CN112957478B - 一种细胞外囊泡(EVs)表面修饰靶向配体的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物医药技术领域,具体说涉及到一种在细胞外囊泡(EVs)表面修饰靶向配体的方法。EVs和靶向配体之间通过linker A和linker B连接,将靶向配体偶联在EVs表面,即获得大量靶向配体修饰的EVs;其中,linker A插入到EVs磷脂双分子层或与EVs表面膜蛋白共价偶联,形成EVs‑linker A;linker B与靶向配体共价偶联,形成靶向配体‑linker B。本发明为构建靶向EVs提供了一种快速、高效、可重复的修饰方法,反应条件温和,无有害副产物,并适合各种靶向配体,可制备针对不同疾病的靶向EVs,在临床疾病靶向治疗方面具有重要的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域,具体说涉及到一种在细胞外囊泡(EVs)表面修饰靶向配体的方法。
背景技术
细胞外囊泡(Extracellular Vesicles,EVs)是由不同细胞分泌的,广泛存在多种体液中的胞外膜性囊泡。根据生物生成和释放途径可分为:1)外泌体(Exosome),直径30~150nm;2)微囊泡(Microvesicle),直径100~1000nm;3)凋亡小体(Apoptotic body),直径50nm~2μm。EVs内容物丰富,包括蛋白质、脂质和核酸等,在生理和病理条件下,EVs将携带生物信息运输到周边靶细胞或通过血液循环及体液被远处组织摄取,因此在细胞间信息交流中发挥着重要作用,并与多种疾病的发生、发展、治疗及预后密切相关。
作为天然的胞间信息载体,相较于脂质体或多聚物纳米颗粒,EVs具有众多优点:体积小,易穿透生物膜,免疫原性低,生物相容性高,在人体血液中半衰期长,能与细胞膜直接融合,将携带的内容物释放到胞浆中,避开了溶酶体的消化,提高药物治疗效果。大量科研文献及临床试验证明了EVs在多种疾病中发挥了预防和治疗作用,此外,EVs可以作为药物载体,递送化学小分子、蛋白质、多肽和基因药物,在医疗领域具有巨大的应用潜力。
虽然EVs在新型医药领域给我们带来了希望,但研究发现,采取静脉给药方式,EVs会在肝脏、脾脏和肺等器官大量富集,最终到达病灶起治疗作用的EVs数量较少。为了将EVs能够精准地递送到病灶,增强EVs的药效,降低对正常细胞的毒副作用,需提高EVs的靶向能力。
目前构建靶向EVs的常用技术有四种:1)通过基因改造EVs供体细胞,间接获取靶向EVs,即通过质粒或病毒转染供体细胞,将靶向蛋白基因片段插入到含有外泌体膜蛋白(如,Lamp2b)质粒中,在EVs生成过程中表达的靶向蛋白被整合到EVs膜上,收集的EVs则具备了靶向能力。但是对于原代细胞或干细胞等难转染细胞,这种技术效率很低,并且不是任何靶向配体都能够采用该技术构建,因此适用范围较窄,且获取靶向EVs的效率过低,可控性差,很难大规模制备;2)利用脂质化的适体(Aptamer)或抗体片段或多肽来标记EVs的磷脂双分子层,纯化分离即可得到靶向EVs,也可将脂质化的Aptamer或抗体片段或多肽标记细胞膜,再破碎细胞得到靶向EVs,该方法的标记效率较低,且游离的脂质化分子易形成胶束,不易去除,导致“假阳性”,此外,构建脂质化的Aptamer或抗体片段或多肽技术复杂,大分子蛋白很难构建成功,降低了该方法的通用性;3)在EVs供体细胞培养过程中,加入糖类衍生物(如,N-乙酰甘露糖类、N-羟乙酰神经氨酸等),该分子进入细胞后,整合入外泌体的生成系统链,分泌的外泌体则修饰有特定糖类衍生物,因此具有肿瘤细胞靶向功能;4)直接利用EVs供体细胞的自身特点,产生靶向EVs,如,肿瘤细胞EVs具有归巢特性,白细胞或血小板EVs具有炎症趋化特性等,但实际应用时,靶向性不尽人意。简而言之,目前靶向EVs的制备方法,效率低,成本高,操作复杂,不可控,还有安全因素,不适合大规模制备并进行临床转化。
发明内容
为解决上述背景技术中提到的问题,本发明提供一种EVs表面修饰靶向配体的方法。
为实现上述目的,本发明采用技术方案为:
一种细胞外囊泡(EVs)表面修饰靶向配体的方法,EVs和靶向配体之间通过linkerA和linker B连接,将靶向配体偶联在EVs表面,即获得大量靶向配体修饰的EVs;其中,linker A插入到EVs磷脂双分子层或与EVs表面膜蛋白共价偶联,形成EVs-linker A;linker B与靶向配体共价偶联,形成靶向配体-linker B。
所述EVs-linker A和靶向配体-linker B通过linker A和linker B之间点击化学反应,将靶向配体偶联在EVs表面,即获得大量靶向配体的EVs。
