CN109395096B - 标记外泌体的方法和aie荧光分子标记的外泌体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本公开涉及一种标记外泌体的方法和AIE荧光分子标记的外泌体及其应用，该方法包括：将含有AIE荧光分子的标记溶液与外泌体混合后进行荧光标记。本公开利用特定的聚集诱导发光荧光分子稳定高效地对外泌体进行标记，不改变外泌体的结构和组成成分，不影响其生物功能，所得到的标记后的外泌体可用于制备示踪药物，有助于对外泌体的功能进行进一步的研究。
Description
技术领域
本公开涉及生物技术领域，具体地，涉及一种标记外泌体的方法和AIE荧光分子标记的外泌体及其应用。
背景技术
外泌体是由活细胞分泌的直径约30-100nm的具有双层膜结构的纳米级细胞外囊泡，天然存在于血液、唾液、尿液和母液等各种体液中。外泌体作为细胞外囊泡的重要组成部分，已成为细胞间通讯的重要形式，其所介导的细胞间通讯可以为邻近细胞提供大量的生物活性信号分子，包括DNA、RNA、microRNA及蛋白质等。被释放至细胞外的外泌体可以通过不同的途径进入靶细胞内，发挥其生物学功能。第一，外泌体可以通过与靶细胞膜表面受体结合，触发靶细胞内的信号转导通路，并进一步调节靶细胞内的生物学过程；第二，外泌体可以被靶细胞内在化，这一过程依赖于网格蛋白介导的内吞作用、脂筏介导的内吞作用及胞饮作用等；第三，外泌体可以通过与靶细胞膜融合，直接将外泌体内携带的活性物质递送到靶细胞内。
随着细胞生物学和医学前沿交叉领域的不断发展，外泌体的研究逐渐深入，越来越多的研究证明外泌体在疾病治疗中展现出令人振奋的治疗效果。如间充质干细胞来源的外泌体通常被认为具有与间充质干细胞相似的功能，包括促进组织损伤修复、抑制炎症反应及减轻组织纤维化程度等。但是，在利用外泌体进行治疗前，首先要阐明外泌体在体内的生物分布和在细胞中的最终命运。所以迫切需要一种标记方法实现对外泌体的体外标记和活体示踪，从而实现在不影响其功能的前提下可视化外泌体，有助于对外泌体的功能进行进一步的研究。
目前为止已有多种标记外泌体的方法，但是都存在一定的缺陷，主要表现在破坏外泌体的膜结构、改变外泌体的组成成分、影响外泌体的功能。例如荧光蛋白报告系统和荧光素酶报告系统通过构建CD63或Gluc过表达的稳定细胞系而产生具有CD63-GFP或Gluc-GFP标记的外泌体，所以这些细胞产生的外泌体的组成成分已经发生改变，而且CD63在外泌体的生物发生和功能中是一种重要的蛋白，也影响了外泌体的功能。通过修饰外泌体的结构、利用外泌体表面的巯基和通过放射性核素标记外泌体则破坏或改变了外泌体的膜结构，改变了其物理性质从而影响外泌体的功能。而最常用的各种荧光染料，却具有很高的淬灭系数，导致其半衰期短且易淬灭，而且它们可以在与外泌体相似的水溶液中形成染料聚集体，导致在外泌体的摄取实验中带来误差。
发明内容
本公开的目的是提供一种标记外泌体的方法和AIE荧光分子标记的外泌体及其应用，该方法不改变外泌体的结构和组成成分，也不影响外泌体的生物功能。
为了实现上述目的，本公开第一方面：提供一种标记外泌体的方法，该方法包括：将含有AIE荧光分子的标记溶液与外泌体混合后进行荧光标记，其中，所述AIE荧光分子的结构式为：
可选地，以含有100μg蛋白质的外泌体为基准，所述AIE荧光分子的用量为1～8nmol。
可选地，所述标记溶液为AIE荧光分子与缓冲液的混合物，所述AIE荧光分子的终浓度为1～8μmol/L。
可选地，所述缓冲液为PBS、Na-HEPES、HEPES或生理盐水。
可选地，所述荧光标记的条件为：温度为4～37℃，时间为2～3h。
可选地，所述外泌体为来源于干细胞的外泌体，所述干细胞包括脂肪间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、脐带间充质干细胞、胎盘间充质干细胞、尿液来源干细胞、内皮祖细胞和心脏干细胞中的一种或多种。
可选地，该方法还包括将荧光标记后的物料进行离心分离的步骤，所述离心的条件为：速度为100000～130000rcf，时间为60～120min。
