JPH11506340A

JPH11506340A - アポプチンの利用と方法

Info

Publication number: JPH11506340A
Application number: JP9500327A
Authority: JP
Inventors: ヒューベルツスマリアノーテボルン，マテウス
Original assignee: アエスキュラープビー．ヴィ．
Priority date: 1995-06-07
Filing date: 1996-06-07
Publication date: 1999-06-08
Also published as: ATE241808T1; AU718422B2; DE69628431T2; EP0830604A1; CA2221495C; AU5913696A; ES2200065T3; EP0830604B1; CA2221495A1; NZ309171A; PT830604E; WO1996041191A1; DE69628431D1; DK0830604T3

Abstract

(57)【要約】本発明は、ヒト正常細胞においてアポプチンがアポプトーシスを誘発しないことを提示する。その上、本発明は、アポプトーシスが多様なヒト腫瘍細胞においてｐ５３アポプトーシスを誘発することおよびアポプチンが数種類のアポプトーシス阻害剤によって阻害されないことを開示する。本発明は、特に腫瘍細胞を殺すが、正常細胞は殺さない抗腫瘍薬からなることを特徴とする。さらに、本発明は、遺伝子療法により細胞死の誘発を提供する。アポプチンは、哺乳類の腫瘍細胞においてアポプトーシスを誘発することができる。本発明は、正常細胞ではアポプチンが細胞質に主に見られ、一方腫瘍細胞では細胞核に存在していたことを指す。また、本発明は細胞の変形活性を見極める診断テストからなることを特徴とする。

Description

【発明の詳細な説明】アポプチンの利用と方法発明の要約本発明は、アポプチンまたはその誘導体、その機能的部分の利用と方法に係るものであり、アポプチンはニワトリ貧血ウイルスのウイルス性蛋白質（ＶＰ３）を指す。それだけでなく、上記アポプチンの新しい誘導体を提示する。アポプチン自体とそのアポトーシス誘発作用は過去に開示されている（下記参照）。しかし、それら過去の開示においては、アポプチンと他のアポトーシス誘発剤の違いはまったく指摘されなかった。われわれは今回、アポプチンが実際は他のアポトーシス誘発剤とは非常に異なること、したがって異なる利用のための異なる方法に応用できる可能性があることに気付いた。従来のアポトース誘発剤は、それが存在するどのような細胞においてもアポトーシスを誘発したが、今回われわれはアポプチンが変形した細胞や腫瘍細胞でのみアポトーシスを誘発することを発見した。このように、発明の１つの具体化として、抗腫瘍療法が挙げられる。アポプチンは、抗腫瘍療法に応用してもほどんど毒性がない。なぜなら、アポプチンは腫瘍細胞においては細胞死を引き起こす可能性が高いが、正常な非変形・非悪性細胞ではその可能性があったとしても非常に低いからである。また、本発明はアポプチンが数種類の抗アポトーシス阻害薬によって阻害されないことを開示する。特に、アポトーシスは多様な（化学）療法薬によって誘発されるが、アポプチンの作用は、アポトーシスの媒介において必須の要素として知られるｐ５３−アポトーシス経路とは異なっている。本発明はさらに、アポプチンが多様なタイプの哺乳類の腫瘍細胞においてアポトーシスを誘発する可能性があるとの知見を開示する。また、本発明は、アポプチン誘発型アポトーシスを起こす可能性のある細胞内の、アポプチンの局在性の違いに係るものである。すなわち、ヒトの変形および悪性細胞と、アポプチン誘発型アポトーシスに感受性を持たない細胞、つまりヒト正常細胞との比較である。