JPH0690769A - バキュロウイルス発現系 - Google Patents

バキュロウイルス発現系

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JPH0690769A JP3339292A JP33929291A JPH0690769A JP H0690769 A JPH0690769 A JP H0690769A JP 3339292 A JP3339292 A JP 3339292A JP 33929291 A JP33929291 A JP 33929291A JP H0690769 A JPH0690769 A JP H0690769A
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Timothy C Peakman
チャールズ ピークマン ティモシィ
Martin J Page
ジョン ペイジ マーチン
Ian George Charles
ジョージ チャールズ アイアン
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Abstract

(57)【要約】 【目的】 組換えバキュロウイルスで感染させた細胞か
ら、高レベルで蛋白を発現させる方法を提供する。 【構成】 細胞中の遺伝子の発現を指令することがで
き、 【化１】 ＴＡＡＴＣＡＴＣＣＡＣＡＧＧＡＧＡＣＴＴＴＣＴＧ よりなるリーダー配列がその前に存在する異種遺伝子に
機能的に結合したプロモーターを有する、組換えバキュ
ロウイルスで感染させた細胞を、蛋白が得られる条件で
培養することにより、高レベルの蛋白の発現を可能にす
る。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】本発明は、バキュロウイルス発現系による
蛋白の調製に関する。
【０００２】バキュロウイルスベクター系は、原核およ
び真核遺伝子の発現に使用されてきた。これらの遺伝子
の発現は、バキュロウイルス（特にオートグラファ・カ
リフォルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒ
ｎｉｃａ）核多角体病ウイルス（ｎｕｃｌｅａｒ ｐｏ
ｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ）（ＡｃＮＰＶ））
のポリヘドリンプロモーターにより調節される。外来遺
伝子を取り込んでいる組換えバキュロウイルスにより感
染された、培養中の昆虫細胞で、この外来遺伝子は発現
される。
【０００３】組換えバキュロウイルスを得るために、バ
キュロウイルス伝達性ベクターが使用される。このベク
ターはポリヘドリンプロモーターを含む。ポリヘドリン
遺伝子に隣接するバキュロウイルスＤＮＡが与えられ
る。このベクターの残りは典型的には細菌のプラスミッ
ドのＤＮＡにより構成される。外来遺伝子は、このプロ
モーターに発現が調節されるように、ポリヘドリンプロ
モーターの下流の伝達性ベクターに挿入される。
【０００４】次に外来遺伝子とバキュロウイルスを有す
る伝達性ベクターが、バキュロウイルス感染に感受性の
昆虫細胞を同時トランスフェクション （ｃｏ−ｔｒａ
ｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）する。典型的にはスポドプテラ・
フルギペルダ細胞培養物が使用される。次に外来遺伝子
の上流および下流の伝達性ベクター中のウイルスＤＮＡ
と、バキュロウイルスの対応するＤＮＡを含む同種組換
えが起きる。従って外来遺伝子とそのポリヘドリンプロ
モーターがバキュロウイルスに伝達される。この外来遺
伝子を発現させるために組換えバキュロウイルスが培養
される。
【０００５】２つの型のバキュロウイルス伝達性ベクタ
ーがある。第一にポリヘドリンのＡＴＤ翻訳開始コドン
の下流に外来遺伝子がクローン化される制限部位を含む
伝達性ベクターがある。このようなベクターは、外来遺
伝子の生成物がポリヘドリンペプチドのＮ−末端部分に
融合している融合蛋白を与える。
【０００６】第２に、ポリヘドリンの天然のＡＴＧ翻訳
コドンの前でポリヘドリン遺伝子の５’非翻訳リーダー
（５’ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄ ｌｅａｄｅｒ）が
終了し、次に制限部位が与えられる伝達性ベクターがあ
る。このような伝達性ベクターはｐＡｃ３７３であり、
ここでは５’非翻訳リーダーは天然のポリヘドリンＡＴ
Ｇの８塩基上流で終る。この制限部位にクローン化され
た遺伝子は、目的の生成物をコードするオープンリーデ
ィングフレーム（ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇｆｒａｍ
ｅ）が後に続くＡＴＧを含む場合は、完全な蛋白として
発現される。
【０００７】ヨーロッパ特許出願第０３４０３５９号に
おいて我々は、ポリヘドリン遺伝子のＮ−末端の少し下
流の外来遺伝子がクローン化される制限部位を有し、ポ
リヘドリン遺伝子の天然のＡＴＧ翻訳開始コドンの代わ
りの別のヌクレオチドトリプレットが存在するバキュロ
ウイルス伝達性ベクターを記載し特許請求した。好適な
このようなベクターはｐＡｃ３６Ｃである。この型の伝
達性ベクターの使用により蛋白の発現レベルが増加して
いた。
【０００８】驚くべきことに我々は、発現させたい異種
遺伝子の前に原核配列をクローン化することにより発現
レベルがさらに改良されることを見いだした。このバキ
ュロウイルス発現系は原核発現系ではない。どちらかと
いえば、発現は高等な真核と分類される昆虫細胞中で起
きる。本発明の原核リーダー配列の使用により、代わり
にコザック配列（Ｋｏｚａｋ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を使
用するよりも驚くほど高い蛋白の発現レベルが得られ
る。コザック配列は真核発現に最適の配列であると考え
られている。
【０００９】従って本発明は、細胞中の遺伝子の発現を
指令することができ、蛋白をコードし、その前に
【化１１】 ＴＡＡＴＣＡＴＣＣＡＣＡＧＧＡＧＡＣＴＴＴＣＴＧ よりなるリーダー配列が存在する異種遺伝子に機能的に
結合したプロモーターを有する組換えバキュロウイルス
で感染させた細胞を、蛋白が得られる条件で培養するこ
とよりなる蛋白の調製方法を与える。
【００１０】さらに本発明は、組換えバキュロウイルス
で感染させた細胞中の遺伝子の発現を指令することがで
き、その前に
【化１２】 ＴＡＡＴＣＡＴＣＣＡＣＡＧＧＡＧＡＣＴＴＴＣＴＧ よりなるリーダー配列が存在する異種遺伝子に機能的に
結合したプロモーターを有する組換えバキュロウイルス
を与える。
【００１１】本発明のリーダー配列は５’末端で（例え
ばさらに１２個以下のまたは６個以下のヌクレオチド
を）延長することができる。従って、リーダー配列がバ
キュロウイルス伝達性ベクターの制限部位の上にリーダ
ー配列をクローン化できるように、追加のヌクレオチド
を与えてもよい。従って追加のヌクレオチドは１つまた
は複数の制限部位の配列である。ＢａｍＨＩ部位を取り
入れるために５’末端で延長したリーダー配列は
【化１３】 ＡＴＣＣＴＡＡＴＣＡＴＣＣＡＣＡＧＧＡＧＡＣＴＴＴＣＴＧ である。
【００１２】この配列は５’末端でＧヌクレオチドで与
えられる。ＨｉｎｄＩＩＩ部位とＢａｍＨＩ部位の両方
を取り込んでいる配列は、
【化１４】 Ｈｉｎｄ ＩＩＩ Ｂａｍ ＨＩ ＡＧＣＴＴＧＧＡＴＣＣＴＡＡＴＣＡＴＣＣＡＣＡＧＧＡＧＡＣＴＴＴＣＴＧ である。
【００１３】典型的にはリーダー配列は、発現したい異
種遺伝子の翻訳開始コドンに融合される。従ってこのよ
うな状況では、リーダー配列の３’末端は異種遺伝子の
ＡＴＧ翻訳開始コドンに直接融合される。ここで「異種
遺伝子」とは、組換えバキュロウイルスに感染された細
胞では普通産生されないポリペプチドをコードする遺伝
子を意味する。この異種遺伝子は、好ましくはバキュロ
ウイルス遺伝子または昆虫細胞の遺伝子ではない。
【００１４】異種遺伝子は翻訳開始コドンで開始する。
この遺伝子は原核または真核でもよい。これは合成遺伝
子でもよい。この異種遺伝子はある選択されたポリペプ
チドをコードする。選択されるポリペプチドは生理学的
に活性のポリペプチド、例えばヒトの体内で活性のある
ポリペプチドでもよい。このポリペプチドは抗体産生を
刺激することができる。このポリペプチドは破傷風毒素
断片Ｃ、ストロメリシン、百日咳主要表面抗原またはＨ
ＩＶ（ヒト免疫不全症ウイルス）インテグラーゼ蛋白か
ら選択される蛋白でもよい。異種遺伝子にコードされる
他のポリペプチドとしては以下のものがある：Ｂ型肝炎
ウイルス表面抗原；Ｂ型肝炎ウイルスコア抗原；増殖因
子（例えば表皮増殖因子（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏ
ｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ） または腫瘍増殖因子（ｔｒａ
ｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏ
ｒ））；インターフェロン、ＡＩＤＳ関連レトロウイル
スのエンベロープ（ｅｎｖｅｌｏｐｅ）由来のポリペプ
チド；プラスモジウム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）属の細
菌由来のポリペプチド；エプスタイン・バーウイルス
（Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ ｖｉｒｕｓ）由来のポリ
ペプチド；ヒト免疫グロブリン分子の重鎖；ヒト免疫グ
ロブリン分子の軽鎖；マウス免疫グロブリン分子の重
鎖；マウス免疫グロブリン分子の軽鎖；ハイブリッド免
疫グロブリン分子（例えばハイブリッド免疫グロブリン
分子の可変領域はヒトではない（例えばマウスの可変領
域）配列、ハイブリッド免疫グロブリン分子の定常領域
はヒト由来であるか、またはハイブリッド免疫グロブリ
ン分子の相補性決定領域（ＣＤＲｓ）はヒト免疫グロブ
リン由来ではなく（例えばマウスの免疫グロブリン由
来）、ハイブリッド免疫グロブリン分子の残りの配列は
ヒト免疫グロブリン由来である）；そしてアミノ酸を通
して酵素分子に隣接するかまたは結合するハイブリッド
免疫グロブリン分子よりなる融合ポリペプチド。
【００１５】プロモーターは典型的にはポリヘドリンプ
ロモーターである。バキュロウイルスは好ましくはオー
トグラファ・カリフォルニカである。組換えバキュロウ
イルスで感染される細胞は、一般的には昆虫細胞の細胞
株の細胞である。トリコプルジア・ニ（Ｔｒｉｃｈｏｐ
ｌｕｓｉａ ｎｉ）、スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓ
ｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）、ヘリオ
ジス・ジー（Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ ｚｅａ）またはマン
ヅカ・セクスタ（Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａ）の細胞
を使用してもよい。好ましい細胞はスポドプテラ・フル
ギペルダ細胞株の細胞である。
【００１６】組換えバキュロウイルスに感染される細胞
は、典型的には標準的な方法（スマーズとスミス（Ｓｕ
ｍｍｅｒｓ，Ｍ．Ｄ．ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ，Ｇ．
Ｅ．）、１９８７年、バキュロウイルスベクターと昆虫
細胞培養法のマニュアル（Ａ ｍａｎｕａｌ ｏｆ ｍ
ｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｂａｃｕｌｏ ｖｉｒｕｓ ｖ
ｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ ｉｎｓｅｃｔ ｃｅｌｌ ｃｕ
ｔｕｒｅ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ）、 テキサス農業試
験場（Ｔｅｘａｓ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｅｘｐ
ｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｓｔａｔｉｏｎ）、ブルティンＮ
ｏ．１５５５）に従って培養される。目的の蛋白が発現
され、次にこれを単離・精製する。
【００１７】組換えバキュロウイルスは以下の方法で調
製される： （ａ） 組換えバキュロウイルスで感染させた細胞中の
遺伝子の発現を指令することができ、前に
【化１５】 ＴＡＡＴＣＡＴＣＣＡＣＡＧＧＡＧＡＣＴＴＴＣＴＧ よりなるリーダー配列が存在する異種遺伝子に機能的に
結合したプロモーターを有する、組換えバキュロウイル
ス伝達性ベクターを与え、（ｂ） バキュロウイルス感
染に感受性の細胞を、組換えバキュロウイルス伝達性ベ
クターと無傷の（ｉｎｔａｃｔ）野生型バキュロウイル
スＤＮＡで同時トランスフェクション（ｃｏ−ｔｒａｎ
ｓｆｅｃｔｉｏｎ）する。
【００１８】（ｂ）段階でトランスフェクションされる
細胞は一般的には昆虫細胞の細胞株の細胞である。トリ