本公开第二方面：提供由本公开第一方面所述的方法得到的AIE荧光分子标记的外泌体。
本公开第三方面：提供本公开第二方面所述的AIE荧光分子标记的外泌体在制备示踪药物中的用途。
通过上述技术方案，本公开利用特定的聚集诱导发光荧光分子稳定高效地对外泌体进行标记，不改变外泌体的结构和组成成分，不影响其生物功能，所得到的标记后的外泌体可用于制备示踪药物，有助于对外泌体的功能进行进一步的研究。
本公开的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
附图说明
附图是用来提供对本公开的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本公开，但并不构成对本公开的限制。在附图中：
图1是测试实施例1的外泌体透射电子显微镜照片；
图2是测试实施例2的外泌体标志蛋白的Western blot鉴定结果；
图3是测试实施例3的外泌体的粒径和Zeta电位的纳米颗粒跟踪分析结果；左图中，横坐标代表直径，纵坐标代表浓度；右图中，横坐标代表Zeta电位，纵坐标代表频率；
图4是测试实施例4的AIE荧光分子标记的外泌体的标记率和稳定率结果；
图5是测试实施例5的AIE荧光分子标记的外泌体的内化结果，左图为AIE荧光分子标记的外泌体，中间为细胞核，右图为AIE荧光分子标记的外泌体被内化于细胞核和细胞质；
图6是测试实施例5的AIE荧光分子标记的外泌体和DiI标记的外泌体在1天和5天时被细胞内化后荧光信号的比较结果；
图7是测试实施例6的AIE荧光分子标记的外泌体在不同时间点的体内示踪结果；
图8是测试实施例7的不同浓度的AIE荧光分子标记的外泌体对细胞活力的影响结果，横坐标代表AIE荧光分子浓度，纵坐标代表细胞活力；
图9是测试实施例7的外泌体对损伤组织的修复情况。
图10是对比例中荧光分子对细胞的标记情况。
其中，Exos代表未标记的外泌体，AIE-Exos代表AIE荧光分子标记的外泌体，DiI-Exos代表DiI荧光分子标记的外泌体，Con代表对照组。
具体实施方式
以下结合附图对本公开的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本公开，并不用于限制本公开。
本公开第一方面：提供一种标记外泌体的方法，该方法包括：将含有AIE荧光分子的标记溶液与外泌体混合后进行荧光标记，其中，所述AIE荧光分子的结构式为：
根据本公开，所述AIE荧光分子可以采用现有技术中的方法制备得到，例如参照：Yu C Y Y,Xu H,Ji S,et al.Radiosensitizers:Mitochondrion-AnchoringPhotosensitizer with Aggregation-Induced Emission CharacteristicsSynergistically Boosts the Radiosensitivity of Cancer Cells to IonizingRadiation(Adv.Mater.15/2017)[J].Advanced Materials,2017,29(15):1606167.中的方法制备得到。
根据本公开，所述外泌体可以为来源于干细胞的外泌体。进一步地，所述干细胞可以包括脂肪间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、脐带间充质干细胞、胎盘间充质干细胞、尿液来源干细胞、内皮祖细胞和心脏干细胞中的一种或多种。本公开对获得所述外泌体的方式没有特殊的限制，例如可以采用现有技术中的方法提取得到所述外泌体。
根据本公开，以含有100μg蛋白质的外泌体为基准，所述AIE荧光分子的用量可以为1～8nmol，优选为4nmol。
根据本公开，所述标记溶液为AIE荧光分子与缓冲液的混合物，所述AIE荧光分子的终浓度可以为1～8μmol/L，优选为4μmol/L。
进一步地，所述缓冲液可以为本领域常规的用于溶解稀释生物制剂的溶液，例如可以为PBS、Na-HEPES、HEPES或生理盐水。
