PT99313B

PT99313B - Processo para a preparacao de proteinas, de viros recombinantes e de vectores de transferencia uteis para a expressao dessas proteinas

Info

Publication number: PT99313B
Application number: PT99313A
Authority: PT
Inventors: Timothy Charles Peakman; Martin John Page; Iam George Charles
Original assignee: Wellcome Found
Priority date: 1990-10-24
Filing date: 1991-10-23
Publication date: 1999-04-30
Also published as: ZA918462B; IE913711A1; ATE131874T1; US5322774A; IE74224B1; EP0486170A1; CA2054069A1; AU647190B2; AU8607291A; JPH0690769A; NZ240318A; PT99313A; GB9023111D0; DE69115653T2; EP0486170B1; DE69115653D1

Description

A presente invenção refere-se à preparação de proteínas por meio de um sistema de expressão de baculovírus.

sistema de vectores do baculovírus foi usado para expressar genes procari óti cos e eucarióticos. A expressão destes genes é controlada pelo promotor de poliedrina de um baculovírus, em particular do vírus de poliedrose nuclear Autoqrapha califarnica (AcNPV). Os genes estranhas são expressos em células de insectos em cultura, as quais são infectadas com baculovírus recombinantes incorporando o gene estranho.

Com o objectivo de obter um baculovírus recombinante, usa-se um vector de transferância de baculovírus. Este vector inclui o promotor de poliedrina. Descreve-se o ADN do baculovírus que ladeia o gene de poliedrina. D resto do vector é tipicamente construído a partir de ADN de um plasmídeo bacteriano. Um gene estranho é inserido no vector de transferência a jusante do promotor de poliedrina de forma a que a sua expressão é controlada por este promotor.

□ vector de transferencia contendo o gene estranho e um baculovírus co-transfectam então células de insecto susceptíveis de serem infectadas por baculovírus. Tipicamente são utilizadas culturas de células de Spodoptera • fruqiperda. Ocorre em seguida uma recombinação homóloga envol. vendo o ADN virai no vector de transferância a montante e a

jusante do gene estranho e do correspondente ADN do baculovírus. 0 gene estranho e o seu promotor de poliedrina são deste modo transferidos para o baculovírus. 0 baculovírus recombinante é cultivado de modo a expressar o gene estranho.

Existem dois tipos de vectores de transferência de baculovírus. Em primeiro lugar, existem vectores de transferência que incluem um local de restrição no qual um gene estranho pode ser clonado a jusante do codão de partida ATG da poliedrina para tradução. Estes vectores de transferência dão como resultado proteínas de fusão nas quais o produto do gene estranho é fundido para uma porção N-terminal do peptideo de poliedrina.

Em segunda lugar existem vectores de transferência nos quais a sequência guia 5' não traduzida do gene de poliedrina termina antes do codão de tradução ATG natural para a poliedrina, produzindo-se então um local de restrição. Um exemplo destes vectores de transferência é o vector pAc373 no qual a sequência guia 5' não traduzida termina S bases a montante do ATG da poliedrina natural. Os genes clonados no local de restrição são expressos sob a forma de proteínas maduras se contêm um ATG seguido por um quadro de leitura livre que codifica para o produto desejado.

No pedido de Patente EP-A-0340359 descrevemos e rei vindicámos um vector de transferência de baculovírus que incorpora um local de restrição no qual um gene estranho pode ser clonado a uma curta distância a jusante da extremidade N-terminal do gene de poliedrina e no qual um outro tripleto de nucleótidos está presente no lugar do codão de partida de tradução ATG natural para o gene de poliedrina. Um dos preferidos entre estes vectores é o pAc36C. Podem ser alcançados níveis incrementados de expressão de uma proteína pelo uso deste tipo de vactor de transferência.

Acabámos de verificar de uma forma surpreendente que os níveis de melhorados clonando uma sequência gene heterólogo que se deseja expressar. D sistema de expressão do baculovírus não é um sistema de expressão procariótico. Pelo expressão podem ainda ser procariótica em frente de um

contrário, a expressão acorre em células de insectos que são classificados como sucariantes superiores. 0 uso da sequência guia procariótica da invenção tem como resultado surpreendentemsnte níveis de expressão das proteínas mais elevados o que se em seu lugar fosse empregue uma sequência de Kozak. Uma sequência de Kozak é uma sequência que se crê ser óptima para a expressão eucariótica.

Deste modo, a presente invenção proporciona um processo para a preparação de uma proteína, processo esse que compreende a cultura sob condi çSfes tais que a proteína ê obtida a partir de células infectadas com um baculovírus recombinante que possui um promotor capaz de dirigir a expressão de um gene nas células, ligado operativamente a um gene heterólogo que codifica para a proteína e que é precedido por uma sequência guia compreendendo!

TAATCATCCACAGGAGACTTTCT6.

Pi invenção proporciona adicionalmente um baculovírus recombinante que possui um promotor, capaz de dirigir a expressão de um gene em células infectadas com o baculovírus recombinante, ligado operativamente a um gene heterólogo que é precedido por uma sequência guia compreendendo:

TAATCATCCACAGGA6ACTTTCTG.

A sequência guia da presente invenção pode ser prolongada na sua extremidade 5', por exemplo num máximo de 12 ou num máxima de ó nucleótidos adicionais. Os nucleótidas adicionais podem deste modo ter sido seleccionados de modo a permitir que a sequência guia seja clonada num local de restrição de um virus de transferência de baculovírus. Os nucleótidos adicionais podem deste modo representar a sequência de um local de restrição ou de locais de restrição. Uma sequência guia prolongada na sua extremidade 5' para acomodar um local Bam HI é:

ATCCTAATCATCCACAGGABACTTTCTB.