コプルジア・ニ、スポドプテラ・フルギペルダ、ヘリオ
ジス・ジーまたはマンヅカ・セクスタの細胞をトランス
フェクションしてもよい。好ましい細胞はスポドプテラ
・フルギペルダ細胞株の細胞である。組換えバキュロウ
イルス伝達性ベクターは、典型的にはプロモーター、リ
ーダー配列そして外来遺伝子に隣接するバキュロウイル
スオートグラファ・カリフォルニカのＤＮＡよりなる。
細胞をトランスフェクションもする野生型バキュロウイ
ルスＤＮＡは、オートグラファ・カリフォルニカのゲノ
ムＤＮＡである。
【００１９】同種組換え（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅ
ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）に続いて、プロモーター、リ
ーダー配列、外来遺伝子そして隣接する組換え伝達性ベ
クターのウイルスＤＮＡが野生型バキュロウイルスＤＮ
Ａに伝達される。組換えバキュロウイルスは例えばプラ
ーク（ｐｌａｑｕｅ）測定法でスクリーニングされる。
この組換えバキュロウイルスは精製される。
【００２０】（ａ）段階で使用される組換えバキュロウ
イルス伝達性ベクターも、本発明の一部を構成する。こ
のような伝達性ベクターは、基本的に異種遺伝子よりな
るＤＮＡ配列と本発明のリーダー配列をバキュロウイル
ス伝達性ベクターにクローン化することにより調製され
る。このＤＮＡ配列は、遺伝子の発現を指令するプロモ
ーターの転写制御下になるように、適当な制限部位で伝
達性ベクターにクローン化される。好ましい伝達性ベク
ターはｐＡｃ３６Ｃであり、この場合ＤＮＡ配列はベク
ターのＢａｍＨＩ部位にクローン化されている。
【００２１】あるいは組換えバキュロウイルス伝達性ベ
クターは、リーダー配列を有する伝達性ベクターから調
製される。異種遺伝子は、リーダー配列のすぐ下流の制
限部位で伝達性ベクターにクローン化される。このタイ
プの好適な伝達性ベクターは以下よりなる： （１）ポリヘドリン遺伝子のＮ−末端の下流の外来遺伝
子がクローン化される制限部位、（２）ポリヘドリン遺
伝子の天然のＡＴＧ翻訳開始コドンの代わりのヌクレオ
チドの別のトリプレット、（３）ポリヘドリン遺伝子の
最初の２４個以下から最初の５０個以下の塩基、そして
（４）（３）の下流であるが（１）の前の本発明のリー
ダー配列。
【００２２】ポリヘドリン遺伝子の最初の２７個以下か
ら最初の３９個以下の塩基が存在することが好ましい。
最初の３３個までの塩基が存在してもよい。これらの塩
基の後に１０個以下の塩基のリンカー配列（例えば５個
以下の塩基）が続いており、これはリーダー配列の前で
ある。リーダー配列のすぐ後に、典型的には制限部位
（１）が続く。
【００２３】リーダー配列と異種遺伝子よりなるＤＮＡ
配列は、典型的にはリーダー配列を作成し、リーダー配
列を遺伝子に融合させて調製される。本発明で使用され
る異種遺伝子配列は合成（例えば重複オリゴヌクレオチ
ドをアニーリング（ａｎｎｅａｌｉｎｇ）する） によ
り調製してもよい。あるいはこれはクローン化するか、
またはｃＤＮＡ配列でもよい。
【００２４】以下の例により本発明を説明する。
【００２５】添付の図面において：図１はｐ３６Ｃ−Ｔ
ＥＴｔａｃ２の作成を示す；図２は、（ａ）伝達性ベク
ターｐ３６ＣＳＴ１とｐ３６ＣＳＴＭ２の作成と、
（ｂ）ｐＫＳＳＴ２のＭ１３誘導体上のオリゴヌクレオ
チド指令突然変異誘発（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄ
ｅ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）に使
用されるオリゴヌクレオチドを示す；図３はｐ３６ＣＳ
Ｔ１の構造を示す；図４は、組織メタロプロテアーゼイ
ンヒビター（ＴＩＭＰ）の存在下（□）または欠如下
（▲黒四角▼）での、感染後１、２、３そして４日目の
ｖ３６ＣＳＴＭ２により感染させた細胞溶解物の活性を
示し、Ｃは対照を意味し、Ｗは野生型バキュロウイルス
を意味し、ＤＰＭは１分間当りの分解を意味し、ＥＮＺ
は純粋な酵素の対照量を意味する。
【００２６】図５は、ｐ３６ＣＰ４０とｐ３６ＣＰ４０
ｐｌの作成に使用されるオリゴヌクレオチドの配列を示
す；図６は、ｖＰ４０、ｖ３６ＣＰ４０ｐｌとｖ３６Ｐ
６０ｐｌ（レーン３から５）で感染させた細胞のドデシ
ル硫酸ナトリウム−ポリアクルルアミドゲル電気泳動
（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）の結果を示し、レーン１と７は蛋
白分子量マーカーを含有し、レーン２と６は感染してい
ない細胞である；図７は、ｐＡｃ３６ＣＨＩＶＫとｐＡ
ｃ３６ＣＨＩＶＰの作成に使用されるヌクレオチドの配
列を示す；図８は、ＨＩＶ−１からのインテグラーゼ蛋
白を発現している昆虫細胞の溶解物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ
分析を示す。ここでレーン１；ｖＡｃ３６ＣＨＩＶ／Ｋ
で感染させた細胞の溶解物、レーン２；ｖＡｃ３６ＣＨ
ＩＶ／Ｐで感染させた細胞の溶解物、レーン３；野生型
ウイルスで感染させた細胞の溶解物。レーン４；感染し
ていない細胞の溶解物。レーン５；蛋白分子量マーカー
（矢印はＨＩＶインテグラーゼのバンドを示す）；そし
て図９、図１０、図１１は、実施例２で使用した１．２
ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片の制限地図を示し、
翻訳開始コドンには下線が引いてある。
【００２７】実施例１：破傷風毒素断片Ｃの発現
【００２８】１．材料と方法 細菌株と組換えＤＮＡ法 大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＧ１株とプラスミッドｐＴＥ
Ｔｔａｃ２はすでに記載されている（マコフ（Ｍａｋｏ
ｆｆ）ら、バイオテクノロジー（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ
ｏｇｙ） 第７巻、１９８９年、１０４３−１０４６
頁；ＷＯ９０／１５８７１）。ＤＮＡ操作法はマニアテ
ィス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）らの方法（「モレキュラーク
ローニング：実験室マニュアル」（”Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍ
ａｎｕａｌ”）、 コールドスプリングハーバー研究所
（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ）、
コールドスプリングハーバー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ）、ニューヨーク、米国、１９８２年）
に従い行った。
【００２９】バキュロウイルス法 バキュロウイルス組換え体は、１μｇのＡｃＮＰＶ Ｄ
ＮＡと２μｇの組換えプラスミッドＤＮＡ（バーンボイ
ムとドリー（Ｂｉｒｎｂｏｉｍ ａｎｄ Ｄｏｌｙ）、
ヌクレイック アシッズリサーチ（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉ
ｄｓ Ｒｅｓ）第７巻、１９７９年、１５１３頁の方法
により調製した）を、リン酸カルシウム沈澱法でスポド
プテラ・フルギペルダ細胞に同時トランスフェクション
して作成した。４時間後細胞を一度洗浄し、再びＴＣ１
００培地（フローラボラトリーズ（ＦＬｏｗ Ｌａｂ
ｓ））を加え、２８℃で３日間培養した。次に上清をプ
ラーク法により力価検定をして封入体陰性（ｉｎｃｌｕ
ｓｉｏｎ ｎｅｇａｔｉｖｅ）のプラークを肉眼でスク
リーニングした。スポドプテラ・フルギペルダ細胞の保
存株を室温でスピナーフラスコ（ｓｐｉｎｎｅｒ ｆｌ
ａｓｋｓ）（テクネ（Ｔｅｃｈｎｅ））中で維持した。
３５ｍｍのシャーレ中に、スポドプテラ・フルギペルダ
細胞を１０６細胞／シャーレで接種し、室温で１０−１
５分間吸着させ、次に１００μｇウイルス／シャーレで
感染させてプラーク測定法を行った。室温で１時間後、
ウイルス接種物を吸引除去し、１％アガロース（２部の
ＴＣ１００＋１部の３％シープラーク（Ｓｅａｐｌａｑ
ｕｅ）ＬＧＴアガロース）で重層した。固まってからア
ガロースの上にさらに１ｍｍのＴＣ１００を重層した。
２８℃で３日後ＴＣ１００を除去し、ＰＢＳ中１０％の
中性赤（ｎｅｕｔｒａｌｒｅｄ）（ＢＤＨ）を１ｍｌ／
シャーレで１時間染色してプラークを目に見えるように
した。プラーク精製したクローンをテクネスピナーフラ
スコ中で２８℃で膨張させた。
【００３０】免疫操作 マウスをアルヒドロゲル（ａｌｈｉｄｒｏｇｅｌ）中の
組換え断片Ｃで免疫し、すでに報告されたように毒素負
荷で破傷風に対する免疫性を試験した（フェアウェザー
（Ｆａｉｒｗｅａｔｈｅｒ）ら、インフェクション・ア
ンド・イミュニティ（Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．）第
５５巻、１９８７年、２４５１−２５４５頁）。
【００３１】アフィニティクロマトグラフィーとＥＬＩＳＡ 臭化シアン活性化セファロース（商標）４Ｂに結合した
モノクローナル抗体ＴＴ０８（シェパード（ｓｈｅｐｐ
ａｒｄ）ら、インフェクション・アンド・イミュニティ
（Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．）第４３巻、７１０−７
１４頁、１９８４年）を用いるアフィニティクロマトグ
ラフィーによりスポドプテラ・フルギペルダ抽出物から
断片Ｃを精製した。断片Ｃを０．１Ｍクエン酸ナトリウ
ムｐＨ３．０で溶出し、等量の０．１Ｍのリン酸ナトリ
ウムを添加して中和した。断片Ｃを前述されたように酵
素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）により測定した
（マコフ（Ｍａｋｏｆｆ）ら、１９８９年）。
【００３２】２．結果と考察 断片Ｃのバキュロウイルスへのクローニング 断片Ｃの構造遺伝子は、３−４％の総細胞蛋白で断片Ｃ
の合成を指令する大腸菌発現プラスミッドであるｐＴＥ
Ｔｔａｃ２上に存在する（マコフ（Ｍａｋｏｆｆ）ら、
１９８９年）。断片Ｃは破傷風毒素の切断生成物である
ため、ｐＴＥＴｔａｃ２はＮ−末端のメチオニン残基で
完全な断片Ｃの合成を指令する。その前に配列ＡＧＡＴ
ＣＴＴＡＡＴＣＡＴＣＣＡＣＡＧＧＡＧＡＣＴＴＴＣＴ
ＧＡＴＧが存在する完全な断片Ｃ構造遺伝子を含む１．
４ｋｂのＢｇＩＩＩ−ＢａｍＨＩ断片を、バキュロウイ
ルスの高レベル発現ベクターであるｐ３６ｃの単一のＢ
ａｍＩ部位（ページ（Ｐａｇｅ）、ヌクレイックアシッ
ズリサーチ（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．）第１７
巻、４５４頁、１９８９年）にクローン化した。
【００３３】得られたプラスミッド、ｐ３６ｃ−ＴｅＴ
ｔａｃ２（図１参照）をバキュロウイルスＡｃＮＰＶＤ
ＮＡとともにスポドプテラ・フルギペルダ細胞中に、リ
ン酸カルシウム沈澱法により同時トランスフェクション
した。組換えウイルスを含む細胞を封入体陰性プラーク
をスクリーニングして同定し、プラーク精製後数個の組
換え体を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥとウェスタンブロッティン
グにより断片Ｃの産生についてスクリーニングした（デ
ータは示していない）。
【００３４】１つの組換え体であるＢＶＦＣ１をさらに
研究した。スポドプテラ・フルギペルダ細胞を感染多重
度（ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉ
ｏｎ） ０．１でＢＶＦＣ１で感染させた。ドデシル硫
酸ナトリウム−ポリアクルルアミドゲル電気泳動（ＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥ）による分析のため、毎日細胞を採った。
断片Ｃは２−４日目にＢＶＦＣ１感染細胞により合成さ
れ、３日目の産生量が最大であった。断片Ｃは明らかに
この細胞に産生される主要なポリペプチドの１つであ
り、そのレベルはポリヘドリンよりわずかに低いのみで
あった。
【００３５】スポドプテラ・フルギペルダ細胞をスピナ
ーフラスコ培養で増殖させ、感染多重度１０でＢＶＦＣ
１ウイルスで感染させた。４日後に細胞を収集し、音波
処理により溶解させ、低速および高速遠心分離により可
溶性抽出物を得た。次に細胞蛋白をＳＤＳ−ＰＡＧＥと
ウェスタンブロッティングで分析した。この細胞抽出物
中で５０ｋＤのバンドが主要な蛋白の１つであった。こ
れが断片Ｃであることは、抗−断片Ｃ抗血清に対するウ
ェスタンブロッティングにより確認した。
【００３６】こうして非常に高発現の断片Ｃが得られた
（約４００μｇ／ｍｌ）。モノクローナル抗体ＴＴ０８
を使用するアフィニティクロマトグラフィーにより細胞
抽出物から断片Ｃを精製した。こうして抽出した断片Ｃ
はＳＤＳ−ＰＡＧＥにより純度８０％であると判定し
た。
【００３７】バキュロウイルスにより発現される断片Ｃの免疫原性 クロストリディウム・テタニ（Ｃ．ｔｅｔａｎｉ） ま
たは大腸菌からの断片Ｃは破傷風毒素による負荷（ｃｈ
ａｌｌｅｎｇｅ）からマウスを防御することができる。
バキュロウイルスから得られた断片Ｃがこの活性を保持
