KR890005071B1 - 재조합 dna 플라스미드를 이용하여 형질전환된 이. 콜라이 세포로부터 프리-s2 코우드로 된 펩티드 및 융합 단백질 효소의 제조방법 - Google Patents

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Description

재조합 DNA 플라스미드를 이용하여 형질전환된 이. 콜라이 세포로부터 프리-S2 코우드로 된 펩티드 및 융합 단백직 효소의 제조방법

제1도는 간염 바이러스 표면항원중 프리-S2 부위의 코우드로 된 뉴클레오티드 서열이 클론된 재조합 플라스미드 pHBSC50 및 pHBSC51 의 제조 과정을 보여주는 계통도.

제2도는 프리-S2-베타 갈락토시다제 융합 단백질 효소의 발현벡터인 pTBG(H-)의 제조과정을 보여주는 계통로.

제3도는 프리-S2의 발현벡터인 pCTHB1 의 제조과정을 보여주는 계통도.

제4도는 프리-S2의 발현벡터인 pCTHB10 의 DNA 배열 및 제한효소지도.

제5도는 프리-S2의 발현벡터인 pCTHB20 의 DNA 배열 및 제한효소지도.

제6도는 프리-S2의 발현벡터인 pCTHB30 의 제조과정을 보여주는 계통도.

제7도는 adr 아형의 프리-S2 발현벡터인 pCTHB40 의 제조과정을 보여주는 계통도.

제8도는 프리-S2 발현벡터에서 프리-S2 를 코우드화하는 뉴클레오티드 서열, 이. 콜라이 베타갈락토시 다제효소를 코우드화하는 뉴클레오티드 서열, 및 이. 콜라이 리포프로테인의 전사정지화 서열들의 배열을 나타내는 제한효소 지도.

제9(a)도는 이. 콜라이 세포 추출액을 SDS-폴리아크릴아미드 젤 전기영동방법으로 분석한 것. 1. 분자량마크 ; 2. 이. 콜라이 JM103/pTBG10 ; 3. JM103/pTBG(H+) ; 4. JM103/pTBG(H-). 제9(b)도 제9(a)도를 웨스턴 블럿으로 분석한것. 1,2,3은 제9(a)도의 2,3,4와 같은 재료임. 제9(c)도 이. 콜라이 JM103/pTBG(H-) 로부터 분리정제된 프리-S2-베타갈락토시다제 융합 단백질 효소, 1. 분자량마크 : 2. 정제된 융합 단백질.

제10도 재조합 프라스미드를 지닌 이. 콜라이를 위상차 현미경으로 관찰한것. 제10(a)도 베타갈락토시다제-프리-S2 융합 단백질의 발현을 유도하기전. 제10(b)도 융합 단백질의 발현을 유도한후 12시간 동안 배양한 것.

제11(a)도는 프리- S2 발현벡터를 함유하는 이. 콜라이 재조합 균주의 발현 유도 후 세포 추출액을 SDS-폴리아크릴아미드 젤 전기영동방법으로 분석한 것. 1.¹⁴C로 표시된 분자량 마크 : 2, pCTHB20 ; 3, pCTHB30 ; 4, pCT10 ; 5, pCTHB10. 제11(b)도 제11(a)도를 웨스턴 블럿으로 분석한것.

제12도는 베타갈락토시다제 -프리-S2 융합 단백질로부터 분리 및 정제된 프리-S2 펩티드를 SDS-폴리아크릴아미드 젤에서 전기영동한 후 실버스테이닝(silver staining) 방법으로 펩티드 벤드를 확인한 것. 1, 분자량 마크 : 2, 부분정제된 프리-S2 펩티드 : 3, 정제된 프리 -S2 펩티드.

본 발명은 간염B형 바이러스(HBV)의 표면항원유전자 부위중프리-S2(pre-S2) 유전자 코우드로 된 벡터개발 및 이들로부터 펩티드를 숙주 미생물로부터 생산해 내는 유전공학적 제조방법에 관한 것이다. 간염 B 형 바이러스는 사람에 침입하여 만성 및 급성 간염을 일으키며 악화될 경우 간경화와 간암의 원인이 된다. 또한 이 바이러스는 전세계적으로 광범위하게 분포되어 있어 안정성이 높고 효율이 좋은 간염백신의 개발은 세계적으로 많이 연구되고 있으며 상업적인 관심을 모으고 있다. 기존의 간염백신제조방법은 간염 보균자의 혈청으로 부터 포르말린(formalin) 처리에 의해 간염 바이러스를 불활성화 시킨후 22nm 간염 표면항원 입자를 분리해 내는 것으로서 혈청원의 제한 및 안정성 검사 등이 문제점으로 되어 있다. 따라서 효율적인 백신 생산방법의 연구들이 계속되고 있고, 특히 최근 들어 개발된 유전공학적 기술을 이용하여 간염백신을 생산하는 연구들이 지난 수년동안 계속 되어 왔다. 이러한 방법은 간염 바이러스의 표면항원 유전자를 발현에 적합하도록 재조합하여 숙주 세표에 형질전환 시키고, 형질전환된 숙주 세포로부터 간염 표면항원을 생산하는 방법으로서 사용되는 숙주세포로는 이. 콜라이; 효모, 및 동물세포 등이 있다.

