KR101927892B1 - 파이토엔 고생산능을 갖는 변이 균주의 제조방법 및 상기 방법으로 제조된 변이 균주 - Google Patents

파이토엔 고생산능을 갖는 변이 균주의 제조방법 및 상기 방법으로 제조된 변이 균주 Download PDF

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Abstract

본 발명을 파이토엔 고생산능을 갖는 변이 균주의 제조방법 및 상기 방법으로 제조된 변이 균주에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명의 방법으로 제조된 파이토엔 고생산능을 갖는 데이노코쿠스 라디오두란스 변이 균주는 대사공학적 방법을 도입하여 제조되었음에도 인위적으로 도입된 항생제 내성 유전자를 갖지 않고, 파이토엔을 생산능이 우수함으로써, 상기 방법으로 제조된 변이 균주는 파이토엔의 대량생산에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

파이토엔 고생산능을 갖는 변이 균주의 제조방법 및 상기 방법으로 제조된 변이 균주{MANUFACTURING METHOD OF MUTANT STRAIN HAVING INCREASED PHYTOENE PRODUCTIVITY AND MUTANT STRAIN MANUFACTURED SAME}
본 발명을 파이토엔 고생산능을 갖는 변이 균주의 제조방법 및 상기 방법으로 제조된 변이 균주에 관한 것이다.
미생물 대사공학은 미생물 등의 유전체를 개량하여 원하는 목적에 맞게 활용하는 기술이다. 유용 대사산물은 미생물의 유전정보와 대사회로로부터 얻을 수 있으며, 미생물 유전자의 조작을 통해서 더 유용한 대사물질이나 그 특성을 개선시킬 수 있는 기술들이 개발되고 있다. 특히, 대사공학분야에서 Flp/FRT 및 cre/lox와 같은 위치-특이적 재조합 기술은 식물, 효모, 미생물과 같은 다양한 생명체 모델에 적용되고 있다.
한편, 데이노코쿠스 라디오두란스는 생물체의 DNA 또는 단백질에 직접 손상을 입할 수 있는 이온화 방사선에 대해 내성을 갖는 것으로 알려져 있다. 상기 균주는 이온화 방사선에 의한 DNA 손상을 빠른 시간 내에 복구할 수 있고, 효소적 또는 비효소적 시스템에 의하여 세포 내에 생성된 활성산소종(ROS)를 효과적으로 제거할 수 있는 능력을 지니고 있다. 이와 같은 특성 때문에 데이노코쿠스 라디오두란스는 방사성 폐기물의 정화에 사용되고 있다. 또한, 의약, 보건, 생명공학 등의 다양한 분야에서 데이노코쿠스 라디오두란스를 적용한 기술의 사례가 증가할 것으로 전망된다.
현재까지 보고된 바에 의하면, 데이노코쿠스 라디오두란스의 대사공학적 제어를 위해, 다른 미생물의 유전자를 세포 내로 도입시키거나, 상동적 재조합 방법을 이용한 돌연변이 균주의 제작 기술이 고안되었다. 그러나, 이러한 돌연변이 제작 기술은 반복적인 유전자 클로닝 과정으로 인해 많은 시간이 소요될뿐만 아니라, 돌연변이 균주를 선별하기 위한 항생제 마커의 제한성으로 다중 돌연변이 균주를 제작하는데 어려움이 있다.
한편, 카로티노이드는 항산화 활성을 가지고 있는 C-40 이소프레노이드 화합물로서, 자연계에 널리 분포되어 있는 한 군의 색소의 총칭이다. 현재까지 알려진 카로티노이드는 6백여 종에 이르며, 이들은 각각 다른 형태로 존재한다. 최근 카로티노이드의 생합성에 관여하는 효소들을 코딩하는 유전자들이 연구되어 왔다. 그 결과, 많은 카로티노이드 생합성과 연관된 효소를 암호화하는 유전자 및 cDNA가 박테리아, 조류, 균주와 담배, 토마토, 고추와 같은 고등식물에서 특성이 발견되었다. 이와 같은 카로티노이드의 중요성 때문에 고등식물에서 카로티노이드 생합성에 관련된 효소를 암호화하는 유전자에 대한 연구가 주목받고 있다. 카로티노이드의 하나인 파이토엔(phytoene)은 피부 미백에 효과적인 성분으로 알려져 있어, 자외선 흡수제, 산화 방지제 및 소염제 등으로 사용된다.
이와 관련하여, 대한민국 등록특허 제10-0813284호는 아그로박테리움-형질전환 방법으로 형질전환된 유채 식물체에서 감귤의 파이토엔 생합성효소(PSY) 유전자를 연속적으로 발현시키면 카로티노이드 성분의 생성이 증가함을 개시하고 있다.
이에, 본 발명자들은 대사공학적 방법을 도입하여 파이토엔을 고생산할 수 있는 데이노코커스 속 균주를 제조하기 위해 노력하던 중, cre-lox 시스템을 변형시켜 DR0861 유전자가 결실된 데이노코커스 라디오두란스의 변이 균주, DR0861 유전자가 결실되고 DR0862, DR1087, DR1395 또는 DR1475 유전자가 과발현된 데이노코커스 라디오두란스의 변이 균주, 및 DR0861 및 DR2250 유전자가 결실되고 DR0862 및 DR1475 유전자가 과발현된 데이노코커스 라디오두란스의 변이 균주를 제조하고, 상기 변이 균주가 우수한 파이토엔 생성능이 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
대한민국 등록특허 제10-0813284호
본 발명의 목적은 cre-lox 시스템을 이용하여 DR0861 유전자가 결실된 데이노코쿠스 속 변이 균주를 제조하는 방법 및 상기 방법으로 제조된 변이 균주를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 변이 균주를 이용하여 파이토엔을 생산하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 제1 선택마커를 포함하는 lox 핵산 단편의 양 말단에 DR0861 유전자의 상부 및 하부 단편이 각각 융합된 DNA 구조체를 데이노코쿠스 속 균주에 도입하여 DR0861 유전자를 결실시키는 단계; 상기 DR0861 유전자가 결실된 균주에 groE 프로모터, cre 재조합 효소를 코딩하는 유전자, 제2 선택마커 및 온도 감수성 repUts를 포함하는 벡터를 도입하여 제1 선택마커를 결실시키는 단계; 및 상기 수득된 변이 균주를 배양하여 제2 선택마커를 포함하는 벡터를 제거하는 단계를 포함하는, cre-lox 시스템을 이용한 DR0861 유전자가 결실된 데이노코쿠스 속 변이 균주의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 방법으로 제조된 DR0861 유전자가 결실된 파이토엔 생산능을 갖는 데이노코쿠스 속 변이 균주를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 변이 균주를 배양하는 단계를 포함하는 파이토엔 생산 방법을 제공한다.
본 발명의 방법으로 제조된 파이토엔 고생산능을 갖는 데이노코쿠스 라디오두란스 변이 균주는 대사공학적 방법을 도입하여 제조되었음에도 인위적으로 도입된 항생제 내성 유전자를 갖지 않고, 파이토엔을 생산능이 우수함으로써, 상기 방법으로 제조된 변이 균주는 파이토엔의 대량생산에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1a는 pAM1 플라스미드의 제조 과정을 도식화한 그림이다.
도 1b는 pAM2 플라스미드의 제조 과정을 도식화한 그림이다.
도 2는 제조된 pAM1 플라스미드의 구조를 도식화한 그림이다.
도 3은 제조된 pAM2 플라스미드의 구조를 도식화한 그림이다.
도 4는 데이노코쿠스 라디오두란스 균주의 유전체에서 DR0861 유전자를 결실시키는 과정을 도식화한 그림이다.
도 5는 cre 유전자의 발현을 조절하는 플라스미드에 따른 cre 재조합 효소의 발현량을 확인한 결과이다.
도 6은 항생제 내성 유전자가 모두 제거되고, DR0861 유전자가 결실된 데이노코쿠스 라디오두란스 변이 균주를 선별한 결과 사진이다.
도 7a는 본 발명의 방법에 따라 제조된 DR0861 유전자가 결실된 데이노코쿠스 라디오두란스 변이 균주의 파이토엔 생성능을 HPLC로 확인한 그래프이다.
도 7b는 본 발명의 방법에 따라 제조된 DR0861 유전자가 결실된 데이토코쿠스 라디오두란스 변이 균주의 파이토엔 생성량을 야생형 균주와 비교하여 나타낸 그래프이다.
도 8은 본 발명의 방법에 따라 제조된 DR0861 유전자가 결실된 데이노코쿠스 라디오두란스 변이 균주의 파이토엔 생성능을 TLC로 확인한 그래프이다(STD: 표준품의 파이토엔; DC: 야생형의 데이노코쿠스 라디오두란스; ΔDR0861: DR0861 유전자가 결실된 데이노코쿠스 라디오두란스 변이 균주; ΔDR0862: DR0862 유전자가 결실된 데이노코쿠스 라디오두란스 변이 균주).
도 9는 DR0862 유전자를 발현하는 플라스미드의 구조를 도식화한 그림이다.
도 10은 DR0862 및 DR1475 유전자를 동시에 발현하는 플라스미드의 구조를 도식화한 그림이다.
도 11은 표준품의 15-cis-파이토엔을 이용하여 작성된 검량선 그래프이다.
도 12는 표준품의 15-cis-파이토엔을 이용하여 수행된 HPLC 결과 크로마토그램이다.
도 13은 실시예 6 내지 13에서 제조된 변이 균주의 파이토엔 생성량을 HPLC로 확인하여 정량화한 그래프이다(None: 실시예 6; dr0862+: 실시예 7; dr1087+: 실시예 8; dr1395+: 실시예 9; dr1475+ 실시예 10; dr0862+, dr1087+: 실시예 11; dr0862+, dr1395+: 실시예 12; dr0862+, dr1475+: 실시예 13).
도 14는 실시예 13에서 제조된 변이 균주의 파이토엔 생성량을 시간별로 확인한 결과 그래프이다.
도 15는 실시예 6, 13, 14 및 비교예 3에서 제조된 변이 균주의 파이토엔 생성량을 HPLC로 확인하여 정량화한 그래프이다(Δdr0861: 실시예 6; Δdr0861, Δdr2250: 비교예 3; Δdr0861, dr0862+, dr1475+: 실시예 13; Δdr0861, Δdr2250, dr0862+, dr1475+: 실시예 14).
도 16은 실시예 14에서 제조된 변이 균주의 파이토엔 생성량을 시간별로 확인한 결과 그래프이다.
