KR20220153767A

KR20220153767A - 엔캡슐린 기반 뎅기 바이러스 또는 코로나 바이러스 백신 생산을 위한 재조합 발현 벡터 및 이의 제조방법

Info

Publication number: KR20220153767A
Application number: KR1020210061143A
Authority: KR
Inventors: 최덕영; 정현교
Original assignee: (주)인테라
Priority date: 2021-05-12
Filing date: 2021-05-12
Publication date: 2022-11-21
Also published as: CN116529256A; KR20230117543A

Abstract

본 발명은 엔캡슐린 단백질 및 이를 포함하는 융합 단백질에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 목적 단백질, 엔캡슐린 단백질 및 RID(RNA interacting domain) 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하여, 목적 단백질의 발현 효율을 증진시켜 고효율로 수용성의 백신을 생산할 수 있으며, 큰 크기의 목적단백질을 이용할 수 있는, 백신 생산용 재조합 발현 벡터 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

Description

엔캡슐린 기반 뎅기 바이러스 또는 코로나 바이러스 백신 생산을 위한 재조합 발현 벡터 및 이의 제조방법 {RECOMBINANT EXPRESSION VECTOR FOR PRODUCTION OF ENCAPSULIN-BASED DENGUE VIRUS OR CORONA VIRUS VACCINE AND METHOD FOR PREPARING THE SAME}

본 발명은 목적 단백질의 발현 효율을 증진시키기 위한 엔캡슐린 단백질 및 이를 포함하는 융합 단백질에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 목적 단백질, 엔캡슐린 단백질 및 RID(RNA interacting domain) 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하여 고효율로 수용성의 백신을 생산할 수 있으며, 큰 크기의 목적단백질을 이용할 수 있는, 백신 생산용 재조합 발현 벡터 및 이의 제조방법을 제공한다.

최근 급증하는 감염성 질환에 대한 효율적인 대응을 위한 신규 예방 백신의 개발과 신체가 이미 가지고 있는 질병(바이러스, 암 등)에 맞서 싸울 수 있도록 도와주는 치료용 백신의 개발이 활발하게 이루어지고 있다.

예방 백신(Prophylactic Vaccines)은 건강한 일반인을 대상으로 질병의 예방을 위한 백신으로 병원균을 주입하여 면역 반응을 유발하는 백신을 말하며, 치료 백신 (Therapeutic Vaccine)은 질병을 보유하고 있는 환자를 대상으로 질병 치료를 위해 면역체계를 강화 (self-antigen 주입 등)하는 백신으로, 암, 알츠하이머 등에 치료제가 될 수 있는 가능성으로 많은 연구 개발이 추진 중에 있다.

전통적인 백신들은 병원균 자체를 배양하는 공정을 기반으로 장기간의 계 대 배양을 통해 독성이 약화된 약독화(attenuated) 균주 또는 화합물 처리를 통해 불활화 (inactivated)된 균주를 사용하여 제조되어 왔다. 그러나 이경우 개발과 제조 기간이 너무 길고 배양이 어려운 병원균에 대한 백신 개발에는 적용이 불가능하다는 단점이 있다.

병원균 자체의 배양에 영향을 받지 않고 보다 효과적인 백신 제조를 위해 병원균 성분 중 특정 부위 단백질이나 변성된 독소만을 항원으로 사용하는 아단위 (subunit) 백신의 개발이 이루어 졌다. 이 경우 보다 높은 안전성이 확보되었다는 장점은 있으나 상대적으로 낮은 면역원성으로 인해 다 회 투여와 별도의 면역증강제 (adjuvant)가 필요하다는 단점 또한 가지고 있다.

보다 안전하면서도 높은 효능을 가진 백신의 개발을 위해서 최근 바이러스 유사 입체 (VLP, Virus-like Particle) 백신 제조 방법이 개발되었으며 기존 백신 생산 기술의 한계점을 뛰어넘을 수 있는 차세대 백신 제조 기술로서 각광받고 있다.

바이러스 유사 입체 (VLP)는 바이러스 구조 단백질을 야생형 바이러스와 겉모습이 유사한 구조를 나타내도록 특이적으로 발현시킨 것으로서 매우 복잡하고 정교한 구조물이다. 직경 20~100 nm의 사이즈를 가지며 다양한 종류의 유전자 재조합 단백질 발현 시스템을 이용하여 이미 서열이 알려진 바이러스의 구조 단백질들을 특이적으로 발현한 다음 중합체 형성 (virion assembly)을 통해 생산이 가능하다.

실제 감염성 바이러스와 유사한 구조와 동일한 외형을 갖추면서도 바이러스 유래 유전자가 없으므로 증식은 불가능한 반면 고밀도 정배열의 항원 표출 (high-density & highly ordered conformation)을 통해 높은 면역원성을 유도한다. 야생형 바이러스와 그 구조가 유사하기 때문에 체내에서 T-세포, B-세포 면역경로를 둘 다 자극할 수 있다는 장점이 있다. 또한, 형성된 구조물 안에 유전물질이 없으므로 감염 능력이 없어 높은 안전성을 가진다는 점과 뛰어난 구조적 안정성을 보인다는 것이 특징이다. 하지만 그 구조가 복잡하며 바이러스 별로 크게 상이한 특성을 보이므로 복잡한 제조 공정이 필요하거나 낮은 생산성 등의 이유로 인해 실제 상업용 백신으로서 허가된 VLP는 몇몇 사례에 불과한 실정이다.

보다 개선된 VLP 기반 백신의 제조를 위해 중합체 구조를 잘 형성하는 VLP 구조체에 외부 병원균 항원을 도입한 융합 바이러스 유사 입체 (chimeric VLP) 제조 기술이 개발되었으며 다양한 병원균을 대상으로 하는 백신 개발에 활용되어 왔다. 이는 다른 특정 바이러스의 구조 단백질 또는 자가 조립 (self-assembling) 단백질로 구성된 VLP 기반 구조의 표면에 외부 병원균 항원을 표출시킨 형태를 띄고 있다. VLP 기반 구조에 외부 항원을 도입하기 위해서는 화학적 결합 (chemical conjugation) 또는 유전적 융합 (genetic fusion) 방식이 사용된다. 화학적 결합 (chemical conjugation) 방식은 이미 제조된 VLP 기반 구조에 별도로 제조된 외부 항원을 공유 결합을 통해 화학적 융합을 시키는 것으로서 일정한 방향으로의 항원 정배열에 어려움이 있으며 표출되는 항원의 밀집도가 상대적으로 낮다는 단점이 지적되고 있다. 반면, 유전적 융합 (genetic fusion) 방식의 경우는 VLP 구조형성 단백질의 유전자와 목적 항원 단백질의 유전자를 DNA 레벨에서 융합 발현시킴으로써 보다 단순한 공정으로 융합 바이러스 유사 입체 (chimeric VLP)제조가 가능하다는 장점이 있다. 단, 이 경우는 10 ~ 20개 이하 아미노산으로 구성된 대단히 작은 크기의 외부 항원만 도입이 가능하며 그 보다 더 클 경우 구조적인 한계성으로 인한 입체적 간섭현상(steric hindrance) 때문에 구조 단백질에 의한 중합체 형성이 저해된다.

Thermotoga Maritima 유래의 엔캡슐린(Encapsulin) C-말단에 일정 크기 이상의 펩타이드 또는 단백질을 융합하여 발현시킬 경우 융합 단백질의 수용성이 현저하게 감소된다. 따라서, C-말단에 외부 항원 단백질을 엔캡슐린(Encapsulin)의 융합 발현을 통해 최종적으로 외부 항원이 표면에 노출된 VLP 중합체를 제조하기 위해서는 먼저, 융합 단백질의 고발현 및 수용성을 현저히 증가시켜주는 수용성 발현 표지 인자 (Soluble Expression Tag) 가 필수적으로 요구된다.

본 발명자들은 이전 연구에서 ARSNTD (aminoacyl RNA synthetase N-terminal domain)을 포함하는 RID (RNA interaction domain)를 결합파트너로 사용하였을 때 다양한 단백질의 단백질 접힘 및 수용성 증가에 관여한다는 것을 밝힌 바 있다.

본 발명에서는 높은 발현량과 수용성을 현저히 증가시켜주는 RID(RNA Interaction Domain)을 엔캡슐린(Encapsulin)의 N-말단에 융합하고 그 C-말단에 큰 분자량(약 25 kDa 이상)의 외부 항원을 융합한 융합단백질의 고효율 수용성 발현을 시도하였다. 그 결과로서, 엔캡슐린(Encapsulin) C-말단에 항원 단백질을 융합한 경우 본 실험의 수용성 표지 발현 인자를 N-말단에 추가하여 수용성이 큰 단백질을 얻을 수 있음을 확인하였다. 상기 융합 단백질은 refolding 과정을 거칠 필요 없이 정제 후 자가 조립 (assembly)을 통해 대량의 융합 바이러스 유사 입체 (chimeric VLP)를 신속하게 생산하는 것을 가능케 한다는 것을 확인하였다.

그 결과, 엔캡슐린(encapsulin) 단백질의 자가 조립 (self-assembly)을 통해 만들어지는 VLP 구조에 이전에는 불가능했던 큰 크기의 목적 항원 단백질을 보다 효율적이고도 안정적으로 표출할 수 있게 됨으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

하나의 적용 사례로서, 최근 사회적으로 대유행되고 있는 COVID-19의 바이러스를 예시로 들 수 있다. 코로나바이러스는 외피가 있는 비분절 양성가닥 RNA 바이러스로 사람에서 호흡기 감염을 일으키는 주요 감염체 중 하나이며 오류가 빈번한(error-prone) RNA-의존성 중합효소를 가지고 있어 감염체의 돌연변이에 대한 대응이 필요하다. 2019-nCoV로 규명된 중증 급성 호흡기 증후군 코로나 바이러스(SARS-CoV-2)는 높은 치사율을 유발하는 병원체이며 감염성이 높기 때문에 전세계에 발병된 코로나바이러스 유래의 COVID-19은 빠른 전파 속도와 높은 사망률을 보인다. 코로나 바이러스 2의 S 단백질은 I-Class 바이러스 융합 삼량체 당단백질이며, 숙주 세포의 바이러스 수용체에 결합하여 바이러스 침입 감수성의 주요 단백질을 결정하며, 수용체 결합 및 막 융합에서 역할을 수행한다. 이러한 기능을 갖는 S 단백질은 낮은 면역원성 및 낮은 수율의 한계를 갖기 때문에, 백신의 개발에 있어서는 수용체 결합 도메인 S 단백질의 수용체 결합 도메인(RBD)에 한정된 개발이 진행되고 있다. 널리 연구되고 있는 RBD 기반 백신의 경우에도 아단위 기반 백신의 개발에서 여전히 낮은 면역원성을 보인다. 또한, 백신 개발을 위해 단기간 생산 가능한 핵산 백신 플랫폼 기술인 mRNA 백신 기반 백신도 임상 3상에서 예방 효과를 보인다는 결과가 있으나, RNA 분해 효소에 의해 쉽게 주성분인 핵산이 분해되어 안정성이 좋지 않아 초저온 콜드체인의 유통이 필요한 실정이며, 낮은 안정성으로 인하여 생체 내 전달이 비효율적이라는 한계를 갖는다.

