KR20130127276A - 형광 물질로 표지된 엑소좀을 이용한 엑소좀을 분석하는 방법 - Google Patents
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Abstract
일 구체예에 따른 엑소좀을 분석하는 방법을 통하여, 엑소좀의 상태를 측정에 소요되는 시간이 적고 편리하며 높은 민감도로 분석할 수 있고, 구체적으로 엑소좀의 캡쳐 또는 용해를 분석함으로써, 엑소좀의 캡쳐 또는 용해를 위한 최적 조건을 스크리닝하는데 이용할 수 있다.
Description
형광 물질로 표지된 엑소좀을 이용한 엑소좀을 분석하고, 구체적으로 엑소좀의 캡쳐(capture) 및 용해를 분석하고, 엑소좀의 캡쳐로부터 고체 지지체의 엑소좀 검출 한계 또는 고체 지지체의 엑소좀 캡쳐 효율을 결정하고, 엑소좀의 용해로부터 엑소좀의 용해 효율을 결정하여 엑소좀의 용해 방법 또는 조건을 결정하는 방법에 관한 것이다.
엑소좀(exosome)은 여러 종류의 세포들로부터 분비되는 막 구조의 작은 소낭이다. 엑소좀의 직경은 대략 30-100nm인 것으로 보고되어 있다. 엑소좀은 전자 현미경을 통한 연구에서 원형질막(plasma membrane)으로부터 직접 떨어져 나가는 것이 아니라 다낭체(multivesicular bodies, MVBs)라고 불리는 세포내 특정 구획에서 기원하며 세포밖으로 방출, 분비되는 것으로 관찰되었다. 즉, 다낭체와 원형질막의 융합이 일어나면, 그러한 소낭들은 세포 밖 환경으로 방출되는데, 이것을 엑소좀이라고 부른다. 이러한 엑소좀이 어떤 분자적 기작에 의해 만들어지는지 확실히 밝혀진 바가 없으나, 적혈구 세포 뿐만 아니라, B-림프구, T-림프구, 수지상 세포, 혈소판, 대식 세포 등을 포함한 다양한 종류의 면역 세포들과 종양 세포 등도 살아 있는 상태에서 엑소좀을 생산하여 분비한다고 알려져 있다. 엑소좀은 정상 상태 및 병적 상태, 이 2가지 모든 상태하에서 다수의 다른 세포 유형으로부터 분리되어 방출된다고 알려져 있다.
또한, 엑소좀은 마이크로RNA(microRNA, miRNA)를 포함하며 이러한 miRNA는 암 조기 진단과 같은 분자 진단에 있어서 유용한 마커로 활용 가능하다. 그러나 엑소좀은 크기가 작고 세포만큼 다량의 miRNA를 포함하고 있지 않으므로 손실 없이 분리 및 정제하는 것이 필요하다.
기존의 엑소좀의 캡쳐(capture) 효율을 측정하는 방법은 항체를 이용한 웨스턴 블로팅을 사용하지만, 이 방법은 편이성과 민감도가 낮다는 단점이 있다.
또한, 기존의 엑소좀의 용해 효율을 구하는 방법은 엑소좀을 용해시킨 후, 핵산의 PCR 또는 RT-PCR을 통해 간접적으로 알아내는 방법을 사용한다. 하지만, 이러한 방법은 용해 효율뿐만 아니라 저해, 흡착 등의 영향도 같이 포함되기 때문에 실제로 용해 방법에 따른 효율 만을 정량할 수 없는 단점이 있다.
아울러, 용해 과정을 확인하는 방법에는 SEM(scanning electron microscope)이나 DLS(dynamic light scattering)를 이용해서 확인할 수 있다. 하지만, SEM이나 DLS를 이용하는 방법은 물리적으로 엑소좀의 용해가 진행되었는지 여부를 알 수 있으나, 정량적으로 산출할 수 없다(도 1 참조).
따라서, 엑소좀의 상태를 분석하는 방법을 개발할 필요가 있다.
일 구체예는 형광 물질이 표지된 엑소좀의 형광 신호 값을 측정하여 엑소좀의 상태를 분석함으로써 엑소좀을 분석을 제공한다.
일 양상은 시료 중 형광 물질이 표지된 엑소좀을 고체 지지체와 인큐베이션하여 엑소좀을 고체 지지체에 결합시키는 단계; 인큐베이션된 반응물로부터 형광 신호의 값을 측정하는 단계; 및 측정된 형광 신호 값으로부터 엑소좀의 상태를 분석하는 단계를 포함하는 엑소좀을 분석하는 방법을 제공한다.
상기 엑소좀을 분석하는 방법은 다음과 같다.
먼저, 시료 중 형광 물질이 표지된 엑소좀을 고체 지지체와 인큐베이션하여 엑소좀을 고체 지지체에 결합시키는 단계를 포함할 수 있다.
용어, "형광 물질"은 물리적 조건 변화, 화학적 처리에 의해 빛을 발생하는 물질을 의미한다. 예를 들어, 상기 형광 물질은 녹색 형광 단백질(green fluorescent protein, GFP), 황색 형광 단백질(Yellow fluorescent protein, YFP), 적색형광단백질(Red fluorescent protein, RFP)과 같은 형광 단백질(fluorescent protein)이거나, 발광 단백질(photoprotein) 또는 루시퍼라제(luciferase) 일 수 있다.
상기 형광 물질이 표지된 엑소좀은 엑소좀의 내부에 형광 물질이 단독으로 위치하거나, 막단백질과 형광 물질이 결합된 융합 단백질을 포함할 수 있다. 상기 융합 단백질은 형광 물질이 막단백질에 직접 혹은 링커를 통하여 결합될 수 있다.