효모와 동물세포에서 생산되는 표면항원은 사람의 혈청에서 분리되는 22nm 입자와 유사한 형태의 입자들로 형성되어 있고, 이 입자들을 분리하여 실험동물에 주사하였을때 간염 표면항원에 대한 항체 생성을 유도하는 것으로 보고되었다. 이가운데는 미야노하라(Miyanohara) 등의 보고 (Pro. Natl. Acad. Sci. U.S.A 제80권 1페이지. 1983). 발렌주엘라(Valenzuela) 등의 보고 (Bio. Technolgy, 제3권, 317페이지, 1985년). 고우프(Gough) 등의 보고 (J.mol.Biol., 제165권, 683페이지, 1983년), 메레이(Murray) 등의 보고(EMBO J., 제3권, 645페이지, 1984년)가 있다. 한편, 이. 콜라이를 숙주 세포로 사용하는 방법에서는 호모나 동물세포에서와 같이 표현항원 입자가 형성되지 않을 뿐 아니라 생성 효율이 매우 낮은 것으로 나타났고 이러한 보고로는 애드먼(Edman) 등의 보고 (Nature, 제291권, 503페이지, 1983년). 품펜(Pumpen) 등의 보고 (Gene, 제30권, 201페이지, 1984) 푸지사와(Fujisawa) 등의 보고 (Gene, 제40권, 23페이지, 1985년)가있다.

발현에 사용되는 간염 바이러스 표면항원 유전자의 구조를 보면 프리-S1(pre-S1) 프리-S2(pre-S2) 와 S 유전자의 세부분으로 되어 있다. 이 부위로부터 만들어지는 표면항원 단백질은 그 크기에 따라 프리-S1+ 프리-S2+S의 큰 (large) 단백질, 프리-S2+S 의 중간(middle) 단백질, 그리고 S 만으로 구성된 주(major)단백질로 나뉘어진다. (Heerman 등, J. Virol, 제52권, 396페이지, 1984년).

이들 표면항원 단백질들은 간염 바이러스의 외피(envelope) 에 존재하는 막 (membrane) 단백질로서 데인(Dane) 바이러스 입자의 경우 300-400개의 단백질 분자가 존재하여 중간 단백질과 큰 단백질은 40-80개 정도 존재한다.

사상(filamemtous) 입자의 경우는 그 구성이 데인 입자와 거의 같으며, 2nm 입자의 경우는 100개 정도의 주 단백질, 10개 정도의 중간 단백질과 1-2개의 큰 단백질이 존재하게 된다.

이와같이 프리-S2부위를 포함하는 중간 단백질과 큰 단백질에 비해 함량이 적게 존재하지만 이 부위의 몇가지 중요한 특성들이 최근들어 보고되고 있다.

마치다(Machida) 등의 보고 (Gastroenterology, 제86권, 910페이지, 1984년)에 의하면 중합된 사람 혈청 알부민(pHSA) 에 대한 결합 수용자리(receptor site) 가 프리-S2 부위에 존재하는 것으로 나타났고, 또한 뉴라스(Neurath) 등의 보고 (Science, 제224권, 392페이지, 1984년)를 보면 프리-S2 유전자 부위에 의해 코우드된 에피토프(epitope) 가 다른 부위의 에피토프에 비해 면역성이 매우 높은 것으로 나타났다. 이러한 보고들에서 나타나는 중요한 사실은 간염백신에 프리-S2 유전자 부위에 의해 코우드 된 에피토프가 포함될 경우에 항체형성 효울이 높아지고, 간염 바이러스 감염시 알부민(pHSA)에 대한 결합수용자리와 중화작용을 일으켜 바이러스가 간으로 감염되는 루트(route)를 효과적으로 막을 수 있다는 점이다. 이에따라 밀리히(Milich)등은 간염백신의 효율성을 증가시키기 위해서는 프리-S2부위를 포함시켜야 한다고 제시하였다(Science, 제228권, 1195페이지, 1985년).

그러나 위에서 기술된 바와같이 바이러스 입자들에는 중간, 및 큰 단백질이 상당히 적은 양으로 존재하고 있고 따라서 보균자의 혈청으로부터 분리해 내는 기존의 간염백신 제조 방식으로는 프리-S2부위를 포함하는 단백질을 많은 양 얻어내기 힘들다. 따라서 유전자 재조합 방법이나 펩티드 합성법에 의한 생산방식을 개발하려는 연구들이 최근 들어 보고되고 있다.

뉴라스(Neurath) 등은 프리-S2 부위의 26개 아미노 밀단 아미노산을 포함하는 펩티드를 합성하여 이 부위에 대한 면역학적 특성을 조사하였고, (Science, 제224권, 392페이지, 1984년 : Nature, 제315권, 154페이지, 1985년), 푸지사와(Fujisawa)등은 프리-S2와 S 유전자가 붙은 형태로 재조합하여 대장균에서 발현되도록 하였는데 이때 얻어진 수율은 250ug/l 로 보고되었다(Gene, 제40권, 23페이지, 1985년). 또한 발렌주엘라(Valenzuela)등은 프리-S2와 S 유전자 부위를 효모에서 발현화도록 하였는데, 이때 얻어진 수율은 105mg/l 정도로 크게 증가되었다(Bio/Technology, 제3권, 317페이지, 1985년).