따라서, 본 발명의 핵심인 자가 조립 (self-assembling) 단백질로 구성된 VLP 기반 구조의 표면에 코로나바이러스의 수용체 결합 도메인(RBD)를 고밀도로 표출시킨 단백질 나노파티클의 제조 방법을 제공하고 특히, RID를 사용하여 대장균에서 고효율 생산을 가능케 함으로써 이 기술의 진보성을 입증하였고, 대유행을 통하여 대단히 많은 감염자와 사망자를 유발시킨 급성 유행성 감염병에 대한 보다 높은 면역 유도능을 갖춘 대응 백신의 단기간의 제조 및 이를 통한 신속한 공급을 가능케 해 줌에 있어 본 발명에 의의가 있다.

또 다른 주요 적용 사례는, 인도를 포함한 전세계 150개 이상의 국가에서 갑작스러운 고열과 더불어 심각한 건강 문제를 유발하는 뎅기열병의 원인이 되는 뎅기 바이러스(DENV)이다. 뎅기바이러스는 단일 가닥 양성 RNA 유전자와 외피를 갖고 있고, 4가지 혈청형인 Type1,2,3,4에 의해 대부분의 감염 발생 기간 동안 동시에 유행하는 뎅기열의 원인이 된다. 뎅기 바이러스의 주요 항원 단백질인 Envelope 단백질의 3개의 도메인 중 면역원성을 갖는 주요 항원인 도메인III(EDIII)에 대한 백신 연구가 진행 중이며, 뎅기 바이러스의 항원 단백질인 EDIII는 숙주 세포를 인식하여 중화항체를 형성한다. 뎅기 바이러스의 경우, 4가지 혈청형의 교차 면역 반응에 대한 잠재성이 매우 낮기 때문에, 전 세계에서 이를 극복하기 위하여 4가지 혈청형에 대한 4가 백신 개발을 진행 중이며, 불활화 카이메릭 생백신을 개발하여 임상 시험 중에 있으나, 바이러스 간섭 등의 제한으로 아단위 기반의 뎅기 바이러스 도메인 EDIII를 이용한 백신을 개발 중인 실정이다.

따라서, 본 발명의 핵심인 자가 조립 (self-assembling) 단백질로 구성된 VLP 기반 구조의 표면에 뎅기 바이러스의 EDIII 단백질을 고밀도로 표출시킨 단백질 나노 파티클의 제조 방법을 제공하고 특히, RID를 사용하여 대장균에서 고효율 생산을 가능케 함으로써 이 기술의 진보성을 입증하였고, 최근 10년 동안 발병률이 증가하고 있으나 아직까지 효율적인 백신의 개발이 이루어지지 못한 전형적인 바이러스성 감염 질환의 백신 수요를 충족하게 해 줄 수 있다는 데에 있어서 본 발명에 의의가 있다.

본 발명은 이러한 감염성 병원체에 의한 감염의 방지 및 감염의 중증도 저하를 위한 향후 지속적인 신규 및 급성 유행성 병원체의 위협에 대비를 위한 적절한 해결책을 제시하고 있다.

본 발명의 목적은 큰 크기의 목적 단백질을 보다 효율적이고 안정적으로 표출할 수 있으며, 엔캡슐린 단백질과 목적 단백질의 융합 단백질을 고효율로 수용성 발현시킬 수 있는 벡터를 제공하는 것이며, 뎅기바이러스 또는 코로나 바이러스 등의 바이러스 항원 단백질을 목적단백질로 이용하여 뎅기 바이러스에 의한 뎅기열 또는 코로나 바이러스에 의한 호흡기 감염증 등의 예방 또는 치료에 이용할 수 있는 융합단백질을 제공하는 것이다.

상술한 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 엔캡슐린 단백질 및 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 백신 생산용 재조합 발현 벡터를 제공한다.

본 발명은 또한, 목적 단백질, 엔캡슐린 단백질 및 RID(RNA interacting domain) 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 백신 생산용 재조합 발현 벡터를 제공한다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 폴리뉴클레오타이드는 RID의 절단을 위하여 TEV 단백질을 추가로 코딩할 수 있다.

본 발명은 또한, 목적 단백질, 엔캡슐린 단백질 및 RID(RNA interacting domain) 단백질을 포함하는 융합단백질을 제공한다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 목적 단백질은 엔캡슐린 단백질의 C-말단에 연결될 수 있다.

본 발명은 또한 a) 목적 단백질; 엔캡슐린 단백질; 및 RID 단백질;을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 바이러스 백신 생산용 재조합 발현 벡터를 생산하는 단계, b) 상기 발현 벡터를 숙주세포에 도입하여 형질전환체를 생산하는 단계 및 c) 상기 형질전환체를 배양하여 재조합 융합 단백질의 발현을 유도하고, 이를 수득하는 단계를 포함하는 백신 생산방법을 제공한다.

본 발명의 일 실시예에 따르면 상기 RID 단백질은 생산되는 백신의 발현량 증가 또는 수용성 증가시키기 위한 융합파트너로 사용될 수 있다.

본 발명의 다른 실시예에 따르면, 상기 RID 단백질은 서열번호 5, 서열번호 6 또는 서열번호 7의 아미노산 서열 또는 이의 일부 서열을 포함할 수 있다.

본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 상기 발현 벡터로 형질 전환된 숙주세포가 제공되며, 본 발명에 있어서 숙주세포는 대장균(E. coli)을 이용할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 엔캡슐린 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 이의 일부 서열을 포함할 수 있다.

본 발명의 다른 실시예에 따르면, 상기 목적 단백질은 바이러스 항원 단백질, 항체, 세포수용체, 효소, 구조 단백질, 혈청 및 세포 단백질로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택될 수 있다.

본 발명의 또 다른 실시예에 다르면, 상기 바이러스 항원 단백질은 코로나 바이러스 항원 단백질 또는 뎅기 바이러스 항원 단백질일 수 있다.

본 발명에 따라 제조된 융합단백질은, 큰 크기의 목적 단백질을 보다 효율적이고 안정적으로 표출할 수 있는 장점이 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 신규 융합파트너로 RID를 포함하여 엔캡슐린과 목적단백질의 융합단백질을 고효율로 수용성 발현시킬 수 있는 장점이 있다.

본 발명에 따라 제조된 융합단백질은, 야생형 바이러스와 구조가 유사하여 체내에서 T-세포 및 B-세포 면역 경로를 모두 자극할 수 있어 면역효과가 크다.

본 발명에 따라 제조된 융합단백질은, 목적 단백질을 뎅기 바이러스 항원 단백질로 할 수 있으며, 이를 이용하여 뎅기열을 예방 또는 치료할 수 있다.

본 발명에 따라 제조된 융합단백질은, 목적 단백질을 코로나 바이러스 항원 단백질로 할 수 있으며, 이를 이용하여 코로나바이러스 감염증을 예방 또는 치료할 수 있다.

본 발명의 백신 생산 방법에 따르면, 대량의 융합단백질을 신속하게 생산하여 백신 생산 시간을 단축할 수 있다.

