PT1253201E - Mutantes e vacinas do virus da anemia da galinha e utilizações à base de proteínas virais, pv1, pv2 e pv3 ou das sequências deste vírus que asseguram a sua codificação - Google Patents
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Description
DESCRIÇÃO
MUTANTES Ξ VACINAS DO VÍRUS DA ANEMIA DA GALINHA E UTILIZAÇÕES À BASE DE PROTEÍNAS VIRAIS PVl, PV2 E PV3 OU DAS SEQUÊNCIAS DESTE VÍRUS QUE ASSEGURAM A
SUA CODIFICAÇÃO A presente invenção tem por objecto novas proteínas e/ou polipéptidos do vírus da anemia da galinha. Além disso,, tem por objecto vacinas e composições para a prevenção ou o tratamento das infecções a vírus em aves de capoeira, em particular infecções com o vírus da anemia da galinha (VAG).
Em particular, a presente invenção tem por objecto vacinas que são menos patogénicas do que o próprio VAG mas que mesmo assim levam à geração de anticorpos de neutralização no animal imunizado.
Além disso, a presente invenção tem por objecto composições contendo os anticorpos contra partes de VAG para o controlo das infecções por VAG. Igualmente, são objecto da presente invenção anticorpos anti-iodiotipo que possuem uma imunidade correspondente ao antigene. A presente invenção também tem por objecto anticorpos para a detecção ou o controlo de infecções por VAG. Também tem por objecto kits para a detecção de VAG. A presente invenção tem ainda por objectivo moléculas de ADN recombinante derivadas de VAG, que codificam para pelo menos uma parte imunogénica de uma proteína de VAG e as células hospedeiras infectadas com essas moléculas de 3 ADN recombinante. As vacinas à base destas células hospedeiras tornaram-se possíveis por meio desta invenção.
Também são objecto da presente invenção as chamadas vacinas de vírus vivos em que uma parte da codificação de ADN para pelo menos uma parte imunogénica de uma proteína de VAG é levada a um vírus infeccioso no hospedeiro desejado.
Processos para a profilaxia ou o controlo das infecções por VAG, em particular em galinhas e processos para a preparação de partes recombinantes de VAG compreendendo sequências e processos para a preparação de vacinas, que são também objecto da presente invenção.
Além disso, a presente invenção tem por objecto as utilizações das proteínas da VAG na indução de apoptose (morte programada das células). Em particular, as proteínas (poplipéptidos) podem ser utilizadas na indução de apoptose em células de tumores.
Além disso, as proteínas de acordo com a presente invenção podem ser utilizadas na eliminação de outras populações de células indesejadas, tais como células T reactivas auto-imunes, em doenças auto-imunes tais como artrite reumatóide, lúpus, etc. A presente invenção tem ainda por objecto a indução de morte de células por meio da terapia dos genes. São. também objecto da presente invenção processos para a preparação destas terapêuticas e processos para os tratamentos que as utilizam. 4 0 vírus da anemia das galinhas (VAG) é um vírus de ADN recentemente caracterizado (Noteborn e De Boer, 1990). Pertence a uma nova família de vírus. Nos frangos a VAG causa anemia por destruição das células percursoras de eritroblas-tóides e imunodeficiência por depleção dos timócitos. Ocorrem lesões no baço e fígado (Jeurissen e outros, 1989). Um estudo recente mostrou que a diminuição de timócitos é causada por via da apoptose induzida por VAG (Jeurissen e outros, 1992b).
Gelderblom e outros (1989) e Todd e outros (1990) mostraram, por meio de estudos com o microscópio electrónico, que as partículas de VAG têm uma simetria do icosaedro T3 e um diâmetro de 23-25 nm. As partículas de VAG concentram depois da sedimentação no equilíbrio a uma densidade de 1,33-1,34 g/mL em CsCl.
Todd e outros (1990) mostraram que as partículas isoladas de vírus contêm só uma proteína com um peso molecular de 50 kDa. O ADN de hélice simples (estrutura helicoidal) nas partículas de VAG está sob a forma de; uma hélice menos circular (Gelderblom e outros; Todd e outros, 1990; Noteborn e outros, 1991). O intermediário de ADN replica-tivo foi clonado e sequenciado completamente. O genoma do VAG tem um comprimento de 2319 nucleótidos. Com base na estrutura do genoma e na sequência de ADN, o vírus não pode ser colocado em nenhuma das famílias conhecidas de vírus (Noteborn e outros, 1991; Todd e outros, 1991). O genoma de VAG contém três quadros de leitura, grandes, parcialmente ou completamente sobrepostos codificando para as proteínas possíveis com pesos moleculares de 51,6, 24,0 e 13,3 kDa. O genoma de VAG contém, além disso, uma região evidente promotora/melhoradora e só um sinal de poliadenilação. A transcrição do intermediário do ADN replicativo produz uma 5 molécula de RNA policistrónica poliadenilada de aproxima-damente 2100 nucleótidos (Noteborn e outros, 1992b).
Os pintos do dia são os mais susceptiveis às infecções por VAG. Nestes animais observa-se letargia, anorexia e anemia a partir dos 10 dias depois da inoculação com VAG. Depois da infecção a mortalidade pode aumentar até a um máximo de 50 %. Com o aumento da idade, a resistência também aumenta. Jerussien e outros (1992) relataram que só os valores de hematócrito dos pintos, que tinham sido infectados com VAG com 1-3 dias de idade, tinham diminuído. As infecções com VAG de pintos com 1-21 dias resultaram numa diminuição em particular no córtex do timo. Contudo, em frangos mais velhos o VAG pode-se multiplicar sub-clinicamente. A infecção por VAG em galinhas mais velhas pode ser determinada pela ocorrência da conversão do soro (Mcllroy e outros, 1992). A dispersão de VAG dentro de um grupo de galinhas ocorre principalmente por via da infecção por contacto. A mais provável é a ingestão de fezes ou de outro material contaminado com fezes dos animais infectados com VAG. Contudo, a infecção por via do ar não pode acontecer. A transmissão dos vírus à descendência por via do ovo é sugerida por Yuasa e outros (1979) mas a transmissão vertical de VAG dos animais mães para os frangos não foi demonstrada pelos requerentes por via experimental. A imunodeficiência resultante da depleção induzida por VAG do córtex do timo é considerada como sendo a causa dos sintomas da doença que ocorrem depois de infecções secundárias causadas por agentes normalmente não patogénicos (De Boer e outros, 1992; Engstrõm, 1988; Rosenberger e Cloud, 1989; von Biilow e outros, 1986; Yuasa e outros, 1980) . 6
Assim, isola-se VAG em animais com a doença de Newcastle, a doença de Mareie, a infecção de bursite (Gumboro) e em animais com a "doença da asa azul" em associação com reovírus. As infecções por VAG conduzem a reacções de inoculação aumentadas, por exemplo, contra o vírus da doença de Newcastle.
Verificou-se que os anticorpos maternos dão uma importante protecção. contra a infecção por VAG. Um recente estudo em condições laboratoriais mostrou que pintos de um dia com imunidade materna não desenvolvem infecções por' VAG. Os pintos do dia podem também ser protegidos passivamente por meio de uma injecção intravenosa de anticorpos de gemas de ovo dos animais mães imunes (De Boer e outros, datas.não publicadas). 0 VAG pode ser multiplicado em cultura de tecidos. Os títulos que se obtêm assim são em geral baixos. Presentemente utiliza-se para isso as células MDCC-MSBl (Yuasa, 1983; Yuasa e outros, 1983), em que o VAG induz um efeito citopatogénico 48-72 horas após a infecção. As células MDCC-MSBl também são utilizadas para determinar os anticorpos de neutralização e os anticorpos que se dirigem contra VAG,· por meio de imuno-fluorescência (Von BUlow e outros, 1985; Chettle e outros, 1991) . Até agora não foi possível atenuar a virulência de VAG por passagens em série de células de MDCC-MSBl.
Os animais mais velhos não' desenvolvem sintomas, da doença depois da infecção por VAG e os pintos com anticorpos maternos estão protegidos. Estes dados foram utilizados na Alemanha num programa de vacinação com base numa exposição controlada a VAG de animais mães com 14-16. semanas de idade. Na Holanda este método de vacinação não é 7 permitido excepto ao nível experimental por causa dos riscos dos participantes. Como se mencionou antes, é bastante possível que o VAG possa ser transmitido à descendência por via de um ovo fertilizado. McNutly e outros (1991) mostraram recentemente que os conjuntos de aves que são seropositivos ao VAG produzem números inferiores aos conjuntos de aves que são seronegativos para o VAG. Além disso, Adair (comunicação pessoal) demonstrou imunodeficiência em galinhas com uma infecção de VAG sub-clinica. A possível transmissão vertical do virus e a imunodeficiência causada por VAG com infecções sub-clinicas torna muito desejável um programa de controlo baseado numa vacina de inoculo.
Em geral, as vacinas inactivadas e as vacinas de sub-unidades são as vacinas mais seguras. 0 facto de, em condições de cultura de tecidos, o VAG multiplicar só títulos baixos torna a preparação de vacina inactivada relativamente cara e trabalhosa. Para a preparação de uma vacina de sub-unidades contra as infecções por VAG, são necessárias as proteínas de VAG que induzem uma resposta imunitária protectora nas galinhas vacinadas. Praticamente só foi encontrada uma proteína (chamada PV1, VP1 na terminologia inglesa) nas partículas de VAG purificadas.
Surpreendentemente, verificou-se agora que esta proteína única, como se mostrará nos exemplos mais à frente, não é capaz de dar uma resposta imunitária que proteja contra as infecções por VAG. Verificou-se que apesar do facto de a PVl parecer ser a única proteína presente na partícula de vírus, a proteína PV2, agora expressa pelos requerentes pela primeira vez, é essencial para gerar anticorpos que neutralizem o vírus. Por isso, só agora é 8 possivel desenvolver uma vacina eficaz com base em partes do virus.