局在性の違いは、細胞が正常か変形および／または悪性化しているかを分析する診断アッセイとして用いられている。発明の背景 Jurrissenら（1992b）は、対照群ニワトリの胸腺では認められなかった多くの現象を、ニワトリ貧血ウイルス（ＣＶＡ）を接種した特異的病原体不在ニワトリの胸腺において観察した。感染１０日後、皮質全体が、クロマチンが細胞核膜に隣接した部位に凝縮した細胞を含んでいた。球状に近い電子凝縮体が、上皮細胞の細胞質に散在してるのが認められた。感染１３日後、胸腺細胞からは皮質が大量に奪われていたが、上皮細胞の多くは電子濃縮体や他の非リンパ細胞を含んだ状態でまだ存在していた。ＣＡＶのさまざまな分離体に感染したニワトリの胸腺から分離したＤＮＡは、電子フェログラムにおいて、オリゴヌクレオソマル崩壊の典型的ラダーリングを示した。このような形態的細胞変化および生化学的変化が観察されたが、これらの変化はＣＡＶに感染した培養鳥由来リンパ芽球状細胞においても観察された。上記の現象は、プログラムされた細胞死またはアポトーシスの生理的プロセスに特徴的なものである。アポトーシスは細胞の収縮、細胞核の分裂、ＤＮＡの凝縮、ＤＮＡのdomain-sized fragmentsへの分裂を特徴とし、ほとんどの細胞ではインターヌクレオソマルの崩壊への続く。最終的には、アポトーシス細胞は包膜体に分裂し、包膜体は隣接する細胞によって急速に食される。したがって、アポトーシスは、非生理的タイプの細胞死である壊死に比べて、組織崩壊が少ない(W yllie et al.，1980，Arends and Wyllie，1991)。アポトーシスは連続した事象である。一般的に、アポトーシスのプロセスはいくつかのステージに分けることができる。ステージ１．アポトーシスの誘因多くの異なる外的および内的動因がアポトーシス・プロセスの誘因となりうる。ステージ２．アポトーシス誘因を媒介しうる要因このステージの主な役割は、腫瘍抑制蛋白質ｐ５３などが果たす。ステージ３．Ｂａｘなどの要因によるアポトーシス・シグナルの増大ステージ４．ＩＣＥセリンプロテアーゼ系物質の活性化これら特異的プロテアーゼが活性化すると、たちまち可逆性が失われる。成長要因（ステージ２．を阻害）、Ｂｃｌ−２（ステージ３．）、ｃｒｍＡ（ステージ４．）など、既知のアポトーシス阻害要因は、アポトーシス・プロセスの決定的ステージの異なるステージでアポトーシスを阻害することが知られている。ステージ５．アポトーシス・シグナルの完成。ＤＮＡの凝縮および分裂など(W hite，1996)。培養したニワトリ分子細胞の感染後まもなくは、ＣＡＶコード化された蛋白質アポプチン（ＶＰ３とも呼ばれる）は細胞クロマチンと共存している。感染後しばらくすると、アポプチンは集合体を形成し、細胞がアポトーシスを起こす。すなわち、細胞内ＤＮＡが分裂し、その結果として凝縮するということである(Not eborn et al..，1994)。イミュノゴールド電子顕微鏡によって、アポプチンがアポトーシス構造内に存在することが示された。インビトロでは、ニワトリにおけるアポプチンの発現は、リンパ芽球Ｔ細胞の変形を惹起し、骨髄細胞がこれら細胞のアポトーシスを誘発した。これらのデータは、ＣＡＶ感染細胞においてアポプチンがアポトーシス経路の誘因となることを示している(Noteborn et al．199 4，Noteborn and koch，1995)。アポプチンは小さな蛋白質で、長さはアミノ酸わずか１２１個、どちらかといえば基本的な蛋白質であり、プロリンが豊富である(Noteborn at al.，1991)。アポプチンは細胞クロマチン構造内だけに存在する。アポプチンのＣターミナル・ベーシック・ストレッチの先端を切ると、細胞核が減少し、アポトーシス作用が有意に低減した（Noteborn at al.