CN109136236B - 一种提高铅结合蛋白特异性的定向进化方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种提高铅结合蛋白特异性的定向进化方法，步骤为：(1)采用易错PCR技术扩增铅结合蛋白基因pbrR，连入含有双向筛选系统的筛选质粒；(2)转化宿主细胞E.coli DH5α，涂布筛选平板进行定向筛选；(3)对筛选得到的突变体蛋白M(PbrR‑C134R)进行初步评估。本发明应用定向进化技术以定向改造三维结构未知的铅结合蛋白，进一步减弱锌离子干扰提高铅结合蛋白的特异性。通过定向筛选和突变体蛋白初步评估，分析确定与铅结合蛋白特异性相关的氨基酸突变位点，为初步解析铅结合蛋白与金属离子结合特异性的关系奠定了基础。同时为定向改造同家族结构未知金属调控蛋白的特异性提供了新颖且简便的改造策略。

Description

一种提高铅结合蛋白特异性的定向进化方法

技术领域

本发明属于蛋白质工程领域，具体涉及一种提高铅结合蛋白特异性的定向进化方法。

背景技术

蛋白质定向进化技术是近些年发展应用的一种高效蛋白质改造策略，它通过模拟随机突变、重组和自然选择的自然进化机制来改造基因，定向选择获得有价值的蛋白质突变体。定向进化不同于自然进化，它由人为引发随机突变，仅仅作用于突变体进行人们所需要方向的进化选择。定向进化可帮助人们在短时间内得到需要特性的蛋白质分子，同时使人们进一步的了解蛋白质结构与功能间的关系，促进了蛋白质理论研究的发展。目前定向进化主要技术路线包括易错PCR等方法。

易错PCR(error-prone PCR)是最早应用的一种定向进化技术手段，由于其简单易懂有效仍作为实际应用中的主要方法之一，它的核心是随机改变编码蛋白的基因序列结合大量筛选获得正向进化的目的基因。易错PCR的基本原理为通过调整改变常规PCR的反应条件，使得扩增过程中发生一定程度的随机错配而引入突变，构建突变文库，再结合高效的筛选工具选出满足需要的目标突变体。易错PCR利用普通的Taq DNA聚合酶不具有3’→5’外切酶活力的性质，在扩增体系添加二价锰离子浓度和提高二价镁离子，人为提高碱基错配率从而在PCR过程中引入突变。由于易错PCR技术中的遗传变化只发生在单一的分子内部，属于无性突变，因而一般适用于长度小于800bp的小基因片段的改造，该类定向进化技术自提出以来为天然蛋白质的性能优化带来了新的生机。

源于耐金属贪铜菌Cupriavidus metallidurans CH34的铅结合蛋白PbrR结合重金属铅离子的功能已被挖掘，初步了解到半胱氨酸对于目标金属离子结合和转录激活发挥着重要作用。但具体的三维结构尚未得以解析，非目标金属离子锌离子的结合机制仍待阐述分析，难以通过理性设计来进行定向改造此蛋白。目前已有研究表明易错PCR技术改造金属结合蛋白大大提高了金属结合蛋白作为金属离子响应元件的灵敏度和特异性等性能，所以定向进化技术的发展同时为提高结构未知的铅结合蛋白PbrR的特异性提供了可能，进一步增强了金属调控蛋白在环境监测领域和环境生物修复领域的应用潜能。

发明内容

本发明所要解决的是克服天然铅结合蛋白结构未知时理性设计改造蛋白的不足,提供一种改进的提高铅结合蛋白特异性的定向进化方法。

本发明的技术方案概述如下：

本发明提出一种提高铅结合蛋白特异性的定向进化方法，包括如下步骤：

(1)采用易错PCR技术扩增铅结合蛋白基因pbrR，连入含有双向筛选系统的筛选质粒；

(2)转化宿主细胞E.coli DH5α，涂布筛选平板进行定向筛选；

(3)对筛选得到的突变体蛋白M(PbrR-C134R)进行初步评估。

所述步骤(1)中的铅结合蛋白基因pbrR的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，待连接筛选质粒区域的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

所述步骤(2)中涂布筛选平板定向筛选的方法为：转化后涂布铅离子-氨苄青霉素固体培养基；灭菌牙签挑取单菌落依次对应至铅离子-氨苄青霉素固体培养基和锌离子-蔗糖固体培养基，筛选获得两种固体培养基上均正常生长的菌落。使用的铅离子-氨苄青霉素固体培养基成分为10g/L蛋白胨、5g/L酵母粉、10g/L NaCl、15g/L琼脂、50μM铅离子和100μg/mL氨苄青霉素；锌离子-蔗糖固体培养基成分为10g/L蛋白胨、5g/L酵母粉、10g/L NaCl、15g/L琼脂、50μM锌离子和100g/L蔗糖。