Esta sequência pode ser proporeionada com um nucleótido B na sua extremidade 5'. Uma sequência incorporando tanto um local Hin III como um local Bam HI é:

Hin III Bam HI

AGCTTSBATCCTAATCATCCACAGGAGACTTT C T G

Tipicamente, a sequência guia é •fundida com o codão de iniciação da tradução do gene heterólogo que se deseja expressar. Nestas circunstâncias, portanto, a extremidade 3' da sequência guia é -fundida directamente com o codão de início de tradução ATG do gene heterólogo. Por gene heterólogo entende-se um gene que codifica para um polipeptideo que não é normalmente produzido pelas células infectadas com o baculovírus recombinante. De preferência, o gene heterólogo não é um gene de baculovírus nem um gene de célula de insecto.

O gene heterólogo começa por um codão de iniciação de tradução. 0 gene pode ser um gene procariótico ou eucariótico. Pode ser um gene sintético. □ gene heterólogo codifica para um polipeptideo seleccionado. 0 polipeptideo seleccionado pode ser um polipeptideo fisiologicamente activo, por exemplo, um polipeptideo activo no corpo humano. 0 polipeptideo pode ser capaz de suscitar anticorpos. 0 polipeptideo pode ser o fragmento C da toxina do tétano, a estromelisina, o antigénio superficial principal da coqueluche ou a proteína integrase de HIV. Outros polipeptideos que podem ser codificados pelo gene heterólogo incluem:

antigénio superficial do virus de hepatite B;

antigénio de núcleo do virus da hepatite B;

factores de crescimento tais como factor de crescimento epidérmico ou factor de crescimento transformante; i nterferães, polipeptídeos derivados do invólucro de um retrovirus associado

à SIDA;

polipeptídeos derivados de um organismo do género plasmodium; polipeptídeos derivados do vírus de Epstein-Barr; a cadeia pesada de uma molécula de imunoglobulina humana; a cadeia leve de uma molécula de imunoglobi1ina humana; a cadeia pesada de uma molécula de imunoglobulina de rato; a cadeia leve de uma molécula de imunoglobulina de rato; moléculas de imunoglobulina híbridas p. εκ. moléculas onde a região variável da molécula de imunoglobulina híbrida é derivada de uma sequência de região variável não humana, como seja a dum rato, e a região constante da molécula de imunoglobulina híbrida é derivada de uma região constante humana ou onde as regiães complementarmente determinantes (CDRs) da molécula de imunoglobulina híbrida são derivadas de uma imunoglobulina não humana tal como uma imunoglobulina murina e as restantes sequências da molécula de imunoglobulinaa híbrida são derivadas de uma imunoglobulina humana; e polipeptídeos de fusão que compreendem uma molécula de imunoglobulina híbrida contígua ou ligada através de uma sequência de ácidos aminados a uma molécula de enzima.

promotor é tipicamente o promotor da poliedrina. O baculovírus é de preferência ftutoqrapha califoi— nica. As células que são infectadas com α baculovírus recombinante são geral mente células de uma linha de células ou células de insecto. Podem ser usadas células de Trichoplusia ni. Spodoptera fruqiperda. Heiiothis zea ou Manduca sexta. As células são de preferência células de uma linha de células de Spodoptera fruqiperda.

As células que são infectadas com o babculovírus recombinante são tipicamente cultivadas de acordo com procedimentos normalizados (Summers, M.D. e Smith, G.E., 1987. Um manual de métodos para vectores de baculovírus e procedimentos de culturas de células de insectos, Texas Agricultural Experimental Station, Bulletin No. 1555). A proteína desejada é expressa. Pode então ser isolada e purificada.

baculovírus recombinante pode ser preparado por um processo compreendendo:

(a) proporcionar um vector de transferência de baculovírus recombinante possuindo um promotor, capaz de dirigir a expressão de um gene em células infectadas com o baculovírus recombinante, ligado operativamente ao gene heterólogo que é precedido pela sequência guia compreendendo:

TAATCATCCACAGGAGACTTTCTG; e (b) co-transfectar células susceptíveis a infecção por baculovírus com o vector de transferência de baculovírus recombinante e com ADN de baculovírus de tipo selvagem intacto.

As células que são transfectadas na fase (b) são geralmente células de uma linha de células ou células de insecto. Células de Trichoplusia ni, Spodoptera frugiperda, Heliothis zea ou Manduca sexta podem ser transfectadas. De preferência as células são células de uma linha de células de Spodoptera fruqiperda. 0 vector de transferência de baculovírus recombinante compreende tipicamente ADN do baculovírus Autographa californica ladeando o promotor, sequência guia e gene estranho. 0 ADN de baculovírus de tipo selvagem que também transfecta as células é então o ADN genómico de Autoqrapha californica.

Após recombinação homóloga, o promotor, a sequência guia, o gene estranho e o ADN virai lateral do vector de transferência recombinante são transferidos para o ADN de baculovírus de tipo selvagem. O baculovírus recombinante é verificado, por exemplo por um ensaio de placa. O baculovírus recombinante pode ser purificado.

vector de transferência de baculovírus recombinante que é empregue na fase (a) é também parte da invenção. Um tal vector de transferência pode ser preparada por clonagem de uma sequência de ADN constituída essencial mente por um gene heterólogo e pela sequência guia da invenção para um vector de transferência de baculovírus. A sequência de ADN ê clonada para o vector de transferência num local de restrição

apropriado de forma a estar sob regulação de transcrição do promotor que dirigira a expressão do gene. 0 vector de transferencia é de preferencia pAc36C, caso em que a sequência de ADN é clonada para o local Bam Hl no vector.