，1994）。アポプチンが小さな蛋白質であることとどちらかというと基本的性格を持つことが、クロマチン構造内でのヒストン蛋白質および／または非ヒストン蛋白質との相互作用を可能にしているのかもしれない。アポトーシスは、余剰な細胞や変形した細胞、悪性細胞を除去するための、プログラムされた活発な生理的プロセスである（Earnshaw，1995）。アポトーシスのプロセスはさまざまな調節刺激によって開始される（Wyllie，1995，and Whit e，1996）。細胞生存率の変化は、ヒトの病因、たとえば細胞増殖の増大だけでなく細胞死の減少によっても惹起される癌の進行において、重要な役割を果たす（Kerr et al.，1994）。さまざまな化学療法薬や放射線療法が、腫瘍細胞におけるアポトーシス誘発を証明してきたが、その多くはワイルドタイプｐ５３を介している(Thompson，1995，Bellamy et al.，1995，Steller，1995，Kaufman，1 989，McDonell et al.，1995，Lowe et al．and Fisher，1994)。しかし、多くの腫瘍はその進行中にｐ５３における突然変異を起こし、多くの場合は癌治療への反応が乏しいことと相関関係がある(Hooper，1994)。（白血病患者の）腫瘍では、腫瘍形成遺伝子Ｂｃｌ−２の発現レベルが高いことと、さまざまなアポトーシス誘発化学療法薬に対する抵抗が強いことの間に関連が認められる場合がある(Hockenberry，1994，Kerr et al.，1994，Sachs and Lotem 199 3)。アポプチンはアポトーシス・ヒト悪性細胞ラインを誘発する可能性がある（No teborn and Koch，1994)。われわれは、アポプチン誘発アポトーシスが起こるのは、機能的ｐ５３が存在しない場合であり（Zhuang et al.，1995a）、Ｂｃｌ− ２およびＢＣＲ−ＡＢＬによって遮断されない（Zhuang et al.，1995）ことを確認した。したがって、アポプチンは、機能的ｐ５３の欠乏およびＢｃｌ−２とＢＣＲ−ＡＢＬの（過）発現によりアポトーシスの（化学）療法誘発に対する耐性を獲得した腫瘍細胞の破壊に有用である。発明の詳細本発明は、（ヒトなどの）悪性細胞および変形細胞と正常細胞における、アポプチンの作用を開示するもである。アポプチンはプライマリＴ細胞や内皮細胞、平滑筋細胞ではアポトーシスを誘発しない。正常細胞は、変形するとアポプチンに反応しやすくなる。正常細胞では、アポプチンはほとんど細胞質に存在するが、腫瘍細胞では細胞核に存在していた。アポプチンは特異的に変形／悪性化した細胞の低減に用いることができる。したがって、アポプチンの抗癌剤としての可能性は非常に高い。アポプチンの発現は、特異的な（ヒト）腫瘍細胞のアポトーシス誘発に利用しうる。アポプチンは正常細胞ではアポトーシスをまったく、あるいは少なくとも有意には誘発しない。つまり、アポプチン治療の毒性が低いといえる。本発明は、アポプチンが変形し、非不死化した細胞においてアポトーシスを誘発できることを開示し、アポプチンのアポトーシス作用が、細胞の変形の初期にすでに可能であることを示唆する。したがって、アポプチンは、治療済みの細胞が変形や悪性化へ向かうことを防ぐための、他の（たとえば、遺伝子または化学）療法の一部として利用できる。アポプチンは、ＤＮＡトランスフェクションによって腫瘍内で（一時的に）発現させられる。（腫瘍）細胞におけるアポプチンの発現は、アポプチンのコーディング・シークエンスを含む（レトロ）ウイルス性ベクターに細胞を感染させることによっても可能である。さらに、アポプチン蛋白質および／またはアポプチンのコーディング・シークエンスを含有する非ウイルス性要素（リポゾームまたはtransferring-derivedベクターなど）を細胞に投与して、アポプチンの発現／存在と腫瘍細胞におけるアポトーシスの誘発を招くこともできる。