ES2200065T3 - Utilizacion de apoptina. - Google Patents

Abstract

ESTA INVENCION DESCRIBE QUE LA APOPTINA NO PUEDE INDUCIR APOPTOSIS EN CELULAS HUMANAS NORMALES. ADICIONALMENTE, LA INVENCION DESCRIBE QUE CUANDO SE TRANSFORMAN CELULAS NORMALES SE VUELVEN SUSCEPTIBLES A LA APOPTOSIS INDUCIDA POR APOPTINA. LA INVENCION DESCRIBE QUE LA APOPTINA INDUCE EN DIVERSOS TIPOS DE TUMORES CELULARES UN TIPO DE APOPTOSIS DISTINTO DE P53, Y QUE NO PUEDE SER BLOQUEADO POR DIVERSOS AGENTES INHIBIDORES DE LA APOPTOSIS. LA INVENCION COMPRENDE UN AGENTE ANTITUMORAL, QUE ESPECIFICAMENTE MATA CELULAS TUMORALES Y NO CELULAS NORMALES. PROPORCIONA ADICIONALMENTE LA INDUCCION DE LA MUERTE CELULAR MEDIANTE TERAPIA GENICA. LA APOPTINA PUEDE INDUCIR LA APOPTOSIS EN CELULAS TUMORALES ANIMALES NO HUMANAS. LA INVENCION PROPORCIONA ASIMISMO QUE EN CELULAS NORMALES LA APOPTINA SE ENCONTRO PREDOMINANTEMENTE EN EL CITOPLASMA, MIENTRAS QUE EN CELULAS TUMORALES SE LOCALIZO EN EL NUCLEO. ADICIONALMENTE, LA INVENCION COMPRENDE UN TEST DE DIAGNOSTICO PARA LA DETERMINACION DE LA ACTIVIDAD TRANSFORMADORA DE CELULAS.

Description

Utilización de apoptina.

Breve descripción de la invención

La presente invención se refiere a métodos y utilizaciones de la apoptina o derivados o fragmentos funcionales de la misma, significando la apoptina la proteína viral 3 (VPS) del virus de la anemia de pollos. La apoptina en sí misma y su actividad inductora de apoptosis se han dado a conocer con anterioridad (ver más adelante). No obstante, en las publicaciones anteriores, la apoptina no se consideraba distinta de cualquier otro agente inductor de apoptosis. Los inventores han descubierto ahora que la apoptina es ciertamente muy distinta de otros agentes inductores de apoptosis y puede, por lo tanto, ser aplicada en diferentes métodos y para diferentes utilizaciones. Si bien los agentes convencionales inductores de apoptosis inducen apoptosis en cualquier célula en la que se encuentren presentes, los inventores han descubierto ahora que la apoptina induce apoptosis solamente en células transformadas o células tumorales.

Por lo tanto, la invención, en una realización, da a conocer terapias antitumorales direccionales. La aplicación de la apoptina como terapia antitumoral provocará poca toxicidad puesto que la apoptina induce muerte celular en una gran proporción en células tumorales y muy reducida, en caso de que exista, en células normales no transformadas, no malignas.

La invención da a conocer también que la apoptina no puede ser inhibida por varios inhibidores antiapoptosis. En particular, la apoptina actúa de forma distinta con respecto a la ruta P53-apoptótica que es conocida como elemento necesario en intermediación de apoptosis, que es disparada por una serie de agentes quimioterapéuticos.

La invención da a conocer además el descubrimiento de que la apoptina puede inducir apoptosis en diferentes tipos de células tumorales humanas.

La invención se refiere además a diferencias en la localización de la apoptina en células susceptibles de apoptosis inducida por la apoptina, es decir, células humanas transformadas y malignas con respecto a células insensibles a la apoptosis inducida por la apoptina, es decir, células humanas normales. La localización diferencial es utilizada como ensayo diagnóstico para analizar si una célula es normal o ha pasado a ser transformada y/o maligna.

Antecedentes de la invención

Jeurissen y otros (1992b) observaron una serie de fenómenos en el timo de pollos inoculados con virus de anemia de pollos (CAV) específica libre de patógenos que eran ausentes en timos de pollos de control. Diez días después de la infección, la totalidad de las células que contienen cortex cuya cromatina se había condensado en áreas adyacentes a la membrana nuclear. Se observaron esporádicamente en el citoplasma de células epiteliales cuerpos más o menos esféricos con densidad de electrones. Después de 13 días de infección, el córtex se encontraba fuertemente agotado de timocitos, mientras que células epiteliales, muchas de ellas conteniendo cuerpos con densidad de electrones, y otras células no limfoides se encontraban todavía presentes. El ADN aislado de los timos de pollos infectados con diferentes campos aislados de CAV mostraron la típica estructura de escalera de fraccionamiento oligonucleosómico en un electroferograma. Estos cambios morfológicos celulares y bioquímicos observados se observaron también en células limfoblastoides de aves de cultivo infectadas por CAV.

Los fenómenos descritos son característicos del proceso fisiológico de la muerte celular programada o apoptosis. La apoptosis se caracteriza por la retracción de células, segmentación del núcleo, condensación y fraccionamiento de ADN en fragmentos de tamaño de dominio, en la mayor parte de células seguido de degradación internucleosomal. Finalmente, las células apoptóticas se fragmentan en cuerpos encerrados por membranas, que son fagocitados rápidamente por células adyacentes. Por lo tanto, la apoptosis provoca mucha menos destrucción de tejidos que la necrosis, tipo de muerte celular no fisiológica (Wyllie y otros, 1980, Arends y Wyllie, 1991).

La apoptosis es una cascada de sucesos. En general, el proceso apoptótico se puede dividir en varias etapas.

Etapa 1 Inicio de la apoptosis

Muchos agentes distintos externos o internos pueden disparar el proceso apoptótico.

Etapa 2 Factores que pueden intermediar el inicio del proceso apoptótico

Un papel principal en esta etapa es el desempeñado, por ejemplo, por la proteína supresora de tumores p53.