Em alternativa, o vector de transferencia de baculovírus recombinante pode ser preparado a partir de um vector de transferência que incorpora a sequência guia.

Um gene heterólogo pode ser cionado para o vector de transferencia num local de restrição imediatamente a jusante da sequência guia. Um vector de transferência preferido deste tipo compreendes (i) um local de restrição no qual um gene de restrição pode ser cionado a jusante da extremidade N-terminal do gene de poliedrina, (ii) outro tripleto de nucleótidos em lugar do codão de início de tradução ATG natural do gene de poliedrina, (iii) desde, no máximo, as primeiras 24 até, no máximo, as primeiras 50 bases do gene de poliedrina, e (iv) a sequência guia da invenção a jusante de (iii) mas antes de (ii).

De preferência estão presentes desde, no máxima, as primeiras 27 até, no máximo, as primeiras 39 bases do gene de poliedrina. Podem estar presentes no máximo as primeiras 33 bases. Estas bases podem ser seguidas por uma sequência de ligação de até 10 bases, por exemplo de até 5 bases, antes da sequência guia. Em alternativa, pode não estar presente qualquer sequência de ligação. A sequência guia é tipicamente seguida imediatamente pelo local de restrição (i).

A sequência de ADN que compreende a sequência guia e um gene heterólogo é preparada normalmente construindo a sequência guia e fundindo a sequência guia com o gene. Uma sequência génica heterólaga para uso na invenção pode ser preparada por sintese, por exemplo por têmpera de oligonucleótidos com sobreposição. Em alternativa, pode ser uma sequência de ADNc ou clonada.

Os seguintes Exemplos ilustram a invenção. Nas -figuras anexas:

a figura 1 mostra a construção de p36C-TETtac2;

a figura 2 mostra (a) a construção dos vectores de transferência p36CSTl e p36CSTM2 e (b) o oligonucleótido usado para mutagénese dirigida para oligonucleótidos no derivado MÍ3 de pKSST2;

a figura 3 mostra a estrutura de p36CSTl;

a figura 4 mostra a actividade dos lisados celulares infectados com v36CSTM2 nos dias 1, 2, 3 e 4 após a infecção na presença (q) ou ausência (Q) de inibor de metaloproteínase de tecido (TIMP), em que C representa o branco, W representa baculovirus de tipo selvagem, DPM representa desintegrações por minuto e ENZ representa um alíquota de branco de enzima pura.

a figura 5 mostra as sequências dos oligonucleótidos usadas na construção de p36CP40 e p36CP40Pl;

a figura 6 mostra os resultados de electroforese de gel de dodecil-sulfato de sódio-poliacrilamida (SDS-PAGE) de células infectadas com vP40, v36CP40pl e v3ÓP60pl (pistas 3 a 5), enquanto as pistas í e 7 contêm marcadores de peso molecular de proteínas e as pistas 2 e 6: células não i nfectadas;

a figura 7 mostra as sequências dos nucleótidos usados na construção de pAc36CHIVK e pAc36CHIVP;

a figura 8 representa uma análise por SDS-PAGE de lisados de células de insectos que expressam a proteína de integrase de HIV-1, na qual Pista 1; Lisado de células infectadas com vAc36CHIV/K. Pista 2; Lisado de células infectadas com vAc36CHIV/P. Pista 3; Lisado de células infectadas com virus do tipo selvagem. Pista 4; Lisado de células não infectadas. Pista 5; Marcadores de Peso molecular de proteínas (A flecha indica a banda de integrase de HIV); e a figura 9 é um mapa de restrição do fragmento de EcoRI-BamHI de 1,2 kb empregue no Exemplo 2, no qual o codão de início da tradução está sublinhado.

Exemplo 1; Expressão do -fragmento C da toxina do tétano

1. Materiais e métodos

Estirpes bacterianas e técnicas de ADN recombinantes

A estirpe E.coli TG1 e o plasmídeo pTETtac2 já foram anteriormente descritos (Makoff et al, Biotechnology 7, 1989, 1043-1046; WO 90/15871). As manipulações do ADN foram realizadas tal como descrito por aniatis et al (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, New York, US, 1982).

Procedimentos com Baculovírus

Os recombinantes de baculovírus foram gerados por contransfecção de 1 pg de AcNPV ADN com 2 pg de ADN de plasmídeo recombinante (preparado segundo o método de Birnboim e Doly, Nucl. Acids Res 7, 1979, 1513) para células de Spodoptera fruqiperda através da precipitação com fosfato de cálcio. Após 4 horas as células foram enxaguadas uma só vez, re-alimentadas com meio TC100 (Flow Labs) e cultivadas durante 3 dias a 285C. Os sobrenadantes foram então titulados em placas e foram seleccionados visualmente em relação a placas negativas de inclusão. Foram mantidas provisões de células 5. fruqiperda em balões de rotação (Techne) à temperatura ambiente. Foram realizadas experiências em placas inoculando-se as células de S. fruqiperda em placas de Petri de 35 mm perfazendo 10^à células/placa, que foram deixadas aderir durante 10 a 15 minutas à temperatura ambiente e depois infectadas com 100 pg de vírus/placa. Após uma hora à temperatura ambiente retirou-se o inóculo de vírus por aspiração e colocaram-se monocamadas com 1% de agarose (2 volumes de TC100 mais 1 volume de agarose Seplaque LGT a 3%). Após deixar assentar depositou-se ainda mais 1 ml de TC100 sobre a agarose. Após 3 dias a 282C removeuse o TC100 e as placas foram visualizadas através de coloração durante 1 hora com 1 ml/placa de vermelho neutro (BDH) a 10% em » *

PBS. Ds clones purificados da placa foram expandidos em bal&es de rotação Tchne a 282C.