도 1은 본 발명의 실시예에 따른 엔캡슐린(Encapsulin) 단백질 생산용 재조합 발현 벡터의 모식도와 고효율 수용성 단백질의 발현 결과이다. 도 1a는 PDB를 이용하여 예측한 엔캡슐린(Encapsulin)의 단백질 구조이다. 도 1b는 pET9a-Encapsulin 재조합 발현 벡터의 구조를 나타낸 모식도이다. 도 1c는 상기 발현 벡터를 이용하여 엔캡슐린(Encapsulin) 단백질의 고효율 수용성 발현 여부를 SDS-PAGE로 확인한 결과이다.
도 2a는 본 발명의 실시예에 따라 발현된 Encapsulin-Linker 단백질을 니켈 친화성 크로마토그래피를 통해 정제하였을 때의 크로마토그램 결과이며, 도 2b는 Encapsulin-Linker 단백질의 분리 양상을 SDS-PAGE로 확인한 결과이다. 도 2c은 니켈 친화성 크로마토그래피에서 용출된 엔캡슐린(Encapsulin) 단백질을 이온 수지 교환 크로마토그래피를 통해 정제하였을 때의 크로마토그램 결과이며, 도 2d는 니켈 친화성 크로마토그래피에서 용출된 엔캡슐린(Encapsulin) 단백질의 정제 양상을 SDS-PAGE로 확인한 결과이다.
도 3a는 정제된 엔캡슐린(Encapsulin) 단백질을 크기 배제 크로마토그래피를 진행한 후의 용출그래프이다. 도 3b는 크기 배제 크로마토그래피를 수행 후 엔캡슐린(Encapsulin) 단백질의 분리 양상을 SDS-PAGE로 확인한 결과이다. 도 3c 및 3d은 정제된 엔캡슐린(Encapsulin) 단백질 입체의 직경 분포를 DLS(Dynamic Light Scattering)를 통해 분석한 결과이다. 도 3e는 정제된 엔캡슐린(Encapsulin) 기반 VLP(Virus-like particle)의 전체적인 외형을 투과전자현미경(TEM)을 통하여 확인한 결과이다.
도 4a는 본 발명의 실시예에 따른 코로나 바이러스 RBD 항원을 표출하는 엔캡슐린(Encapsulin) 기반 바이러스 유사 입체를 제조하기 위하여 발현량 및 수용성 증진 융합파트너인 RID와 적정 서열의 효소 절단 부위 및 연결 부위를 Encapsulin CoV RBD 융합 단백질에 적용하여 발현하는 전략을 도시한 것이다. 도 4b는 도 4a에 해당하는 발현 벡터의 구조를 나타내며, 발현량 및 수용성 증진 융합파트너인 MSAVKAA-RID 및 TEV Cleavage 효율을 위한 추가 서열을 삽입한 pET9a-MSAVKAA-RID-Linker1-TEV-Linker2-Encapsulin-Linker3-Coronavirus RBD의 벡터 구조에 해당한다.
도 5는 발현량 및 수용성 증진 융합파트너인 RID의 적용 여부에 따른 엔캡슐린(Encapsulin)과 목적 단백질의 융합 단백질의 수용성 발현에 미치는 영향을 확인한 결과이다. 엔캡슐린의 C말단에 코로나 바이러스 (2019-nCoronavirus, CoV)의 항원인 RBD(크기 23.6 kDa)를 융합한 단백질의 경우, 단백질은 불용성 발현 양상을 보이는 반면, 그 N-말단에 RID를 융합하여 발현시키면 대부분이 수용성으로 발현되는 것을 확인한 결과를 SDS-PAGE를 통하여 확인하였다.
도 6a는 본 발명의 실시예에 따라 발현된 RID-Encapsulin-Linker3-CoV RBD 단백질(크기 66.4 kDa)을 니켈 친화성 크로마토그래피를 통해 정제하였을 때의 크로마토그램 결과이며, 도 6b는 RID-Encapsulin-Linker3-CoV RBD 단백질의 분리 양상을 SDS-PAGE로 확인한 결과이다. 도 6c은 니켈 친화성 크로마토그래피에서 N-말단의 RID와 TEV 절단 부위를 분리하여 Encapsulin-Linker3-CoV RBD 단백질 융합체를 정제하였을 때의 크로마토그램 결과이며, 도 6d는 Encapsulin-Linker3-CoV RBD 단백질을 TEV 효소 처리 및 2차 니켈 친화성 크로마토그래피에 이르기까지의 정제 과정에서의 융합 단백질의 정제 양상 및 순도를 확인한 SDS-PAGE 결과이다. 도 6e은 니켈 친화성 크로마토그래피에서 Encapsulin-Linker3-CoV RBD 단백질 융합체를 이온 교환 수지 크로마토그래피를 통해 정제하였을 때의 크로마토그램 결과이며 도 6f는 융합 단백질의 정제 양상 및 순도를 확인한 SDS-PAGE 결과이다.
도 7a은 정제된 엔캡슐린(Encapsulin) 단백질-목적단백질 융합체의 VLP의 전체적인 직경 분포를 확인하기 위하여 DLS(Dynamic Light Scattering)를 통해 분석한 결과를 나타낸 것이다. 도 7b는 정제된 투과전자현미경(TEM)을 통하여 표면에 목적 단백질이 표출된 엔캡슐린(Encapsulin) 기반 융합 단백질의 VLP의 전체적인 외형을 확인한 결과이다.
도 8a은 본 발명의 실시예에 따른 뎅기 바이러스의 EDIII 항원 단백질을 표출하는 엔캡슐린(Encapsulin) 단백질 기반 바이러스 유사 입체 및 이에 의해 제조된 백신의 모식도이다. 도 8b는 도 8a에 해당하는 발현 벡터의 구조를 나타내며, 발현량 및 수용성 증진 융합파트너인 MSAVKAA-RID 및 TEV Cleavage 효율을 위한 추가 서열을 삽입한 pET9a-MSAVKAA-RID-Linker1-TEV-Linker2-Encapsulin-Linker3-Dengue virus EDIII 벡터 구조의 이미지이다. 발현량 및 수용성 증진 융합파트너인 RID를 적용하였을 때 엔캡슐린(Encapsulin) 단백질과 목적 단백질의 융합 단백질의 융합 발현에 미치는 영향을 도9 및 도10의 결과를 통하여 확인하였다.
도 9는 발현량 및 수용성 증진 융합파트너인 RID의 적용 여부에 따른 엔캡슐린(Encapsulin)과 목적 단백질의 융합 단백질의 수용성 발현에 미치는 영향을 확인한 결과이다. 엔캡슐린의 C말단에 뎅기 바이러스 (Dengue virus, DENV)의 항원인 EDIII(크기 11.4 kDa)를 융합한 단백질의 경우, 단백질은 불용성 발현 양상을 보이는 반면, 그 N-말단에 RID를 융합하여 발현시키면 대부분이 수용성으로 발현되는 것을 확인한 결과를 SDS-PAGE를 통하여 확인하였다.
도 10a는 본 발명의 실시예에 따라 발현된 RID-Encapsulin-Linker3-DENV EDIII 단백질(크기 53.1 kDa)을 니켈 친화성 크로마토그래피를 통해 정제하였을 때의 크로마토그램 결과이며, 도 10b는 RID-Encapsulin-Linker3-DENV EDIII 단백질의 분리 양상을 SDS-PAGE로 확인한 결과이다. 도10c은 니켈 친화성 크로마토그래피에서 N-말단의 RID와 TEV 절단 부위를 분리하여 Encapsulin-Linker3-DENV EDIII 단백질 융합체를 정제하였을 때의 크로마토그램 결과이며, 도 10d는 Encapsulin-Linker3-DENV EDIII 단백질을 TEV 효소 처리 및 2차 니켈 친화성 크로마토그래피에 이르기까지의 정제 과정에서의 융합 단백질의 정제 양상 및 순도를 확인한 SDS-PAGE 결과이다. 도 10e는 니켈 친화성 크로마토그래피에서 Encapsulin-Linker3-DENV EDIII 단백질 융합체를 이온 교환 수지 크로마토그래피를 통해 정제하였을 때의 크로마토그램 결과이며 도 10f는 융합 단백질의 정제 양상 및 순도를 확인한 SDS-PAGE 결과이다.
도 11a는 정제된 엔캡슐린(Encapsulin) 단백질-목적단백질 융합체의 VLP의 전체적인 직경 분포를 확인하기 위하여 DLS(Dynamic Light Scattering)를 통해 분석한 결과를 나타낸 것이다. 도 11b는 정제된 투과전자현미경(TEM)을 통하여 표면에 목적 단백질이 표출된 엔캡슐린(Encapsulin) 기반 융합 단백질의 VLP의 전체적인 외형을 확인한 결과이다.

이하, 본 발명의 바람직한 실시예를 상세히 설명한다. 본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 후술되어 있는 실시 예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 게시되는 실시 예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 수 있으며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 게시가 완전하도록 하고, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다. 명세서 전체에 걸쳐 동일 참조 부호는 동일 구성 요소를 지칭한다.

다른 정의가 없다면, 본 명세서에서 사용되는 모든 용어(기술 및 과학적 용어를 포함)는 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 공통적으로 이해될 수 있는 의미로 사용될 수 있을 것이다. 또 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 용어들은 명백하게 특별히 정의되어 있지 않는 한 이상적으로 또는 과도하게 해석되지 않는다. 본 명세서에서 사용된 용어는 실시예들을 설명하기 위한 것이며 본 발명을 제한하고자 하는 것은 아니다. 본 명세서에서, 단수형은 문구에서 특별히 언급하지 않는 한 복수형도 포함한다.

본 발명은 엔캡슐린 단백질 및 목적 단백질을 코딩하는 폴리 뉴클레오타이드를 포함하는, 백신 생산용 재조합 발현 벡터를 제공한다.

본 명세서에서 “엔캡슐린 단백질”은 목적 단백질에 융합되어 함께 발현됨으로써 단백질의 발현 효율을 증진시킬 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 따르면 상기 엔캡슐린 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 이의 일부 서열을 포함한다.

본 발명에 사용된 엔캡슐린(encapsulin) 단백질은 Thermotoga maritima, Pyrococcus furiosus, Myxococcus xanthus 등으로부터 수득할 수 있으며, 가장 바람직하게는 Thermotoga maritima로부터 수득할 수 있다. Thermotoga maritima로부터 수득한 엔캡슐린(encapsulin) 단백질을 이용하는 경우, 작은 크기의 파티클(particle)을 형성할 수 있어 백신으로 사용하기에 더욱 유리하다.

본 발명의 엔캡슐린(encapsulin) 단백질은, 약 60여개가 자가 조립되어 직경 30~32nm 크기의 파티클(particle)을 형성할 수 있다. 이는 pH 변화와 온도 변화에도 안정적인 형태를 유지할 수 있는 장점이 있다. 따라서 다양한 카고(cargo) 단백질 또는 물질을 탑재할 수 있으며 노출된 표면 domain (바람직하게는 C-terminal)에 다양한 항원을 부착할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 재조합 발현 벡터는 엔캡슐린(encapsulin) 단백질을 이용함으로써, 박테리아 외 다양한 효모 또는 배양세포에서도 발현, 자가조립 가능하다.

본 명세서에서 사용된 용어 “목적 단백질(target protein)”은 당업자가 대량으로 생산하고자 하는 단백질로서, 재조합 발현벡터에 상기 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 삽입하여 숙주세포에서 발현 가능한 단백질을 의미한다.

본 발명의 일 실시예에 따르면 상기 목적 단백질은 바이러스 항원 단백질, 항체, 세포수용체, 효소, 구조 단백질, 혈청 및 세포 단백질을 포함한다. 본 발명의 바람직한 일 실시예에 따르면 상기 바이러스 항원 단백질은 서열번호 2, 서열번호 3의 아미노산 서열 또는 이의 일부 서열을 포함한다.

본 발명에 따르면, 목적 단백질에 해당하는 바이러스 항원 단백질에는, 코로나 바이러스 항원 단백질, 뎅기 바이러스 항원 단백질이 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다. 예를 들어, 아미노산 10개 내지 300개의 크기를 갖는 항원 단백질일 수 있으며, 바람직하게는 아미노산 20개 내지 223개 크기의 바이러스 항원 단백질일 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 뎅기 바이러스는 혈청형에 따라 4가지 이상의 항원 단백질을 형성할 수 있으며, 예를 들어 하기 서열번호 3(Dengue virus Type 2 EDIII (KP406804.1)), 서열번호 11(Dengue　Virus　Type　1　EDIII　(EF654110.1)), 서열번호 12(Dengue　Virus　Type　3　EDIII　(KP406805.1)), 서열번호 13(Dengue　Virus　Type　4　EDIII　(KP406806.1))에 표시된 것과 같다.

본 명세서에 사용된 용어 "발현 벡터"는 발현 벡터의 전사에 제공되는 추가단편에 작동 가능하게 연결된 목적(타겟) 단백질을 암호화하는 단편으로 구성되는 선형 또는 원형의 DNA 분자이다. 그와 같은 추가 단편은 프로모터 및 종료암호 서열을 포함한다. 발현 벡터는 하나 이상의 복제 개시점, 하나 이상의 선택 마커 등을 또한 포함한다. 발현 벡터는 일반적으로 플라스미드 또는 바이러스 DNA로부터 유도되거나 또는 둘 다의 요소를 함유한다. 본 명세서에서 사용된 용어 “작동 가능하게 연결된”은 프로모터에서 전사가 개시하고 암호화 서열을 통해 종료암호로 진행하는데 작용하도록 단편이 배열되는 것을 나타낸다.

본 발명에 따른 발현벡터에 있어서, 상기 발현벡터는 플라스미드, 바이러스 벡터, 파지 입자 또는 게놈 삽입물일 수 있다. 상기 발현벡터는 숙주세포 내로 형질전환된 후, 숙주세포의 게놈과 무관하게 복제되거나 숙주세포의 게놈 내로 통합될 수 있다.

본 발명은 또한, 목적 단백질, 엔캡슐린 단백질 및 RID(RNA interacting domain) 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 백신 생산용 재조합 발현 벡터를 제공한다. 본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 폴리뉴클레오타이드는 “링커(Linker)”를 추가로 코딩할 수 있으며, 상기 목적 단백질, 엔캡슐린 단백질 및 RID(RNA interacting domain) 단백질의 사이에는 각각 적어도 하나의 링커(Linker) 단백질이 위치할 수 있다.

상기 링커의 아미노산 서열에는, 적어도 하나의 글리신(glycine), 세린(serine)을 포함될 수 있다. 상기 링커(Linker)는 서열번호 8, 9 또는 10의 유전자서열을 포함할 수 있으며, 각각의 위치는 한정되지 않으나, 항원 단백질과 엔캡슐린 단백질 사이에 서열번호 10의 유전자 서열을 포함하는 링커 단백질이 위치하는 것이 바람직하다.