도 17은 실시예 14에서 제조된 변이 균주의 파이토엔 생성량을 균주의 성장곡선 및 배양 배지에 포함되는 탄소원의 소모비와 비교 분석한 결과 그래프이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 제1 선택마커를 포함하는 lox 핵산 단편의 양 말단에 DR0861 유전자의 상부 및 하부 단편이 각각 융합된 DNA 구조체를 데이노코쿠스 속 균주에 도입하여 DR0861 유전자를 결실시키는 단계; 상기 DR0861 유전자가 결실된 균주에 groE 프로모터, cre 재조합 효소를 코딩하는 유전자, 제2 선택마커 및 온도 감수성 repUts를 포함하는 DNA 벡터를 도입하여 제1 선택마커를 결실시키는 단계; 및 상기 수득된 변이 균주를 배양하여 제2 선택마커를 포함하는 벡터를 제거하는 단계를 포함하는, cre-lox 시스템을 이용한 DR0861 유전자가 결실된 데이노코쿠스 속 변이 균주의 제조방법을 제공한다.
본 명세서에서 사용된 용어, "cre-lox 시스템"은 DNA의 특정 부위에서 결실, 삽입, 전좌 및 역위를 수행하는데 사용되는 위치특이적 재조합 효소기술을 의미한다. 상기 cre-lox 시스템은 진핵 및 원핵 생물의 유전자로부터 돌연변이를 유발시키는데 사용가능하다. 이는 단일 효소인 cre 재조합 효소로 구성되어 있고, 짧은 표적 서열인 lox 서열을 재조합한다. 돌연변이를 유발시키고자 하는 위치에 lox 서열을 적절히 배치함으로써, 표적 유전자가 활성화 또는 억제되거나, 다른 유전자와 치환될 수도 있다. 일반적으로 lox P는 34개의 염기로 구성된 박테리오파지 P1 부위로 비대칭인 8 bp의 염기 서열을 포함하고, 중앙에 2개의 염기를 제외하고는, 13 bp 크기인 2쌍의 회문구조(palimdromic)를 갖는다(ATAACTTCGTATA-NNNTANNN-TATACGAAGTTAT).
본 명세서에서 사용된 용어, "선택 마커"는 특정 유전자의 산물을 의미한다. 상기 산물을 포함하는 미생물은 이를 포함하지 않는 미생물에는 나타나지 않는 특별한 형질을 가짐으로써, 이에 의해 미생물의 구별을 가능하게 한다. 상기 선택 마커는 항생제 내성 유전자일 수 있다. 상기 항생제 내성 유전자는 카나마이신, 클로람페니콜, 스펙티노마이신 및 스트렙토마이신으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상, 구체적으로, 카나마이신 및 클로람페니콜로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
상기 데이노코쿠스 속 균주는 데이노코쿠스 라디오두란스(D. radiodurans), 데이노코쿠스 인디쿠스(D. indicus), 데이노코쿠스 카에니(D. caeni), 데이노코쿠스 아쿠아티쿠스(D. aquaticus), 데이노코쿠스 디폴리머란스(D. depolymerans), 데이노코쿠스 그란디스(D. grandis), 데이노코쿠스 데죠네시스(D. daejeonensis), 데이노코쿠스 라디오톨러란스(D. radiotolerans), 데이노코쿠스 지오써말리스(D. geothermalis), 데이노코쿠스 루버(D. ruber), 데이노코쿠스 안타티커스(D. antarcticus), 데이노코쿠스 프로테오리티쿠스(D. proteolyticus), 데이노코쿠스 라디오푸그난스(D. radiopugnans), 데이노코쿠스 라디오필러스(D. radiophilus), 데이노코쿠스 셀룰로실리티쿠스(D. cellulosilyticus) 및 데이노코쿠스 스웬시스(D. swuensis)로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상, 구체적으로는 데이노코쿠스 라디오두란스일 수 있다.
본 발명은 제1 선택마커를 포함하는 lox 핵산 단편의 양 말단에 DR0861 유전자의 상부 및 하부 단편이 각각 융합된 DNA 구조체를 데이노코쿠스 속 균주에 도입하여 DR0861 유전자를 결실시키는 단계를 제공한다.
본 명세서에서 사용된 용어, "DR0861" 유전자는 파이토엔의 C11 및 C11' 위치에 이중 결합을 도입하여 파이토엔을 제타-카로텐(ξ-carotene)으로 전환하는 역할을 하는, 파이토엔 탈수소효소(dehydrogenase)를 암호화하는 유전자이다. 상기 파이토엔 탈수소효소는 파이토엔 불포화효소로도 불린다. 상기 DR0861 유전자는 통상의 기술분야에 알려진 어떠한 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 구체적으로, 상기 DR0861 유전자는 서열번호 22의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드일 수 있다.
상기 DR0861 유전자의 상부 및 하부 단편은 전장의 DR0861 유전자 서열에서 5' 또는 3' 말단으로부터 0.5 내지 1.2 kb, 구체적으로 0.6 내지 1.1 kb, 더욱 구체적으로 0.7 내지 1.0 kb의 길이를 포함할 수 있다. 상기 단편은 데이노코쿠스 속 균주의 유전체에 존재하는 DR0861 유전자와의 상동재조합을 위해 포함될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "lox 핵산 단편"은 cre-lox 시스템을 이용하여 데이노코쿠스 라디오두란스 균주의 유전체로부터 원하는 유전자를 제거하기 위한 단편으로서, 본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 lox 핵산 단편은 lox 단편을 양 말단에 갖는 제1 선택마커를 포함할 수 있다. 상기 lox 핵산 단편은 lox71 및 lox66으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 lox 유전자를 단편의 양 말단에 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 lox 핵산 단편은 서열번호 17의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 DR0861 유전자가 결실된 균주에 groE 프로모터, cre 재조합 효소를 코딩하는 유전자, 제2 선택마커 및 온도 감수성 repUts를 포함하는 벡터를 도입하여 제1 선택마커를 결실시키는 단계를 제공한다.
상기 groE 프로모터는 cre 재조합 효소와 작동가능하게 연결될 수 있다. 상기 용어, "작동가능하게 연결된"은 핵산의 발현을 조절하는 서열과 목적하는 단백질을 코딩하는 핵산 서열이 가능적으로 연결되어 있는 것을 의미한다. 재조합 벡터의 제조에서 작동가능하게 연결하는 것은 통상의 기술자에 의해 잘 알려진 방법으로 수행될 수 있다. 상기 groE 프로모터는 groES 유전자(NCBI GeneBank ID: 1800077)의 상위(upstream) 부분의 299 bp를 포함하는 폴리뉴클레오티드, 구체적으로 서열번호 18의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드일 수 있다.
한편, 상기 제2 선택마커는 Kat 프로모터와 작동가능하게 연결될 수 있다. 이때, 상기 Kat 프로모터는 KatE1 유전자(NCBI GeneBank ID: 1800077)의 상위(upstream) 부분의 138 bp를 포함하는 폴리뉴클레오티드, 구체적으로 서열번호 19의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "온도 감수성 repUts"는 특정 범위의 온도 내에서만 플라스미드가 복제가 가능하게 하는 유전자인 repU 유전자를 의미한다(H. H. Nguyen et al ., Molecular Microbiology, 2009, 73(2), 240-252). 상기 유전자를 포함하는 플라스미드는 28℃의 배양 온도에서는 복제되어 숙주세포 내에서 플라스미드의 유지를 가능하게 하지만, 37℃의 배양 온도에서는 상기 플라스미드가 복제되지 않아 숙주세포 내에서 제거된다. 상기 repU 유전자 및 이를 포함하는 플라스미드는 통상의 기술분야에 잘 알려져 있다.
상기 제1 선택마커를 결실시키는 단계는 제1 선택마커의 양 말단에 결합한 lox 유전자가 cre 재조합 효소에 의해 인식되어 이들 부위를 절단함으로써, 제1 선택마커를 데이노코쿠스 속 균주의 유전체로부터 제거할 수 있다.
상기 단계에서 groE 프로모터, cre 재조합 효소를 코딩하는 유전자, 제2 선택마커 및 온도 감수성 repUts를 포함하는 벡터는 서열번호 21의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 수득된 변이 균주를 배양하여 제2 선택마커를 포함하는 벡터를 제거하는 단계를 제공한다.
상기 제2 선택마커의 제거는, 온도 감수성 마커인 repUts에 의하여 제2 선택마커를 포함하는 벡터가 특정 온도 범위 내에서는 복제되지 않는 특성을 사용할 수 있다. 따라서, 상기 단계는 변이 균주를 특정 온도 범위 내에서 일정 기간 동안 배양함으로써 제2 선택마커를 포함하는 벡터를 제거할 수 있다. 구체적으로, 상기 배양을 위한 온도는 30 내지 40℃, 구체적으로 31 내지 39℃, 더욱 구체적으로 33 내지 38℃일 수 있다.
상기 단계에 따라 수득된 변이 균주는 제1 및 제2 선택마커가 모두 제거됨으로써 항생제가 포함된 배지에서는 성장하지 못하는 특성에 기초하여 선별될 수 있다.
또한, 본 발명은 DR0862, DR1087, DR1395 및 DR1475로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자를 각각 발현하는 플라스미드를 도입하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "DR0862" 유전자는 파이토엔 합성효소(phytoene synthase)를 암호화하는 유전자로서, 상기 파이토엔 합성효소는 전구체인 제라닐제라닐 파이로포스페이트(geranylgeranyl pyrophosphate)를 기질로 하여 파이토엔을 합성할 수 있다. 상기 DR0862 유전자는 통상의 기술분야에 알려진 어떠한 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 구체적으로, 상기 DR0862 유전자는 서열번호 41의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "DR1087" 유전자는 이소펜테닐 파이로포스페이트 이성화효소(isopentenyl pyrophosphate isomerase)를 암호화하는 유전자로서, 이소펜테닐 파이로포스페이트를 디메틸알릴 파이로포스페이트(demethylally pyrophosphate)로 이성질화할 수 있다. 상기 DR1087 유전자는 통상의 기술분야에 알려진 어떠한 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 구체적으로, 상기 DR1087 유전자는 서열번호 42의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "DR1395" 유전자는 제라닐제라닐 파이로포스페이트 합성효소(geranylgeranyl pyrophosphate synthase)를 암호화하는 유전자로서, 파네실 파이로포스페이트(fanesyl pyrophosphate)를 기질로 사용하여 제라닐제라닐 파이로포스페이트를 합성할 수 있다. 상기 DR1395 유전자는 통상의 기술분야에 알려진 어떠한 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 구체적으로, 상기 DR1395 유전자는 서열번호 43의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "DR1475" 유전자는 1-디옥시-D-자일룰로스-5-포스페이트 합성효소(1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate synthase)를 암호화하는 유전자로서, 파이루베이트(pyruvate) 및 글루코즈-3-포스페이트(glucose-3-phosphate)를 기질로 사용하여 1-디옥시-D-자일룰로스-5-포스페이트를 합성할 수 있다. 상기 DR1475 유전자는 통상의 기술분야에 알려진 어떠한 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 구체적으로, 상기 DR1475 유전자는 서열번호 44의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드일 수 있다.