所述linker A和linker B的两端分别含有化学活性基团,活性基团之间通过一定长度的聚乙二醇(PEG)相连接;其中,所述linker A和linker B相连的一端分别为点击化学基团对,使linker A和linker B之间发生点击化学反应;linker A另一端基团与EVs发生反应,linker B另一端基团与靶向配体发生反应;所述linker A和linker B相连的点击化学基团对为:1)基于铜(I)催化叠氮化物-炔烃反应的点击化学反应基团对;如炔(Alkyne)与叠氮(N3)进行反应;2)基于张力促进的1,3偶极环加成反应(SPAAC)的点击化学反应基团对;如双环[6,1,0]壬炔(BCN)、氮杂-二苯并环辛炔(DBCO)、二苯并环辛炔(DIBO)、DIFBO、双芳基氮杂环辛炔酮(BARAC)等环辛炔衍生物均可与叠氮(N3)进行反应;3)基于Diels-Alder反应的点击化学反应基团对;如反式环辛烯(Trans-Cycloctene)、环丙烯(Cyclopropene)均可与四嗪(Tetrazine)进行反应;4)基于SH-ene反应的点击化学反应基团对;如烯、炔、马来酰亚胺、异氰酸酯、卤代烃、环氧化物均可与巯基发生反应。
所述的1)基于叠氮化物-炔烃反应的点击化学反应式为:
2)基于SPAAC反应的叠氮(N3)与环辛炔的点击化学反应式为:
其中环辛炔的衍生物结构式包括如下:
3)基于Diels-Alder反应的四嗪(Tetrazine)与反式环烯(Trans-Cycloctene)的点击化学反应式为:
其中四嗪(Tetrazine)、反式环辛烯(Trans-Cycloctene)、环丙烯(Cyclopropene)的结构式如下:
4)基于SH-ene反应的点击化学反应式如下:
所述点击化学基团对在linker A和linker B之间可以互换。
所述linker A与EVs发生反应的活性基团为带有与EVs膜蛋白表面巯基或伯胺基反应的基团物质或带有插入到EVs磷脂双分子层的基团物质。
所述带有与EVs膜蛋白表面巯基或伯胺基反应的基团物质为马来酰亚胺(Maleimide)或N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS);带有插入到EVs磷脂双分子层的基团物质为甘油脂类、脂肪酰类、固醇类、甘油磷脂类、鞘脂类、异戊烯醇类、糖脂类及其衍生物。
所述linker A和linker B分子,两个化学活性基团之间可连接不同分子量的聚乙二醇(PEG),一般为PEG4、PEG5、PEG8、PEG12、PEG16、PEG24、PEG1000和PEG2000。
所述linker B与配体反应的基团为带有与配体表面巯基或伯胺基反应的基团物质,所述有与配体表面巯基或伯胺基反应的基团物质为马来酰亚胺(Maleimide)或N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS);或者配体为多肽、核酸和小分子时,可直接将点击化学基团修饰上去使其与linker B相连。
所述配体为靶向多肽,可通过直接表达或人工合成为普通的多肽,也可在合成过程中将“点击化学”基团直接修饰在多肽序列中。修饰了“点击化学”基团的多肽,可直接与EVs-linker A孵育,发生‘点击化学’反应,将靶向多肽偶联在EVs表面。
所述配体为靶向性核酸或小分子,在合成过程中将“点击化学”基团修饰在核酸序列或小分子中。修饰了“点击化学”基团的核酸或小分子,可直接与EVs-linker A孵育,发生‘点击化学’反应,将核酸或小分子偶联在EVs表面。
所述细胞外囊泡(EVs)包括外泌体(Exosome)、微泡(Microvesicle)、凋亡小体(Apoptotic body)、细胞来源的细胞膜仿生囊泡(Cell-Derived Membrane Vesicle,CMV)或细胞膜包裹的仿生纳米颗粒。
所述靶向配体是指能够特异识别目标组织或细胞的表面受体并与之相互作用的蛋白质、多肽、核酸或小分子。
细胞外囊泡(EVs)表面修饰靶向配体的方法,包括如下具体步骤:
(1)将linker A和linker B分别溶解在相应的溶剂中,获得linker A溶液浓度为10~100μM,linker B溶液浓度为10mM。
所述分别溶解linker A和linker B的溶液可相同或不同选自二甲基亚砜、二甲基甲酰胺、四氢呋喃、二氯甲烷、氯仿等。
(2)将上述获得linker A溶液与EVs混合,linker B溶液与靶向配体混合,分别在pH值为6.5~8.0的溶液中,15~37℃旋转混匀1~2小时,其中,linker A的工作浓度为10~100μM,linker B和靶向配体的摩尔比为5:1~20:1。进一步的说,将linker A溶液与EVs混合,linker B溶液与靶向配体混合,而后分别加入至反应缓冲液中,调节pH值进行反应;缓冲液为PBS或150mM NaCl。
具体优选的,细胞外囊泡的体积与靶向配体的体积比为4:1。
具体优选的,靶向配体使用浓度为0.2-1mg/ml,进一步地优选为0.5mg/ml。
具体优选的,linker A的工作浓度为40μM。
具体优选的,linker B的工作浓度取决于靶向配体的使用浓度。
