CN111494341A - 一种纳米细胞膜载药囊泡及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种纳米细胞膜载药囊泡及其制备方法与应用，其特点在于通过物理挤出技术，在形成纳米尺度细胞膜囊泡的过程中进行药物包裹，不对所包裹药物活性产生任何影响，并且能够延长药物在体内循环时间，提高药物靶向能力，实现药物的定向缓慢释放。制备方法包括细胞膜的获取，和细胞膜纳米囊泡的制备。能够实现药物靶向特定部位特定细胞递送，使药物充分发挥治疗作用，防止药物一次性大量聚集在肝脏或肾脏造成的肝肾损伤。通过探针包裹能够追踪药物体内动力学变化。
Description
技术领域
本发明所属领域为纳米载体与药物包封，具体说是基于细胞膜制备的纳米载药囊泡及其制备方法与应用。
技术背景
仿生纳米药物载体不仅能够缓释药物从而延长药物在体内的时效性，而且能够辅助溶解性较低的药物制备可注射剂型。现有纳米载体多由人工合成，体系含有非生物源性物质，不能完全模拟机体天然组分构成，进入机体容易被免疫系统识别清除。细胞外泌体是一种由细胞膜包裹蛋白质，DNA，mRNA，microRNA等多种生物活性分子形成的百纳米尺度小囊泡。能够高效定向地将生物活性因子转运到目标细胞发挥作用。该纳米囊泡既不影响包裹成分活性，又能规避机体免疫系统攻击，其外壳成分为细胞膜，然而其产量非常有限，不适于大规模提取。本发明模拟细胞外泌体结构特征，提取细胞膜，通过挤出技术，在形成纳米尺度细胞膜囊泡的过程中进行药物包裹，形成一种基于细胞膜的纳米仿生载药囊泡。延长药物在体内循环时间，提高药物靶向能力，实现药物的定向缓慢释放。
发明内容
本发明所述纳米囊泡是采用细胞膜挤出技术制备的仿生载药囊泡，用于药物包封，以提高药物体内靶向性、延长药物时效性；所述细胞膜为功能定制化脂肪间充质干细胞细胞膜、骨髓间充质干细胞细胞膜、脐带间充质干细胞细胞膜、胎盘间充质干细胞细胞膜、宫血间充质干细胞细胞膜、白细胞细胞膜、红细胞细胞膜中的一种或多种组成的细胞膜混合物；所述药物为荧光探针、化合物、生物活性因子中的一种或几种组合成的混合物。
其具体制备方法包括以下步骤：
1)细胞膜的获取：通过合适的化学/物理刺激因子或修饰技术使细胞膜表达或嵌合某种特定功能分子，功能化的细胞用PBS分散，107个细胞/管分装在离心管中，1000rpm离心5min，弃掉上清，获得备用细胞；准备细胞裂解液：0.01M Tris，0.001M MgCl2，2mM PMSF，0.35M蔗糖、终浓度为10μg/mL的DNase和RNaseA溶于蒸馏水，终pH＝7.4；107个备用细胞加入1mL细胞裂解液，22000rpm匀浆2min，然后4℃，4000rpm，离心10min，收集上清液，再4℃，10000rpm，离心20min，弃上清，所获沉淀用细胞裂解液洗涤两遍，所得沉淀即为纯化细胞膜；
2)细胞膜纳米囊泡制备：107个细胞的细胞膜用0.5mL PBS重悬后，用超声破碎仪(Sonics VCX150)以25％-35％的功率超声25-35s，之后与等体积待包裹药物溶液混匀，用挤出器(
Mini Extruder)将悬浮液通过不同孔径尺寸的醋酸膜挤出20-30次，制备不同尺度载药纳米囊泡；收集挤膜完成的混悬液，于4℃，100000g离心1h，弃上清，沉淀用200-500μL PBS重悬得到纳米囊泡。
所得载药纳米囊泡可用于药物靶向递送，延长药物作用时间等。
本发明与现有技术相比突出优点在于：
1、在纳米原材料选择上，细胞膜来源于生物体，甚至是包封药物使用者自身，具有更好的生物相容性和免疫逃避能力，能够延长药物被机体清除的时间，增强药物治疗效果。
2、在制备工艺上，所需设备简单常规，是一种物理方法制备纳米颗粒，不破坏药物活性和有效性，能够精准控制纳米囊泡尺度，容易实现质量控制。因为挤出器挤出过程是将细胞膜碎片再囊泡化，所以对被包裹药物的溶解性要求不高，也能够对包裹药物进行缓慢释放。同时避免化学制备方法引入的交联剂等化学分子对机体的损伤作用。
3、在功能上，仿生纳米载药囊泡能够实现药物靶向特定部位特定细胞递送，使药物充分发挥治疗作用，防止药物一次性大量聚集在肝脏或肾脏造成的肝肾损伤。通过探针包裹能够追踪药物体内动力学变化。
具体实施方式
实施例1：