용어, "막단백질"은 세포막 지질 이중층으로 이입되는 단백질 또는 당단백질을 의미하는 것으로, 이것은 막단백질 전체가 지질층을 관통하거나, 표층에 위치하는 모든 단백질을 포함한다. 예를 들어, 효소, 펩티드 호르몬, 국소 호르몬 등의 수용체, 당 등의 수용담체, 이온채널, 세포막 항원 일 수 있다. 또한, 상기 막단백질은 엑소좀에 존재하는 단백질일 수 있으며, 예를 들어, EpCAM, CD63, CD81, Hsc70, MHC I, Tsg101, calnexin 또는 gp96 일 수 있다. 이러한 막단백질은 형광 물질을 엑소좀 내에 효율적으로 위치시켜 준다. 상기 형광 물질은 막단백질의 N 말단 또는 C 말단에 링커를 통하여 결합될 수 있다. 용어, "링커(linker)"는 형광 물질과 막단백질을 연결하는 펩타이드를 의미하며, 1개 내지 50개의 아미노산으로 구성된 펩티드일 수 있으며, 5 내지 20개의 아미노산으로 구성된 펩티드일 수 있다.
용어, "고체 지지체(solid phase 또는 solid support)"는 크로마토그래프에서 이동상에 대응하는 용어이다. 컬럼 크로마토그래피에 있어서는 분리 관에 충전한 흡착제(고체) 또는 담체에 함침시킨 액체, 평판 크로마토그래피에 있어서는 여과지 등의 담체에 유지된 액체가 고체 지지체가 되며, 친화 크로마토그래피에 있어서는 흡착제를 분리를 목적으로 하는 물질에 특이적 친화력을 갖는 화합물을 고체 지지체에 결합시킨 것이 고체 지지체가 될 수 있다. 고체 지지체는 예를 들어 자성 비드(magnetic bead) 또는 폴리스티렌일 수 있다.
상기 고체 지지체는 엑소좀에 결합하는 물질을 포함할 수 있다. 예를 들어, 엑소좀에 결합하는 물질은 항체일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 용어, "항체(antibody)"는 항원에 대항하기 위해 혈액에서 생성된 당단백질로서, 항원에 특이적이다. 항체는 목적으로 하는 항원에 따라 다른 항체가 고체 지지체에 결합될 수 있고, 예를 들어 일 구체예에서 항체는 항-EpCAM 일 수 있다.
이후, 인큐베이션된 반응물로부터 형광 신호의 값을 측정하는 단계를 포함할 수 있다. 형광 신호의 측정은 형광 물질의 종류에 따라 다양한 방법이 이용될 수 있다. 예를 들어, 형광 물질이 형광 단백질(fluorescent protein)일 경우, 자외선을 조사하여 발생하는 형광광도를 형광광독계(fluorophotometer)를 사용하여 측정할 수 있다. 또는, 형광 물질이 루시퍼라제(luciferase)일 경우, 루시페린 및 ATP를 이용하여 빛을 발생시킨 후, 루미노비터를 이용하여 광도를 측정할 수 있다.
일 구체예에서, 형광물질이 표지된 엑소좀을 인큐베이션 시키지 않은 고체 지지체를 대조군으로 할 수 있고, 측정된 형광 신호 값에서 대조군의 형광 신호 값을 제거하여 형광 물질이 표지된 엑소좀과 고체 지지체의 결합에 의한 형광 신호 값을 결정할 수 있다.
이후, 측정된 형광 신호 값으로부터 엑소좀의 상태를 분석하는 단계를 포함할 수 있다.
엑소좀의 상태를 분석하는 것은 고체 지지체와 엑소좀의 결합 또는 고체 지지체에 엑소좀이 캡쳐(capture)된 상태를 분석하는 것일 수 있다.
또한, 엑소좀을 분석하는 방법은 측정된 형광 신호 값으로부터 고체 지지체의 엑소좀 검출 한계를 결정하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다. 일 구체예에서 고체 지지체의 엑소좀 검출 한계는 고체 지지체의 엑소좀 캡쳐 효율(capture efficiency)로 나타낼 수 있다.
또한, 엑소좀을 분석하는 방법은 인큐베이션된 반응물을 세척하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다. 일 구체예에서 세척 전 후의 형광 신호의 값을 비교함으로써 세척 조건에 따른 엑소좀의 안정성을 결정할 수 있다.
또한, 엑소좀을 분석하는 방법은 인큐베이션된 반응물에 용해 용액의 접촉, 비드 비팅(bead beating), 가열(boiling), 냉각 및 융해(freezing and thawing), 초음파 처리(ultrasonication) 및 액체 질소 중 갈기(grinding in liquid nitrogen)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 수행하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다.
일 구체예에서, 용해 용액의 접촉, 비드 비팅(bead beating), 가열(boiling), 냉각 및 융해(freezing and thawing), 초음파 처리(ultrasonication) 및 액체 질소 중 갈기(grinding in liquid nitrogen)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 수행함으로써 엑소좀이 용해될 수 있다.
상기 용해 용액은 엑소좀을 용해시키는 물질이 포함된 용액을 말하고, 일 구체예에서 엑소좀을 용해시키는 물질은 계면활성제, 포타슘 에틸 크산토겐산염(potassium ethyl xanthogenate, XS) 완충용액 또는 리소자임을 포함하는 용액일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 상기 계면활성제는 예를 들어 SDS, 트리톤(Triton) X-100 또는 세틸 트리메틸 암모늄 브로마이드(cetyl trimethyl ammonium bromide, CTAB)일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
일 구체예에서, 형광 신호의 값을 측정하는 것은 용해 용액의 접촉, 비드 비팅(bead beating), 가열(boiling), 냉각 및 융해(freezing and thawing), 초음파 처리(ultrasonication) 및 액체 질소 중 갈기(grinding in liquid nitrogen)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 수행하기 전과 후의 형광 신호 값을 측정하는 것일 수 있다.
일 구체예에서, 형광물질이 표지된 엑소좀을 인큐베이션 시키지 않은 고체 지지체를 대조군으로 하여, 용해 용액의 접촉, 비드 비팅(bead beating), 가열(boiling), 냉각 및 융해(freezing and thawing), 초음파 처리(ultrasonication) 및 액체 질소 중 갈기(grinding in liquid nitrogen)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 수행하기 전과 후의 형광 신호 값을 측정할 수 있다.