しているか否かを調べるために、バキュロウイルスＢＶ
ＦＣ１で感染させておいたスポドプテラ・フルギペルダ
細胞の可溶性抽出物でマウスを免疫した。予備的な結果
はこの調製物は免疫原活性を有することを示していた
（データは示していない）。免疫精製した断片Ｃとその
後に破傷風毒素を負荷してこの試験を繰り返した。その
結果を表１に示す。
【００３８】
【表１】 ａアンヒドロゲル中の抗原をＢＡＬＢ／ｃマウスの皮下
に注射した。２回目の投与は１回目の投与の４週間後に
行った。ｂ 最後の注射後４週間目に、５０ＬＤ５０ｓの破傷風毒
素をマウス（１群当りｎ＝１０）に負荷した。ｃ 破傷風毒素由来
【００３９】０．２５μｇの１回投与または０．０６μ
ｇの２回投与で免疫したマウスは、破傷風の負荷に対し
て充分防御されたため、これはバキュロウイルスで発現
された断片Ｃはこの測定法で生物活性があったことを示
している。免疫に必要な断片Ｃのレベルは、クロストリ
ディウム・テタニまたは大腸菌由来の断片Ｃに必要なレ
ベル（マコフ（Ｍａｋｏｆｆ）ら、１９８９年）と似て
いるため、バキュロウイルス発現物質が同等の活性を有
していることを示している。
【００４０】実施例２：ストロメリシン蛋白の発現
【００４１】１．一般 実施例１の断片Ｃの発現は、真核翻訳に最適と考えられ
ている配列（コザック配列）を用いる断片Ｃの発現と比
較されていなかった。昆虫細胞中で発現が起きるバキュ
ロウイルス発現系は、高度の真核性と分類される。従っ
てコザック規則が適用できるという実験的証拠はない
が、翻訳規則は哺乳動物遺伝子について決められたコザ
ック規則に一致すると考えられる。しかし実施例１で使
用した本発明のリーダーは共通コザック配列に関しては
次善最適（ｓｕｂ−ｏｔｉｍａｌ）である。
【００４２】従って本発明のリーダー配列をコザック次
善最適配列、コザック最適配列、コザック完全配列と比
較するために、実験を行った。最初の実験ではストロメ
リシン蛋白の発現を試験した。２つの作成体を作り測定
した。最初の作成体は、コザック共通配列の翻訳開始コ
ドンＡＴＧの回りで次善最適であるｖ３６ＳＴ１という
名前の組換えバキュロウイルスである： ｖ３６ＳＴ１ ５’ ＧＡＴＣＣＧＡＡＴＴＣ ＡＴＧ Ｔ ３’
【００４３】第２の作成体はｖ３６ＳＴＭ２という名前
の組換えバキュロウイルスで、これはストロメリシン遺
伝子の翻訳開始コドンに融合した本発明のリーダー配列
を含有していた。プロテアーゼ活性を測定して感染した
細胞を定量した。ｖ３６ＳＴ１で感染した細胞のプロテ
アーゼ活性は、バックグランド活性（約４００単位）と
区別できなかった。非感染細胞と野生型ウイルスで感染
した細胞の活性は同様に低かった（２００−３００単
位）。これに対して、ｖ３６ＳＴＭ２で感染した細胞は
約８０００単位のプロテアーゼ活性（すなわち２０倍の
刺激）を有していた。さらに詳細には：
【００４４】２．伝達性ベクターｐ３６ＣＳＴ１とｐ３
６ＣＳＴＭ２の作成 作成したストロメリシン遺伝子を含有する伝達性ベクタ
ー（ｐ３６ＣＳＴ１とｐ３６ＣＳＴＭ２）は、ｐＡｃ３
６Ｃ（ページ（Ｐａｇｅ）、１９８９年）から得られ
た。完全なストロメリシン遺伝子（ウィタム（Ｗｈｉｔ
ｈａｍ）ら、バイオケム・ジェイ（Ｂｉｏｃｈｅｍ．
Ｊ．）第２４０巻、９１３−９１６頁、１９８６年；
イーエムビーエル（ＥＭＢＬ）データベース、コードＨ
ＳＳＴＲＯＭＲ）は、１．２ｋｂのＥｃｏＲＩ−Ｂａｍ
ＨＩ断片として合成され（図９、図１０、図１１）、ｐ
ＵＣ１８プラスミッドにクローン化した。この断片をゲ
ル電気泳動と電気溶出により精製し、図２ａに示す２つ
のオリゴヌクレオチドの１つまたは別の１つに結合さ
せ、次にブルースクリプト（Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ）Ｋ
ＳのＢａｍＨＩ部位にクローン化した。得られたプラス
ミッドをｐＫＳＳＴ１と命名した（図２ａ（１）とｐＫ
ＳＳＴ２（図２ａ（２））。
【００４５】プラスミッドｐＫＫＳＴ１をＢａｍＨＩで
消化し、ゲル電気泳動の後ゲル電気溶出で精製した１．
２ｋｂ断片を、バキュロウイルス伝達性ベクターｐＡｃ
３６Ｃ中に正しい配向でクローン化した。このプラスミ
ッドをｐ３６ＣＳＴ１と命名した（図３）。
【００４６】３．ｐ３６ＣＳＴＭ２の作成−ｐＭ１３Ｓ
Ｔ２の突然変異誘発 ｐＫＳＳＴ２からの１．２ｋｂのＢａｍＨＩ断片を、ゲ
ル電気泳動次にゲル電気溶出で精製し、Ｍ１３ ｍｐ１
９のアンチセンス（ａｎｔｉｓｅｎｓｅ）配向で複製型
のＢａｍＨＩ部位にクローン化した。このプラスミッド
をｐＭ１３ＳＴ２と命名した。しかし原核リーダーの配
列を正確に再生するためには、ストロメリシン遺伝子の
翻訳開始コドンの前に位置する、配列ＡＡＴＴＣを除去
することが必要であった。これは、アマシャムインター
ナショナルオリゴヌクレオチド突然変異誘発キット（Ａ
ｍｅｒｓｈａｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｏｌｉ
ｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ
ｋｉｔ）と、ｐＭ１３ＳＴ２由来の１本鎖Ｍ１３テンプ
レートを使用して行った。使用したオリゴヌクレオチド
を図２ｂに示す。突然変異型ｐＭ１３ＳＴ２の翻訳開始
の回りの配列の位置は、ＤＮＡシークエンシング（ｓｅ
ｑｕｅｎｃｉｎｇ）で確認した。ｐＭ１３ＳＴ２Ｍから
の１．２ｋｂのＢａｍＨＩ断片をプラスミッドの複製型
から精製し、バキュロウイルス伝達性ベクターｐＡｃ３
６Ｃ中に正しい配向でクローン化した。得られたプラス
ミッドをｐＡｃ３６ＣＳＴＭ２と命名した。
【００４７】４．組換えウイルスの作成 スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｆ２１）細胞（ ボー
ゲン（Ｖａｕｇｈｅｎ）ら、インビトロ（Ｉｎ ｖｉｔ
ｒｏ）第１３巻、２１３−２１７頁、１９７７年）を、
１０％胎児牛血清（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ））と５μｇ／
ｍｌゲンタマイシンを補足したＴＣ１００培地中で２７
℃で懸濁培養で増殖させた。ＡｃＮＰＶを懸濁培養で２
７℃でＳｆ２１細胞中で増殖させた。異種遺伝子配列を
含有する組換えウイルスは、Ｓｆ２１細胞中の細胞外ウ
イルス（ＥＣＶ）培養物から精製したＡｃＮＰＶＤＮＡ
で、モル比２０：１の組換え伝達性ベクターｐ３６ＣＳ
Ｔ１とｐ３６ＣＳＴＭ２を同時トランスフェクションし
て作成した。ＡｃＮＰＶＤＮＡの精製法はすでに報告さ
れているもの（スマーズとスミス（Ｓｕｍｍｅｒｓａｎ
ｄ Ｓｍｉｔｈ）、１９８７年、「バキュロウイルスベ
クターと昆虫細胞培養法のマニュアル」（”Ａ ｍａｎ
ｕａｌ ｏｆ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒｂａｃｕｌｏｖ
ｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ ｉｎｓｅｃｔ ｃ
ｅｌｌｃｕｔｕｒｅ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ”）と同様で
であるが、培養物は細胞当り０．１ｐｆｕ（プラーク形
成単位）で感染させ、６日後に収集し、ショ糖密度勾配
段階は省略した。同時トランスフェクションはすでに報
告されたものである（スマーズとスミス（Ｓｕｍｍｅｒ
ｓ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ）、 １９８７年、方法１）。
【００４８】トランスフェクション培養上清の連続希釈
を用いる標準アガロース重層測定法（ブラウウンとフォ
ークナー（Ｂｒｏｗｎ ａｎｄ Ｆａｕｌｋｎｅｒ）、
１９７７年、ジェイ・ジェン・ビロル（Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖ
ｉｒｏｌ）、第３６巻、３６１−３６４頁）により、得
られたＥＣＶを組換え体についてスクリーニングした。
中性赤染色後、多角体（ｐｏｌｙｈｅｄｒａ）の欠如に
ついてスクリーニングして組換えプラークの可能性のあ
るものを肉眼で選択し、０．５ｍｌの培地中に採り、プ
ラーク測定法を繰り返して精製した。２７℃でＳｆ２１
細胞のモノレーヤー（ｍｏｎｏｌａｙｅｒ）培養物の感
染により、組換えウイルスを高力価（＞１０８ｐｆｕ／
ｍｌ）にスケールアップした。得られた高力価ウイルス
をｖ３６ＣＳＴ１とｖ３６ＣＳＴＭ２と命名した。
【００４９】 ５．組換えウイルスで感染させた細胞からの蛋白の分析 第４節に記載した組換えウイルスの構造をサザンブロッ
ティングにより確認した。ポリヘドリン陰性の不活性の
陽性プラークを０．５ｍｌの培地に採り、少なくとも１
時間分散させた。この１００μｌを用いて３５ｍｍの組
織培養皿（ｔｉｓｓｕｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｄｉｓｈ）
中の２×１０６個のＳｆ２１細胞を感染させ、２７℃で
１時間インキュベートした。この接種物を除去し、１ｍ
ｌの新鮮な培地で置換し、プレートを２７℃で３日間イ
ンキュベートした。次に細胞をリン酸緩衝化生理食塩水
（ＰＢＳ）中で洗浄し取り出した。
【００５０】６．バキュロウイルス発現ストロメリシン
のプロテアーゼ活性 組換えウイルスから発現された蛋白を以下のようにして
測定した。感染した細胞を１％のノニデット（Ｎｏｎｉ
ｄｅｔ）Ｐ４０と１５０ｍＭのＮａＣｌで溶解させ、遠
心分離により膜性物質を除去した。残りの溶解液をトリ
チウム化カゼイン（１００μｌトリス緩衝液中２００μ
ｇ−シグマ）とインキュベートした。反応物を３７℃で
２時間インキュベートし、３０％のトリクロ酢酸（ＴＣ
Ａ）５０μｌを添加して反応を停止させた。ＴＣＡで沈
澱した放射能を測定してストロメリシンの活性を求め
た。図４は、ｖ３６ＳＴＭ２に対するこの測定法の結果
を示す。ｖ３６ＳＴ１について得られた価はバックグラ
ンドと実質的に区別できなかったため、表に含まれてい
ない。
【００５１】驚くべきことに、組織メタロプロテアーゼ
インヒビター（ＴＩＭＰ）（ストロメリシンのインヒビ
ター）の存在は細胞溶解液に観察される活性を低下させ
なかった。溶解液中のある因子がストロメリシンの作用
を阻害していると考えられる。これを支持する証拠とし
て、陰性対照の溶解液に既知量の純粋な活性ストロメリ
シンを加える。（ｓｐｉｋｅ）と、観察される活性は予
想より低いということがある。
【００５２】実施例３ 百日咳主要表面抗原の発現 １．一般 バキュロウイルス中でまず２つの作成体を発現させた。
最初のもの（ｖＰ６０ｐｌと呼ぶ）は、百日咳主要表面
抗原（分子量＝６０ｋＤａ）をコードしており、ｐ３６
Ｃ中で発現され、本発明のリーダーを含有していた。ｖ
Ｐ６０ｐｌで感染させた昆虫細胞中のこの蛋白の発現は
非常に効率的であった（４００−５００μｇ／ｍｌ）。
２番目の作成体（ｖＰ４０）は、主要表面抗原の端が切
れた型（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ ｆｏｒｍ）であった。こ
の遺伝子の上流の配列は以下のようにコザック最適配列
であった（コザック完全配列ではないが）： ｖＰ４０ ＧＡＡＴＴＣＡＡＴ ＡＴＧＧ コザック共通 （ＣＣＣ）（ＧＣＣ）ＧＣＣ ＡＣＣ ＡＴＧＧ ＊ ＊＊＊＊ 翻訳開始コドン
【００５３】コザック共通配列中で星印をつけた塩基は
翻訳において、より重要である。括弧内の塩基はそれほ
ど重要ではない。ｖＰ４０で感染させた細胞中の４０ｋ
Ｄａ蛋白の発現はまだ効率的であった（約１００μｇ／
ｍｌ）が、ｖＰ６０ｐｌ感染細胞からのＰ６０の発現よ
り４−５倍低かった。
【００５４】次に行った実験は、ｖＰ６０ｐｌ中と同じ
原核リーダーが前にある４０ｋＤａ蛋白を発現する組換
えウイルスを作成することである。２つの作成体からの
６０ｋＤａ蛋白と４０ｋＤａ蛋白の発現を測定した。ｖ
Ｐ４０からよりｖＰ４０ｐｌからの４０ｋＤａ蛋白の発
現の方が３−４倍高く、ｖＰ６０ｐｌから発現される蛋
白のレベルに近付いていた。
【００５５】２．ｐ３６ＣＰ６０ｐｌ、ｐ３６ＣＰ４０
およびｐ３６ＣＰ４０ｐｌの作成 Ｎ−末端を欠く百日咳主要表面抗原（ＰＭＳＡ）遺伝子
体を、種々の翻訳リーダーとＰＭＳＡのＮ−末端を含有
する合成オリゴヌクレオチドに融合させて、プラスミッ
ドｐ３６ＣＰ４０とｐ３６ＣＰ４０ｐｌを作成した。こ
の２つのプラスミッドの作成に使用したオリゴヌクレオ
チドの配列を図５に示す。
【００５６】（１） ｐ３６ＣＰ６０ｐｌの作成 本発明のリーダーに融合したＰＭＳＡコード配列を含有
する、ｐＰｅｒｔａｃ７からの１．８ｋｂのＢｇｌＩＩ
−ＢａｍＨＩ断片を、ゲル電気泳動とゲル電気溶出によ
り精製し、バキュロウイルス伝達性ベクターｐＡｃ３６
ＣのＢａｍＨＩ部位ヘクローン化した（ページ（Ｐａｇ
ｅ）、１９８９年）。得られたプラスミッドをｐ３６Ｃ
Ｐ６０ｐｌと命名した。
【００５７】（２） ｐＡｃ３６ＣＰ４０とｐＡｃ３６
ＣＰ４０ｐｌの作成 ｐＰｅｒｔａｃ９（ｐＰｅｒｔａｃ７から得られる、マ
コフ（Ｍａｋｏｆｆ）ら）からの４．６ｋｂｐのＢｇｌ
ＩＩ−ＳａｃＩ断片を電気泳動とその後の電気溶出によ
り精製した。コザック最適配列を含むオリゴヌクレオチ
ド対を、ＢｇｌＩＩ−ＳａｃＩ断片としてこのベクター
にクローン化した。シークエンシング後、１．１ｋｂｐ
のＢｇｌＩＩ−ＢａｍＨＩ断片を正しい配向でｐＡｃ３