구체적으로, 본 발명에 따른 방법은 DR0862, DR1087, DR1395 또는 DR1475 유전자를 하나, 둘 또는 그 이상으로 발현하는 플라스미드를 추가로 도입하는 것을 포함할 수 있다. 이때, 상기 도입은 하나, 둘 또는 그 이상의 유전자가 각각 발현되도록 제작된 플라스미드를 사용하여 수행되거나, 또는 하나의 유전자를 발현하는 각각의 플라스미드를 하나, 둘 또는 그 이상 사용하여 수행될 수 있다. 한 균주에서 하나, 둘 또는 그 이상의 유전자를 과발현하도록 조작하는 방법은 통상의 기술분야에 잘 알려져 있다.
상기 DR0862, DR1087, DR1395 및 DR1475로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자를 각각 발현하는 플라스미드는 통상의 기술분야에 잘 알려진 방법에 따라 제조될 수 있다. 상기 제조된 플라스미드를 균주에 도입하는 방법 또한 통상의 기술자에 의해 적절히 수행될 수 있다.
또한, 본 발명은 DR2250 유전자를 결실시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "DR2250" 유전자는 카로테노이드 3',4' 불포화 효소(carotenoid 3',4' desaturase)인 메톡시뉴로스포렌 탈수소효소(methoxyneurosporene dehydrogenase)를 암호화하는 유전자로서, 상기 메톡시뉴로스포렌 탈수소효소는 카로테노이드의 C3' 및 C4' 위치에 이중결합을 도입할 수 있다. 상기 DR2250 유전자는 통상의 기술분야에 알려진 어떠한 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 구체적으로, 상기 DR2250 유전자는 서열번호 45의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드일 수 있다.
상기 DR2250 유전자를 결실시키는 방법은 통상의 기술분야에 알려진 어떠한 방법으로도 수행될 수 있다. 일례로, DR2250 유전자의 결실은 상술한 DR0861 유전자를 결실시키는 방법과 동일한 방법으로 수행될 수 있다.
본 발명의 방법에 따른 폴리뉴클레오티드는 암호화하고 있는 단백질의 기능에 영향을 미치지 않는 범위 내에서, 염기의 결실, 삽입, 치환 또는 추가에 의해 상이한 서열을 갖는 변이체 또는 단편을 포함할 수 있다. 또한, 상기 유전자는 공지된 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드와 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 이상의 상동성을 가질 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 lox 단편을 양 말단에 포함하고, 제1 선택마커로서 클로람페니콜을 포함하는 플라스미드를 제조하였다(도 1a 참조). 또한, groE 프로모터에 의해 cre 유전자의 발현이 조절되는 제2 선택마커를 포함하고, 온도 감수성 repUts를 포함하는 플라스미드를 제조하였다(도 1b 참조).
상기 제1 선택마커를 포함하는 DNA 구조체에 표적 유전자인 DR0861 유전자의 상부 및 하부 단편을 융합시키고, 이를 먼저 데이노코쿠스 라디오두란스 균주에 도입하여 DR0861 유전자가 결실된 균주를 선별하였다(도 4 참조). 상기 선별된 균주로부터 제1 선택마커를 제거하기 위해 cre 재조합 효소를 발현하는 제2 선택마커를 포함하는 벡터를 도입하고, 제1 선택마커가 제거된 균주를 선별하였다. 또한, 제1 선택마커가 제거된 균주에서 제2 선택마커를 제거하기 위해, 상기 균주를 37℃의 온도에서 배양한 뒤, 배양된 균주 중에서 항생제가 포함되지 않은 배지에서만 성장하는 균주를 선별함으로써, 모든 선택마커가 제거되고 DR0861 유전자가 결실된 데이노코쿠스 라디오두란스 균주를 선별하였다(도 6 참조).
또한, 본 발명자들은 상기 DR0861 유전자가 결실된 데이노코쿠스 라디오두란스 균주에 DR0862, DR1087, DR1395, DR1475, DR0862 및 DR1087, DR0862 및 DR1395, 또는 DR0862 및 DR1475 유전자를 발현하는 플라스미드를 도입하여, DR0861 유전자가 결실된 동시에 DR0862, DR1087, DR1395, DR1475, DR0862 및 DR1087, DR0862 및 DR1395, 또는 DR0862 및 DR1475 유전자를 과발현하는 데이노코쿠스 변이 균주를 제조하였다(도 9 및 10 참조). 나아가, 본 발명자들은 DR0861 및 DR2250 유전자가 결실되고, DR0862 및 DR1475 유전자를 과발현하는 데이노코쿠스 변이 균주를 제조하였다.
또한, 본 발명은 상기 방법으로 제조된 DR0861 유전자가 결실된 파이토엔 생산능을 갖는 데이노코쿠스 속 변이 균주를 제공한다.
상기 데이노코쿠스 속 변이 균주는 상술한 방법에 따라 제조될 수 있다. 구체적으로, 상기 데이노코쿠스 속 균주는 데이노코쿠스 라디오두란스(D. radiodurans), 데이노코쿠스 인디쿠스(D. indicus), 데이노코쿠스 카에니(D. caeni), 데이노코쿠스 아쿠아티쿠스(D. aquaticus), 데이노코쿠스 디폴리머란스(D. depolymerans), 데이노코쿠스 그란디스(D. grandis), 데이노코쿠스 데죠네시스(D. daejeonensis), 데이노코쿠스 라디오톨러란스(D. radiotolerans), 데이노코쿠스 지오써말리스(D. geothermalis), 데이노코쿠스 루버(D. ruber), 데이노코쿠스 안타티커스(D. antarcticus), 데이노코쿠스 프로테오리티쿠스(D. proteolyticus), 데이노코쿠스 라디오푸그난스(D. radiopugnans), 데이노코쿠스 라디오필러스(D. radiophilus), 데이노코쿠스 셀룰로실리티쿠스(D. cellulosilyticus) 및 데이노코쿠스 스웬시스(D. swuensis)로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상, 구체적으로는 데이노코쿠스 라디오두란스일 수 있다.
DR0861 유전자가 결실된 데이노코쿠스 속 변이 균주는 우수한 파이토엔 생성능을 가질 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 본 발명의 방법에 따라 제조된 DR0861 유전자가 결실된 데이노코쿠스 라디오두란스 균주가 우수한 파이토엔 생산능을 나타내는 것을 HPLC 및 TLC 분석 방법으로 확인하였다(도 7 및 8 참조).
또한, 본 발명자들은 DR0861 유전자가 결실된 동시에 DR0862, DR1087, DR1395, DR1475, DR0862 및 DR1087, DR0862 및 DR1395, 또는 DR0862 및 DR1475 유전자를 과발현하는 데이노코쿠스 변이 균주도 우수한 파이토엔 생산능을 나타내고, 특히 DR0861 유전자가 결실되고, DR0862 및 DR1475 유전자를 과발현하는 데이노코쿠스 변이 균주가 가장 우수한 파이토엔 생산능을 나타냄을 확인하였다(도 13 참조). 또한, 상기 DR0861 유전자가 결실되고, DR0862 및 DR1475 유전자를 과발현하는 변이 균주는 배양 72시간에 가장 높은 파이토엔 생성능을 나타내었다(도 14 참조). 나아가, 본 발명자들은 DR0861 및 DR2250 유전자가 결실되고, DR0862 및 DR1475 유전자를 과발현하는 변이 균주를 제조하여, 상기 균주가 DR0861 유전자가 결실되고, DR0862 및 DR1475 유전자를 과발현하는 변이 균주보다 더욱 현저한 파이토엔 생성능을 나타냄을 확인하였다(도 15 참조). 또한, 상기 DR0861 및 DR2250 유전자가 결실되고, DR0862 및 DR1475 유전자를 과발현하는 변이 균주는 배양 72시간에 가장 높은 파이토엔 생성능을 나타내었다(도 16 참조).
또한, 본 발명은 상술한 특징을 갖는 본 발명에 따른 변이 균주를 배양하는 단계를 포함하는 파이토엔 생산 방법을 제공한다.
상기 배양은 통상의 기술분야에 잘 알려진 적당한 배지 및 배양 조건에 따라 수행될 수 있다. 구체적으로, 상기 배양은 회분식, 연속식 또는 유가식 배양일 수 있다. 상기 파이토엔 생산 방법은 변이 균주를 배양하여 수득된 배양물로부터 파이토엔을 수득하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 파이토엔의 수득은 통상의 기술자에 의해 적절히 수행될 수 있다.
이하, 본 발명을 하기 실시에에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명이 이들에 의해 제한되는 것은 아니다.
실시예 1. 제1 선택마커를 포함하는 플라스미드의 제작
카나마이신 내성 유전자의 양 말단에 lox66 및 lox71 유전자를 포함하는 플라스미드를 다음과 같은 방법을 제조하였다(도 1a).
먼저, pKatAPH3 플라스미드(Satoh K. et al ., Microbiology, 152:3217-3226, 2006)를 주형으로 하여 하기 표 1에 기재된 염기서열을 갖는 Lox66F(서열번호 1) 및 Lox71R(서열번호 2) 프라이머를 이용하여 lox66 및 lox71 유전자를 양 말단에 갖도록 카나마이신 내성 유전자를 증폭시켰다. 구체적으로, 1 ㎕의 pKatAPH3, 각각 1 ㎕의 lox66F 및 lox71R 프라이머(10 pmole/㎕) 및 17 ㎕의 멸균증류수의 혼합물을 pfu 폴리머라제 믹스(Bioneer)에 첨가한 뒤, 이를 T-100 Thermal cycler DNA 증폭기(Bio-rad)를 이용하여 수행하였다. PCR은 95℃에서 5분 동안 반응시킨 뒤, 95℃ 30초, 60℃ 30초 및 72℃ 1분의 반응과정을 1회로 하여 이를 30회 반복함으로써 수행되었다.