根据本公开，所述荧光标记的条件可以为：温度为4～37℃，时间为2～3h。
根据本公开，该方法还可以包括将荧光标记后的物料进行离心分离的步骤，离心后去除上清，得到AIE荧光分子标记的外泌体。进一步地，所述离心的条件可以为：速度为100000～130000rcf，时间为60～120min。所得到的AIE荧光分子标记的外泌体可用一定量的缓冲液(如PBS)重悬后于适宜温度下保存备用。
本公开第二方面：提供由本公开第一方面所述的方法得到的AIE荧光分子标记的外泌体。
本公开第三方面：提供本公开第二方面所述的AIE荧光分子标记的外泌体在制备示踪药物中的用途。
以下通过实施例进一步详细说明本公开。
实施例中，AIE荧光分子参照：Yu C Y Y,Xu H,Ji S,et al.Radiosensitizers:Mitochondrion-Anchoring Photosensitizer with Aggregation-Induced EmissionCharacteristics Synergistically Boosts the Radiosensitivity of Cancer Cellsto Ionizing Radiation(Adv.Mater.15/2017)[J].Advanced Materials,2017,29(15):1606167.中的方法制备得到。
实施例和对比例中所使用的外泌体的提取方法为：
细胞培养基、双抗、胰酶等试剂均购于Gibco公司；细胞培养耗材均购于Corning公司。
细胞培养所需血清为去除外泌体的胎牛血清，购于BI公司，处理步骤如下：将胎牛血清置于超速离心管中，120000g在4℃离心2h，在超净台中取上清，并用0.22μm的针式滤器过滤，保存于-80℃冰箱备用。细胞传代培养、冻存及复苏等细胞生物学实验操作步骤详见《动物细胞培养(第六版)》。
收集含有外泌体的人胎盘间充质干细胞(hP-MSCs)的条件培养基：当培养于75cm2的细胞培养瓶中的hP-MSCs处于对数增长期，细胞汇合度达到80％时，吸尽培养基，用PBS洗两次，每瓶加入10ml配置好的含有10％无外泌体的FBS的完全培养基，继续培养48h后，将培养基收集至离心管中，该培养基为富含外泌体的条件培养基。
将上述步骤获得的条件培养基于4℃，300g离心10min，去除细胞碎片；将所得上清于4℃，12000g离心20min，去除凋亡小体等大的细胞碎片；用0.22μm的针式滤器过滤所得上清，去除直径大于200nm的微囊泡；把过滤后的上清置于超速离心管中，4℃100000g离心70min，弃上清，加入适量PBS重悬管底沉淀，于-80℃保存。
实施例
本实施例用于说明本公开的标记外泌体的方法。
取5mmol/L的AIE荧光分子0.8μL，加入提取好的含100μg蛋白质的100μl外泌体样品中，以PBS补足至1000μL，充分振荡混匀，于暗室中室温37℃进行荧光标记2h。然后将上述混合液移入超速离心管中，以PBS补满，4℃，100000rcf速度下离心60min后去除上清，得到AIE荧光分子标记的外泌体。
用50μL PBS重悬上述AIE荧光分子标记的外泌体，分装并储存于-80℃冰箱备用。
对比例
本实施例用于说明采用与本公开不同的荧光分子对外泌体进行标记的方法，参照Ding,D.；Mao,D.；Li,K.；Wang,X.；Qin,W.；Liu,R.；Chiam,D.S.；Tomczak,N.；Yang,Z.；Tang,B.Z.；Kong,D.；Liu,B.,Precise and long-term tracking of adipose-derivedstem cells and their regenerative capacity via superb bright and stableorganic nanodots.ACS Nano 2014,8(12),12620-31.所采用的荧光分子的结构式为：。
按照实施例的方法标记外泌体，不同的是，采用上述荧光分子进行荧光标记。