1)细胞膜的获取：取正常培养的人骨髓间充质干细胞107个于离心管中，1000rpm离心5min，弃掉上清，获得备用细胞；准备细胞裂解液：0.01M Tris，0.001M MgCl2，2mMPMSF，0.35M蔗糖、终浓度为10μg/mL的DNase和RNaseA溶于蒸馏水，终pH＝7.4；107个备用细胞加入1mL细胞裂解液，22000rpm匀浆2min，然后4℃，4000rpm，离心10min，收集上清液，再4℃，10000rpm，离心20min，弃上清，所获沉淀用细胞裂解液洗涤两遍，所得沉淀即为纯化细胞膜；
2)细胞膜纳米囊泡制备：107个细胞的细胞膜用0.5mL PBS重悬后，用超声破碎仪(Sonics VCX150)以25％的功率超声25s，之后与等体积待包裹药物溶液混匀，用挤出器(
Mini Extruder)将悬浮液通过0.4μm孔径的醋酸膜挤出25次；收集挤膜完成的混悬液，于4℃，100000g离心1h，弃上清，沉淀用500μL PBS重悬得到具有缓释作用的纳米载药囊泡。
实施例2：
1)细胞膜的获取：人脐带间充质干细胞传代铺展6小时后，更换诱导培养基(20ng/mL INFγ，10ng/mL TNFα)诱导48小时，使细胞膜获得靶向功能，功能化细胞用PBS分散，107个细胞/管分装在离心管中，1000rpm离心5min，弃掉上清，获得备用细胞；准备细胞裂解液：0.01M Tris，0.001M MgCl2，2mM PMSF，0.35M蔗糖、终浓度为10μg/mL的DNase和RNaseA溶于蒸馏水，终pH＝7.4；107个备用细胞加入1mL细胞裂解液，22000rpm匀浆2min，然后4℃，4000rpm，离心10min，收集上清液，再4℃，10000rpm，离心20min，弃上清，所获沉淀用细胞裂解液洗涤两遍，所得沉淀即为纯化细胞膜；
2)细胞膜纳米囊泡制备：107个细胞的细胞膜用0.5mL PBS重悬后，用超声破碎仪(Sonics VCX150)以35％的功率超声30s，之后与等体积待包裹药物溶液混匀，用挤出器(
Mini Extruder)将悬浮液通过0.3μm孔径的醋酸膜挤出30次；收集挤膜完成的混悬液，于4℃，100000g离心1h，弃上清，沉淀用200μL PBS重悬得到具有靶向作用的纳米载药囊泡。
实施例3：
1)细胞膜的获取：取正常培养的人脂肪间充质干细胞107个于离心管中，1000rpm离心5min，弃掉上清，获得备用细胞；准备细胞裂解液：0.01M Tris，0.001M MgCl2，2mMPMSF，0.35M蔗糖、终浓度为10μg/mL的DNase和RNaseA溶于蒸馏水，终pH＝7.4；107个备用细胞加入1mL细胞裂解液，22000rpm匀浆2min，然后4℃，4000rpm，离心10min，收集上清液，再4℃，10000rpm，离心20min，弃上清，所获沉淀用细胞裂解液洗涤两遍，所得沉淀即为纯化细胞膜；
2)细胞膜纳米囊泡制备：107个细胞的细胞膜用0.5mL PBS重悬后，用超声破碎仪(Sonics VCX150)以35％的功率超声25s，之后与等体积地塞米松和FITC混合溶液混匀，用挤出器(
Mini Extruder)将悬浮液通过0.4μm孔径醋酸膜挤出30次，通过0.2μm孔径醋酸膜挤出30次；收集挤膜完成的混悬液，于4℃，100000g离心1h，弃上清，沉淀用400μLPBS重悬得到具有示踪作用的仿生纳米囊泡。
实施例4：
1)细胞膜的获取：分离血液白细胞，收集107个备用；准备细胞裂解液：0.01MTris，0.001M MgCl2，2mM PMSF，0.35M蔗糖、终浓度为10μg/mL的DNase和RNaseA溶于蒸馏水，终pH＝7.4；107个备用细胞加入1mL细胞裂解液，22000rpm匀浆2min，然后4℃，4000rpm，离心10min，收集上清液，再4℃，10000rpm，离心20min，弃上清，所获沉淀用细胞裂解液洗涤两遍，所得沉淀即为纯化细胞膜；
2)细胞膜纳米囊泡制备：107个细胞的细胞膜用0.5mL PBS重悬后，用超声破碎仪(Sonics VCX150)以25的功率超声35s，之后与等体积VEGF(vascular endothelial growthfactor)溶液混匀，用挤出器(