본 명세서에서 사용된 용어 “RID”,“RNA interacting domain”, “N terminal appended RNA binding domain of Lysyl tRNA synthetase)”, 또는 “LysRS RNA 결합 도메인(LysRS RNA interacting domain)”는 LysRS의 RNA와 기타 단백질간의 상호작용에 관여하는 고유한 N-말단(N-terminal) 연장부위를 의미한다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 RID 단백질은 상기 백신의 발현량 증가 또는 수용성 증가시키기 위한 융합파트너로 이용될 수 있다.

본 발명의 바람직한 일 실시예에 따르면, 상기 RID 단백질은 백신의 발현량을 증가시키기 위한 도메인(이하 EE 도메인) 및 수용성을 증가시키기 위한 도메인(이하 SE 도메인)을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 EE도메인은 서열번호 5의 아미노산 서열 또는 이의 일부 서열을 포함할 수 있으며, 상기 SE 도메인은 서열번호 6 또는 서열번호 7의 아미노산 서열 또는 이의 일부 서열을 포함할 수 있다.

본 발명의 백신 생산용 재조합 발현 벡터에 있어서, 단백질 절단효소는 TEV일 수 있다.

본 발명의 바람직한 일 실시예에 따르면 목적 단백질을 코딩하는 폴리 뉴클레오타이드는 RID의 절단을 위해 TEV 단백질을 코딩할 수 있다.

본 발명은 또한 상기 발현 벡터로 형질 전환된 숙주세포를 제공한다.

본 명세서에서 사용된 용어 “형질전환” 또는 “도입”은 DNA를 숙주로 도입하여 DNA가 염색체외 인자로서 또는 염색체 통합 완성에 의해 복제 가능하게 되는 것을 의미한다. 본 발명에 따른 발현벡터를 형질 전환시키는 방법은 전기천공법(electroporation), 인산칼슘(CaPO4)법, 염화칼슘(CaCl2)법, 미세주입법 (microinjection), 폴리에틸렌글리콜(PEG)법, DEAE-덱스트란법, 양이온 리포좀법 또는 초산 리튬-DMSO법을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 따른 숙주세포에 있어서, 상기 숙주세포는 DNA의 도입효율이 높고, 도입된 DNA의 발현 효율이 높은 숙주세포가 바람직하며, 원핵 및 진핵을 포함한 모든 미생물이 사용될 수 있다. 바람직하게는, 상기 숙주세포는 대장균(E. coli)일 수 있다.

본 발명은 또한, 목적 단백질 및 엔캡슐린 단백질을 포함하는 융합단백질을 제공하며, 상기 융합단백질은 RID(RNA interacting domain) 단백질을 더 포함할 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어 “융합 단백질(fusion protein)”은 목적 단백질 서열의 N-말단 또는 C-말단에 다른 단백질이 연결되거나 다른 아미노산 서열이 부가된 단백질을 의미한다. 본 발명의 바람직한 일 실시예에 따르면 상기 목적 단백질은 엔캡슐린 단백질의 C-말단(C-terminal)에 연결될 수 있다. 또한, 본 발명에서 상기 융합 단백질은, 본 발명의 재조합 발현 벡터에 의해 생산된 백신일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 재조합 발현 벡터를 이용하여 융합 단백질을 형성할 수 있으며, 상기 융합 단백질은 그 자체로, 또는 임의의 추가 공정을 거쳐 백신으로 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 엔캡슐린(encapsulin) 단백질은 목적 단백질의 발현 효율을 향상시킬 수 있으며, 또한 수용성 증진 단백질로 잘 알려진 RID에 상기 엔캡슐린 단백질을 결합한 융합 단백질은 목적 단백질의 발현 효율뿐만 아니라 수용성을 향상시킴으로써, 융합 단백질의 생산에 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, a) 목적 단백질; 및 엔캡슐린 단백질;을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 바이러스 백신 생산용 재조합 발현 벡터를 생산하는 단계, b) 상기 발현 벡터를 숙주세포에 도입하여 형질전환체를 생산하는 단계 및 c) 상기 형질전환체를 배양하여 재조합 융합 단백질의 발현을 유도하고, 이를 수득하는 단계를 포함하는 백신 생산방법이 제공된다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다.

이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

[실시예 1]

엔캡슐린(Encapsulin)을 포함하는 융합 단백질의 제조

<실시예 1-1>

엔캡슐린(Encapsulin)을 포함하는 융합 단백질의 고효율 생산을 위하여 도 1a의 단백질 구조를 갖는 Thermotoga Maritama 유래 Encapsulin (Thermotoga maritima MSB8 (Sequence ID: NC_000853, Protein ID: WP_004080898.1)) 유전자 서열이 이용되었다 (서열번호 1). 상기 유전자 서열에 기초하여 대장균에서 코돈 최적화 후 합성된 유전자 서열을 제조하였다 (서열번호 1). (실시예 1-1의 상기 유전자 서열은 ㈜바이오닉스에 Encapsulin 유전자 합성 의뢰하여 제조하였다.) 이후, 엔캡슐린(Encapsulin)의 정제 목적으로 HIS tag을 포함하는 서열의 연결 부위를 C-말단에 삽입하였다. (아미노산 서열 GGGSGGGSHHHHHHGGGS, (HHHHHH: 6xHIS tag에 해당하는 아미노산)) 상기 제조된 복합체는 “ENC”로 명명한다. 상기 서열의 유전자는 pET-9a (Novagene, 69431-3CN) (서열번호 4) 발현 벡터의 MCS 내에 존재하는 절단 효소인 NdeI와 BamHI를 사용하여 삽입하였다.

<실시예 1-2>

상기 실시예 1-1에서 제작된 발현 벡터를 HMS174 competent cell (Novagen (RecA mutation in a K-12 strain, Cat: 69453-3))에 형질 전환하였다. 모든 형질 전환된 대장균은 50 μg/ml 카나마이신 (Kanamycin)이 포함된 3ml의 LB 배지에서 37℃에서 250rpm으로 5-7시간 배양한 후 1ml을 10ml에 옮겨 10배 희석한 후 추가 배양하였다. 약 2-4시간 후 O.D600 0.8~0.9에 도달하였을 때 0.4mM IPTG (Biosesang, Cat#I1006, Lot#LB0C0340, cas#367-93-1)를 첨가한 뒤 16℃에서 17-19시간(최대 21시간) 동안 배양하였다. 배양액은 원심 분리를 통하여 침전된 대장균만을 수득하여 -80℃ 초저온 냉동 보관하였다. 3 ml의 배양 배지에 해당되는 대장균 수확물에 0.3 ml의 용해 완충 용액(50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 5% glycerol, 0.1% Triton X-100 및 10 mM imidazole)을 넣고 초음파 분쇄 후 전체 용해물(T, Total lysate)을 원심 분리를 통하여 침전물(P, Precipitant)과 상등액 (S, Soluble lysate)으로 분리한 다음 분리된 단백질을 SDS-PAGE로 분석하였다.

도 1은 실시예 1-1에 따른 엔캡슐린(Encapsulin) 단백질 생산용 재조합 발현 벡터의 모식도와 고효율 수용성 단백질의 발현 결과이다. 도 1a는 PDB를 이용하여 엔캡슐린(Encapsulin)의 예측되는 단백질 구조이며, 도 1b는 pET9a-Encapsulin 재조합 발현 벡터의 구조를 나타낸 모식도이다. 도 1c에 나타난 바와 같이 상기 발현 벡터를 이용하여 엔캡슐린(Encapsulin) 단백질의 고효율 수용성 발현 여부를 SDS-PAGE로 확인하였다. 실시예 1-1 및 1-2에 따라 발현된 단백질은 32.1kDa의 크기로 대장균에서 수용성 발현이 된 것을 확인할 수 있었다.

<실시예 1-3>

실시예 1-2와 동일한 방식의 배양 방법을 이용하여 500 ml의 대장균을 배양 및 발현을 유도하여 수득한 세포를 75ml의 lysis buffer [A 버퍼 [50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 5% glycerol, 0.1% Triton X-100 및 10 mM imidazole]로 재현탁하였다. 상기 세포 재현탁물을 초음파세포 파쇄기(sonication: pulse 3s/17s, 35% amplitude, 1min 30s, 4times total)를 이용하여 세포를 분쇄시켰다. 상기 용해된 세포를 4℃에서 13500rpm으로 10분동안 원심분리하고, 상층액을 취하여 AKTA(GE healthcare)을 이용하여 Ni+-친화 크로마토그래피를 수행하였다. 먼저, 양이온-교환 수지 컬럼인 HisTrap HP(GE Healthcare Life Sciences, Little Chalfont, Buckinghamshire, UK, 5mL size)컬럼을 완충액 A(50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 5% glycerol, 0.2% Tween-20 및 10 mM imidazole)로 평형화시킨 다음, 수용성 단백질을 포함한 수용성 용해액을 1ml/분의 유속으로 상기 평형화된 컬럼에 적재하였다. 엔캡슐린(Encapsulin) 단백질의 정제는 완충액 A 및 1M의 이미다졸을 포함한 완충액 B(50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 5% glycerol, 0.2% Tween-20 및 1M imidazole)를 이용하여 이미다졸이 10mM 내지 1M 농도 범위에서 선형 농도 구배로 증가 주입되는 형태로 수행되었으며, 이를 통해 각각 2ml씩의 분획들을 수득하였다.

도 2a 및 2b에 나타난 바와 같이 상기 용출물을 SDS-PAGE를 통해 엔캡슐린(Encapsulin) 단백질의 분리 양상을 확인 후 해당 분획의 용출물을 투석 버퍼 (50 mM Tris-HCl (pH 8.5), 10 mM NaCl, 0.2% Tween-20)에 9℃에서 18시간 동안 투석하였다.

1차 정제 및 Dialysis 이후의 엔캡슐린(Encapsulin) 단백질이 VLP를 형성하는지 여부를 확인하기 위한 생화학적 분석을 수행하였으며, 크로마토그래피 (Ion Exchange Chromatography)를 수행하였다. 상기의 투석에 의해 수득한 엔캡슐린(Encapsulin) 단백질들은 FPLC 시스템(AKTA, GE healthcare)을 이용하여 이온 교환 수지 크로마토그래피로 정제하였다. 컬럼(HiTrap Q FF, 1mL size (GE Healthcare Life Sciences, Little Chalfont, Buckinghamshire, UK)은 완충 용액 A(50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 10 mM NaCl, 5% glycerol, 0.2% Tween-20)으로 평형화되었으며, 1ml/분의 유속으로 로딩하였다. 엔캡슐린(Encapsulin) 단백질은 10mM 내지 1M의 선형 농도 구배를 갖는 NaCl을 주입하여 용출하였으며, 완충 용액 A와 완충 용액 B(50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 1M NaCl, 5% glycerol, 0.2% Tween-20)를 통해 선형 농도 구배를 통한 정제를 진행하였으며, 각각 1ml씩의 분획들을 수득하였다.