대조군의 상기 수행 전후의 형광 신호 값을 대조군의 형광 신호 값을 제거하여 형광 물질이 표지된 엑소좀과 고체 지지체의 결합에 의한 형광 신호 값을 결정할 수 있다.
또한, 엑소좀의 상태를 분석하는 것은 엑소좀의 용해 상태를 분석하는 것일 수 있다.
일 구체예에서, 측정된 형광 신호 값으로부터 엑소좀의 용해 효율을 결정하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있고, 일 구체예에서 엑소좀의 용해 효율은 하기 [식 I]에 따라 결정될 수 있다.
[식 I]
상기 결정된 엑소좀의 용해 효율로부터 엑소좀의 용해 방법을 결정하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있으며, 엑소좀의 용해 방법은 물리적, 화학적 또는 효소적 용해일 수 있다. 또한, 결정된 엑소좀의 용해 효율로부터 엑소좀의 용해 조건을 결정하는 단계를 추가적으로 결정할 수 있으며, 엑소좀의 용해 조건은 처리 농도, 처리 시간 또는 용출 부피일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
또한, 엑소좀을 분석하는 방법은 세척하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다.
상기 일 구체예에 의한 방법으로 고체 지지체에서 엑소좀의 상태를 측정에 소요되는 시간이 적고 편리하며 높은 민감도로 분석할 수 있고, 구체적으로 엑소좀의 캡쳐 또는 용해를 분석함으로써, 엑소좀의 캡쳐 또는 용해를 위한 최적 조건을 결정할 수 있다.
일 구체예에 따른 엑소좀을 분석하는 방법을 통하여, 엑소좀의 상태를 측정에 소요되는 시간이 적고 편리하며 높은 민감도로 분석할 수 있고, 구체적으로 엑소좀의 캡쳐 또는 용해를 분석함으로써, 엑소좀의 캡쳐 또는 용해를 위한 최적 조건을 스크리닝하는데 이용할 수 있다.
도 1은 EM과 DLS를 이용하여 엑소좀 용해를 확인하는 그림이다.
도 2는 (a)웨스턴 블로팅, (b)형광 물질이 표지된 엑소좀을 이용하여 고체 지지체의 엑소좀 캡쳐 효율을 결정하는 그림이다.
도 3은 세척 조건에서 고체 지지체에 캡쳐된 엑소좀 안정성을 보여주는 그림이다.
도 4는 형광 물질이 표지된 엑소좀을 이용하여 엑소좀의 용해 효율을 결정하는 개요를 나타내는 그림이다.
도 5는 용해 방법에 따른 엑소좀의 용해 효율(%)을 보여주는 그림이다.
도 6은 처리되는 화학물질(트리톤 X-100)에 따른 엑소좀의 용해 효율(%)을 보여주는 그림이다.
도 7은 용출 부피에 따른 엑소좀의 용해 효율(%)을 보여주는 그림이다.
용해 효율; ◆ - 0.25% 트리톤 X-100, ■ - 0.5% 트리톤 X-100,
상대적 농도; ▲ - 0.25% 트리톤 X-100, × - 0.5% 트리톤 X-100,
도 8은 처리 시간에 따른 엑소좀의 용해 효율(%)을 보여주는 그림이다.
도 2는 (a)웨스턴 블로팅, (b)형광 물질이 표지된 엑소좀을 이용하여 고체 지지체의 엑소좀 캡쳐 효율을 결정하는 그림이다.
도 3은 세척 조건에서 고체 지지체에 캡쳐된 엑소좀 안정성을 보여주는 그림이다.
도 4는 형광 물질이 표지된 엑소좀을 이용하여 엑소좀의 용해 효율을 결정하는 개요를 나타내는 그림이다.
도 5는 용해 방법에 따른 엑소좀의 용해 효율(%)을 보여주는 그림이다.
도 6은 처리되는 화학물질(트리톤 X-100)에 따른 엑소좀의 용해 효율(%)을 보여주는 그림이다.
도 7은 용출 부피에 따른 엑소좀의 용해 효율(%)을 보여주는 그림이다.
용해 효율; ◆ - 0.25% 트리톤 X-100, ■ - 0.5% 트리톤 X-100,
상대적 농도; ▲ - 0.25% 트리톤 X-100, × - 0.5% 트리톤 X-100,
도 8은 처리 시간에 따른 엑소좀의 용해 효율(%)을 보여주는 그림이다.
이하 하나 이상의 구체예를 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예
1.
엑소좀
및
비드의
준비
1-1.
GFP
-
표지된
엑소좀의
준비
pGL4.76(AY864931) 플라스미드를 주형으로 하고, 멀티 클로닝 사이트(MSC)에 CMV 프로모터를 가지고, CD63-GFP의 융합 단백질를 암호화하는 뉴클레오티드 핵산(서열번호 1 참조)을 삽입하여, CD63-GFP가 결합된 융합단백질을 포함한 엑소좀을 제조하기 위한 벡터를 제작하였다(서열번호 2 참조).
형질감염 하루 전에 세포를 150 mm 플레이트에 고르게 접종하여 배양하였다. 플라스미드 7.5㎍ DNA를 7.5㎖의 Opti-MEM 무혈청 배지(serum-free medium)(Invitrogen)에 희석시킨 후, 완전히 혼합하였다. 플러스 시약(Plus reagent)(Invitrogen)을 사용하기 전에 완전하게 섞어준 후, 희석된 DNA에 플러스 시약 75㎕를 추가한 후, 천천히 혼합한 후, 실온에서 5분 동안 인큐베이션하였다. Lipofectamine™ LTX를 사용하기 전에 부드럽게 섞어준 후, 상기에서 인큐베이션한 혼합액에 187.5㎕를 직접 추가한 후 완전히 섞어주었다. 그 후, 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였다.