６ＣのＢａｍＨＩ部位へクローン化した。得られたプラ
スミッドをｐＡｃ３６ＣＰ４０と命名した。
【００５８】プラスミッドｐＡｃ３６ＣＰ４０ｐｌを２
段階で作成した。ｐＰｅｒｔａｃ７からの１．１ｋｂｐ
のＢｇｌＩＩ−ＢａｍＨＩ断片（マコフ（Ｍａｋｏｆ
ｆ）ら、バイオテクノロジー（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏ
ｇｙ） 第８巻、１９９０年、１０３０−１０３３頁）
を精製し、ｐＵＣ９のＢａｍＨＩ部位へアンチセンス配
向でクローン化した。このプラスミッドをｐＵＣ６９−
６と命名した。本発明のリーダーと４０ｋＤａ蛋白のＮ
−末端配列を含有する１対のオリゴヌクレオチドを、Ｂ
ａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ部位断片としてＭ１３ｍｐ１
９の複製型にクローン化した。このオリゴヌクレオチド
の配列をＤＮＡシークエンシングで確認した。この作成
体からの複製型のＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ挿入体を
精製し、ｐＵＣ９プラスミッドのＢａｍＨＩとＨｉｎｄ
ＩＩＩ部位の間にクローン化した。得られたプラスミッ
ドをｐＵＣ９−３と命名した。
【００５９】このｐＵＣ９−３プラスミッドをＳａｃＩ
とＨｉｎｄＩＩＩで消化し、本発明のリーダー、４０ｋ
Ｄａ蛋白のＮ−末端配列およびｐＵＣ９ベクター体を含
む３．０ｋｂ断片を単離した。４０ｋＤａ蛋白のＣ−末
端を含有する１．１ｋｂｐのＳａｃＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ
断片を精製し、ＳａｃＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ消化ｐＵＣ９
−３中にクローン化した。得られたプラスミッドをｐＵ
Ｃ９−１と命名した。このプラスミッドは、リーダーに
融合した４０ｋＤａの端の切れた（ｔｒａｎｃａｔｅ
ｄ）ＰＭＳＡの完全なコード配列を有しており、２つの
ＢａｍＨＩ部位が隣接していた。ｐＵＣ９−１からの
１．２ｋｂのＢａｍＨＩ断片を精製し、ｐＡｃ３６Ｃの
ＢａｍＨＩ部位にクローン化した。得られたプラスミッ
ドをｐＡｃ３６ＣＰ４０ｐｌと命名した。
【００６０】３． 組換えウイルスの産生と組換えウイ
ルスで感染させた細胞からの蛋白の分析 これは実施例２に記載の方法で行った。得られた高力価
ウイルスをｖ３６ＣＰ６０ｐｌ、ｖ３６ＣＰ４０そして
ｖ３６ＣＰ４０ｐｌと命名した。感染した細胞を５％Ｓ
ＤＳで溶解し、生成物を１０％ゲルのＳＤＳ／ポリアク
ルルアミドゲル電気泳動の後クマシーブルー染色で分祈
した。結果を図６に示す。
【００６１】これら生成物の同定と抗原性は、ポリクロ
ーナルウサギ抗血清を用いるウェスタンブロッティング
で確認した（示されていない）。６０ｋＤａの生成物
（レーン５）は実際には６９ｋＤａバンドとして泳動し
た。この異常な泳動の理由は不明である。アミノ酸配列
から予想される分子量は６０ｋＤａである。この６０ｋ
Ｄａ生成物は少し、抗体と交差反応する４０ｋＤａ生成
物に分解している。パルスチェース（ｐｕｌｓｅ−ｃｈ
ａｓｅ）実験で求めると、４０ｋＤａと６０ｋＤａの蛋
白ともに安定である（データは示していない）。発現レ
ベルは上記したようなものであり、本発明のリーダー配
列の使用の優位性を示していた。
【００６２】実施例４：ヒト免疫不全症ウイルス（ＨＩ
Ｖ）インテグラーゼ蛋白の発現１．一般 ２つの作成体を調製し測定した。最初のもの（ｖ３６Ｈ
ＩＶＫ）は、完全コザックリーダー配列に融合したイン
テグラーゼ遺伝子体を含有していた。２番目のもの（ｖ
３６ＨＩＶＰ）は、本発明のリーダー配列に融合したイ
ンテグラーゼ遺伝子体を含有していた。ｖ３６ＨＩＶＰ
によるインテグラーゼ蛋白の発現レベルは、ｖ３６ＨＩ
ＶＫによるインテグラーゼ蛋白の発現レベルより４−５
倍良かった。
【００６３】２．プラスミッドｐＡｃ３６ＣＨＩＶＫと
ｐＡｃ３６ＣＨＩＶＰの作成 ｐＡｃ３６ＣＨＩＶＫとｐＡｃ３６ＣＨＩＶＰ中にイン
テグラーゼ蛋白を含有するＤＮＡの断片を、プラスミッ
ドｐＩＮｐＵＣ１９から得た。この作成体は、１．６ｋ
ｂｐのＫｐｎＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片上にＨＩＶインテ
グラーゼ蛋白コード配列を含有していた（シャーマンと
ファイフェ（Ｓｈｅｒｍａｎ ａｎｄＦｙｆｅ）、ピー
エヌエーエス ユーエスエー（ＰＮＡＳ ＵＳＡ） 第
８７巻、５１１９−５１２３頁、１９９０年）。部位指
令突然変異誘発により、ＨＩＶインテグラーゼ蛋白のＮ
−末端フェニルアラニンのすぐ横にに隣接して、Ｎｄｅ
Ｉ部位が導入されていた。プラスミッドｐＡｃ３６ＣＨ
ＩＶＰとｐＡｃ３６ＣＨＩＶＫは、ｐＩＮｐＵＣ１９か
らの８９８ｂｐのＮｄｅＩ断片をゲル電気泳動の後ゲル
電気溶出で精製して作成した。次にこの断片を図７に示
すオリゴヌクレオチドの対の１つに結合させ、ｐＡｃ３
６ＣのＢａｍＨＩ部位へクローン化した。ＡＴＧに融合
した本発明のリーダーを含有する作成体はｐＡｃ３６Ｃ
ＨＩＶＰと命名し（図７ａ）、完全コザック共通配列を
含有するものはｐＡｃ３６ＣＨＩＫＫと命名した。
【００６４】３． 組換えウイルスの作成と組換えウイ
ルスで感染させた細胞からの蛋白の分析 これは実施例２に記載した方法で行った。得られた高力
価ウイルスをｖ３６ＣＩｎｔＫとｖ３６ＣＩｎｔＰと命
名した。感染した細胞（２×１０６個、７２ｈｐｉ）を
１００μｌの１５０ｍＭトリス、５％ＳＤＳ、２５％グ
リセロールと０．１％Ｗ／Ｖプロモフェノールブルーで
溶解した。 これらの溶解物の試料を１０％ＳＤＳ／Ｐ
ＡＧＥゲルで分析した（図８）。ｖＡｃ３６ｃＨＩＶ／
Ｐで感染させた細胞はｖＡｃ３６ＣＨＩＶ／Ｋで感染さ
せた細胞よりも約５倍高いレベルでＨＩＶインテグラー
ゼを発現した。
【図面の簡単な説明】
【図１】 ｐ３６Ｃ−ＴＥＴｔａｃ２の作成を示す。
【図２】 （ａ）伝達性ベクターｐ３６ＣＳＴ１とｐ３
６ＣＳＴＭ２の作成と（ｂ）ｐＫＳＳＴ２のＭ１３誘導
体上のオリゴヌクレオチド指令突然変異誘発に使用され
るオリゴヌクレオチドを示す。
【図３】 ｐ３６ＣＳＴ１の構造を示す。
【図４】 組織メタロプロテアーゼインヒビター（ＴＩ
ＭＰ）の存在下（□）または欠如下（▲黒四角▼）で
の、感染後１、２、３そして４日目のｖ３６ＣＳＴＭ２
により感染させた細胞溶解物の活性を示し、Ｃは対照を
意味し、Ｗは野生型バキュロウイルスを意味し、ＤＰＭ
は１分間当りの分解を意味し、ＥＮＺは純粋な酵素の対
照量を意味する。
【図５】 ｐ３６ＣＰ４０とｐ３６ＣＰ４０ｐｌの作成
に使用されるオリゴヌクレオチドの配列を示す。
【図６】 ｖＰ４０、ｖ３６ＣＰ４０ｐｌとｖ３６Ｐ６
０ｐｌ（レーン３から５）で感染させた細胞のドデシル
硫酸ナトリウム−ポリアクルルアミドゲル電気泳動（Ｓ
ＤＳ−ＰＡＧＥ）の結果を示し、レーン１と７は蛋白分
子量マーカーを含有し、レーン２と６は感染していない
細胞である。
【図７】 ｐＡｃ３６ＣＨＩＶＫとｐＡｃ３６ＣＨＩＶ
Ｐの作成に使用されるヌクレオチドの配列を示す。
【図８】 ＨＩＶ−１からのインテグラーゼ蛋白を発現
している昆虫細胞の溶解物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示
す。ここでレーン１；ｖＡｃ３６ＣＨＩＶ／Ｋで感染さ
せた細胞の溶解物、レーン２；ｖＡｃ３６ＣＨＩＶ／Ｐ
で感染させた細胞の溶解物、レーン３；野生型ウイルス
で感染させた細胞の溶解物、レーン４；感染していない
細胞の溶解物、レーン５；蛋白分子量マーカー（矢印は
ＨＩＶインテグラーゼのバンドを示す）。
【図９】 実施例２で使用した１．２ｋｂの ＥｃｏＲ
Ｉ−ＢａｍＨＩ断片の制限酵素地図を示し、翻訳開始コ
ドンには下線が引いてある。
【図１０】 実施例２で使用した１．２ｋｂのＥｃｏＲ
Ｉ−ＢａｍＨＩ断片の制限酵素地図を示し、翻訳開始コ
ドンには下線が引いてある。
【図１１】実施例２で使用した１．２ｋｂのＥｃｏＲＩ
−ＢａｍＨＩ断片の制限酵素地図を示し、翻訳開始コド
ンには下線が引いてある。
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【手続補正書】
【提出日】平成４年１月１０日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正内容】
【書類名】 明細書
【発明の名称】 バキュロウイルス発現系
【特許請求の範囲】
【化１】 ＴＡＡＴＣＡＴＣＣＡＣＡＧＧＡＧＡＣＴＴＴＣＴＧ よりなるリーダー配列が存在することを特徴とする、上
記方法。
【化２】 ＡＴＣＣＴＡＡＴＣＡＴＣＣＡＣＡＧＧＡＧＡＣＴＴＴＣＴＧ よりなる、請求項１に記載の方法。
【化３】 ＴＡＡＴＣＡＴＣＣＡＣＡＧＧＡＧＡＣＴＴＴＣＴＧ よりなるリーダー配列が存在することを特徴とする、上
記組換えバキュロウイルス。
【化４】 ＡＴＣＣＴＡＡＴＣＡＴＣＣＡＣＡＧＧＡＧＡＣＴＴＴＣＴＧ よりなる、請求項８に記載の組換えバキュロウイルス。
【化５】 ＴＡＡＴＣＡＴＣＣＡＣＡＧＧＡＧＡＣＴＴＴＣＴＧ よりなるリーダー配列が存在することを特徴とする、上
記方法。
【化６】 ＡＴＣＣＴＡＡＴＣＡＴＣＣＡＣＡＧＧＡＧＡＣＴＴＴＣＴＧ よりなる、請求項１３に記載の方法。
【化７】 ＴＡＡＴＣＡＴＣＣＡＣＡＧＧＡＧＡＣＴＴＴＣＴＧ よりなるリーダー配列が存在することを特徴とする、上
記ベクター。
【化８】 ＴＡＡＴＣＡＴＣＣＡＣＡＧＧＡＧＡＣＴＴＴＣＴＧ よりなるリーダー配列が前に存在する遺伝子よりなるＤ
ＮＡ配列。
【化９】 ＡＴＣＣＴＡＡＴＣＡＴＣＣＡＣＡＧＧＡＧＡＣＴＴＴＣＴＧ よりなる、請求項２０に記載のＤＮＡ配列。
【化１０】 ＴＡＡＴＣＡＴＣＣＡＣＡＧＧＡＧＡＣＴＴＴＣＴＧ よりなるリーダー配列（４）が与えられることを特徴と
する、上記ベクター。
【発明の詳細な説明】
【０００１】本発明は、バキュロウイルス発現系による
蛋白の調製に関する。
【０００２】バキュロウイルスベクター系は、原核およ
び真核遺伝子の発現に使用されてきた。これらの遺伝子
の発現は、バキュロウイルス（特にオートグラファ・カ
リフォルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒ
ｎｉｃａ）核多角体病ウイルス（ｎｕｃｌｅａｒ ｐｏ
ｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ）（ＡｃＮＰＶ））
のポリヘドリンプロモーターにより調節される。外来遺
伝子を取り込んでいる組換えバキュロウイルスにより感
染された、培養中の昆虫細胞で、この外来遺伝子は発現
される。
【０００３】組換えバキュロウイルスを得るために、バ
キュロウイルス伝達性ベクターが使用される。このベク
ターはポリヘドリンプロモーターを含む。ポリヘドリン
遺伝子に隣接するバキュロウイルスＤＮＡが与えられ
る。このベクターの残りは典型的には細菌のプラスミッ
ドのＤＮＡにより構成される。外来遺伝子は、このプロ
モーターに発現が調節されるように、ポリヘドリンプロ
モーターの下流の伝達性ベクターに挿入される。
【０００４】次に外来遺伝子とバキュロウイルスを有す
る伝達性ベクターが、バキュロウイルス感染に感受性の
昆虫細胞を同時トランスフェクション（ｃｏ−ｔｒａｎ
ｓｆｅｃｔｉｏｎ）する。典型的にはスポドプテラ・フ
ルギペルダ細胞培養物が使用される。次に外来遺伝子の
上流および下流の伝達性ベクター中のウイルスＤＮＡ
と、バキュロウイルスの対応するＤＮＡを含む同種組換
えが起きる。従って外来遺伝子とそのポリヘドリンプロ
モーターがバキュロウイルスに伝達される。この外来遺
伝子を発現させるために組換えバキュロウイルスが培養
される。
【０００５】２つの型のバキュロウイルス伝達性ベクタ
ーがある。第一にポリヘドリンのＡＴＤ翻訳開始コドン
の下流に外来遺伝子がクローン化される制限部位を含む
伝達性ベクターがある。このようなベクターは、外来遺
伝子の生成物がポリヘドリンペプチドのＮ−末端部分に
融合している融合蛋白を与える。
【０００６】第２に、ポリヘドリンの天然のＡＴＧ翻訳
コドンの前でポリヘドリン遺伝子の５’非翻訳リーダー
（５’ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄ ｌｅａｄｅｒ）が終
了し、次に制限部位が与えられる伝達性ベクターがあ
る。このような伝達性ベクターはｐＡｃ３７３であり、
ここでは５’非翻訳リーダーは天然のポリヘドリンＡＴ
Ｇの８塩基上流で終る。この制限部位にクローン化され
た遺伝子は、目的の生成物をコードするオープンリーデ
ィングフレーム（ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍ
ｅ）が後に続くＡＴＧを含む場合は、完全な蛋白として
発現される。
【０００７】ヨーロッパ特許出願第０３４０３５９号に
おいて我々は、ポリヘドリン遺伝子のＮ−末端の少し下
流の外来遺伝子がクローン化される制限部位を有し、ポ
リヘドリン遺伝子の天然のＡＴＧ翻訳開始コドンの代わ
りの別のヌクレオチドトリプレットが存在するバキュロ
ウイルス伝達性ベクターを記載し特許請求した。好適な
このようなベクターはｐＡｃ３６Ｃである。この型の伝
達性ベクターの使用により蛋白の発現レベルが増加して
いた。
【０００８】驚くべきことに我々は、発現させたい異種