최근 미첼(Michel)등은 프리-S2와 S 유전자를 동물세포(중국산 햄스터 쥐의 난소세포)에서 발현시켰는데, 생성된 간염 표면항원은 22nm 입자를 형성하였으며 단백질 구성 및 항원 결정인자등이 실제의 입자와 비슷하였다(Bio/Technology, 제3권, 561페이지, 1985년).

또한 이 입자들은 중합된 사람 혈청 알부틴(pHSA)과 결합할 수 있었으며, 쥐에서의 면역반응을 조사하였을때 S 부위만 지닌 입자들보다 훨씬 더 강한 면역반응을 일으켰다.(Science, 제228권, 1195페이지, 1985년).

본 발명에서는 간염 표면항원 유전자 부위 중 프리-S2 유전자가 코우드하는 펩티드를 유전공학적인 방법을 사용하여 대장균으로부터 생산해 내는 것을 요점으로 하며, 사용한 방법으로는 대장균의 베타갈락토시다제 폴리펩티드의 아미노 말단과 카르복시 말단 각각에 융합된 형태의 단백질을 제조하는 방식들을 이용하였다.

이와같은 방법은 대장균 내에서 분해되기 쉬운 외부 단백질을 베타갈락토시다제와 같은 숙주 단백질에 연결시켜 안정화할 수 있다는 장점이 있다(Silhavy 등, Microbiol. Rev. 제49권, 389페이지, 1985년). 사용한 전사 활성화 서열(프로모터)로는 택(Tac) 전사 활성화 서열을 사용하였으며, 베타갈락토시다제의 아미노 말단에 연결된 프리-S2 베타갈락토시다제 융합 단백질은 이.콜라이 총 세포 단백질의 15% 이상이 되도록, 카르복시 말단에 연결된 융합 단백질의 경우는 그 수율이 최고 60%까지 생산되록 하였다.

카르복시 말단에 프리-S2 펩티드가 융합된 형태로 제조하는 방식에서는 베타-갈락토시다제의 아미노 말단 200개와 350개 아미노산에 연결시키는 방법과 350번째 아미노산에 연결시키되 메치오닌이 많은 200에서 280번째 사이의 아미노산이 제거되도록 하는 방식을 이용하였다. 길이가 짧은 아미노 말단에 연결시키는 방법은 전체 얻어진 베타칼락토시다제-프리-S2 융합 단백질 중에 프리-S2 펩티드의 상대적인 양을 증가시키는 효과가 있다. 베타갈락토시다제의 아미노 말단서열중 상기의 메치오닌기가 많은 부위를 제거 시키는 방법은 융합 단백질을 시안브롬(CNBr)을 사용하여 메치오닌기를 절단하였을때 원하는 프리-S2 펩티드가 다른 펩티드산물로부터 크기에 따라 쉽게 분리될수 있다는 장점이 있다.

[실시예 1]

1) 본 발명에서 사용된 기본적인 플라스미드는 다음과 같다.

플라스미드 pHBSC12 (제1도참조) (KCTC 8321p) 는 pUC12 플라스미드(Messing, Methods in Enzymology, 제101권, 20페이지, 1983년)DNA 를 EcoRI 과 HincII 제한효소로 절단한 후 간염바이러스 DNA 에서 분리된 프리-S2 유전자를 포함하는 221bp EcoRI-HincII DNA단면(Valenzuela 등. Nature, 제28권 815페이지. 1979년)을 삽입하여 연결시킨 것이다. 플라스미드 pTBG10 (KCTC 8323p) (제2도참조)은 ptac12 플라스미드(Amann등. Gene, 제25권, 259페이지, 1983년)의 Tac전사활성화 서열뒤에 pORF-1 플라스미드(Weinstock 등. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 제80권 4432페이지. 1983)로부터 유래한 이.콜라이 효소 베타갈락토시다제를 코우드하는 유전자(lacZ)를 삽입하여 제조하였다

플라스미드 pCT10 (제3도 및 제7도참조)은 pTBG10 플라스미드와 유사하나 lacZ 유전자 뉴클레오티드 서열중 아미노 말단의 354개 아미노산을 코우드할 수 있는 부위(lacZ)까지만 포함되어 있으며 (동일자출원된 특허출원제 87-4호 참조). Tac 전사 활성화 서열과 lacZ' 서열 사이에 SalI 제한효소 부위가 제거되었고 lacZ'서열 바로 뒤에 새로운 SalI 부위가 도입되어 있다.

2) Tac 전사 활성화 서열 및 이.콜라이 베타갈락토시다제효소를 코우드화하는 뉴클레오티드 서열을 전사. 해독 및 발현과정에 적합하도록 끼워넣기 위하여 제2도의 방법을 사용하였다.

pTBG10 플라스미드 DNA 2ug 을 완충용액II(50mM Tris-Cl, pH8.0 ; 10mM MgCl₂; 50mM NaCl)에서 37℃의 온도로 2시간 동안 SalⅠ 제한효소로 분해한후(제2도 참조)페놀과 클로로포름으로 추출하였다. 추출된 용액에 2배 부피의 에탄올을 섞고 -70℃ 에서 15분간 침전시킨후 원심분리에 의해 DNA를 회수 하였다.

