CN111110855B - 一种利用红细胞制备的靶向性的囊泡药物 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种利用红细胞制备的靶向性的囊泡药物，所述囊泡药物，以成熟红细胞的细胞空壳包裹有：不含有遗传物质的待包裹的细胞的内容物、或药物的一种或多种。本发明利用红细胞进行细胞制备的靶向性的囊泡药物，包裹去除了核酸所需细胞的生物活性物质，进行递送，从而避免了细胞囊泡中含有的遗传物质，可能出现的导致使用者产生基因重组、基因突变等风险，具有更加安全的特点。同时所述囊泡药物能够进行靶向递送，以提高治疗效果；可以对细胞囊泡进行靶向修饰，可以使药物准确到底病症部位，提高治疗效果、降低药物副作用。因此该方法可以大规模生产可用于安全性更高、治疗效果更好的细胞囊泡靶向载体及药物。

Description

一种利用红细胞制备的靶向性的囊泡药物
技术领域
本发明涉及生物技术领域，更具体地，涉及一种利用红细胞制备的靶向性的囊泡药物。
背景技术
细胞囊泡，是由细胞分泌出的小囊泡，大小不等，直径分布范围50～1000n m，细胞囊泡分为多种类型，由不同的机制产生，包括外泌体、微囊泡等。其中，外泌体是一类直径分布在50～200nm的小囊泡，绝大多数的细胞都会分泌出这类囊泡。在以往的认知中，细胞囊泡一直以来被认为是细胞将代谢废物排出细胞的途径，并不具备重要的生理功能。然而随着科学的不断进步，细胞囊泡的运输机制被逐渐阐明，认为其是一类非常重要的在细胞间传递信号的囊泡，其中携带丰富的miRNA、mRNA、DNA、蛋白质、脂类等成分，细胞囊泡可以将这些成分从一个细胞传递到另一个细胞，并被受体细胞有效的利用。虽然至今还有很多未知的机理，但细胞囊泡,尤其是外泌体的运输调控已经被证明具有非常重要的生理功能。外泌体可以在不同细胞之间传递化学物质的功能也已逐步阐明。
正是因为外泌体能够在不同细胞间传递化学物质的功能，以及其纳米级别的体积，非常有利于细胞的吸收，因此掀起了以外泌体作为药物或药物载体的研究热潮。(1)外泌体本身可作为药物，如来自干细胞的外泌体具有促进损伤组织修复再生的功能，来自免疫细胞的外泌体具有调节免疫应答的功能。因此外泌体在一定程度上可代替细胞治疗的功能，而且相比细胞治疗具有更好的安全性：外泌体治疗不会存在细胞治疗中潜在的成瘤风险；在一定情况下可以使用异体来源的外泌体，不必完全需要自体细胞供给，有利于外泌体产品的商品化生产；外泌体比细胞更加便于保存和运输。(2)外泌体可以作为药物载体，进行多种药物的运输。
与纳米药物载体、脂类药物载体相比，外泌体具有非常明显的优势。1.外泌体免疫原性小，不会引起强烈的免疫反应；2.与常规纳米药物载体相比，外泌体极易被细胞吸收，具有很高的药物传递效率；3.外泌体被细胞吸收后可以逃避溶酶体途径，能够有效释放药物，而常规纳米药物载体进入细胞后，通常会进入溶酶体途径，被溶酶体降解，导致药物无法发挥治疗效果。因为上述优点，外泌体具备了成为优良药物载体的潜力。
然而，外泌体作为药物或药物载体载体，仍有一些问题急待克服，最主要的问题就是外泌体的产量很低。在通常情况下，5×109个细胞产生的外泌体仅够一个体重为70kg的患者一次的用量。如需要获得商品化的外泌体，将需要进行大量的细胞培养，消耗大量的时间，从而产生高昂的生产成本，其次有些细胞并不能够在体外进行大量扩增，势必限制其外泌体的大量获取。
为了解决外泌体产率的问题，W.Jo、J.Park等提出了一个将细胞通过一系列的小孔后会产生大小均匀的细胞囊泡的方法，该方法获得的细胞囊泡数量相比外泌体的产量提高了近100倍，同时该方法获得的细胞囊泡同样容易进入其他细胞，具有药物传递功能。因此，该方法是进行细胞囊泡规模化生产的优良方法。但是，用该方法获得的细胞囊泡，虽然产量得到提高，但是细胞通过挤压后，细胞的内含物都会被包裹在细胞囊泡中，特别是DNA等遗传物质也会被大量的包裹进细胞囊泡之中。当囊泡被其他受体细胞吸收后，其中大量存在的DNA就会有引起使用者基因组发生重组或突变的风险。