采用激光共聚焦显微镜仪器测试标记情况，检测条件为：Ex＝543nm；Em>560nm。结果如图10所示，可见，本对比例采用的荧光分子可以标记细胞，但不能标记外泌体。
测试实施例1
使用透射电子显微镜鉴定外泌体形态。
将未标记的外泌体和实施例得到的AIE荧光分子标记的外泌体分别滴于200目的样品铜网上，室温静止2min，用滤纸吸干多余液体；在样品网上滴加20mg/mL醋酸铀溶液，室温静置1min，对样品进行负染，用滤纸吸干多余液体，并将样品网晾干；将制备好的样品置于透射电镜下观察，并采集照片。
如图1所示，与未标记的外泌体相比，AIE荧光分子标记的外泌体形态和直径均不发生改变，形态为杯状囊泡样结构，直径约为70～120nm左右。
测试实施例2
通过Western blot检测外泌体的标志蛋白CD9和CD63。
蛋白样品制备：在未标记的外泌体和实施例得到的AIE荧光分子标记的外泌体中分别加入RIPA裂解液裂解外泌体，反复吹打后移入洁净1.5mL EP管中，在冰上裂解30min，每10min涡旋振荡一次，于4℃，12000rpm离心15min，将上清移入新的EP管中；使用BCA法测定外泌体蛋白浓度，其余蛋白液中加入5倍上样缓冲液，在沸水中煮10min，保存于-80℃冰箱中备用。
聚丙烯酰胺凝胶电泳：将洁净晾干的玻璃板装于制胶架上，使底边吻合严密，用蒸馏水验漏。按照分离胶配方配制10％的分离胶溶液，充分混匀，用移液器加入4.5ml分离胶溶液至玻璃板缝隙中，立即轻柔加入蒸馏水将分离胶液面压平，约20min后分离胶凝固。按照配方配制5％的浓缩胶溶液，灌注1.5ml浓缩胶溶液到分离胶的上方，立即插入梳子，待浓缩胶凝固后便可使用。将配好的胶板放置到电泳槽内，注意短玻板向内侧，在两块玻板中间加入电泳液，将梳子拔出，按照测定蛋白浓度统一上样量，将蛋白样品加入上样孔中，添加电泳液至电泳槽标记处，盖好电泳槽盖，注意连接正负极，90V开始电泳，待溴酚蓝跑至分离胶时，将电压调至120V，直至溴酚蓝接近玻板底部时停止电泳。
转膜：将转膜夹与海绵及滤纸浸泡于预冷的转膜缓冲液中，把聚丙烯酰胺凝胶置于黑色夹板一侧，剪取适宜大小的PVDF膜，置于甲醇中活化60s，放置于胶上，除尽气泡，覆盖滤纸和海绵，按照转膜夹负极(黑色)-海绵-滤纸-胶-膜-滤纸-海绵-正极(白色)顺序夹好转膜夹，放置于转膜槽中，添加转膜液，冰浴恒压120V转膜2h。
封闭：将转膜完成的PVDF膜取出，用TBST溶液洗尽凝胶残渣，置于5％的脱脂牛奶(封闭液)中，水平摇床100rpm室温封闭1h。
抗体杂交：①一抗孵育：用封闭液按照说明书稀释一抗(CD9，1：1000稀释，CD63，1:1000稀释)，吸取2ml一抗置于抗体孵育盒中，对照蛋白Marker将目的条带剪下，浸泡于对应一抗中，4℃孵育过夜；②二抗孵育：将条带用TBST溶液清洗3次，每次5min，然后加入对应二抗，水平摇床100rpm室温孵育2h，孵育完成后用TBST洗3次，每次5min。
发光检测：把发光液A/B按1:1比例进行混合配成工作液，在暗室中将发光液滴加在膜上，待目的条带发出绿色荧光时，用胶片进行曝光、显影及定影。
如图2所示，与未标记的外泌体相比，AIE荧光分子标记的外泌体的标志蛋白CD9和CD63的表达没有显著差异。
测试实施例3
用纳米颗粒跟踪分析仪检测外泌体粒径、Zeta电位和浓度。
将未标记的外泌体和实施例得到的AIE荧光分子标记的外泌体分别用双蒸水稀释，加入到纳米颗粒跟踪分析仪样品池中进行检测，通过子体积的扫描，计算出颗粒的Zeta电位和粒径柱状图结果。
如图3所示，AIE荧光分子标记的外泌体的粒径分布没有发生显著改变，Zeta电位稍有变化，可能是因为带正电的AIE荧光分子附着外泌体表面所致。
测试实施例4
通过流式细胞术检测AIE荧光分子标记的外泌体的标记率和稳定率。
将未标记的外泌体和实施例得到的AIE荧光分子标记的外泌体分别重悬于50μL经0.22μm滤膜过滤的PBS中，保证每个流式检测的外泌体包含500ng的蛋白；加入450μL过滤的PBS重悬样品；上述样品过200目的筛子于流式管，准备上机检测，检测10000个稀释的外泌体。
如图4所示，在AIE荧光分子标记后24小时的标记率达71.2％，在第五天后标记率仍为37.5％。