Os requerentes clonaram os três quadros de leitura aberta no genoma da VAG em vectores de baculovirus. Expressaram-se as três proteínas PV1, PV2 e PV3 de VAG apenas em células de Sf9, em combinação com uma das outras proteínas de VAG ou as três em simultâneo por meio de uma infecção conjunta com baculovirus' de VAG recombinante. Injectaram-se os animais mães com lisados impuros de células que continham uma ou mais proteínas de VAG. Só depois da imunização das galinhas com , preparações de antigenes contendo quantidades proporcionais das três proteínas de VAG ou contendo principalmente PV1 e PV2 e também alguma PV3, se desenvolvem os anticorpos de neutralização. Os ovos desses animais continham anticorpos maternos contra VAG. Os ensaios da infecção com descendentes de animais mães vacinados mostraram que pelo menos as proteínas PV1 e PV2 de VAG são necessárias para a indução de uma resposta imunitária protectora. A descendência de animais mães injectados com as três proteínas de VAG tinha ainda maior protecção contra as infecções por VAG. A injecção ém galinhas das três proteínas de VAG que tinham sido individualmente produzidas em células Sf9 induziu poucos anticorpos de neutralização contra VAG. Isto implica que para uma indução óptima de anticorpos de neutralização contra VAG 2 ou VAG 3, as proteínas devem ser sintetizadas em conjunto numa célula (de insecto). É possível que fragmentos das proteínas de VAG 2 ou 3 sejam suficientes para uma reposta imunitária protectora eficaz contra a infecção por VAG. 9
Os produtos recombinantes de VAG, PV1 + PV2 ou PVl + PV2 + PV3, que serão utilizados para a vacinação de galinhas, podem ser sintetizados por meio do sistema do baculovirus. As proteínas de VAG podem também ser sintetizadas por meio de outros sistemas, tais como células bacterianas ou de levedura, por via de uma infecção retro (virai) ou de ampliação do gene (sistema OHC [ovário de hamster chinês]-dhfr). O facto de as proteínas 2 ou 3 codificadas pelos quadros de leitura aberta do genoma de VAG poderem induzir uma resposta imunitária protectora nas galinhas é também aplicável ao desenvolvimento de vectores de vírus vivos. As sequências de codificação para PVl + PV2 ou PVl + PV2 + PV3 são então clonadas em vectores de vírus vivos. É também possível que uma das proteínas de VAG, PVl, PV2 ou PV3, separadamente, mas dentro do contexto de um vector de vírus vivo, seja também apropriada para a indução de uma resposta imunitária protectora contra infecções de VAG. A expressão de fragmentos de uma ou mais das proteínas de VAG mencionadas antes por vectores de vírus vivos pode ser suficiente para a indução de uma resposta imunitária protectora.
Nas aves de capoeira, só se podem utilizar vectores de vírus vivos em que eles próprios exibam uma boa replicação no sistema das aves. Elegíveis para serem utilizados como vectores de vírus em galinhas são, entre outras coisas: poxvírus das aves, vectores retroviraís, vectores do vírus do herpes (vírus de Marek e vírus do herpes do peru), adenovírus e vírus da laringo-traqueia. Verificou-se ainda 10 que a indução da morte das células, quando induzida por VAG, pode praticamente ser atribuída a PV3 e parcialmente a PV2.
Eliminando os 11 aminoácidos do terminal C de PV3, a indução da apoptose por meio de PV3 fica fortemente reduzida. Em consequência, a actividade patogénica de VAG pode ser drasticamente reduzida por introdução de um codão de paragem na região do terminal C de PV3. Introduz-se um codão de paragem extra na região de codificação de PV3 no clone de VAG pVAG/EcoRI (Noteborn e De Boer) que contém o genoma completo de VAG. Corta-se o genoma completo do mutante de VAG do vector e recicla-se. Transfectam-se as células de MDCC-MSB1 com o ADN do mutante de VAG reciclado e colhem-se os vírus da descendência que são menos patogénicos. As galinhas são vacinadas com os vírus de mutantes de VAG atenuados. Dado que a proteína de PV2 também tem um efeito de indução da apoptose, é possível também preparar VAG atenuado que contenha uma mutação na região de codificação de PV2 ou PV2 e PV3. A introdução, mencionada antes, de um codão de paragem na região de codificação de PV2 e/ou de PV3 pode. também ser utilizada na produção . de vectores de vírus vivos, recombinantes de VAG.
Os animais infectados com VAG numa idade mais avançada não desenvolvem sintomas clínicos. Ao mesmo tempo parece que essas infecções podem levar a grandes perdas económicas para a indústria das aves. A imunização das aves com os produtos de VAG recombinante descritos antes conduzirá a uma protecção activa contra os sintomas sub-clínicos mencionados antes. 11
I
As três proteínas de VAG que foram expressas no sistema no sistema de baculovírus separadamente ou em combinação com uma ou duas proteínas de VAG podem ser utilizadas para anticorpos de rastreio dirigidos contra VAG. As galinhas infectadas ou vacinadas com VAG podem assim ser rastreadas. Pode-se utilizar uma ou mais proteínas de VAG em ensaios de imunidade, tal como o "ensaio de imuno-absorção ligado à enzima" (ELISA), ensaio de mancha de imuno-peroxidase e ensaio de imuno-fluores-cência. Para a medição dos anticorpos de neutralização são necessárias duas ou mais proteínas de VAG. A imunização de ratos com os 3 produtos recombinantes I de VAG sintetizados em células de insectos com baculovírus re-combinante de VAG produziu. finalmente anticorpos monoclonais específicos para PV2 e PV3. Estes monoclonais reagiram com estruturas específicas em células infectadas com VAG e não reagiram com células não infectadas.
I i
Por meio dos anticorpos gerados com proteínas de VAG recombinante, as proteínas de VAG podem ser rastreadas em preparações de órgãos de galinhas infectadas com VAG. Com base nestes dados, podem desenvolver-se ensaios de-diagnóstico fiáveis. Os anticorpos monoclonais e policlonais, de acordo com. a presente invenção, podem também ser utilizados em outros ensaios de diagnóstico tais como ÈLlSAs, RIAs, SPIAs, ensaios de imunofluorescência e ensaio de manchas de imunoperoxídase, eventualmente em conjunto com uma ou mais proteínas de VAG ou os seus fragmentos.
Em princípio, todos os enquadramentos conhecidos dos ensaios de diagnóstico imunológico são possíveis com todos os marcadores disponíveis e dependem do ensaio a ser realizado e das condições em que se realizam e uma pessoa 12 especializada na matéria será capaz de seleccionar o enquadramento mais apropriado. Além disso, para os fins da presente invenção, os anticorpos e/ou outras proteínas /polipéptidos são também derivados e/ou fragmentos, desde que possuam a actividade desejada. No caso dos anticorpos, isto significa que eles devem ser capazes de pelo menos reconhecer o antigene.
Os anticorpos de acordo com a presente invenção podem também ser utilizados para a imunização passiva de aves de capoeira. Contra os anticorpos de acordo com a presente invenção podem também ser gerados anticorpos que são chamados "imagem interna" do antigene e podem assim ser usados novamente tal qual, em particular nas imunizações passivas e em diagnósticos. 0 VAG induz a apoptose em timócitos infectados. É possível que uma infecção por VAG de tumores (humanos) também resulte na morte de células das células dos tumores.
In vitro a proteína de VAG PV3 é por si própria capaz de induzir apoptose em células de tumor mononulcear de galinhas e em diversas células de tumor humano. A expressão da proteína de VAG pode por isso ser utilizada para a indução da morte de células em tumores (em pessoas). A proteína PV3 pode ser (transientemente) expressa em tumores por meio da transfecção de ADN. A expressão de células de PV3 (em tumores) pode também ter lugar pela infecção das células com vectores (retro)virais que contêm uma sequência de codificação para PV3. A administração às células de componentes não virais (por exemplo lipossomas ou vectores derivados de transferrina) contendo proteínas PV3 e/ou sequências de codificação para 13 PV3, é ainda uma outra possibilidade para a ex-pressão/presença de PV3 em células (de tumor).
As utilizações mencionadas antes podem também servir para a indução possível da morte de células pela expressão em células (de tumor) de PV1 ou PV2 em conjunto com PV3.
As proteínas de VAG PV2 e/ou PV3 podem ser utilizadas em tratamentos para a redução da formação de tumores (humanos). Isto pode acontecer, por exemplo, por injecção das proteínas de acordo com a presente invenção directa-mente num tumor sólido ou acoplando as proteínas a um ligando com afinidade com um anti-ligando associado a um tumor. Este acoplamento pode efectuar-se tanto quimicamente como (no caso de o ligando também ser uma proteína) por via de tornar recombinante uma proteína de fusão. 0 acoplamento químico pode efectuar-se directamente ou por meio de um grupo espaçador. Eventualmente, pode-se se-leccionar uma molécula veicular inerte, tal como uma proteína de soro indiferenciada, à qual se liga tanto o ligando como a proteína virai, por via de um grupo espaçador ou não.
Exemplos de combinações de interacções ligando-anti-ligando frequentemente propostas são os pares ligando-re-ceptor, tais. como EGF/receptor, IL-2 (interleuci-na)/receptor, célula T/receptor, anticorpo/antigene do tumor, etc.. Dá-se preferência a uma combinação ligando-anti-ligando que pode ser internalizada pela célula. Quando se selecciona um conjugado, pode ser vantajoso aplicar um grupo instável intrínseco como um acoplamento entre a 14 proteina virai e o ligando, de tal modo que a proteína virai na célula volta à sua. forma original. Não é necessário, em todos os casos seleccionar uma combinação de internalização. As células de tumor são activas sob o ponto de vista metabólico e reterão activamente ou passivamente substâncias, isto é, também as proteínas de acordo com a presente invenção, por via de fagocitose e /ou pinocitose. 0 ligando ao qual a proteína de acordo com a presente invenção pode ser acoplada, de alguma forma, não necessita de ser um ligando completo. Em geral, será suficiente utilizar uma parte da ligação do anti-ligando. Também os derivados dos ligandos em questão serão úteis desde que possuam uma actividade de ligação do anti-ligando. No caso do ligando ser um anticorpo, tem que se considerar o facto de os anticorpos de uma origem diferente da do tipo que é administrado, conduzirem, na maioria dos casos, a uma resposta imunitária. Além disso, isto também se aplica a um certo número de outros ligandos de proteína.