遺伝子の前に原核配列をクローン化することにより発現
レベルがさらに改良されることを見いだした。このバキ
ュロウイルス発現系は原核発現系ではない。どちらかと
いえば、発現は高等な真核と分類される昆虫細胞中で起
きる。本発明の原核リーダー配列の使用により、代わり
にコザック配列（Ｋｏｚａｋ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を使
用するよりも驚くほど高い蛋白の発現レベルが得られ
る。コザック配列は真核発現に最適の配列であると考え
られている。
【０００９】従って本発明は、細胞中の遺伝子の発現を
指令することができ、蛋白をコードし、その前に
【化１１】 ＴＡＡＴＣＡＴＣＣＡＣＡＧＧＡＧＡＣＴＴＴＣＴＧ よりなるリーダー配列が存在する異種遺伝子に機能的に
結合したプロモーターを有する組換えバキュロウイルス
で感染させた細胞を、蛋白が得られる条件で培養するこ
とよりなる蛋白の調製方法を与える。
【００１０】さらに本発明は、組換えバキュロウイルス
で感染させた細胞中の遺伝子の発現を指令することがで
き、その前に
【化１２】 ＴＡＡＴＣＡＴＣＣＡＣＡＧＧＡＧＡＣＴＴＴＣＴＧ よりなるリーダー配列が存在する異種遺伝子に機能的に
結合したプロモーターを有する組換えバキュロウイルス
を与える。
【００１１】本発明のリーダー配列は５’末端で（例え
ばさらに１２個以下のまたは６個以下のヌクレオチド
を）延長することができる。従って、リーダー配列がバ
キュロウイルス伝達性ベクターの制限部位の上にリーダ
ー配列をクローン化できるように、追加のヌクレオチド
を与えてもよい。従って追加のヌクレオチドは１つまた
は複数の制限部位の配列である。ＢａｍＨＩ部位を取り
入れるために５’末端で延長したリーダー配列は
【化１３】 ＡＴＣＣＴＡＡＴＣＡＴＣＣＡＣＡＧＧＡＧＡＣＴＴＴＣＴＧ である。
【００１２】この配列は５’末端でＧヌクレオチドで与
えられる。Ｈｉｎｄ ＩＩＩ部位とＢａｍ ＨＩ部位の
両方を取り込んでいる配列は、
【化１４】 Ｈｉｎｄ ＩＩＩ Ｂａｍ ＨＩ ＡＧＣＴＴＧＧＡＴＣＣＴＡＡＴＣＡＴＣＣＡＣＡＧＧＡＧＡＣＴＴＴＣＴＧ である。
【００１３】典型的にはリーダー配列は、発現したい異
種遺伝子の翻訳開始コドンに融合される。従ってこのよ
うな状況では、リーダー配列の３’末端は異種遺伝子の
ＡＴＧ翻訳開始コドンに直接融合される。ここで「異種
遺伝子」とは、組換えバキュロウイルスに感染された細
胞では普通産生されないポリペプチドをコードする遺伝
子を意味する。この異種遺伝子は、好ましくはバキュロ
ウイルス遺伝子または昆虫細胞の遺伝子ではない。
【００１４】異種遺伝子は翻訳開始コドンで開始する。
この遺伝子は原核または真核でもよい。これは合成遺伝
子でもよい。この異種遺伝子はある選択されたポリペプ
チドをコードする。選択されるポリペプチドは生理学的
に活性のポリペプチド、例えばヒトの体内で活性のある
ポリペプチドでもよい。このポリペプチドは抗体産生を
刺激することができる。このポリペプチドは破傷風毒素
断片Ｃ、ストロメリシン、百日咳主要表面抗原またはＨ
ＩＶ（ヒト免疫不全症ウイルス）インテグラーゼ蛋白か
ら選択される蛋白でもよい。異種遺伝子にコードされる
他のポリペプチドとしては以下のものがある：Ｂ型肝炎
ウイルス表面抗原；Ｂ型肝炎ウイルスコア抗原；増殖因
子（例えば表皮増殖因子（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏ
ｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）または腫瘍増殖因子（ｔｒａｎ
ｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ））；
インターフェロン、ＡＩＤＳ関連レトロウイルスのエン
ベロープ（ｅｎｖｅｌｏｐｅ）由来のポリペプチド；プ
ラスモジウム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）属の細菌由来の
ポリペプチド；エプスタイン・バーウイルス（Ｅｐｓｔ
ｅｉｎ−Ｂａｒｒ ｖｉｒｕｓ）由来のポリペプチド；
ヒト免疫グロブリン分子の重鎖；ヒト免疫グロブリン分
子の軽鎖；マウス免疫グロブリン分子の重鎖；マウス免
疫グロブリン分子の軽鎖；ハイブリッド免疫グロブリン
分子（例えばハイブリッド免疫グロブリン分子の可変領
域はヒトではない（例えばマウスの可変領域）配列、ハ
イブリッド免疫グロブリン分子の定常領域はヒト由来で
あるか、またはハイブリッド免疫グロブリン分子の相補
性決定領域（ＣＤＲｓ）はヒト免疫グロブリン由来では
なく（例えばマウスの免疫グロブリン由来）、ハイブリ
ッド免疫グロブリン分子の残りの配列はヒト免疫グロブ
リン由来である）；そしてアミノ酸を通して酵素分子に
隣接するかまたは結合するハイブリッド免疫グロブリン
分子よりなる融合ポリペプチド。
【００１５】プロモーターは典型的にはポリヘドリンプ
ロモーターである。バキュロウイルスは好ましくはオー
トグラファ・カリフォルニカである。組換えバキュロウ
イルスで感染される細胞は、一般的には昆虫細胞の細胞
株の細胞である。トリコプルジア・ニ（Ｔｒｉｃｈｏｐ
ｌｕｓｉａ ｎｉ）、スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓ
ｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）、ヘリオ
ジス・ジー（Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ ｚｅａ）またはマン
ヅカ・セクスタ（Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａ）の細胞
を使用してもよい。好ましい細胞はスポドプテラ・フル
ギペルダ細胞株の細胞である。
【００１６】組換えバキュロウイルスに感染される細胞
は、典型的には標準的な方法（スマーズとスミス（Ｓｕ
ｍｍｅｒｓ，Ｍ．Ｄ．ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ，Ｇ．
Ｅ．）、１９８７年、バキュロウイルスベクターと昆虫
細胞培養法のマニュアル（Ａ ｍａｎｕａｌ ｏｆ ｍ
ｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｂａｃｕｌｏ ｖｉｒｕｓ ｖ
ｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ ｉｎｓｅｃｔ ｃｅｌｌ ｃｕ
ｔｕｒｅ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ）、テキサス農業試験
場（Ｔｅｘａｓ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｅｘｐｅ
ｒｉｍｅｎｔａｌ Ｓｔａｔｉｏｎ）、ブルティンＮ
ｏ．１５５５）に従って培養される。目的の蛋白が発現
され、次にこれを単離・精製する。
【００１７】組換えバキュロウイルスは以下の方法で調
製される： （ａ） 組換えバキュロウイルスで感染させた細胞中の
遺伝子の発現を指令することができ、前に
【化１５】 ＴＡＡＴＣＡＴＣＣＡＣＡＧＧＡＧＡＣＴＴＴＣＴＧ よりなるリーダー配列が存在する異種遺伝子に機能的に
結合したプロモーターを有する、組換えバキュロウイル
ス伝達性ベクターを与え、（ｂ） バキュロウイルス感
染に感受性の細胞を、組換えバキュロウイルス伝達性ベ
クターと無傷の（ｉｎｔａｃｔ）野生型バキュロウイル
スＤＮＡで同時トランスフェクション（ｃｏ−ｔｒａｎ
ｓｆｅｃｔｉｏｎ）する。
【００１８】（ｂ）段階でトランスフェクションされる
細胞は一般的には昆虫細胞の細胞株の細胞である。トリ
コプルジア・ニ、スポドプテラ・フルギペルダ、ヘリオ
ジス・ジーまたはマンヅカ・セクスタの細胞をトランス
フェクションしてもよい。好ましい細胞はスポドプテラ
・フルギペルダ細胞株の細胞である。組換えバキュロウ
イルス伝達性ベクターは、典型的にはプロモーター、リ
ーダー配列そして外来遺伝子に隣接するバキュロウイル
スオートグラファ・カリフォルニカのＤＮＡよりなる。
細胞をトランスフェクションもする野生型バキュロウイ
ルスＤＮＡは、オートグラファ・カリフォルニカのゲノ
ムＤＮＡである。
【００１９】同種組換え（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅ
ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）に続いて、プロモーター、リ
ーダー配列、外来遺伝子そして隣接する組換え伝達性ベ
クターのウイルスＤＮＡが野生型バキュロウイルスＤＮ
Ａに伝達される。組換えバキュロウイルスは例えばプラ
ーク（Ｐｌａｑｕｅ）測定法でスクリーニングされる。
この組換えバキュロウイルスは精製される。
【００２０】（ａ）段階で使用される組換えバキュロウ
イルス伝達性ベクターも、本発明の一部を構成する。こ
のような伝達性ベクターは、基本的に異種遺伝子よりな
るＤＮＡ配列と本発明のリーダー配列をバキュロウイル
ス伝達性ベクターにクローン化することにより調製され
る。このＤＮＡ配列は、遺伝子の発現を指令するプロモ
ーターの転写制御下になるように、適当な制限部位で伝
達性ベクターにクローン化される。好ましい伝達性ベク
ターはｐＡｃ３６Ｃであり、この場合ＤＮＡ配列はベク
ターのＢａｍＨＩ部位にクローン化されている。
【００２１】あるいは組換えバキュロウイルス伝達性ベ
クターは、リーダー配列を有する伝達性ベクターから調
製される。異種遺伝子は、リーダー配列のすぐ下流の制
限部位で伝達性ベクターにクローン化される。このタイ
プの好適な伝達性ベクターは以下よりなる： （１）ポリヘドリン遺伝子のＮ−末端の下流の外来遺伝
子がクローン化される制限部位、（２）ポリヘドリン遺
伝子の天然のＡＴＧ翻訳開始コドンの代わりのヌクレオ
チドの別のトリプレット、（３）ポリヘドリン遺伝子の
最初の２４個以下から最初の５０個以下の塩基、そして
（４）（３）の下流であるが（１）の前の本発明のリー
ダー配列。
【００２２】ポリヘドリン遺伝子の最初の２７個以下か
ら最初の３９個以下の塩基が存在することが好ましい。
最初の３３個までの塩基が存在してもよい。これらの塩
基の後に１０個以下の塩基のリンカー配列（例えば５個
以下の塩基）が続いており、これはリーダー配列の前で
ある。リーダー配列のすぐ後に、典型的には制限部位
（１）が続く。
【００２３】リーダー配列と異種遺伝子よりなるＤＮＡ
配列は、典型的にはリーダー配列を作成し、リーダー配
列を遺伝子に融合させて調製される。本発明で使用され
る異種遺伝子配列は合成（例えば重複オリゴヌクレオチ
ドをアニーリング（ａｎｎｅａｌｉｎｇ）する）により
調製してもよい。あるいはこれはクローン化するか、ま
たはＣＤＮＡ配列でもよい。
【００２４】以下の例により本発明を説明する。
【００２５】添付の図面において：図１はｐ３６Ｃ−Ｔ
ＥＴｔａｃ２の作成を示す；図２は、（ａ）伝達性ベク
ターｐ３６ＣＳＴＩとｐ３６ＣＳＴＭ２の作成と、
（ｂ）ｐＫＳＳＴ２のＭ１３誘導体上のオリゴヌクレオ
チド指令突然変異誘発（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄ
ｅ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）に使
用されるオリゴヌクレオチドを示す；図３はｐ３６ＣＳ
Ｔ１の構造を示す；図４は、組織メタロプロテアーゼイ
ンヒビター（ＴＩＭＰ）の存在下（□）または欠如下
（▲黒四角▼）での、感染後１，２，３そして４日目の
ｖ３６ＣＳＴＭ２により感染させた細胞溶解物の活性を
示し、Ｃは対照を意味し、Ｗは野生型バキュロウイルス
を意味し、ＤＰＭは１分間当りの分解を意味し、ＥＮＺ
は純粋な酵素の対照量を意味する。
【００２６】図５は、ｐ３６ＣＰ４０とｐ３６ＣＰ４０
ｐｌの作成に使用されるオリゴヌクレオチドの配列を示
す；図６は、ｖＰ４０、ｖ３６ＣＰ４０Ｐｐｌｖ３６Ｐ
６０ｐｌ（レーン３から５）で感染させた細胞のドデシ
ル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）の結果を示し、レーン１と７は蛋
白分子量マーカーを含有し、レーン２と６は感染してい
ない細胞である；図７は、ｐＡｃ３６ＣＨＩＶＫとｐＡ
ｃ３６ＣＨＩＶＰの作成に使用されるヌクレオチドの配
列を示す；図８は、ＨＩＶ−１からのインテグラーゼ蛋
白を発現している昆虫細胞の溶解物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ
分析を示す。ここでレーン１；ｖＡｃ３６ＣＨＩＶ／Ｋ
で感染させた細胞の溶解物、レーン２；ｖＡｃ３６ＣＨ
ＩＶ／Ｐで感染させた細胞の溶解物、レーン３；野生型
ウイルスで感染させた細胞の溶解物。レーン４；感染し
ていない細胞の溶解物。レーン５；蛋白分子量マーカー
（矢印はＨＩＶインテグラーゼのバンドを示す）；そし
て図９、図１０、図１１は、実施例２で使用した１．２
ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片の制限地図を示し、
翻訳開始コドンには下線が引いてある。
【００２７】実施例１：破傷風毒素断片Ｃの発現