서열번호 이름 서열(5'→3')
서열번호 1 Lox66F gcttgatatctaccgttcgtatagcatacattatacgaagttat
서열번호 2 Lox71R tagaggatcctaccgttcgtataatgtatgctatacgaagttat
서열번호 3 GroEF cgtggcggccgctcggcttggaagcacgtatt
서열번호 4 GroER tacgggcagtaaattggacatatccactagtaacggccgcc
서열번호 5 CreF ggcggccgttactagtggatatgtccaatttactgcccgta
서열번호 6 CreR agcttatcgataccgtcgacctaatcgccatcttccagca
서열번호 7 pKatF tgctggaagatggcgattaggtcgacggtatcgataagct
서열번호 8 pKatR ccagtgatttttttctccatatgctctccttcgcctcgct
서열번호 9 CmF agcgaggcgaaggagagcatatggagaaaaaaatcactgg
서열번호 10 CmR gcgactcgaggtcgactctagaggatcctc
수득된 산물을 1% 아가로즈 겔에서 전기영동하여 확인하고, 이를 DNA fragment purification kit(Intron lifetechnology)를 이용하여 정제하였다. 상기 수득된 PCR 산물과 pKatAPH3를 각각 EcoRV 및 BamHI으로 절단한 뒤, 결찰시켜 카나마이신 내성 유전자의 양 말단에 lox66 및 lox71 유전자를 포함하는 플라스미드를 제조하였다. 상기 제조된 플라스미드를 pAM1(서열번호 20)이라 명명하였다(도 2).
실시예 2. groE 프로모터에 의해 cre 유전자의 발현이 조절되는 제2 선택마커를 포함하는 플라스미드의 제작
cre 재조합 효소, 클로람페니콜 내성 유전자 및 groE 프로모터 유전자를 포함하는 플라스미드를 다음과 같은 방법으로 제조하였다(도 1b).
2-1. groE 프로모터 유전자의 수득
groE 프로모터의 유전자를 수득하기 위해, 데이노코쿠스 라디오두란스 유전자를 주형으로 사용하고, 각각 0.5 ㎕의 상기 표 1에 기재된 GroEF(서열번호 3) 및 GroER(서열번호 4)의 프라이머 및 AccuPower™ pfu PCR premix mix(Bioneer)를 사용한 것을 제외하고는, 상기 실시예 1과 동일한 조건 및 방법으로 PCR을 수행하였다. 그 결과, groE 프로모터 유전자의 PCR 산물을 수득하였다.
2-2. cre 유전자의 수득
cre 유전자를 수득하기 위해, NCBI Accession number_ab449974의 서열을 참고하여 인공적으로 합성한 폴리뉴클레오티드(Bioneer)를 주형으로 사용하고, 상기 표 1에 기재된 CreF(서열번호 5) 및 CreR(서열번호 6)의 프라이머를 사용한 것을 제외하고는, 상기 실시예 1과 동일한 조건 및 방법으로 PCR을 수행하였다. 그 결과, cre 유전자의 PCR 산물을 수득하였다.
2-3. groE 프로모터 유전자 및 cre 유전자의 연결
실시예 2-1 및 2-2에서 수득한 PCR 산물을 혼합하여 주형으로 사용하고, 상기 표 1에 기재된 GroEF(서열번호 3) 및 CreR(서열번호 6)의 프라이머를 사용한 것을 제외하고는, 상기 실시예 1과 동일한 조건 및 방법으로 PCR을 수행하였다. 그 결과, groE 프로모터 유전자 및 cre 유전자가 융합된 형태의 PCR 산물을 수득하였다.
2-4. KatE1 프로모터 유전자의 수득
KatE1 프로모터를 수득하기 위해, 데이노코쿠스 라디오두란스 유전자를 주형으로 사용하고, 상기 표 1에 기재된 pKatF(서열번호 7) 및 pKatR(서열번호 8)의 프라이머를 사용한 것을 제외하고는 상기 실시예 1과 동일한 조건 및 방법으로 PCR을 수행하였다. 그 결과, KatE1 프로모터 유전자의 PCR 산물을 수득하였다.
2-5. 클로람페니콜 내성 유전자의 수득
클로람페니콜 내성 유전자를 수득하기 위해, pRAD1 플라스미드(Meima R. et at., Applied and environmental microbiology 66:3856-3867, 2000)를 주형으로 사용하고, 상기 표 1에 기재된 CmF(서열번호 9) 및 CmR(서열번호 10)의 프라이머를 사용한 것을 제외하고는, 상기 실시예 1과 동일한 조건 및 방법으로 PCR을 수행하였다. 그 결과, KatE1 프로모터 유전자의 PCR 산물을 수득하였다. 그 결과, 클로람페니콜 내성 유전자의 PCR 산물을 수득하였다.
2-6. KatE1 프로모터 유전자 및 클로람페니콜 내성 유전자의 연결
실시예 2-4 및 2-5에서 수득한 PCR 산물을 혼합하여 주형으로 사용하고, 상기 표 1에 기재된 pKatF(서열번호 7) 및 CmR(서열번호 10)의 프라이머를 사용한 것을 제외하고는, 상기 실시예 1과 동일한 조건 및 방법으로 PCR을 수행하였다. 그 결과, 클로람페니콜 내성 유전자의 PCR 산물을 수득하였다.
2-7. groE 프로모터 유전자, cre 유전자, KatE1 프로모터 유전자 및 클로람페니콜 내성 유전자의 연결
실시예 2-3 및 2-6에서 수득한 PCR 산물을 혼합하여 주형으로 사용하고, 상기 표 1에 기재된 GroEF(서열번호 3) 및 CmR(서열번호 10)의 프라이머를 사용한 것을 제외하고는, 상기 실시예 2와 동일한 조건 및 방법으로 PCR을 수행하였다. 그 결과, groE 프로모터 유전자, cre 유전자, KatE1 프로모터 유전자 및 클로람페니콜 내성 유전자가 융합된 형태의 PCR 산물을 수득하였다.
2-8. 제2 선택마커를 포함하는 플라스미드의 제작
실시예 2-7에서 수득한 PCR 산물을 13840 플라스미드(Nguyen, H. H. et al ., Molecular microbiology, 73:240-252, 2009)와 함께 NotI 및 XhoI(Enzynomics)으로 절단한 뒤, 결찰시켜 제조된 플라스미드를 pAM2(서열번호 21)라고 명명하였다(도 3).
비교예 1. KatE1 프로모터에 의해 cre 유전자의 발현이 조절되는 제2 선택마커를 포함하는 플라스미드의 제작
groE 프로모터의 위치에 KatE1 프로모터를 삽입한 것을 제외하고는, 상기 실시예 2와 동일한 조건 및 방법으로 KatE1 프로모터에 의해 cre 유전자의 발현이 조절되는 제2 선택마커를 포함하는 플라스미드를 제작하였다.
실시예 3. DR0861 유전자가 결실된 데이노코쿠스 라디오두란스 변이 균주의 제조
3-1. DR0861 유전자의 상위 및 하위 부위의 수득
데이노코쿠스 라디오두란스의 DNA를 주형으로 하여, DR0861 유전자의 상위 부위 1 kb 및 하위 부위 1 kb를 각각 하기 표 2에 기재된 프라이머 1, 2, 5 및 6(서열번호 11, 12, 15 및 16)의 프라이머를 사용한 것을 제외하고는, 상기 실시예 1과 동일한 조건 및 방법으로 PCR을 수행하였다. 그 결과, DR0861 유전자의 상위 및 하위 부위의 1 kb의 PCR 산물을 각각 수득하였다.
서열번호 이름 서열(5'→3')
서열번호 11 프라이머 1 catagtgaaagaaacgtctg
서열번호 12 프라이머 2 agcttatcgataccgtcgacgacagtaaacctcggaagtc
서열번호 13 프라이머 3 gacttccgaggtttactgtcgtcgacggtatcgataagct
서열번호 14 프라이머 4 ttaagcggaatccgtatgaccatgcctgcaggtcgactct
서열번호 15 프라이머 5 agagtcgacctgcaggcatggtcatacggattccgcttaa
서열번호 16 프라이머 6 ttggtccacatgctggtgca
3-2. lox 유전자를 양쪽에 포함하는 카나마이신 내성 유전자의 증폭
실시예 1에서 제작된 pAM1 플라스미드를 주형으로 하여, lox71 및 lox66 유전자를 양 말단에 포함하는 카나마이신 내성 유전자를 상기 표 2에 기재된 프라이머 3 및 4(서열번호 13 및 14)의 프라이머를 사용한 것을 제외하고는, 상기 실시예 1과 동일한 조건 및 방법으로 PCR을 수행하였다. 그 결과, lox71 및 lox66 유전자를 양 말단에 포함하는 카나마이신 내성 유전자의 PCR 산물을 수득하였다.
3-3. DR0861 유전자의 상위 및 하위 부위와 lox 유전자를 양쪽에 포함하는 카나마이신 내성 유전자의 연결
먼저, 실시예 3-1 및 3-2에서 수득된 PCR 산물을 1% 아가로즈 겔에서 전기영동하여 확인하고, 이를 DNA fragment purification kit(Intron lifetechnology)를 이용하여 각각 정제하였다. 정제된 PCR 산물을 혼합하여 주형으로 사용하고, 상기 표 2에 기재된 프라이머 1(서열번호 11) 및 프라이머 6(서열번호 16)의 프라이머를 사용하였으며, PCR 과정에서 72℃ 3분 동안 반응시킨 것을 제외하고는, 상기 실시예 1과 동일한 조건 및 방법으로 PCR을 수행하였다. 그 결과, DR0861 유전자의 상위 및 하위 부위와 lox 유전자를 양쪽에 포함하는 카나마이신 내성 유전자가 융합된 형태의 PCR 산물을 수득하였다(도 4).
3-4. DR0861 유전자가 결실된 변이 균주의 제조
먼저, 데이노코쿠스 라디오두란스(ATCC 13939, 농업유전자원정보센터, 한국) 균주를 TGY 배지(0.5%(w/v)의 트립톤, 0.1%(w/v)의 글루코스 및 0.3%(w/v)의 효모 추출물)를 이용하여 30℃의 온도에서 OD600의 값이 0.5에 도달할 때까지 배양하였다. 배양한 세포를 원심분리하여 30 mM의 칼슘클로라이드(CaCl2)가 포함된 2x TGY 배지에 현탁한 뒤, 현탁액을 얼음에서 1시간 동안 정치시켰다. 이를 다시 원심분리하여 상등액을 제거하고 30 mM의 CaCl2 및 10%(v/v) 글리세롤이 포함된 50 ㎕의 TGY 배지를 첨가하여 재현탁한 뒤, 멸균된 1.5 ㎖ 튜브에 50 ㎕ 씩 분주하여 준비하였다.
한편, 실시예 3-3에서 수득된 PCR 산물은 1% 아가로즈 겔에서 전기영동하고, 이를 DNA fragment purification kit(Intron lifetechnology)를 이용하여 정제하였다. 10 ㎕의 정제된 PCR 산물, 50 ㎕의 데이노코쿠스 라디오두란스 세포 및 30 mM의 CaCl2가 포함된 50℃의 2x TGY 배지를 혼합하고, 상기 혼합물을 얼음에서 30분 동안 정치시킨 뒤, 32℃에서 1.5시간 동안 반응시켰다. 반응 후, 900 ㎕의 2x TGY 배지를 첨가하고, 이를 30℃에서 12시간 동안 배양하였다. 배양된 균주를 25 ㎍/㎖의 카나마이신이 포함된 2x TGY 고체 배지에 200 ㎕ 씩 도말하고, 30℃에서 3 내지 4일 동안 배양하였다. 배양된 균주로부터 DNA를 추출하여 DR0861 유전자가 결실되었는지를 염기서열 분석으로 확인하고, 최종 선별된 균주를 DrAM1으로 명명하였다.