(3)对上述获得的EVs-linker A和靶向配体-linker B分别纯化,纯化后EVs-linker A和靶向配体-linker B在37℃下点击化学反应30~120min,即获得表面修饰靶向配体的EVs。
所述分别纯化去除游离的linker A和linker B。具体优选的,选择凝胶过滤层析或超滤方式进行纯化,凝胶过滤柱球蛋白分离范围为1000-5000,超滤管滤膜的截留分子量为3kDa。
所述点击化学反应后纯化去除游离的靶向配体-linker B。具体俄日选择凝胶过滤层析或超滤方式进行纯化,所述的凝胶过滤层析柱球蛋白分离范围为10×103-4×106、70×103-20×106或70×103-40×106,超滤管滤膜的截留分子量为100~300kDa。
本发明的有益效果在于:
本发明利用一对高效、快速、反应特异的点击化学分子,将靶向配体修饰于EVs表面,赋予EVs靶向特性。整个反应条件温和,生理条件下即可发生反应,不需额外添加催化剂或其他化学物质,不产生有害副产物,反应过程中不会损伤EVs膜结构,也不影响靶向配体的生物活性和功能,具体为:
1.本发明利用一对高效、快速、反应特异的linker A和linker B,将靶向配体偶联在EVs表面,赋予EVs靶向能力。其中,Linker A利用一端的化学活性基团(如,马来酰亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺酯)或脂类将点击化学基团修饰在EVs表面。其中,linker A一端化学活性基团可与EVs膜蛋白上的巯基或伯胺基发生反应,实现对EVs膜蛋白的位点选择性修饰,反应条件温和、快速、选择性高,反应效率可达到80%以上;脂类以插入方式整合到EVs磷脂双分子层中,通用性高。进而本发明的方法不局限只能通过工程改造供体细胞修饰分泌的外泌体,体液和组织中分离的外泌体或生物膜来源的EVs均可进行修饰。
2.本发明利用点击化学反应实现linker A和linker B的高效连接特点在生物医药领域独具魅力,首先,点击化学基团反应专一,与生物分子几乎不反应,对其连接的其他基团几乎无影响;其次,点击化学反应可以在生理条件中进行,在室温或37℃,磷酸缓冲液或生理盐水中即发生反应,不需要添加催化剂或其他化学物质,不产生有害副产物,反应过程中不会损伤EVs膜结构,也不影响靶向配体的生物活性和功能;最后,反应后生成的氮杂唑基团非常稳定,不易分解。另外,目前商品化的点击化学基团对种类丰富,反应效率均较高,可以根据实验需求设计出带有不同点击化学基团对的linker A和linker B。
3.与传统的细胞外囊泡靶向技术相比,本发明技术操作简便,反应快速,特异性好,可大规模制备靶向配体的EVs;另外,除细胞培养液外,各种体液和组织来源的细胞外囊泡以及细胞膜制备的仿生囊泡均可进行靶向修饰,应用范围较宽。
附图说明
图1为不同浓度的linker A与外泌体连接效率比较结果图。
图2为linker A与外泌体反应时间的摸索结果图。
图3为与兔IgG反应时,不同浓度linker B连接效率比较结果图。
图4为linker B与兔IgG反应时,不同缓冲液pH值连接效率比较结果图。
图5为不同浓度兔IgG靶向蛋白修饰效率(ELISA检测)结果图。
图6为不同浓度兔IgG靶向蛋白修饰效率(Western Blot检测)结果图。
图7为多肽GE11不同使用浓度对外泌体表面修饰效率的影响。
图8为外泌体修饰前及修饰GE11后的透射电镜比较图。
图9为人脐带间充质干细胞膜仿生囊泡(hUMSC-CMV)的粒径测定结果图。
图10为修饰曲妥珠单抗的hUMSC-CMV的粒径测定结果图
图11为Western Blot和ELISA方法鉴定hUMSC-CMV表面修饰曲妥珠单抗结果图。
图12为表面修饰或不修饰曲妥珠单抗的hUMSC-CMV细胞摄取比较结果图,其中,A=空白对照,B=未修饰曲妥珠单抗的CMV,C=修饰曲妥珠单抗的CMV,D与C类似,但SK-BR-3细胞表面受体提前被曲妥珠单抗封闭。
图13为本发明实施例提供的流程图。
具体实施方式
为了使本发明所述的内容便于理解和操作,下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步说明,但是本发明不仅限于此。
本发明利用一对高效、快速、反应特异的点击化学分子linker A和linker B,将靶向配体偶联在EVs表面,赋予EVs靶向能力。其中Linker A利用一端的化学活性基团(马来酰亚胺(Maleimide)、N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS))或脂类将点击化学基团修饰在EVs表面。含磷脂双分子层或表面有膜蛋白的囊泡,如外泌体(exosomes)、微泡(microvesicles)、凋亡小体(apoptotic body)、细胞膜仿生囊泡(CMV)以及细胞膜包裹的纳米颗粒,均可通过linker A修饰上点击化学基团。