Etapa 3 Aumento de la señal apoptótica por factores tales como Bax Etapa 4 Activación de los miembros de la familia ICE serina-proteasa

Tan pronto como estas proteasas específicas son activadas, se ha pasado del punto sin retorno. Inhibidores conocidos de la apoptosis, tales como factores de crecimiento (inhiben en la etapa 2), Bcl-2 (etapa 3) o crmA (etapa 4), se sabe que inhiben la apoptosis en diferentes etapas durante la etapa de decisión del proceso apoptótico.

Etapa 5 Ejecución de la señal apoptótica. Por ejemplo, ADN se condensa y se fragmenta. (White, 1996).

Poco tiempo después de la infección de células mononucleares cultivadas de pollos, la proteína codificada por CAV apoptina (es llamada también VP3) se co-localiza con cromatina celular. Más adelante después de la infección, la apoptina forma agregados, las células pasan a ser apoptóticas, es decir, el ADN celular se fragmenta y, como resultado, se condensa (Noteborn y otros, 1994). Se ha demostrado por microscopía electrónica inmunooro que la apoptina se encuentra presente en estructuras apoptóticas. In vitro, la expresión de apoptina en pollos transformó las células T limfoblastoides y la apoptosis inducida por células mieloides en estas células. Estos datos indican que la apoptina puede disparar la ruta apoptótica en células infectadas por CAV (Noteborn y otros, 1994, Noteborn y Koch, 1995).

La apoptina es una proteína pequeña, con una longitud de solamente 121 aminoácidos, que es más bien básica y rica en prolina (Noteborn y otros, 1991). La apoptina está situada estrictamente dentro de las estructuras de cromatina celular. El truncado del tramo básico terminal C de la apoptina tiene como resultado una localización nuclear reducida y una actividad apoptótica significativamente reducida (Noteborn y otros, 1994). Las pequeñas dimensiones de carácter más bien básico de la apoptina puede permitir que ésta interaccione con proteínas histona y/o no histona dentro de la estructura de la cromatina.

La apoptosis es un proceso fisiológico activo y programado para la eliminación de células superfluas, alteradas o malignas (Earnshaw, 1995). El proceso apoptótico puede ser iniciado por una serie de estímulos reguladores (Wyllie, 1995 y White, 1996). Los cambios en la tasa de supervivencia de células juegan un importante papel en la patogénesis humana, por ejemplo, en el desarrollo del cáncer, que es provocado por la proliferación celular aumentada pero también por la muerte celular disminuida (Kerr y otros, 1994). Una serie de compuestos quimioterapéuticos y de radiaciones se ha demostrado que inducen apoptosis en las células tumorales, en muchos casos a través de p53 de tipo salvaje (Thompson, 1995, Bellamy y otros, 1995, Steller, 1995, Kaufman, 1989, McDonell y otros, 1995, Lowe y otros, y Fisher, 1994).

No obstante, muchos tumores adquieren una mutación en p53 durante su desarrollo, frecuentemente correlacionada con su pobre respuesta a la terapia de cáncer (Hooper, 1994). Para varios tumores (leucémicos), un elevado nivel de expresión de Bcl-2 proto-oncogénico se asocia con una fuerza de resistencia a diferentes agentes quimioterapéuticos inductores de apoptosis (Hockenberry, 1994, Kerr y otros, 1994, Sachs y Lotern, 1993).

La apoptina puede inducir líneas celulares humanas malignas de apoptosis (Noteborn y Koch, 1994). Los inventores han establecido que la apoptosis inducida por apoptina tiene lugar en ausencia de p53 funcional (Zhuang y otros, 1995a), y no se puede bloquear por Bcl-2 Y BCR-ABL (Zhuang y otros, 1995). Por lo tanto, la apoptina es útil para la destrucción de células tumorales, que han pasado a ser resistentes a la inducción quimioterapéutica de la apoptosis, debido a la falta de p53 funcional y sobreexpresión de Bcl-2 y BCR-ABL.

Descripción detallada de la invención

La presente invención da a conocer la actividad apoptótica de la apoptina en células humanas malignas y transformadas con respecto a células normales. La apoptina deja de inducir apoptosis en células T primarias, células endoteliales y de músculos lisos. Cuando las células normales son transformadas, pasan a ser susceptibles por apoptina. En células normales, la apoptina ha sido encontrada de manera predominante en el citoplasma, mientras que en células tumorales se encontró en el núcleo.

La apoptina puede ser utilizada para agotamiento de células específicamente transformadas/malignas. Por lo tanto, la apoptina es un agente antitumoral muy potente. La expresión de la apoptina puede utilizada para la inducción de apoptosis en células tumorales humanas específicamente. La apoptina no induce apoptosis o por lo menos no lo hace significativamente en células normales, indicando que la toxicidad del tratamiento de apoptina será baja.

La invención da a conocer que la apoptina es capaz de inducir apoptosis en células humanas transformadas, no inmortalizadas, lo cual implica que la actividad apoptótica de la apoptina pasa a ser ya disponible durante sucesos de transformación primitivos en células. Por lo tanto, la apoptina puede ser incluida en otras terapias (por ejemplo, de genes o quimio) para impedir que las células tratadas sufran transformación e incluso que se vuelvan malignas.

La apoptina puede ser expresada (transitoriamente) en tumores por medio de transfección de ADN. La expresión de la apoptina en células (tumorales) puede tener también lugar por infección de células con vectores retrovíricos que contienen una frecuencia de codificación para la apoptina.

La administración a células de componentes no víricos que codifican la secuencia para la apoptina (por ejemplo, liposomas o vectores derivados de transferrina) es otra posibilidad para la expresión/presencia de apoptina e inducción de apoptosis en células tumorales.

Además, los inventores han aportado pruebas de que la apoptina es distinta de la ruta apoptótica inducida por p53. Además, el hecho de que la apoptina no necesita p53 funcional, la apoptina no puede ser bloqueada por inhibidores de la ruta apoptótica p53, tales como las proteínas similares a Bcl-2, y la proteína de viruela de vaca cmA, que bloquea las actividades de proteasa similares a ICE. Estos inhibidores interfieren dentro de diferentes etapas de la cascada apoptótica de apoptina inducida por p53, podrían inducir apoptosis completamente independiente de la ruta apoptótica bloqueada por estos inhibidores apoptóticos, o podrían actuar más abajo de ellos.