所述步骤(3)中突变体蛋白M初步评估的方法包括铅锌离子筛选条件下的初步验证和不同金属离子筛选条件下的初步分析，编码蛋白M的基因序列如SEQ ID No.3所示。

具体说明如下：

步骤(1)包括易错PCR技术扩增基因pbrR、连入筛选质粒，具体步骤如下：

①易错PCR技术扩增基因pbrR：易错PCR扩增SEQ ID No.1核苷酸序列的铅结合蛋白基因pbrR，反应体系为5μL 10×EasyTaq Buffer，4μL 2.5mM dNTPs，4μL 10mM dCTP，4μL10mM dTTP，10μL 25mM MgCl₂，(0μL、0.4μL、0.8μL、1.2μL、1.6μL、2μL)5mM MnCl₂，1μLpUC57-G7-Kan，1μL EP2F，1μL EP2R，1μL EasyTaq DNA Polymerase，补水至50μL。Mn²⁺可以降低聚合酶对模板的特异性引入错配，设置Mn²⁺浓度梯度为0、0.2、0.4、0.6、0.8和1mM，提高Mg²⁺的终浓度至7mM以稳定非互补的碱基对。反应程序为94℃预变性3min；94℃变性5sec，55℃退火15sec，72℃延伸40sec，35个循环；72℃彻底延伸10min。观察电泳条带亮度选取合适反应条件，然后琼脂糖凝胶回收如SEQ ID No.1所示核苷酸序列的铅结合蛋白基因片段。

EP2F：CTTTCGTTTTATTTGATGCCCTAGTCGCTTGGATGGGCGG

EP2R：GACATCTCCCATCCGACGCCATGAATATCCAGATCGGCGAG

②连入筛选质粒：使用引物EPF和EPR高保真扩增如SEQ ID No.2所示核苷酸序列的待连接筛选质粒片段，同源重组方式连接两片段形成多种突变筛选质粒。

EPF：GGCGTCGGATGGGAGATGTC

EPR：GGCATCAAATAAAACGAAAGGC

步骤(2)包括转化宿主细胞E.coli DH5α，涂布筛选平板和定向筛选，具体方法为：

①转化宿主细胞E.coli DH5α：连接体系通过42℃热激45sec转化至感受态细胞E.coliDH5α，37℃、220rpm摇床培养复苏1h。

②涂布筛选平板：复苏后的细胞培养液直接涂布铅离子-氨苄青霉素固体培养基，37℃恒温培养过夜。

③定向筛选：灭菌牙签挑取过夜平板上的单菌落依次对应至铅离子-氨苄青霉素固体培养基和锌离子-蔗糖固体培养基，铅离子-氨苄青霉素固体培养基于37℃恒温培养过夜，锌离子-蔗糖固体培养基于30℃恒温培养过夜，筛选获得两种固体培养基上均正常生长的对应菌落，即为突变体蛋白M所含菌株。

步骤(3)包括突变体蛋白于铅锌离子筛选条件下的初步验证和不同金属离子筛选条件下的初步分析，具体操作如下：

①铅锌离子筛选条件下的初步验证：送往公司测序确定氨基酸突变位点PbrR-C134R，并接种细胞生长OD₆₀₀约为0.6的菌液分别至氨苄青霉素LB液体培养基和蔗糖LB液体培养基，均分别添加铅离子和锌离子至终浓度50μM，以包含野生型筛选质粒的菌株作为对照，置于相应温度的摇床培养，记录比较野生型和突变体蛋白所含菌株10h的OD₆₀₀测定值。

②不同金属离子筛选条件下的初步分析：接种细胞生长OD₆₀₀约为0.6的菌液分别至铅离子-氨苄青霉素LB液体培养基，同时分别进行锌离子、镉离子、铜离子条件下氨苄青霉素LB液体培养基的培养，以及未添加金属离子作为对照，记录比较野生型和突变体蛋白所含菌株10h的OD₆₀₀测定值。

本发明应用定向进化技术以定向改造三维结构未知的铅结合蛋白，进一步减弱锌离子干扰从而提高了铅结合蛋白的特异性。通过定向筛选和突变体蛋白初步评估，可分析确定与铅结合蛋白特异性相关的氨基酸突变位点，为初步解析铅结合蛋白与金属离子结合特异性的关系奠定了一定的研究基础。同时为定向改造同家族结构未知的金属调控蛋白的特异性提供了新颖且简便的改造策略。

附图说明

图1：铅锌离子筛选条件下的突变体蛋白性能验证；

图2：不同金属离子条件下的突变体蛋白性能评价。

具体实施方式

本发明中使用的SEQ ID No.1核苷酸序列的铅结合蛋白基因pbrR源于公司合成质粒pUC57-G7-kan，SEQ ID No.2核苷酸序列的待连接的筛选质粒片段源于含有双向筛选系统的筛选质粒。底盘细胞为E.coli DH5α购买自北京全式金生物技术有限公司。

LB液体培养基组成为：10g/L NaCl、10g/L蛋白胨和5g/L酵母粉。固体培养基则额外添加15g/L琼脂粉。

卡那霉素储存液：称量0.1g硫酸卡那霉素至10mL容量瓶中，加入蒸馏水定容，经0.22μm水系滤膜过滤除菌后分装至2mL离心管，贮存于-20℃冰箱备用，储存液浓度为10mg/mL，待LB液体培养基温度降低至50℃后添加，工作浓度50μg/mL。

氨苄青霉素储存液：称量1g硫酸卡那霉素至10mL容量瓶中，加入蒸馏水定容，经0.22μm水系滤膜过滤除菌后分装至2mL离心管，贮存于-20℃冰箱备用，储存液浓度为100mg/mL，待LB液体培养基温度降低至50℃后添加，工作浓度100μg/mL。

