋巴瘤细胞杀伤增强
将适量BCN-Raji细胞接种到24孔板上，对照组为NK细胞和Raji混合，混合比例分别为1：0.5和1：1，实验组为BCN-Raji与N3-NK细胞混合，混合比例分别为1：0.5和1：1，两组细胞同时共孵育24h。结束后细胞用钙黄绿素/碘化丙啶(Calcein-AM/PI)进行活/死细胞染色，随后用荧光倒置显微镜对染色后的Raji细胞进行成像分析。图4以灰度显示，A列和D列应为红色荧光，B列和E列应为绿色荧光，C列为A列和B列通道的叠加，F列为D列和E列通道的叠加。钙黄绿素/碘化丙啶(Calcein-AM/PI)细胞染色结果显示，N3-NK组的Raji细胞较其他组(未经点击化学人工靶向修饰的细胞组)出现大量的红色荧光(图4B列和E列中BCN-Raji+N3-NK组的红色荧光比NK+Raji组强)，表明Raji细胞大量死亡，说明叠氮甘露糖类似物修饰后的NK细胞对BCN单糖类似物(Ac4ManN-BCN)修饰的B淋巴瘤细胞杀伤增强。
实施例4：叠氮甘露糖类似物(Ac4ManNAz)修饰后的免疫细胞N3-NK细胞在体内肿瘤组织区域靶向研究
当NOD/SCID荷瘤小鼠的肿瘤体积达到100-200mm3时，将小鼠分为两组，通过尾静脉给药分别注射由细胞膜染料(如DIR)染色的NK和N3-NK细胞。注射N3-NK的小鼠提前瘤内注射Ac4ManN-BCN，使小鼠肿瘤标记BCN基团。用小动物活体成像系统对给药小鼠进行荧光成像。处理72h后，将其主要器官(心，肝，脾，肺，肾)和肿瘤取出，用小动物活体成像系统进行荧光成像。如图5所示，图5为N3-NK细胞在小鼠体内的肿瘤组织靶向性与生物分布图。图片以灰度表示，除了白色区域，灰色颜色越浅说明细胞富集越多。结果显示，N3-NK细胞在肝脏富集最多，脾脏和肺次之，在心和肾没有观察到有细胞富集，且图5最后一列显示N3-NK组NK细胞在肿瘤区域荧光面积更大，富集更多，说明叠氮修饰改造后的NK细胞对肿瘤识别能力增强，从而有更多的NK细胞富集在肿瘤区域，证明其靶向性更好。
以上实施例中的免疫细胞以NK细胞为例，肿瘤细胞系以Raji为例，但是本发明的方法在原理上适用于任何细胞类型的靶向，并不局限于肿瘤细胞和免疫细胞的靶向，因为只要是活生命体，都可以通过单糖、胆碱或氨基酸的细胞代谢把点击化学基团代谢到细胞表面，从而通过点击化学的快速配对反应实现被修饰的细胞的结合和靶向。以上的实验操作也并非只有在肿瘤细胞和免疫细胞中才可以实现。
本发明的方法可以应用于免疫细胞和肿瘤细胞之间的靶向，点击化学基团修饰后的免疫细胞能够增强对肿瘤细胞的识别能力。此外，第二细胞除了可以为免疫细胞外，还可以是点击化学基团的纳米颗粒，运用本发明的靶向方法，可以使点击化学基团的纳米颗粒靶向肿瘤组织，纳米颗粒中中可以包载抗肿瘤药物，实现对肿瘤的靶向治疗。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种点击化学介导的靶向方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)通过细胞代谢的方法将点击化学基团代谢到第一细胞表面，得到点击化学-第一细胞；
(2)通过细胞代谢的方法将点击化学配对基团代谢到第二细胞表面，得到点击化学配对-第二细胞；
(3)所述点击化学-第一细胞和所述点击化学配对-第二细胞之间进行生物正交反应，实现两种细胞的结合。
2.根据权利要求1所述的点击化学介导的靶向方法，其特征在于，所述步骤(1)和/或所述步骤(2)中的所述细胞代谢的方法是使用点击化学基团修饰单糖、单糖类似物、胆碱、胆碱类似物、氨基酸中的任一种。
3.根据权利要求1所述的点击化学介导的靶向方法，其特征在于，所述步骤(1)和/或所述步骤(2)中的所述点击化学基团为(1R,8S,9r)-双环[6.1.0]壬-4-炔基-9-基甲醇、炔基类似物、叠氮、四嗪类似物、二苯并环辛炔中的任一种。
4.根据权利要求1-3任一项所述的点击化学介导的靶向方法，其特征在于，所述步骤(1)中的所述点击化学-第一细胞通过将点击化学基团与第一细胞共培育获得，所述步骤(2)中的所述点击化学配对-第二细胞通过将点击化学配对基团与第二细胞共培育获得。
5.根据权利要求4所述的点击化学介导的靶向方法，其特征在于，所述共培育的时间为48-72h。
6.根据权利要求1所述的点击化学介导的靶向方法，其特征在于，所述步骤(1)中的所述第一细胞为癌症相关的肿瘤细胞系。
7.根据权利要求6所述的点击化学介导的靶向方法，其特征在于，所述肿瘤细胞系为Raji、MCF-7、HepG2、K562、A549、MB49中的任一种。
8.根据权利要求1所述的点击化学介导的靶向方法，其特征在于，所述步骤(2)中的所述第二细胞为天然杀伤细胞、T细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、点击化学基团的纳米颗粒中的任一种。
9.根据权利要求1所述的点击化学介导的靶向方法，其特征在于，所述步骤(3)中的所述点击化学-第一细胞与所述点击化学配对-第二细胞的摩尔比为1：0.2～5。
10.权利要求1-9任一项所述的点击化学介导的靶向方法在细胞识别方面的应用。
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