Estos datos implican que la apoptina es un inductor muy potente de apoptosis en células tumorales, que pueden superar bloques (todos analizados) de actividad antiapoptótica en células transformadas y malignas. Por lo tanto, la apoptina es un potente agente antitumoral para una amplia variedad de células tumorales.

La localización diferencial de la apoptina en células normales con respecto a células transformadas/malignas, se puede utilizar como prueba de diagnóstico para distinguir si una célula ha pasado a ser transformada/maligna.

Además de la inducción de apoptosis en células tumorales humanas, los inventores han proporcionado pruebas asimismo de que la apoptina puede inducir apoptosis en otras células tumorales de mamíferos. La invención puede ser utilizada por el tratamiento del cáncer en diferentes sistemas humanos.

Así pues, la invención proporciona la utilización de un vehículo que suministra un gen que codifica una substancia tumoricida, principalmente pero no exclusivamente con una célula tumoral humana para preparar un medicamento para impedir carácter maligno al suministrar el gen a células transformadas no inmortalizadas, caracterizándose porque la substancia tumoricida es apoptina o un equivalente funcional de la misma. En la técnica anteriormente conocida, se han dado a conocer muchos vehículos para suministrar agentes citotóxicos o precursores de los mismos. Un problema importante en el suministro de agentes citotóxicos es que estos pueden ser dañinos para todas las células y no solamente para las células tumorales (que se designará de manera intercambiable células transformadas o células malignas o células tumorales). Por lo tanto, se han investigado muchas formas distintas de direccionar las substancias citotóxicas a las células tumorales. Si bien muchos compuestos direccionantes son conocidos en la actualidad, todos ellos presentan el inconveniente de no ser completamente específicos para la diana u objetivo tumoral. Por lo tanto, la utilización de estas sustancias citotóxicas no ha conocido hasta el momento mucha difusión. En el tiempo de este descubrimiento, se creía que la apoptina tenía el mismo inconveniente por el hecho de que necesitaría un compuesto direccionante altamente específico. Los inventores han descubierto que esto no es necesario para la apoptina. La apoptina tiene solamente un efecto significativo en células tumorales y no en células normales.

Así pues, aunque la fracción o compuesto direccionante o cualquier otro medio de suministro de la apoptina (o un equivalente funcional) no es muy específico, esto resultará difícilmente en toxicidad alguna para tejidos normales. Un equivalente funcional de la apoptina es cualquier fragmento o derivado que tenga el mismo tipo de actividad, posiblemente en diferentes cantidades.

Una fracción o compuesto direccionante está bien definido en la técnica como molécula con la actividad de unión específica para una molécula objetivo. Debe ser capaz, preferentemente, de internalización. La molécula objetivo o diana puede ser un antígeno o un epítopo, en cuyo caso el compuesto direccionante es un anticuerpo o un fragmento o un derivado del mismo. La molécula objetivo puede ser un receptor, en cuyo caso el compuesto direccionante es un ligando para dicho receptor. Estos son solamente ejemplos de combinaciones adecuadas. El enlace entre la fracción direccionante y la apoptina tiene solamente una exigencia en el hecho de que debe permitir el funcionamiento de las funciones de ambos asociados. Así pues, puede ser un enlace químico (lábil), puede ser una proteina de fusión. El conjugado puede ser incluso un liposoma cubierto con fracciones direccionantes y lleno de apoptina (o un gen que codifica la misma) etc. La invención comprende también la utilización de un vehículo para preparar un medicamento a utilizar en el suministro de una apoptina que codifica un gen a una célula tumoral humana, utilizando terapia de genes, de manera que el vehículo comprende una fracción direccionante que tiene afinidad para una molécula asociada principalmente, pero no exclusivamente, con la superficie de dicha célula tumoral. La terapia génica tiene muchos métodos bien conocidos de suministrar genes a células utilizando virus tales como adenovirus o retrovirus. Los técnicos de la materia sabrán como seleccionar el vehículo adecuado. Dado que la apoptina funciona solamente induciendo apoptosis en células transformadas, la misma o su gen pueden ser utilizados como medio de seguridad en otros regímenes terápicos de genes distintos a la terapia tumoral, tales como los que rectifican deficiencias de enfermedades hereditarias. En este caso, es administrado en un vehículo de suministro del gen junto con el gen de interés y, si la célula en la que el gen de interés ha sido insertado resulta maligna, entonces será susceptible a la acción de la apoptina.

La apoptina no puede ser inhibida por los mecanismos de inhibición de otras sustancias inductoras de apoptosis. Si la apoptina se tiene que utilizar para eliminar células que no son transformadas, entonces esto se puede conseguir al proporcionar apoptina o un equivalente funcional de la misma dotada de una señal de localización nuclear. Dado que la apoptina necesita encontrarse en el núcleo, esto tendrá como resultado la apoptosis. Sin dicha señal, la apoptina permanecería fuera del núcleo y no tendría efecto significativo (tal como se da a conocer en este documento).

Por lo tanto, dicha apoptina con una señal de localización de núcleo podía ser utilizada en un método para la eliminación de células de una población de células objetivo o diana. Se conocen bien en esta técnica las señales de localización nuclear (NLS). Se puede conseguir genes de fusión que codifican un NLS y una apoptina.

Dado que la apoptina tiene una localización distinta en células normales en comparación con células transformadas, es posible utilizar la apoptina como herramienta de diagnóstico, distinguiendo entre estos dos tipos de células. Por lo tanto, la invención da a conocer también un método para distinguir entre células transformadas y/o malignas y/o células tumorales y células normales, que comprende las etapas de disponer dichas células con la proteína vírica 3 (VP3;apoptina) y detectar la presencia o ausencia de actividad apoptótica de la apoptina, por ejemplo, detectando la localización de dicha proteína vírica en dichas células. La apoptina localizada puede ser detectada, por ejemplo, con anticuerpos.