Entretanto tornou-se suficientemente conhecido que os anticorpos podem ser manipulados de tal maneira que não geram uma resposta imunitária mas ainda reconhecem o antigene desejado.
Explica-se resumidamente aqui a seguir como é que os anticorpos de animais podem tornar-se apropriados para serem utilizados em pessoas (humanização), mas também é claro que também são possíveis adaptações de outro tipo.
Em primeiro lugar, é possível eliminar quimicamente a parte constante do anticorpo a ser humanizada, de modo a preparar FAB, FAB'2 ou fragmentos ainda mais pequenos (Winter e outros, 1990). Em geral, estes fragmentos serão, 15 pelo menos, menos imunogénicos. Esses fragmentos podem também ser preparados por meio da tecnologia do ADN recombi-nante.
Além disso, é possivel substituir as partes constantes dos anticorpos animais pelas suas contra-partes humanas por meio da tecnologia do ADN recombinante (Cabilly e outros, 1984; Boss e outros, 1984).
Além disso, é ainda possível inocular os domínios de ligação do antigene dos anticorpos dos animais em anticorpos de origem humana (Winter e outros, 1987).
Os antigenes de tumores conhecidos contra os quais se geraram os anticorpos são, por exemplo, ACE (antigene car-cino-embrionário) e similares. A presente invenção será explicada em.mais detalhe com base na parte experimental que se segue. Isto tem apenas um fim ilustrativo e não deve ser interpretado como uma limitação do objectivo de protecção.
PARTE EXPERIMENTAL
Baculovírus, células de insectos e células T de galinhas
Obteve-se o baculovírus recombinante pAcRP23-lacZ (Bishop 1992) do Dr. R. Possee, NERC Institute of Virology, Oxford, Reino Unido e purificou-se o ADN genómico como foi descrito por Summers e Smith (1987). Obtiveram-se células de Spodoptera frugiperda (Sf9) na American Tissue Culture Collection (n° CRL 1711). Os stocks de baculovírus cresceram em mono-camadas confluentes e culturas de suspensão 16 num meio TC 100 (Gibco/BRL) contendo soro de bovino fetal a 10 % como foi descrito por Summers e Smith (1987). A linha de células T MDCC-MSBl transformada com o virus da doença de Marek (Yuasa, 1983; Yuasa e outros, 1983) cresceu em meio de RPMI-1680 (Gibco/BRL) contendo soro de bovino fetal a 10 %; utilizaram-se as células para as experiências de infecção do ADN. EXEMPLO 1 ,
1.1 Clonaqem de ADN de VAG
Todas as sequências de ADN de VAG derivaram originalmente do ADN do plasmido plc-2 0H/VAG-EcoRI (Noteborn e De Boer, 1990) . Todas as etapas de clonagem com o ADN do plasmido foram realizadas de acordo com os métodos descritos por Maniatis e outros (1982).
As sequências de codificação das três proteínas de VAG PVl, PV2 e PV3 foram clonadas separadamente em vectores de transferência de baculovírus pAcYMl (Matsuura e outros, 1987), que se obteve do Dr. D. H. L. Bishop, NERC Institute of Virology, Oxford, Reino Unido. A sequência de codificação para a proteína de PV3 VAG e um mutante derivado dela foi clonada no vector de expressão pRSV-H20 (Offringe e outros).
As transformações de ADN realizaram-se na estirpe HB101 de E. coli. Todos os plasmidos se multiplicaram em grandes culturas, sob agitação, purificaram-se com gradientes de CsCl e depois foram filtrados em colunas de Sephacryl S-500. 17
1.2 Transfecçâo do ADN
Isolou-se o ADN do baculovírus recombinante AcRP23-lacZ de baculovírus extracelular de acordo com o processo descrito por Summers e Smith (1987). 0 gene lacZ contém um único sitio de corte para a enzima de restrição Bsu361. Linearizou-se o AcRP23-lacZ por digestão com Bsu361. As células de Sf9 foram transfectadas com precipitados de fosfato de cálcio do ADN do baculovírus linearizado AcRP23-lacZe e o ADN do vector recombinante de transferência de acordo com o processo de Smith e outros (1983); isto é uma adaptação do protocolo de transfecçâo de Graham e Van der Eb (1973) para células Sf9.
Para a transfecçâo das diversas linhas de células humanas e de galinha, fez-se uma suspensão de 10 microgramas de ADN de pRSV-PV3, pCMV-PV3, PRSV-tr ou pRSV-tr em 25 microlitros de água de Milli-Q e misturou-se com 2 60 microlitros de tampão de. TBS. Adicionou-se 15 microlitros de dextrano de DEAE a 10 mg/mL à mistura de ADN que se incubou durante 30 minutos à temperatura ambiente.
Centrifugaram-se as células a 1500 rpm numa mesa centrífuga. Substituiu-se o meio por 5 mL de tampão de TBS e, cuidadosamente, fez-se uma nova suspensão das células. Transformaram-se as células.em peletes e eliminou-se o tampão de TBS. Fez-se, cuidadosamente, uma nova suspensão dos peletes de células em 300 microlitros de uma mistura de dextrano de DEAE/ e ADN e incubou-se durante 30 minutos à temperatura ambiente. Adicionou-se 0,5 mL de DMSO /TBS a 25 % e incubou-se a suspensão durante 3 minutos à temperatura ambiente. Adicionou-se 5 mL de TBS e centrifugaram-se as células a 1500 rpm numa mesa de centrifugação. Eliminou-se o sobrenadante e adicionou-se 5 mLde meio de tecido. Fez- 18 se uma nova suspensão das células, centrifugou-se, recolheu-se em 5 mL de meio de cultura de tecidos e incubou-se a 37 °C - C02 a 6 %. 1.3 Selecção do baculovírus de VAG recombinante
Analisaram-se os sobrenadantes contendo baculovírus extracelular num ensaio de placa com vermelho neutro (Brown e FaulJcner, 1977) e X-gal (Brown e outros, 1991) . As placas negativas a lac-Z foram inoculadas numa monocamada de células Sf9 em pratos de microtitulação. Cinco dias depois da in-fecção recolheram-se os sobrenadantes e armazenaram-se a 4 °C. Analisaram-se os lisados das células num ensaio de hibridação de abertura pontual com ADN de plc-20H/VAG-EcoRi marcado com 32P como uma sonda.
Inocularam-se as mono-camadas de células Sf9 com sobrenadantes dos lisados das células que hibr.idaram fortemente com a sonda de ADN de VAG marcada. Dois dias após a infecção, marcaram-se as células com leucina 3H. Separaram-se as proteínas em géis de SDS de poliacrilamida (PAA) (Laemmli, 1970) , que se tornaram visíveis por meio de um processo de fluorografia e fez-se o ensaio para avaliar a presença de uma proteína de VAG recombinante especifica e a ausência de proteína de β-galactosidase.
1.4. Síntese das preparações de proteína impuras de VAG
Os baculovírus recombinantes do VAG que expressem a proteína esperada de VAG em células Sf9 infectadas foram colocados em pratos de acordo com o processo descrito por Summers e Smith (1983). Infectaram-se mono-camadas de células Sf9 com um tipo de baculovírus recombinante de VAG com uma multiplicidade de infecções (mole) de 19 aproximadamente 5 unidades de formação de placas (ufp) por célula. Realizaram-se co-infecções de 2 ou 3 baculovírus recombinantes de VAG diferentes em mono-camadas de células Sf9 com uma mole de 10 ufp de cada baculovírus recombinante de VAG por célula. Três dias após a infecção, recolheram-se as células de Sf9 infectadas. Fez-se uma suspensão dos lisados impuros de células em tampão de SBF (soro bovino fetal).
EXEMPLO II
2.1. Imunização de galinhas com proteínas específicas de VAG
Injectou-se intraperitonealmente e subcutaneamente grupos de galinhas com 6 semanas de idade com lisados impuros emulsionados em adjuvante de Freund completo à razão de 106 ou 108 células Sf9 que foram infectadas com um ou mais baculovírus recombinantes de VAG. Como controlo, injectou-se um grupo de 8 animais para uma experiência de imunização com tampão de SBF emulsionado em adjuvante de Freund completo. Em dias diferentes, após a imunização, recolheu-se sangue e analisou-se o soro para determinar os anticorpos neutralizados dirigidos contra VAG.
2.2 Imunização dos animais mães contra o VAG
Injectaram-se quatro grupos, de 16 galinhas cada um, com lisados impuros de 2 x 107 células de Sf9 que foram simul-taneamente infectadas com baculovírus recombinantes de PVl, PV2 e PV3; ou com PV1 e PV2; ou com PV1 e PV3; ou com bacu-lovírus recombinantes de PV2 e PV3. Emulsionaram-se estes lisados das células num volume igual de adjuvante de Freund completo. Como um grupo de controlo, injectaram- 20 se 16 galinhas com tampão SBF em adjuvante de Freund completo. Extraiu-se, no seio de clorofórmio, o material da gema dos ovos das galinhas· com estes lisados ou com tampão de SBF e analisou-se para detectar a presença de anticorpos de neutralização.
EXEMPLO III
3.1. Produção e caracterização de anticorpos monoclonais especificamente dirigidos contra proteínas de VAG
Obteve-se o anticorpo monoclonal CVl-VAG-85.1 por in-jecçào de ratos intraperitonealmente com células de MDCC-MSB1 injectadas em VAG com adjuvante de Freund incompleto. Final-mente, fundiram-se células do baço de ratos imunizados com células de mieloma P3X63-Ag8.653 {Noteborn e outros, 1991).
Os outros anticorpos monoclonais dirigidos contra os antigenes de VAG obtiveram-se por injecçâo de extractos impuros de células Sf9 infectados com os três baculovírus recombinantes de VAG no baço de 4 ratos BALB/c. Fez-se o ensaio do soro dos ratos imunizados 7 semanas depois da imunização para determinar os anticorpos de neutralização contra VAG. Fundiram-se as células do baço de ratos imunizados com células de mieloma P3X63-Ag8.653. Ensaiaram-se os anticorpos dirigidos contra os antigenes de VAG de diferentes formas: um ensaio de neutralização do soro; ELISAs baseados em VAG purificado e lisados impuros de células SF9 infectadas com baculovírus recombinante de VAG; ensaios de imunofluorescência em MBCC-MSB1 infectadas por VAG ou em células Sf9 infectadas com baculovírus recombinante de VAG; ensaio das manchas (Western blot) dos lisados impuros de células Sf9 infectadas com· baculovírus 21 recombínante de VAG e coloração com imunoperoxidase nos cortes do timo de galinhas infectadas com VAG.