本发明采用的试剂和设备为本技术领域常规试剂和设备,鼠抗人抗体CD9(Cat.312102)购于Biolegend公司,二抗为HRP标记的山羊抗鼠抗体(Cat.31430),二抗为HRP标记的羊抗兔抗体(Cat.31460)购于Invitrogen公司。ECL化学发光液Super SignalTMWest Pico Plus Chemiluminescent(Cat.34580)购于Thermo Fisher公司,SA-HRP(Cat.BA1088)购于博士德生物。兔IgG蛋白(Cat.BA1045)购于博士德生物。曲妥珠单抗(Cat.Ab00103-10.0)购于Absolute Antibody。除非特别说明,以下实施例所用试剂、材料和仪器均可从商业途径得到。
实施例1
人脐带间充质干细胞外泌体(hUMSC-exosome)表面修饰兔IgG蛋白,通过调整各个反应条件和参数,获得最优的EVs表面修饰靶向配体的方案。
1.配制linker A和linker B储存液:linker A和linker B均购自上海拓旸生物科技有限公司,linker A(Cat.E120605)的点击化学基团为氮杂-二苯并环辛炔(DBCO),另一端活性基团为N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS),两个基团之间通过PEG2000连接,简写为DBCO-PEG-NHS(2000);linker B(Cat.E120604)的点击化学基团为叠氮(N3),另一端活性基团为N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS),两个基团之间通过PEG2000连接,简写为N3-PEG-NHS(2000)。将linker A和linker B干粉溶解在二甲基亚砜(DMSO)溶液中,浓度均为10mM。
2.摸索与hUMSC-exosome反应的linker A工作浓度,操作步骤如下:
(1)取超速离心法提取的人脐带间充质干细胞外泌体(hUMSC-exosome)600μl,浓度为5×1010particles/ml,缓冲液为PBS(pH 7.4),加入不同体积的10mM linker A溶液,使工作浓度分别为5μM、10μM、20μM、40μM、60μM、80μM和100μM,吹打混匀后,室温下旋转混匀2小时,旋转速度为20转/分钟。然后采用凝胶过滤纯化柱纯化,去除游离的linker A分子。凝胶过滤柱的分离范围为1000~5000Da,柱床体积10ml,上样600μl,空隙体积3.5ml,随后收集1200μl的馏分,即为连接了linker A的外泌体(exosome-linker A)。
(2)ELISA方法检测纯化的exosome-linker A,具体步骤如下:包被鼠抗人CD9抗体,100μl/孔,终浓度为5μg/ml,包被液为碳酸缓冲液(pH 9.6),4℃过夜,然后用含0.05%Tween 20的PBS(PBST)洗涤2次,再加入含2%BSA的PBST,200μl/孔,室温封闭1小时,PBST洗涤2次,加入步骤(1)中的exosome-linker A,100μl/孔,37℃孵育1.5小时,PBST洗涤3次,然后每孔加入终浓度为10μM的N3-PEG-biotin(2000),100μl/孔,37℃孵育1小时,PBST洗涤3次,最后加入1μg/ml的链霉亲和素-辣根过氧化物酶(SA-HRP)100μl,37℃孵育30分钟,PBST洗涤6次,先后加入50μl底物显色溶液A和B,37℃显色5分钟,再加入50ul的2M H2SO4终止反应,最后使用酶标检测仪,在波长450nm下读数。从ELISA结果(见图1)来看,在一定浓度范围内,外泌体连接linker A的效率是随着linker A浓度的增加而增加,当浓度达到40μM时,几乎达到了饱和,故优选的linker A工作浓度为40μM。
3.摸索hUMSC-exosome与linker A反应的时间。
取超速离心法提取的人脐带间充质干细胞外泌体(hUMSC-exosome)6份,每份600μl,浓度为5×1010particles/ml,缓冲液为PBS(pH 7.4),分别加入40μM的linker A,旋涡震荡混匀后,室温下旋转0.5、1.0、1.5、2.0、2.5或3.0小时。然后采用凝胶过滤纯化柱进行纯化,去除游离的linker A分子。凝胶过滤柱的分离范围为1000~5000Da,柱床体积10ml,上样600μl,空隙体积3.5ml,随后收集1200μl的馏分,即为exosome-linker A。ELISA方法检测纯化后的exosome-linker A,操作步骤同上述2中(2),ELISA结果(见图2)显示:当反应时间达到1小时及以上时,连接效率较高,故优选反应时间为1~2小时。
4.摸索与靶向配体反应的linker B的工作浓度,操作步骤如下:
(1)选取0.5mg/ml的兔IgG 150μl,加入不同体积的10mM linker B(N3-PEG4-NHS)溶液,使其与IgG的摩尔比为2:1、5:1、10:1和20:1,漩涡震荡混匀后,室温下旋转混匀2小时,旋转速度为20转/分钟。