铅离子-氨苄青霉素固体培养基组成：10g/L蛋白胨、5g/L酵母粉、10g/L NaCl、15g/L琼脂、50μM铅离子和100μg/mL氨苄青霉素。

锌离子-蔗糖固体培养基组成：10g/L蛋白胨、5g/L酵母粉、10g/L NaCl、15g/L琼脂、50μM锌离子和100g/L蔗糖。

氨苄青霉素LB液体培养基：10g/L蛋白胨、5g/L酵母粉、10g/L NaCl、100μg/mL氨苄青霉素。

蔗糖LB液体培养基：10g/L NaCl、10g/L蛋白胨、5g/L酵母粉，蔗糖100g/L。

硝酸铅溶液：称量0.1656g硝酸铅，1％硝酸溶液溶解定容至100mL，配制浓度为5mmol/L。

硝酸锌溶液：称量0.1487g六水合硝酸锌，1％硝酸溶液溶解定容至100mL，配制浓度为5mmol/L。

氯化镉溶液：称量0.0942g氯化镉，加水溶解定容至100mL，配制浓度为5mmol/L。

氯化铜溶液：称量0.0672g氯化铜，加水溶解定容至100mL，配制浓度为5mmol/L。

下面根据本发明的方法，结合具体的实施例对本发明做进一步说明：

实施例1

一种提高铅结合蛋白特异性的定向进化方法，包括如下步骤：

(1)采用易错PCR技术扩增铅结合蛋白基因pbrR，连入含有双向筛选系统的筛选质粒；

(2)转化宿主细胞E.coli DH5α，涂布筛选平板进行定向筛选；

(3)对筛选得到的突变体蛋白M(PbrR-C134R)进行初步评估。

具体方法如下：

步骤(1)包括易错PCR技术扩增基因pbrR、连入筛选质粒，具体步骤如下：

①易错PCR技术扩增基因pbrR：易错PCR扩增SEQ ID No.1核苷酸序列的铅结合蛋白基因pbrR，反应体系为5μL 10×EasyTaq Buffer，4μL 2.5mM dNTPs，4μL 10mM dCTP，4μL10mM dTTP，10μL 25mM MgCl₂，0.8μL 5mM MnCl₂，1μL pUC57-G7-Kan，1μL EP2F，1μL EP2R，1μL EasyTaq DNA Polymerase，补水至50μL。Mn²⁺浓度为0.4mM，Mg²⁺终浓度至7mM。反应程序为94℃预变性3min；94℃变性5sec，55℃退火15sec，72℃延伸40sec，35个循环；72℃彻底延伸10min。琼脂糖凝胶回收如SEQ ID No.1所示核苷酸序列的铅结合蛋白基因片段，1％琼脂糖凝胶电泳切下目标条带；放入干净离心管后等体积加入PN溶液，50℃水浴溶解；溶解后的溶液转移至吸附柱中静置吸附1min，12000rpm离心1min后倒掉废液；向吸附柱中加入漂洗液600μL，静置2min，12000rpm离心1min后倒掉废液；再次12000rpm离心2min去除残余漂洗液，吸室温放置晾干；转移吸附柱至新离心管中，滴加双蒸水30μL至吸附膜中央50℃洗脱5min，12000rpm离心2min收集DNA片段。

EP2F：CTTTCGTTTTATTTGATGCCCTAGTCGCTTGGATGGGCGG

EP2R：GACATCTCCCATCCGACGCCATGAATATCCAGATCGGCGAG

②连入筛选质粒：使用引物EPF和EPR高保真扩增如SEQ ID No.2所示核苷酸序列的待连接筛选质粒片段，扩增结束的50μL反应体系加入1μL DMT enzyme，37℃反应60min去除模板质粒减少阳性干扰。同源重组方式连接回收纯化后的两片段形成多种突变筛选质粒。同源重组连接体系为4μL 5×CEⅡBuffer，2μL ExnaseⅡ，两片段各1μL，12μL ddH₂O。反应条件37℃连接30min，反应结束后温度降为4℃或迅速置于冰上冷却。

EPF：GGCGTCGGATGGGAGATGTC

EPR：GGCATCAAATAAAACGAAAGGC

步骤(2)包括转化宿主细胞E.coli DH5α，涂布筛选平板和定向筛选，具体方法为：

①转化宿主细胞E.coli DH5α：连接体系通过42℃热激45sec转化至感受态细胞E.coli DH5α，37℃、220rpm摇床培养复苏1h。

②涂布筛选平板：复苏后的细胞培养液直接涂布铅离子-氨苄青霉素固体培养基，37℃恒温培养过夜。

③定向筛选：灭菌牙签挑取过夜平板上的单菌落依次对应至铅离子-氨苄青霉素固体培养基和锌离子-蔗糖固体培养基，铅离子-氨苄青霉素固体培养基于37℃恒温培养过夜，锌离子-蔗糖固体培养基于30℃恒温培养过夜，筛选获得两种固体培养基上均正常生长的菌株，即为突变体蛋白M所含菌株。