La invención se explicará de manera más detallada en base a la parte experimental siguiente. Esto está destinado solamente a la finalidad ilustrativa y no se debe interpretar como limitación del objetivo de protección.

Experimentos Aislamiento de células primarias humanas

Se aislaron células primarias humanas T de 6 donantes de sangre normales por centrifugación Ficol y se cultivaron en medio-RPMI, conteniendo 6% de suero humano y 0,8\mug por ml de fitohemaglutinina. Después de 3 días, el medio fue refrescado y se añadieron 300 unidades por ml de interleuquina-2. Se aislaron de cordones umbilicares células primarias humanas de músculos lisos (SMC) y células endoteliales vasculares (HUVEC). Se cultivaron SMC en medio CM199 suplementado con ECGF y heparina, y HUVEC en medio DMEM conteniendo 10% de suero fetal de vaca.

Plásmidos de ADN

Toda las secuencias de ADN CAV son derivadas originalmente del plásmido ADN plc-20H/CAV-
EcoRI (Noteborn y De Boer, 1990). Todas las etapas de clonado con ADN de plásmidos se llevaron a cabo, en principio, de acuerdo con métodos de Maniatis y otros (1982).

El plásmido de expresión pCMV-fs, anteriormente llamado pCMV-VP3, contiene secuencias ADN CAV que codifican apoptina exclusivamente (nt 427-868), el plásmido pCMV-tr codifica una apoptina truncada que carece de los 11 aminoácidos del terminal C (Zhuang y otros, 1995a), y el pCMV-des codifica la desmina, proteína estructural que se encuentra en células musculares que no induce apoptosis (Menke y otros, datos no publicados). Los plásmidos de expresión pC-MV-BAG-1 (Noteborn, M.H.M., datos no publicados), pC-MV-Bcl-2 (Zhuang y otros, 1995b) y pCMV-crmA (Noteborn, M.H.M., datos no publicados) expresan las proteínas antiapoptosis BAG-1, Bcl-2 y la proteína crmA de la viruela que inhibe proteasas parecidas a ICE, respectivamente. Los plásmidos de expresión pCMV-E1B21K expresan la proteína del adenovirus E1B 21kDa y pCMV-p53, la proteína p53 supresora de tumor (Zhuang y otros, 1995).

Todos los genes expresados transitoriamente se encuentran bajo la regulación del promotor del citomegalovirus.

Queratinocitos y fibroblastos humanos normales, transformados y malignos

Se aislaron queratinocitos humanos de la piel y se cultivaron en presencia de una capa de fibroblastos de ratón 3T3 letalmente irradiados con 137C. Los cultivos primarios de queratinocitos epidérmicos humanos (FSK-1) se iniciaron en medio completo, tal como se describe (Rheinwald y Green, 1975) con modificaciones menores.

Se cultivaron fibroblastos VH10 diploides de piel humana normal (Klein, 1990) en medio DMEM suplementado con 10% de suero fetal de vaca.

Los fibroblastos NW18 tumorigénicos transformados por SV40 (Weissman y Stanbridge, 1983) fueron cultivados en medio MEM suplementado con 8% de suero fetal de vaca.

Se cultivaron queratinocitos tumorigénicos
SCC-15 (Rheinwald y Beckett, 1981), derivados de carcinoma de células escamosas en medio DMEM/F12 (3:1) conteniendo 5% de suero fetal de vaca, 0,4 \mug por ml de hidrocortisona y 1 \muM de isoproterenol.

Los fibroblastos transformados por SV40, pre-
crisis(Pre) y post-crisis(Post), tal como se describen por B. Klein y otros (1990) fueron cultivados en medio MEM con 8% de suero fetal de vaca.

La cepa de queratinocito transformada espontáneamente HaCaT (Boukamp y otros, (1988) fue una donación del Profesor Doctor Fusenig, DKFZ, Heidelberg, Alemania. Las células HaCaT fueron cultivadas en medio DMEM suplementado con 10% de suero fetal de vaca. Se cultivaron células de la cepa SVK14 de queratinocitos transformados por SV40 (Taylor-Papadimitriou y otros, 1982) en el mismo medio que las células SCC-15.

Transfecciones de ADN

Se purificó ADN de plásmido por centrifugación en un gradiente CsCl y cromatografía de columna en Sephacryl S500(Pharmacia).

Las células T humanas primarias estimuladas mediante fitohemaglutinina fueron transfectadas en presencia de DEAE-dextrano, tal como se ha descrito (Noteborn y otros, 1994). Se transfectaron células de ratón Crip y células humanas Hep3B, VH10, Pre y Post-, y células NW18, de HUVEC y de SMC con ADN de plásmido, mediante precipitación de calcio-fosfato, tal como se ha descrito (Graham y Van der Eb, 1973). Se transfectaron células FSK-1, HaCaT, SVK14 y SSC-15 con DOTAP [D.Fisher, resultados no publicados].

Inmunofluorescencia

Se cultivaron células T en suspensión y se fijaron sobre placas de microscopio de cristal. Todas las demás células fueron cultivadas sobre placas de microscopio de cristal dotadas de recubrimiento. Las células fueron fijadas con 80% de acetona durante 10 minutos a temperatura ambiente, y se utilizaron para inmunofluorescencia indirecta tal como se ha descrito (Noteborn y otros, 1994). Para demostrar la presencia y/o localización celular de la apoptina (truncada) en anticuerpos monoclonales de ratón de células transfectadas (MAb), se utilizaron CVI-CAV-85,1-(85,1) (Noteborn y otros, 1991) y CVI-CAV-111,3 (111,3; Koch, datos no publicados), y se utilizó el ratón MAb 33 (Monosan, Uden, Holanda) para desmina humana. Se utilizaron como segundos anticuerpos, anticuerpos antiratón de cabra marcados mediante fluorecesceína-isotiocianato (Jackson Immunoresearch Laboratories Inc., West Grove PA). Se tiñó ADN nuclear con 2,4-diamidino-2-fenilindol(DAPI) o ioduro de propidio (PI).

Transfección de ADN estable de células VH10.