(2)采用Western Blot方法检测IgG与linker B的连接效率,具体步骤如下:配制10%的聚丙烯酰胺凝胶,每个样品取100ng与Loading buffer混合,煮沸10分钟上样,待溴酚蓝到达胶底部时,PVDF膜进行湿性转膜,恒流250mA,80分钟。之后,采用含0.05%Tween20的TBS(TBST)洗涤膜2次,加入含4%脱脂奶粉的TBST封闭1小时,TBST洗涤2次,再加入10μM的DBCO-PEG4-biotin,室温孵育2小时,TBST洗涤3次,继续加入终浓度为1μg/ml的链霉亲和素-辣根过氧化物酶(SA-HRP),室温孵育1小时,TBST洗涤3次,最后按1:1比例加入化学发光显色底物A和B,进行化学发光显影。
(3)从Western Blot结果(见图3)来看,在linker B(N3-PEG4-NHS)与兔IgG的摩尔比为2:1时,IgG连接linker B的效率较弱,但摩尔比提高到5:1时,效率显著提高,10:1、20:1和5:1的连接效率没有差别,故优选linker B与靶向配体的摩尔比例为5:1。
5.摸索linker B与靶向配体反应的缓冲液pH值。
选取0.5mg/ml的兔IgG 150μl,加入一定体积的linker B,使它与IgG的摩尔比为5:1,调整PBS缓冲液的pH值,使其分别为6.8、7.4、8.0、8.4和8.8,漩涡震荡混匀后,室温下旋转混匀2小时,旋转速度为20转/分钟。采用Western Blot方法检测兔IgG连接linker B的效率,每个样品上样量20ng,操作步骤同上述4中(3),Western Blot结果(见图4)显示,缓冲液pH值在6.8~8.0时,兔IgG连接linker B(N3-PEG-NHS)的效率较高,说明适合NHS与蛋白活性基团反应的pH值范围是6.8~8.0。
6.摸索靶向配体兔IgG的使用浓度,操作步骤如下:
(1)linker A与人脐带间充质干细胞外泌体(hUMSC-exosome)进行反应,纯化去除游离linker A分子。根据上述优化条件,在离心管中吸取超速离心法提取的hUMSC-exosome600μl,共7份,浓度为5×1010particles/ml,缓冲液为PBS(pH 7.4),再加入40μM的linker A分子,混匀后,室温下旋转混匀2小时。纯化方式同2(1),收集的1200μl馏分即为外泌体-linker A。
(2)linker B与兔IgG进行反应,纯化去除游离的linker B分子。配制6份不同浓度的兔IgG溶液,浓度分别为2.0mg/mL、1.0mg/mL、0.5mg/mL、0.2mg/mL、0.1mg/mL和0.05mg/mL,体积为150μl,缓冲液为PBS(pH 7.4),在溶液中各自加入linker B,使linker B与IgG的摩尔比为5:1,此外,还有一份浓度为1.0mg/ml的IgG不加入linker B作为阴性对照。震荡混匀后,室温下旋转混匀2小时,再采用凝胶过滤纯化柱纯化去除游离的linker B分子。纯化柱的分离范围为1000~5000Da,柱床体积2ml,上样150μl,空隙体积800μl,随后收集300μl馏分,即为IgG-linker B。
(3)将纯化后的1200μl外泌体-linker A与300μl的IgG-linker B或IgG(阴性对照)进行反应,37℃孵育1小时。
(4)纯化去除剩余的游离IgG-linker B。从步骤6(3)反应液中取750μl进行凝胶过滤纯化,该纯化柱柱床10ml,蛋白分离范围为10×103~4×106Da,空隙体积3.5ml,收集1500μl馏分,即为修饰了IgG蛋白的外泌体(exosome-IgG)。
(5)使用ELISA方法分别检测外泌体的CD9含量及表面修饰的IgG含量。检测外泌体CD9含量的步骤:将100μl人CD9抗体包被在高吸附酶标板上,浓度为5μg/ml,然后用含2%BSA的PBST封闭1小时,PBST洗涤2次,加入100μl的exosome-IgG,37℃孵育1.5小时,PBST洗涤3次,再加入100μl人CD9-biotin抗体(1μg/ml),37℃孵育1.5小时,PBST洗涤3次,加入100μl的SA-HRP(1μg/ml),37℃孵育30分钟,PBST洗涤6次,先后加入50μl底物显色溶液A和B,37℃显色5分钟,最后加入50μl的2M H2SO4终止反应,使用酶标检测仪,在波长450nm下读数。检测外泌体表面修饰的IgG的步骤:人CD9抗体包被、封闭、以及样品孵育方式同前,之后加入100ul羊抗兔IgG-HRP抗体,37℃孵育1小时;PBST洗涤6次;再加入底物A和B显色,终止显色和读数。IgG和CD9的OD450读数见表1,ELISA结果示意图见图5。
表1不同IgG使用浓度时外泌体表面修饰效率比较
兔IgG使用浓度(mg/ml) | IgG OD450值 | CD9 OD450值 |
2.0 | 2.216 | 0.575 |
1.0 | 2.617 | 0.393 |