Mini Extruder)将悬浮液通过0.4μm孔径醋酸膜挤出25次，通过0.2μm孔径醋酸膜挤出25次；收集挤膜完成的混悬液，于4℃，100000g离心1h，弃上清，沉淀用400μL PBS重悬得到具有缓释生长因子作用的仿生纳米囊泡。
实施例5：
取200μL载药囊泡(包裹VEGF的纳米囊泡、VEGF与空白囊泡混合悬液)加入到3.8mLPBS中置于垂直混悬仪上，37℃条件下检测VEGF释放效率，分别于4h、12h、24h、2d、4d、7d取反应液200μL补充PBS 200μL。反应结束后，用VEGF ELISA试剂盒检测反应液中VEGF浓度。结果如表1显示，VEGF经细胞膜纳米囊泡包裹后具有缓释作用，释放作用能够持续7d。
实施例6：
取50μL包裹FITC的纳米囊泡(靶向纳米载药囊泡和正常纳米载药囊泡)分别与炎症血管内皮细胞和正常血管内皮细胞在37℃条件下避光共孵育10min，反应结束后用PBS清洗细胞3次。加入200μL PBS后在激光共聚焦显微镜或酶标仪488nm激发光下读取荧光值，重复三次，测定靶向纳米载药囊泡与炎症血管内皮细胞的特异性结合能力。结果如表1显示，靶向纳米载药囊泡能够有效的将所包裹的药物定向递送到损伤细胞，在特定位点发挥治疗作用。
实施例7：
取50μL纳米囊泡(包裹有VEGF的靶向纳米囊泡)或等量VEGF溶液，经尾静脉注射到20mg/kg顺铂诱导的急性肾损伤小鼠体内，4d、10d后取小鼠血清检测血尿素氮(BUN)和血清肌酐(SCr)含量，并取材做冷冻切片，用免疫荧光染色的方法和Evan Blue检测法，检测肾实质损伤和血管修复情况。
结果：靶向递送纳米囊泡移植急性肾损伤小鼠治疗评价结果发现，包裹VEGF的纳米囊泡能够更有效降低血清尿素氮和血清肌酐含量，CD31免疫荧光染色结果显示血管连续性更好，Evan Blue检测血管渗透性降低。证明本发明的载药纳米囊泡能够通过靶向病灶部位缓释药物发挥更好的治疗效果。
表1.载药纳米囊泡和药物溶液性质比较
Claims (3)
1.纳米细胞膜载药囊泡是利用细胞膜通过挤出技术制备的纳米载药囊泡，细胞膜为功能定制化脂肪间充质干细胞细胞膜、骨髓间充质干细胞细胞膜、脐带间充质干细胞细胞膜、胎盘间充质干细胞细胞膜、宫血间充质干细胞细胞膜、白细胞细胞膜、红细胞细胞膜中的一种或多种组成的细胞膜混合物；药物为荧光探针、化合物、生物活性因子中的一种或几种组合成的混合物。
2.纳米细胞膜载药制备方法，包括以下步骤：
1)细胞膜的获取：通过合适的化学/物理刺激因子或修饰技术使细胞膜表达或嵌合某种特定功能分子，功能化的细胞用PBS分散，107个细胞/管分装在离心管中，1000rpm离心5min，弃掉上清，获得备用细胞；准备细胞裂解液：0.01M Tris，0.001M MgCl2，2mM PMSF，0.35M蔗糖、终浓度为10μg/mL的DNase和RNaseA溶于蒸馏水，终pH＝7.4；107个备用细胞加入1mL细胞裂解液，22000rpm匀浆2min，然后4℃，4000rpm，离心10min，收集上清液，再4℃，10000rpm，离心20min，弃上清，所获沉淀用细胞裂解液洗涤两遍，所得沉淀即为纯化细胞膜；
2)细胞膜纳米囊泡制备：107个细胞的细胞膜用0.5mL PBS重悬后，用超声破碎仪(Sonics VCX150)以25％-35％的功率超声25-35s，之后与等体积待包裹药物溶液混匀，用挤出器(
Mini Extruder)将悬浮液通过不同孔径尺寸的醋酸膜挤出20-30次，制备不同尺度载药纳米囊泡；收集挤膜完成的混悬液，于4℃，100000g离心1h，弃上清，沉淀用200-500μL PBS重悬得到纳米囊泡。
3.所得纳米细胞膜载药囊泡可用于药物靶向递送，延长药物作用时间等。
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Legal Events
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|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication | ||
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Application publication date: 20200807 |