われわれはさらに、アポプチンがｐ５３誘発アポトーシス経路と異なることを証明した。アポプチンが機能的ｐ５３を必要としないという事実に加え、アポプチンは、Ｂｃｌ−２（に類似した）蛋白質などのｐ５３アポトーシス経路阻害薬や、ＩＣＥに類似したプロテアーゼ作用を遮断する牛痘蛋白質ｃｒｍＡによって遮断されることがない。これら遮断薬は、ｐ５３誘発アポトーシス経路の異なるステージで介入する。一方、アポプチンは、これらアポトーシス阻害薬によって遮断されるアポトーシス経路とは全く別のアポトーシスを誘発するか、それらの後の段階で作用するのかもしれない。これらのデータは、アポプチンが腫瘍細胞のアポトーシス誘発物質として非常に有効性が高いことを示唆しており、アポプチンは変形細胞や悪性細胞における抗アポトーシス作用の（分析されたすべての）遮断を克服しうる。したがって、アポプチンは非常に多様な腫瘍（細胞）の抗腫瘍薬として、有効性が高い。正常な細胞と変形／悪性細胞におけるアポプチンの局在性の相違を、細胞が変形／悪性化したかどうかを見極める診断テストに用いることができる。ヒト腫瘍細胞におけるアポトーシス誘発以外に、アポプチンは他の哺乳類の腫瘍細胞においてもアポトーシスを誘発しうることをわれわれは証明した。本発明は、さまざまな哺乳類の癌治療に利用することができる。このように、本発明は、腫瘍殺傷物質を運搬する媒介物、または主に腫瘍細胞に対して効果を持つが腫瘍細胞だけに効果をもつわけではない腫瘍殺傷物質をコード化した遺伝子を提供する。本発明の特徴は、腫瘍殺傷物質はアポプチンまたは機能的にアポプチンと同等の物質だという点にある。先行技術では、細胞毒性薬剤を運ぶ多くの媒介物や先駆物質が開示されてきた。細胞毒性薬剤を運ぶ場合の主な問題は、それらが腫瘍細胞（本発明では変形／悪性細胞または腫瘍細胞と呼ぶ）だけでなくすべての細胞に有害だということである。したがって、細胞毒性物質を腫瘍細胞に的をしぼって運ぶための多くのさまざまな方法が研究されてきた。今日、それらターゲティング・モイエティの多くが知られているが、そのどれもが腫瘍細胞に対し完全に特異的とはいえないという欠点を持っている。したがって、このような細胞毒性物質の利用は、現在のところ大きな成功を収めていない。アポプチンが発見された当時、高度に特異的なターゲティング・モイエティが必要だという点で、アポプチンも同じ欠点を持つと考えられた。今回われわれは、アポプチンにはそれが必要ないということを突き止めた。アポプチンは腫瘍細胞に対してのみ有意な効果を発揮し、正常な細胞には作用しない。このように、ターゲティング・モイエティまたはアポプチン（またはその機能的同等物質）を運ぶ他の方法の特異性がそれほど高くなくとも、正常な組織に対する毒性はほどんどない。このように、本発明は、主に腫瘍細胞の表面にあるが腫瘍細胞の表面だけに関わるとはいえない分子とアポプチンまたはその機能的同等物質を親和結合させるターゲティング・モイエティを用いた、腫瘍特異的療法に有用な発明である。アポプチンの機能的同等物質は、アポプチンの一部であれ誘導体であれ、アポプチンと同種の作用を持つものであればよいが、その量は異なるだろう。ターゲティング・モイエティは、ターゲット分子に対し特異的な結合作用を持つ分子として定義される。インターナリゼーションが可能であることが望ましい。ターゲット分子は抗源またはエピトープかもしれない。その場合、ターゲティング・モイエティは抗体またはその一部、または誘導体となる。ターゲット分子が受容体の場合は、その受容体のリガンドがターゲティング・モイエティとなる。これらは、適切な組み合わせの例にすぎない。ターゲティング・モイエティとアポプチンの結合に唯一必要なことは、結合する両者の機能が維持されることである。