Procedimentos de imunização

C em gel alidro de confrontação te (Fairwaether

Foram imunizados ratos com fragmento e a sua imunidade ao tétano foi testada através com a toxina tal como foi descrito anteriormenet al., Infect. Immun. 55, 1987, 2541-2545).

Cromatografia de afinidade e ELISft

D fragmento C foi purificado a partir de extractos de S.fruqiperda através de cromatografia de afinidade com anticorpos monoclonais TT08 CSheppard et al, Infect. Immun. 43, 710-714, 1984) ligado a Sspharose (marca registada) 4B activada por brometo de cianogénio. 0 fragmento C foi eluído com citrato de sódio 0,1 M de pH 3,0 e foi neutralizado através da adição de um volume igual de fosfato de sódio 0,1 M, D fragmento C foi analisado por uma análise de imunosorvente ligado a enzima (ELISA) tal como descrito anteriormente (Makoff et al, 1989).

2. RESULTADOS E DISCUSSÃO

Clonagem do fragmento C no baculovírus

gene estrutural para α fragmento C encontra-se presente em pTETac2, um plasmídeo de expressão E.coli que dirige a sintese do fragmento C a 3 a 4% da proteína celular total (Makoff et al, 1989). Como α fragmento C é um produto e cisão da toxina do tétano, o pTETac2 dirige a síntese do fragmento C maduro com um resíduo de metionina na extremidade N-terminal. Um fragmento BqlII-BamHI. contendo o gene estructural do fragmento C inteiro procedido pela sequência AGATCTTAATCATCCACAGGAGACTTTCTGATG, foi clonado no local BamHI singular de p36C que é um vector de expressão de baculovírus de • alto nível (Page, Nucl. Acids Res. 17, 454, 1989).

plasmídeo resultante, p36C-TeTtac2 (ver Figura 1), -foi cotransfectado com ADN de baculovírus AcNPV em células de S, frugiperda através de precipitação com -fosfato de cálcio. As células contendo vírus recombinantes foram identificadas através de selecção em relação a placas negativas de inclusão. Após a purificação de placas foram seleccionadas vários recombinantes para a produção de fragmento C por SDS-PABE e mancha de Western (dados não apresentados).

Um recombinante, BVFC1, foi estudado de uma forma mais aprofundada. As células de S, frugiperda foram infectadas com BVFC1 numa multiplicidade de infecção de 0,1. As células foram retiradas a intervalos diários para análise por electroforese de gel de poliacrilamida-dodecilsulfato de sódio (SDS-PAGE). □ fragmento C foi sintetizado por células infectadas por BVFC1 durante 2a 4 dias, tendo-se alcançada a quantidade máxima de produção no dia 3. O fragmento C foi claramente um dos polipeptídeos produzidos maioritariamente pelas células num nível só ligeiramente mais baixo que a poli edrina.

As células de S.fruqiperda foram cultivadas em balftes de rotação e foram infectadas com vírus de BVFC1 numa multiplicidade de infecção de 10. Após 4 dias as células foram recolhidas, lisadas por meio de ultrassons e deste modo obteve-se um extracto solúvel através de centrifugação de baixa e alta velocidade. As proteínas das células foram então analisadas por SDS-PAGE e mancha de Western. Uma banda de entre 5 foi uma das proteínas maioritárias no extracto celular. A sua identidade como fragmento C foi confirmada através da mancha de Western contra soros anti-fragmento C.

Obteve-se deste modo uma expressão do fragmento C muito alta (cerca de 400 pg/ml). 0 fragmento C foi purificado a partir do extracto celular por cromatografia de afinidade utilizando o anticorpo monoclonal TTOB. 0 fragmento C purificada desta forma mostrou ser 80% mais puro por determinação por SDS-PAGE.

Imunogeneticidade do fragmenta C expresso por baculovírus

D fragmento C de C, tetani ou

E. coli protege ratos contra a toxina do tétano. Para se determinar se o fragmento C produzido por baculovírus é responsável por esta actividade, os ratos foram imunizados com o extrato solúvel de células de 5. frugiperda que tinham sido infectadas com baculovírus BVFC1. Os resultados preliminares indicaram que estas preparaç&es possuiam uma actividade imunizadora (dados não apresentados). Este ensaio foi repetido com fragmento C imunopurifiçado seguido de provocação com a toxina do tétano. Os resultados são apresentados no Quadro 1.

Quadro 1 Imunização de ratos com fragmento C recombinante expresso por Baculovírus

Tratamento

Quantidade (juq)

Sobrevi ventes^b uma dose duas doses

Frag. C	1	10	10
Frag. C	0,25	10	10
Frag. C	0,06	0	10
Frag. C	0,10	0	0
PBS		0	0
Frag. C^c		10	10

* Injectou-se antigénio em gel alidro em ratos BALB/c por via subcutânea. A segunda dose foi dada 4 semanas depois da primeira injecção.