步骤(3)包括突变体蛋白M的铅锌离子筛选条件下的初步验证和多金属离子筛选条件下的初步分析，具体操作如下：

①铅锌离子筛选条件下的初步验证：送往公司测序确定氨基酸突变位点PbrR-C134R，并挑取突变体蛋白M的单菌落接种至至卡那霉素50μg/mL的LB液体培养基中过夜培养，转接至LB液体培养基直至细胞生长至OD₆₀₀约为0.6，分别接种至氨苄青霉素LB液体培养基和蔗糖LB液体培养基，且分别添加铅离子和锌离子至终浓度50μM，以包含野生型蛋白WT的菌株作为对照，置于相应温度的摇床培养，记录比较野生型蛋白WT和突变体蛋白M所含菌株10h的OD₆₀₀测定值，见图1。

②不同金属离子筛选条件下的初步分析：挑取突变体蛋白M的单菌落接种至至卡那霉素50μg/mL的LB液体培养基中过夜培养，转接至LB液体培养基直至细胞生长至OD₆₀₀约为0.6，分别接种至铅离子-氨苄青霉素LB液体培养基，同时分别进行锌离子、镉离子、铜离子条件下氨苄青霉素LB液体培养基的培养，以及未添加金属离子作为对照，记录比较野生型蛋白WT和突变体蛋白M所含菌株10h的OD₆₀₀测定值，如图2所示。

图1为铅锌离子筛选条件下的突变体蛋白M所含菌株生长验证，可以看出突变体蛋白M所含菌株在锌离子-蔗糖LB液体培养基上快速生长细胞密度可达3.58，与野生型WT相比生长不受抑制，锌离子结合能力有所减弱；在铅离子氨苄青霉素LB液体培养基仍能生长，且生长值较野生型提高1.79倍，铅离子结合能力有所增强。图2为不同金属离子条件下的突变体蛋白M所含菌株生长评价，可以看出突变体蛋白M所含菌株还额外增强了镉离子结合能力，但结合弱于铅离子，由此发现了铅结合蛋白134位半胱氨酸的功能，同时，同源建模结果确定突变的氨基酸位点处于C端的金属结合环区，从而揭示了134位氨基酸的重要作用。

实施例2

一种提高铅结合蛋白特异性的定向进化方法，包括如下步骤：

(1)采用易错PCR技术扩增铅结合蛋白基因pbrR，连入含有双向筛选系统的筛选质粒；

(2)转化宿主细胞E.coli DH5α，涂布筛选平板进行定向筛选；

(3)对筛选得到的突变体蛋白M(PbrR-C134R)进行初步评估。

具体方法如下：

步骤(1)包括易错PCR技术扩增基因pbrR、连入筛选质粒，具体步骤如下：

①易错PCR技术扩增基因pbrR：易错PCR扩增SEQ ID No.1核苷酸序列的铅结合蛋白基因pbrR，反应体系为5μL 10×EasyTaq Buffer，4μL 2.5mM dNTPs，4μL 10mM dCTP，4μL10mM dTTP，10μL 25mM MgCl₂，1.2μL 5mM MnCl₂，1μL pUC57-G7-Kan，1μL EP2F，1μL EP2R，1μL EasyTaq DNA Polymerase，补水至50μL。Mn²⁺浓度为0.6mM，Mg²⁺终浓度至7mM。反应程序为94℃预变性3min；94℃变性5sec，55℃退火15sec，72℃延伸40sec，35个循环；72℃彻底延伸10min。琼脂糖凝胶回收如SEQ ID No.1所示核苷酸序列的铅结合蛋白基因片段，1％琼脂糖凝胶电泳切下目标条带；放入干净离心管后等体积加入PN溶液，50℃水浴溶解；溶解后的溶液转移至吸附柱中静置吸附1min，12000rpm离心1min后倒掉废液；向吸附柱中加入漂洗液600μL，静置2min，12000rpm离心1min后倒掉废液；再次12000rpm离心2min去除残余漂洗液，吸室温放置晾干；转移吸附柱至新离心管中，滴加双蒸水30μL至吸附膜中央50℃洗脱5min，12000rpm离心2min收集DNA片段。

EP2F：CTTTCGTTTTATTTGATGCCCTAGTCGCTTGGATGGGCGG

EP2R：GACATCTCCCATCCGACGCCATGAATATCCAGATCGGCGAG

②连入筛选质粒：使用引物EPF和EPR高保真扩增如SEQ ID No.2所示核苷酸序列的待连接筛选质粒片段，扩增结束的50μL反应体系加入1μL DMT enzyme，37℃反应60min去除模板质粒减少阳性干扰。同源重组方式连接回收纯化后的两片段形成多种突变筛选质粒。同源重组连接体系为4μL 5×CEⅡBuffer，2μL ExnaseⅡ，两片段各1μL，12μL ddH₂O。反应条件37℃连接30min，反应结束后温度降为4℃或迅速置于冰上冷却。

EPF：GGCGTCGGATGGGAGATGTC

EPR：GGCATCAAATAAAACGAAAGGC

步骤(2)包括转化宿主细胞E.coli DH5α，涂布筛选平板和定向筛选，具体方法为：

①转化宿主细胞E.coli DH5α：连接体系通过42℃热激45sec转化至感受态细胞E.coli DH5α，37℃、220rpm摇床培养复苏1h。

②涂布筛选平板：复苏后的细胞培养液直接涂布铅离子-氨苄青霉素固体培养基，37℃恒温培养过夜。

③定向筛选：灭菌牙签挑取过夜平板上的单菌落依次对应至铅离子-氨苄青霉素固体培养基和锌离子-蔗糖固体培养基，铅离子-氨苄青霉素固体培养基于37℃恒温培养过夜，锌离子-蔗糖固体培养基于30℃恒温培养过夜，筛选获得两种固体培养基上均正常生长的菌株，即为突变体蛋白M所含菌株。