실시예 4. DR0861 유전자가 결실된 변이 균주로부터 항생제 내성 유전자의 제거
먼저, 실시예 2에서 제조된 pAM2 플라스미드를 실시예 3-4에 기재된 방법 및 조건으로 실시예 3에서 제조된 DR0861 유전자가 결실된 변이 균주에 형질전환하였다. 형질전환된 균주로부터 카나마이신 내성 유전자가 제거된 균주를 선별하기 위해, 3 ㎍/㎖의 클로람페니콜이 포함된 2x TGY 고체 배지에 도말하여 배양하였다. 배양된 균주로부터 DNA를 추출하여 카나마이신 내성 유전자가 결실되었는지를 염기서열 분석으로 확인하고, 최종 선별된 균주를 DrAM2으로 명명하였다.
실시예 5. groE 또는 KatE1 프로모터에 의한 cre 단백질의 발현량 확인
실시예 3에서 제조된 groE 프로모터에 의해 cre 단백질의 발현이 조절되는 제2 선택마커를 포함하는 플라스미드가 도입된 변이 균주와 KatE1 프로모터에 의해 cre 단백질의 발현이 조절되는 제2 선택마커를 포함하는 플라스미드가 도입된 변이 균주에서 cre 단백질의 발현량을 다음과 같은 방법으로 확인하였다.
구체적으로, groE 프로모터 또는 KatE1 프로모터를 포함하는 플라스미드를 데이노코쿠스 라디오두란스 균주를 TGY 배지를 이용하여 OD=1까지 배양하였다. 상기 배양액으로부터 각각의 프로모터를 포함하는 세포만을 원심분리로 수득하여 용해 완충액을 첨가하고, 초음파 분쇄기를 사용하여 세포를 각각 용해시켰다. 용해된 각각의 세포 용해물을 4,000 rpm, 4℃의 조건에서 20분 동안 원심분리하여 단백질을 포함하는 상등액을 회수하고, 이를 브래드포드 어세이 방법을 사용하여 각각의 상등액에 포함된 단백질의 양을 정량하였다. 정량한 단백질 10 ㎍을 SDS-PAGE 겔을 이용하여 전기영동한 뒤, 이를 코마시블루 염색약으로 염색하여 cre 단백질의 크기인 약 35 kDa에 해당하는 밴드의 변화를 관찰하였다.
그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이, groE 프로모터에 의해 cre 단백질의 발현이 조절되는 제2 선택마커를 포함하는 플라스미드가 도입된 변이 균주에서 생성된 cre 단백질의 발현량이 KatE1 프로모터를 포함하는 제2 선택마커를 포함하는 플라스미드가 도입된 변이 균주보다 높았다(도 5).
실시예 6. 항생제 내성 유전자 및 DR0861 유전자가 모두 제거된 데이노코쿠스 라디오두란스 균주의 제조
실시예 2에서 제조된 pAM2 플라스미드는 온도감수성 플라스미드로서 37℃의 조건에서는 데이노코쿠스 라디오두란스 균주 내에서 복제되지 않는다. 따라서, 이를 이용하여 DrAM2 균주로부터 pAM2 플라스미드를 다음과 같은 방법으로 제거하였다.
구체적으로, DrAM2 균주를 37℃에서 TGY 액체 배지를 사용하여 24시간 동안 배양하여 준비하였다. 준비된 DrAM2 균주를 2x TGY 고체 배지에 부피비로 1:10,000이 되도록 희석하여 도말하고, 이를 30℃에서 2일 동안 배양하였다. 형성된 단일 콜로니를 멸균된 팁(tip)을 이용하여 카나마이신 또는 클로람페니콜이 포함된 2x TGY 고체 배지, 또는 항생제를 포함하지 않는 2x TGY 고체 배지에 접종하고, 30℃에서 1일 동안 배양하였다. 배양 후, 항생제를 포함하지 않는 배지에서만 성장한 단일 콜로니를 최종적으로 선별하여 이를 DrAM3로 명명하였다(도 6).
비교예 2. DR0862 유전자가 결실된 데이노코쿠스 라디오두란스 변이 균주의 제조
DR0861 유전자 대신 DR0862 유전자가 결실된 것을 제외하고는, 상기 서술된 것과 동일한 조건 및 방법으로 DR0862 유전자가 결실된 데이노코쿠스 라디오두란스 변이 균주를 제조하였다.
실험예 1. DR0861 유전자가 결실된 데이노코쿠스 라디오두란스 변이 균주의 파이토엔 생산효과 확인
1-1. 균주의 배양 및 배양 산물의 수득
먼저, 10 g의 트립톤(BD, 프랑스), 10 g의 효모 추출물(Acumedia, 미국), 2 g의 포도당(Duksan, 한국) 및 2 g의 K2HPO4(Daejung, 한국)를 1 ℓ의 정제수에 용해시키고 pH를 6.5로 보정하여 액체 배지를 제조하였다. 상기 제조된 액체 배지를 3개의 500 ㎖ 삼각 플라스크에 100 ㎖씩 분주하여 가압멸균하고, 멸균된 액체 배지에 1 ㎖의 실시예 6에서 제조된 변이 균주, 비교예 2에서 제조된 변이 균주 또는 야생형의 데이노코쿠스 라디오두란스 균주를 접종하였다. 상기 균주는 30℃, 200 rpm의 조건으로 72시간 동안 교반하며 배양하였다. 배양 후, 배양액을 4℃, 4,000 rpm의 조건으로 원심분리하여 분말화된 세포를 회수하고, 여기에 1 ㎖의 에틸아세테이트를 첨가하여 교반하였다. 15분 동안 교반하여 수득된 현탁액을 0.45 ㎛의 포어(pore) 크기를 갖는 여과지를 이용하여 감압여과하고, 증발시켜 배양물 잔사를 수득하였다.
1-2. 고성능 액체크로마토그래피(HPLC) 분석을 통한 파이토엔의 생성 확인
실험예 1-1에서 수득된 DR0861 유전자가 결실된 데이노코쿠스 라디오두란스 균주, 및 야생형의 데이노코쿠스 라디오두란스 균주로부터 수득된 잔사를 이용하여 HPLC를 통해 파이토엔의 생성량을 분석하였다.
구체적으로, 컬럼은 Zorbax Eclipse XDB-C18 5 ㎛(4.6x250 ㎜)를 사용하였고, 온도는 35℃, 유속은 2.0 ㎖/min으로 설정하였다. 한편, 실험예 1-1에서 준비된 잔사는 5 ㎕를 주입하였다. 이동상은 아세토니트릴, 메탄올 및 이소프로판올이 40:50:10으로 배합된 것을 사용하였다. 이때, 비교를 위한 표준품으로는 15-cis-파이토엔(>95%, Toronto Research Chemical)을 사용하였다.
그 결과, 도 7a에 나타난 바와 같이, 야생형 균주에서는 파이토엔이 생성되지 않았으나, DR0861 유전자가 결실된 균주에서는 우수한 파이토엔 생성능을 나타냄을 확인하였다(도 7a). 또한, 파이토엔 생성량을 확인한 결과, 도 7b에 나타난 바와 같이, DR0861 유전자가 결실된 균주에서 약 0.4 ㎎/ℓ 이상의 파이토엔이 생성되었다(도 7b).
1-3. 박층크로마토그래피(TLC) 분석을 통한 파이토엔의 생성 확인
먼저, TLC 분석을 위한 실리카겔 플레이트(TLC silica gel 60, MERCK)는 5x6.5 ㎝의 크기로 준비하였다. 준비된 플레이트의 고정상에 위치한 베이스라인에 실험예 1-1에서 수득한 배양물 잔사를 도포하였다. 이때, 베이스라인은 플레이트 하단의 내측으로 약 1~3 ㎝ 떨어진 곳에 위치시키고, 시료는 스팟 형태로 도포하였다. 플로로포름:메탄올:아세톤:아세트산이 부피비로 10:1:0.4:0.2의 비율로 혼합된 혼합액을 전개용매로서 전개용 챔버에 1 ㎝ 이하의 깊이로 첨가하였다. 시료가 도포된 TCL 플레이트를 이의 하단이 전개용매에 닿도록 전개용 챔버에 고정하고, 베이스라인은 전개용매에 닿지 않도록 설치하였다. 이후, 전개용 챔버의 뚜껑을 닫아 전개용 챔버를 밀폐시키고, 전개를 진행하며 전개 용매가 플레이트의 위쪽으로 1 ㎝ 떨어진 곳까지 전개되었을 때 전개를 종료하였다. 전개가 종료된 플레이트는 전개 용매를 모두 휘발시키고 10% 황산을 도포하고 120℃의 핫플레이트 위에 두어 분리된 시료가 확인될때까지 가열하였다.
그 결과, 도 8에 나타난 바와 같이, DR0861 유전자가 결실된 변이 균주에서 우수한 파이토엔 생성능을 나타냄을 확인하였다(도 8).
실시예 7. DR0861 유전자가 결실되고, DR0862 유전자가 과발현된 데이노코쿠스 라디오두란스 변이 균주의 제조
DR0861 유전자가 결실된 데이노코쿠스 라디오두란스 균주에 속도제한효소(rate-limiting enzyme)로 잘 알려진 DR0862(crtB) 유전자를 과발현하는 플라스미드를 형질전환하여, DR0861 유전자가 결실되고, DR0862 유전자가 과발현된 데이노코쿠스 라디오두란스 변이 균주를 제조하였다.
먼저, DR0862 유전자는 데이노코쿠스 라디오두란스 유전자를 주형으로 사용하여 하기 표 3에 기재된 dr0862F1(서열번호 23) 및 dr0862R1(서열번호 24) 각각의 프라이머 0.5 ㎕, 및 AccuPower™ pfu PCR premix mix(Bioneer)를 사용한 것을 제외하고는, 실시예 1과 동일한 조건 및 방법으로 PCR을 수행하여 수득하였다.