EXEMPLO IV 4.1. Ensaio de neutralização in vitro
Diluiu-se o soro das galinhas e ratos injectados com lisados de células Sf9 ou diluiram-se em tampão de SBF a 1:2 ou 1:4 e depois fez-se uma série de diluições de duas vezes. Incubaram-;se os soros diluídos durante 1 hora com 104 -105 de TCID50 VAG-Cux-1 (Von Bulow e outros, 1983; Von Biilow, 1985) . Aproximadamente 100 mil células da linha de células T MDCC-MSB1 transformadas pelo vírus da doença de Marek foram infectadas com esta mistura de soro diluído e vírus. Como controlos, infectaram-se as células MDCC-MSBl com VAG que se neutralizou com um anti-soro de VAG positivo e um anti-soro negativo originário de galinhas isentas de agentes patogénicos específicas.
4.2 Experiências de reforço de VAG Pôs-se a chocar ovos fertilizados de cinco grupos de galinhas imunizadas. Injectaram-se intramuscularmente os pintos, no Io dia, com 105'5 TCID50 VAG-Cux-1. No 6o e no 14° dias após a infecção, 5 galinhas em cada grupo foram submetidas a cortes. Analisou-se o timo do ponto de vista macroscópico e imuno-histológicamente. Também se retirou a heparina do sangue e fez-se o ensaio das células do sangue num ensaio de re-isolamento do vírus. Catorze dias depois da infecção colheu-se a heparina do sangue de todos os animais para determinar o hematócrito. 22 EXEMPLO V 5.1. Imuno-histoloqia e imuno-fluorescência
Fizeram-se cortes do timo e da medula dos ossos enquanto congelados e utilizaram-se para o ensaio da mancha da imunoperoxidase com anticorpos monoclonais específicos de VAG, tal como foi descrito por Jeurissen e outros (1988).
Fixaram-se as células com acetona a 80 % e utilizaram-se para os ensaios de imunofluorescência com anticorpos mono-clonais específicos de VAG e conjugado com IgC anti-rato de cabra com isotiocianato de fluoresceína (Noteborn e outros, 1990). 5.2. Detecção de VAG nas amostras de sangue
Lavaram-se três vezes com SBF as amostras de sangue de pintos infectados com VAG e recolheram-se para 1 mL. Adicio-nou-se. vinte microlitros da suspensão, de células obtida a 105 células de MDCC-MSBl. Diluiu-se 10 vezes as células de MDCC-MSBl em cada 4-5 dias, transferiram-se para um meio de cultura fresco, até que o efeito citopatogénico específico do VAG se tornasse visível. Se. depois de 10 passagens não se observar ainda nenhum efeito citopatogénico, então considera -se que o isolamento do vírus foi negativo. 0 número de vezes das passagens é uma medida da quantidade de VAG infeccioso presente no sangue dos pintos infectados. 23
Resultados e discussão
Construção de vectores recombinantes de transferência de VAG 0 genoma do VAG contém três grandes quadros de leitura aberta que se sobrepõem parcialmente ou totalmente uns aos outros. Utilizando codões iniciais em diferentes quadros de leitura, o genoma do VAG codifica para três proteínas únicas. As sequências de codificação para as proteínas de VAG foram clonadas separadamente (PV1, fig. 1; PV2, fig. 2; e PV3, fig. 3) em vectores de transferência do baculovírus pAcYMl. Como o quadro de leitura'de PV3 cai completamente dentro do quadro de leitura de PV2, PV3, no caso da expressão de PV2, é sempre sintetizada também, embora num grau claramente menor. 0 vector de transferência pAcYMl perde as sequências de codificação para a poli-hedrina, o promotor de pol.i-hedrina contém, inclusivamente, o resíduo A do codão inicial para o gene de poli-hedrina e as sequências que não codificam 3', incluindo o sinal de poliadenilação. Ambos os lados da sequência de poli-hedrina são flanqueados por sequências virais. . O vector de transferência contém sequências de porcarioto para a multiplicação em bactérias (Matsuura e outros, 1987).
0 plasmido.pEP-51,6 (Noteborn e outros, 1992a) contém sequências de ADN de VAG das posições 791 a 2319. A inserção do ADN de VAG contém a região de codificação completa para a proteína PV1 flanqueada por 62 bp 5' - sequências de ADN não codificando em 3' de 117 bp.; 0 plasmido pEP-51,6 foi parcialmente cortado com HindIII e depois completamente cortado com EcoRI e as "extremidades pegajosas" foram cheias por meio de polimerase de Klenòw. Isolou-se um fragmento de ADN de VAG de 1,53 kb. 24
Linearizou-se o plasmido pAcYMl com BamHI, as "extremidades pegajosas" foram cheias por meio de polimerase de Klenow e finalmente tratou-se com fosfatase alcalina (CIP). Ligou-se o fragmento de ADN de VAG 1,53 kb no ADN de pAcYMl linearizado. Determinou-se a orientação de PVl no ADN de pAcYMl por análise de restrição enzimática e a construção final dé PacPVl está ilustrada na fig. 4. 0 plasmido pEP-24.0 (Noteborn e outros, datas não publicadas') contém o fragmento de ADN 1,15 kb BamHI com as sequências de ADN de VAG nas posições 354 a 1508 {Noteborn e De Boer, 1990) . Este fragmento de ADN de VAG contém a região de codificação para a proteína PV2 flanqueada pelas sequências de ADN não codificando em 5' de 26 bp e as sequências de ADN não codificando em 3' de 484 bp. 106 bp a jusante do codão inicial para a PV2 . encontra-se o codão inicial para PV3 noutro quadro, de leitura e a outra sequência de codificação para PV3. Tratou-se o plasmido pEP-24,0 com BamHI; isolou-se o fragmento· de ADN de 1,15 kb e ligou-se a BamHI linearizado e ao plasmido pAcYMl de 9,3 kb tratado com CIP. A estrutura final do ADN dé pAcPV2 foi caracterizada com enzimas de restrição e está ilustrada na fig. 4.
O plasmido pEP-13.3 (Noteborn e outros., datas não publicadas) contém o fragmento de ADN BamHI-EcoRI de 0,46 kb com as sequências de ADN de VAG das posições 427 a 868 (Noteborn e De Boer, 1990) . .0 fragmento de ADN de VAG contém a região de codificação para PV3, as sequências de ADN de 58 bp e 25 bp não codificando em 5'- e 3'-respectivamente. Cortou-se o plasmido pEP-13.3 com as enzimas de restrição BamHI e EcoRI e isolou-se um fragmento de BamHI-EcoRI de 0,4 6 kb. O ADN de pAcYMl. do vector de transferência foi lineari-zado com BamHI e tratado com CIP 25 e isolou-se um fragmento de 9,3 kb. Os dois oligómeros de ADN sintético 5'-GATCCAACCCGGGTTG-3' e 5'-AATTCAACCCGGGTTG-3' hibridaram um com o outro e, em conjunto, formaram um ligante de ADN de BamHI-EcoRI. 0 ligante de ADN. foi ligado ao BamHI-EcoRI de 0,46 e ao fragmento de ADN BamHI de 9,3 kb. A estrutura final de pAc-PV3 foi analisada por digestão da enzima de restrição e está ilustrada na fig. 4.
Preparação do baculovirus recombinante de VAG
Cada um dos três vectores recombinantes de transferência de VAG foi transfectado separadamente, em conjunto com o ADN do baculovirus recombinante AcRP23-lacZ, nas células Sf9. A infecção ocorreu com o ADN do baculovirus "desprotegido" e o ADN do vector de transferência. Este genoma do baculovirus contém, em vez do gene de poli-hedrina, o gene lacZ, -sob a regulação do promotor da poli-hedrina. Obtiveram-se assim depois baculovirus de recombinação homóloga que incorporaram sempre um dos três genes de VAG em vez do gene lacZ e ainda sob a regulação do promotor dó gene de poli-hedrina. Os baculovirus que incorporaram normalmente o gene de VAG já não tinham Ό gene lacZ. No primeiro exemplo, os vírus recombinantes· de VAG foram caracterizados pela ausência de actividade da β-galactosidase nas placas de células de insectos infectadas com baculovirus. Determinou-se ainda a integração das sequências de ADN de VAG no genoma dos baculovirus por meio de uma sonda de ADN específica de VAG numa experiência de hibridação.