因此，去除细胞囊泡载体中的DNA，则能够满足产量和安全两方面的需求，获得高产量同时无DNA更加安全的囊泡载体或囊泡药物。为了实现该目标，红细胞因其不含基因组DNA的特点，就成为了我们的一个重要工具。
红细胞也是一类经过了长期持续研究的药物载体，其优势主要有1.成熟的红细胞无细胞核，结构简单，生物相容性良好，能自然降解不产生毒性物质；2.红细胞是人体血液中含量最多的一种细胞，易于获取；3.渗透压的改变可以使多肽、蛋白质、酶、核酸及多种化合物进入细胞，便于药物装载；4.具有天然的靶向性，红细胞在血液循环中停留时间较长，并能迅速聚集到肝、脾等器官，具有治疗网状内皮系统疾病的潜能；5.红细胞膜表面蛋白能使红细胞有效逃逸免疫系统的清除作用；6.可实现药物的缓慢释放，药物的治疗浓度可维持3～4周时间；7.血型相同的红细胞即可供异体患者使用，避免自体细胞治疗的繁琐步骤。
但是红细胞作为药物载体，体积略大，向病灶内渗透能力较差；易富集于肝、脾，对其他位置的病灶不能有效给药，都严重的制约了其作为药用载体的应用。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术的不足，提供一种利用红细胞制备的靶向性的囊泡药物，该囊泡药物可避免由于遗传物质的存在导致的基因组重组、突变等风险，以提供一种更加安全的细胞囊泡作为药物载体，并通过特有的十字架性核酸分子对细胞囊泡进行靶向修饰，从而获得具备优良靶向功能的囊泡药物。
本发明的第一个目的是提供一种利用红细胞制备的囊泡药物。
本发明的第二个目的是提供一种利用红细胞制备的靶向性的囊泡药物的制备方法。
为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案予以实现的：
本发明通过获得成熟的无核红细胞，通过细胞处理，将细胞内含物释放出来，得到红细胞空壳，同时将所需细胞经过细胞破碎后去除DNA组分，用红细胞将其包裹，通过一系列操作获得微小的红细胞囊泡，再通过靶向修饰获得无DNA的靶向性的囊泡药物。也可将红细胞囊泡视为靶向药物载体，同时向其中加入多种类型药物或单独加入药物，作为靶向药物载体，药物包括化学药物、蛋白药物、核酸药物、天然药物等。本发明获得的无DNA细胞靶向囊泡，具有更安全、产量高、治疗效果好、具有靶向性等特点。
因此，本发明要求保护一种利用红细胞制备的囊泡药物，所述囊泡药物，粒径大小为50～300nm，其以成熟红细胞的细胞空壳包裹以下成分中的一种：
(1)不含有遗传物质的待包裹的细胞的内容物；
或(2)不含有遗传物质的待包裹的细胞的内容物和药物的混合物；
或(3)药物。
优选地，所述遗传物质为DNA或RNA中的一种或两种。
优选地，所述囊泡表面修饰有十字架结构的核酸物质，所示十字架结构的核酸物质一端连接有脂溶性分子插入细胞囊泡，另一端连接有针对靶点的靶向分子。
优选地，所述待包裹的细胞包括但不限于干细胞，或免疫细胞等类型细胞。
更优选地，所述干细胞包括但不限于以下的一种或几种：胚胎干细胞、心肌干细胞、肝干细胞、神经干细胞、诱导性多能干细胞、间充质干细胞等
更优选地，所说免疫细胞包括但不限于以下的一种或几种：NK细胞、CIK细胞、DC细胞、T细胞等。
优选地，所述药物包括但不限于：蛋白质、多肽、核酸、细胞因子、抗体、化合物等；或者为已经装载有药物的纳米颗粒，如脂质体等纳米颗粒。
优选地，所述红细胞的细胞空壳包裹的成分为蛋白。
优选地，所述红细胞的细胞空壳包裹的成分为不含有DNA的NK细胞的内容物。
优选地，所述红细胞的细胞空壳包裹的成分为阿霉素，且所述十字架结构的核酸物质由DNA序列1和DNA序列1组成：
DNA序列1的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，其3’端连接有胆固醇，
DNA序列2的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，其3’端连接有CEA
(carcinoembryonic antigen)核酸适配体。