선형 농도 구배 (linear gradient; 10mM → 1M NaCl)을 통한 이온 교환 수지 크로마토그래피를 통하여 대장균 유래의 다른 단백질 등이 정제된 융합 단백질을 획득하였다 (도 2c 및 도 2d). 정제된 엔캡슐린(Encapsulin) 단백질은 20% 글리세롤(glycerol) 비율을 포함한 상태로 4℃에서 보관하였다.

추가적으로, 크기 배제 크로마토그래피(SEC)를 이용한 정제를 진행하였다. 분석은 FPLC 시스템 (AKTAPurifier, GE Healthcare)를 이용하여 실험을 수행하였다 (도 3a및 도 3b). 상기 준비된 샘플을 투석 용액과 같은 조건의 완충용액 (50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 10 mM NaCl, 5% glycerol)으로 평형화된 겔-여과 컬럼 (SuperoseTM 6 Increase 10/300 GL (GE Healthcare Life Sciences))에 통과하여 용출시켰다. 크기배제 크로마토그래피의 용출 패턴은 280nm의 파장으로 측정되었으며, Unicorn 프로그램 (GE Healthcare Life Sciences)을 사용하여 수집하였다.

도 3b에 보여지는 바와 같이, 대장균에서 고효율로 수용성 발현된 엔캡슐린(Encapsulin) 단백질의 최종 정제를 확인하였으며, 최종적으로 정제된 단백질의 농도는 BSA(Amresco, Solon, OH, USA)를 이용하여 정량하였다.

<실시예 1-4>

정제된 엔캡슐린(Encapsulin) 단백질을 포함하는 융합 단백질(VLP)의 전체적인 직경 분포를 확인하기 위하여 동적광산란(Dynamic Light Scattering, DLS)을 통하여 분석하였다. 상기 복합체의 분석은 DLS (Particular Systems, Zetasizer Nano Family)를 이용하여 16℃의 온도 조건으로 샘플 1mL을 Cuvette에 넣어 측정하였다. 세포의 동적광산란 분석은 이미지에서 각 영역별 total intensity 및 Mass 등을 이용하여 확인하였다. 도 3c 및 도 3d와 같이 DLS의 Hydrodynamic Radius에서의 직경이 야생형 엔캡슐린(Encapsulin)가 보이는 30~40nm와 비슷한 크기로 나타나는 것을 확인하였다.

<실시예 1-5>

정제된 엔캡슐린(Encapsulin) 단백질을 포함하는 융합단백질(VLP)의 외형을 전자 현미경으로 관찰하였다. 정제된 Encapsulin VLP를 먼저 구리 그리드에 1분 간 올린 뒤 2% 아세트산 우라닐(uranyl acetate)를 이용하여 1분 간 염색하였고 10분 간 상온에서 건조한 뒤 투과 전자 현미경(TEM, Transmission electron microscope (120kV); Talos L120C, FEI, Czech)을 이용하여 촬영하였다. 상기 얻어진 결과 도 3e에 나타난 바와 같이, 정제된 엔캡슐린(Encapsulin) 단백질이 VLP를 형성하는 것을 확인할 수 있었다. 확인된 VLP의 직경은 30~40nm 사이에서 확인되었으며, 이는 야생형 엔캡슐린(Encapsulin)의 직경과 유사함을 확인할 수 있었다.

[실시예 2]

고효율 및 수용성 증진을 위한 N-말단의 발현량 및 수용성 증진 파트너를 추가한 엔캡슐린(Encapsulin) 코로나 바이러스 항원 복합체의 제조

<실시예 2-1>

C-말단에 코로나 바이러스 RBD 항원(223a.a, 25.0 kDa) 목적 단백질을 부착한 엔캡슐린(Encapsulin) 단백질 융합 단백질로 구성된 엔캡슐린(Encapsulin) 기반 바이러스 유사 입체를 만들기 위하여 코로나 바이러스 항원인 RBD (RNA Binding Domain)을 삽입하였다. 삽입된 코로나 바이러스에는 2019-nCoV spike S 단백질 유래의 RBD (BetaCoV/Korea/KCDC03/2020, (NCBI access number: MN908947) 유전자가 이용되었다 (서열번호 2). 코로나 바이러스의 항원인 RBD은 223개의 아미노산으로 구성되어 있으며, 단백질의 분자량은 약 25 kDa에 해당한다. 상기 단백질 서열에 기초하여 대장균에서 코돈 최적화 후 합성된 유전자 서열을 제조하였다 (서열번호 2). (㈜바이오닉스에 유전자 합성 의뢰)

도 5에서는 엔캡슐린(Encapsulin) 단백질의 N-말단에 발현량 증가 및 수용성 증가의 효능이 있는 MSAVKAA (서열번호 5)와 RID 펩타이드 (서열번호 6) 및 50% 이상 유사한 돌연변이 RID 펩타이드 (서열번호 7)를 융합한 재조합 단백질을 제조하고 수용성 발현 양상을 검증하였다.

또한, TEV 절단 부위의 서열인 ENLYFQG/S를 응용하여 최적화된 서열의 연결 부위(Linker)로, 아미노산 서열이 (GaSb)n (a≥1, b≥1, n≥1)인 펩티드를 이용하였으며, 이를 TEV cleavage 서열과 상기 융합 단백질 서열 사이에 넣었다. 본 실시예에서 제작된 융합 단백질 발현 벡터의 모식도는 도 4b와 같다.

상기 서열의 유전자는 pET-9a (Novagene, 69431-3CN) (서열번호 4) 발현 벡터를 이용하여 상기예 1에서 제작하였던 재조합 복합체 단백질 발현 벡터인 pET-9a - Encapsulin vector를 기반으로 제작되었다. T7 RNA polymerase가 IPTG에 의하여 발현되며, 이를 통해 DE3 게놈 상에 존재하는 Lac 오페론과 T7 프로모터가 작동하는 pET vector의 MCS(Multiple Cloning Site; 다중 클로닝 부위)에 삽입된 기존의 엔캡슐린(Encapsulin) 복합체 단백질 벡터 서열의 N-말단에 수용성 및 발현률의 증가를 위한 RID 서열을 추가하고 TEV 절단 효율을 증진시키기 위하여 연결 부위 서열을 추가하였다. pET9a vector에 Nde1 및 KpnI와 BamHI 절단 효소를 이용하여 잘라내 서브클로닝하여 재삽입 하였다. MCS 내부에 존재하는 절단 효소 부위 중 NdeI와 KpnI 서열 사이에 본 연구의 RID와 연결부위 (Linker1), 절단 효소 부위 및 TEV 효소의 절단 효율을 높이기 위한 연결 부위 (Linker2)를 삽입하고, KpnI와 BamHI 절단 효소 사이에 엔캡슐린(Encapsulin)과 코로나 바이러스 항원 단백질이 융합된 형태의 단백질을 갖도록 구상된 DNA 서열들을 각각 삽입하였으며, 각각의 유전자들은 T4 DNA 리가아제 (ligase)를 통해 pET 벡터와 삽입 유전자 서열을 연결시켰으며, 이들의 DNA의 연결 반응으로 인해 발생된 박테리아 클론은 DNA 서열 분석을 통하여 코돈 최적화된 뉴클레오티드의 서열이 삽입됨을 확인하였다.

실시예 2-1에서 제조된 재조합 복합체 발현 벡터의 서열은 다음과 같다.

MSAVKAA-RID-Linker1-TEV-Linker2-ENC-Linker3-CoV RBD [(서열번호5)-(서열번호7)-(서열번호8)-TEV-(서열번호9)-(서열번호1)-(서열번호10)-(서열번호2)]

:MSAVKAA-AAVQAAEVKVDGSEPKLSANELAARLAAEAAVAEAEAAQAELSEKQLSQATAAATNHTTDNGVGPEEESVGT-HHHHHH-ENLYFQ-GSGSGS-EFLKRSFAPLTEKQWQEIDNRAREIFKTQLYGRKFVDVEGPYGWEYAAHPLGEVEVLSDENEVVKWGLRKSLPLIELRATFTLDLWELDNLERGKPNVDLSSLEETVRKVAEFEDEVIFRGCEKSGVKGLLSFEERKIECGSTPKDLLEAIVRALSIFSKDGIEGPYTLVINTDRWINFLKEEAGHYPLEKRVEECLRGGKIITTPRIEDALVVSERGGDFKLILGQDLSIGYEDREKDAVRLFITETFTFQVVNPEALILLKF-GGGSGGGSEAAAKGGGS-RVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNF

상기 제조된 복합체는 “RID-ENC-CoV RBD”로 명명하였다.

<실시예 2-2>

상기 실시예 2-1에서 제작된 발현 벡터를 HMS174 competent cell (Novagen (RecA mutation in a K-12 strain, Cat: 69453-3))에 형질 전환하였다. 모든 형질 전환된 대장균은 50 μg/ml 카나마이신 (Kanamycin)이 포함된 3ml의 LB 배지에서 37℃에서 250rpm으로 5-7시간 배양한 후 1ml을 10ml에 옮겨 10배 희석한 후 추가 배양하였다. 약 2-4시간 후 O.D600 0.5~0.7에 도달하였을 때 0.4mM IPTG (Biosesang, Cat#I1006, Lot#LB0C0340, cas#367-93-1)를 첨가한 뒤 16℃에서 17-19시간(최대 21시간) 동안 배양하였다. 배양액은 원심 분리를 통하여 침전된 대장균만을 수득하여 -80℃ 초저온 냉동 보관하였다. 3 ml의 배양 배지에 해당되는 대장균 수확물에 0.3 ml의 용해 완충 용액(50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 5% glycerol, 0.1% Triton X-100 및 10 mM imidazole)을 넣고 초음파 분쇄 후 전체 용해물(T, Total lysate)을 원심 분리를 통하여 침전물(P, Precipitant)과 상등액 (S, Soluble lysate)으로 분리한 다음 SDS-PAGE로 분석한 결과, 도 5에 보이는 바와 같이 RID를 N-말단에 추가한 엔캡슐린(Encapsulin)-코로나바이러스 항원 융합 단백질이 고효율 수용성 발현을 보이고 있음을 확인하였다.

<실시예 2-3>

고효율 수용성 발현이 확인된 상기 실시예 2-2와 동일한 방식의 배양 방법을 이용하여 500 ml의 대장균을 배양 및 발현을 유도하여 수득한 세포를 75ml의 용해 완충 용액 [A 버퍼 [50 mM Tris-HCl (pH 7.9), 150 mM NaCl, 5% glycerol, 10 mM imidazole]로 재현탁 하였다. 상기 세포 재현탁물을 초음파세포 파쇄기 +(sonication: pulse 15s/50s, 70% amplitude, 2min 30s, 2times total)를 이용하여 세포를 분쇄시켰다. 상기 용해된 세포를 4℃에서 13500rpm으로 10분동안 원심분리하고, 상층액을 취하여 AKTA(GE healthcare)을 이용하여 Ni+ 친화 크로마토그래피를 수행하였다. 먼저, HisTrap HP(GE Healthcare Life Sciences, Little Chalfont, Buckinghamshire, UK, 5mL size)컬럼을 완충액 A(50 mM Tris-HCl (pH 7.9), 150 mM NaCl, 5% glycerol 및 10 mM imidazole)로 평형화시킨 다음, 세포 용해 상층액을 1ml/분의 유속으로 상기 평형화된 컬럼에 적재하였다. RID-ENC-CoV RBD 단백질은 완충액 A 및 1M의 이미다졸을 포함한 완충액 B(50 mM Tris-HCl (pH 7.9), 150 mM NaCl, 5% glycerol 및 1M imidazole)를 이용하여 이미다졸이 10mM 내지 1M 농도 범위에서 선형 농도 구배로 증가 주입을 통해 용출하였으며 2ml씩의 분획들을 수득하였다.