^b Os ratos (n = 10 por grupo) foram provocados com 50 LE^, s de toxina de tétano durante 4 semanas após a primeira injecção. ^c Derivado de toxina de tétano.

Os ratos imunizados com uma dose 0,25 pg ou com duas doses de 0,06 pg ficaram completamente protegi• dos contra o tétano, indicando que o fragmento C expresso por

4.

baculovírus foi biologicamente activo nesta experiência. Ds níveis de fragmento C necessários para a imunidade são semelhantes aos requeridos para fragmento C derivado de C. tetani ou de E. coli (Makoff et al, 1989), mostrando que o material expresso pelo baculovírus possui uma actividade comparável.

Exemplo Ξ: Expressão da proteína de estromelisina

1. Geral

A expressão do fragemnto C no Exemplo 1 não foi comparada com a expressão do fragmento C utilizando-se uma sequência tida como opcional para tradução eucariótica (uma sequência de Kozak). O sistema de expressão de baculovírus, no qual a expressão ocorre em células de insecto, é classificado como eucariótico superior. Seria de esperar que as regras de tradução se adaptassem ás regras de Kozak determinadas para genes de mamíferos apesar de não existir qualquer prova experimental sobre a aplicação das regras de Kozak. A sequência guia da presente invenção empregue no Exemplo 1 situa-se abaixo do nível óptimo no que respeita à sequência de Kozak consensual.

As experiências foram deste modo conduzidas de forma a poder-se comparar a sequência guia da presente invenção com as sequências sub-óptima, óptima e perfeita de Kozak. □ primeiro conjunto de experiências envolve a expressão da proteína de estromelisina. Foram preparadas e analisadas duas construç&es. A primeira construção foi um baculovírus recombinante designado por v3STl que era subóptimo na zona do codão de início de tradução ATG para a sequência consensual de Kozak:

V3ÓST1 5' GATCCGAATTC ATG T 3'

A segunda construção foi um baculovírus recombinante designado por v36STM2 que continha a sequência guia da presente invenção fundida ao codão de início de tradução do gene da estromelisina. As células infectadas foram

analisadas através da determinação da actividade de protease. Não -foi possível distinguir a actividade de protease das células infectadas com v36STl da actividade de -fundo (cerca de 400 unidades). A actividade das células não infectadas e das células infectadas com o vírus de tipo selvagem foi igual mente baixa (200 a 300 unidades). Em contraste as células infectadas com v36STM2 possuiam uma actividade de protease de cerca de 8000 unidades, isto é uma estimulação igual a 20 vezes. De uma forma mais pormenorizadas

2. Construção de vectores de transferência p56CSTl e P56CSTM2 □s vectores de transferência pSóCCTi e p36CSTM2 que contêm α gene de estromelisina manipulado foram derivados de pAc36C (Page, 19S9). 0 gene de estromilisina na sua totalidade (Whitham et al. Biochem. J. 240, 913-916, 1986; EMBL database, code HSSTROMR) foi sintetizado como um fragmento EcoRI - BamHI de 1,2 kb (Figura 9) que foi clonado no plasmídeo pUC18. Este fragmento foi purificado através de electroforese em gel e electroeluição, ligado a um ou outro dos dois oligonucleótidos apresentados na Figura 2a, e depois foi clonado no local BamHI de Bluescript KS. Os plasmídeos resultantes foram designados por pKSSTl (Figura 2a(i)) e pKSST2 (Figura 2a (ii)).

plasmídeo pKSSTl foi digerido com BamHI e o fragmento de 1,2 kb foi purificado por electroforese em gel seguida de electroeluição e clonado na orientação no vector de transferência de baculovírus pAc36C. Este plasmídeo foi denominado p36CSTl (Fig. 3).

3. Construção de p36CSTM2 - mutaqenese de PM13ST2 fragmento BamHI de 1,2 kb de pKSST2 foi purificado por electroforese em gel seguida de electroeluição e foi clonado no local BamHI da forma de replicação na orientação anti-sentido do M13 mpl9. Este plasmídeo foi designado por pM13ST2. No entanto para se regenerar exactamente a

sequência do guia procariótica -foi necessário suprimir-se a sequência AATTC posicionada antes do codão de início da tradução do gene da estromolisi na. Esta operação -foi realizada por utilização do conjunto de mutagénese de oligonucleótidos Amersham International e da matriz M13 de cadeia simples derivada de pM13ST2. 0 oligonucleótido utilizado é apresentado na Figura 2b. A posição da sequência na região do início da tradução da forma sujeita a mutação, pM13STM2, foi confirmada por sequênciação de ADN. 0 fragmento BamHI de 1,2 kb de pM13STM2 foi purificada da forma replicativa do plasmídeo e cionado na orientação correcta no vector de transferência do baculovírus pAcSóC. 0 plasmídeo resultante foi chamado pAc3ÓCSTM2.

4. Geração de vírus recombinantes

As células de Spodoptera funqiperda CSf21) (Vaughen et al. In vitro, 13 213-217, 1977) foram deixadas crescer em culturas de suspensão a 272C em meio TC1OO (Flow Laboratories), com suplemento de soro fetal de bovino a 10% (Gibco) e 5 pg/ml de gentamicina. Propagou-se AcNPV em células Sf21 cultivadas a 27.2C em culturas de suspensão. Ds vírus recombinantes contendo as sequências de genes recombinantes hsterólogos foram gerados por co--transfecção de uma propor— ção malar de 20:1, dos vectores de transferência recombinantes p36CSTl e p36CSTM2, com ADN de AcNPV purificado a partir de culturas de vírus extracelulares (ECV) em células Sf21. □ método de purificação do ADN de AcNPV foi realizado tal como descrito (Summers e Smith, 19G7, “A Manual of Methods for Baculovírus Vectors and Insect Dell Culture procedure), com excepção de que as culturas foram infectadas a 0,1 pfu por célula e recolhidas após 6 dias, tendo-se omitido o passo do grtadiente de sucrose. A co-transfecção foi realizada tal como se descreve (Summers e Smith, 19Θ7, Método 1).