このように、これは（不安定な）化学的結合であり、融合蛋白質であるかもしれない。ターゲティング・モイエティに包まれアポプチン（またはアポプチンをコード化した遺伝子）などに満たされたリポソームの場合さえあるかもしれない。本発明は、遺伝子療法を用いて、アポプチンをコード化した遺伝子を腫瘍細胞へ運ぶ媒介物をも含む。遺伝子療法には、アデノウイルスやレトロウイルスなどのウイルスを使用して細胞に遺伝子を運ぶ、よく知られた方法が多くある。この技術に優れた人であれば、正しい媒介物の選択のしかたを知っているだろう。アボプチンがアポトーシスを誘発するのは変形細胞に限られるため、アポプチンまたはその遺伝子は、遺伝病の遺伝子欠損を修正するなどの腫瘍療法よりは、むしろ他の遺伝子療法の管理における安全対策として用いることができる。その場合に、アポプチンは運ぶべき遺伝子とともに遺伝子運搬媒介物に入れられる。運ぶべき遺伝子が挿入された細胞が悪性化した場合は、その細胞はアポプチンの作用を受けやすくなる。このように、本発明は運ぶべき核酸を、ターゲット細胞に運ぶ媒介物を提供する。この媒介物はアポプチンをコード化した遺伝子またはアポプチンの機能的同等物である。本発明は、アポプチンを初めて本格的に実現可能なものとして医用使用しようとするものであり、このような利用法も本発明の一部を成す。このように、アポプチンまたはその機能的同等物を利用して、ターゲット細胞数を低減するが、その方法は主にターゲット細胞に特異的であるがその特異性は完全ではなく、アポプチンまたはその機能的同等物は細胞毒性物質である。また、ターゲット細胞が他のアポトーシス誘発剤に対し感受性が低い場合に、アポプチンまたはその機能的同等物を、ターゲット細胞の低減法として用いる。後者が可能であるのは、他のアポトーシス誘発物質を阻害する機序によって、アポプチンが阻害されないためである。変形していない細胞の除去にアポプチンが用いられる場合は、細胞核ローカライゼーション・シグナルを備えたアポプチンまたはその機能的同等物を供することによって、これを達成することができる。アポプチンは細胞核内に存在する必要があるため、これは結果的にアポトーシスを招来する。上記のシグナルが備わっていない場合は、（ここに開示したように）アポプチンは細胞核外にとどまり、有意な効果が得られないだろう。このように、細胞核ローカライゼーション・シグナルを備えたアポプチンは、ターゲット細胞の細胞数低減方法として用いることができる。細胞核ローカライゼーション・シグナル（ＮＬＳ）は、この領域ではよく知られている。また、ＮＬＳやアポプチンをコード化した融合遺伝子を使用することも可能である。アポプチンは正常細胞と変形細胞では異なる局在性を示すため、正常細胞と変形細胞を見分けるための診断ツールとして用いることができる。このように、本発明は、細胞にウイルス性蛋白質３（ＶＰ３；アポプチン）を運ぶ方法と、細胞内の上記ウイルス性蛋白質の局在性を検出する方法を含んでおり、変形および／または悪性および／または腫瘍細胞と正常細胞を区別する方法を提示する。局在したアポプチンは、抗体などによって検出できる。本発明は、下記の実験の項でさらに詳細に説明する。これは、例証を目的とするものにすぎず、本発明の保護範囲を制限するものと解釈されるべきではない。実験ヒトプライマリ細胞の分離Ｆｉｃｏｌ遠心分離法を用いて、正常な血液ドナー６例のヒトプライマリＴ細胞を分離し、６％のヒト血清と０．８ｕｇ／ｍｌのフィトヘマグルチニンを含有するＲＰＭＩ−培養液で培養した。３日後、培養液を新しいものに取り替え、１ｍｌ当たり３００ユニットのインターロイキン−２を加えた。臍帯からヒトプライマリ平滑筋細胞（ＳＭＣ）と管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を分離した。