更优选地，CEA核酸适配体的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。
本发明还要求保护一种利用红细胞制备的靶向性的囊泡药物的制备方法，包括以下步骤：
S1.制备成熟红细胞的细胞空壳；
S2.制备待包裹物质；
S3.利用成熟红细胞的细胞空壳与待包裹物质制备囊泡药物；
S4.在囊泡药物表面修饰十字架结构的核酸物质，使得十字架结构的核酸物质一端连接脂溶性分子插入细胞囊泡，另一端连接有针对靶点的靶向分子；
其中，所示待包裹物质制备为：(1)不含有遗传物质的待包裹的细胞的内容物，或(2)不含有遗传物质的待包裹的细胞的内容物和待包裹的药物的混合物，或(3)药物；
步骤S3的具体做法为：(1)将成熟红细胞的细胞空壳与待包裹物质混合，改变渗透压，使待包裹物质进入成熟红细胞的细胞空壳，之后通过直径为0.1μm-5μm的孔，分离囊泡药物；或(2)将成熟红细胞的细胞空壳与待包裹物质混合，之后通过直径为0.1μm-5μm的孔，分离囊泡药物。
优选地，所述红细胞可由胚胎干细胞、诱导多能化干细胞、巨核红系祖细胞、共同髓系祖细胞、造血干细胞、或红系祖细胞诱导分化为成熟红细胞获得，也可直接从血液样本中分离获得。
优选地，步骤S1的具体做法为：采用改变渗透压的方法进行红细胞内含物的释放，将红细胞与低渗液混合，静置，使红细胞释放出内含物，得到红细胞的细胞空壳。
优选地，步骤S1的具体做法为：采用溶菌酶等穿孔蛋白，将红细胞打孔，释放出红细胞中内含物，得到成熟红细胞的细胞空壳。
最优选的，步骤S1制备成熟红细胞的细胞空壳方法为：红细胞中使用低渗液涨破，静置后离心，弃上清，重复2～-3次去除红细胞释放出的血红蛋白等胞内成分。
更优选地，所述低渗液为5mM KCl，5mM哌嗪-N，N-双-2-乙磺酸，5mM MgSO4。
优选地，步骤S2中，不含有遗传物质的待包裹的细胞的内容物的制备方法为：破碎待包裹的细胞，得到细胞内容物，去除核酸物质，得到不含有遗传物质的待包裹的细胞的内容物。
更优选地，步骤S2中，所述破碎待包裹的细胞的方法为：机械方法、化学方式、或生物方法。
进一步更优选地，所述机械方法为：超声破碎、高压破碎、冻融破碎、改变渗透压破碎、颗粒破碎、微波破碎中的一种或几种的结合。
进一步更优选地，所述化学方式为：加入表面活性剂或强离子剂，所述表面活性剂为：SDS、Tween20、Triton X-100、NP-40中的一种或几种的结合，所述强离子剂为异硫氰酸胍、盐酸胍中的一种或几种的结合。
作为一个实施方案，制备成熟红细胞的细胞空壳的具体方法为：收集红细胞，加入低渗液以1：4的体积比混匀，4℃静置15min，600g离心5min，弃上清，重复2～3次去除红细胞释放出的血红蛋白等胞内成分，得到成熟红细胞的细胞空壳。
更优选地，所述生物方法为：加入穿孔蛋白进行酶解，所述酶为溶菌酶。
待包裹的细胞破碎后因为其中的所含有的DNA成分，具有通过重组、插入等方式改变使用者基因组的可能性，从而存在影响使用者健康的潜在风险，因此通过去除其中的DNA等核酸成分再进行包裹可以降低或消除该风险，将使药物具有更高的安全性。
优选地，步骤S2中，去除内容物中的核酸物质的方法为：细胞破碎处理后，通过磁珠法、层析过柱法，滤膜法之一分离去除基因组DNA成分，保持其他细胞成分的生物活性。
优选地，所述待包裹的药物为所述药物包括但不限于：蛋白质、多肽、核酸、细胞因子、抗体、化合物等；或者为已经装载有药物的纳米颗粒，如脂质体等纳米颗粒。
更优选地，所述待包裹的药物为核酸，所述核酸为RNA药物、基因编辑系统。
更优选地，所述待包裹的药物为RNA药物，包括但不仅限于siRNA、miRNA、shRNA、mRNA、反义寡核苷酸等。
更优选地，所述待包裹的药物为基因编辑系统，包括但不仅限于CRISPR-C as基因编辑系统。
优选地，步骤S3中，使待包裹物质进入成熟红细胞的细胞空壳的方法为：控制溶液渗透压或温度条件，使细胞膜重新闭合以包裹待包裹物质进入成熟红细胞的细胞空壳。
更优选地，步骤S3中，使待包裹物质进入成熟红细胞的细胞空壳的方法为：将细胞与高渗溶液以不同体积混合进行进行反应，进行反应，所述高渗溶液包括但不限于10×PBS，高浓度KCl等。