또한 프리 -S2 코우드로 된 뉴클레오티드 서열을 갖는 DNA 단편을 얻기위하여 pHBSC50 플라스미드 (제1도 참조) DNA 10ug을 완충용액 Ⅰ(50mM Tris-Cl, pH8.0 ; 10mM NaCl)에서 AvaII 제한효소로 37℃ 에서 2시간 동안 분해한 후 완충용액 II 의 조건에서 SalI 제한효소로 다시 분해하였다.

분해되어 생겨난 DNA 단편들을 1.8% 아가로즈 젤(agarose gel) 전기영동법에 의해 크기에 따라 분리한 후 프리-S2 코우드로 된 뉴클레오티드 서열이 포함된 165bp SalI-AvaII DNA 단편을 분리하였다(제2도참조). 분리된 DNA 단편 100ng과 위에서 회수한 SalI 제한효소로 처리된 pTBG10 플라스미드 DNA 600ng 을 섞고 완충용액 III(66mM Tris-Cl, pH7.6 ; 5mM MgCl₂; 50mM dithiothreitol ; 1mM ATP)의 조건하에서 T4 DNA 리가아제로 10℃ 에서 12시간동안 처리하였다

이후, 페놀과 클로로포름 추출 및 에탄을 침전에 의해 처리된 DNA 를 회수하고 완충용액 IV(50mM Tris-Cl, pH7.2 ; 10mM MgSO₄; 0.1mM dithiothreitol ; 50ug/ml bovine serum albumin ; 2nM dATP, dCTP, dGTP, TTP)의 조건하에서 클리나우 효소로 20℃ 에서 30분동안 처리하였다.

페놀과 클로로포름 추출 및 에탄올 침전에 의해 회수된 DNA 를 완충용액 III에서 T4 DNA 리가아제로 10℃ 에서 12시간동안 처리하여 목적하는 pTBG(H-) (KCTC 8314p) 플라스미드를 제조하였다. 위의 방법으로 제조된 pTBG(H-) 플라스미드에는 Tac 전사활성화 서열, 이.콜라이 락토오즈 해독 활성화 서열, 해독 시작서열. 프리-S2 코우드로 된 뉴클레오티드 서열, 이.콜라이 베타갈락토시다제효소를 코우드화하는 뉴클레오티드 서열이 순서대로 전사, 해독 및 발현과정에 적합하도록 연결되어 있다(제1도 및 제2도 참조).

[실시예 2]

이.콜라이 베타갈락토시다제 효소의 아미노 말단을 코우드화하는 뉴클레오티드 서열 뒤에 프리-S2 코우드로 된 뉴클레오티드 서열을 연결하기 위하여 제3도의 방법을 사용하였다. 프리-S2 코우드로 된 뉴클레오티드 서열과 S 코우드로 된 뉴클레오티드 서열의 일부를 갖는 pHBSC51 플라스미드(제1도참조) DNA 12ug을 완충용액I에서 HindIII 제한효소로 37℃ 에서 2시간동안 분해한후 다시 완충용액II 에서 SalI 제한효소로 37℃ 에서 2시간 동안 분해 하였다. 분해된 DNA 단편들을 1.8% 아가로즈 젤 전기영동법에 의해 크기에 따라 분리한 후 프리-S2 코우드로 된 뉴클레오티드 서열과 S 코우드로 된 뉴클레오티드 서열의 일부를 포함하는 259bp SalI-HindⅢ DNA 단편을 분리하였다(제3도참조). 해독 및 전사정지화 서열을 갖는 뉴클레오티드 서열을 얻기 위하여 pINIII-AI 플라스미드를 SalI 및 HindIII 제한효소로 분해하여 1% 아가로즈 젤 전기영동법에 의해 원하는 뉴클레오티드 서열이 포함된 약 950bp DNA 단편을 분리하였다.

위에서 얻은 두 DNA 단편을 T4 DNA 리가아제의 처리에의해 연결한후 1% 아가로즈 젤 전기영동법에 의해 크기에 따라 분리하여 목적하는 1209bp SalI 단편을 회수하였다. 이 DNA 단편 20ng 과 SalI 제한효소로 분해된 pCT10 플라스미드 DNA 100ng 을 완충용액 III 의 조건하에서 T4 DNA 리가아제로 10℃에서 12시간 동안 처리하여 pCTHB1 플라스미드 (KCTC 8315p)를 제조하였다(제3도참조). 위의 방법으로 제조된 pCTHB1 플라스미드에는 Tac 전사활성화 서열, 이.콜라이 락토오즈 해독 활성화 서열, 해독 시작 서열, 이.콜라이 베타갈락토시다제 효소의 아미노 말단 약 350개 아미노산 서열을 코우드화하는 뉴클레오티드 서열(lacZ), 프리-S2 코우드로 된 뉴클레오티드 서열과 S 코우드로 된 뉴클레오티드 서열의 일부(S'), 해독 정지 서열, 이.콜라이 리포프로테인 전사 정지화 서열 등이 전사, 해독 및 발현과정에 적합하도록 연결 되어 있다(제1도 및 제3도 참조). pCTHB10 플라스미드 (KCTC 8316p)를 제조하기 위해서는 위와같은 방법을 사용하였으나 프리-S2 코우드로 된 뉴클레오티드 서열로서 pHBSC10 플라스미드 DNA 의 183bp SalI-HindIII DNA 단편을 사용한 점이 다르며 S 코우드로 된 뉴클레오티드 서열(S') 이 포함되어 있지 않다.(제1도, 제3도 및 제4도 참조). 또한, pCHTB20 플라스미드 (KCTC 8317p) 도 위와 같은 방법으로 제조하였고 차이점은 이.콜라이 베타갈락토사다제의 뉴클레오티드 서열로서 아미노 말단에 약 200개 아미노산 서열을 코우드화하는 뉴클레오티드 서열이 사용되었다는 것이다(제5도 및 제8도 참조).