Expressão das proteínas· de VAG em células de Sf9
Analisou-se a expressão das proteínas de VAG específicas em- células Sf9 infectadas com VAG recombinante, por 26 meio de marcaçao da proteína com leucina 3H e electroforese em gel de PAA-SDS. A proteína PV1 de VAG tinha um peso molecular calculado de 51,6 kDa (Noteborn e De Boer, 1990). Os lisados das células de insectos infectadas com o baculovírus recombinante de PVl contêm uma proteína de 52 kDa para além dos produtos de baculovírus e dos produtos celulares. A proteína de 52 kDa estava ausente nos lisados das células de insectos infectadas com o baculovírus' AcRP23-lacZ e nas células não infectadas. A expressão in vitro da sequência de codificação de PV1 teve como resultado uma proteína de 52 kDa {Noteborn e De Boer, 1992) . O mais provável é que a PV1 não seja glicosada porque a PVl que é sintetizada num lisado de reticulócito de coelho e a PVl que é sintetizada em células de insectos têm o mesmo peso molecular. A tradução do gene que codifica para PV2, mas que também contém todas as sequências de codificação para PV3, produzidas num sistema in vitro de proteínas de VAG específico, de 30 e 28 kDa e uma quantidade menor de um produto de proteína de 16 kDa. A tradução de apenas um quadro de leitura aberta para PV3 num sistema in vitro, contudo, produziu apenas uma proteína de 16 kDa. A expressão de PV2 pelo baculovírus recombinante de PV2 em células de insectos infectadas produziu produtos específicos de aproximadamente 28 kDa e de 30 kDa. As células Sf9 infectadas com um baculovírus recombinante lacZ não contêm estas proteínas específicas de VAG. O produto específico de VAG de 16 kDa poderia ser demonstrado principalmente e apenas em quantidades muito pequenas. Estes dados mostram que o baculovírus recombinante de PV2 expressa fortemente a proteína PV2 e expressa a PV3 mas em menor grau. Uma 27 possível explicação para isto é que um codão inicial interno num gene presente no genoma do baculovírus é utilizado de uma forma muito ineficiente. 0 baculovírus recombinante de PV3 sintetizado nas célu-las de insectos infectadas, um produto principal de 16 kDa e pequenas quantidades de algumas proteínas com pesos molecula-res de aproximadamente 21.000 e 12.000-14.000. Num ensaio de imuno-fluorescência, o anticorpo monoclonal específico de VAG CVI-VAG-85.1 reagiu especificamente com as células Sf9 que expressam PV3. Este anticorpo monoclonal precipitou especificamente apenas uma proteína com um peso molecular de 16.000 a partir dos lisados de células Sf9 marcadas radioactivamente, infectadas com o baculovírus recombinante de PV3. Por meio de uma análise de varrimento de péptidos (Geysen e outros, 1984), localizou-se o epítopo do anticorpo monoclonal CVI-VAG-85.1, no terminal N de PV3. A análise de varrimento dos péptidos está ilustrada na fig. 5.
Indução de anticorpos de neutralização em galinhas imunizadas com proteínas de VAG recombinante
No caso da anemia das galinhas determinou-se que os anticorpos de neutralização estão correctamente correlacionados com a protecçâo. A proteína de VAG ou várias proteínas de VAG que induzem anticorpos de neutralização nas galinhas formam assim a base de uma sqbunidade de. vacina.
Numa, primeira instância verificou-se que a proteína de VAG era capaz de induzir anticorpos contra a neutralização de VAG em galinhas. Injectaram-se grupos de 8 galinhas, com a idade aproximada de 6 semanas, com lisados de 106 ou 10a 28 células Sf9 infectadas com VAG recombinante, emulsionados em adjuvante de Freund completo. Como controlo, injectou-se um grupo de 8 galinhas com tampão de SBF emulsionado em adjuvante de Freund completo. Antes da imunização e 2, 4 e 6 semanas depois da imunização, colheram-se amostras de sangue. Nenhum dos animais de controlo injectados com SBF em adjuvante de Freund completo desenvolveu anticorpos contra VAG (quadro 1) . Também as galinhas injectadas com lisados de 106 ou 108 células Sf9 infectadas com baculovírus recombinante de PV2 ou dé PV3 não desenvolveram anticorpos de neutralização contra VAG. Das galinhas injectadas com lisado de 106 células de insectos infectadas com baculovírus recombinante de PVl, três dessas galinhas e das galinhas injectadas com uma dose de 10® células infectadas, duas galinhas desenvolveram baixos títulos variando entre 1:8 e 1:32.
Os requerentes concluíram, que as três proteínas recombinantes de VAG, se injectadas separadamente nas galinhas, não induzem ou induzem apenas muito ligeiramente anticorpos de neutralização contra VAG.
Em consequência, os requerentes estudaram se a combinação das três proteínas de VAG recombinante seria capaz de induzir anticorpos de neutralização nas galinhas. Com este fim, infectaram-se células Sf9 simultaneamente com os três baculovírus recombinante de VAG. Prepararam-se lisados impuros de 106 ou 108 das células infectadas, que assim continham PVl + PV2 + PV3 recombinante. Injectaram-se grupos de oito galinhas com idades entre 6-8 semanas com estes lisados emulsionados em adjuvante de Freund completo. Como controlo, injectou-se um grupo de 8 galinhas com tampão de SBF emulsionado em adjuvante dé Freund completo. Cinco semanas depois da imunização, verificou-se que as 29 oito galinhas imunizadas com lisado de 106 células infectadas todas tinham títulos de neutralização entre 32 e 256, enquanto sete dos oito animais imunizados com 108 células tinham títulos entre 16 e 512 (quadro 2a) . Sete semanas depois da imunização, verificou-se que todos os animais de ambos os grupos tinham desenvolvido um título de neutralização contra VAG. Verificou-se que o grupo das galinhas injectadas com tampão de SBF não tinha desenvolvido uma resposta imunitária demonstrável de neutralização. É realmente necessário, para a indução dos anticorpos de neutralização contra VAG, que as três proteínas de VAG sejam sintetizadas simultaneamente em células de insectos? Para responder a esta questão, infectaram-se as células Sf9 sepa-radamente com baculovírus recombinante de PV1, PV2 e PV3. Depois, combinaram-se os lisados impuros de células, misturaram-se com adjuvante de Freund e injectou-se num grupo de 8 galinhas. Como controlo, utilizaram-se preparações de um lisado impuro de células Sf9 que sintetizaram as 3 proteínas de VAG simultaneamente e utilizou-se tampão de SBF. Emulsionaram-se ambas as preparações em adjuvante de Freund completo e depois injectaram-se em grupos separados de 8 galinhas cada um.
Verificou-se que o soro do grupo das galinhas injectadas com os lisados impuros de células Sf9 em que as 3 proteínas de VAG tinham sido sintetizadas separadamente não continha ou só continha muito poucos anticorpos de neutralização contra VAG. Contudo, verificou-se que os animais do grupo de controlo injectados com lisados impuros de células Sf9 que sintetizaram em conjunto as 3 proteínas de VAG, tal como se esperava, desenvolveram uma resposta 30 imunitária de neutralização. Verificou-se que os animais injectados com tampão de SBF eram negativos (quadro 2b).
Anticorpos de neutralização em ovos de animais mãe imunizados
As experiências de imunização anteriores mostraram que as 3 proteínas recombinantes de VAG expressas em conjunto em células Sf9, induziram anticorpos de neutralização contra VAG. Numa experiência seguinte, verificou-se se as combinações de 2 proteínas de VAG eram também · capazes de induzir anticorpos de neutralização. Mediram-se então os anti-corpos nas gemas dos ovos dos animais mães imunizadas.
Injectaram-se quatro grupos de 16 galinhas com a idade de 33 semanas com o lisado impuro de células Sf9 que tinham sido infectadas simultaneamente com diferentes combinações de baculovírus recombínante de VAG. As preparações contendo quer PV1 + PV2 + PV3 quer PV1 + PV2 induziram, na maioria dos ani-mais, anticorpos de neutralização claramente demonstráveis nos seus ovos (quadro 3). Verificou-se que os ovos de galinhas injectadas com preparações contendo quer PV1 + PV3 quer PV2 + PV3 não tinham um título claro de anticorpos de neutralização nas suas gemas. Só as gemas de ovos de uma das galinhas examinadas mostraram conter títulos baixos de anti-corpos de neutralização. Verificou-se que os ovos do grupo de controlo das 16 galinhas injectadas com tampão de SBF não continham anticorpos de neutralização.
Os dados das experiências referidas antes com proteínas recombinantes de VAG mostram que PV1 + PV2 em conjunto é necessário e suficiente para a indução de anticorpos de neutralização contra as infecções de VAG. 31
Contudo, uma quantidade menor de PV3 nas preparações de PV1 + PV2 não pode ser desprezada.
Protecção contra o reforço de VAG na descendência de galinhas imunizadas
Os anticorpos maternos protegem os pintos jovens contra sintomas clínicos causados por uma infecção provocada pelo VAG. Os requerentes estudaram quais os grupos de galinhas imunizadas com proteínas recombinantes específicas de VAG- protegiam a descendência contra o reforço de VAG. Aqui isolou-se o vírus e observaram-se os sintomas clínicos característicos do VAG: atrofia do timo, diminuição do-.hematócrito e aumento da mortalidade.
Grupos de galinhas com entre 23 e 35 dias de idade foram reforçados com uma dose elevada de VAG. Seis dias após a infecção, submeteram-se 5 animais a seccionamento e com as mães injectadas com tampão de SBF, verificou-se que tinham um timo visivelmente reduzido macroscopicamente. No caso da descendência de mães injectadas com PV1 + PV3 recombinante, 4 dos 5 animais tinham um timo pequeno. Contudo, nos 5 descendentes, submetidos a seccionamento, de mães injectadas com as 3 proteínas recombinantes de VAG em conjunto, veri-ficou-se que todos tinham um timo normal. No grupo dos descendentes de mães tratadas com PV1 + PV2, só 1 dos 5 animais examinados tinha um timo reduzido (quadro 4). Catorze dias depois da infecção, submeteram-se novamente a secção 5 animais por grupo. Todos os descendentes de mães imunizadas com PV2 + PV3 recombinantes ou tampão de SBF sofreram de atrofia do timo. Verificou-se que os animais do grupo injectado com as 3 proteínas recombinantes de'.VAG em conjunto tinham timos normais. Só 1 dos 5 pintos examinados dos animais injectados com PV1 + PV2 recombinante tinha o 32 timo reduzido (quadro 4) . Uma experiência independente mostrou que os pintos de mães injectadas com PV1 e PV3 recombinante tinham timos reduzidos, tal como descrito para os animais nascidos de mães injectadas com PV2 e PV3 recombinante (Koch, resultados não publicados). Catorze dias depois da infecção determinou-se o hematócrito de todos os descendentes infectados com VAG. Seleccionou-se um hematócrito de 27 % como o limite para a anemia. Verificou-se que a descendência de mães injectadas com tampão de SBF tinha um hematócrito fortemente reduzido, com valores variando, entre 7 e 19 % (quadro 5). Os descendentes de mães injectadas com PV2 + PV3 recombinantes tinham, em média, um hematócrito ligeiramente mais elevado. Nestes grupos só um animal tinha um hematócrito mais elevado do que 27. Uma experiência independente mostrou que toda a descendência de mães animais injectadas com PV1 e PV3 recombinantes têm um hematócrito reduzido (Koch, resultados não publicados). Dos 35 descendentes examinados dos animais injectados com preparações contendo PV1, PV2 e PV3, só um animal tinha um hematócrito desviado, em que no grupo de PV1 + PV2, 2 dos 29 animais examinados tinham um hematócrito abaixo de 27 %.