서열번호 이름 서열(5'→3')
서열번호 23 dr0862F1 aagtactagtatgaggtctagggccggtt
서열번호 24 dr0862R1 ctatgcggccgctcagccgtggaccgcgccca
서열번호 25 dr1087F1 gttaactagtatgcggctggacactgtgtt
서열번호 26 dr1087R1 ctaggcggccgccttgcagaggggtcccttta
서열번호 27 dr1395F1 aagtactagtatgcgtcccgaactgctcgc
서열번호 28 dr1395R1 ataggcggccgctcacttctcccgcgtcgcca
서열번호 29 dr1475F1 ctagactagtgtgaacgaacttcccggcac
서열번호 30 dr1475R1 taacgcggccgcctacacctcaatcggcacgt
수득된 PCR 산물을 1% 아가로즈 겔에서 전기영동하여 확인하고, 이를 DNA fragment purification kit(Intron lifetechnology)를 이용하여 정제하였다. 정제된 PCR 산물과 pRADZ3 플라스미드(Meima R. and Lidstrom M. E., Applied environmental microbiology, 66:3856-3867)를 각각 SpeI 및 NotI 제한효소로 절단한 뒤, 결찰시켜 pRADZ3 내에 존재하는 groE 프로모터의 하위에 DR0862 유전자가 발현되도록 플라스미드를 제조하였다(도 9). 제조된 플라스미드를 실시예 3-4와 동일한 방법 및 조건으로 실시예 6에서 제조된 DR0861 유전자가 결실된 균주에 형질전환함으로써 DR0861 유전자가 결실되고, DR0862 유전자가 과발현된 데이노코쿠스 라디오두란스 변이 균주를 제조하였다.
실시예 8. DR0861 유전자가 결실되고, DR1087 유전자가 과발현된 데이노코쿠스 라디오두란스 변이 균주의 제조
DR0861 유전자가 결실된 데이노코쿠스 라디오두란스 균주에 속도제한효소로 잘 알려진 DR1087(idi) 유전자를 과발현하는 플라스미드를 형질전환하여, DR0861 유전자가 결실되고, DR1087 유전자가 과발현된 데이노코쿠스 라디오두란스 변이 균주를 제조하였다. 실험은, DR1087 유전자를 수득하기 위해 상기 표 3에 기재된 dr1087F1(서열번호 25) 및 dr1087R1(서열번호 26) 프라이머를 사용한 것을 제외하고는, 실시예 7과 동일한 조건 및 방법으로 수행되었다. 그 결과, DR0861 유전자가 결실되고, DR1087 유전자가 과발현된 데이노코쿠스 라디오두란스 변이 균주를 제조하였다.
실시예 9. DR0861 유전자가 결실되고, DR1395 유전자가 과발현된 데이노코쿠스 라디오두란스 변이 균주의 제조
DR0861 유전자가 결실된 데이노코쿠스 라디오두란스 균주에 속도제한효소로 잘 알려진 DR1395(crtE) 유전자를 과발현하는 플라스미드를 형질전환하여, DR0861 유전자가 결실되고, DR1395 유전자가 과발현된 데이노코쿠스 라디오두란스 변이 균주를 제조하였다. 실험은, DR1395 유전자를 수득하기 위해 상기 표 3에 기재된 dr1395F1(서열번호 27) 및 dr1395R1(서열번호 28) 프라이머를 사용한 것을 제외하고는, 실시예 7과 동일한 조건 및 방법으로 수행되었다. 그 결과, DR0861 유전자가 결실되고, DR1395 유전자가 과발현된 데이노코쿠스 라디오두란스 변이 균주를 제조하였다.
실시예 10. DR0861 유전자가 결실되고, DR1475 유전자가 과발현된 데이노코쿠스 라디오두란스 변이 균주의 제조
DR0861 유전자가 결실된 데이노코쿠스 라디오두란스 균주에 속도제한효소로 잘 알려진 DR1475(dxs) 유전자를 과발현하는 플라스미드를 형질전환하여, DR0861 유전자가 결실되고, DR1475 유전자가 과발현된 데이노코쿠스 라디오두란스 변이 균주를 제조하였다. 실험은, DR1475 유전자를 수득하기 위해 상기 표 3에 기재된 dr1475F1(서열번호 29) 및 dr1475R1(서열번호 30) 프라이머를 사용한 것을 제외하고는, 실시예 7과 동일한 조건 및 방법으로 수행되었다. 그 결과, DR0861 유전자가 결실되고, DR1475 유전자가 과발현된 데이노코쿠스 라디오두란스 변이 균주를 제조하였다.
실시예 11. DR0861 유전자가 결실되고, DR0862 및 DR1087 유전자가 과발현된 데이노코쿠스 라디오두란스 변이 균주의 제조
DR0861 유전자가 결실되고, DR0862 및 DR1087 유전자가 과발현된 데이노코쿠스 라디오두란스 변이 균주를 다음과 같은 방법으로 제조하였다.
먼저, 실시예 8에서 제조된 DR1087 유전자가 포함된 pRADZ3 플라스미드를 주형으로 사용하여, groE 프로모터 및 DR1087 유전자를 포함하는 부분을 하기 표 4에 기재된 바와 같은 groF(서열번호 31) 및 dr1087R2(서열번호 32) 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하였다. 구체적으로, PCR은 1 ㎕의 DNA 주형, 1 ㎕의 프라이머 각각, 및 17 ㎕의 멸균 증류수의 혼합물에 pfu 폴리머라제 믹스(Bioneer)를 첨가한 뒤, 이를 T-100 Thermal cycler DNA 증폭기(Bio-rad)를 사용하여 수행하였다. PCR은 95℃에서 5분 동안 반응시킨 뒤, 95℃ 30초, 60℃ 30초 및 72℃ 1분의 반응과정을 1회로 하여 이를 30회 반복함으로써 수행되었다.
서열번호 이름 서열(5'→3')
서열번호 31 groF ataggcggccgctcggcttggaagcacgtatt
서열번호 32 dr1087R2 gttacctaggcttgcagaggggtcccttta
서열번호 33 dr1395R2 ctaggtcgaccttaagcctaggtcacttctcccgcgtcgcca
서열번호 34 dr1475R2 gttacctaggctacacctcaatcggcacgt
수득된 PCR 산물을 1% 아가로즈 겔에서 전기영동하여 확인하고, 이를 DNA fragment purification kit(Intron lifetechnology)를 이용하여 정제하였다. 정제된 PCR 산물과 실시예 7에서 제조된 DR0862 유전자가 포함된 pRADZ3 플라스미드를 각각 NotI 및 SalI 제한효소로 절단한 뒤, 결찰시켜 pRADZ3 내에 포함된 DR0862 유전자의 하위에 groE 프로모터 및 DR1087 유전자가 발현되도록 플라스미드를 제조하였다. 제조된 플라스미드를 실시예 3-4와 동일한 방법 및 조건으로 실시예 6에서 제조된 DR0861 유전자가 결실된 균주에 형질전환함으로써 DR0861 유전자가 결실되고, DR0862 및 DR1087 유전자가 과발현된 데이노코쿠스 라디오두란스 변이 균주를 제조하였다.
실시예 12. DR0861 유전자가 결실되고, DR0862 및 DR1395 유전자가 과발현된 데이노코쿠스 라디오두란스 변이 균주의 제조
DR0861 유전자가 결실되고, DR0862 및 DR1395 유전자가 과발현된 데이노코쿠스 라디오두란스 변이 균주를 제조하였다. 실험은, 실시예 9에서 제조된 DR1395 유전자가 포함된 pRADZ3 플라스미드를 주형으로 사용하고, 상기 표 4에 기재된 groF(서열번호 31) 및 dr1395R2(서열번호 33) 프라이머를 사용한 것을 제외하고는, 실시예 11과 동일한 조건 및 방법으로 수행되었다. 그 결과, DR0861 유전자가 결실되고, DR0862 및 DR1395 유전자가 과발현된 데이노코쿠스 라디오두란스 변이 균주를 제조하였다.
실시예 13. DR0861 유전자가 결실되고, DR0862 및 DR1475 유전자가 과발현된 데이노코쿠스 라디오두란스 변이 균주의 제조
DR0861 유전자가 결실되고, DR0862 및 DR1475 유전자가 과발현된 데이노코쿠스 라디오두란스 변이 균주를 제조하였다. 실험은, 실시예 10에서 제조된 DR1475 유전자가 포함된 pRADZ3 플라스미드를 주형으로 사용하고, 상기 표 4에 기재된 groF(서열번호 31) 및 dr1475R2(서열번호 34) 프라이머를 사용한 것을 제외하고는, 실시예 11과 동일한 조건 및 방법으로 수행되었다(도 10). 그 결과, DR0861 유전자가 결실되고, DR0862 및 DR1475 유전자가 과발현된 데이노코쿠스 라디오두란스 변이 균주를 제조하였다.
실험예 2. DR0861 유전자가 결실되고, DR0862, DR1087, DR1395 또는 DR1475 유전자가 과발현된 데이노코쿠스 라디오두란스 변이 균주의 파이토엔 생산효과 확인
2-1. 균주의 배양 및 배양 산물의 수득
먼저, 하기 표 5에 기재된 바와 같은 조성을 포함하는 배양 배지를 pH 7.0으로 보정하고, 이를 고압멸균하여 준비하였다.
성분 최종 농도
인산완충액(phosphate buffer) 20 mM
황산암모늄(ammonium sulfate) 15 mM
MnCl2 5 μM
MgCl2 0.8 mM
CaCl2 0.18 mM
과당(fructose) 10 g/ℓ
비타민 믹스(vitamin mix) 10 ㎎/㎖
L-시스테인(L-cystein) 50 ㎎/ℓ
L-메티오닌(L-methionine) 25 ㎎/ℓ
L-히스티딘(L-histidine) 25 ㎎/ℓ
효모추출물(yeast extract) 1 g/ℓ
준비된 50 ㎖의 배양 배지를 250 ㎖의 삼각 플라스크에 넣고, 여기에 실시예 6 내지 13에서 제조된 데이노코쿠스 라디오두란스 변이 균주를 각각 500 ㎕씩 접종하였다. 상기 균주는 30℃, 200 rpm의 조건으로 72시간 동안 교반하며 배양하였다. 이때, 실시예 7 내지 13에서 제조된 균주의 배양 배지에는 3 ㎍/㎖ 농도의 클로람페니콜을 첨가하였다. 배양 후, 배양 후, 배양액을 4℃, 4,000 rpm의 조건으로 15분 동안 원심분리하여 세포를 회수하고, 상등액을 제거하였다. 회수된 세포에 3차 증류수를 첨가하여 세포를 세척하고, 메탄올과 아세톤이 2:7의 부피비로 혼합된 유기 용매 3 ㎖를 첨가하여 세포를 현탁하였다. 현탁된 세포를 상온에서 15분 동안 정치시켜 세포로부터 파이토엔이 추출되도록 하였다. 15분 후, 현탁된 세포를 4℃, 4,000 rpm의 조건으로 15분 동안 원심분리하여 상등액을 수득하였다. 수득된 1 ㎖의 상등액을 0.2 ㎛의 포어(pore) 크기를 갖는 여과지를 이용하여 여과함으로써, 파이토엔이 포함된 용매를 최종적으로 수득하였다.