상기 용출물을 SDS-PAGE를 통해 목적(타겟) 단백질의 분리 양상을 확인 후 해당 분획의 용출물을 Dialysis 버퍼 (20 mM Tris-HCl (pH 7.9), 5% glycerol, 10 mM NaCl, 0.02% Tween-20)에 9℃에서 12-16시간 동안 투석하였다. 이 때, 4시간 동안 먼저 투석한 후 나머지 8-12시간 동안 TEV 절단 효소를 이용하여 N-말단의 RID와 엔캡슐린(Encapsulin)-코로나 바이러스 항원 융합 단백질의 사이를 절단하였다.

N-말단의 융합파트너인 RID 등이 제거된 목적 융합 단백질을 분리 및 정제하기 위하여 HisTrap HP(GE Healthcare Life Sciences, Little Chalfont, Buckinghamshire, UK, 5mL size)컬럼을 이용하여 Dialysis 버퍼와 동일한 용액 A (20 mM Tris-HCl (pH 7.9), 5% glycerol, 10 mM NaCl, 0.02% Tween-20)로 평형화 시킨 다음, 1ml/분의 유속으로 상기 평형화 된 컬럼에 적재하였다. N-말단의 융합파트너인 RID 등이 제거된 ENC-CoV RBD 목적 단백질은 상기 컬럼에 흡착되지 않고 용출되는 형태로 회수하였다.

목적 단백질의 최종 순도 증가를 위하여 AKTA(GE healthcare)을 이용하여 이온 교환 수지 크로마토그래피 (Ion Exchange Chromatography)를 수행하였다. 컬럼(HiTrap Q FF, 1mL size (GE Healthcare Life Sciences, Little Chalfont, Buckinghamshire, UK)을 완충 용액 A(20 mM Tris-HCl (pH 7.9), 10 mM NaCl, 5% glycerol, 0.02% Tween-20)으로 평형화한 후, 1ml/분의 유속으로 적재하였고, 완충 용액 A와 완충 용액 B(20 mM Tris-HCl (pH 7.9), 1M NaCl, 5% glycerol, 0.02% Tween-20)를 통해 10mM 내지 1M의 선형 농도 구배를 갖는 NaCl 주입을 통해 목적 단백질을 용출하였으며 각 1ml씩의 분획들로 수득하였으며, 그 결과 그 정제 양상과 순도는 도면 6f에 도시된 바와 같다 (도 6f). 정제된 ENC-CoV RBD 단백질은 20% 글리세롤(glycerol) 비율을 포함한 상태로 4℃에서 보관하였으며, 최종적으로 정제된 단백질의 농도는 BSA(Amresco, Solon, OH, USA)를 이용하여 정량하였다.

<실시예 2-4>

실시예 2-3의 ENC-CoV RBD 융합단백질로 구성된 융합 단백질(VLP)의 전체적인 직경 분포를 확인하기 위하여 동적광산란(Dynamic Light Scattering, DLS)을 통하여 분석하였다. 상기 복합체의 분석은 DLS (Particular Systems, Zetasizer Nano Family)를 이용하여 16℃의 온도 조건으로 샘플 1mL을 Cuvette에 넣어 측정하였다. 세포의 동적광산란 분석은 이미지에서 각 영역별 total intensity 및 Mass 등을 이용하여 확인하였다. 도 7a와 같이 DLS의 Hydrodynamic Radius에서의 직경 30~40nm의 Particle 크기의 분포를 갖는 것을 확인하였다.

<실시예 2-5>

정제된 엔캡슐린(Encapsulin) 단백질에 의해 이루어진 바이러스 유사 입체(VLP)의 외형을 전자 현미경으로 관찰하였다. 정제된 Encapsulin VLP를 먼저 구리 그리드에 1분 간 올린 뒤 2% 아세트산 우라닐(uranyl acetate)를 이용하여 1분 간 염색하였고 10분 간 상온에서 건조한 뒤 투과 전자 현미경(TEM, Transmission electron microscope (120kV); Talos L120C, FEI, Czech)을 이용하여 촬영하였다. 도 7b에 나타난 바와 같이, 정제된 ENC-CoV RBD 단백질이 VLP를 형성하는 것을 확인할 수 있었다. 확인된 VLP의 직경은 기존의 엔캡슐린(Encapsulin) 단백질의 직경인 30~40nm 사이로 보이며, C-말단에 항원단백질이 융합된 융합 단백질의 형태로도 구형의 VLP를 형성함을 확인하였다.

상기 실시예 2의 결과를 통하여, 본 발명에 따른 Encapsulin과 목적 단백질이 융합된 VLP를 투여하였을 때, 높은 수준의 목적 단백질 특이 항체가 유도되며 이 항체는 목적 단백질과 그 수용체 간의 결합을 저해하는 성능이 뛰어남을 확인하였다.

[실시예 3]

고효율 및 수용성 증진을 위한 N-말단의 발현량 및 수용성 증진 파트너 펩타이드를 추가한 엔캡슐린(Encapsulin) 뎅기 바이러스 항원 복합체의 제조

<실시예 3-1>

C-말단에 목적 단백질을 부착한 엔캡슐린(Encapsulin) 단백질 융합 단백질로 구성된 엔캡슐린(Encapsulin) 기반 바이러스 유사 입체를 만들기 위하여 뎅기 바이러스 항원을 이용하였다. RBD (RNA Binding Domain)을 삽입하였다. 엔캡슐린(Encapsulin) 단백질로 뎅기 바이러스 항원인 EDIII를 삽입하였으며, 뎅기 바이러스 유래의 EDIII (Dengue virus 2 isolate DENV-2/KBPV-VR-29, complete genome, Sequence ID: KP406804.1) 유전자가 이용되었다 (서열번호 3). 뎅기 바이러스의 항원인 EDIII는 101개의 아미노산으로 이루어져 있으며, 약 11.4 kDa의 크기를 갖는다. 상기 단백질 서열에 기초하여 대장균에서 코돈 최적화 후 합성된 유전자 서열을 제조하였다 (서열번호 3). (㈜바이오닉스에 유전자 합성 의뢰)

도 9에서는 엔캡슐린(Encapsulin) 단백질의 N-말단에 발현량 증가 및 수용성 증가의 효능이 있는 MSAVKAA (서열번호 5)와 RID 펩타이드 (서열번호 6) 및 50% 이상 유사한 돌연변이 RID 펩타이드 (서열번호 7)를 융합한 재조합 단백질을 제조하고 수용성 발현 양상을 검증하였다. 상기 돌연변이 RID의 경우 수용성 증가를 위하여 RID의 아미노산을 Lysine(Lys,K)을 Alanine (Ala, A)로 1개 이상 9개 이하로 치환하여 사용하였다.

또한, TEV 절단 부위의 서열인 ENLYFQG/S를 응용하여 최적화된 서열의 연결 부위(Linker)로 아미노산 서열이 (GaSb)n (a≥1, b≥1, n≥1)인 펩티드를 이용하였으며, 이를 TEV cleavage 서열과 상기 융합 단백질 서열 사이에 넣었다. 본 실시예에서 제작된 융합 단백질 발현 벡터의 모식도는 도 8b와 같다.

상기 서열의 유전자는 pET-9a (Novagene, 69431-3CN) (서열번호 4) 발현 벡터를 이용하여 상기예 2에서 제작하였던 재조합 복합체 단백질 발현 벡터인 pET9a-ENC-Linker3-CoV RBD vector 및 pET9a-MSAVKAA-RID-Linker1-6xHIS-TEV-Linker2-ENC-Linker3-CoV RBD Vector를 기반으로 제작되었으며, NotI와 BamHI 절단 효소를 이용하여 Enc의 C-말단의 코로나 바이러스 항원 단백질을 뎅기 바이러스의 항원으로 대체하여 삽입하였다.

실시예 3-1에서 제조된 재조합 복합체 발현 벡터의 서열은 다음과 같다.

MSAVKAA-RID-Linker1-TEV-Linker2-ENC-Linker3-DENV EDIII [(서열번호5)-(서열번호6)-(서열번호8)-TEV-(서열번호9)-(서열번호1)-(서열번호10)-(서열번호3)]

:MSAVKAA-AAVQAAEVKVDGSEPKLSKNELKRRLKAEKKVAEKEAKQKELSEKQLSQATAAATNHTTDNGVGPEEESV-GTHHHHHHENLYFQ-GSGSGS-EFLKRSFAPLTEKQWQEIDNRAREIFKTQLYGRKFVDVEGPYGWEYAAHPLGEVEVLSDENEVVKWGLRKSLPLIELRATFTLDLWELDNLERGKPNVDLSSLEETVRKVAEFEDEVIFRGCEKSGVKGLLSFEERKIECGSTPKDLLEAIVRALSIFSKDGIEGPYTLVINTDRWINFLKEEAGHYPLEKRVEECLRGGKIITTPRIEDALVVSERGGDFKLILGQDLSIGYEDREKDAVRLFITETFTFQVVNPEALILLKF-GGGSGGGSEAAAKGGGS-KGMSYSMCTGKFKVVKEIAETQHGTIVIRVQYEGDGSPCKIPFEIMDLEKRHVLGRLITVNPIVTEKDRPVNIEAEPPFGDSYIIIGVEPGQLKLNWFKKG

상기 제조된 복합체는 “RID-ENC-DENV EDIII”로 명명하였다.

<실시예 3-2>

상기 실시예 3-1에서 제작된 발현 벡터를 HMS174 competent cell (Novagen (RecA mutation in a K-12 strain, Cat: 69453-3))에 형질 전환하였다. 모든 형질 전환된 대장균은 50 μg/ml 카나마이신 (Kanamycin)이 포함된 3ml의 LB 배지에서 37℃에서 250rpm으로 5-7시간 배양한 후 1ml을 10ml에 옮겨 10배 희석한 후 추가 배양하였다. 약 2-4시간 후 O.D600 0.5~0.7에 도달하였을 때 0.4mM IPTG (Biosesang, Cat#I1006, Lot#LB0C0340, cas#367-93-1)를 첨가한 뒤 16℃에서 17-19시간(최대 21시간) 동안 배양하였다. 배양액은 원심 분리를 통하여 침전된 대장균만을 수득하여 -80℃ 초저온 냉동 보관하였다. 3 ml의 배양 배지에 해당되는 대장균 수확물에 0.3 ml의 용해 완충 용액(50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 5% glycerol, 0.1% Triton X-100 및 10 mM imidazole)을 넣고 초음파 분쇄 후 전체 용해물(T, Total lysate)을 원심 분리를 통하여 침전물(P, Precipitant)과 상등액 (S, Soluble lysate)으로 분리한 다음 SDS-PAGE로 분석한 결과, 도면 9에 보이는 바와 같이 RID를 N-말단에 추가한 엔캡슐린(Encapsulin)-뎅기바이러스 항원 융합 단백질이 고효율 수용성 발현을 보이고 있음을 확인하였다.