Observou-se uma elevada mortalidade com descendentes de animais mães injectados com PV2 e PV3 recombinante, 50,9 % e cóm SBF 4 8,3 %. No grupo de descendentes de animais mães in-jectados com PVl + PV2 + PV3 recombinante a mortalidade é de 9 % e com PVl + PV2 é de 15,4 %. Contudo, a maior parte dos animais morreram no prazo de 5 dias após a injecção. A mortalidade causada por uma infecção por VAG é geralmente mais tardia. Por esta razão, distinguiu-se no quadro 6 entre mortalidade antes do dia 14 e depois do reforço do dia 14. A mortalidade antes do dia 14 é muitas vezes especifica, inter alia como um resultado da injecção. A mortalidade depois do dia 14 é, no grupo de animais com 33 anticorpos maternos contra PVl + PV2 + PV3 de 7%; contra PV1 + PV2 de 0 %, PV2 + PV3.de 27,4 % e no grupo de controlo de 20,7 %. No grupo de PV2 + PV3 8 animais morreram depois de se retirarem amostras de sangue para a determinação do hematócrito como resultado de condições de enfraquecimento dos pintos, muito provavelmente causadas por anemia. No grupo do SBF morreram 2 animais durante a recolha de sangue. Todos estes animais tinham um timo claramente reduzido.
Examinou-se a virémia na descendência infectada com o VAG fazendo um isolamento dos virus nas células sanguíneas. Recolheram-se amostras de sangue para avaliar a heparina de 5 animais por cada grupo nos dias 6 e 14 após o reforço. Verificou-se que os descendentes de animais mães injectados com PV2 + PV3 ou SBF, que praticamente não tinham protecção contra infecções por VAG, continham títulos relativamente elevados de vírus 6 e 14 dias após a infecção. Seis dias após a infecção, verificou-se que os descendentes dos animais injectados com PVl + PV2 + PV3 ou PVl + PV2 continham um título de vírus claramente inferior ao da descendência mencionada antes. Catorze dias depois da infecção, só o grupo de descendentes de animais injectados com PVl + PV2 + PV3 tinham um título de vírus claramente inferior aos dos outros 3 grupos.
Os resultados da indução de anticorpos de neutralização em animais mãe mostram que as proteínas recombinantes de VAG PVl e PV2 são muito importantes para a indução de uma resposta imunitária de neutralização. As experiências de infecção mostram que a proteína recombinante PV3 de VAG dá uma protecção suplementar para além do efeito obtido por PVl + PV2. 34
Produção e caracterização de anticorpos monoclonais contra VAG
Para a produção de anticorpos monoclonais contra VAG, injectaram-se ratos com lisados impuros de células Sf9 co-infectados com baculovírus recombinante de PVl, PV2 e PV3. No total, obtiveram-se 9 linhas de células de hibridoma dife-rentes produzindo anticorpos monoclonais contra antigenes de VAG.
Análises de manchas (Western blots) com antigenes de VAG produzidas com o sistema de expressão de baculovírus mostraram que os anticorpos monoclonais 111.1, 111.2, 111.4, 112.1, 112.2, 120.1 e 120.2 são fortemente dirigidos contra PV2 e os anticorpos monoclonais 111.3 e 120.3 fortemente contra PV3. Os anticorpos monoclonais que reagem fortemente contra PV2 mostram toda uma fraca reacção cruzada com PV3. Inversamente, os anticorpos monoclonais dirigidos contra PV3 mostram uma fraca reacção cruzada com PV2.
Um ensaio de neutralização do soro mostrou que nenhum dos anticorpos monoclonais obtidos tinha uma actividade de neutralização contra VAG, a despeito do facto de o soro do rato imunizado para a preparação de hibridomas ter uma actividade de neutralização contra VAG.
Numa análise de detecçâo de péptidos (Geysen e outros, 1984), o epítopo do anticorpo monclonal 111.2 foi localizado no meio de. PV2 (fig. 6) . Verificou-se que o anticorpo monoclonal 111.3 se dirigia contra um epítopo na extremidade terminal N de PV3 (fig. 7), nomeadamente ao lado do epítopo de PV3 reconhecido pelos anticorpos monoclonais CVI-VAG-85.1 (fig. 5). 35 A imunofluorescência mostrou que os anticorpos monoclonais dirigidos contra PV2 e PV3 reconhecem estruturas especificas nas células MDCC-MSB1 infectadas com VAG. Nenhum dos anticorpos monoclonais dirigidos contra os antigenes de VAG reagiu com células de MDCC-MSBl não infectadas. Os anti-corpos monoclonais específicos de PV2 reconheceram outras estruturas para além dos anticorpos monoclonais específicos de PV3 em células infectadas com VAG. A expressão de PV3 em células de galinha induz apoptose
Jeurissen e outros mostraram que o VAG causa apoptose em tímócitos infectados. Os requerentes estudaram se uma das proteínas de VAG, em particular PV3, é capaz de induzir, independentemente, apoptose em células T de galinhas.
As sequências de codificação para PV3 foram clonadas no vector de expressão pRSV-20H. 0 fragmento de BamHI-EcoRI de 0,46 kb com sequências de ADN de VAG das posições 427-868 (Noteborn e outros, 1991) foi isolado do plasmido pEP-13.3. O fragmento de ADN de VAG contém as sequências de codificação de PV3 e, além disso as sequências de flanqueio 5r de 58 bp e 3' de 25 bp. O. vector pRSV-H20 foi linearizado com BglII, tratado com CIP e isolou-se um fragmento de 4,3 kb. Hibri-daram-se dois oligómeros sintéticos de ADN 5' -GATCCAACCCGGGTTG-3' e 5'-AATTCAACCCGGGTTG-3' e assim formaram um ligante de BamHI-EcoRI de hélice dupla. O ligante de ADN de BamHI-EcoRI e o fragmento de ADN BamHI-EcoRI de 0,46 kb foram ligados ao fragmento de ADN BglII de 4,3 kb. A estrutura final de pRSV-PV3 continha a região de codificação para PV3 sob a regulação do promotor do vírus do sarcoma de Rous e foi 36 controlado pela análise da enzima de restrição (fig. 8a; Noteborn e outros, 1993).
As células MDCC-MSB1 foram infectadas com ADN de pRSV-PV3 por meio do método do dextrano DEAE. Quarenta e duas ho-ras após a infecção fixaram-se as células e analisaram-se no que respeita à expressão de PV3, por meio da coloração com CVI-VAG-85.1 monoclonal. As células foram também coradas com iodeto de propidio que cora muito fortemente o ADN de núcleos intactos mas cora muito pouco o ADN do núcleo apoptótico (Telford e outros, 1992). Mais de 90 % das células infectadas continham uma distribuição granular fina de PV3 no núcleo que foi corado com iodeto de propidio. Dois dias após a infecção, verificou-se que 40 % das células que expressam PV3 continham núcleos que estavam pouco corados com iodeto de propidio e a PV3 estava presente sob a forma de agregados. Três e mais dias depois da infecção verificou-se que mais do que 90 % das. células que continham PV3 continham agregados de PV3 e o ADN com uma coloração muito fraca provocada pelo iodeto de propidio (fig. 9). Três dias depois da transfecção, o ADN das células de PV3 infectadas mostrava um modelo de oligonu-cleosoma em escada caracteristico da apoptose. A distribuição de PV3 observada nas células infectadas correspondeu completamente à das células MDCC-MSBl infectadas com VAG. Pouco depois da infecção (passado 1 - 1,5 dias), a PV3 estava com uma distribuição granular fina no núcleo: o ADN celular estava ainda intacto nesta etapa. Um pouco mais tarde no progresso da infecção (depois de, aproximadamente, três dias) a PV3 forma agregados no núcleo (Koch, data não publicada). O ADN das células infectadas com VAG está fra-gmentado (Jeurissen e outros, 1992). 37 A conclusão dos requerentes é que PV3 é ela própria ca-paz de induzir a apoptose especifica de VAG em células MDCC-MSBl. A expressão da codificação de ADN de pRSV-PV3. para PV3 na linha de células de monócitos. de LSCC-HD11 também conduz à apoptose nestas células. A expressão da proteína PV2 em células MDCC-MSBl também conduz a danos do ADN celular. Três dias após a infecção das células MDCC-MSBl com ADN que codifica para PV2, em 20 % e passados 5 dias, em aproximadamente metade das células infectadas, o núcleo estava muito pouco corado com iodeto de propídio. Por isso, também PV2, embora em menor grau do que PV3, parece estar envolvida na indução da morte de células específica de VAG. 0 efeito de PV3 truncada na indução de apoptose em células MDCC-MSBl PV3 é uma proteína com 121 aminoácidos de comprimento, que contém duas peças ricas em prolina, uma região hidrofó-bica e duas porções fortemente carregadas positivamente (fig. 8b). As regiões carregadas pósitivamente são possivelmente sinais de localização de núcleos e/ou domínios de ligação de ADN (Noteborn e outros, 1987; Ramakrishnan, 1993).
Os requerentes estudaram se a extremidade do terminal C básico de PV# estava envolvida na actividade apoptótica de PV3. Com este fim, um produto de PV3 truncado foi feito por eliminação de 11 codões no terminal C das sequências de codi-ficação de PV3. Cortou-se o plasmido pEP-PV3 com as enzimas de restrição BamHI e HindIII e isolou-se o ADN de BamHI-HindIII de 0,38 kb. Dois oligómeros sintéticos de ADN, 5'-AGCTTGATTACCACTACTCCTGAG-3' e 5'- 38 TCGACTAGGGAGTAGTGGTAATCA-3'' hibridaram e assim formaram em conjunto um ligante de ADN HindIII-Sall de hélice dupla. Cortou-se o plasmido pRSV-H20 com BglII e Sall, tratou-se com fosfatase alcalina e isolou-se um fragmento de ADN de 4,3 kb. Ligou-se o ligante de ADN HindIII-Sall e o fragmento de BamHI-HindIII de 0,38 kb no fragmento BglII-Sall de 4,3 kb. A estrutura final de pRSV-tr contendo as sequências de codificação para a proteína de PV3 truncada sob a regulação do promotor de RSV (fig. 8a) foi analisada por meio da enzima de restrição e a análise das sequências.