2-2. 고성능 액체크로마토그래피( HPLC ) 분석을 통한 파이토엔의 생성 확인
실험예 2-1에서 수득된 실시예 6 내지 13에서 제조된 데이노코쿠스 라디오두란스 변이 균주로부터 수득된 잔사를 이용하여 HPLC를 통해 파이토엔의 생성량을 실험예 1-2와 동일한 방법으로 분석하였다. 이때, 비교를 위한 표준품으로는 15-cis-파이토엔(>95%, Toronto Research Chemical)을 사용하였고, 이를 100 ㎎/ℓ부터 6.25 ㎎/ℓ까지의 농도로 희석하여 검량선을 작성하였다(도 11 및 12). 작성된 검량선을 사용하여 계산된, 실시예 6 내지 13에서 제조된 데이노코쿠스 라디오두란스 변이 균주의 파이토엔 생성량을 도 13에 나타내었다.
도 13에 나타난 바와 같이, 실시예 6의 변이 균주(none)가 0.34±0.15 ㎎/ℓ의 파이토엔 생성량을 나타낸 것에 비해 실시예 7 내지 13에서 제조된 변이 균주에서 더 많은 양의 파이토엔을 생성하였다. 특히 한개의 유전자를 과발현하는 변이 균주 중에서는 실시예 7의 변이 균주(dr0862+)에서 가장 많은 양의 파이토엔을 생성하였다(1.85±0.18 ㎎/ℓ). 한편, 두개의 유전자를 과발현하는 변이 균주 중에서는 실시예 13의 변이 균주(dr0862+, dr1475+)가 가장 많은 양의 파이토엔을 생성하였다(3.25±0.21 ㎎/ℓ)(도 13).
2-3. 배양 시간에 따른 파이토엔 생성 확인
실험예 2-2에서 가장 많은 양의 파이토엔을 생성하는 것으로 확인된 실시예 13의 변이균주를 이용하여 배양 시간에 따른 파이토엔 생성량을 확인하였다. 실험은, 배양을 0, 24, 48, 72 및 96시간 동안 수행한 것을 제외하고는 실험예 2-1과 동일한 조건 및 방법으로 배양 산물을 수득하였다. 또한, 실험예 2-2와 동일한 조건 및 방법으로 파이토엔 생성량을 확인하였다.
그 결과, 도 14에 나타난 바와 같이, 파이토엔 생성량을 배양 24시간 경과후에 급증하였으며, 72시간(3.71±0.1 ㎎/ℓ)에 최고점에 달했다가 이후 조금 감소하는 경향을 보였다(도 14).
실시예 14. DR0861 및 DR2250 유전자가 결실되고, DR0862 및 DR1475 유전자가 과발현된 데이노코쿠스 라디오두란스 변이 균주의 제조
먼저, DR2250 유전자의 상위 부위 1 kb 및 하위 부위 1kb를 각각 하기 표 6에 기재된 프라이머를 사용한 것을 제외하고는, 상기 실시예 1과 동일한 조건 및 방법으로 PCR을 수행하여, DR2250 유전자의 상위 및 하위 부위의 1 kb PCR 산물을 각각 수득하였다.
서열번호 이름 서열(5'→3')
서열번호 35 dr2250-1 catgttcatcaccagccgca
서열번호 36 dr2250-2 agcttatcgataccgtcgactgtagcgggagcagtatcac
서열번호 37 dr2250-3 gtgatactgctcccgctacagtcgacggtatcgataagct
서열번호 38 dr2250-4 aatgccttctcgccatccagcatgcctgcaggtcgactct
서열번호 39 dr2250-5 agagtcgacctgcaggcatgctggatggcgagaaggcatt
서열번호 40 dr2250-6 gatgtcgcgagttcgaatct
상기 수득된 PCR 산물을 실시예 3-2 및 3-3에 기재된 바와 동일한 방법으로 카나마이신 내성 유전자와 연결하고, 실시예 6에서 제조된 DDR0861 유전자가 결실된 변이 균주를 사용하여 실시예 3-4에 기재된 바와 동일한 조건 및 방법으로 DR0861 및 DR2250 유전자가 결실된 변이 균주를 제조하였다. 상기 제조된 균주에 DR0862 및 DR1475 유전자를 포함하는 플라스미드를 실시예 3-4에 기재된 바와 동일한 방법으로 형질전환하여 최종적으로 DR0861 및 DR2250 유전자가 결실되고, DR0862 및 DR1475 유전자가 과발현된 데이노코쿠스 라디오두란스 변이 균주의 제조하였다.
비교예 3. DR0861 및 DR2250 유전자가 결실된 데이노코쿠스 라디오두란스 변이 균주의 제조
실시예 14에서 수득된 카나마이신 내성 유전자와 DR2250 유전자의 상위 및 하위 부위를 포함하는 PCR 산물과 실시예 6에서 제조된 DR0861 유전자가 결실된 변이 균주를 사용하여 실시예 3-4에 기재된 바와 동일한 조건 및 방법으로 DR0861 및 DR2250 유전자가 결실된 데이노코쿠스 라디오두란스 변이 균주를 제조하였다.
실험예 3. DR0861 및 DR2250 유전자가 결실되고, DR0862 및 DR1475 유전자가 과발현된 데이노코쿠스 라디오두란스 변이 균주의 파이토엔 생산효과 확인
3-1. HPLC 분석을 통한 파이토엔의 생성 확인
실시예 6, 13, 14 및 비교예 3에서 제조된 변이 균주를 사용하여 상기 실험예 2에 기재된 바와 동일한 조건 및 방법으로 파이토엔 생산효과를 확인하였다. 그 결과, 실시예 6, 실시예 13, 실시예 13 및 비교예 3에서 제조된 변이 균주의 파이토엔 생성량을 도 15에 나타내었다.
도 15에 나타난 바와 같이, 실시예 6 및 비교예 3의 변이 균주에 비해, 실시예 13 및 14의 변이 균주는 더 높은 파이토엔 생성량을 보였다. 특히, 실시예 14의 변이 균주(4.5±0.2 ㎎/ℓ)는 실시예 13의 변이 균주(3.5±0.24 ㎎/ℓ)보다 파이토엔 생성량이 약 21% 증가하였다(도 15).
3-2. 배양 시간에 따른 파이토엔 생성 확인
실험예 3-1에서 가장 많은 양의 파이토엔을 생성하는 것으로 확인된 실시예 14의 변이 균주를 이용하여 실험예 2-3과 동일한 조건 및 방법으로 시간에 따른 파이토엔 생성량을 확인하였다.
그 결과, 도 16에 나타난 바와 같이, 실시예 13의 변이 균주를 사용하여 시간에 따른 파이토엔 생성량을 확인한 결과와 유사하게 배양 72시간에 가장 많은 파이토엔을 생성하였다(도 16).
3-3. 균주의 성장, 탄소원 소모 및 파이토엔의 생성 비교 분석
실시예 14의 변이 균주를 이용하여, 상기 균주의 성장곡선, 성장 시 사용하는 탄소원의 소모비 및 파이토엔의 생성량을 비교분석한 결과를 도 17에 나타내었다.
도 17에 나타난 바와 같이, 실시예 14의 균주는 배양 96시간 동안 배양 배지에 포함되는 거의 모든 탄소원을 소모하고, 배양 48시간 동안 최대 세포 성장을 보이며(OD600=5.4±0.1), 배양 72시간에서 파이토엔을 가장 많이 생성하였다(4.3±0.1 ㎎/ℓ)(도 17). 즉, 상기 결과들을 토대로, 실시예 14의 변이 균주는 배양 72시간 동안 시간당 약 600 ㎍/ℓ의 파이토엔을 생성하는 것을 알 수 있었다.