형질감염을 시킬 MCF-7 세포(ATCC)를 포함한 접시에 상기에서 제조된 DNA-지질 복합체를 한 방울씩 천천히 떨어뜨렸다. 그리고, 플레이트를 천천히 흔들어 주면서 혼합하였다. 상기 DNA-지질 복합체와 세포가 혼합된 플레이트를 37℃, CO2 인큐베이터에서 12 내지 24시간 동안 인큐베이션시켰다. 그 후, 새로운 엑소좀이 없는 배지로 교환하였다. FBS(fetal bovine serum)를 가진 배양 배지를 엑소좀이 없는 FBS(exosome-free FBS)를 포함한 신선한 배지로 교체하여 주었다. CO2 인큐베이터에서 37℃에서 24 내지 48시간 세포를 배양하였고, 그 후 조건 배지(conditioned medium)를 수거하였다.
깨끗한 조건 배지를 50㎕ 원심분리기 튜브에 옮긴 후, 4℃ 300g에서 10분간 원심분리를 하였다. 상층액을 제거한 후, 나머지를 새로운 원심분리기 튜브에 옮겼다. 다시 4℃ 300g에서 10분간 원심분리를 하였다. 상층액을 제거한 후, 나머지를 새로운 원심분리기 튜브에 옮겼다. 다시 4℃ 2,000g에서 20분간 원심분리를 하였다. 상층액을 새로운 초고속 원심분리기가 가능한 폴리알로머(polyallomer) 튜브 또는 폴리카보네이트(polycarbonate) 병에 옮겼다. 다시 4℃ 10,000 g에서 30분간 원심분리를 하였다. 상층액을 새로운 초고속 원심분리기용 튜브에 옮겼다. 이것을 4℃ 110,000g에서 70분간 원심분리를 하였고, 상층액을 완전히 제거하였다. 펠렛을 1000㎕ PBS로 튜브 내에서 재현탁시켰다. 그리고, 튜브를 PBS로 채우고 나서 4 ℃ 100,000g에서 70분간 원심분리하였다. 가능한 완전하게 상층액을 제거하였다. 펠렛을 다시 PBS로 튜브 내에서 재현탁시키고 4℃ 100,000g에서 70분간 원심분리를 하였다. 가능한 한 완전히 상층액을 제거하였다. 펠렛을 재현탁시키기 위하여, 소량의 PBS 또는 TBS를 추가하고, 재현탁하였다. 100㎕로 분액하여 -80℃에 보관한 후 필요한 경우 녹여 사용하였다.
1-2.
시료로부터
엑소좀을
분리하기 위한
비드의
제작
100㎕의 Dynabeads M-270 Amine (Invitrogen)를 0.1M MES (2-morpholinoethanesulfonic acid), 0.5M NaCl이고 pH 6.0인 완충용액 200㎕로 2회 세척한 후, 100㎕의 완충용액에 재현탁하였다. 35% w/v 폴리아크릴산(Aldrich)을 1/10로 희석한 용액 48㎕와 236㎕의 완충 용액를 혼합한 다음, 비드에 가하고 잘 섞었다.
그 후, 54㎕의 75mg/ml(증류수 중) EDC(ethyl-3-dimethyl-aminopropyl carbodiimide) 용액, 210㎕의 15mg/ml(증류수 중) NHS(n-hydroxysuccinimide) 용액을 넣고 1시간 동안 회전시켰다. 이후 400㎕의 완충용액으로 2회 세척한 후 400㎕의 완충용액에 재현탁하였다.
준비된 비드 용액을 400㎕의 0.025M MES, pH 6.0 완충용액으로 2회 세척하였다. 비드에 54㎕의 75mg/ml(0.025M MES, pH 6.0 중) EDC 용액, 210㎕의 15mg/ml(0.025M MES, pH 6.0 중) NHS 용액과 236㎕의 완충용액을 가하고 잘 섞은 뒤 30분간 회전시켰다. 비드를 다시 400㎕의 완충 용액으로 2회 세척한 후 400㎕의 완충용액에 재현탁한 다음, 여기에 3㎕의 단백질 G 용액(10ug/㎕)을 가하고 1시간 동안 회전시켰다. 이후 39㎕의 술포베타인(Sulfobetaine; SB, 증류수 중 100ug/㎕)를 PEG(polyethylene glycol, Mw=5,000, 20ug/㎕) 300㎕ 씩 넣고, 1 내지 2시간 동안 회전시켰다. 그 다음, 400㎕의 1X PBS (0.02% tween)로 2회 세척하고, 400㎕의 1X PBS로 2회 세척하였다.
준비된 비드 용액을 400㎕의 0.1M 소듐 아세테이트, pH 5.0 완충용액으로 2회 세척하였다. 160㎕의 항-EpCAM(R&D systems)과 340㎕의 완충용액을 혼합한 후, 이 용액을 비드에 가하고 3시간 동안 회전시켰다. 이후 200㎕의 1X PBS (0.02% tween)로 2회 세척하고, 200㎕의 1X PBS로 2회 세척한 후 100㎕의 1X PBS에 재현탁하였다.
준비된 비드 용액을 400㎕의 0.1M 소듐 보레이트, pH 9.3 완충용액으로 2회 세척하였다. 400㎕의 20mM DMP(pH 9.3 완충용액 중)를 비드에 가하고 1시간 동안 회전시켰다. 이후 400㎕의 50mM 에탄올아민, 0.1M 소듐 보레이트, pH 8.0 완충용액으로 2회 세척한 후 다시 200㎕의 완충용액을 가하고 1시간 동안 회전시켰다. 그 다음, 200㎕의 1X PBS (0.02% tween)로 2회 세척하고, 200㎕의 1X PBS로 2회 세척한 후 100㎕의 1X PBS에 재현탁하였다.
1-3.
엑소좀의
분리
30㎕의 준비된 비드에 인간 혈청(serum)(Sigma)과 GFP-표지된 엑소좀(CD63-GFP 엑소좀)을 혼합한 용액 300㎕를 넣고 24시간 동안 30rpm으로 회전시킨다. 이때, 엑소좀만을 비드에 캡쳐시킨 비교 실험으로 흡착에 의해 증가된 형광 값을 제거하였다. 상층액을 제거하고 200㎕의 1X PBS로 3회 세척한 뒤 300㎕의 1X PBS에서 추가로 3시간 동안 회전시켰다. 상층액을 제거하고 200㎕의 1X PBS로 3회 세척한 뒤 비드를 자석을 이용하여 분리하였다.