Foi efectuada uma busca de ECV resultante para selecçâo de recombinantes através de uma análise de placa com camada de agarose normal (Brown e Faulkner, 1977, J.

Gen Virol, 36, 361-364) utilizando diluiçães em série do sobrenadanté da cultura de transfecção. Após coloração com vermelho neutro foram seleccionadas vi suai mente as placas potencialmente recombinantes através de selecção da ausência de poliedros, estas foram recolhidas e colocadas em 0,5 ml de meio de cultura e purificadas através de repetidas análises de placa. Efectuou-se um aumento de escala dos vírus recombinantes até obtenção de um alto título (> 1<? pfu/^zml ) por infecção das culturas de monocamada de células Sf21 a 272C. Ds vírus de alto título foram designados por v36CSTl e V36CSTM2.

Análise de proteínas de células infectadas com os vírus recombinantes

A estrutura dos vírus recombinantes descritos na secção 4 foi confirmada através da mancha de Southern. Recolheram-se as placas negativas em relação a poliedrina negativa e positivas em relação a inserçbes para 0,5 ml de meio de cultura e deixaram-se difundir durante pelo menos 1 hora. Desta cultura foi utilizada uma aliquota de 100 μΐ para infectar 2 χ 10⁶ de células Bf21 numa placa de cultura de tecido de 35 mm, a qual foi incubada a 272C durante 1 hora. 0 inóculo foi removido e substituído por 1 ml de meio de cultura fresco e as placas foram incubadas a 27.QC durante 3 dias. As células foram então lavadas numa solução salina com tampão de fosfato (PBS) e removidas.

6. Actividade de protease da estromelisi na expressa por baculovírus

As proteínas expressas a partir dos vírus recombinantes foram analisadas da maneira seguinte.As células infectadas foram lisadas com 1% de nonideto P40 ÍNP40) e NaCl 150 mM e o material membranoso foi removido por centrifugação. 0 lisado restante foi incubado com caseína tritiada (200 pg em 100 μΐ de tampão tris - Sigma). A reacção foi

incubada a 372C durante 2 horas e foi feita terminar com a adição de 50 μΐ e um ácido tricloroacêtico a 307» (TCA). A actividade da estromelisi na foi determinada através da medição da radioactividade precipitada por TCA. A figura 4 mostra os resultadas desta análise em v36STM2. Ds valores obtidos para V36ST1 foram virtualmente indistinguíveis dos valores de fundo e não foram incluídos.

Surpreendentemente a presença de inibor de metaloproteínase de tecido (TIMP), um inibidor da estromelisina, não reduziu a actividade observada nos lisados das células. Supfte-se que um factor no lisado inibe a acção da estromelisina. As provas de suporte desta afirmação vêem da observação de que se os lisados dos brancos foram provocados com uma dada quantidade de estromelisina activa pura, então a actividade observada é mais baixa do que a experada.

EXEMPLO 5; Expressão do antigénio superficial principal da coqueluche

1. Geral

Duas construçães foram iniciaimente expressas em baculovírus. A primeira, chamada vp60pL, codificava para o antigénio superficial principal da coqueluche (peso molecular - 60 KDa) e foi expressa em p36C e continha α guia da presente invenção. A expressão desta proteína em células de insecto infectadas com vP60pl foi muito eficiente (400 a 500 ug/ml)„ A segunda construção, vP40 , era uma forma truncada do antigénio superficial principal. As sequências a montante deste gene eram óptimas segundo Kozak, apesar de não serem perfeitas, tal como se segue:

vP40

Consenso de Kozak

GAATTCAAT ÍC C C> (G C C) G C C ACC s

codão de início de tradução

As bases marcadas com (*) no consenso

de Kozak são as mais importantes na tradução. As que aparecem entre parêntesis são de menor importância. A expressão da proteína de 40 KDa em células infectadas com vP40 era ainda eficiente (cerca de 100 pg/ml) mas 4a 5 vezes inferior à expressão de células de P60 infectadas por vPóOpl.

A experiência que foi efectuada am seguida destinava-se a fazer um vírus recombinante que expressasse a proteína de 40 KDa precedida pelo mesmo guia procariótico de vPóOpl. A expressão da proteína de 60 KDa e da proteína de 40 KDa das duas construçães foi determinada. A expressão da proteína de 40 KDa era 3 a 4 vezes superior quando proveniente de vP40pl do que quando proveniente de vP40 e aproximava-se dos níveis de proteína expressa por vPóOpl.

2. Construção de p56CP60pl, p36cF40 e p56CP40pl

Os plasrnídeos p36cP40 e p36CP40pl foram preparados através da fusão do corpo do gene de antigénio superficial principal da coqueluche <F‘MSA) a que falta a extremidade N-terminal com oligonucleótidos sintéticos contendo vários guias de tradução e o terminal N de PMSA. A sequência de oligonucleótidos utilizada na construção dos dois plasrnídeos é apresentada na Figura 5.