<110> University of seoul Industry Cooperation Foundation <120> MANUFACTURING METHOD OF MUTANT STRAIN HAVING INCREASED PHYTOENE PRODUCTIVITY AND MUTANT STRAIN MANUFACTURED SAME <130> 2018P-03-015 <150> KR 2017-0040806 <151> 2017-03-30 <160> 45 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Lox66F <400> 1 gcttgatatc taccgttcgt atagcataca ttatacgaag ttat 44 <210> 2 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Lox71R <400> 2 tagaggatcc taccgttcgt ataatgtatg ctatacgaag ttat 44 <210> 3 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GroES <400> 3 cgtggcggcc gctcggcttg gaagcacgta tt 32 <210> 4 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GroER <400> 4 tacgggcagt aaattggaca tatccactag taacggccgc c 41 <210> 5 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CreF <400> 5 ggcggccgtt actagtggat atgtccaatt tactgcccgt a 41 <210> 6 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CreR <400> 6 agcttatcga taccgtcgac ctaatcgcca tcttccagca 40 <210> 7 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pKatF <400> 7 tgctggaaga tggcgattag gtcgacggta tcgataagct 40 <210> 8 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pKatR <400> 8 ccagtgattt ttttctccat atgctctcct tcgcctcgct 40 <210> 9 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CmK <400> 9 agcgaggcga aggagagcat atggagaaaa aaatcactgg 40 <210> 10 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CmR <400> 10 gcgactcgag gtcgactcta gaggatcctc 30 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 1 <400> 11 catagtgaaa gaaacgtctg 20 <210> 12 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 2 <400> 12 agcttatcga taccgtcgac gacagtaaac ctcggaagtc 40 <210> 13 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 3 <400> 13 gacttccgag gtttactgtc gtcgacggta tcgataagct 40 <210> 14 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 4 <400> 14 ttaagcggaa tccgtatgac catgcctgca ggtcgactct 40 <210> 15 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 5 <400> 15 agagtcgacc tgcaggcatg gtcatacgga ttccgcttaa 40 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 6 <400> 16 ttggtccaca tgctggtgca 20 <210> 17 <211> 1060 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> lox nucleic acid fragment <400> 17 gtcgacggta tcgataagct tgatatctac cgttcgtata gcatacatta tacgaagtta 60 tgaattcgag ctcgcatgga gaccgagggc ccttgacatt gagaatgatt ctcaatatgg 120 tgcagggagc ttcgggcctc ttgccgcgca gcagagccag cgaggcgaag gagagcatat 180 gagccatatt caacgggaaa cgtcttgctc gaagccgcga ttaaattcca acatggatgc 240 tgatttatat gggtataaat gggctcgcga taatgtcggg caatcaggtg cgacaatcta 300 tcgattgtat gggaagcccg atgcgccaga gttgtttctg aaacatggca aaggtagcgt 360 tgccaatgat gttacagatg agatggtcag actaaactgg ctgacggaat ttatgcctct 420 tccgaccatc aagcatttta tccgtactcc tgatgatgca tggttactca ccactgcgat 480 ccccgggaaa acagcattcc aggtattaga agaatatcct gattcaggtg 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agggcgatcg gtgcgggcct 2220 cttcgctatt acgccagctg gcgaaagggg gatgtgctgc aaggcgatta agttgggtaa 2280 cgccagggtt ttcccagtca cgacgttgta aaacgacggc cagtgaattc gagctc 2336 <210> 21 <211> 10227 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pAM2 plasmid <400> 21 tgtctaacaa ttcgttcaag ccgacgccgc ttcgcggcgc ggcttaactc aagcgttaga 60 tgcactaagc acataattgc tcacagcctc gcgaaccatc aagcttatcg ataccgtcga 120 ggaacctctt acgtgccaat caacgtctca ttttcgccaa aagttggccc agggcttccc 180 ggtatcaaca gggacaccag gatttattta ttctgcgaag tgatcttccg tcacaggtat 240 ttattcggtc gaaaaggatc taggtgaaga tcctttttga taatctcatg accaaaatcc 300 cttaacgtga gttttcgttc cactgagcgt cagaccccgt agaaaagatc aaaggatctt 360 cttgagatcc tttttttctg cgcgtaatct gctgcttgca aacaaaaaaa ccaccgctac 420 cagcggtggc ttgtttgccg gatcaagagc taccaactct ttttccgaag gtaactggct 480 tcagcagagc gcagatacca aatactgttc ttctagtgta gccgtagtta ggccaccact 540 tcaagaactc tgtagcaccg cctacagacc tcgctctgct aatcctgtta ccagtggctg 600 ctgccagtgg cgataagtcg tgtcttaccg ggttggactc aagacgatag ttaccggata 660 aggcgcagcg gtcgggctga acggggggtt cgtgcacaca gcccagcttg gagcgaacga 720 cctacaccga actgagatac ctacagcgtg agctatgaga aagcgccacg cttcccgaag 780 ggagaaaggc ggacaggtat ccggtaagcg gcagggtcgg aacaggagag cgcacgaggg 840 agcttccagg gggaaacgcc tggtatcttt atagtcctgt cgggtttcgc cacctctgac 900 ttgagcgtcg atttttgtga tgctcgtcag gggggcggag cctatggaaa aacgccagca 960 acgcggcctt tttacggttc ctggcctttt gctggccttt tgctcacatg ttctttcctg 1020 cgttatcccc tgattctgtg gataaccgta ttaccgcctt tgagtgagct gataccgctc 1080 gccgcagccg aacgaccgag cgcagcgagt cagtgagcga ggaagcggaa gaggatctag 1140 cacaagagcg gaaagatgtt ttgttctaca tccagaacaa cctctgctaa aattcctgaa 1200 aaattttgca aaaagttgtt gactttatct acaaggtgtg gcataatgtg tggaattgtg 1260 agcgctcaca attaagcttg aattcccggg cggccgctcg gcttggaagc acgtattgtc 1320 gccctacata tatacgttaa agctaacagc tggcaagggg atacccccat tccccgtccc 1380 agcgcccctt gagcgtcata gactcagatt gtcagcttcg gtcagttgac atttttctta 1440 tcggcgctct accatccgtg acggattgaa ggcgctgggc gggaaaaagc 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gtcagcaagc cgctcgccga cttcatgagc cgggcgaaaa actccacccg ccacttcttc 720 gaccccgcca gcgtcaaccc cttcgccgcg atgggcgtgc gctacgtcgg cccggtggac 780 ggccacaacg tgcaggaact ggtgtggctg ctcgaaagac tggtggacct cgatggcccg 840 accatcctcc acatcgtcac caccaagggc aagggcctga gctacgccga ggccgacccg 900 atctactggc acggcccggc caagttcgac ccggcgaccg gcgagtacgt gccgagcagc 960 gcctattcgt ggagcgccgc cttcggtgag gccgtgaccg agtgggcgaa gaccgacccg 1020 cgcaccttcg tcgtcacgcc cgccatgcgc gagggcagcg ggctggtcga attcagccgc 1080 gtacacccgc accgttacct cgacgtgggc atcgccgagg aagtcgcggt gacgacggcg 1140 gcgggcatgg cgctgcaagg gatgcggccc gtcgtcgcca tctactccac cttcctgcaa 1200 cgcgcctacg accaggtgtt gcacgacgtg gcgattgagc acctcaacgt caccttctgc 1260 atcgaccgcg cgggcatcgt gggggcggac ggggccacgc acaacggcgt gttcgacctc 1320 agcttcctgc gctctatccc cggcgtccgc atcgggctgc cgaaagacgc cgccgaactg 1380 cgcgggatgc tcaagtacgc ccagacgcac gacggcccct ttgccatccg ctacccgcgc 1440 ggcaatacgg cgcaggtgcc cgccgggacg tggccggacc tgaaatgggg cgagtgggaa 1500 cggctgaagg ggggcgacga cgtggtgatt ctggcgggcg gcaaggcgct cgactatgcc 1560 ttgaaggccg ccgaggacct ccccggtgtg ggcgtggtca atgcccgctt cgtcaagccg 1620 ctcgacgaag agatgctgcg cgaggtgggg ggccgggccc gcgccctgat tacggtggaa 1680 gacaacaccg tcgtcggcgg cttcgggggc gcggtgctcg aggcgctgaa cagcatgaac 1740 ctgcatccca ccgtgcgcgt tctcggcatt cccgacgagt ttcaggaaca cgccactgcc 1800 gagagcgtcc acgcccgcgc cggcatcgac gccccggcga ttcggacggt gctcgccgaa 1860 ctcggggtgg acgtgccgat tgaggtgtag 1890 <210> 45 <211> 1473 <212> DNA <213> Deinococcus radiodurans <400> 45 gtgatactgc tcccgctaca ctgcggccat gtgccctgtt tccctcccct ggagctgcct 60 gtgacccatg tggcggtgat cggggccggt ttctcagggc tggcggcggc cctgcggctg 120 gcccaggcag gggcgcaagt gacggtgctc gatgccctcg accggcccgg cggcaaggcg 180 gcgctcgggt acgacgattt ctccagcggg cccaccgtcg tcaccatgcc gcagattttc 240 gccgcgctgc acgcccgtct cggctgggac gctcccgcgc tgaccccggc gcaccccacc 300 accacgtacc acgcgctgag cgggcggaca tttgctcccg aggccctcaa cgtggtcggc 360 agtcttgacc ctaccatgac ccagctttcc cgcgcagaag ggcgacgtta 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gcacctcacg gcctgctcgg cagcctgcgc cccggctggc ggctcccgca ggcccgcaat 1320 ctcgttcagg tgggcgggac cgttcaccct ggcggcggcg ttccactgtc actcctctcc 1380 ggctggaacg gggcaggcag tttgcttgga ttggactacg actccctgga tggcgagaag 1440 gcatttggaa agcccgctcc agccatcaaa taa 1473

Claims (17)

1) 제1 선택마커를 포함하고 서열번호 17의 염기서열로 구성되는 lox 핵산 단편의 양 말단에 DR0861 유전자의 상부 및 하부 단편이 각각 융합된 DNA 구조체를 데이노코쿠스 속 균주에 도입하여 DR0861 유전자를 결실시키는 단계;
2) 상기 단계 1)의 DR0861 유전자가 결실된 균주에 groE 프로모터, cre 재조합 효소를 코딩하는 유전자, 제2 선택마커 및 온도 감수성 repUts를 포함하고 서열번호 21의 염기서열로 구성되는 벡터를 도입하여 제1 선택마커를 결실시키는 단계; 및
3) 상기 단계 2)에서 수득된 변이 균주를 배양하여 제2 선택마커를 포함하는 벡터를 제거하는 단계를 포함하는, cre-lox 시스템을 이용한 DR0861 유전자가 결실된 데이노코쿠스 속 변이 균주의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 DR0861 유전자가 서열번호 22의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드인, DR0861 유전자가 결실된 데이노코쿠스 속 변이 균주의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 단계 3)의 배양이 30 내지 40℃의 온도에서 수행되는, DR0861 유전자가 결실된 데이노코쿠스 속 변이 균주의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 데이노코쿠스 속 균주가 데이노코쿠스 라디오두란스인, DR0861 유전자가 결실된 데이노코쿠스 속 변이 균주의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 DR0861 유전자의 상부 및 하부 단편이 0.5 내지 1.2 kb의 길이를 갖는, DR0861 유전자가 결실된 데이노코쿠스 속 변이 균주의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 lox 핵산 단편이 lox71 및 lox66으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 lox 유전자를 단편의 양 말단에 포함하는, DR0861 유전자가 결실된 데이노코쿠스 속 변이 균주의 제조방법.
삭제
제1항에 있어서, 상기 groE 프로모터가 서열번호 19의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드인, DR0861 유전자가 결실된 데이노코쿠스 속 변이 균주의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 제1 및 제2 선택마커가 항생제 내성 유전자인, DR0861 유전자가 결실된 데이노코쿠스 속 변이 균주의 제조방법.
제9항에 있어서, 상기 항생제 내성 유전자가 카나마이신, 클로람페니콜, 스펙티노마이신 및 스트렙토마이신으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인, DR0861 유전자가 결실된 데이노코쿠스 속 변이 균주의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 제1 선택마커가 cre 재조합 효소의 발현에 의해 제거되는, DR0861 유전자가 결실된 데이노코쿠스 속 변이 균주의 제조방법.
삭제
제1항에 있어서, DR0862, DR1087, DR1395 및 DR1475로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자를 각각 발현하는 플라스미드를 도입하는 단계를 추가로 포함하는, DR0861 유전자가 결실된 데이노코쿠스 속 변이 균주의 제조방법.
제13항에 있어서, DR0862 및 DR1475 유전자를 각각 발현하는 플라스미드를 모두 도입하는 단계를 추가로 포함하는, DR0861 유전자가 결실된 데이노코쿠스 속 변이 균주의 제조방법.
제1항, 제13항 및 제14항 중 어느 한 항에 있어서, DR2250 유전자를 결실시키는 단계를 추가로 포함하는, DR0861 유전자가 결실된 데이노코쿠스 속 변이 균주의 제조방법.
제1항의 방법으로 제조된 DR0861 유전자가 결실된 파이토엔 생산능을 갖는 데이노코쿠스 속 변이 균주.
제16항의 변이 균주를 배양하는 단계를 포함하는 파이토엔 생산 방법.
KR1020180036883A 2017-03-30 2018-03-29 파이토엔 고생산능을 갖는 변이 균주의 제조방법 및 상기 방법으로 제조된 변이 균주 KR101927892B1 (ko)

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