0.5 | 2.653 | 0.793 |
0.2 | 2.288 | 0.722 |
0.1 | 2.203 | 0.927 |
0.05 | 0.852 | 1.093 |
N(阴性对照) | 0.421 | 0.814 |
空白对照 | 0.069 | 0.069 |
(6)使用Western Blot方法分别检测外泌体CD9含量及表面修饰的IgG含量。具体如下:配制2张10%的聚丙烯酰胺凝胶,取20μl的exosome-IgG与Loading buffer混合,煮沸10分钟上样,上样顺序为2.0mg/mL、1.0mg/mL、0.5mg/mL、0.2mg/mL、0.1mg/mL、0.05mg/mL,阴性对照,两张胶的样品上样顺序保持一致。待溴酚蓝到胶底部时,进行PVDF膜湿性转膜,转模参数恒流250mA 80分钟。之后,用含0.05%Tween20的TBS(TBST)洗涤膜2次,加入含4%脱脂奶粉的TBST封闭1小时,TBST洗涤2次,一张膜用于检测CD9抗体:加入终浓度为1μg/ml的鼠抗人CD9抗体,室温孵育2小时,洗涤3次,再加入羊抗鼠IgG-HRP抗体(1:4000稀释),室温孵育1小时,洗涤3次。另一张膜用于检测兔IgG:加入羊抗兔IgG-HRP抗体(1:4000稀释),室温孵育1小时,洗涤3次,之后两张膜按1:1的比例加入化学发光底物A和B进行显影,结果见图6。
Western Blot和ELISA检测结果显示,外泌体表面可成功修饰兔IgG蛋白,修饰效率与IgG使用浓度在一定范围内呈正相关,随IgG浓度增加而提高,当浓度为0.5mg/mL时,修饰效率已达到最佳。
实施例2
在人脐带间充质干细胞外泌体表面修饰多肽GE11,GE11是通过噬菌体肽库筛选技术获得的小分子多肽,为表皮生长因子受体(EGFR)的配体,参见图13具体操作步骤如下:
1.配制linker A储液:linker A购自上海拓旸生物科技有限公司,linker A(Cat.P006032)的点击化学基团为氮杂-二苯并环辛炔(DBCO),另一端活性基团为二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(DSPE),两个基团之间连接的PEG分子量为2000,简写为DSPE-PEG-DBCO(2000)。将linker A干粉溶解在二甲基亚砜(DMSO)溶液中,浓度为10mM。
2.化学合成修饰生物素(biotin)和叠氮(N3)的多肽GE11(N3-GE11-biotin),该多肽合成于北京中科亚光生物科技有限公司,GE11氨基酸序列为YHWYGYTPQNVI,在序列氨基端修饰N3,在羧基端连接一个氨基酸K后再修饰biotin,将多肽干粉溶解在PBS缓冲液中(PH7.4),浓度为1.0mg/ml。
3.exosome与linker A反应并纯化,获得exosome-linker A。超速离心法提取人脐带间充质干细胞外泌体(hUMSC-exosome)600μl,浓度为5×1010particles/ml,缓冲液为PBS(pH 7.4),加入linker A溶液,使工作浓度为40μM,吹打混匀后,37℃混匀1小时,旋转速度为20转/分钟。然后采用凝胶过滤纯化柱进行纯化,该纯化柱柱床10ml,蛋白分离范围为10×103~4×106Da,上样600μl,空隙体积3.5ml,收集1200μl馏分,即为exosome-linker A。
4.将纯化后的exosome-linker A与不同浓度的N3-GE11-biotin反应并纯化。配制7份体积150μl不同浓度的GE11溶液,浓度分别为0.5mg/mL、0.4mg/mL、0.3mg/mL、0.2mg/mL、0.1mg/mL、0.05mg/mL和0mg/ml,分别与600μl的exosome-linkerA发生点击反应,此外还有一份0.5mg/ml的GE11与未连接linker A的exosomes直接反应,作为阴性对照,37℃孵育1小时。然后采用凝胶过滤柱进行纯化,纯化步骤同实施例1的6(4),从而获得纯净的exosomes-GE11。
5.采用ELISA方法分别检测外泌体含量及修饰的GE11含量。外泌体含量通过检测CD9来确定,ELISA检测CD9方法同实施例1的5(5),而检测外泌体表面修饰的GE11含量,主要根据GE11多肽上的biotin来确定,检测步骤如下,将100μl人CD9抗体包被在酶标板上,浓度为5μg/ml,接着用含2%BSA的PBST封闭1小时,PBST洗涤2次,加入100μl的exosome-GE11,37℃孵育1.5小时,PBST洗涤3次,继续加入100μl的SA-HRP,工作浓度为1ug/ml,37℃孵育30分钟,PBST洗涤6次,先后加入50μl底物显色溶液A和B,37℃显色5分钟,最后加入50μl的2MH2SO4终止显色,使用酶标检测仪,在波长450nm下读数。CD9和GE11-biotin的OD450读数见表2,ELISA结果示意图见图7。ELISA结果显示,外泌体表面可成功修饰上多肽GE11,当GE11的工作浓度为0.1mg/ml时,修饰效率已达到最佳,进一步提高多肽浓度,无法显著增加表面修饰效率。