Se transfectaron fibroblastos VH10 diploides normales humanos con pCMV-fs, expresando apoptina de tamaño completo, o bien, pCMV-neo-Bam, el plásmido hueco sin las secuencias CAV que codifican apoptina. Se seleccionaron clones estables con medio G41B, se cultivaron sobre placas de microscopio de cristal y se fijaron con acetona al 80%. La expresión de la apoptina fue analizada por inmunofluorescencia indirecta utilizando MAb 85,1.

Resultados y discusión Expresión de la apoptina en células tumorales de ratón in vitro

Los inventores han examinado si la apoptina puede inducir apoptosis asimismo en células tumorales de mamíferos o de origen no humano. Por lo tanto, se transfectaron células de la línea celular tumoral de ratón Crip (Danos, 1988) con pCMV-fs ADN codificando apoptina. Tres días después de la transfección, las células fueron fijadas. Mediante inmunofluorescencia y tinción PI, las células fueron examinadas en cuanto a expresión de apoptina, y se examinó sobre si resultaban apópticas. Después de tres días de la transfección, el 54% de las células tumorales de ratón que contenían apoptina resultaron apoptóticas.

Estos resultados indican que la apoptina puede inducir apoptosis en diferentes líneas celulares de tumores de mamíferos.

En células Hep 3B la ruta apoptótica inducida por apoptina es distinta de la ruta apoptótica inducida a partir de p53

Recientemente, los inventores han demostrado que la apoptina induce apoptosis en células de osteosarcoma, sin presencia de p53 de tipo salvaje (Zhuang, y otros, 1995, Noteborn y Koch, 1994). Chiou y otros (1994) y Debbas y White (1993) han demostrado que la proteína Bcl-2 y adenovirus 5 (Ad 5) E1B 21K puede bloquear la apoptosis inducida/intermediada por p53 actuando más abajo de p53.

Los inventores han examinado si la proteína
Ad 5 E1B 21K y Bcl-2 pueden inhibir la ruta independiente de p53 de apoptosis inducida por apoptina en comparación con apoptosis dependiente de p53. Con este objetivo, han estudiado el efecto de la co-expresión de estas proteínas con apoptina o p53 en la línea celular del hepatoma humano Hep3B.

Se cotransfectaron células Hep3B con pCMV-fs, codificando apoptina y pCMV-neo-Bam DNA (control negativo), PCMV E1B21 DNA, codificando la proteína Ad5 E1B 21K ó pCMV-Bcl2 (Zhuang y otros, 1995b), codificando Bcl-2 humana. El número de células de expresión de apoptina fue rastreado por inmunofluorescencia indirecta y por tinción DAPI, que es débil y/o irregular cuando las células se han vuelto apoptóticas.

De manera sorprendente, en varios momentos después de la transfección, el porcentaje de células Hep3B que expresaban apoptina que resultaron apoptóticas, fue similar a las células Hep3B que contenían tanto apoptina como E1B-21K o tanto apoptina como Bcl-2. A efectos de brevedad, solamente se indican en la figura 1 los datos obtenidos seis días después de la transfección.

Para mostrar que E1B-21K o Bcl-2 tienen ciertamente un efecto anti-apoptótico en células Hep3B, los inventores examinaron si estas dos proteínas podían inhibir apoptosis provocada por sobre-expresión de p53 en células Hep3B. En comparación con la co-transfección de células Hep3B con pCMV-p53 DNA codificando p53 de tipo salvaje (Baker y otros, 1990) y pCMV-neo-Bam, co-transfección con plásmidos pCMV-p53 y pCMV-E1B21, o pCMV-Bcl2 resultó en una reducción significativa de la apoptosis inducida por p53, según análisis de inmunofluorescencia y tinción PI (figura 2).

De este modo, la ausencia de efecto de las proteínas E1B 21K y Bcl-2 de apoptosis inducida por apoptina no se puede explicar por la no funcionalidad de las proteínas expresadas en células Hep3B puesto que pueden inhibir la ruta apoptótica inducida por p53. El hecho de que E1B 21K y Bcl2 pudieran influir negativamente en la ruta apoptótica regulada por p53 en células Hep3B, si bien la apoptosis inducida por apoptina no pudo ser inhibida, indica que la ruta dependiente de p53 y p53 independiente inducible por apoptina son rutas distintas, como mínimo, con células Hep3B.

El hecho de que en un gran número de tumores no se puede inducir apoptosis en una serie de agentes quimioterapéuticos parece estar relacionado a funciones alteradas de p53 (Lowe y otros, 1993). Por lo tanto, la inducción de una ruta apoptótica independiente de p53 es un enfoque útil como terapia alternativa para tumores.

Caracterización de la ruta apoptótica inducida por apoptina en células Saos-2

La ruta apoptótica inducida por apoptina parece ser distinta de la inducida por p53 (ver anterior). Bcl-2, del que se conoce la involucración en la tumoformación por inhibición de la ruta apoptótica, no pudo bloquear la apoptosis inducida por apoptina, pero pudo bloquear la ruta p53. Recientemente, se ha indicado por otros investigadores que Bcl-2 y Bag-1 (Takayama y otros, 1995) conjuntamente podían ser necesarios para la inhibición de la llamada apoptosis independiente de Bcl-2, tal como parece ser el caso para la apoptosis inducida por apoptina.

Para examinar si Bag-1 podría influir negativamente la apoptosis inducida por apoptina de modo propio o conjuntamente con Bcl-2, se llevaron a cabo co-transfecciones de células Saos-2 pC-MV-fs y pCMV-Bcl-2, o pCMV-Bag-1, o pCMV-Bcl-2 y pCMV-Bag-1. En paralelo, se llevaron a cabo experimentos de control de co-transfección similares con p53. Bag-1 o una combinación de Bag-1 y Bcl-2 no inhiben la apoptosis inducida por apoptina, mientras que la apoptosis inducida por p53 quedaba significativamente inhibida por Bag-1 o Bag-1 y Bcl-2 (figura 3). Los inventores llegaron a la conclusión de que la ruta apoptótica inducida por apoptina es independiente de las proteínas similares a Bcl-2 o actúa más adelante de ellas.