进一步优选地，高渗溶液的用量为低渗液体积的1/10。
步骤S3中，将待包裹物质先用成熟红细胞的细胞空壳进行包裹，或不进行包裹，混匀后直接通过直径为0.1μm-5μm的孔，使得形成细胞囊泡的同时将待包裹物质包裹入细胞囊泡中。
优选地，所述孔为一系列不同孔径(孔径包括但不限于0.1μm～5μm)的孔或单一孔径的孔。
十字架结构的一端可连接胆固醇等脂溶性分子，有助于其插入细胞囊泡的脂质膜结构，另一端或两端可连接其他功能性分子，如蛋白、核酸配体、配体、抗体、化合物、药物、荧光基团等分子，以靶向针对的靶点或发挥其它包括治疗、示踪、成像等功能。
优选地，步骤S4中，所述十字架结构的核酸物质为两条或以上核酸链，通过互补序列组成，所述核酸链包括DNA、RNA，或经过修饰的DNA、RNA链，或含有特殊碱基的核酸链。
更优选地，每条核酸链的长度根据不同的设计方法长度可从10～200nt。
不含有遗传物质的待包裹的细胞的内容物或其他药物与红细胞混合，将药物装入红细胞内，再加入高渗液，将红细胞重新封闭。也可略过封装步骤，直接将去DNA后的细胞组分或其他药物与红细胞混合混匀，然后通过一系列不通孔径的膜，使药物在形成细胞囊泡的同时被封包入细胞囊泡中。
当需要包裹的细胞为干细胞时，因为干细胞含有丰富的生长因子，对于组织的再生修复有良好效果；当需要包裹的细胞为免疫细胞时，免疫细胞如NK细胞含有颗粒酶、穿孔素、FasL等分子，可以诱导肿瘤细胞死亡，在肿瘤免疫治疗中有重要作用。因此干细胞或免疫细胞中的天然组分在对应的疾病治疗中起着重要作用，采用囊泡携带其成分，也在很大程度上能发挥细胞治疗的作用，同时避免了细胞治疗中，细胞成瘤的可能性。
本发明通过去除红细胞的内含物，增加其药物装载能力，将去除核酸后的干细胞、免疫细胞或其他所需细胞的活性成分，亦或是其他核酸类、蛋白类、化学类药物包裹在红细胞囊泡中，通过一系列不同孔径的膜，形成纳米级的药物，并进行靶向性修饰，使其能够有效的将药物运送至病症部位。
具体的，囊泡药物的制备方法为：
S1.提取成熟红细胞，制备其细胞空壳；
S2.制备待包裹物质；
S3.S2的产物与成熟红细胞的细胞空壳混合，静置离心后加入低渗液的1/10体积高渗液，37℃30min；
S4.上一步的产物通过孔径为0.1μm～5μm的孔，重复4～5次，再通过孔径为0.1μm～5μm的孔，重复4～5次，漂洗后即得。
具体的，所述红细胞的细胞空壳包裹的成分为蛋白，囊泡药物的制备方法为：
S1.按照所述方法提取成熟红细胞的细胞空壳；
S2.蛋白用低渗液稀释；
S3.S2的产物与成熟红细胞的细胞空壳混合，静置离心后加入低渗液的1/10体积ph＝7.4的10×PBS，37℃30min；
S4.上一步的产物通过孔径为1μm的孔，重复4～5次，再通过孔径为0.2μm的孔，重复4～5次，漂洗后即得。
更优选地，S2的产物分次与成熟红细胞的细胞空壳混合，每次混合之后静置5min，500g离心3min。
具体的，所述红细胞的细胞空壳包裹的成分为蛋白不含有DNA的NK细胞的内容物，所述囊泡药物的制备方法为，
S1.按照所述方法提取成熟红细胞的细胞空壳；
S2.采用高压破碎仪破碎NK细胞，用磁珠法去除DNA，用低渗液稀释；
S3.S2的产物与S1的产物混合，静置离心后，加入低渗液的1/10体积ph＝7.4的10×PBS，37℃30min；
S4.上一步的产物通过孔径为1μm的孔，重复4～5次，再通过孔径为0.2μm的孔，重复4～5次，漂洗后即得。
具体地，本所述红细胞的细胞空壳包裹的成分阿霉素，所述囊泡表面修饰有十字架结构的核酸物质，所述十字架结构的核酸物质一端连接有胆固醇，另一端连接有CEA核酸适配体，所述十字架结构的核酸物质由DNA序列1和DNA序列2组成：DNA序列1的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，其3’端连接有胆固醇，DNA序列2的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，其3’端连接有CEA核酸适配体。CEA核酸适配体的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，所述囊泡药物的制备方法为，