表2不同GE11浓度对外泌体表面修饰效率的影响
GE11使用浓度(mg/ml) | GE11 OD450值 | CD9 OD450值 |
1.0 | 1.839 | 1.089 |
0.5 | 1.718 | 1.198 |
0.2 | 1.578 | 1.235 |
0.1 | 1.475 | 1.167 |
0.05 | 0.672 | 1.269 |
0 | 0.069 | 1.345 |
N(阴性对照) | 0.065 | 1.336 |
PBS | 0.065 | 0.065 |
6.透射电镜下观察人脐带间充质干细胞外泌体(hUMSC-exosome)及修饰了GE11的外泌体形态及大小。
取超速离心法获得的hUMSC-exosome,浓度5×1010particles/ml,以及修饰后的exosomes-GE11,进行透射电镜观察,操作步骤如下:取样品40μl,加入5μl的4%多聚甲醛进行混合,取30μl该悬液滴加于封口膜上,将铜网Formvar膜面朝下放在悬液上,静置30分钟,然后在封口膜上滴加去离子水50μl,将铜网放置在上面约1分钟,重复清洗3次,最后取约60μl的1%醋酸双氧铀滴加在封口膜上,将铜网放置在上面染色5min,之后用滤纸吸走多余液体,膜面朝上,室温干燥2小时。接着80kV下拍摄透射电镜照片。电镜结果见图8,电镜下,负染exosome显示为100nm左右圆盘状膜泡,修饰前和修饰后外泌体的大小和形态无明显差别,说明采用DSPE的方式插入到外泌体磷脂双分子层,并未破坏外泌体的膜结构,并且表面修饰多肽GE11,对外泌体的粒径大小影响非常小。
实施例3
在人脐带间充质干细胞来源的仿生囊泡表面修饰曲妥珠单抗(HER2单抗),并检测它的靶向性能,具体操作步骤如下:
1.配制linker A和linker B储液:linker A和linker B均购自西安点化生物科技有限公司,linker A(Cat.1613439-69-2)的点击化学基团为反式环辛烯(Trans-Cycloctene),另一端活性基团为N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS),两个基团之间连接4个PEG分子,简写为NHS-PEG4-Trans Cycloctene;linker B(Cat.1682653-80-0)的点击化学基团为四嗪(Tetrazine),另一端活性基团为N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS),两个基团之间连接5个PEG分子,简写为Tetrazine-PEG5-NHS。将linker A和linker B干粉溶解在二甲基亚砜(DMSO)溶液中,浓度均为10mM。
2.获取人脐带间充质干细胞来源的细胞膜仿生囊泡(hUMSC-CMV)。用细胞刮刀收集培养的人脐带间充质干细胞,PBS洗涤2次,加入PBS及50×蛋白酶抑制剂重悬细胞。用Dounce匀浆器破碎细胞,将破碎后的细胞悬液转移至离心管中,700g,4℃离心10分钟,收集的上清液继续100000g离心1小时,沉淀用PBS重悬,并采用高压均质机进行高压均质,高压均质参数为压力400bar 1分钟,1000bar 1分钟,从而获得人脐带间充质干细胞来源的细胞膜仿生囊泡(hUMSC-CMV)。对制备的细胞膜仿生囊泡进行纳米颗粒跟踪分析(NTA),粒径大小为126.7nm,结果见图9。
3.linker A与hUMSC-CMV进行反应,并纯化去除游离linker A分子。取hUMSC-CMV600ul,加入linker A分子,使其终浓度为40μM,震荡混匀后,室温下旋转混匀2小时。纯化步骤同案例1的2(1),获得CMV-linker A。
4.linker B与曲妥珠单抗(Absolute Antibody,Cat.Ab00103-10.0)进行反应,纯化去除游离的linker B分子。配制150μl浓度为0.5mg/mL的曲妥珠单抗,反应缓冲液为PBS(pH 7.4),在溶液中加入linker B,使linker B与IgG的摩尔比为5:1,混匀后,室温下旋转混匀2小时。再采用凝胶过滤纯化柱纯化去除游离的linker B分子,纯化步骤同案例1的6(2),获得曲妥珠单抗-linker B。
5.将纯化后的1200μl CMV-linker A与300μl曲妥珠单抗-linker B或曲妥珠单抗(阴性对照)进行反应,37℃孵育1小时。
6.纯化去除游离的曲妥珠单抗-linker B。将步骤5的1500μl反应液进行凝胶过滤柱纯化,纯化柱柱床24ml,蛋白分离范围为10×103~4×106Da,空隙体积8ml,随后收集的3ml馏分即为修饰了曲妥珠单抗的细胞膜仿生囊泡(CMV-曲妥珠单抗)。
7.将修饰了曲妥珠单抗的CMV(CMV-曲妥珠单抗)进行纳米颗粒跟踪分析(NTA),粒径大小为134.7nm,结果见图10,表面修饰蛋白对囊泡的粒径基本无影响。