Por medio de microscopía doble de inmunofluorescencia y fluorescencia intensificada por vídeo, se analizó si la apoptina podía regular la expresión bax. Bax es una proteína celular que puede inducir apoptosis, y se asocia a proteínas Bcl-2 y otras proteínas celulares, todavía desconocidas. p53 regula de modo creciente la expresión de Bax, que resulta en inducción de apoptosis (Oltvai y otros, 1993). Los inventores han encontrado pruebas de que la apoptina no reguló el nivel de proteína Bax, mientras que en un experimento similar se demostró que p53 podía hacerlo. Este es otro argumento por el que la apoptina parece no actuar a través de la ruta apoptótica de p53.

Se conoce que las proteínas similares a (ICE) de enzima de conversión de interleuquina-1-beta son las últimas o de una de las últimas etapas en la cascada de decisión del proceso apoptótico (Kumar, 1995). Para examinar si las proteínas similares a ICE pueden jugar un papel en la apoptosis inducida por apoptina, se co-expresó el inhibidor de ICE crmA con apoptina. Los inventores han encontrado pruebas de que la inhibición de las proteínas similares a ICE debida a la expresión de la proteína crmA de la viruela de vaca no tiene como resultado la inhibición de apoptosis inducida por apoptina. No obstante, en un experimento paralelo, se demostró que la expresión de crmA podía reducir apoptosis inducida por p53 (figura 4).

Por lo tanto, los inventores llegan a la conclusión de que la apoptina es muy próxima o se encuentra incluso más allá del punto de no retorno dentro de la cascada de decisión apoptótica. Además, la apoptosis inducida por apoptina no utiliza la ruta apoptótica inducida por p53 o utiliza solamente una parte muy reducida de la misma.

Expresión de apoptina en células humanas normales

Se transfectaron transitoriamente tres tipos de células humanas primarias, es decir, células endoteliales vasculares (HUVEC), células de músculos lisos (HSMC) y células T, con apoptina de tamaño completo de codificación de plásmido (pCMV-fs). Las células que expresaban apoptina fueron rastreadas a través de inmunofluorescencia indirecta con MAb 85,1[8] o 111,3. Se analizó la inducción de apoptosis en células apoptina positivas con ayuda de DAPI ó PI, que efectúan tinción de núcleos intactos regularmente, pero de los apoptóticos irregularmente y/o débilmente (Telford, 1992). Cinco días después de la transfección, solamente 20% aproximadamente de las células primarias expresando apoptina efectuaron tinción de manera anormal con DAPI ó PI (no se muestran datos). Menke y otros (datos no publicados) han indicado para otro sistema de apoptosis que este bajo porcentaje de células anormales DAPI no es debido a un agente específico inductor de apoptosis, sino que es debido a eventos de transfección. Asimismo, los experimentos indicados más adelante demuestran esta afirmación. En experimentos similares, 60-90% de las células malignas conteniendo apoptina se mostraron apoptóticas (Zhuang y otros, 1995, 1995a,b). La localización de apoptina en estas células primarias fue también diferente de la localización en células tumorales. En todas las células normales, la apoptina se encontró en el citoplasma, y no en el núcleo tal como se había observado para diferentes líneas de células tumorales (Zhuang y otros, 1995, 1995a,b). Estos resultados sugieren que la apoptina no induce apoptosis en varias células humanas cultivadas no transformadas, no tumorigénicas, y que la localización celular de la apoptina es importante para su actividad apoptótica.

Expresión de la apoptina de células normales humanas y sus derivados malignos

Los inventores también examinaron la respuesta a la expresión de apoptina en líneas celulares tumorales con respecto a la de células normales de las que habían sido generadas. Con este objetivo, se transfectaron de forma transitoria fibroblastos de piel diploide y queratinocitos de individuos normales y sus oponentes tumorigénicos con pCMV-fs, expresando apoptina de tamaño completo, pCMV-tr, expresando apoptina truncada o un plásmido codificando desmina (pCMV-des). La desmina no tiene actividad apoptótica (Menke y otros, datos no publicados), y se utiliza como control negativo. Cinco días después de la transfección, el porcentaje de fibroblastos VH10 positivos de apoptina (figura 5) y queratinocitos FSK-1 (figura 6), que se había vuelto apoptótico no era superior a 15%. Este nivel de células con tinción DAPI de manera aberrante fue similar para células conteniendo apoptina truncada o desmina. El nivel bajo de apoptosis en estas células positivas de apoptina se puede deber no a inducción específica de apoptina de muerte celular, sino a eventos de transfección.

Para examinar si los fibroblastos tumorigénicos y los queratinocitos eran susceptibles a la apoptina, se transfectaron NW18 y SCC-15 con plásmidos codificando apoptina (de tamaño completo o truncados) o desmina. La apoptina y, en menor grado, la apoptina truncada podían inducir apoptosis en células tumorales NW-18 (figura 5) y SCC-15 (figura 6). Hasta
65-75% de estas células positivas de apoptina eran apoptóticas a los cinco días después de la transfección, lo cual se encuentra dentro de un rango similar al indicado para muerte celular inducida por apoptina en líneas celulares de osteosarcoma (Zhuang y otros, 1995a). El nivel de células NW-18 y SCC-15 positivas de desmina con tinción DAPI anormales no fue significativamente superior al que se encuentra entre fibroblastos y queratinocitos normales (figuras 5 y 6).

La actividad diferencial de la apoptina en células normales y tumorales no se puede explicar por diferentes tasas de proliferación, puesto que éstas son similares para fibroblastos VH10 y células de osteosarcoma Saos-2.

Las observaciones de los inventores muestran que la apoptina no induce apoptosis en fibroblastos y queratinocitos normales, pero lo hace en sus derivados tumorigénicos.