S1.按照上文所述方法提取制备成熟红细胞的细胞空壳；
S2.低渗液将阿霉素稀释；
S3.S2的产物与S1的产物混合，混匀溶液，静置离心后，加入低渗液的1/10体积ph＝7.4的10×PBS，37℃30min；；
S4.合成十字架结构的核酸物质，两条DNA链混合，室温放置30min，得到十字架结构的核酸物质，20μg十字架结构的核酸物质与109细胞囊泡混匀，20℃放置1h，4℃放置30min，100000g离心1h，弃上清，PBS重新悬浮细胞囊泡沉淀。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)利用无细胞核的红细胞得到细胞空壳，进行细胞囊泡的生产，作为药物运输载体。同时，当运输药物为细胞组分时，则采取将细胞组分中DNA去除的方法，最终获得不含有DNA或DNA含量极低的细胞囊泡。相比目前的细胞囊泡载体安全性更高，不会对使用者基因组产生重组或突变等影响。
(2)本发明将细胞空壳和细胞挤压的生产囊泡的方法结合在一起，既能避免DNA带来的潜在风险，也能极大程度提高细胞囊泡产量，能够真正实现细胞囊泡的规模化生产，并将其用于疾病的治疗。
(3)利用十字形核酸分子作为连接体对细胞囊泡进行靶向修饰极为便利，核酸序列可以进行大规模人工合成，可以进行灵活修饰来实现其稳定性或多样性，满足多种需求。目前对细胞囊泡或外泌体的修饰多通过在细胞内进行蛋白过表达，从而让这些蛋白出现在细胞囊泡或外泌体膜部位，和蛋白受体相结合，进而达到靶向给药的目的。然而蛋白种类的限制、蛋白过表达对母细胞的影响、蛋白到达囊泡膜部位的效率都影响着最终的结果。同时这种方法也存在操作复杂、重复性差、费时费力等缺点。相对于细胞内蛋白的过表达，人工合成的核酸链则成本低、重复性高、能够进行很好的质量控制，而且便于修饰，结构可灵活控制，可携带多种靶向分子、荧光示踪分子、治疗药物等。
(4)利用本发明得到的红细胞空壳用于细胞囊泡生产，在只装载生产条件易于控制的化学药、核酸药、蛋白药等药物时，具有更好的稳定性和重复性，不同批次间的差异更小。目前现有方法制备出的细胞囊泡，其中含有细胞内组分，包括DNA、RNA、蛋白、脂类、糖类等，不同批次间的产品受到不同批次间细胞生长情况的影响比较大，而空的细胞囊泡则减少了不同批次间细胞差异的影响。
本发明利用红细胞进行细胞囊泡靶向药物生产，用于包裹去除了DNA的其他所需细胞的生物活性物质，进行靶向递送，从而避免了细胞囊泡中含有的DNA等遗传物质，可能出现的导致使用者产生基因重组、基因突变等风险，具有更加安全的特点，并能够在一定程度上具备替代细胞治疗的潜力。同时该方法能够将其他所需药物单独或同时与细胞活性成分加入红细胞囊泡中，进行靶向递送，以提高治疗效果。该方法还可以获得大量的细胞囊泡，解决了外泌体类药物产量不足的问题。最后该方法通过对细胞囊泡进行靶向修饰，可以使药物准确到底病症部位，提高治疗效果、降低药物副作用。因此该方法可以大规模生产可用于安全性更高、治疗效果更好的细胞囊泡靶向药物。
附图说明
图1为本发明所述红细胞囊泡载体制备路线图；A：将细胞组分或药物组分先封装入红细胞囊泡，再通过不同孔径的膜，制备出红细胞囊泡载体；B：将细胞组分或药物组分直接与红细胞囊泡混合，再通过不同孔径的膜，制备出红细胞囊泡载体。
图2为本发明实施例1中红细胞囊泡粒径大小检测结果；采用nanosight仪器对红细胞囊泡的粒径大小及数量进行检测。
图3为本发明实施例1中红细胞囊泡携带绿色荧光蛋白进入肿瘤细胞荧光照片；红细胞囊泡携带绿色荧光蛋白GFP进入肿瘤细胞。
图4为本发明实施例2中NK细胞去除DNA后，PCR检测基因GAPDH的凝胶电泳结果；通过磁珠法去除NK细胞DNA，对照组为不经磁珠处理，1次、2次分别是用磁珠处理样本1次和2次，对处理后的产物进行GAPDH基因PCR扩增。