(i) Construção de p56CF60pí

D fragmento Bq 111 - BamHI de 1,8 kb de pPertac 7, contendo a sequência de codificação de PMSA fundida ao guia da presente invenção, foi purificado por electroforese em gel e electroeluição de gel e foi clonado no local Bam Hl do vector de transferência do baculovírus pAc36C (Page, 1989). 0 plasmídeo resultante foi designado p36CP60pl.

(i i ) Construção de pAc36CP40 e pAc36CF‘4O fragmento Bql II - Sac I de 4,6 kbp de pPertac 9 (derivado de pPertac 7, Makoff et al.) foi purificado por electroforese seguida de electroeluição. Um par de oligonucleótidos contendo uma sequência óptima de Kopzak foi

clonado neste vector como fragmento Bql II - Sac I. Após sequênciação o fragmento Bql II - Bam HI de 1,1 kbp foi clonado na orientação correcta no local Bam HI do pAc36C. O plasmídeo resultante foi chamado pAc36CF'4O.

plasmídeo pAc36CP40pl foi construído em duas fases. 0 fragmento Bql II - Bam HI de 1,1 kbp de pPertac 7 (Makoff et al.. Biotechnolagy 8, 1990, 1030 - 1033) foi purificado e clonado no local Bam HI do pUC9 na orientação contra a lógica. Este plasmídeo foi designado pUC69-fc. Um par de oligonucleótidos contendo o guia da presente invenção e a sequência terminal N da proteína de 40 KDa foi clonado sob a forma de um fragmento Bam HI - Hind III na forma de replicação de M13 mpl9. A sequência do oligonucleótido foi confirmada por sequenciação do ADN. A inserção BamHI - Hind II da forma de replicação desta construção foi purificada e clonada entre os locais BamHI e Hind III do plasmídeo pUC9. D plasmídeo resultante foi designado pUC9-3.

plasmídeo pUC9-3 foi digerido com Sac I e Hind III e isolou-se o fragmento de 3,0 kb, contendo o guia da presente invenção, a sequência terminal N da proteína de 40 KDa e o corpo de vector pUC9. 0 fragmento Sac I - Hind III de 1,1 kbp, contendo a porção terminal C da proteína 40 KDa, foi purificado e clonado no vector p!JC9-3 digerido com Sac I Hind III. 0 plasmídeo resultante foi designado pUC9-l. Este plasmídeo continha toda a sequência de codificação para o PMSA truncado de 40 KDa fundido com o guia e flanqueado por dois locais Bam Hl. 0 fragmento Bam Hl de 1,2 kb de pUC9-l foi purificado e clonado nos locais Bam Hl de pAc36C. 0 plasmídeo resultante foi designado pAc36C040pl.

3. Geração de vírus recombinantes e análise de proteínas de células infetcadas com os vírus recombinantes

Esta operação foi realizada tal como se descreve no Exemplo 2. Os vírus ds alto título resultantes foram designados v36CP60pl, v36C040 e v36CP40pl. As células infectadas foram lisadas com SDS a 5íí o produto foi analisado

por electroforese em gel de SDS/poliacrilamida a 10% seguida de coloração com azul de Coomassie» Os resultados são apresentados na Figura 6.

A identidade e antigeneticidade destes produtos foi confirmada através de análise de mancha de Western utilizando antissoros de coelho policlonais (não apresentado). 0 produto de 60 KDa (pista 5) migrou como uma banda de 69 KDa. A razão desta migração anómala não é clara. 0 peso molecular previsto tal como determinação a partir da sequência de ácido aminados é de 60 KDa. 0 produto de 60 KDa apresenta alguma degradação no produto de 40 KDa que apresenta reacção cruzada com o anticorpo. Ambas as proteínas de 40 KDa e de 60 KDa são estáveis, de acordo com determinação por experiências de pulsgem-expulsão (dados não apresentados). Ds níveis de expressão foram os indicados anteriormente, demonstrando a superioridade do uso da sequência guia da presente invenção.

EXEMPLO 4; Expressão da proteína inteqrase do vírus de imunodeficiência human o (HIV)

1. Geral

Prepararam-se e analisaram-se duas construçães. A primeira, v36HIVK, continha o corpo do gene da integrase fundido com uma sequência guia perfeita de Kozak. A segunda, v36HIVP, continha o corpo do gene da integrase fundido com a sequência guia da presente invenção. □ nível de expressão da proteína de integrase por v36HÍVP foi 4a 5 vezes superior ao nível de expressão da proteína de integrase de v36HIVK.

2. Construção dos plasmídeos pAc56HIVK e pAc36HIVP □ fragmento de ADN que contém o gene de integrase em pAc36HIVK e pAc36HIVP foi derivado do plasmídeo pINpUC19. Esta construção continha a sequência codificadora da proteína de integrase de HIV num fragmento Κρη I - Hind III de

1,6 kbp (Sherman e Fyfe, PMAS USA, B7, 5119-5123, 1990). Tinha • sido introduzido um local Nde I por mutagénese dirigida ao

local imediatamente adjacente á fenilalanina terminal N da proteína de integrase HIV. Os plasmídeos pAc36HIVK e pAc36HIVP •foram construídos através da purificação do fragmento Nde I de 898 bp de pINpUCl? através de electroforese em gel seguida de electroeluição de gel. □ fragmento foi então ligado a um dos pares de oligonucleótidos apresentados na Figura 7 e cionados no local Bam HI de pAc36C. A construção contendo o guia da presente invenção fundida com ATG foi designada pAc36HIVP (figura 7a) enquanto que a que continha a sequência consensual de Kozak perfeita foi chamada pAc36CHIKK.