[실시예 3]

생성되는 융합 단백질의 수율을 높게 유지시키고 융합 단백질을 시안브콤 (CNBr) 으로 처리하여 생겨나는 펩티드 혼합물로부터 프리-S2 코우드로 된 펩티드를 크기에 따라 쉽게 분리할 수 있도록 제6도와 같은 방법을 고안 및 사용하여 pCTHB30 플라스미드 (KCTC 8318p)를 제조하였다(제6도 및 제8도 참조).

pCTHB10 플라스미드 DNA 20ng을 ClaI 제한효소로 완충용액V (50mM Tris-Cl, pH8.0 ; 10mM MgCl₂)에서 37℃로 2시간 동안 처리한 후 1.5% 아가로즈 젤 전기영동법에 의해 크기에 따라 분리하여 이.콜라이 베타갈락토시다제 효소의 약 280-355 아미노산 잔기의 서열을 코우드와하는 253bp DNA 단편을 분리하였다. 이들, 이.콜라이 베타칼락토시다제 효소의 아미노 말단 약 200개 아미노산 서열을 코우드화하는 뉴클레오티드 서열 뒤의 ClaI 제한효소 자리에 번역 프레임(reading frame) 이 맞도록 연결하기 위하여 다음의 방법을 사용하였다.

이.콜라이 베타칼락토시다제 효소의 말단 약 200개 아미노산을 코우드화하는 뉴클레오티드 서열이 포함된 pCTHB20 플라스미드 DNA 5ug을 SalI 제한효소로 부분절단하여 2개의 SalI 제한효소 자리중에서 한 자리만 절단된 DNA를 0.8% 아가로즈 젤 전기영동법에 의해 분리하였다. 절단된 DNA를 완충용액 IV의 조건하에서 클리나우 효소를 20℃에서 30분간 처리한후 페놀과 클로로포름 추출 및 에탄을 침전에 의해 DNA를 회수하였다. 회수된 DNA를 완충용액 III의 건조하에서 T4 DNA 리가아제로 10℃에서 12시간동안 처리하여 pCTHB25 플라스미드를 제조하였다.

이러한 방법으로 번역 프레임을 변형시킨 후 위에서 분리한 253bp ClaI 단편과 ClaI 제한효소를 처리된 pCTHB25 플라스미드 DNA를 T4 DNA 리가아제의 처리에 의해 연결하여 pCTHB30 플라스미드를 제조하였다.

위의 방법으로 제조된 pCTHB30 플라스미드에는 이.콜라이 베타칼락토사다제의 아미노 말단 약 200개 아미노산 서열 다음에 약 80개의 아미노산이 결여되고 그 뒷부분에 약 280에서 355까지의 아미노산 사슬이 연결된 번형된 폴리펩티드를 코우드화 하는 뉴클레오티드 서열(lacz"')이 포함되어 있다(제8도 참조).

[실시예 4]

프리-S2 코우드로 된 뉴클레오티드 서열로 adr 아형(subtype) 아미노산 서열을 코우드화하는 뉴클레오티드 서열을 사용하기 위하여 제7도와 같은 방법을 사용하였다. pCTH30 플라스미드 DNA 20ug을 SalI 제한 효소로 부분절단하여 두개의 SalI 자리중에서 한 자리만 절단된 DNA를 0.8% 아가로즈 젤 전기영동법으로 분리하였다. 이 DNA를 HindIII 제한효소로 절단하여 HindIII-SalI DNA 단편을 0.8% 아가로즈 젤 전기영동법으로 분리하였다. adr 아형의 아미노산 서열을 코우드화하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 DNA 단편을 얻기 위하여 pHBV(adr) 플라스미드(한국생화학회지, 제17권, 70페이지, 1984년, 김연수와 강현삼지음) DNA 20ug을 BstEII와 ShoI 제한효소로 절단하여 527bp의 BstEII-XhoI DNA 단편을 1.2% 아가로즈 젤 전기영동법으로 분리하였다. 이 DNA 단편을 DdeI과 AvaII 제한효소를 절단하여 157bp DdeI-AvaII DNA 단편을1.8% 아가로즈 젤 전기영동법으로 분리하여 프리-S2 코우드로 된 뉴클레오티드 서열의 DNA를 얻었다. 이 DNA 단편을 상기의 HindIII-SalI으로 분해된 pCTHB30 플라스미드 DNA에 삽입시키기 위해 합성링커 2 및 합성링커 3과 함께 섞어 T4 DNA 리가아제로 연결시킨후 HindIII 제한효소로 절단하고 1.8% 아가로즈 젤 전기영동법으로 크기에 따라 분리하여 189bp DNA 단편을 얻었다(제7도 참조). 이 DNA 단편은 adr 아형의 프리-S2 코우드로 된 뉴클레오티드 서열을 지니고 있으며 5' 말단은 SalI 절단 부위와, 3' 말단은 HindIII 절단 부위와 연결될 수있다.