步骤(3)包括突变体蛋白M的铅锌离子筛选条件下的初步验证和多金属离子筛选条件下的初步分析，具体操作如下：

①铅锌离子筛选条件下的初步验证：送往公司测序确定氨基酸突变位点PbrR-C134R，并挑取突变体蛋白M的单菌落接种至至卡那霉素50μg/mL的LB液体培养基中过夜培养，转接至LB液体培养基直至细胞生长至OD₆₀₀约为0.6，分别接种至氨苄青霉素LB液体培养基和蔗糖LB液体培养基，且分别添加铅离子和锌离子至终浓度50μM，以包含野生型蛋白WT的菌株作为对照，置于相应温度的摇床培养，记录比较野生型蛋白WT和突变体蛋白M所含菌株10h的OD₆₀₀测定值。

②不同金属离子筛选条件下的初步分析：挑取突变体蛋白M的单菌落接种至至卡那霉素50μg/mL的LB液体培养基中过夜培养，转接至LB液体培养基直至细胞生长至OD₆₀₀约为0.6，分别接种至铅离子-氨苄青霉素LB液体培养基，同时分别进行锌离子、镉离子、铜离子条件下氨苄青霉素LB液体培养基的培养，以及未添加金属离子作为对照，记录比较野生型蛋白WT和突变体蛋白M所含菌株10h的OD₆₀₀测定值。

所得结果与实施例1的结果大致保持一致，因此定向进化方法可作为一个有力的方法应用于铅结合蛋白特定的特异性增强，为进一步了解蛋白中重要氨基酸提供新的研究手段，更好的提高了天然金属调控蛋白在环境检测及环境修复领域中的应用价值。

序列表

SEQ ID No.1

CTAGTCGCTTGGATGGGCGGTGGTCCCCCGCGTATCACACACGCAGTCCGACAGTCCCTGCAGAATCCCGCACGATTGGGCGGGCCTGGCACCAGAACAGGCTTCGCGCAGTTCCACCAAATGGTGCTTCAGTTCGAGCAAAGCTCCGATCCGAGATTCGACCTGACGGATGTGCTCATCCAAGAGCATATTGACTTCACCGCAATCCTGGTCGGGCCGCTTCCGGTAACTCAATAAGGTCCGTACGTCGCTCAACGGCATATCCAGAGACCGGCAGTGACGAATGAACTGCAAGCGCTCCACGTGCTCCTCGCCATACAGGCGAAAATTCCCCCGGCTGCGGCCCGGCGGCGGCAACAGCCCTTCTTGTTCGTAGAAGCGAATGGTCACCACCGGGCATGCGGTGCGCTTGGCAAGCTCGCCGATCTGGATATTCAT