As células de MDCC-MSB1 foram infectadas de uma forma transiente com ADN de pRSV-tr, em diferentes . momentos depois da infecção, foram coradas com CVI-VAG-85.1 monoclonal e .iodeto de propídio. A imunofluorescência mostrou que 42 horas depois da infecção a maior parte das células expressaram PV3 truncada contendo PV3 finamente granulada no seu núcleo. O ADN celular · foi fortemente corado com iodeto de propídio. Três dias após a infecção, ainda 80 % das células expressando PV3 truncada tinham núcleos fortemente corados com iodeto de propídio (fig. 9). O ADN isolado das células de MDCC-MSBl em 3 dias depois da infecção com pRSV-tr estava muito menos degradado do que o ADN isolado das células de MDCC-MSBl infectadas com pRSV-PV3. A fracção de núcleos positivos ao iodeto de propídio das células que expressam PV3 truncada declina lentamente até aproxímadamente 50 % em 5 dias depois da infecção. A maior parte das células contendo PV3 truncada e fracamente coradas pelo iodeto de propídio tem uma distribuição de PV3 granular. Só uma única célula contendo PV3 agrega. A expressão de PV3 truncada nas células de MDCC-MSBl aparentemente induz a morte das células menos eficientemente do que a expressão de PV3 do tipo selvagem (natural). 39
Também é notável que o mutante de PV3 pode formar muito menos agregados do que o PV3 do tipo selvagem. A expressão de PV3 em células de tumores humanos induz apoptose
Para a expressão de PV3 em células humanas utilizam-se os vectores de expressão pRSV-PV3 (fig- 8a) e PCMV-PV3. As sequências de codificação para PV3 foram clonadas no vector de expressão neo-pCMV contendo um promotor forte do gene imediatamente precoce de citomegalovirus (CMV) (Boshart e outros, 1985). Isolou-se o fragmento de BamHI de 0,46 com sequências de ADN de CAV das posições 427-868 (Noteborn e outros, 1991) a partir do plasmido pAc-PV3 (fig. 4) . Linea-' rizou-se o vector de neo-CMV com BamHI, tratou-se com CIP e isolou-se um fragmento de 7,5 kb. Ligou-se o fragmento de ADN de BamHI de 0,46 ao fragmento de ADN de BamHI de .7,5. A orientação verdadeira da sequência de codificação de PV3 em relação ao promotor de CMV na estrutura final de pCMV-PV3 foi determinada por meio da análise da enzima de restrição (fig. 10).
Para a expressão de PV3 truncada em células humanas, providenciou-se o fragmento Xhol-Sall de 0,46 kb da codificação do plasmido pRSV-tr para a PV3 truncada (fig. 8a) com terminais cegos por meio do tratamento com polimerase de Klenow e isolou-se. Linearizou-se o vector pCMV-neo com BamHI, provido de terminais cegos e desfosforilou-se com tratamento com CIP. O fragmento de ADN de extremidade cega de 0,4 6 kb foi ligado ao fragmento de ADN de extremidade cega de 7,5 kb. A estrutura do pCMV-tr contém as sequências de codificação para a PV3 truncada sob a regulação do promotor de CMV (fig. 10) . 40
No primeiro exemplo, a PV3 foi expressa nas 3 linhas de células hematopoiéticas de tumor humano KG-1, DOHH-2 e K562 e numa linha de células imortalizada Jobo-0. As linhas de células KG-1 e K562 derivaram de diferentes pacientes com leucemia mielóide humana (Koeffler e Golde, 1980) e DOHH-2 de um paciente com um linfoma B folicular (Landegent e outros, resultados não publicados). As células de Jobo-0 foram imortalizadas com o vírus de Epstein Barr (Landegent, resultados não publicados). Transfectaram-se as 4 linhas de células humanas com ADN de pSRV-PV3 (KG-1) ou com ADN de pCMV-PV3 (DOHH-2, K562 e Jobo-1) . Fixaram-se as células, e analisaram-se no que respeita à expressão de PV3 por coloração com CVI-VAG-85.1 monoclonal e no que respeita à indução de apoptose por coloração com iodeto de propidio. Pouco depois da infecção observaram-se células positivas de PV3 com uma distribuição granular fina de PV3 no núcleo que estava corado com iodeto de propidio e encontraram-se células positivas de PV3 com núcleo contendo agregados de PV3 para as 4 linhas'de células hematopoiéticas diferentes variando entre 75 e 95%, 5 dias depois da transfecção (fig. 11a) . Depois transfectaram-se as células K562 com ADN do plasmido pCMV-tr que expressa PV3 truncada de terminal C. A expressão de PV3 truncada em células de K562 induziu a morte de células muito menos eficientemente do que a PV3 do tipo selvagem. A conclusão dos requerentes é que a expressão de PV3 em células hematopoiéticas de tumor humano leva à indução específica da apoptose. A expressão de PV3 na linha de células de tumor humano da mama MCF-7 (Lippman e outros, 1980) também resultou na indução de apoptose (Noteborn e outros, resultados não publicados). 41
Na literatura descreve-se que os tumores (humanos) e as linhas de células de tumores que não contêm p53 funcional são menos susceptíveis ou mesmo não susceptíveis à indução da morte de células por quimioterapia e tratamento com radiação (Lowe e outros, 1993). 0 gene p53 do supressor do tumor actua como um intermediário na indução da apoptose por agentes anti-tumor específicos. Os requerentes examinaram se a PV3 era capaz de induzir a apoptose em células humanas que não possuíam p53 ou possuíam p53 com mutações. A PV3 foi expressa em células humanas de osteo-sarcoma por meio da transfecção de DEAE-dextrano com o plasmido pCMV-PV3. As células de Saos-2 derivadas do osteo-sarcoma não podem sintetizar p53 e as células de Saos-2/alal43 expressam um p53 com mutação e portanto não funcional. Como controlo positivo utilizou-se a linha de células U2-0S contendo p53 do tipo selvagem (Diller e outros, 1990) . Os resultados ilustrados na fig. 12a mostram que PV3 pode induzir apoptose num grau comparável ao das células que são p53 (Saos-2 e Saos-2/Alal43) ou p53+ (U2-OS). Seis dias após a transfecção, a maior parte das células positivas de PV3 são apoptóticas. A expressão de PV3 truncada induziu uma apoptose muito menos eficiente nas células Saos-2 (fig. 12b). A conclusão dos requerentes é que PV3 pode induzir especificamente a apoptose em células de tumor humano contendo ou não contendo o gene supressor do tumor p53.
Descrição das figuras A figura 1 mostra a sequência de ADN e a sequência de aminoácidos da proteína PVl do vírus da anemia da galinha (VAG) . A numeração das sequências do ADN do VAG está dada na patente de invenção holandesa n° 9002008. 42 A figura 2 mostra a sequência de ADN e a sequência de aminoácídos da proteína PV2 do vírus da anemia da galinha. A numeração das sequências de ADN de VAG está dada na patente de invenção holandesa n0 9002008. A figura 3 mostra a sequência de ADN e a sequência de aminoácídos da proteína PV3 do vírus da anemia da galinha. A numeração das sequências de ADN de VAG está dada na patente dè invenção holandesa n° 9002008. A figura 4 mostra a representação diagramática dos 3 vectores de transferência recombinante de VAG pAc-PVl, pAc-PV2 e pAc-PV3. A figura 5 mostra a análise de varrimento de péptidos do anticorpo monoclonal CVl-VAG-85,1 com péptidos (12-mers) derivados de PV3. A sequência do núcleo de PSTVFR, contra a qual se dirige o CVI-VAG-85.1 monoclonal, está nas posições 12 a 17 da sequência de aminoácídos de PV3 (Noteborn e outros, 1991). A figura 6 mostra a análise de. varrimento de péptidos do anticorpo monoclonal 111.2 com péptidos (12-mers) derivados de PV2. O 111.2 monoclonal é dirigido contra o epitopo GLEDRSTQ que está nas posições 109 a 116 da sequência de aminoácídos de PV2 (Noteborn e outros, 1991). Só se mostram os resultados obtidos com os péptidos N°s 1 a 140 (extinção dos péptidos n°s 141 a 206 < 0,103). A figura 7 mostra a análise de varrimento de péptidos do anticorpo monoclonal 111.3 com péptidos (12-mers) derivados de PV3. O monoclonal 111.3 dirige-se contra o epitopo PTSSR que está nas posições 19 a 23 da sequência de aminoácídos de PV3 (Noteborn e outros, 1991). 43
Figura 8-0 painel A mostra a representação diagrama-tica dos 2 vectores de expressão pRSV-PV3 e p-SRV-tr. O painel B mostra a sequência de aminoácidos da proteína de VAG PV3. Os resíduos de prolina estão impressos em itálico e os aminoácidos a negrito. Os 11 aminoácidos do terminal 11, cujos codões foram eliminados no vector de expressão estão sublinhados. A figura 9 mostra a cinética do efeito apoptótico de PV3 ou PV3 truncada. As células de MDCC-MSB1 foram infectadas com plasmido pRSV-PV3 (o) ou pRSV-tr (o), fixaram-se e coraram-se com o anticorpo monoclonal CVI-Vag-85,1 em tempos diferentes depois da infecção. Dão-se as percentagens de células imuno-fluorescentes com núcleos que normalmente coram com iodeto de propídio. Por experiência foram contadas pelo menos 100 células que tinham expressado PV3 ou PV3 truncada. A figura 10 mostra a representação diagramática dos vectores de expressão pCMV-PV3 e pCMV-tr. A figura 11 mostra a cinética do efeito apoptótico de PV3 em células hematopoiéticas humanas (de tumor). Trans-fectou-se a linha de células KG1 com o plasmido pRSV-PV3 e as linhas de células DOHH-2, K562 e Jobo-0 foram infectadas com o plasmido pCMV-PV3. S.ão dadas as percentagens das células positivas de PV3 com núcleos muito pouco corados com iodeto de propídio e células apoptóticas. Por experiência contou-se pelo menos 200 células. A figura 12 mostra a cinética do efeito apoptótico de PV3 nas linhas de células humanas de osteo-sarcoma. As células das linhas de células Saos-2, Saos-2/Alal43 e U2-0S foram transfectadas com o plasmido pCMV-PV3. São dadas as 44 percentagens das células positivas de PV3 com núcleos que coram pouco com iodeto de propidio e células apoptóticas. Por experiência contaram-se pelo menos 500 células.