이 DNA 단편을 PCTHB30 플라스미드의 HindIII-SalI DNA 단편과 T4 DNA 리가아제로에 의해 연결시켜서 pCTHB40 플라스미드(KCTC 8319p)를 제조하였다(제7도 참조). 위의 방법으로 제조된 pCTHB40 플라스미드에는 pCTHB30에서와 마찬가지로 Tac 전사 활성화 서열, 이.콜라이 락토오즈 해독 활성화 서열, 해독 시작 서열. 이.콜라이 베타갈락토시다제 효소의 변형된 아미노 말단 약 280개 아미노산 서열을 코우드화하는 뉴클레오티드 서열(lacz"'), adr 아형의 프리-S2 코우드로된 뉴클레오티드 서열, 해독 정지 서열, 이.콜라이 리포프로테인전사 정지화 서열이 전사, 해독 및 발현과정에 적합하도록 연결 되어 있다(제6도, 제7도 및 제8도 참조).

[실시예 5]

시실예 1에서 제조된 pTBG(H-) 플라스미드 DNA를 이.콜라이 JM103균주(Messing 등, Nucleic Acid Research, 제9권, 309페이지, 1981년)에 형질전환시키기 위해서 칼슘클로리드(CaCl₂) 방법을 사용하였다(Mandel 과 Higa, J. Mol. Biol., 제53권, 154페이지, 1970년), 형질전환된 균주를 X-gal(2% v/v)과 엠피실린(50mg/ml)이 포함된 배지에서 37℃로 16시간 동안 배양하여 푸른색의 콜로니를 일차 선별한 후 이차적으로 플라스미드 DNA를 분리하여 제한효소 절단에 의한 분석방법에 의해 pTBG(H-) 플라스미드를 갖는 이.콜라이 JM103균주(E.coli JM103/pTBG(H-)를 선별하였다. 이 균주로부터 프리-S2 코우드로된 펩터드와 이.콜라이 베타칼락토시다제 효소가 융합된 폴리펩티드의 생성을 유도하기 위하여 다음의 방법을 실시하였다.

이.콜라이 JM103/pTBG(H-) 균주를 LB배지 (1L에 트립톤 10g, 효모 추출물 5g, NaCl 10g ; pH7.5)에서 37℃로 16시간동안 배양한 후 이 배양액 1ml을 LB 배지 100ml에 접종하여 500ml플라스크에서 배양하였다. 37℃에서 2시간동안 배양한 후 이소-프로필-베타-갈락토시드(iso-propyl-β-D-galactoside, IPTG)를 최종 1mM이 되도록 넣어 융합 폴리펩티드의 생성을 유도하였다. 유도 후 6시간동안 배양하여 8% SDS-폴리아크릴아미드 젤 전기영동(SDS-polyacrylamide gel electrophoresis) 방법에 의해 생성된 융합 폴리펩티드를 확인하였다(제9(a)도 참조). 생성된 융합 폴리텝티드 중에 프리-S2 코우드로 된 펩티드의 항원성(antigenicity)을 확인하기 위해서 요오드-125로 표식된 감염 표면항원에 대한 항체(125I-Amtibody against HBsAg, Abbott회사)를 사용하여 웨스턴 블럿 실험(Western blot, Towbin 등, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 제76권, 4350페이지, 1979년)을 행하였다(제9(b)도 참조) 이.콜라이 JM103/pTBG(H-) 균주에서 생산된 플리-S2-베타갈락토시다제 융합 단백질은 베타갈락토시다제 친화성 컬럼 크로마토그라피 방법(Ullmann, Gene, 제29권, 27페이지, 1984)을 사용하여 분리정제 되었으며 그 순수도는 SDS-폴리아크릴아미드 젤 전기영동방법으로 확인되었다.(제9(c)도 참조).

[실시예 6]

프리-S2 펩티드가 베타칼락토시다제의 카르복시 말단에 융합된 것을 생산하기 위해서 실시예 2,3 및4에서 제조된 pCTHB10, pCTHB20, pCTHB30, 및 pCTHB40 플라스미드 DNA를 칼슘클로리드로 처리된 이.콜라이 JM109 균주(Yanisch-Perron등, Gene, 제33권, 103페이지, 1985년)에 형질전환시켰다. 형질전환된 균주의 선별 및 융합 폴리펩티드 생성의 유도는 실시예 5에서와 같이 행하였다. 유도된 이.콜라이 JM109/pCTHB10, JM109/pCTHB20, JM109/pCTHB30, 및 JM109/pCTH40 균주들은 위상차 현미경으로 관찰한 결과 세포내에 단백질 과립(Inclusion Body)을 포함하고 있었다(제10도 참조). 이 단백질 과립은 세포를 분쇄하였을때 불용성 침전물 상태로 원심분리법(1,000g에서 5분간)에 의해 쉽게 분리되었으며, 거의 대부분의 베타갈락토시다제-프리-S2 융합 폴리펩티드로 구성되어 있었다. 상기의 형질전환된 균주에서 생산된 베타갈락토시다제 프리-S2 융합 폴리펩티드는 SDS-폴리아크릴아미드 젤 상에서 기대했던 분자량의 위치에서 나타났으며(제11(a)도 참조), 프리-S2 코우드로 된 펩티드의 항원성도 웨스턴 블럿 실험에 의해확인되었다(제11(b)도 참조). 이들 융합 폴리펩티드의 수율은 덴시토메트리 스캔(Densitometry Scan)으로 측정한 결과 총 세포 단백질의 45-60% 정도로 생산되었다.