SEQ ID No.2

GGCGTCGGATGGGAGATGTCTTGACTCTATAGTAACTAGAGGGTGTTAAATCGGCAACGCGAGATGAATACACACAAGGGGTTGCCATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTaTTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACCGAAAGAGGAGAAATTAATGAACATCAAAAAGTTTGCAAAACAAGCAACAGTATTAACCTTTACTACCGCACTGCTGGCAGGAGGCGCAACTCAAGCGTTTGCGAAAGAAACGAACCAAAAGCCATATAAGGAAACATACGGCATTTCCCATATTACACGCCATGATATGCTGCAAATCCCTGAACAGCAAAAAAATGAAAAATATCAAGTTTCTGAATTTGATTCGTCCACAATTAAAAATATCTCTTCTGCAAAAGGCCTGGACGTTTGGGACAGCTGGCCATTACAAAACGCTGACGGCACTGTCGCAAACTATCACGGCTACCACATCGTCTTTGCATTAGCCGGAGATCCTAAAAATGCGGATGACACATCGATTTACATGTTCTATCAAAAAGTCGGCGAAACTTCTATTGACAGCTGGAAAAACGCTGGCCGCGTCTTTAAAGACAGCGACAAATTCGATGCAAATGATTCTATCCTAAAAGACCAAACACAAGAATGGTCAGGTTCAGCCACATTTACATCTGACGGAAAAATCCGTTTATTCTACACTGATTTCTCCGGTAAACATTACGGCAAACAAACACTGACAACTGCACAAGTTAACGTATCAGCATCAGACAGCTCTTTGAACATCAACGGTGTAGAGGATTATAAATCAATCTTTGACGGTGACGGAAAAACGTATCAAAATGTACAGCAGTTCATCGATGAAGGCAACTACAGCTCAGGCGACAACCATACGCTGAGAGATCCTCACTACGTAGAAGATAAAGGCCACAAATACTTAGTATTTGAAGCAAACACTGGAACTGAAGATGGCTACCAAGGCGAAGAATCTTTATTTAACAAAGCATACTATGGCAAAAGCACATCATTCTTCCGTCAAGAAAGTCAAAAACTTCTGCAAAGCGATAAAAAACGCACGGCTGAGTTAGCAAACGGCGCTCTCGGTATGATTGAGCTAAACGATGATTACACACTGAAAAAAGTGATGAAACCGCTGATTGCATCTAACACAGTAACAGATGAAATTGAACGCGCGAACGTCTTTAAAATGAACGGCAAATGGTACCTGTTCACTGACTCCCGCGGATCAAAAATGACGATTGACGGCATTACGTCTAACGATATTTACATGCTTGGTTATGTTTCTAATTCTTTAACTGGCCCATACAAGCCGCTGAACAAAACTGGCCTTGTGTTAAAAATGGATCTTGATCCTAACGATGTAACCTTTACTTACTCACACTTCGCTGTACCTCAAGCGAAAGGAAACAATGTCGTGATTACAAGCTATATGACAAACAGAGGATTCTACGCAGACAAACAATCAACGTTTGCGCCGAGCTTCCTGCTGAACATCAAAGGCAAGAAAACATCTGTTGTCAAAGACAGCATCCTTGAACAAGGACAATTAACAGTTAACAAATAAGGCATCAAATAAAACGAAAGGCTCAGTCGAAAGACTGGGCCTTTCGTTTTATCTGTTGTTTGTCGGTGAACGCTCTCCTGAGTAGGACAAATCCGCCGCCCTAGACCTAGGCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCAATGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGGACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGACTAGTGCTTGGATTCTCACCAATAAAAAACGCCCGGCGGCAACCGAGCGTTCTGAACAAATCCAGATGGAGTTCTGAGGTCATTACTGGATCTATCAACAGGAGTCCAAGCGAGCTCTCGAACCCCAGAGTCCCGCTCAGAAGAACTCGTCAAGAAGGCGATAGAAGGCGATGCGCTGCGAATCGGGAGCGGCGATACCGTAAAGCACGAGGAAGCGGTCAGCCCATTCGCCGCCAAGCTCTTCAGCAATATCACGGGTAGCCAACGCTATGTCCTGATAGCGGTCCGCCACACCCAGCCGGCCACAGTCGATGAATCCAGAAAAGCGGCCATTTTCCACCATGATATTCGGCAAGCAGGCATCGCCATGGGTCACGACGAGATCCTCGCCGTCGGGCATGCGCGCCTTGAGCCTGGCGAACAGTTCGGCTGGCGCGAGCCCCTGATGCTCTTCGTCCAGATCATCCTGATCGACAAGACCGGCTTCCATCCGAGTACGTGCTCGCTCGATGCGATGTTTCGCTTGGTGGTCGAATGGGCAGGTAGCCGGATCAAGCGTATGCAGCCGCCGCATTGCATCAGCCATGATGGATACTTTCTCGGCAGGAGCAAGGTGAGATGACAGGAGATCCTGCCCCGGCACTTCGCCCAATAGCAGCCAGTCCCTTCCCGCTTCAGTGACAACGTCGAGCACAGCTGCGCAAGGAACGCCCGTCGTGGCCAGCCACGATAGCCGCGCTGCCTCGTCCTGCAGTTCATTCAGGGCACCGGACAGGTCGGTCTTGACAAAAAGAACCGGGCGCCCCTGCGCTGACAGCCGGAACACGGCGGCATCAGAGCAGCCGATTGTCTGTTGTGCCCAGTCATAGCCGAATAGCCTCTCCACCCAAGCGGCCGGAGAACCTGCGTGCAATCCATCTTGTTCAATCATGCGAAACGATCCTCATCCTGTCTCTTGATCAGATCTTGATCCCCTGCGCCATCAGATCCTTGGCGGCAAGAAAGCCATCCAGTTTACTTTGCAGGGCTTCCCAACCTTACCAGAGGGCGCCCCAGCTGGCAATTCCGACGTC

SEQ ID No.3

CTAGTCGCTTGGATGGGCGGTGGTCCCCCGCGTATCACGCACGCAGTCCGACAGTCCCTGCAGAATCCCGCACGATTGGGCGGGCCTGGCACCAGAACAGGCTTCGCGCAGTTCCACCAAATGGTGCTTCAGTTCGAGCAAAGCTCCGATCCGAGATTCGACCTGACGGATGTGCTCATCCAAGAGCATATTGACTTCACCGCAATCCTGGTCGGGCCGCTTCCGGTAACTCAATAAGGTCCGTACGTCGCTCAACGGCATATCCAGAGACCGGCAGTGACGAATGAACTGCAAGCGCTCCACGTGCTCCTCGCCATACAGGCGAAAATTCCCCCGGCTGCGGCCCGGCGGCGGCAACAGCCCTTCTTGTTCGTAGAAGCGAATGGTCACCACCGGGCATGCGGTGCGCTTGGCAAGCTCGCCGATCTGGATATTCAT