Expresión de apoptina en células transformadas humanas

¿Se requiere tumorigenicidad en la apoptina para inducir muerte celular, o es suficiente la mera transformación de una célula? Para contestar a esta pregunta los inventores han examinado el efecto de la apoptina en fibroblastos no tumorigénicos transformados y queratinocitos. La apoptina, apoptina truncada, y desmina fueron expresadas transitoriamente en fibroblastos transformados por SV40 antes de (Pre) o post (Post) inmortalización, en queratinocitos SVK14 transformados por SV40 e inmortalizados, y en queratinocitos HaCaT transformados de manera espontánea. La apoptina fue capaz de inducir apoptosis en todos estos tipos de células transformadas, en una medida similar a la de las células tumorales (figuras 5 y 6). El porcentaje de células conteniendo apoptina (truncada) que habían resultado apoptóticas fue significativamente más elevado que en células positivas de desmina. Estos datos implican que la apoptina puede inducir apoptosis tanto en células malignas como transformadas.

Algunos agentes quimioterapéuticos y radiaciones pueden inducir apoptosis en células transformadas pero no lo hacen en células no transformadas (Thompson, 1995, McDonell y otros, 1995). La transformación parece provocar cambios que producen una célula más sensible a estímulos apoptóticos. Se sabe que algunas otras proteínas exterminan células tumorales de manera específica. La proteína NS-1 estructural de parvovirus induce lisis celular específicamente en células neoplásicas (VanAcker y Rommelaere, 1995). Asimismo, ha sido construido un adenovirus que expresa bcl-xs que induce apoptosis en carcinoma de seno y colon humanos y en células de neuroblastoma, pero no en células hematopoyéticas normales humanas o en la línea celular de leucemia humana K562 (Clarke y otros, 1995).

Transfección estable de células VH10 con una apoptina que codifica un plásmido

Para excluir que la apoptina tiene una actividad apoptótica menor pero significativa en células VH10 normales, estas células fueron transfectadas de manera estable con pCMV-fs o con pCMV-neo-Bam como control. Los inventores obtuvieron una cantidad similar de colonias en ambas transfecciones. Las células resultantes, transfectadas de manera estable con pCMV-fs, expresaron apoptina que estaba localizada en la región perinuclear (datos no mostrados). Por lo tanto, se puede llegar a la conclusión de que la apoptina no puede inducir apoptosis ni puede inducir el crecimiento de células VH10 normales en ningún otro sentido.

Localización celular de apoptina en células normales con respecto a células transformadas y malignas

Aparte de las diferentes actividades apoptóticas de la apoptina en células malignas y transformadas con respecto a células normales, los inventores han observado también diferencias en la localización celular de la apoptina en estos tipos de células. En células transformadas y malignas, antes de que los cambios morfológicos apoptóticos sean perceptibles, la apoptina es distribuida en forma de gránulos finos, principalmente en el núcleo. Después de que las células han sufrido apoptosis, se agregó apoptina en el núcleo. Como contraste, la localización de apoptina en fibroblastos y queratinocitos normales tiene lugar principalmente en el citoplasma, concentrándose alrededor del núcleo, tanto en forma de pequeños gránulos como agregados más grandes. En células primarias HUVEC, HSMC y T, también se localizó apoptina en estas estructuras perinucleares características. Hasta el momento, en todas las líneas celulares transformadas o malignas estudiadas, la apoptina tenía una localización nuclear, mientras que en todas las células normales analizadas hasta el momento, no la tenía.

Otros investigadores han propuesto que las células transformadas han sufrido mutaciones de pérdida de función, como resultado de lo cual un inhibidor de funcionamiento normal ha quedado fuera de servicio. Debido a estos cambios, el transporte nuclear de proteínas puede ser promovido o impedido en células cancerosas (Csermely y otros, 1995). Es posible que en células normales la apoptina esté asociada a uno o varios factores celulares y/o modificada por los mismos, resultando ello en su localización dentro de estructuras perinucleares. La pérdida de estos factores (funcionales) en células malignas puede permitir que la apoptina entre en el núcleo. La apoptina alberga no solamente secuencias de importación nuclear putativas (Noteborn y otros, 1991, 1994, 1995, Zhuang y otros, 1995, 1995a,b) pero asimismo una región de aminoácido parecida a señales de exportación nuclear (posición 33-46: IRIGIAGITITLSL), similar al del inhibidor de proteína kinasa (PKI) y la proteína HIV-Rev (Wen y otros, 1995, Fischer, y otros, 1995, Gerace, 1995). Puede ser que esta señal de exportación nuclear potencial no puede ser reconocida en las diferentes líneas celulares analizadas malignas y transformadas.

Los resultados que se han descrito indican que la localización nuclear de la apoptina es importante por su capacidad de inducir apoptosis. Esto está de acuerdo con la observación de que la apoptina truncada, que tiene una actividad apoptótica reducida (Figuras 5 y 6), se encuentra parcialmente en el citoplasma. Los estudios con microscopio electrónico con células mononucleares de pollo han revelado que la apoptina se co-localiza con la cromatina celular (Noteborn y otros, 1994). La interacción de la apoptina con cromatina puede tener como resultado el desarrollado de su superestructura. Este último fenómeno se ha descrito para células prostáticas ventrales de rata, que pasaron a ser apoptóticas después de la castración de las ratas (Kyprianou y Isaacs, 1989).

La apoptina como agente antitumoral

Los resultados obtenidos por los inventores indican que la apoptina es un agente antitumoral. En primer lugar, la apoptina es específicamente activa en células malignas y transformadas, pero, como mínimo in vitro, no en las células normales sometidas a prueba. Por lo tanto, el efecto tóxico del tratamiento de apoptina puede ser muy bajo. En segundo lugar, la apoptina induce apoptosis de manera independiente a p53. El hecho de que varios agentes quimioterapéuticos pierden esta capacidad inducida por apoptosis en un gran número de tumores parece estar relacionado a una función p53 alterada. Por lo tanto, la inducción de una ruta apoptótica independiente de p53 puede ser un enfoque útil como candidato alternativo para terapia tumoral. Además, la apoptina no queda aparentemente bloqueada por Bcl-2, que se sabe que está relacionado con el desarrollo, por ejemplo, de tumores leucémicos y que puede inhibir apoptosis inducida por agentes quimioterapéuticos. Además, los inventores han observado que BAG-1, una proteína relacionada con Bcl-2, no es capaz de bloquear la apoptosis inducida por apoptina.