<실시예 3-3>

고효율 수용성 발현이 확인된 상기 실시예 3-2와 동일한 방식의 배양 방법을 이용하여 500 ml의 대장균을 배양 및 발현을 유도하여 수득한 세포를 75ml의 용해 완충 용액 [A 버퍼 [50 mM Tris-HCl (pH 7.9), 150 mM NaCl, 5% glycerol, 10 mM imidazole]로 재현탁 하였다. 상기 세포 재현탁물을 초음파세포 파쇄기 +(sonication: pulse 15s/50s, 70% amplitude, 2min 30s, 2times total)를 이용하여 세포를 분쇄시켰다. 상기 용해된 세포를 4℃에서 13500rpm으로 10분동안 원심분리하고, 상층액을 취하여 AKTA(GE healthcare)을 이용하여 Ni+ 친화 크로마토그래피를 수행하였다. 먼저, HisTrap HP(GE Healthcare Life Sciences, Little Chalfont, Buckinghamshire, UK, 5mL size)컬럼을 완충액 A(50 mM Tris-HCl (pH 7.9), 150 mM NaCl, 5% glycerol 및 10 mM imidazole)로 평형화시킨 다음, 세포 용해 상층액을 1ml/분의 유속으로 상기 평형화된 컬럼에 적재하였다. RID-ENC-DENV EDIII 단백질은 완충액 A 및 1M의 이미다졸을 포함한 완충액 B(50 mM Tris-HCl (pH 7.9), 150 mM NaCl, 5% glycerol 및 1M imidazole)를 이용하여 이미다졸이 10mM 내지 1M 농도 범위에서 선형 농도 구배로 증가 주입을 통해 용출하였으며 2ml씩의 분획들을 수득하였다.

상기 용출물을 SDS-PAGE를 통해 목적(타겟) 단백질의 분리 양상을 확인 후 해당 분획의 용출물을 Dialysis 버퍼 (20 mM Tris-HCl (pH 7.9), 5% glycerol, 10 mM NaCl, 0.02% Tween-20)에 9℃에서 12-16시간 동안 투석하였다. 이 때, 4시간 동안 먼저 투석한 후 나머지 8-12시간 동안 TEV 절단 효소를 이용하여 N-말단의 RID와 엔캡슐린(Encapsulin)-뎅기 바이러스 항원 융합 단백질의 사이를 절단하였다.

N-말단의 융합파트너인 RID 등이 제거된 목적 융합 단백질을 분리 및 정제하기 위하여 HisTrap HP(GE Healthcare Life Sciences, Little Chalfont, Buckinghamshire, UK, 5mL size)컬럼을 이용하여 Dialysis 버퍼와 동일한 용액 A (20 mM Tris-HCl (pH 7.9), 5% glycerol, 10 mM NaCl, 0.02% Tween-20)로 평형화 시킨 다음, 1ml/분의 유속으로 상기 평형화 된 컬럼에 적재하였다. N-말단의 융합파트너인 RID 등이 제거된 ENC-DENV EDIII 목적 단백질은 상기 컬럼에 흡착되지 않고 용출되는 형태로 회수하였다.

목적 단백질의 최종 순도 증가를 위하여 AKTA(GE healthcare)을 이용하여 이온 교환 수지 크로마토그래피 (Ion Exchange Chromatography)를 수행하였다. 컬럼(Fractogel TMAE, 5mL size (#125069, Merck)을 완충 용액 A(20 mM Tris-HCl (pH 7.9), 10 mM NaCl, 5% glycerol, 0.02% Tween-20)으로 평형화한 후, 1ml/분의 유속으로 적재하였고, 완충 용액 A와 완충 용액 B(20 mM Tris-HCl (pH 7.9), 1M NaCl, 5% glycerol, 0.02% Tween-20)를 통해 10mM 내지 1M의 선형 농도 구배를 갖는 NaCl 주입을 통해 목적 단백질을 용출하였으며 각 1ml씩의 분획들로 수득하였으며, 그 결과 그 정제 양상과 순도는 도면 10f에 도시된 바와 같다 (도 10f). 정제된 ENC-DENV 단백질은 20% 글리세롤(glycerol) 비율을 포함한 상태로 4℃에서 보관하였으며, 최종적으로 정제된 단백질의 농도는 BSA(Amresco, Solon, OH, USA)를 이용하여 정량하였다.

<실시예 3-4>

실시예 3-3의 ENC-DENV EDIII 융합단백질로 구성된 융합 단백질(VLP)의 전체적인 직경 분포를 확인하기 위하여 동적광산란(Dynamic Light Scattering, DLS)을 통하여 분석하였다. 상기 복합체의 분석은 DLS (Particular Systems, Zetasizer Nano Family)를 이용하여 16℃의 온도 조건으로 샘플 1mL을 Cuvette에 넣어 측정하였다. 세포의 동적광산란 분석은 이미지에서 각 영역별 total intensity 및 Mass 등을 이용하여 확인하였다. 도 11a와 같이 DLS의 Hydrodynamic Radius에서의 직경 30~40nm의 Particle 크기의 분포를 갖는 것을 확인하였다.

<실시예 3-5>

정제된 엔캡슐린(Encapsulin) 단백질에 의해 이루어진 바이러스 유사 입체(VLP)의 외형을 전자 현미경으로 관찰하였다. 정제된 Encapsulin VLP를 먼저 구리 그리드에 1분 간 올린 뒤 2% 아세트산 우라닐(uranyl acetate)를 이용하여 1분 간 염색하였고 10분 간 상온에서 건조한 뒤 투과 전자 현미경(TEM, Transmission electron microscope (120kV); Talos L120C, FEI, Czech)을 이용하여 촬영하였다. 도 11b에 나타난 바와 같이, 정제된 ENC-DENV 단백질이 VLP를 형성하는 것을 확인할 수 있었다. 확인된 VLP의 직경은 기존의 엔캡슐린(Encapsulin) 단백질의 직경인 30~40nm 사이로 보이며, C-말단에 항원단백질이 융합된 융합 단백질의 형태로도 구형의 VLP를 형성함을 확인하였다.

실시예 3의 결과에서도 실시예 2의 결과와 마찬가지로 본 발명을 이용한 엔캡슐린(Encapsulin)의 대장균에서의 고효율 단백질 생산 및 VLP 형성을 모두 확인하였으며, 이는 본 실험의 고효율 및 수용성 증진 융합 파트너인 RID가 엔캡슐린(Encapsulin)의 C-말단에 항원 등의 단백질을 삽입한 융합 단백질 기반의 플랫폼을 형성하는데 필수적임을 나타낸다.