실시예
2.
비드의
엑소좀
캡쳐 효율 측정
합성된 비드가 시료(혈청 등)에 존재하는 엑소좀을 얼마나 캡쳐(capture)할 수 있는지 여부를 평가하였다.
실시예 1-3에 기재된 바에 따라 비드에 엑소좀을 캡쳐시켰다. 그 후 항-EpCAM 항체로 웨스턴 블로팅을 수행하여 엑소좀 검출 한계를 측정하였다. 또는, 비드에 캡쳐된 GFP-표지된 엑소좀(CD63-GFP)에 100㎕의 GFP-분석 완충용액(Biovison)을 넣어준 후 용액의 형광을 측정함으로써 엑소좀 검출 한계를 측정하였다.
그 결과 웨스턴 블로팅에 의한 엑소좀 검출 한계는 50ng이나, CD63-GFP에 의한 엑소좀 검출 한계는 12.5ng으로 4배 더 우수함을 확인하였다(도 2 참조).
실시예
3. 세척 조건에서
엑소좀
안정성 분석
실시예 1-3에 기재된 바에 따라 비드에 GFP-표지된 엑소좀을 캡쳐시킨 후(490ng), 300㎕의 1X PBS로 0시간, 1시간, 2시간, 3시간 동안 세척하고, 세척 후 100㎕의 GFP-분석 완충용액(Biovison)을 넣어준 후 용액의 형광을 측정함으로써 엑소좀의 안정성을 확인하였다.
그 결과 3시간까지 엑소좀 안정성이 유지됨을 확인하였다(도 3 참조).
실시예
4.
엑소좀의
용해 및 용해 효율의 측정
준비된 GFP-표지된 엑소좀이 캡쳐된 비드에 20㎕의 0.5% 트리톤 X-100 용액(PBS 중 700mM NaCl)을 가한 다음, 실온에서 20분간 인큐베이션시켰다. 상층액을 제거하고 200㎕의 1X PBS로 3회 세척하였다.
각각의 분리된 비드 및 용해 처리를 하지 않은 비드에 100㎕의 GFP 분석 완충용액(BioVision)을 가하고 잘 섞은 다음, 10 분 동안 실온에서 반응시킨 후, 자석을 이용해 용액과 비드를 분리하였다. 용액의 형광 세기를 Beckman Couler DTX 800 장비를 이용하여 측정한 후, 하기 [식 I]로 용해 효율을 산출하였다(도 4 참조).
[식 I]
실시예
5.
엑소좀
용해 방법의 결정
엑소좀을 용해하는 방법 중 화학적인 방법과 물리적인 방법의 엑소좀 용해 효율을 비교하였다.
실시예 1-3에 기재된 바에 따라 비드에 GFP-표지된 엑소좀을 캡쳐시킨 후, ⅰ)화학적 용해 방법으로서, 300㎕의 용해 용액(Invitrogen)을 가하고 15초 동안 볼텍싱하여 엑소좀을 용해시키거나; 또는 ⅱ)물리적 용해 방법(bead beating)으로서, 준비된 비드를 사용해서 ExiSpin™(볼텍싱 및 원심분리)를 이용하여 30 사이클을 수행하였다. 각 실험은 3회 반복하였다.
실시예 4에 기재된 바에 따라 용해 효율을 산출하였다. 그 결과 화학적 방법에 의한 엑소좀 용해 효율은 98.76%이고, 물리적 방법에 의한 엑소좀 용해 효율은 73.22%로서, 화학적 방법의 효율이 약 25% 더 우수함을 확인하였다(도 5 참조).
실시예
6. 화학적
엑소좀
용해 방법에 있어서 용해 조건의 최적화
6-1.
트리톤
X-100 농도의 최적화
실시예 1-3에 기재된 바에 따라 비드에 GFP-표지된 엑소좀을 캡쳐시킨 후, 하기의 조건으로 엑소좀을 용해시켰다. 각 실험은 3회 반복하였다.
조건: 매질 - 증류수,
처리 시간 - 30분,
트리톤 X-100의 농도 - 0 내지 2%, 및
용출 부피 - 50㎕.
실시예 4에 기재된 바에 따라 엑소좀 용해 효율을 산출하였다. 그 결과 0.25% 트리톤 X-100에서 엑소좀 용해 효율이 포화됨을 확인하였다(도 6 참조).
6-2. 용출 부피의 최적화
실시예 1-3에 기재된 바에 따라 비드에 GFP-표지된 엑소좀을 캡쳐시킨 후, 하기의 조건으로 엑소좀을 용해시켰다. 각 실험은 3회 반복하였다.
조건: 매질 - 증류수,
처리 시간 - 30분,
트리톤 X-100의 농도 - 0 내지 0.5%, 및
용출 부피 - 10 내지 50㎕.
실시예 4에 기재된 바에 따라 엑소좀 용해 효율을 산출하였다. 그 결과 용출 부피를 10㎕까지 감소시켜도 용해 효율은 90% 이상을 유지하였고, 용출 부피당 용해 효율은 용출 부피가 10㎕일 때 가장 우수함을 확인하였다(도 7 참조).
6-3. 처리 시간의 최적화
실시예 1-3에 기재된 바에 따라 비드에 GFP-표지된 엑소좀을 캡쳐시킨 후, 하기의 조건으로 엑소좀을 용해시켰다. 각 실험은 3회 반복하였다.
조건: 매질 - 증류수,
처리 시간 - 0 내지 60분,
트리톤 X-100의 농도 - 0 내지 0.25%, 및
용출 부피 - 10㎕.
실시예 4에 기재된 바에 따라 엑소좀 용해 효율을 산출하였다. 그 결과 처리 시간 10분 이상에서 엑소좀 용해 효율이 90% 이상을 유지함을 확인하였다(도 8 참조).