图5为本发明实施例2中红细胞囊泡携带去DNA的NK细胞组分后对肿瘤细胞杀伤效果的检测结果；将包裹了NK细胞组分的红细胞囊泡载体加入不同的肿瘤细胞，分别在48h(A)和72h(B)检测细胞活性。
图6为本发明实施例3中十字形核酸分子示意图。
图7为本发明实施例3中红细胞囊泡经靶向修饰后，携带药物阿霉素，分别对靶向细胞和非靶向细胞活性的影响检测结果；经过靶向修饰的携带阿霉素(Doxorubicin，DOX)的红细胞囊泡(Nanovesicles，NV)加入HEK293和CaCo2细胞后24h进行MTT检测。
具体实施方式
下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1采用红细胞囊泡运输GFP蛋白至肿瘤细胞
一、实验方法
(1)红细胞分离
收集人血常规结果正常的抗凝全血，600g离心5mins，去除上层血清。每管加入2倍体积的等渗液(150mM NaCl，20mM HEPES，pH 7.6)混匀后，600g离心5mins，去除上清液，如此等渗液洗涤3次。第三次600g离心10min后去除上清液，得到红细胞。
(2)红细胞内含物分离
将洗涤红细胞加入低渗液(5mM KCl，5mM哌嗪-N，N-双-2-乙磺酸，5mM MgSO4)以1：4的体积比混匀，4℃静置15min，600g离心5min，弃上清，重复2～3次去除红细胞释放出的血红蛋白等胞内成分。
(3)GFP装载
用低渗液将GFP重组蛋白(ProSpec，货号PRO-687)稀释至10μg/ml，加入至10倍体积的红细胞中，轻柔颠倒离心管，混匀溶液，静置5min，500g离心3min，弃上清，继续加入低渗液稀释的GFP，颠倒离心管混匀溶液，静置10min。加入之前加入的低渗液的1/10体积的10×PBS高渗液(ph 7.4)，随即将其置于37℃恒温水浴锅中30min，使红细胞膜重新封闭。
(4)细胞囊泡制备
脂质体挤出器(Avanti Polar Lipids)，安装孔径为1μm的聚碳酸酯膜，将上述步骤得到的红细胞-GFP在脂质体挤出器的作用下通过聚碳酸酯膜，重复该步骤4～5次，得到的产物再通过0.2μm的聚碳酸酯膜，重复4～5次。加入PBS，3000g离心10min，取上清，100000g离心1h，弃上清，加入PBS漂洗，再次4℃，100000g离心1h，弃上清，加入PBS将沉淀悬起，4℃放置待用。
(5)细胞囊泡大小的测定
取上一步制备好的细胞囊泡，用PBS稀释20倍，使用纳米粒径分析仪(NanoSightNS300)检测囊泡直径大小。
(6)细胞囊泡和肿瘤细胞的相互作用
将上一步制备好的细胞囊泡加入结肠癌细胞Caco2中，细胞继续培养24h后，倒弃上清培养液，细胞用3ml pH 7.4PBS洗3次，加入新鲜细胞培养液。
二、实验结果
采用nanosight仪器对红细胞囊泡的粒径大小及数量进行检测，结果如图2所示检测结果显示囊泡粒径大小主要集中在100μm-250μm范围内，其中大部分分布在148μm～172μm，囊泡大小比较均一。
制备好的细胞囊与结肠癌细胞CaCo2混合后，荧光显微镜下观察，结果显示(图3)在细胞内可见GFP绿色荧光，证明细胞囊泡能够被细胞吸收，能够将GFP蛋白带入细胞内部。
实施例2采用红细胞囊泡运输NK细胞无DNA内含物至肿瘤细胞
一、NK细胞培养
抽取抗凝外周血50ml，800g，15min室温离心，取离心后细胞成分，加入pH 7.4PBS悬浮细胞，加入人淋巴细胞分离液，混匀，800g，15min室温离心。取细胞层，加入培养基alpha MEM，并添加20％FCS、12.5％马血清、0.2mM肌醇、0.02mM叶酸、1.43mMβ-巯基乙醇、600U/ml IL-2、10U/ml青霉素以及10μg/ml链霉素。待细胞增殖至足够数量时，离心收集细胞。
二、NK细胞破碎及DNA去除
(1)实验方法