Geração de vírus recombinantes e análise de proteínas de células infectadas com os vírus recombinantes

Seguiu-se o procedimento descrito no Exemplo 2. Os vírus de alto título resultantes foram designados v36CIntk e v36IntP. As células infectadas <2 x IO⁴, 72 hpi) foram lisadas com 100 |_il de tris 150 mM, 5% de SDS, 25% de glicerol e 0,1% p/v de azul de bromofencl. As amostras destes lisados foram analisadas em géis SDS-PAGE a 10% (Figura 8). As células infectadas com vAc36C HIV/P expressaram a proteína de integrase a níveis cerca de 5 vezes superiores ao das células infectadas com vAc36CHIV/K.

Claims

REIVINDICAÇÕES

- lã. Processo para a preparação de uma proteína caracterizado por compreender a cultura em condições que permitem a obtenção da proteína de células infectadas com um baculovírus recombinante que possui um promotor com capacidade para dirigir a expressão de um gene nas células ligado de modo operacional a um gene heterólogo que codifica para a proteína e que é precedido por uma sequência guia que contém:

TAATCATCCACAGGAGACTTTCTG.

- 2â. Processo de acordo com a reivindicação i caracterizado por a sequõncia guia conters

ATCCTAATCATCCACAGGAGACTTTCTG

Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 ou 2 caracterizado por a sequância guia estar •fundida ao codão de início da tradução do gene heterólogo.

— 4ã a ~

Processo de acordo com qualquer das reivindicações i a 3 caracterizado por o gene heterólogo codificar para o fragmento C da toxina do tétano, para a estremeiisina, para o antigénio superficial principal da coqueluche ou para a proteína integrase do HIV.

- 5ã. Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 4 caracterizado por o promotor ser o promotor da poliedrina.

Processo de acordo com qualquer das reivindicações í a 5 caracterizado por as células serem células de uma linha de células de Spodoptera fruqiperda.

- 7ã. -»

Processo de acordo com qualquer das reivindicaç&es 1 a 6 caracterizado por compreender adicionalmente o isolamento e a purificação da proteína obtida.

- 8â. Processo para a preparação de um baculovírus recombinante caracterizado por compreender:

(a) proporcionar um vector de transferências de baculovírus recombinante que possui um promotor com capacidade de dirigir a expressão de um gene em células infectadas com um baculovírus recombinante ligado de modo operacional a um gene heterólogo que é precedido por uma sequência guia que contém:

TAATCATCCACASGAGACTTTCTG; e (b) co—transfectar células susceptíveis à infecção por baculovírus com o vector de transferência de baculovírus recombinante e com ADN intacto de baculovírus de tipo sei vagem.

- 9â. Processo de acordo com a reivindicação B caracterizado por a sequência guia conter:

ATCCTAATCATCCACAGGABACTTTCTB.

- 10ã. Processo de acordo com qualquer das rsivindicações S ou 9 caracterizado por a sequência guia estar fundida ao codão de inicio da tradução do gene heterólogo.

- liã. Processo de acordo com qualquer das rei vindicações S a 10 caracterizado por o gene heterólogo codificar para o fragmento C da toxina do tétano, para a estromelisina, para o gene antigénio superficial principal da coqueluche ou para a proteína integrasse do HIV.

- 12ã. Processo de acordo com qualquer das reivindicações S a 11 caracterizado por o promotor ser o promotor da poliedrina.

- 13ã. Processo de acordo com qualquer das reivindicações Θ a 12 caracterizado por as células serem células de uma linha de células do insecto Spodoptera fruqiperda.

- 14ã. Processo para a preparação de um vector de transferência de baculovírus recombinante caracterizado por compreender a clonagem de uma sequência de ADN constituída essencial mente por um gene precedido por uma sequência guia que contéms

TAATCATCCACAGGA GACTTTCTG.

15â.

Processo de acordo com a rei vindicação

14 caracterizado por a sequência guia conter:

ATCCTAATCATCCACAGGAGACTTTCTG.

- 16*. Processo de acordo com qualquer das reivindicaç&es 14 ou 15 caracterizado por a sequência guia estar fundida ao codão de início da tradução do gene heterólogo.

- 17ã. Processa de acordo com qualquer das rei vi ndi caçífes 14 a ló caracterizado por o gene heterólogo codificar para o fragmento C da toxina do tétano, para a estromelisina, para o antigénio superficial principal da coqueluche ou para a proteína integrase do HIV.

- 13*. Processo de acordo com a reivindicação 14 caracterizado por o vector de transferência ser o vector p AujóC.

- 19*. Processa de acordo com a reivindicação 14 caracterizado por o vector de transferência de baculovírus obtido conter:

(i) um local de restrição no qual o gene estranho pode ser clonada a jusante da extremidade Nterminal do gene de poliedrina;

(ii) um outro tripleto de nucleótidos no lugar do codão de início de tradução natural ATG do gene da poliedrina;

(iii) desde as primeiras 24 até às primeiras 50 bases do gene da poliedrina; e (iv) a jusante de (iii) mas antes de (iv), uma sequência guia que contém:

TAATCATCCACASSASACTTTCTS.

- 20â. Processo para a preparação de um vector de transferência de baculovírus caracterizado por compreender a clonagem de um gene heterólogo no local de restrição (i) de um vector de transferéncia de baculovírus obtida de acordo com a reivindicação 19.

A requerente reivindica a prioriedade do pedido de patente britânico apresentado em 24 de