재조합 DNA에 의해 생성된 베타갈락토시다제-프리-S2 융합 단백질로 부터 프리-S2 펩티드를 분리해 내기 위해서 다음과 같은 방법을 사용하였다. pCTHB30 플라스미드를 포함하는 이. 콜라이 JM109 균주를 1l의 LB 배지에서 배양하고 실시예 5에서와 같은 융합 폴리펩티드의 생성을 유도하였다.

배양액에서 세포를 원심분리(3000g)에 의해 수거하고 40ml의 50mM Tris-Cl(pH8.0)에 녹인 후 초음파로 세포를 분쇄하였다. 이 세포 추출액을 또 다시 원심분리하여 융합 단백질 과립을 회수하였다. 이 과립을 40ml의 90% 포름산(formic acid)에 녹인후 200배 몰수의 시안브롬(CNBr) 용액 10ml을 가하여 36시간 동안 반응시켰다.

위의 반응에서 얻어진 펩티드 절편들은 G-75젤 크로마토그라피 방법으로 분리하여 pre-S2 펩티드만을 분리 정제하였다. 순수 정제된 pre-S2 펩티드는 SDS-폴리아크릴아미드 젤 전기영동법으로 분자량을 측정한 결과 기대했던 위치에서 밴드가 나타났다(제12도 참조).

Claims (27)