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Quadro 1.
Indução de anticorpos de neutralização depois da imunização com PV1 recombinante. H° da galinha Dose de Titulo de dia neutralização no 0 14 28 42 1 0* <4 <4 . <4 <4 2 0 <4 <4 <4 <4 3 0 <4 <4 <4 <4 4 0 <4 <4 <4 <4 5 0 <4 <4 <4 e 0 <4 <4 <4 <4 7 0 <4 <4 <4 <4 8 0 <4 <4 <4 <4 9 10‘ <4 <4 <4 <4 10 105 <4 . 8 32 8 1 1 105 <4 <4 <4 <4 12 10s <4 8 <4 13 106 <4 <4 <4 <4 14 106 <4 <4 <4 16 15 10e <4 <4 ._<4 <4 18 10e <4 <4 <4 .<4 17 10“ <4 <4 <4 <4 18 106 <4 <A <4 <4 19 106 <4 <4 8 8 20 I-» o σι <4 <4 <4 <4 21 106 <4 <4 <4 22 10' <4 <4 8 23 10B <4 <4 <4 <4 24 106 <4 <4 <4 <4 — § elemento das células SF9 de insectos infectado com baculovirus recombinante. A imunização foi realizada com o lisado de células. jl animais injectados com SBF exn vez de lisado de células. 51
Quadro 2A
Indução de anticorpos de neutralização depois da imunização com PV1, PV2 mais PV3 recombinantes galinha no. Dose de antigénio § Titulo de neutralização no dia 15 35 42 1 0* <4 <4 <4 2 0 <4 <4 <4 3 0 <4 <4 <4 4 0 <4 <4 <4 5 0 <4 <4 <4 6 0 <4 <4 <4 7 0 <4 <4 <4 8 0 <4 <4 <4 9 io6 32 256 1024 10 • IO6 8 32 64 11 106 <4 64 256 12 106 8 64 128 13 106 4 64 128 14 106 <4 16 256 15 10s 8 >128 256 16 106 4 >128 1024 17 10° 32 <4 4 18 10B 8 512 256 19 10s 16 64 64 20 10s <4 64 256 21 10B <4 .16 32 22 10a <4 32 12,8 23 10s 16 64 256 24 10a 4 64 128 § elemento das células SF9 de insectos infectado com baculovirus recombinante. A imunização foi realizada com o lisado de células. SI animais injectados com SBF em vez de lisado de células'.
Quadro 2B. Indução de anticorpos de neutralização depois da imunização de lisados impuros de células Sf9 co-infectadas com baculovirus recombinante de PVl, PV2 e PV3 ou misturas de lisados de células Sf9 infectadas separadamente com baculovirus recombinante de PVl, PV2 e PV3
Galinha n°. Imunização Titulo de neutralização no dia 0 14 28 42 1042 SBF <2 <2 <2 <2 1044 SBF <2 <2 <2 <2 1046 SBF <2 <2 <2 <2 1048 SBF <2 <2 <2 <2 1051 SBF <2 <2 <2 1053 SBF <2 <2 £2 <2 52
Galinha n°. Imunização Titulo de neutralização no dia 1056 SBF <2 <2 <2 <2 1084 SBF <2 <2 <2 <2 1058 * <2 <2 128 256 1060 em conjunto <2 16 512 512 1062 em conjunto <2 2 . 64 128 1064 em conjunto <2 16 128 ' 256 1066 em conjunto <2 4 64 64 1068 em conjunto <2 16 256 N.D 1070 em conjunto <2 16 126 512 1072 em conjunto <2 16 256 512 1074 separado1 <2 <2 8 8 1078 separado <2 2 <2 <2 1081 separado <2 2 <2 <2 1083 separado <2 <2 <2 <2 1085 separado <2 <2 2 8 1087 separado <2 <2 <2 <2 1089 separado <2 <2 <2 <2 1091 separado <2 52 <2 <2 * imunização com lisados impuros de células Sf9 co-infectadas com baculovirus recombinante de PVl, PV2 e PV3 s, imunização com misturas de lisados impuros de células Sf9 infectadas separadamente com baculovirus recombinante de PVl, PV2 e PV3
Quadro 3. Anticorpos de neutralização em gemas de ovos de galinhas depois da imunização com uma combinação de PVl, PV2 e PV3 recombinantes animal Imunização Número de ovos de titulo média 1194 SBF 1 <4 SBF 3 <4 1231 SBF 3 <4 1232 SBF 4 <4 1233 SBF 4 <4 1251 SBF 4 <4 SBF 2 <4 1195 PV1+PV2+PV3 5 <4 1196 PV1+PV2+PV3 3 16 1197 PV1+PV2+PV3 1 4 1199 PV1+PV2+PV3 2 64 1203 PV1+PV2+PV3 4 22,6 1205 PV1+PV2+PV3 1 32 1206 PVI+PV2+PV3 3 128 ' 1207 PV1+PV2+PV3 3 32 1208 PV1+PV2+PV3 3 12, 6 1210 PV1+PV2+PV3 4 32 1216 PV1+PV2 3 64 1217 PV1+PV2 4 16 1216 PV1+PV2 3 64 1219 PV1+PV2 4 45,2 1220 PV1+PV2 3 32 1223 PV1+PV2 3 . 50,8 1224 PV1+PV2 4 76 122 6 PV1+PV2 3 40,4 1227 PV1+PV2 4 19 53
1228 PV1+PV2 2 8 1229 PV1+PV2 3 4 1230 EV1+PV2 3 32 1235 PVÍ+PV3 3 _<4 1238 PVI+PV3 3 4 1239 PV1+PV3 <4 1245 EV1+PV3 3 <4 1248 PV1+PV3 2 <4 1249 PV1+PV3 3 <4 1255 PV2+PV3 3 <4 1258 PV2+PV3 5 <4 1259 PV2+PV3 4 <4 1260 PV2+PV3 4 <4 1261 PV2+PV3 4 <4 1263 PV2+PV3 3 <4 1264 PV2+PV3 4 9,6 1265 PV2+PV3 3 <4 1266 PV2+PV3 3 <4 1267 FV2+PV3 2 <4 1268 PV2+PV3 3 <4 1269 EV2+PV3 3 <4 1270 PV2+PV3 4 <4 Quadro 4. Observações nas na descendência de animais secções depois imunizados com do reforço produtos de VAG
recombinantes de VAG
Grupo 1 PV1+PV2+PV3 Grupo 2 PV1+PV2 Grupo 3 PV2+PV3 Grupo 4 SBF 0/5* 1/5 dia 6 depois da infecção 4/5 515 0/5 1/5 dia 14 depois da infecção 5/5 . 515 1/3 0/0 Mais do que 14 dias depois da infecção 13/14 616 (nd:’ 2/2)1 (nd: 1/14) 9 número de animais com um timo pequeno 4 sem realização de dissecção por causa da mortalidade específica
Quadro 5. Valores do hematócrito na descendência de animais mães imunizados com produtos de baculovirus de VAG recombinante
Imunização com uma combinação de produtos recombinantes de baculovirus PV1+PV2+PV3 EV1+PV2 PV2+PV3 SBF 37’ 29 14 18 30 31 20 11 33 34 13 16 33 30 28 15 54
Imunização com uma combinação de produtos recombinantes de baculovirus 34 35 25 19 28 34 8 13 34 22 28 9 32 34 12 11 29 36 6 17 29 32 18 10 36 30 16 17 31 25 19 18 32 36 14 7 28 34 29 8 32 33 13 10 33 32 8 8 31 36 31 12 37 34 14 14 32 28 25 9 38 32 19 11 30 35 15 8 33 36 7 12 23 17 17 38 1 4 12 37 9 13 31 18 32 8 31 12 32 14 34 32 ******* ******* ******* (continuação)
Imunização com baculovirus uma combinação de produtos recombinantes de PV1+PV2 + PV3 PV1+PV2 PV2+PV3 SBF média: 32,1 32,4 16, 0 12,7 Desvio padrão 3,09 3, 66 6,98 3,52 max-min 23-38 22-37 6-28 7-19 número n=35 n=23 n=30 n=2 6 I % hematócríto em animais individuais 55
Quadro 5. Mortalidade após o reforço de VAG na descendência de animais mães imunizados com produtos recombinantes de
VAG
Grupo 1 PV1+PV2+PV3 Grupo 2 PV1+PV2 Grupo 3 PV2+PV3 Grupo 4 SBF 1/43 7/39 Antes do dia 14 depois da infecçâc 12/51 8/29 (2 %) (15,4 %) dia 14 depois da infecçâo (23,5 %) (27,6 %) 3/43 0/39 Depois do dia 14 após a infecçâo 14/51 6/29 (7 %) (27,4 %} (20,7 %)
Lisboa, 15 de Outubro de 2008 56
Claims (3)
- REIVINDICAÇÕES 1. Polipéptido derivado do virus da anemia da galinha, fora do seu ambiente natural, caracterizado pelo facto de o referido polipéptido compreender a sequência tal como está descrita na figura 3, polipéptido esse em que existe uma mutação que diminui a capacidade de indução de apoptose, em que o referido polipéptido mutado compreende pelo menos os primeiros 110 aminoácidos com terminal N, tal como descrito na figura 3.
- 2. Processo para a obtenção de um polipéptido-, de acordo com a reivindicação. 1, caracterizado pelo facto de compreender a clonagem do quadro de leitura aberta num vector de baculovirus, expressando o referido polipé-ptido nas células Sf9 e preparando um lisado de células impuro.
- 3. Anticorpo ou um seu derivado ou um seu fragmento, caracterizado pelo facto de se dirigir contra um polipéptido, de acordo com a reivindicação 1. Lisboa, 15 de Outubro de 2008 1
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