8.ELISA方法和WB方法测定CMV表面的CD9及曲妥珠单抗含量,检测方法同实施案例1的6(5)和6(6),检测结果见图11,显示曲妥珠单抗成功修饰在hUMSC-CMV表面。
9.细胞摄取实验验证CMV-曲妥珠单抗的靶向性能,具体步骤如下:
将未修饰和经曲妥珠单抗修饰的hUMSC-CMV进行DiO染料标记和纯化,标记时,在hUMSC-CMV溶液中加入终浓度为10μM的DiO染料,37℃孵育30分钟,然后采用凝胶过滤纯化柱进行纯化,纯化方式同实施例1的步骤2(1)。接着将过表达HER2的人类乳腺癌SK-BR-3细胞接种于24孔板中,每孔接种10000个细胞,分为A、B、C、D四组;A、B、C组不添加曲妥珠单抗,D组加入终浓度为1μg/ml的曲妥珠单抗,在37℃培养箱中共孵育1h后。然后A组作为空白对照,B组加入终浓度为109particles/ml不经修饰的hUMSC-CMV,C和D组均加入终浓度为109particles/ml的修饰了曲妥珠单抗的hUMSC-CMV,37℃共同孵育4小时后,洗涤细胞,进行DAPI核染色,洗涤3次后,在荧光显微镜下观察细胞摄取情况,其中DiO的激发波长为484nm,DAPI的激发波长为360nm。实验结果如图12所示,与未修饰的CMV相比,修饰了曲妥珠单抗的CMV被细胞摄取的数量明显增多,而D组提前加入曲妥珠单抗,封闭了细胞表面的HER2,导致细胞表面的HER2不再与CMV-曲妥珠单抗结合,摄取量明显下降。证实细胞外囊泡表面修饰上曲妥珠单抗,确实可以增强靶向能力,当抑制靶向配体与细胞受体结合后,可以阻止细胞对胞外囊泡的摄取。
以上所述仅为本发明的较佳实施例,凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰,皆应属本发明的涵盖范围。
Claims (4)
1.一种细胞外囊泡表面修饰靶向配体的方法,其特征在于:EVs和靶向配体之间通过linker A和linker B连接,将靶向配体偶联在EVs表面,即获得大量靶向配体修饰的EVs;其中,linker A插入到EVs磷脂双分子层或与EVs表面膜蛋白共价偶联,形成EVs-linker A;linker B与靶向配体共价偶联,形成靶向配体-linker B;
所述EVs-linker A和靶向配体-linker B通过linker A和linker B之间点击化学反应,将靶向配体偶联在EVs表面,即获得大量靶向配体的EVs;
所述linker A和linker B的两端分别含有化学活性基团,活性基团之间通过一定长度的聚乙二醇相连接;其中,所述linker A和linkerB相连的一端分别为点击化学基团对,使linker A和linker B之间发生点击化学反应;linker A另一端基团与EVs发生反应,linkerB另一端基团与靶向配体发生反应;所述linker A和linker B相连的点击化学基团对为:1)基于铜(I)催化叠氮化物-炔烃反应的点击化学反应基团对;2)基于张力促进的1,3偶极环加成反应的点击化学反应基团对;3)基于Diels-Alder反应的点击化学反应基团对;4)基于SH-ene反应的点击化学反应基团对;
所述linker A与EVs发生反应的活性基团为带有与EVs膜蛋白表面巯基或伯胺基反应的基团物质或带有插入到EVs磷脂双分子层的基团物质;
所述带有与EVs膜蛋白表面巯基或伯胺基反应的基团物质为马来酰亚胺或N-羟基琥珀酰亚胺酯;
所述linker B与配体反应的基团为带有与配体表面巯基或伯胺基反应的基团物质,或在合成多肽、核酸和或小分子配体时,可直接将点击化学基团修饰上linker B。
2.按照权利要求1所述的细胞外囊泡表面修饰靶向配体的方法,其特征在于:所述细胞外囊泡包括外泌体、微泡、凋亡小体、细胞来源的细胞膜仿生囊泡或细胞膜包裹的仿生纳米颗粒。
3.按照权利要求1所述的细胞外囊泡表面修饰靶向配体的方法,其特征在于:所述靶向配体是指能够特异识别目标组织或细胞的表面受体并与之相互作用的蛋白质、多肽、核酸或小分子。
4.按权利要求1~3任意一项所述的细胞外囊泡表面修饰靶向配体的方法,其特征在于:
(1)将linker A和linker B分别溶解在相应的溶剂中,获得linkerA溶液浓度为10~100μM,linker B溶液浓度为10mM;
(2)将上述获得linker A溶液与EVs混合,linker B溶液与靶向配体混合,分别在pH值为6.5~8.0的溶液中,15~37℃旋转混匀1~2小时,其中,linker A的工作浓度为10~100μM,linker B和靶向配体的摩尔比为5:1~20:1;
(3)对上述获得的EVs-linker A和靶向配体-linker B分别纯化,纯化后EVs-linker A和靶向配体-linker B在37℃下点击化学反应30~120min,即获得表面修饰靶向配体的EVs。
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