序列表

<110> 天津大学

<120> 一种提高铅结合蛋白特异性的定向进化方法

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 438

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ctagtcgctt ggatgggcgg tggtcccccg cgtatcacac acgcagtccg acagtccctg 60

cagaatcccg cacgattggg cgggcctggc accagaacag gcttcgcgca gttccaccaa 120

atggtgcttc agttcgagca aagctccgat ccgagattcg acctgacgga tgtgctcatc 180

caagagcata ttgacttcac cgcaatcctg gtcgggccgc ttccggtaac tcaataaggt 240

ccgtacgtcg ctcaacggca tatccagaga ccggcagtga cgaatgaact gcaagcgctc 300

cacgtgctcc tcgccataca ggcgaaaatt cccccggctg cggcccggcg gcggcaacag 360

cccttcttgt tcgtagaagc gaatggtcac caccgggcat gcggtgcgct tggcaagctc 420

gccgatctgg atattcat 438

<210> 2

<211> 4380

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ggcgtcggat gggagatgtc ttgactctat agtaactaga gggtgttaaa tcggcaacgc 60

gagatgaata cacacaaggg gttgccatga gtattcaaca tttccgtgtc gcccttattc 120

ccttttttgc ggcattttgc cttcctgttt ttgctcaccc agaaacgctg gtgaaagtaa 180

aagatgctga agatcagttg ggtgcacgag tgggttacat cgaactggat ctcaacagcg 240

gtaagatcct tgagagtttt cgccccgaag aacgttttcc aatgatgagc acttttaaag 300

ttctgctatg tggcgcggta ttatcccgta ttgacgccgg gcaagagcaa ctcggtcgcc 360

gcatacacta ttctcagaat gacttggttg agtactcacc agtcacagaa aagcatctta 420

cggatggcat gacagtaaga gaattatgca gtgctgccat aaccatgagt gataacactg 480

cggccaactt acttctgaca acgatcggag gaccgaagga gctaaccgct tttttgcaca 540

acatggggga tcatgtaact cgccttgatc gttgggaacc ggagctgaat gaagccatac 600

caaacgacga gcgtgacacc acgatgcctg tagcaatggc aacaacgttg cgcaaactat 660

taactggcga actacttact ctagcttccc ggcaacaatt aatagactgg atggaggcgg 720

ataaagttgc aggaccactt ctgcgctcgg cccttccggc tggctggttt attgctgata 780

aatctggagc cggtgagcgt gggtctcgcg gtatcattgc agcactgggg ccagatggta 840

agccctcccg tatcgtagtt atctacacga cggggagtca ggcaactatg gatgaacgaa 900

atagacagat cgctgagata ggtgcctcac tgattaagca ttggtaaccg aaagaggaga 960

aattaatgaa catcaaaaag tttgcaaaac aagcaacagt attaaccttt actaccgcac 1020

tgctggcagg aggcgcaact caagcgtttg cgaaagaaac gaaccaaaag ccatataagg 1080

aaacatacgg catttcccat attacacgcc atgatatgct gcaaatccct gaacagcaaa 1140

aaaatgaaaa atatcaagtt tctgaatttg attcgtccac aattaaaaat atctcttctg 1200

caaaaggcct ggacgtttgg gacagctggc cattacaaaa cgctgacggc actgtcgcaa 1260

actatcacgg ctaccacatc gtctttgcat tagccggaga tcctaaaaat gcggatgaca 1320

catcgattta catgttctat caaaaagtcg gcgaaacttc tattgacagc tggaaaaacg 1380

ctggccgcgt ctttaaagac agcgacaaat tcgatgcaaa tgattctatc ctaaaagacc 1440

aaacacaaga atggtcaggt tcagccacat ttacatctga cggaaaaatc cgtttattct 1500

acactgattt ctccggtaaa cattacggca aacaaacact gacaactgca caagttaacg 1560

tatcagcatc agacagctct ttgaacatca acggtgtaga ggattataaa tcaatctttg 1620

acggtgacgg aaaaacgtat caaaatgtac agcagttcat cgatgaaggc aactacagct 1680

caggcgacaa ccatacgctg agagatcctc actacgtaga agataaaggc cacaaatact 1740

tagtatttga agcaaacact ggaactgaag atggctacca aggcgaagaa tctttattta 1800

acaaagcata ctatggcaaa agcacatcat tcttccgtca agaaagtcaa aaacttctgc 1860

aaagcgataa aaaacgcacg gctgagttag caaacggcgc tctcggtatg attgagctaa 1920

acgatgatta cacactgaaa aaagtgatga aaccgctgat tgcatctaac acagtaacag 1980

atgaaattga acgcgcgaac gtctttaaaa tgaacggcaa atggtacctg ttcactgact 2040

cccgcggatc aaaaatgacg attgacggca ttacgtctaa cgatatttac atgcttggtt 2100

atgtttctaa ttctttaact ggcccataca agccgctgaa caaaactggc cttgtgttaa 2160

aaatggatct tgatcctaac gatgtaacct ttacttactc acacttcgct gtacctcaag 2220

cgaaaggaaa caatgtcgtg attacaagct atatgacaaa cagaggattc tacgcagaca 2280

aacaatcaac gtttgcgccg agcttcctgc tgaacatcaa aggcaagaaa acatctgttg 2340

tcaaagacag catccttgaa caaggacaat taacagttaa caaataaggc atcaaataaa 2400