1. 전사 및 해독 활성화 서열, 폴리펩티드의 아미노 말단을 코우드화하는 뉴클레오티드 서열, 간염 B형 바이러스의 표면항원(HBsAg)유전사 부위중에서 프리-S₂코우드로된 뉴클레오티드 서열, 해독 및 전사 정지화시그날이 발현과정에서 적합하도록 함에 있어서, 발현되는 HBsAg 유전자 부위가 프리-S₂유전자 코우드로된 뉴클레오티드 서열 다음에 S코우드로된 폴리펩티드의 소수성 아미노 말단 부위를 코우드화하는 뉴클레오티드 서열이 연결되는 것을 특징으로 하는 벡터.
2. 전사 및 해독 활성화 서열, HBsAg 유전자 부위중에서 프리-S₂코우드로된 뉴클레오티드 서열, 폴리펩티드를 코우드화하는 뉴클레오티드 서열, 해독 및 전사 정지화 시그날이 발현과정에 있어서, 폴리펩티드를 코우드화하는 뉴클레오티드 서열이 이.콜라이베타갈락토시다제를 코우드화하는 뉴클레오티드 서열인 것을 특징으로 하는 벡터.
3. 제1항에 있어서, 발현되는 HBsAg 유전자 부위가 55개 아미노산을 코우드화하는 프리-S₂코우드로된 뉴클레오티드 서열 바로 뒤에 해독 정지 시그날이 연결된 뉴클레오티드 서열을 함유하는 벡터.
4. 제1,2 및 3항에 있어서, 발현되는 HBsAg 유전자 부위가 adw2 또는 adr 아형의 아미노산 서열을 코우드화하는 뉴클레오티드 서열인 벡터.
5. 제1항에 있어서, 폴리펩티드의 아미노 말단을 코우드화하는 뉴클레오티드 서열이 이.콜라이 베타갈락토시다제의 아미노 말단 아미노산을 코우드화하는 뉴클레오티드 서열인 벡터.
6. 제1항에 또는 제5항에 있어서, 폴리펩티드의 아미노 말단을 코우드화하는 뉴클레티드 서열이 이.콜라이 베타갈락토시다제의 아미노 말단 약 200개 또는 350개의 아미노산 서열을 코우드화하는 뉴클레오티드 서열인 벡터.
7. 제1항 또는 제5항에 있어서, 폴리펩티드의 아미노 말단을 코우드화하는 뉴클레티드 서열이 이.콜라이 베타갈락토시다제의 아미노 말단 약 200개 아미노산 서열 다음에 아미노산 잔기 280에서 355까지의 아미노산 서열이 연결된 폴리펩티드를 코우드화하는 뉴클레오티드 서열인 벡터.
8. 제1항에 또는 제2항에 있어서, 전사 활성화 서열이 Tac 전사활성화 서열인 벡터.
9. 제1항에 있어서, 전사 정지화 서열이 이.콜라이 리포프로테인 전사 정지화 서열인 벡터.
10. 제1항 또는 제2항에 있어서, 재조합제 DNA 발현백터가 플로스미드인 벡터.
11. PUC12 플라스미드 DNA를 ECOR₁과 HincII 제한효소를 절단한후 감염바이러스 DNA에서 분리된 프리-S₂유전자를 포함하는 221bp, ECORI-HincII DNA 단편이 삽입된 플라스미드 PHBSC12.
12. Tac 전사 활성화서열, 이콜라이락토오스 해독 활성화서열, 해독시작 해열, 이.콜라이베터 갈락토시다제 효소의 아미노 말단 약 350개 아미노산 서열을 코우드화하는 뉴클레오티드 서열(lacz'), 프리-S₂코우드로 된 뉴클레오티드 서열과 S코우드로된 뉴클레오티드 서열의 일부(S), 해독 정지서열, 이. 콜라이 리포프로테인 전사 정지화 서열등이 전사, 해독 및 발현과정에 적합토록 연결된 플라스미드 PCTHB1.
13. 프리-S₂코우드로된 뉴클레오티드 서열로서 PHBSC50 플라스미드 DNA 의 183bp SalI-HindIII DNA 단편을 사용한 플라스미드 PCTHB10.
14. 이.콜라이 베타 갈락토시다제의 뉴클레오티드 서열로서 아미노 말단에 약 200개 아미노산 서열을 코우드화하는 뉴클레오티드 서열이 사용된 플라스미드 PCTHB20.
15. 이.콜라이 베타 갈락토시다제의 아미노 말단 약 200개 아미노산 서열 다음에 약 80개의 아미노산이 결여되고 그 뒷부분에 약 280개에서 355까지의 아미노산사슬이 연결된 변형된 폴리펩티드를 코우드화하는 뉴클레오티드 서열(lacz")이 포함되는 플라스미드 PCTHB30.
16. 뉴클레티드 서열(lacz'"), adr아형의 프리-S₂코우드로 된 뉴클레오티드 서열, 해독 정지서열, 이. 콜라이 리포프로테인전사 정지화 서열이 전사. 해독 및 발현과정에 적합하도록 연결된 플라스미드 PCTHB40.
17. Tac 전사활성화 서열, 이.콜라이 락토오스 해독 활성화 서열, 해독시작 서열, 프리-S₂코우드로 된 뉴클레오티드 서열, 이. 콜라이 베타 갈락토시다제 효소를 코우드화하는 뉴클레오티드 서열이 순서대로 전사, 해독 및 발현과정에 적합토록 연결된 플라스미드 PTBG(H-).
18. 제1,2,3,4,11,12,13,14,15,16,17항중 어느 하나의 벡터에 의해 형질전환된 이. 콜라이 균주.
19. a)전사 및 해독 활성화서열 폴리펩티드의 아미노 말단을 코우드화하는 뉴클레오티드 서열, 간염 B형 바이러스의 표면항원 HBsAg 유전자 부위중에서 프리-S₂코우드로 된 뉴클레오티드 서열, 해독 및 전사 정지화 시그널이 발현과정에서 적합하도록 연결된 DNA서열을 벡터에 삽입하고, b) 이 재조합된 발현벡터를 숙주미생물에 도입하여 숙주미생물이 프리-S₂유전자 코우드로된 펩티드를 갖는 융합 단백질을 생성하도록 배양시키고, c) 생성된 융합 단백질로부터 프리-S₂유전자 코우드로된 펩티드만을 분리해 내는 것을 특징으로하여 프리-S₂유전자 코우드로된 펩티드를 제조하는 방법.
20. a)전사 및 해독 활성화 서열, HBsAg 유전자 부위중에서 프리-S₂코우드로된 뉴클레오티드 서열, 폴리펩티드를 코우드화하는 뉴클레오티드 서열, 해독 및 전사 정지화 시그날이 발현과정에 적합하도록 연결된 DNA 서열을 갖는 발현 벡터를 제조하고, b) 이 재조합된 발현벡터를 숙주미생물에 도입하여 프리-S₂유전자 코우드로 된 펩티드를 갖는 융합 단백질을 생성하는 것을 특징으로 하여 프리-S₂유전자 코우드로된 융합 단백질 효소를 제조하는 방법.
21. 플라스미드 PCTHB1, PCTHB10, PCTHB20, PCTHB30, 및 PCTHB40으로 캄피턴트 세포를 형질 전환시킨 후, 형질전환된 세포를 유전자 발현 및 유도에 적절한 중식조건하에서 배양시킴을 특징으로하여 세포내에 균질성이 높은 단백질 과립을 제조하는 방법.
22. 제19항 또는 제21항에 있어서, 형질전환된 숙주세포가 이.콜라이인 방법.
23. 제21항에 있어서, 제조된 균질성이 높은 단백질 과립으로부터 추출 및 분리된 융합 폴리펩티드를 시안브롬(CNBr)으로 처리하여 프리-S₂코우드로된 펩티드를 제조하는 방법.
24. 플라스미드 PTBG(H-)로 캄피턴트 세포를 형질전환 시킨후, 형질전환된 세포를 유전자 발현 및 유도에 적절한 중식조건하에서 배양시킴을 특징으로하여 프리-S₂코우드로된 펩티드를 포함하는 융합 단백질 효소를 제조하는 방법.
25. 제30항 또는 24항에 있어서, 형질전환된 숙주 세포가 이.콜라이인 방법.
26. 제24항에 있어서, 제조된 융합 단백질 효소를 베타 갈락토시다제 친화성 컬럼 크로마토그라피 방법으로 분리, 정제하는 방법.
27. 제24항 또는 26항에 있어서, 생성된 융합 단백질을 시안브롬(CNBr)으로 처리하여 프리-S₂코우드로된 펩티드를 제조하는 방법.

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