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<130> PN096629
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<170> KopatentIn 2.0
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DNA sequence coding CD63-GFP
<400> 1
atggcggtgg aaggaggaat gaaatgtgtg aagttcttgc tctacgtcct cctgctggcc 60
ttttgcgcct gtgcagtggg actgattgcc gtgggtgtcg gggcacagct tgtcctgagt 120
cagaccataa tccagggggc tacccctggc tctctgttgc cagtggtcat catcgcagtg 180
ggtgtcttcc tcttcctggt ggcttttgtg ggctgctgcg gggcctgcaa ggagaactat 240
tgtcttatga tcacgtttgc catctttctg tctcttatca tgttggtgga ggtggccgca 300
gccattgctg gctatgtgtt tagagataag gtgatgtcag agtttaataa caacttccgg 360
cagcagatgg agaattaccc gaaaaacaac cacactgctt cgatcctgga caggatgcag 420
gcagatttta agtgctgtgg ggctgctaac tacacagatt gggagaaaat cccttccatg 480
tcgaagaacc gagtccccga ctcctgctgc attaatgtta ctgtgggctg tgggattaat 540
ttcaacgaga aggcgatcca taaggagggc tgtgtggaga agattggggg ctggctgagg 600
aaaaatgtgc tggtggtagc tgcagcagcc cttggaattg cttttgtcga ggttttggga 660
attgtctttg cctgctgcct cgtgaagagt atcagaagtg gctacgaggt gatgacgcgt 720
acgcggccgc tcgagatgga gagcgacgag agcggcctgc ccgccatgga gatcgagtgc 780
cgcatcaccg gcaccctgaa cggcgtggag ttcgagctgg tgggcggcgg agagggcacc 840
cccgagcagg gccgcatgac caacaagatg aagagcacca aaggcgccct gaccttcagc 900
ccctacctgc tgagccacgt gatgggctac ggcttctacc acttcggcac ctaccccagc 960
ggctacgaga accccttcct gcacgccatc aacaacggcg gctacaccaa cacccgcatc 1020
gagaagtacg aggacggcgg cgtgctgcac gtgagcttca gctaccgcta cgaggccggc 1080
cgcgtgatcg gcgacttcaa ggtgatgggc accggcttcc ccgaggacag cgtgatcttc 1140
accgacaaga tcatccgcag caacgccacc gtggagcacc tgcaccccat gggcgataac 1200
gatctggatg gcagcttcac ccgcaccttc agcctgcgcg acggcggcta ctacagctcc 1260
gtggtggaca gccacatgca cttcaagagc gccatccacc ccagcatcct gcagaacggg 1320
ggccccatgt tcgccttccg ccgcgtggag gaggatcaca gcaacaccga gctgggcatc 1380
gtggagtacc agcacgcctt caagaccccg gatgcagatg ccggtgaaga aagagtt 1437
<210> 2
<211> 5589
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pGL4.76_CMV_CD63-GFP sequence
<400> 2
ggcctaactg gccggtacct gagctcgcta gcctcgagga tatcaagatc tgccgccgcg 60
atcgccatgg cggtggaagg aggaatgaaa tgtgtgaagt tcttgctcta cgtcctcctg 120
ctggcctttt gcgcctgtgc agtgggactg attgccgtgg gtgtcggggc acagcttgtc 180
ctgagtcaga ccataatcca gggggctacc cctggctctc tgttgccagt ggtcatcatc 240
gcagtgggtg tcttcctctt cctggtggct tttgtgggct gctgcggggc ctgcaaggag 300
aactattgtc ttatgatcac gtttgccatc tttctgtctc ttatcatgtt ggtggaggtg 360
gccgcagcca ttgctggcta tgtgtttaga gataaggtga tgtcagagtt taataacaac 420
ttccggcagc agatggagaa ttacccgaaa aacaaccaca ctgcttcgat cctggacagg 480
atgcaggcag attttaagtg ctgtggggct gctaactaca cagattggga gaaaatccct 540
tccatgtcga agaaccgagt ccccgactcc tgctgcatta atgttactgt gggctgtggg 600
attaatttca acgagaaggc gatccataag gagggctgtg tggagaagat tgggggctgg 660
ctgaggaaaa atgtgctggt ggtagctgca gcagcccttg gaattgcttt tgtcgaggtt 720
ttgggaattg tctttgcctg ctgcctcgtg aagagtatca gaagtggcta cgaggtgatg 780
acgcgtacgc ggccgctcga gatggagagc gacgagagcg gcctgcccgc catggagatc 840
gagtgccgca tcaccggcac cctgaacggc gtggagttcg agctggtggg cggcggagag 900
ggcacccccg agcagggccg catgaccaac aagatgaaga gcaccaaagg cgccctgacc 960
ttcagcccct acctgctgag ccacgtgatg ggctacggct tctaccactt cggcacctac 1020
cccagcggct acgagaaccc cttcctgcac gccatcaaca acggcggcta caccaacacc 1080
cgcatcgaga agtacgagga cggcggcgtg ctgcacgtga gcttcagcta ccgctacgag 1140
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gataacgatc tggatggcag cttcacccgc accttcagcc tgcgcgacgg cggctactac 1320
agctccgtgg tggacagcca catgcacttc aagagcgcca tccaccccag catcctgcag 1380
aacgggggcc ccatgttcgc cttccgccgc gtggaggagg atcacagcaa caccgagctg 1440
ggcatcgtgg agtaccagca cgccttcaag accccggatg cagatgccgg tgaagaaaga 1500
gttttctaga gtcggggcgg ccggccgctt cgagcagaca tgataagata cattgatgag 1560
tttggacaaa ccacaactag aatgcagtga aaaaaatgct ttatttgtga aatttgtgat 1620
gctattgctt tatttgtaac cattataagc tgcaataaac aagttaacaa caacaattgc 1680
attcatttta tgtttcaggt tcagggggag gtgtgggagg ttttttaaag caagtaaaac 1740
ctctacaaat gtggtaaaat cgataaggat ccgtttgcgt attgggcgct cttccgctga 1800
tctgcgcagc accatggcct gaaataacct ctgaaagagg aacttggtta gctaccttct 1860
gaggcggaaa gaaccagctg tggaatgtgt gtcagttagg gtgtggaaag tccccaggct 1920
ccccagcagg cagaagtatg caaagcatgc atctcaatta gtcagcaacc aggtgtggaa 1980
agtccccagg ctccccagca ggcagaagta tgcaaagcat gcatctcaat tagtcagcaa 2040