【００２８】１．材料と方法 細菌株と組換えＤＮＡ法 大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＧ１株とプラスミッドｐＴＥ
Ｔｔａｃ２はすでに記載されている（マコフ（Ｍａｋｏ
ｆｆ）ら、バイオテクノロジー（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ
ｏｇｙ）第７巻、１９８９年、１０４３−１０４６頁；
ＷＯ９０／１５８７１）。ＤＮＡ操作法はマニアティス
（Ｍａｎｉａｔｉｓ）らの方法（「モレキュラークロー
ニング：実験室マニュアル」（”Ｍｏｌｅｃｕｌａａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎ
ｕａｌ”）、コールドスプリングハーバー研究所（Ｃｏ
１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ）、コール
ドスプリングハーバー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａ
ｒｂｏｒ）、ニューヨーク、米国、１９８２年）に従い
行った。
【００２９】バキュロウイルス法 バキュロウイルス組換え体は、１μｇのＡｃＮＰＶ Ｄ
ＮＡと２μｇの組換えプラスミッドＤＮＡ（バーンボイ
ムとドリー（Ｂｉｒｎｂｏｉｍ ａｎｄ Ｄｏｌｙ）、
ヌクレイックアシッズリサーチ（ＮｕＣｌ．Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓ）第７巻、１９７９年、１５１３頁の方法によ
り調製した）を、リン酸カルシウム沈澱法でスポドプテ
ラ・フルギペルダ細胞に同時トランスフェクションして
作成した。４時間後細胞を一度洗浄し、再びＴＣ１００
培地（フローラボラトリーズ（Ｆｌｏｗ Ｌａｂｓ））
を加え、２８℃で３日間培養した。次に上清をプラーク
法により力価検定をして封入体陰性（ｉｎｃｌｕｓｉｏ
ｎｎｅｇａｔｉｖｅ）のプラークを肉眼でスクリーニン
グした。スポドプテラ・フルギペルダ細胞の保存株を室
温でスピナーフラスコ（Ｓｐｉｎｎｅｒ ｆｌａｓｋ
ｓ）（テクネ（Ｔｅｃｈｎｅ））中で維持した。３５ｍ
ｍのシャーレ中に、スポドプテラ・フルギペルダ細胞を
１０６細胞／シャーレで接種し、室温で１０−１５分間
吸着させ、次に１００μｇウイルス／シャーレで感染さ
せてプラーク測定法を行った。室温で１時間後、ウイル
ス接種物を吸引除去し、１％アガロース（２部のＴＣ１
００＋１部の３％シープラーク（Ｓｅａｐ１ａｑｕｅ）
ＬＧＴアガロース）で重層した。固まってからアガロー
スの上にさらに１ｍｍのＴＣ１００を重層した。２８℃
で３日後ＴＣ１００を除去し、ＰＢＳ中１０％の中性赤
（ｎｅｕｔｒａｌ ｒｅｄ）（ＢＤＨ）を１ｍｌ／シャ
ーレで１時間染色してプラークを目に見えるようにし
た。プラーク精製したクローンをテクネスピナーフラス
コ中で２８℃で膨張させた。
【００３０】免疫操作 マウスをアルヒドロゲル（ａｌｈｉｄｒｏｇｅｌ）中の
組換え断片Ｃで免疫し、すでに報告されたように毒素負
荷で破傷風に対する免疫性を試験した（フェアウェザー
（Ｆａｉｒｗｅａｔｈｅｒ）ら、インフェクション・ア
ンド・イミュニティ（Ｉｎｆｅｃｔ．ｌｍｍｕｎ．）第
５５巻、１９８７年、２４５１−２５４５頁）。
【００３１】アフィニティクロマトグラフィーとＥＬＩＳＡ 臭化シアン活性化セファロース（商標）４Ｂに結合した
モノクローナル抗体ＴＴ０８（シェパード（ｓｈｅｐｐ
ａｒｄ）ら、インフェクション・アンド・イミュニティ
（Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．）第４３巻、７１０−７
１４頁、１９８４年）を用いるアフィニティクロマトグ
ラフィーによりスポドプテラ・フルギペルダ抽出物から
断片Ｃを精製した。断片Ｃを０．１Ｍクエン酸ナトリウ
ムｐＨ３．０で溶出し、等量の０．１Ｍのリン酸ナトリ
ウムを添加して中和した。断片Ｃを前述されたように酵
素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）により測定した
（マコフ（Ｍａｋｏｆｆ）ら、１９８９年）。
【００３２】２．結果と考察 断片Ｃのバキュロウイルスへのクローニング 断片Ｃの構造遺伝子は、３−４％の総細胞蛋白で断片Ｃ
の合成を指令する大腸菌発現プラスミッドであるｐＴＥ
Ｔｔａｃ２上に存在する（マコフ（Ｍａｋｏｆｆ）ら、
１９８９年）。断片Ｃは破傷風毒素の切断生成物である
ため、ｐＴＥＴｔａｃ２はＮ−末端のメチオニン残基で
完全な断片Ｃの合成を指令する。その前に配列ＡＧＡＴ
ＣＴＴＡＡＴＣＡＴＣＣＡＣＡＧＧＡＧＡＣＴＴＴＣＴ
ＧＡＴＧが存在する完全な断片Ｃ構造遺伝子を含む１．
４ｋｂのＢｇＩＩＩ−ＢａｍＨＩ断片を、バキュロウイ
ルスの高レベル発現ベクターであるｐ３６ｃの単一のＢ
ａｍＩ部位（ページ（Ｐａｇｅ）、ヌクレイックアシッ
ズリサーチ（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．）第１７
巻、４５４頁、１９８９年）にクローン化した。
【００３３】得られたプラスミッド、ｐ３６ｃ−ＴｅＴ
ｔａｃ２（図１参照）をバキュロウイルスＡｃＮＰＶＤ
ＮＡとともにスポドプテラ・フルギペルダ細胞中に、リ
ン酸カルシウム沈澱法により同時トランスフェクション
した。組換えウイルスを含む細胞を封入体陰性プラーク
をスクリーニングして同定し、プラーク精製後数個の組
換え体を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥとウエスタンブロッティン
グにより断片Ｃの産生についてスクリーニングした（デ
ータは示していない）。
【００３４】１つの組換え体であるＢＶＦＣ１をさらに
研究した。スポドプテラ・フルギペルダ細胞を感染多重
度（ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉ
ｏｎ）０．１でＢＶＦＣ１で感染させた。ドデシル硫酸
ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ
−ＰＡＧＥ）による分析のため、毎日細胞を採った。断
片Ｃは２−４日目にＢＶＦＣ１感染細胞により合成さ
れ、３日目の産生量が最大であった。断片Ｃは明らかに
この産生される主要なポリペプチドの１つであり、その
レベルはポリヘドリンよりわずかに低いのみであった。
【００３５】スポドプテラ・フルギペルダ細胞をスピナ
ーフラスコ培養で増殖させ、感染多重度１０でＢＶＦＣ
１ウイルスで感染させた。４日後に細胞を収集し、音波
処理により溶解させ、低速および高速遠心分離により可
溶性抽出物を得た。次に細胞蛋白をＳＤＳ−ＰＡＧＥと
ウェスタンブロッティングで分析した。この細胞抽出物
中で５０ｋＤのバンドが主要な蛋白の１つであった。こ
れが断片Ｃであることは、抗−断片Ｃ抗血清に対するウ
ェスタンブロッティングにより確認した。
【００３６】こうして非常に高発現の断片Ｃが得られた
（約４００μｇ／ｍｌ）。モノクローナル抗体ＴＴ０８
を使用するアフィニティクロマトグラフィーにより細胞
抽出物から断片Ｃを精製した。こうして抽出した断片Ｃ
はＳＤＳ−ＰＡＧＥにより純度８０％であると判定し
た。
【００３７】バキュロウイルスにより発現される断片Ｃの免疫原性 クロストリディウム・テタニ（Ｃ．ｔｅｔａｎｉ）また
は大腸菌からの断片Ｃは破傷風毒素による負荷（ｃｈａ
ｌｌｅｎｇｅ）からマウスを防御することができる。バ
キュロウイルスから得られた断片Ｃがこの活性を保持し
ているか否かを調べるために、バキュロウイルスＢＶＦ
Ｃ１で感染させておいたスポドプテラ・フルギペルダ細
胞の可溶性抽出物でマウスを免疫した。予備的な結果は
この調製物は免疫原活性を有することを示していた（デ
ータは示していない）。免疫精製した断片Ｃとその後に
破傷風毒素を負荷してこの試験を繰り返した。その結果
を表１に示す。
【００３８】
【表１】 ａ アンヒドロゲル中の抗原をＢＡＬＢ／ｃマウスの皮
下に注射した。２回目の投与は１回目の投与の４週間後
に行った。ｂ 最後の注射後４週間目に、５０ＬＤ５０Ｓの破傷風
毒素をマウス（１群当りｎ＝１０）に負荷した。ｃ 破傷風毒素由来
【００３９】０．２５μｇの１回投与または０．０６μ
ｇの２回投与で免疫したマウスは、破傷風の負荷に対し
て充分防御されたため、これはバキュロウイルスで発現
された断片Ｃはこの測定法で生物活性があったことを示
している。免疫に必要な断片Ｃのレベルは、クロストリ
ディウム・テタニまたは大腸菌由来の断片Ｃに必要なレ
ベル（マコフ（Ｍａｋｏｆｆ）ら、１９８９年）と似て
いるため、バキュロウイルス発現物質が同等の活性を有
していることを示している。
【００４０】実施例２：ストロメリシン蛋白の発現
【００４１】１．一般 実施例１の断片Ｃの発現は、真核翻訳に最適と考えられ
ている配列（コザック配列）を用いる断片Ｃの発現と比
較されていなかった。昆虫細胞中で発現が起きるバキュ
ロウイルス発現系は、高度の真核性と分類される。従っ
てコザック規則が適用できるという実験的証拠はない
が、翻訳規則は哺乳動物遺伝子について決められたコザ
ック規則に一致すると考えられる。しかし実施例１で使
用した本発明のリーダーは共通コザック配列に関しては
次善最適（ｓｕｂ−ｏｔｉｍａｌ）である。
【００４２】従って本発明のリーダー配列をコザック次
善最適配列、コザック最適配列、コザック完全配列と比
較するために、実験を行った。最初の実験ではストロメ
リシン蛋白の発現を試験した。２つの作成体を作り測定
した。最初の作成体は、コザック共通配列の翻訳開始コ
ドンＡＴＧの回りで次善最適であるｖ３６ＳＴ１という
名前の組換えバキュロウイルスである： ｖ３６ＳＴ１ ５’ ＧＡＴＣＣＧＡＡＴＴＣ ＡＴＧ Ｔ ３’
【００４３】第２の作成体はｖ３６ＳＴＭ２という名前
の組換えバキュロウイルスで、これはストロメリシン遺
伝子の翻訳開始コドンに融合した本発明のリーダー配列
を含有していた。プロテアーゼ活性を測定して感染した
細胞を定量した。ｖ３６ＳＴ１で感染した細胞のプロテ
アーゼ活性は、バックグランド活性（約４００単位）と
区別できなかった。非感染細胞と野生型ウイルスで感染
した細胞の活性は同様に低かった（２００−３００単
位）。これに対して、ｖ３６ＳＴＭ２で感染した細胞は
約８０００単位のプロテアーゼ活性（すなわち２０倍の
刺激）を有していた。さらに詳細には：
【００４４】２．伝達性ベクターｐ３６ＣＳＴ１とｐ３
６ＣＳＴＭ２の作成 作成したストロメリシン遺伝子を含有する伝達性ベクタ
ー（ｐ３６ＣＳＴ１とｐ３６ＣＳＴＭ２）は、ｐＡｃ３
６Ｃ（ページ（Ｐａｇｅ）、１９８９年）から得られ
た。完全なストロメリシン遺伝子（ウィタム（Ｗｈｉｔ
ｈａｍ）ら、バイオケム・ジェイ（Ｂｉｏｃｈｅｍ．
Ｊ．）第２４０巻、９１３−９１６頁、１９８６年；イ
ーエムビーエル（ＥＭＢＬ）データベース、コードＨＳ
ＳＴＲＯＭＲ）は、１．２ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨ
Ｉ断片として合成された（図９、図１０、図１１）、ｐ
ＵＣ１８プラスミッドにクローン化した。この断片をゲ
ル電気泳動と電気溶出により精製し、図２ａに示す２つ
のオリゴヌクレオチドの１つまたは別の１つに結合さ
せ、次にブルースクリプト（Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ）Ｋ
ＳのＢａｍＨＩ部位にクローン化した。得られたプラス
ミッドをｐＫＳＳＴ１と命名した（図２ａ（１）とｐＫ
ＳＳＴ２（図２ａ（２））。
【００４５】プラスミッドｐＫＫＳＴ１とＢａｍＨＩで
消化し、ゲル電気泳動の後ゲル電気溶出で精製した１．
２ｋｂ断片を、バキュロウイルス伝達性ベクターｐＡｃ
３６Ｃ中に正しい配向でクローン化した。このプラスミ
ッドをｐ３６ＣＴ１と命名した（図３）。
【００４６】３．ｐ３６ＣＳＴＭ２の作成−ｐＭ１３Ｓ
Ｔ２の突然変異誘発 ｐＫＳＳＴ２からの１．２ｋｂのＢａｍＨＩ断片を、ゲ
ル電気泳動次にゲル電気溶出で精製し、Ｍ１３ｍｐ１９
のアンチセンス（ａｎｔｉｓｅｎｓｅ）配向で複製型の
ＢａｍＨＩ部位にクローン化した。このプラスミッドを
ｐＭ１３ＳＴ２と命名した。しかし原核リーダーの配列
を正確に再生するためには、ストロメリシン遺伝子の翻
訳開始コドンの前に位置する、配列ＡＡＴＴＣを除去す
ることが必要であった。これは、アマシャムインターナ
ショナルオリゴヌクレオチド突然変異誘発キット（Ａｍ
ｅｒｓｈａｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｏｌｉｇ
ｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｋ
ｉｔ）と、ｐＭ１３ＳＴ２由来の１本鎖Ｍ１３テンプレ
ートを使用して行った。使用したオリゴヌクレオチドを
図２ｂに示す。突然変異型ｐＭ１３ＳＴ２の翻訳開始の
回りの配列の位置は、ＤＮＡシークエンシング（ｓｅｑ
ｕｅｎｃｉｎｇ）で確認した。ｐＭ１３ＳＴ２Ｍからの
１．２ｋｂのＢａｍＨＩ断片をプラスミッドの複製型か
ら精製し、バキュロウイルス伝達性ベクターｐＡｃ３６
Ｃ中に正しい配向でクローン化した。得られたプラスミ
ッドをｐＡｃ３６ＣＳＴＭ２と命名した。
【００４７】４．組換えウイルスの作成 スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｆ２１）細胞（ボーゲ
ン（Ｖａｕｇｈｅｎ）ら、インビトロ（Ｉｎ ｖｉｔｒ