测试实施例5
通过激光共聚焦显微镜观察外泌体的内化。
人脐静脉内皮细胞(HUVECs)的培养：将HUVECs培养于24孔板的细胞爬片上。
外泌体的内化：待融合度达到70％左右时，加入实施例得到的AIE荧光分子标记的外泌体，37℃恒温培养24～48h。然后弃去培养基，PBS清洗之后用4％多聚甲醛固定10min，然后用PBS洗3次，再用细胞核荧光染料DAPI染色15min，PBS洗3次，在激光共聚焦显微镜下观察被内化的外泌体，检测条件为：Ex＝488nm；Em＝500-700nm。
如图5所示，AIE荧光分子标记的外泌体分布在细胞核和细胞质中，表明AIE荧光分子标记的外泌体可以被细胞内吞化。
作为对比，采用常用商业化荧光探针DiI(购自Sigma)标记外泌体后同样与HUVECs共培养48h，观察外泌体的内化。
如图6所示，DiI标记的外泌体的荧光强度远不如AIE荧光分子标记的外泌体。可以证明，相较于商业化荧光探针而言，本公开的AIE荧光分子的光稳定性更强、尺寸可控性更好、表面修饰更容易。
测试实施例6
检测AIE荧光分子标记的外泌体的体内示踪情况。
6～8周健康雌性FVB小鼠尾静脉注射100μL实施例得到的AIE荧光分子标记的外泌体；在不同时间点利用Xenogen IVIS Lumina活体成像系统监测AIE荧光分子标记的外泌体在体内的分布。
如图7所示，AIE荧光分子标记的外泌体在体内呈时间依赖性分布，显示了本公开的AIE荧光分子具有深的组织穿透性、低的生物背景干扰、高的灵敏度和专一性以及高的生物安全性。
测试实施例7
检测AIE荧光分子标记的外泌体对细胞活力的影响。
人脐静脉内皮细胞(HUVECs)以10000cells/孔的密度接种于96孔板中，预培养24h；向细胞培养基中加入100μg/mL不同浓度AIE荧光分子标记的外泌体(每个浓度有5个平行孔)，AIE荧光分子终浓度分别为1μM，2μM，4μM和8μM，未标记的外泌体作为对照。
于24h后，弃掉原有培养基，每孔中加入100μL新培养基，然后每孔加入20μL MTT溶液，持续培养4h。
弃掉培养基，用PBS冲洗细胞3次，然后在每孔中加入100μl的DMSO溶液，室温孵育15min。吸取每孔溶液50μL至新96孔板中，酶标仪490nm波长下，测量吸光度值。
如图8所示，不同浓度的AIE荧光分子标记的外泌体均对细胞的活力无显著影响。
小鼠急性肝损伤模型的构建：采用四氯化碳(CCL4)诱导法，称取小鼠体重，小鼠按2ml/kg体重腹腔注射25％的四氯化碳橄榄油溶液，每周两次，共一周。损伤小鼠随机分为3组：PBS组，AIE荧光分子组，AIE荧光分子标记的外泌体组，24h后尾静脉给药治疗。此外，只注射橄榄油的小鼠作为对照组。
苏木素&伊红染色评价损伤组织结构恢复情况：在第7天时，处死小鼠对损伤组织取材，制作石蜡切片，并对其进行苏木素&伊红染色，对损伤组织中央静脉细胞坏死情况及炎症浸润进行评估。
如图9所示，AIE荧光分子标记的外泌体可以减轻损伤组织坏死，抑制炎症反应，并促进损伤组织结构的恢复。
以上结合附图详细描述了本公开的优选实施方式，但是，本公开并不限于上述实施方式中的具体细节，在本公开的技术构思范围内，可以对本公开的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本公开的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本公开对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本公开的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本公开的思想，其同样应当视为本公开所公开的内容。
Claims (9)
1.一种标记外泌体的方法，其特征在于，该方法包括：将含有AIE荧光分子的标记溶液与外泌体混合后进行荧光标记，其中，所述AIE荧光分子的结构式为：