ccatagtccc gcccctaact ccgcccatcc cgcccctaac tccgcccagt tccgcccatt 2100
ctccgcccca tggctgacta atttttttta tttatgcaga ggccgaggcc gcctctgcct 2160
ctgagctatt ccagaagtag tgaggaggct tttttggagg cctaggcttt tgcaaaaagc 2220
tcgattcttc tgacactagc gccaccatga agaagcccga actcaccgct accagcgttg 2280
aaaaatttct catcgagaag ttcgacagtg tgagcgacct gatgcagttg tcggagggcg 2340
aagagagccg agccttcagc ttcgatgtcg gcggacgcgg ctatgtactg cgggtgaata 2400
gctgcgctga tggcttctac aaagaccgct acgtgtaccg ccacttcgcc agcgctgcac 2460
tacccatccc cgaagtgttg gacatcggcg agttcagcga gagcctgaca tactgcatca 2520
gtagacgcgc ccaaggcgtt actctccaag acctccccga aacagagctg cctgctgtgt 2580
tacagcctgt cgccgaagct atggatgcta ttgccgccgc cgacctcagt caaaccagcg 2640
gcttcggccc attcgggccc caaggcatcg gccagtacac aacctggcgg gatttcattt 2700
gcgccattgc tgatccccat gtctaccact ggcagaccgt gatggacgac accgtgtccg 2760
ccagcgtagc tcaagccctg gacgaactga tgctgtgggc cgaagactgt cccgaggtgc 2820
gccacctcgt ccatgccgac ttcggcagca acaacgtcct gaccgacaac ggccgcatca 2880
ccgccgtaat cgactggtcc gaagctatgt tcggggacag tcagtacgag gtggccaaca 2940
tcttcttctg gcggccctgg ctggcttgca tggagcagca gactcgctac ttcgagcgcc 3000
ggcatcccga gctggccggc agccctcgtc tgcgagccta catgctgcgc atcggcctgg 3060
atcagctcta ccagagcctc gtggacggca acttcgacga tgctgcctgg gctcaaggcc 3120
gctgcgatgc catcgtccgc agcggggccg gcaccgtcgg tcgcacacaa atcgctcgcc 3180
ggagcgcagc cgtatggacc gacggctgcg tcgaggtgct ggccgacagc ggcaaccgcc 3240
ggcccagtac acgaccgcgc gctaaggagg taggtcgagt ttaaactcta gaaccggtca 3300
tggccgcaat aaaatatctt tattttcatt acatctgtgt gttggttttt tgtgtgttcg 3360
aactagatgc tgtcgaccga tgcccttgag agccttcaac ccagtcagct ccttccggtg 3420
ggcgcggggc atgactatcg tcgccgcact tatgactgtc ttctttatca tgcaactcgt 3480
aggacaggtg ccggcagcgc tcttccgctt cctcgctcac tgactcgctg cgctcggtcg 3540
ttcggctgcg gcgagcggta tcagctcact caaaggcggt aatacggtta tccacagaat 3600
caggggataa cgcaggaaag aacatgtgag caaaaggcca gcaaaaggcc aggaaccgta 3660
aaaaggccgc gttgctggcg tttttccata ggctccgccc ccctgacgag catcacaaaa 3720
atcgacgctc aagtcagagg tggcgaaacc cgacaggact ataaagatac caggcgtttc 3780
cccctggaag ctccctcgtg cgctctcctg ttccgaccct gccgcttacc ggatacctgt 3840
ccgcctttct cccttcggga agcgtggcgc tttctcatag ctcacgctgt aggtatctca 3900
gttcggtgta ggtcgttcgc tccaagctgg gctgtgtgca cgaacccccc gttcagcccg 3960
accgctgcgc cttatccggt aactatcgtc ttgagtccaa cccggtaaga cacgacttat 4020
cgccactggc agcagccact ggtaacagga ttagcagagc gaggtatgta ggcggtgcta 4080
cagagttctt gaagtggtgg cctaactacg gctacactag aagaacagta tttggtatct 4140
gcgctctgct gaagccagtt accttcggaa aaagagttgg tagctcttga tccggcaaac 4200
aaaccaccgc tggtagcggt ggtttttttg tttgcaagca gcagattacg cgcagaaaaa 4260
aaggatctca agaagatcct ttgatctttt ctacggggtc tgacgctcag tggaacgaaa 4320
actcacgtta agggattttg gtcatgagat tatcaaaaag gatcttcacc tagatccttt 4380
taaattaaaa atgaagtttt aaatcaatct aaagtatata tgagtaaact tggtctgaca 4440
gcggccgcaa atgctaaacc actgcagtgg ttaccagtgc ttgatcagtg aggcaccgat 4500
ctcagcgatc tgcctatttc gttcgtccat agtggcctga ctccccgtcg tgtagatcac 4560
tacgattcgt gagggcttac catcaggccc cagcgcagca atgatgccgc gagagccgcg 4620
ttcaccggcc cccgatttgt cagcaatgaa ccagccagca gggagggccg agcgaagaag 4680
tggtcctgct actttgtccg cctccatcca gtctatgagc tgctgtcgtg atgctagagt 4740
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cacatgatca cccatattat gaagaaatgc agtcagctcc ttagggcctc cgatcgttgt 4920
cagaagtaag ttggccgcgg tgttgtcgct catggtaatg gcagcactac acaattctct 4980
taccgtcatg ccatccgtaa gatgcttttc cgtgaccggc gagtactcaa ccaagtcgtt 5040
ttgtgagtag tgtatacggc gaccaagctg ctcttgcccg gcgtctatac gggacaacac 5100
cgcgccacat agcagtactt tgaaagtgct catcatcggg aatcgttctt cggggcggaa 5160
agactcaagg atcttgccgc tattgagatc cagttcgata tagcccactc ttgcacccag 5220
ttgatcttca gcatctttta ctttcaccag cgtttcgggg tgtgcaaaaa caggcaagca 5280
aaatgccgca aagaagggaa tgagtgcgac acgaaaatgt tggatgctca tactcgtcct 5340
ttttcaatat tattgaagca tttatcaggg ttactagtac gtctctcaag gataagtaag 5400
taatattaag gtacgggagg tattggacag gccgcaataa aatatcttta ttttcattac 5460
atctgtgtgt tggttttttg tgtgaatcga tagtactaac atacgctctc catcaaaaca 5520
aaacgaaaca aaacaaacta gcaaaatagg ctgtccccag tgcaagtgca ggtgccagaa 5580
catttctct 5589
Claims (23)
- 시료 중 형광 물질이 표지된 엑소좀을 고체 지지체와 인큐베이션하여 엑소좀을 고체 지지체에 결합시키는 단계;
인큐베이션된 반응물로부터 형광 신호의 값을 측정하는 단계; 및
측정된 형광 신호 값으로부터 엑소좀의 상태를 분석하는 단계를 포함하는 엑소좀을 분석하는 방법. - 청구항 1에 있어서, 형광 물질은 형광 단백질(fluorescent protein), 발광 단백질(photoprotein) 또는 루시퍼라제인 것인 엑소좀을 분석하는 방법.