ｏ）第１３巻、２１３−２１７頁、１９７７年）を、１
０％胎児牛血清（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）と５μｇ／ｍｌ
ゲンタマイシンを補足したＴＣ１００培地中で２７℃で
懸濁培養で増殖させた。ＡｃＮＰＶを懸濁培養で２７℃
でＳｆ２１細胞中で増殖させた。異種遺伝子配列を含有
する組換えウイルスは、Ｓｆ２１細胞中の細胞外ウイル
ス（ＥＣＶ）培養物から精製したＡｃＮＰＶＤＮＡで、
モル比２０：１の組換え伝達性ベクターｐ３６ＣＳＴ１
とｐ３６ＣＳＴＭ２を同時トランスフェクションして作
成した。ＡｃＮＰＶＤＮＡの精製法はすでに報告されて
いるもの（スマーズとスミス（Ｓｕｍｍｅｒｓ ａｎｄ
Ｓｍｉｔｈ）、１９８７年、「バキュロウイルスベク
ターと昆虫細胞培養法のマニュアル」（“Ａ ｍａｎｕ
ａｌ ｏｆ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｂａＣｕｌｏｖ
ｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ ｉｎｓｅｃｔ ｃ
ｅｌｌ ｃｕｔｕｒｅ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ”）と同様
であるが、培養物は細胞当り０．１ｐｆｕ（プラーク形
成単位）で感染させ、６日後に収集し、ショ糖密度勾配
段階は省略した。同時トランスフェクションはすでに報
告されたものである（スマーズとスミス（Ｓｕｍｍｅｒ
ｓ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ）、１９８７年、方法１）。
【００４８】トランスフェクション培養上清の連続希釈
を用いる標準アガロース重層測定法（ブラウウンとフォ
ークナー（Ｂｒｏｗｎ ａｎｄ Ｆａｕｌｋｎｅｒ）、
１９７７年、ジェイ・ジェン・ビロル（Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖ
ｉｒｏｌ．）、第３６巻、３６１−３６４頁）により、
得られたＥＣＶを組換え体についてスクリーニングし
た。中性赤染色後、多角体（ｐｏｌｙｈｅｄｒａ）の欠
如についてスクリーニングして組換えプラークの可能性
のあるものを肉眼で選択し、０．５ｍｌの培地中に採
り、プラーク測定法を繰り返して精製した。２７℃でＳ
ｆ２１細胞のモノレーヤー（ｍｏｎｏｌａｙｅｒ）培養
物の感染により、組換えウイルスを高力価（＞１０８Ｐ
ｆｕ／ｍｌ）にスケールアップした。得られた高力価ウ
イルスをｖ３６ＣＳＴ１とｖ３６ＣＳＴＭ２と命名し
た。
【００４９】５．組換えウイルスで感染させた細胞から
の蛋白の分析 第４節に記載した組換えウイルスの構造をサザンブロッ
ティングにより確認した。ポリヘドリン陰性の不活性の
陽性プラークを０．５ｍｌの培地に採り、少なくとも１
時間分散させた。この１００μｌを用いて３５ｍｍの組
織培養皿（ｔｉｓｓｕｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｄｉｓｈ）
中の２×１０６個のＳｆ２１細胞を感染させ、２７℃で
１時間インキュベートした。この接種物を除去し、１ｍ
ｌの新鮮な培地で置換し、プレートを２７℃で３日間イ
ンキュベートした。次に細胞をリン酸緩衝化生理食塩水
（ＰＢＳ）中で洗浄し取り出した。
【００５０】６．バキュロウイルス発現ストロメリシン
のプロテアーゼ活性 組換えウイルスから発現された蛋白を以下のようにして
測定した。感染した細胞を１％のノニデット（Ｎｏｎｉ
ｄｅｔ）Ｐ４０と１５０ｍＭのＮａＣｌで溶解させ、遠
心分離により膜性物質を除去した。残りの溶解液をトリ
チウム化カゼイン（１００μｌトリス緩衝液中２００μ
ｇ−シグマ）とインキュベートした。反応物を３７℃で
２時間インキュベートし、３０％のトリクロロ酢酸（Ｔ
ＣＡ）５０μｌを添加して反応を停止させた。ＴＣＡで
沈澱した放射能を測定してストロメリシンの活性を求め
た。図４は、ｖ３６ＳＴＭ２に対するこの測定法の結果
を示す。ｖ３６ＳＴ１について得られた価はバックグラ
ンドと実質的に区別できなかったため、表に含まれてい
ない。
【００５１】驚くべきことに、組織メタロプロテアーゼ
インヒビター（ＴＩＭＰ）（ストロメリシンのインヒビ
ター）の存在は細胞溶解液に観察される活性を低下させ
なかった。溶解液中のある因子がストロメリシンの作用
を阻害していると考えられる。これを支持する証拠とし
て、陰性対照の溶解液に既知量の純粋な活性ストロメリ
シンを加える（Ｓｐｉｋｅ）と、観察される活性は予想
より低いということがある。
【００５２】実施例３ 百日咳主要表面抗原の発現 １．一般 バキュロウイルス中でまず２つの作成体を発現させた。
最初のもの（ｖＰ６０Ｐｌと呼ぶ）は、百日咳主要表面
抗原（分子量＝６０ｋＤａ）をコードしており、ｐ３６
Ｃ中で発現され、本発明のリーダーを含有していた。ｖ
Ｐ６０ｐｌで感染させた昆虫細胞中のこの蛋白の発現は
非常に効率的であった（４００−５００μｇ／ｍｌ）。
２番目の作成体（ｖＰ４０）は、主要表面抗原の端が切
れた型（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ ｆｏｒｍ）であった。こ
の遺伝子の上流の配列は以下のようにコザック最適配列
であった（コザック完全配列ではないが）： ｖＰ４０ ＧＡＡＴＴＣＡＡＴ ＡＴＧＧ コザック共通 （ＣＣＣ）（ＧＣＣ）ＧＣＣ ＡＣＣ ＡＴＧＧ ＊ ＊＊＊＊ 翻訳開始コドン
【００５３】コザック共通配列中で星印をつけた塩基は
翻訳において、より重要である。括弧内の塩基はそれほ
ど重要ではない。ｖＰ４０で感染させた細胞中の４０ｋ
Ｄａ蛋白の発現はまだ効率的であった（約１００μｇ／
ｍｌ）が、ｖＰ６０ｐｌ感染細胞からのＰ６０の発現よ
り４−５倍低かった。
【００５４】次に行った実験は、ｖＰ６０ｐｌ中と同じ
原核リーダーが前にある４０ｋＤａ蛋白を発現する組換
えウイルスを作成することである。２つの作成体からの
６０ｋＤａ蛋白と４０ｋＤａ蛋白の発現を測定した。ｖ
Ｐ４０からよりｖＰ４０ｐｌからの４０ｋＤａ蛋白の発
現の方が３−４倍高く、ｖＰ６０ｐｌから発現される蛋
白のレベルに近付いていた。
【００５５】２．ｐ３６ＣＰ６０ｐｌ、ｐ３６ＣＰ４０
およびｐ３６ＣＰ４０ｐｌの作成 Ｎ−末端を欠く百日咳主要表面抗原（ＰＭＳＡ）遺伝子
体を、種々の翻訳リーダーとＰＭＳＡのＮ−末端を含有
する合成オリゴヌクレオチドに融合させて、プラスミッ
ドｐ３６ＣＰ４０とｐ３６ＣＰ４０ｐｌを作成した。こ
の２つのプラスミッドの作成に使用したオリゴヌクレオ
チドの配列を図５に示す。
【００５６】（１）ｐ３６ＣＰ６０ｐｌの作成 本発明のリーダーに融合したＰＭＳＡコード配列を含有
する、ｐＰｅｒｔａｃ７からの１．８ｋｂのＢｇｌＩＩ
−ＢａｍＨＩ断片を、ゲル電気泳動とゲル電気溶出によ
り精製し、バキュロウイルス伝達性ベクターｐＡｃ３６
ＣのＢａｍＨＩ部位へクローン化した（ページ（Ｐａｇ
ｅ）、１９８９年）。得られたプラスミッドをｐ３６Ｃ
Ｐ６０ｐｌと命名した。
【００５７】（２）ｐＡｃ３６ＣＰ４０とｐＡｃ３６Ｃ
Ｐ４０ｐｌの作成 ｐＰｅｒｔａｃ９（ｐＰｅｒｔａｃ７から得られる、マ
コフ（Ｍａｋｏｆｆ）ら）からの４．６ｋｂｐのＢｇｌ
ＩＩ−ＳａｃＩ断片を電気泳動とその後の電気溶出によ
り精製した。コザック最適配列を含むオリゴヌクレオチ
ド対を、ＢｇｌＩＩ−ＳａｃＩ断片としてこのベクター
にクローン化した。シークエンシング後、１．１ｋｂｐ
のＢｇｌＩＩ−ＢａｍＨＩ断片を正しい配向でｐＡｃ３
６ＣのＢａｍＨＩ部位へクローン化した。得られたプラ
スミッドをｐＡｃ３６ＣＰ４０と命名した。
【００５８】プラスミッドｐＡｃ３６ＣＰ４０ｐｌを２
段階で作成した。ｐＰｅｒｔａｃ７からの１．１ｋｂｐ
のＢｇｌＩＩ−ＢａｍＨＩ断片（マコフ（Ｍａｋｏｆ
ｆ）ら、バイオテクノロジー（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏ
ｇｙ）第８巻、１９９０年、１０３０−１０３３頁）を
精製し、ｐＵＣ９のＢａｍＨＩ部位ヘアンチセンス配向
でクローン化した。このプラスミッドをｐＵＣ６９−６
と命名した。本発明のリーダーと４０ｋＤａ蛋白のＮ−
末端配列を含有する１対のオリゴヌクレオチドを、Ｂａ
ｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ部位断片としてＭ１３ｍｐ１９
の複製型にクローン化した。このオリゴヌクレオチドの
配列をＤＮＡシークエンシングで確認した。この作成体
からの複製型のＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ挿入体を精
製し、ｐＵＣ９プラスミッドのＢａｍＨＩとＨｉｎｄＩ
ＩＩ部位の間にクローン化した。得られたプラスミッド
をｐＵＣ９−３と命名した。
【００５９】このｐＵＣ９−３プラスミッドをＳａｃＩ
とＨｉｎｄＩＩＩで消化し、本発明のリーダー、４０ｋ
Ｄａ蛋白のＮ−末端配列およびｐＵＣ９ベクター体を含
む３．０ｋｂ断片を単離した。４０ｋＤａ蛋白のＣ−末
端を含有する１．１ｋｂｐのＳａｃＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ
断片を精製し、ＳａｃＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ消化ｐＵＣ９
−３中にクローン化した。得られたプラスミッドをｐＵ
Ｃ９−１と命名した。このプラスミッドは、リーダーに
融合した４０ｋＤａの端の切れた（ｔｒａｎｃａｔｅ
ｄ）ＰＭＳＡの完全なコード配列を有しており、２つの
ＢａｍＨＩ部位が隣接していた。ｐＵＣ９−１からの
１．２ｋｂのＢａｍＨＩ断片を精製し、ｐＡｃ３６Ｃの
ＢａｍＨＩ部位にクローン化した。得られたプラスミッ
ドをｐＡｃ３６ＣＰ４０ｐｌと命名した。
【００６０】３．組換えウイルスの産生と組換えウイル
スで感染させた細胞からの蛋白の分析 これは実施例２に記載の方法で行った。得られた高力価
ウイルスをｖ３６ＣＰ６０ｐｌ、ｖ３６ＣＰ４０そして
ｖ３６ＣＰ４０ｐｌと命名した。感染した細胞を５％Ｓ
ＤＳで溶解し、生成物を１０％ゲルのＳＤＳ／ポリアク
ルルアミドゲル電気泳動の後クマシーブルー染色で分析
した。結果を図６に示す。
【００６１】これら生成物の同定と抗原性は、ポリクロ
ーナルウサギ抗血清を用いるウェスタンブロッティング
で確認した（示されていない）。６０ｋＤａの生成物
（レーン５）は実際には６９ｋＤａバンドとして泳動し
た。この異常な泳動の理由は不明である。アミノ酸配列
から予想される分子量は６０ｋＤａである。この６０ｋ
Ｄａ生成物は少し、抗体と交差反応する４０ｋＤａ生成
物に分解している。パルスチェース（ｐｕｌｓｅ−ｃｈ
ａｓｅ）実験で求めると、４０ｋＤａと６０ｋＤａの蛋
白ともに安定である（データは示していない）。発現レ
ベルは上記したようなものであり、本発明のリーダー配
列の使用の優位性を示していた。
【００６２】実施例４：ヒト免疫不全症ウイルス（ＨＩ
Ｖ）インテグラーゼ蛋白の発現 １．一般 ２つの作成体を調製し測定した。最初のもの（ｖ３６Ｈ
ＩＶＫ）は、完全コザックリーダー配列に融合したイン
テグラーゼ遺伝子体を含有していた。２番目のもの（ｖ
３６ＨＩＶＰ）は、本発明のリーダー配列に融合したイ
ンテグラーゼ遺伝子体を含有していた。ｖ３６ＨＩＶＰ
によるインテグラーゼ蛋白の発現レベルは、ｖ３６ＨＩ
ＶＫによるインテグラーゼ蛋白の発現レベルより４−５
倍良かった。
【００６３】２．プラスミッドｐＡｃ３６ＣＨＩＶＫと
ｐＡｃ３６ＣＨＩＶＰの作成 ｐＡｃ３６ＣＨＩＶＫとｐＡｃ３６ＣＨＩＶＰ中にイン
テグラーゼ蛋白を含有するＤＮＡの断片を、プラスミッ
ドＰＩＮｐＣＵ１９から得た。この作成体は、１．６ｋ
ｂｐのＫｐｎＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片上にＨＩＶインテ
グラーゼ蛋白コード配列を含有していた（シャーマンと
ファイフェ（Ｓｈｅｒｍａｎ ａｎｄＦｙｆｅ）、ピー
エヌエーエス ユーエスエー（ＰＮＡＳ ＵＳＡ）第８
７巻、５１１９−５１２３頁、１９９０年）。部位指令
突然変異誘発により、ＨＩＶインテグラーゼ蛋白のＮ−
末端フェニルアラニンのすぐ横に隣接して、ＮｄｅＩ部
位が導入されていた。プラスミッドｐＡｃ３６ＣＨＩＶ
ＰとｐＡｃ３６ＣＨＩＶＫは、ＰＩＮｐＵＣ１９からの
８９８ｂｐのＮｄｅＩ断片をゲル電気泳動の後ゲル電気
溶出で精製して作成した。次にこの断片を図７に示すオ
リゴヌクレオチドの対の１つに結合させ、ｐＡｃ３６Ｃ
のＢａｍＨＩ部位へクローン化した。ＡＴＧに融合した
本発明のリーダーを含有する作成体はｐＡｃ３６ＣＨＩ
ＶＰと命名し（図７ａ）、完全コザック共通配列を含有
するものはｐＡｃ３６ＣＨＩＫＫと命名した。
【００６４】３．組換えウイルスの作成と組換えウイル
スで感染させた細胞からの蛋白の分析 これは実施例２に記載した方法で行った。得られた高力
価ウイルスをｖ３６ＣＩｎｔＫとｖ３６ＣＩｎｔＰと命
名した。感染した細胞（２×１０６個、７２ｈｐｉ）を
１００μｌの１５０ｍＭトリス、５％ＳＤＳ、２５％グ
リセロールと０．１％Ｗ／Ｖプロモフェノールブルーで
溶解した。これらの溶解物の試料を１０％ＳＤＳ／ＰＡ
ＧＥゲルで分析した（図８）。ｖＡｃ３６ｃＨＩＶ／Ｐ
で感染させた細胞はｖＡｃ３６ＣＨＩＶ／Ｋで感染させ
た細胞よりも約５倍高いレベルでＨＩＶインテグラーゼ