Descripción de las figuras

La figura 1 muestra el efecto de expresión de
E1B-21kD y Bcl-2 sobre la inducción de apoptosis por células VP3 en p53-minus Hep3B. El porcentaje indicado es el de las células positivas en apoptina que son apoptóticas 6 días después de la transfección. Las células fueron co-transfectadas con 2,5 ug de pCMV-VP3 y 5 ug de pCMV-neo-Barn (barras no rayadas), 5 ug de pCMV-E1B21 (barras ralladas), o bien 5 ug de pCMV-Bcl2 de plásmido de ADN (barras de puntos). Como mínimo, se han realizado 3 experimentos independientes. Para cada experimento, se examinaron como mínimo 200 células positivas de apoptina.

La figura 2 muestra el efecto de las proteínas E1B-21K y Bcl-2 en la inducción de apoptosis por p53 en la línea celular Hep3B. Las células fueron co-transfectadas con 2,5 Êug de pCMV-p53 y 5 Êug de pCMV-neo-Bam, 5 ug de pCMV-E1B21K, o 5 ug de pCMV-Bcl2 ADN plásmido. Se llevan a cabo dos transfecciones independientes. Las células fueron analizadas 4 ó 5 días después de la transfección. El porcentaje indicado es el de las células positivas p53 que eran apoptóticas. Para cada experimento, se examinan como mínimo 200 células positivas de p53.

La figura 3 muestra el efecto de la expresión de Bcl-2 y Bag-1 en apoptosis inducida por p53 o apoptosis inducida por apoptina. Las células Saos-2 fueron co-transfectadas con 2,5 ug de pCMV-fs, y 5 ug de pCMV-Bcl-2, pCMV-Bag-1, o PCMV-Bag-1 y pCMV-Bcl-2. En un experimento paralelo, las células fueron co-transfectadas con 2,5 ug de pCMV-p53 y 5 ug pCMV-Bcl-2, pCMV-Bag-1 o pCMV-Bag-1 y pCMV-Bcl-2. Como controles, se co-transfectaron pCMV-p53 o pCMV-fs con pCMV-neo-Bam. Se llevaron a cabo, como mínimo, 3 experimentos independientes de ambas series. Las células fueron recogidas 4 días después de la transfección. Esto indica porcentaje de células p53 o apoptina positivas que han resultado apoptóticas. Para cada experimento se han examinado, como mínimo, 200 células.

La figura 4 muestra el efecto del inhibidor ICE crmA en la inducción de apoptosis p53 o inducida por la apoptina. Se co-transfectaron células Saos-2 con 2,5 ug pCMV-fs y 5 ug pCMV-crmA (+crmA) o pCMV-neo-Bam (-crmA). En paralelo, se co-transfectaron células con 2,5 ug pCMV-p53 y 5 ug pCMV-crmA o pCMV-neo-Bam. Se llevaron a cabo dos experimentos independientes. Las células fueron recogidas 5 días después de transfección. Se ha indicado el porcentaje de las células p53 o apoptina positivas que han pasado a ser apoptóticas. Para cada experimento, se examinaron, como mínimo, 200 células positivas.

La figura 5 muestra la actividad de apoptina en fibroblastos humanos transformados o malignos con respecto a normales. El porcentaje de células que han producido tinción de manera anormal con DAPI se indica como medida relativa para apoptosis en fibroblastos VH10 normales con respecto a transformados (Pre, Post) y tumorales (NW18), transfectados de manera transitoria con pCMV-fs, pCMV-tr o pCMV-des. Las células fueron fijadas cinco días después de transfección y analizadas por inmunofluorescencia indirecta. Los resultados son las medias de, como mínimo, tres experimentos independientes. En cada experimento, como mínimo, 200 células de tamaño completo o truncadas positivas de apoptina o desmina fueron sometidas a examen. Las células fueron fijadas 5 días después de transfección y analizadas por inmunofluorescencia indirecta.

La figura 6 muestra la actividad de apoptina en queratinocitos transformados o malignos con respecto a normales. El porcentaje de células que ha realizado tinción anormal con DAPI se indica como medida relativa para apoptosis en queratinocitos normales (FSK-1) con respecto a transformados (SVK14, HaCAT) y tumorales (SCC-15), transfectados transitoriamente con pCMV-fs, pCMV-tr, o
pCMV-des. Las células fueron fijadas cinco días después de transfección y se analizaron por inmunofluorescencia indirecta. Los resultados son las medias de, como mínimo, tres experimentos independientes. En cada experimento, como mínimo, se examinaron 200 células de tamaño completo o truncadas positivas y de apoptina o desmina.

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Claims (3)

1. Método para la distinción entre células humanas transformadas y/o malignas y/o tumorales y células humanas normales, comprendiendo las etapas de disponer dichas células in vitro con proteína vírica 3 (VP3; apoptina) y detectar la presencia o ausencia de actividades apoptóticas de la apoptina en células humanas malignas y transformadas con respecto a células humanas normales.

2. Utilización de un vehículo para la preparación de un medicamento para la prevención de incidencias malignas, en la que dicho vehículo es utilizado para facilitar un ácido nucleico de interés a una célula diana humana transformada no inmortalizada, y en la que dicho vehículo comprende un gen que codifica apoptina o un fragmento o un derivado que provoca apoptosis en células humanas transformadas y no lo provoca en células humanas normales.

3. Utilización de un vehículo que comprende un gen que codifica una substancia tumoricida y una fracción diana que tiene afinidad de unión para una molécula asociada principalmente, pero no exclusivamente, con la superficie de una célula de tumor humano, para la preparación de un medicamento para terapia tumoral dirigida para suministrar un gen que codifica una substancia tumoricida a una molécula asociada principalmente, pero no exclusivamente, con una célula tumoral humana, caracterizada porque la substancia tumoricida es apoptina o un fragmento de un derivado de la misma, que provoca apoptosis en células humanas transformadas y que no la provoca en células humanas normales.