取上一步收集好的细胞，采用高压破碎仪破碎NK细胞，功率为0.75k W，经25s一次性破碎。将500μl细胞匀浆和50μl的磁珠加入离心管中混匀，置于混匀器上，缓慢转动20mins，将离心管置于磁力架上1mins，至溶液澄清，吸取上清液至另一离心管中，再次加入新的磁珠，重复上一步骤1遍。所得到NK细胞内含物即为去除DNA的胞内物质。分别取磁珠处理一次和两次的样本，各取50μl，使用DNA抽提试剂盒提取其中DNA，通过PCR检测其中GAPDH含量(GAPDH-F-5'-TGCTGAGTCACCTTCGAACC-3'；GAPDH-R-5'-AGCATAACCTGACACCAGCC-3')。
(2)实验结果
结果如图4所示，经过磁珠分离后的胞内物质，GAPDH含量显著减少，可间接反映出其中所含有的DNA量明显减少，得到DNA去除的NK细胞内容物。
三、红细胞包裹NK细胞内含物
按实施例1中的方法制备红细胞空壳，将去除DNA后的NK细胞内含物与2倍体积低渗液混合(5mM KCl，5mM哌嗪-N，N-双-2-乙磺酸，5mM MgSO4)，取1体积的红细胞空壳加入NK细胞与低渗液的混合液中，按实施例1中的方法将NK细胞内含物包装入红细胞空壳中。即，用低渗液将DNA去除的NK细胞内容物稀释至10μg/ml，加入至红细胞中，轻柔颠倒离心管，混匀溶液，静置5min，500g离心3min，继续加入低渗液稀释的GFP，颠倒离心管混匀溶液，静置10min。加入之前加入的低渗液的1/10体积的10×PBS高渗液(ph 7.4)，随即将其置于37℃恒温水浴锅中30min，使红细胞膜重新封闭。
四、细胞囊泡制备
按实施例1中的方法制备包裹了NK细胞内含物的红细胞囊泡。
五、囊泡抗肿瘤效果测试
(1)实验方法
将上述包裹了NK细胞内含物的红细胞囊泡分别加入白血病细胞K562、结肠癌细胞HTC116、宫颈癌细胞Hela中，对照组中加入无NK细胞内含物的红细胞囊泡。细胞继续培养72h，在48h和72h两个时间点分别进行MTT实验。
(2)实验结果
结果显示(图5)，实验组与对照组相比，包裹了NK细胞内含物的红细胞囊泡能够对三种肿瘤细胞都产生杀伤作用，其中对白血病细胞K562的杀伤效果较为明显。
实施例3靶向修饰的细胞囊泡的抗肿瘤效果
用红细胞囊泡包裹抗肿瘤药物阿霉素，并且进行靶向修饰，来实现靶向肿瘤细胞给药，从而减少对正常细胞的损伤。
一、实验方法
(1)红细胞空壳制备
按施例1中的方法制备红细胞空壳。
(2)阿霉素药物装载
用低渗液(5mM KCl，5mM哌嗪-N，N-双-2-乙磺酸，5mM MgSO4)将阿霉素稀释至100μg/ml，取2倍体积加入至红细胞空壳中，轻柔颠倒离心管，混匀溶液，静置5min，500g离心3min，继续加入2倍体积的低渗液稀释的阿霉素，颠倒离心管混匀溶液，静置10min，加入1/10低渗液体积的ph＝7.4的10×PBS高渗液，随即将其置于37℃恒温水浴锅中30min，使红细胞膜重新封闭。
(3)红细胞囊泡的靶向修饰
按实施例1中的方法制备包裹了阿霉素的红细胞囊泡。红细胞囊泡的靶向修饰，红细胞囊泡表面修饰有十字架结构的核酸物质，十字架结构的核酸物质由DNA序列1和DNA序列2组成：DNA序列1的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，其3’端连接有胆固醇，DNA序列2的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，其3’端连接有CEA核酸适配体，CEA核酸适配体的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。
即DNA序列1为：
5'-GGAGGCTACCTTAGATTGGTCCAATCTGGATAGCAGGAACGG-胆固醇-3'
即DNA序列2为：
5'-CCGTTCCTGCTATCTCGATGGACCATCGCTAGTAGCCTCC-aptamer-3'
CEA aptame为：5'-ATACCAGCTTATTCAATT-3'