- 청구항 2에 있어서, 형광 단백질은 녹색 형광 단백질(green fluorescent protein, GFP), 황색 형광 단백질(Yellow fluorescent protein, YFP), 또는 적색 형광 단백질(Red fluorescent protein, RFP)인 것인 엑소좀을 분석하는 방법.
- 청구항 1에 있어서, 형광 물질이 표지된 엑소좀은 막단백질 및 형광 물질이 결합된 융합 단백질을 포함하는 것인 엑소좀을 분석하는 방법.
- 청구항 4에 있어서, 막단백질은 엑소좀에 존재하는 것인 엑소좀을 분석하는 방법.
- 청구항 4에 있어서, 막단백질은 EpCAM, CD63 및 CD81로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 엑소좀을 분석하는 방법.
- 청구항 1에 있어서, 고체 지지체는 자성 비드 또는 폴리스티렌인 것인 엑소좀을 분석하는 방법.
- 청구항 1에 있어서, 고체 지지체는 엑소좀에 결합하는 물질을 포함하는 것인 엑소좀을 분석하는 방법.
- 청구항 8에 있어서, 엑소좀에 결합하는 물질은 항체인 것인 엑소좀을 분석하는 방법.
- 청구항 9에 있어서, 항체는 항-EpCAM인 것인 엑소좀을 분석하는 방법.
- 청구항 1에 있어서, 엑소좀의 상태를 분석하는 것은 고체 지지체와 엑소좀의 결합을 분석하는 것인 엑소좀을 분석하는 방법.
- 청구항 1에 있어서, 측정된 형광 신호 값으로부터 고체 지지체의 엑소좀 검출 한계를 결정하는 단계를 추가적으로 포함하는 것인 엑소좀을 분석하는 방법.
- 청구항 1에 있어서, 인큐베이션된 반응물을 세척하는 단계를 추가적으로 포함하는 것인 엑소좀을 분석하는 방법.
- 청구항 1에 있어서, 인큐베이션된 반응물에 용해 용액의 접촉, 비드 비팅(bead beating), 가열(boiling), 냉각 및 융해(freezing and thawing), 초음파 처리(ultrasonication) 및 액체 질소 중 갈기(grinding in liquid nitrogen)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 수행하는 단계를 추가적으로 포함하는 것인 엑소좀을 분석하는 방법.
- 청구항 14에 있어서, 용해 용액은 계면활성제, 포타슘 에틸 크산토겐산염(potassium ethyl xanthogenate, XS) 완충용액 또는 리소자임을 포함하는 용액인 것인 엑소좀을 분석하는 방법.
- 청구항 15에 있어서, 계면활성제는 SDS, 트리톤(Triton) X-100 또는 세틸 트리메틸 암모늄 브로마이드(cetyl trimethyl ammonium bromide, CTAB)인 것인 엑소좀을 분석하는 방법
- 청구항 14에 있어서, 형광 신호의 값을 측정하는 것은 용해 용액의 접촉, 비드 비팅(bead beating), 가열(boiling), 냉각 및 융해(freezing and thawing), 초음파 처리(ultrasonication) 및 액체 질소 중 갈기(grinding in liquid nitrogen)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 수행하기 전과 후의 형광 신호 값을 측정하는 것인 엑소좀을 분석하는 방법.
- 청구항 14에 있어서, 엑소좀의 상태를 분석하는 것은 엑소좀의 용해 상태를 분석하는 것인 엑소좀을 분석하는 방법.
- 청구항 17에 있어서, 측정된 형광 신호 값으로부터 엑소좀의 용해 효율을 결정하는 단계를 추가적으로 포함하는 것인 엑소좀을 분석하는 방법.
- 청구항 19에 있어서, 결정된 엑소좀의 용해 효율로부터 엑소좀의 용해 방법을 결정하는 단계를 추가적으로 포함하는 것인 엑소좀을 분석하는 방법.
- 청구항 20에 있어서, 엑소좀의 용해 방법은 물리적, 화학적 또는 효소적 용해인 것인 엑소좀을 분석하는 방법.
- 청구항 19에 있어서, 결정된 엑소좀의 용해 효율로부터 엑소좀의 용해 조건을 결정하는 단계를 추가적으로 결정하는 것인 엑소좀을 분석하는 방법.
- 청구항 22에 있어서, 엑소좀의 용해 조건은 처리 농도, 처리 시간 또는 용출 부피인 것인 엑소좀을 분석하는 방법
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