이상 본 발명의 실시예들을 설명하였지만, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

<110> InThera Inc. <120> RECOMBINANT EXPRESSION VECTOR FOR PRODUCTION OF ENCAPSULIN-BASED DENGUE VIRUS OR CORONA VIRUS VACCINE AND METHOD FOR PREPARING THE SAME <130> 1068764 <160> 14 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 795 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Encapsulin <400> 1 atggaatttc tgaaacggag ctttgcgccg ctgaccgaaa aacagtggca ggaaattgat 60 aatcgcgccc gggaaatttt taaaacccag ctgtatggtc ggaaatttgt tgatgtggaa 120 ggcccgtatg gctgggaata tgccgcacat cctctgggtg aagtggaagt tctgagcgat 180 gaaaatgaag tggtgaaatg gggcctgcgg aaaagcctgc cgctgattga actgcgcgcc 240 acctttacac tggatctgtg ggagctggat aatctggaac ggggcaaacc gaacgtggat 300 ctgagttcac tggaagaaac agttcggaaa gtcgccgaat tcgaggatga agttattttc 360 cgcggctgcg aaaaaagcgg cgttaaaggc ctgctgtcat tcgaggaacg gaaaatcgaa 420 tgcggtagca ccccgaaaga tctgctggag gccatcgtgc gcgcactgag catcttttcc 480 aaagatggta tcgaaggtcc gtataccctg gttatcaata ccgatcgctg gatcaatttt 540 ctgaaagaag aagcgggtca ttatccgctg gaaaaacggg tggaagaatg tctgcggggt 600 ggtaaaatta 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ggtcattttc ggcgaggacc 1080 gctttcgctg gagcgcgacg atgatcggcc tgtcgcttgc ggtattcgga atcttgcacg 1140 ccctcgctca agccttcgtc actggtcccg ccaccaaacg tttcggcgag aagcaggcca 1200 ttatcgccgg catggcggcc gacgcgctgg gctacgtctt gctggcgttc gcgacgcgag 1260 gctggatggc cttccccatt atgattcttc tcgcttccgg cggcatcggg atgcccgcgt 1320 tgcaggccat gctgtccagg caggtagatg acgaccatca gggacagctt caaggatcgc 1380 tcgcggctct taccagccta acttcgatca ctggaccgct gatcgtcacg gcgatttatg 1440 ccgcctcggc gagcacatgg aacgggttgg catggattgt aggcgccgcc ctataccttg 1500 tctgcctccc cgcgttgcgt cgcggtgcat ggagccgggc cacctcgacc tgaatggaag 1560 ccggcggcac ctcgctaacg gattcaccac tccaagaatt ggagccaatc aattcttgcg 1620 gagaactgtg aatgcgcaaa ccaacccttg gcagaacata tccatcgcgt ccgccatctc 1680 cagcagccgc acgcggcgca tctcgggcag cgttgggtcc tggccacggg tgcgcatgat 1740 cgtgctcctg tcgttgagga cccggctagg ctggcggggt tgccttactg gttagcagaa 1800 tgaatcaccg atacgcgagc gaacgtgaag cgactgctgc tgcaaaacgt ctgcgacctg 1860 agcaacaaca tgaatggtct tcggtttccg tgtttcgtaa agtctggaaa cgcggaagtc 1920 agcgccctgc accattatgt tccggatctg catcgcagga tgctgctggc taccctgtgg 1980 aacacctaca tctgtattaa cgaagcgctg gcattgaccc tgagtgattt ttctctggtc 2040 ccgccgcatc cataccgcca gttgtttacc ctcacaacgt tccagtaacc gggcatgttc 2100 atcatcagta acccgtatcg tgagcatcct ctctcgtttc atcggtatca ttacccccat 2160 gaacagaaat cccccttaca cggaggcatc agtgaccaaa caggaaaaaa ccgcccttaa 2220 catggcccgc tttatcagaa gccagacatt aacgcttctg gagaaactca acgagctgga 2280 cgcggatgaa caggcagaca tctgtgaatc gcttcacgac cacgctgatg agctttaccg 2340 cagctgcctc gcgcgtttcg gtgatgacgg tgaaaacctc tgacacatgc agctcccgga 2400 gacggtcaca gcttgtctgt aagcggatgc cgggagcaga caagcccgtc agggcgcgtc 2460 agcgggtgtt ggcgggtgtc ggggcgcagc catgacccag tcacgtagcg atagcggagt 2520 gtatactggc ttaactatgc ggcatcagag cagattgtac tgagagtgca ccatatatgc 2580 ggtgtgaaat accgcacaga tgcgtaagga gaaaataccg catcaggcgc tcttccgctt 2640 cctcgctcac tgactcgctg cgctcggtcg ttcggctgcg gcgagcggta tcagctcact 2700 caaaggcggt aatacggtta tccacagaat caggggataa cgcaggaaag aacatgtgag 2760 caaaaggcca gcaaaaggcc aggaaccgta aaaaggccgc gttgctggcg tttttccata 2820 ggctccgccc ccctgacgag catcacaaaa atcgacgctc aagtcagagg tggcgaaacc 2880 cgacaggact ataaagatac caggcgtttc cccctggaag ctccctcgtg cgctctcctg 2940 ttccgaccct gccgcttacc ggatacctgt ccgcctttct cccttcggga agcgtggcgc 3000 tttctcatag ctcacgctgt aggtatctca gttcggtgta ggtcgttcgc tccaagctgg 3060 gctgtgtgca cgaacccccc gttcagcccg accgctgcgc cttatccggt aactatcgtc 3120 ttgagtccaa cccggtaaga cacgacttat cgccactggc agcagccact ggtaacagga 3180 ttagcagagc gaggtatgta ggcggtgcta cagagttctt gaagtggtgg cctaactacg 3240 gctacactag aaggacagta tttggtatct gcgctctgct gaagccagtt accttcggaa 3300 aaagagttgg tagctcttga tccggcaaac aaaccaccgc tggtagcggt ggtttttttg 3360 tttgcaagca gcagattacg cgcagaaaaa aaggatctca agaagatcct ttgatctttt 3420 ctacggggtc tgacgctcag tggaacgaaa actcacgtta agggattttg gtcatgaaca 3480 ataaaactgt ctgcttacat aaacagtaat acaaggggtg ttatgagcca tattcaacgg 3540 gaaacgtctt gctcgaggcc gcgattaaat tccaacatgg atgctgattt atatgggtat 3600 aaatgggctc gcgataatgt cgggcaatca ggtgcgacaa tctatcgatt gtatgggaag 3660 cccgatgcgc cagagttgtt tctgaaacat ggcaaaggta gcgttgccaa tgatgttaca 3720 gatgagatgg tcagactaaa ctggctgacg gaatttatgc ctcttccgac catcaagcat 3780 tttatccgta ctcctgatga tgcatggtta ctcaccactg cgatccccgg gaaaacagca 3840 ttccaggtat tagaagaata tcctgattca ggtgaaaata ttgttgatgc gctggcagtg 3900 ttcctgcgcc ggttgcattc gattcctgtt tgtaattgtc cttttaacag cgatcgcgta 3960 tttcgtctcg ctcaggcgca atcacgaatg aataacggtt tggttgatgc gagtgatttt 4020 gatgacgagc gtaatggctg gcctgttgaa caagtctgga aagaaatgca taagcttttg 4080 ccattctcac cggattcagt cgtcactcat ggtgatttct cacttgataa ccttattttt 4140 gacgagggga aattaatagg ttgtattgat gttggacgag tcggaatcgc agaccgatac 4200 caggatcttg ccatcctatg gaactgcctc ggtgagtttt ctccttcatt acagaaacgg 4260 ctttttcaaa aatatggtat tgataatcct gatatgaata aattgcagtt tcatttgatg 4320 ctcgatgagt ttttctaaga a 4341 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MSAVKAA <400> 5 atgtccgcag taaaagcagc c 21 <210> 6 <211> 210 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ARSNTD <400> 6 gcggccgtgc aggcggccga ggtgaaagtg gatggcagcg agccgaaact gagcaagaat 60 gagctgaaga gacgcctgaa agctgagaag aaagtagcag agaaggaggc caaacagaaa 120 gagctcagtg agaaacagct aagccaagcc actgctgctg ccaccaacca caccactgat 180 aatggtgtgg gtcctgagga agagagcgtg 210 <210> 7 <211> 210 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mARSNTD(9) <400> 7 gcggccgtgc aggcggccga ggtgaaagtg gatggcagcg agccgaaact gagcgcgaat 60 gagctggcgg cgcgcctggc ggctgaggcg gcggtagcag aggcggaggc cgcgcaggcg 120 gagctcagtg agaaacagct aagccaagcc actgctgctg ccaccaacca caccactgat 180 aatggtgtgg gtcctgagga agagagcgtg 210 <210> 8 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LINKER1 <400> 8 ggcggtggct ctggcggtgg ctct 24 <210> 9 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LINKER2 <400> 9 ggttctggtt ctggttct 18 <210> 10 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LINKER3 <400> 10 ggcggtggct ctgaagcggc cgcgaaaggc ggtggctct 39 <210> 11 <211> 339 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Dengue Virus Type 1 EDIII (EF654110.1) <400> 11 gcggccgcga aaggcggtgg ctctaaaggt gtgagctatg ttatgtgcac cggttcattt 60 aaactggaaa aagaagttgc agaaacccag catggcaccg ttctggttca ggttaaatat 120 gaaggcaccg atgcaccgtg taaaattccg tttagcagcc aggatgaaaa aggtgttacc 180 cagaatggtc gtctgattac cgcaaatccg attgttaccg ataaagaaaa accggtgaat 240 atcgaagcag aaccgccttt tggtgaaagc tatctggttg ttggtgccgg tgaaaaagca 300 ctgaaactga gctggttcaa aaaaggctag taaggatcc 339 <210> 12 <211> 339 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Dengue Virus Type 3 EDIII (KP406805.1) <400> 12 gcggccgcga aaggcggtgg ctctaaaggt atgagctatg ccatgtgcct gaataccttt 60 gtgctgaaaa aagaagttag cgaaacccag catggcacca ttctgattaa agtggaatac 120 aaaggtaaag acgcaccgtg caaaattccg tttagcaccg aagatggtca gggtaaagca 180 cataatggtc gtctgattac cgcaaatccg gttgttacca aagaagaaga accggttaac 240 attgaagcag aaccgccttt tggtgaaagc aatattgtta ttggcattgg cgataaagcc 300 ctgaagatta attggtatcg taagggctag taaggatcc 339 <210> 13 <211> 339 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Dengue Virus Type 4 EDIII (KP406806.1) <400> 13 gcggccgcga aaggcggtgg ctctaaaggc atgagctata ccatgtgcag cggtaaattt 60 agcatcgata aagaaatggc agaaacccag catggcacca ccgttgttcg tgttaaatat 120 gaaggtgcgg gtgcaccgtg taaagttccg attgaaattc gtgatgtgaa caaagaaaaa 180 gtggtgggtc gtattattag cagcaccccg tttgcagaat ataccgatag cgttaccaat 240 atcgaactgg aaccgccttt tggtgatagc tatattgtta ttggtgtggg tgatagcgca 300 ctgaccctgc attggtttcg taaaggttag taaggatcc 339 <210> 14 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 6xHIS tag <400> 14 His His His His His His 1 5

Claims

목적 단백질;
엔캡슐린 단백질; 및
RID(RNA interacting domain) 단백질;을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하고,
상기 목적 단백질은 뎅기 바이러스(Dengue virus) 항원 단백질 또는 코로나 바이러스 항원 단백질인, 백신 생산용 재조합 발현 벡터.
제1 항에 있어서,
상기 엔캡슐린 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는, 백신 생산용 재조합 발현 벡터.
제1 항에 있어서,
상기 RID 단백질은 상기 백신의 발현량 또는 수용성을 증가시키기 위한 융합파트너인, 백신 생산용 재조합 발현 벡터.
제1 항에 있어서,
상기 RID 단백질은 서열번호 5, 서열번호 6 또는 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는, 백신 생산용 재조합 발현 벡터.
제1 항에 있어서,
상기 목적 단백질, 엔캡슐린 단백질 및 RID(RNA interacting domain) 단백질의 사이에는 적어도 하나의 링커 단백질이 위치하고,
상기 링커 단백질은 서열번호 8, 서열번호 9 또는 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 백신 생산용 재조합 발현 벡터.
제1 항에 있어서,
상기 폴리뉴클레오타이드는 RID 단백질의 절단을 위하여 TEV 단백질을 추가로 코딩하는 백신 생산용 재조합 발현 벡터.
제1 항 내지 제6 항 중 어느 한 항에 따른 발현 벡터로 형질 전환된 숙주세포.
제7 항에 있어서,
상기 숙주세포는 대장균(E. coli)인 것을 특징으로 하는 형질 전환된 숙주세포.
목적 단백질; 엔캡슐린 단백질; 및 RID(RNA interacting domain) 단백질;을 포함하고,
상기 목적 단백질은 뎅기 바이러스(Dengue virus) 항원 단백질 또는 코로나 바이러스 항원 단백질인, 융합단백질.
제9 항에 있어서
상기 목적 단백질은 엔캡슐린 단백질의 C-말단에 연결되는 것인, 융합단백질.
제9 항에 있어서,
상기 목적 단백질, 엔캡슐린 단백질 및 RID(RNA interacting domain) 단백질의 사이에는 적어도 하나의 링커 단백질이 위치하고,
상기 링커 단백질은 서열번호 8, 서열번호 9 또는 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는, 융합단백질.
a) 목적 단백질; 엔캡슐린 단백질; 및 RID 단백질;을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 백신 생산용 재조합 발현 벡터를 생산하는 단계;
b) 상기 발현 벡터를 숙주세포에 도입하여 형질전환체를 생산하는 단계; 및
c) 상기 형질전환체를 배양하여 재조합 융합 단백질의 발현을 유도한 후 이를 수득하는 단계;를 포함하고,
상기 목적 단백질은 뎅기 바이러스(Dengue virus) 항원 단백질 또는 코로나 바이러스(Coronavirus) 항원 단백질인, 백신 생산방법.
제12 항에 있어서,
상기 RID 단백질은 상기 백신의 발현량 또는 수용성을 증가시키기 위한 융합파트너인, 백신 생산방법.
제12 항에 있어서,
상기 RID 단백질은 서열번호 5, 서열번호 6 또는 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는, 백신 생산방법.
제12 항에 있어서,
상기 목적 단백질, 엔캡슐린 단백질 및 RID(RNA interacting domain) 단백질의 사이에는 적어도 하나의 링커 단백질이 위치하고,
상기 링커 단백질은 서열번호 8, 서열번호 9 또는 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는, 백신 생산방법.
제12 항에 있어서,
상기 숙주세포는 대장균(E. coli)인 것을 특징으로 하는, 백신 생산방법.
제12 항에 있어서,
상기 엔캡슐린 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는, 백신 생산방법.