合成十字架结构的核酸物质(图6)，CEA在多种肿瘤细胞中高表达。将合成好的两条DNA链按等质量混合，室温放置30min，将20μg核酸混合物与109细胞囊泡混匀，20℃放置1h，4℃放置30min。100000g离心1h，弃上清，PBS重新悬浮细胞囊泡沉淀。
(4)靶向修饰的红细胞囊泡对肿瘤细胞的特异杀伤作用
将状态良好的肠癌细胞Caco2和正常细胞HEK293，分别接种在96孔板中，第二天加入经靶向修饰的携带阿霉素的红细胞囊泡，每孔加入106个囊泡。24h后使用MTT方法测定细胞活性
二、实验结果
MTT结果显示(图7)，对比经过靶向修饰的红细胞囊泡对CEA高表达的肠癌细胞Caco2和CEA低表达的细胞HEK293的杀伤作用。对于经过靶向修饰的红细胞囊泡对于Caco2具有较强的杀伤作用，而对HEK293的毒性较低。说明经过靶向修饰的红细胞囊泡载体具有较好的靶向作用。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。
序列表
<110> 深圳百纳心致生命科学有限公司
<120> 一种利用红细胞制备的靶向性的囊泡药物
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ggaggctacc ttagattggt ccaatctgga tagcaggaac gg 42
<210> 2
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ccgttcctgc tatctcgatg gaccatcgct agtagcctcc 40
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ataccagctt attcaatt 18

Claims (3)

1.一种利用红细胞制备的囊泡药物，其特征在于，所述囊泡药物，粒径大小为50～300nm，其以成熟红细胞的细胞空壳包裹以下成分中的一种：
(1)不含有DNA的NK细胞的内容物；
或(2)药物；
所述药物为化学药物或蛋白药物；所述化学药物为阿霉素；
所述成熟红细胞的空壳的制备方法为：采用改变渗透压的方法进行红细胞内含物的释放，将红细胞与低渗液混合，静置，使红细胞释放出内含物，得到红细胞的细胞空壳；
所述囊泡表面修饰有十字架结构的核酸物质，所示十字架结构的核酸物质一端连接有脂溶性分子插入细胞囊泡，另一端连接有针对靶点的靶向分子；所述十字架结构的核酸物质由DNA序列1和DNA序列2组成：
DNA序列1的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，其3’端连接有胆固醇，
DNA序列2的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，其3’端连接有CEA核酸适配体；
所述CEA核酸适配体的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。
2.一种如权利要求1所述的囊泡药物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.制备成熟红细胞的细胞空壳；
S2.制备待包裹物质；
S3.利用成熟红细胞的细胞空壳与待包裹物质制备囊泡药物；
S4.在囊泡药物表面修饰十字架结构的核酸物质，使得十字架结构的核酸物质一端连接脂溶性分子插入细胞囊泡，另一端连接有针对靶点的靶向分子；
步骤S3的具体做法为：(1)将成熟红细胞的细胞空壳与待包裹物质混合，改变渗透压，使待包裹物质进入成熟红细胞的细胞空壳，之后通过直径为0.1μm-5μm的孔，分离囊泡药物；或(2)将成熟红细胞的细胞空壳与待包裹物质混合，之后通过直径为0.1μm-5μm的孔，分离囊泡药物。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤S1的具体方法为：红细胞中使用低渗液涨破，静置后离心，弃上清，重复2～3次去除红细胞释放出的胞内成分。
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