2.根据权利要求1所述的方法，其中，以含有100μg蛋白质的外泌体为基准，所述AIE荧光分子的用量为1～8nmol。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述标记溶液为AIE荧光分子与缓冲液的混合物，所述AIE荧光分子的终浓度为1～8μmol/L。
4.根据权利要求3所述的方法，其中，所述缓冲液为PBS、Na-HEPES、HEPES或生理盐水。
5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述荧光标记的条件为：温度为4～37℃，时间为2～3h。
6.根据权利要求1所述的方法，其中，所述外泌体为来源于干细胞的外泌体，所述干细胞包括脂肪间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、脐带间充质干细胞、胎盘间充质干细胞、尿液来源干细胞、内皮祖细胞和心脏干细胞中的一种或多种。
7.根据权利要求1所述的方法，其中，该方法还包括将荧光标记后的物料进行离心分离的步骤，所述离心的条件为：速度为100000～130000rcf，时间为60～120min。
8.由权利要求1～7中任意一项所述的方法得到的AIE荧光分子标记的外泌体。
9.权利要求8所述的AIE荧光分子标记的外泌体在制备示踪药物中的用途。
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| Title |
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| "Biodistribution of mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles in a model of acute kidney injury monitored by optical imaging";CRISTINA GRANGE et al;《INTERNATIONAL JOURNAL OF MOLECULAR MEDICINE》;20141231;第33卷;第1055-1063页 * |
| "In Vivo Real-Time Imaging of Extracellular Vesicles in Liver Regeneration via Aggregation-Induced Emission Luminogens";Hongmei Cao et al;《ACS Nano》;20190307;第13卷;第3522-3533页 * |
| "Mitochondrion-Anchoring Photosensitizer with Aggregation-Induced Emission Characteristics Synergistically Boosts the Radiosensitivity of Cancer Cells to Ionizing Radiation";Chris Y. Y. Yu et al;《Adv. Mater.》;20170213;第29卷;第1-9页 * |
| "Tracking Exosomes in Vitro and in Vivo To Elucidate Their Physiological Functions:Implications for Diagnostic and Therapeutic Nanocarriers";Li-Ming Shen et al;《ACS Appl. Nano Mater》;20180531;第1卷;第2438-2448页 * |
| "一种绿色荧光蛋白标记的骨髓间充质干细胞源性外泌体的构建及鉴定";任瑞 等;《神经解剖学杂志》;20170331;第33卷(第2期);第167-171页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN109395096A (zh) | 2019-03-01 |
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