を発現した。
【図面の簡単な説明】
【図１】ｐ３６Ｃ−ＴＥＴｔａｃ２の作成を示す。
【図２】（ａ）伝達性ベクターｐ３６ＣＳＴ１とｐ３６
ＣＳＴＭ２の作成と（ｂ）ｐＫＳＳＴ２のＭ１３誘導体
上のオリゴヌクレオチド指令突然変異誘発に使用される
オリゴヌクレオチドを示す。
【図３】ｐ３６ＣＳＴ１の構造を示す。
【図４】組織メタロプロテアーゼインヒビター（ＴＩＭ
Ｐ）の存在下（□）または欠如下（▲黒四角▼）での、
感染後１、２、３そして４日目のｖ３６ＣＳＴＭ２によ
り感染させた細胞溶解物の活性を示し、Ｃは対照を意味
し、Ｗは野生型バキュロウイルスを意味し、ＤＰＭは１
分間当りの分解を意味し、ＥＮＺは純粋な酵素の対照量
を意味する。
【図５】ｐ３６ＣＰ４０とｐ３６ＣＰ４０ｐｌの作成に
使用されるオリゴヌクレオチドの配列を示す。
【図６】ｖＰ４０、ｖ３６ＣＰ４０ｐｌとｖ３６Ｐ６０
ｐｌ（レーン３から５）で感染させた細胞のドデシル硫
酸ナトリウム−ポリアクルルアミドゲル電気泳動（ＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥ）の結果を示し、レーン１と７は蛋白分子
量マーカーを含有し、レーン２と６は感染していない細
胞である。
【図７】ｐＡｃ３６ＣＨＩＶＫとｐＡｃ３６ＣＨＩＶＰ
の作成に使用されるヌクレオチドの配列を示す。
【図８】ＨＩＶ−１からのインテグラーゼ蛋白を発現し
ている昆虫細胞の溶解物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示
す。ここでレーン１；ｖＡｃ３６ＣＨＩＶ／Ｋで感染さ
せた細胞の溶解物、レーン２；ｖＡｃ３６ＣＨＩＶ／Ｐ
で感染させた細胞の溶解物、レーン３；野生型ウイルス
で感染させた細胞の溶解物、レーン４；感染していない
細胞の溶解物、レーン５；蛋白分子量マーカー（矢印は
ＨＩＶインテグラーゼのバンドを示す）。
【図９】実施例２で使用した１．２ｋｂのＥｃｏＲＩ−
ＢａｍＨＩ断片の制限酵素地図を示し、翻訳開始コドン
には下線が引いてある。
【図１０】実施例２で使用した１．２ｋｂのＥｃｏＲＩ
−ＢａｍＨＩ断片の制限酵素地図を示し、翻訳開始コド
ンには下線が引いてある。
【図１１】実施例２で使用した１．２ｋｂのＥｃｏＲＩ
−ＢａｍＨＩ断片の制限酵素地図を示し、翻訳開始コド
ンには下線が引いてある。 ─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成５年９月２０日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図面の簡単な説明
【補正方法】変更
【補正内容】
【図面の簡単な説明】
【図１】ｐ３６Ｃ−ＴＥＴｔａｃ２の作成を示す。
【図２】（ａ）伝達性ベクターｐ３６ＣＳＴ１とｐ３６
ＣＳＴＭ２の作成と（ｂ）ｐＫＳＳＴ２のＭ１３誘導体
上のオリゴヌクレオチド指令突然変異誘発に使用される
オリゴヌクレオチドを示す。
【図３】ｐ３６ＣＳＴ１の構造を示す。
【図４】組織メタロプロテアーゼインヒビター（ＴＩＭ
Ｐ）の存在下（□）または欠如下（▲黒四角▼）での、
感染後１、２、３そして４日目のｖ３６ＣＳＴＭ２によ
り感染させた細胞溶解物の活性を示し、Ｃは対照を意味
し、Ｗは野生型バキュロウイルスを意味し、ＤＰＭは１
分間当りの分解を意味し、ＥＮＺは純粋な酵素の対照量
を意味する。
【図５】ｐ３６ＣＰ４０とｐ３６ＣＰ４０ｐｌの作成に
使用されるオリゴヌクレオチドの配列を示す。
【図６】ｖＰ４０、ｖ３６ＣＰ４０ｐｌとｖ３６Ｐ６０
ｐｌ（レーン３から５）で感染させた細胞のドデシル硫
酸ナトリウム−ポリアクルルアミドゲル電気泳動（ＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥ）の結果を示し、レーン１と７は蛋白分子
量マーカーを含有し、レーン２と６は感染していない細
胞である。
【図７】ｐＡｃ３６ＣＨＩＶＫとｐＡｃ３６ＣＨＩＶＰ
の作成に使用されるヌクレオチドの配列を示す。
【図８】電気泳動の結果を示す写真であり、ＨＩＶ−１
からのインテグラーゼ蛋白を発現している昆虫細胞の溶
解物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。ここでレーン１；
ｖＡｃ３６ＣＨＩＶ／Ｋで感染させた細胞の溶解物、レ
ーン２；ｖＡｃ３６ＣＨＩＶ／Ｐで感染させた細胞の溶
解物、レーン３；野生型ウイルスで感染させた細胞の溶
解物、レーン４；感染していない細胞の溶解物、レーン
５；蛋白分子量マーカー（矢印はＨＩＶインテグラーゼ
のバンドを示す）。
【図９Ａ】実施例２で使用した１．２ｋｂのＥｃｏＲＩ
−ＢａｍＨＩ断片の制限酵素地図を示し、翻訳開始コド
ンには下線が引いてある。
【図９Ｂ】実施例２で使用した１．２ｋｂのＥｃｏＲＩ
−ＢａｍＨＩ断片の制限酵素地図を示し、翻訳開始コド
ンには下線が引いてある。
【図９Ｃ】実施例２で使用した１．２ｋｂのＥｃｏＲＩ
−ＢａｍＨＩ断片の制限酵素地図を示し、翻訳開始コド
ンには下線が引いてある。
【手続補正２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正内容】
【図３】
【図４】
【図１】
【図６】
【図８】
【図９Ｂ】
【図２】
【図５】
【図７】
【図９Ａ】
【図９Ｃ】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 15/49 Ｃ１２Ｐ 21/02 ＺＮＡ Ｃ 8214−4Ｂ //(Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 7/01 Ｃ１２Ｒ 1:92） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:92） (72)発明者 マーチン ジョン ペイジ イギリス国ケント，ベッケンハム，ラング リィ コート（番地なし) (72)発明者 アイアン ジョージ チャールズ イギリス国ケント，ベッケンハム，ラング リィ コート（番地なし)

Claims (24)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 細胞中の遺伝子の発現を指令することが
    でき蛋白をコードする異種遺伝子に機能的に結合したプ
    ロモーターを有する、組換えバキュロウイルス（ｂａｃ
    ｕｌｏｖｉｒｕｓ）で感染させた細胞を、 蛋白が得ら
    れる条件で培養することよ りなる蛋白の調製方法にお
    いて、該異種遺伝子の前に 【化１】 ＴＡＡＴＣＡＴＣＣＡＣＡＧＧＡＧＡＣＴＴＴＣＴＧ よりなるリーダー配列が存在することを特徴とする、上
    記方法。
  2. 【請求項２】 リーダー配列は 【化２】 ＡＴＣＣＴＡＡＴＣＡＴＣＣＡＣＡＧＧＡＧＡＣＴＴＴＣＴＧ よりなる、請求項１に記載の方法。
  3. 【請求項３】 リーダー配列は異種遺伝子の翻訳開始コ
    ドンに融合（ｆｕｓｅ）している、請求項１または２に
    記載の方法。
  4. 【請求項４】 異種遺伝子、は破傷風毒素断片Ｃ、スト
    ロメリシン（ｓｔｒｏｍｅｌｙｓｉｎ）、百日咳主要表
    面抗原およびヒト免疫不全症ウイルスインテグラーゼ
    （ｉｎｔｅｇｒａｓｅ）蛋白から選択される蛋白をコー
    ドする、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
  5. 【請求項５】 プロモーターはポリヘドリン（ｐｏｌｙ
    ｈｅｄｒｉｎ）プロモーターである、前記請求項のいず
    れか１項に記載の方法。
  6. 【請求項６】 細胞はスポドプテラ・フルギペルダ（Ｓ
    ｐｏｄｏｐｔｅｒａｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞株の細
    胞である、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
  7. 【請求項７】 こうして得られた蛋白をさらに単離・精
    製することよりなる、前記請求項のいずれか１項に記載
    の方法。
  8. 【請求項８】 組換えバキュロウイルスで感染させた細
    胞中の遺伝子の発現を指令することができ、異種遺伝子
    に機能的に結合したプロモーターを有する組換えバキュ
    ロウイルスにおいて、該異種遺伝子の前に 【化３】 ＴＡＡＴＣＡＴＣＣＡＣＡＧＧＡＧＡＣＴＴＴＣＴＧ よりなるリーダー配列が存在することを特徴とする、上
    記組換えバキュロウイルス。
  9. 【請求項９】 リーダー配列は 【化４】 ＡＴＣＣＴＡＡＴＣＡＴＣＣＡＣＡＧＧＡＧＡＣＴＴＴＣＴＧ よりなる、請求項８に記載の組換えバキュロウイルス。
  10. 【請求項１０】 リーダー配列は異種遺伝子の翻訳開始
    コドンに融合している、請求項８または９に記載の組換
    えバキュロウイルス。
  11. 【請求項１１】 異種遺伝子は、破傷風毒素断片Ｃ、ス
    トロメリシン、百日咳主要表面抗原およびヒト免疫不全
    症ウイルスインテグラーゼ蛋白から選択される蛋白をコ
    ードする、請求項８から１０までのいずれか１項に記載
    の組換えバキュロウイルス。
  12. 【請求項１２】 プロモーターはポリヘドリンプロモー
    ターである、請求項８から１１までのいずれか１項に記
    載の組換えバキュロウイルス。
  13. 【請求項１３】 （ａ） 組換えバキュロウイルスで感
    染させた細胞中の遺伝子の発現を指令することができ、
    異種遺伝子に機能的に結合したプロモーターを有する、
    組換えバキュロウイルス伝達性ベクター（ｔｒａｎｓｆ
    ｅｒ ｖｅｃｔｏｒ）を与え、（ｂ） バキュロウイル
    ス感染に対して感受性の細胞を、組換えバキュロウイル
    ス伝達性ベクターと無傷の（ｉｎｔａｃｔ）野生型バキ
    ュロウイルスＤＮＡで同時トランスフェクション（ｃｏ
    −ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）することよりなる、組換
    えバキュロウイルスの調製方法において、該異種遺伝子
    の前に 【化５】 ＴＡＡＴＣＡＴＣＣＡＣＡＧＧＡＧＡＣＴＴＴＣＴＧ よりなるリーダー配列が存在することを特徴とする、上
    記方法。
  14. 【請求項１４】 リーダー配列は 【化６】 ＡＴＣＣＴＡＡＴＣＡＴＣＣＡＣＡＧＧＡＧＡＣＴＴＴＣＴＧ よりなる、請求項１３に記載の方法。
  15. 【請求項１５】 リーダー配列は異種遺伝子の翻訳開始
    コドンに融合している、請求項１３または１４に記載の
    方法。
  16. 【請求項１６】 異種遺伝子は、破傷風毒素断片Ｃ、ス
    トロメリシン、百日咳主要表面抗原およびヒト免疫不全
    症ウイルスインテグラーゼ蛋白から選択される蛋白をコ
    ードする、請求項１３から１５までのいずれか１項に記
    載の方法。
  17. 【請求項１７】 プロモーターはポリヘドリンプロモー
    ターである、請求項１３から１６までのいずれか１項に
    記載の方法。
  18. 【請求項１８】 細胞はスポドプテラフルギペルダ昆虫
    細胞株の細胞である、請求項１３から１７までのいずれ
    か１項に記載の方法。
  19. 【請求項１９】 組換えバキュロウイルスで感染させた
    細胞中の遺伝子の発現を指令することができ異種遺伝子
    に機能的に結合したプロモーターを有する、組換えバキ
    ュロウイルス調製に使用するためのバキュロウイルス伝
    達性ベクターにおいて、該異種遺伝子の前に 【化７】 ＴＡＡＴＣＡＴＣＣＡＣＡＧＧＡＧＡＣＴＴＴＣＴＧ よりなるリーダー配列が存在することを特徴とする、上
    記ベクター。
  20. 【請求項２０】 基本的に 【化８】 ＴＡＡＴＣＡＴＣＣＡＣＡＧＧＡＧＡＣＴＴＴＣＴＧ よりなるリーダー配列が前に存在する遺伝子よりなるＤ
    ＮＡ配列。
  21. 【請求項２１】 リーダー配列は 【化９】 ＡＴＣＣＴＡＡＴＣＡＴＣＣＡＣＡＧＧＡＧＡＣＴＴＴＣＴＧ よりなる、請求項２０に記載のＤＮＡ配列。
  22. 【請求項２２】 リーダー配列は異種遺伝子の翻訳開始
    コドンに融合している、請求項２０または２１に記載の
    ＤＮＡ配列。
  23. 【請求項２３】 異種遺伝子は、破傷風毒素断片Ｃ、ス
    トロメリシン、百日咳主要表面抗原およびヒト免疫不全
    症ウイルスインテグラーゼ蛋白から選択される蛋白をコ
    ードする、前記請求項２０から２２までのいずれか１項
    に記載のＤＮＡ配列。
  24. 【請求項２４】 （１）ポリヘドリン遺伝子のＮ−末
    端の下流の外来遺伝子がクローン化される制限部位； （２）ポリヘドリン遺伝子の天然のＡＴＧ翻訳開始コド
    ンの代わりのヌクレオチドの別のトリプレット（ｔｒｉ
    ｐｌｅｔ）；そして （３）ポリヘドリン遺伝子の最初の２４個以下から最初
    の５０個以下の塩基よりなる、バキュロウイルス伝達性
    ベクターにおいて、（３）の下流であるが（１）の前に 【化１０】 ＴＡＡＴＣＡＴＣＣＡＣＡＧＧＡＧＡＣＴＴＴＣＴＧ よりなるリーダー配列（４）が与えられることを特徴と
    する、上記ベクター。
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