acgaaaggct cagtcgaaag actgggcctt tcgttttatc tgttgtttgt cggtgaacgc 2460

tctcctgagt aggacaaatc cgccgcccta gacctaggcg ttcggctgcg gcgagcggta 2520

tcagctcact caaaggcggt aatacggtta tccacagaat caggggataa cgcaggaaag 2580

aacatgtgag caaaaggcca gcaaaaggcc aggaaccgta aaaaggccgc gttgctggcg 2640

tttttccata ggctccgccc ccctgacgag catcacaaaa atcgacgctc aagtcagagg 2700

tggcgaaacc cgacaggact ataaagatac caggcgtttc cccctggaag ctccctcgtg 2760

cgctctcctg ttccgaccct gccgcttacc ggatacctgt ccgcctttct cccttcggga 2820

agcgtggcgc tttctcaatg ctcacgctgt aggtatctca gttcggtgta ggtcgttcgc 2880

tccaagctgg gctgtgtgca cgaacccccc gttcagcccg accgctgcgc cttatccggt 2940

aactatcgtc ttgagtccaa cccggtaaga cacgacttat cgccactggc agcagccact 3000

ggtaacagga ttagcagagc gaggtatgta ggcggtgcta cagagttctt gaagtggtgg 3060

cctaactacg gctacactag aaggacagta tttggtatct gcgctctgct gaagccagtt 3120

accttcggaa aaagagttgg tagctcttga tccggcaaac aaaccaccgc tggtagcggt 3180

ggtttttttg tttgcaagca gcagattacg cgcagaaaaa aaggatctca agaagatcct 3240

ttgatctttt ctacggggtc tgacgctcag tggaacgaaa actcacgtta agggattttg 3300

gtcatgacta gtgcttggat tctcaccaat aaaaaacgcc cggcggcaac cgagcgttct 3360

gaacaaatcc agatggagtt ctgaggtcat tactggatct atcaacagga gtccaagcga 3420

gctctcgaac cccagagtcc cgctcagaag aactcgtcaa gaaggcgata gaaggcgatg 3480

cgctgcgaat cgggagcggc gataccgtaa agcacgagga agcggtcagc ccattcgccg 3540

ccaagctctt cagcaatatc acgggtagcc aacgctatgt cctgatagcg gtccgccaca 3600

cccagccggc cacagtcgat gaatccagaa aagcggccat tttccaccat gatattcggc 3660

aagcaggcat cgccatgggt cacgacgaga tcctcgccgt cgggcatgcg cgccttgagc 3720

ctggcgaaca gttcggctgg cgcgagcccc tgatgctctt cgtccagatc atcctgatcg 3780

acaagaccgg cttccatccg agtacgtgct cgctcgatgc gatgtttcgc ttggtggtcg 3840

aatgggcagg tagccggatc aagcgtatgc agccgccgca ttgcatcagc catgatggat 3900

actttctcgg caggagcaag gtgagatgac aggagatcct gccccggcac ttcgcccaat 3960

agcagccagt cccttcccgc ttcagtgaca acgtcgagca cagctgcgca aggaacgccc 4020

gtcgtggcca gccacgatag ccgcgctgcc tcgtcctgca gttcattcag ggcaccggac 4080

aggtcggtct tgacaaaaag aaccgggcgc ccctgcgctg acagccggaa cacggcggca 4140

tcagagcagc cgattgtctg ttgtgcccag tcatagccga atagcctctc cacccaagcg 4200

gccggagaac ctgcgtgcaa tccatcttgt tcaatcatgc gaaacgatcc tcatcctgtc 4260

tcttgatcag atcttgatcc cctgcgccat cagatccttg gcggcaagaa agccatccag 4320

tttactttgc agggcttccc aaccttacca gagggcgccc cagctggcaa ttccgacgtc 4380

<210> 3

<211> 438

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ctagtcgctt ggatgggcgg tggtcccccg cgtatcacgc acgcagtccg acagtccctg 60

cagaatcccg cacgattggg cgggcctggc accagaacag gcttcgcgca gttccaccaa 120

atggtgcttc agttcgagca aagctccgat ccgagattcg acctgacgga tgtgctcatc 180

caagagcata ttgacttcac cgcaatcctg gtcgggccgc ttccggtaac tcaataaggt 240

ccgtacgtcg ctcaacggca tatccagaga ccggcagtga cgaatgaact gcaagcgctc 300

cacgtgctcc tcgccataca ggcgaaaatt cccccggctg cggcccggcg gcggcaacag 360

cccttcttgt tcgtagaagc gaatggtcac caccgggcat gcggtgcgct tggcaagctc 420

gccgatctgg atattcat 438

Claims (4)

1.一种提高铅结合蛋白特异性的定向进化方法，其特征是步骤如下：

(1)采用易错PCR技术扩增铅结合蛋白基因pbrR，连入含有双向筛选系统的筛选质粒；

(2)转化宿主细胞E.coli DH5α，涂布筛选平板进行定向筛选；

铅结合蛋白基因pbrR的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，待连接筛选质粒区域的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

2.如权利要求1所述的方法，其特征是步骤(2)中涂布筛选平板定向筛选的方法为：转化后涂布铅离子-氨苄青霉素固体培养基；灭菌牙签挑取单菌落依次对应至铅离子-氨苄青霉素固体培养基和锌离子-蔗糖固体培养基，筛选获得两种固体培养基上均正常生长的菌落。

3.如权利要求2所述的方法，其特征是铅离子-氨苄青霉素固体培养基成分为10g/L蛋白胨、5g/L酵母粉、10g/L NaCl、15g/L琼脂、50μM铅离子和100μg/mL氨苄青霉素；锌离子-蔗糖固体培养基成分为10g/L蛋白胨、5g/L酵母粉、10g/L NaCl、15g/L琼脂、50μM锌离子和100g/L蔗糖。

4.一种权利要求1所述的方法筛选得到的突变体蛋白，其特征是，编码蛋白的基因序列如SEQ ID No.3所示。

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