ＳＭＣは、ＥＣＧＦとヘパリンを補充したＣＭ１９９培養液で培養した。ＨＵＶＥＣは、１０％の子牛胎児血清を含むＤＭＥＭ培養液で培養した。ＤＮＡプラスミドＣＡＶＤＮＡシークエンスは元来どれも、プラスミドＤＮＡｐＩｃ−２０Ｈ／ＣＡＶ−ＥｃｏＲＩから採取される（Noteborn and De Boer，1990）。プラスミドＤＮＡのクローニング・ステップはすべて、原則的にManiatis et al．(1 982)による方法に従って実行された。かつてｐＣＭＶ−ＶＰ３と呼ばれていた発現プラスミドｐＣＭＶ−ｆｓは、アポプチンのみをコード化するＣＡＶＤＮＡシークエンスを含む(nt 427-868)。プラスミドｐＣＭＶ−ｔｒは、先端を切ってＣ−ターミナル１１アミノ酸を欠くアポプチンをコード化する（Zhuang et al.，1995a）。ｐＣＭＶ−ｄｅｓは、アポトーシスを誘発しない筋細胞に認められる構造的蛋白質であるｄｅｓｍｉｎをコード化する（Menke et al.，非公開データ）。発現プラスミドｐＣＭＶ−ＢＡＧ−１（Noteborn，M．H．M.，非公開データ）、ｐＣＭＶ−ＢｃＬ−２（Zhuang et al.，1995b）、ｐＣＭＶ−ｃｒｍＡ（Noteborn，M．H．M.，非公開データ）は、それぞれＩＣＥに似たプロテアーゼを阻害し、抗アポトーシス蛋白質ＢＡＧ −１、Ｂｃｌ−２および牛痘ｃｒｍＡ蛋白質を発現する。発現プラスミドｐＣＭＶ−Ｅ１Ｂ２１Ｋは、アデノウイルスＥ１Ｂ２１ｋＤａ蛋白質と、腫瘍抑制蛋白質ｐ５３であるｐＣＭＶ−ｐ５３を発現する（Zhuang et al.，1995）。一時的に発現した遺伝子はすべて、サイトメガロウイルス・プロモータの調節下にある。ヒトの正常な、形質転換された、および悪性の角化細胞ならびに繊維芽細胞ヒト角化細胞を包皮から単離し、１３７Ｃｓで致死量的に照射したマウスの３Ｔ３繊維芽細胞の層の存在下で成長させた。ヒト表皮角化細胞（ＦＳＫ−１）の１次培養を、文献記載（Rheinwald and Green，1975）の完全培地に僅かの変更を加えたものの中で開始した。ヒトの正常な包皮の二倍体ＶＨ１０繊維芽細胞（Klein，1990）を、１０％のウシ胎児血清を補充したＤＭＥＭの中で成長させた。ＳＶ４０で形質転換した腫瘍発生的のＮＷ１８繊維芽細胞（Weissman and Stanbridge，1983）を、８％のウシ胎児血清を補充したＭＥＭ培地の中で成長させた。偏平上皮細胞腫瘍から誘導した腫瘍発生的化細胞であるＳＣＣ−１５（Rheinw ald and Beckett，1981）を、５％のウシ胎児血清、０．４μｇ／ｍｌのハイドロコーチゾンおよび１μＭのインブロテレノールを含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２（３：１）培地の中で培養した。 B．Kleinら（1990）が記載しているようなＳＶ４０−形質転換繊維芽細胞である前分利（ｐｒｅ−ｃｒｉｓｉｓ）（Ｐｒｏ）および後分利（ｐｏｓｔ−ｃｒｉｓｉｓ）（Ｐｏｓｔ）を、８％のウシ胎児血清と共にＭＥＭ培地の中で成長させた。自動的形成変換角化細胞株のＨａＣａＴ（Boukampら(1988)）は、Prof．Dr. Fusenig（DKFZ，Heidelberg，Germany）から恵与されたものである。ＨａＣａＴ細胞を、１０％のウシ胎児血清を補充したＤＭＥＭ培地の中で成長させた。ＳＶ４０で形質転換した角化細胞株ＳＶＫ１４（Taylor-Papadimitriouら、1982）細胞を、ＳＣＣ−１５細胞におけると同じ培地で培養した。ＤＮＡトランスフェクションプラスミドＤＮＡを、ＣｓＣｌ勾配中での遠心分離およびセファクリルＳ５００（Pharmacia）中でのカラムクロマトグラフィーで精製した。フェトヘマググルチニンで刺激した１次ヒトＴ細胞を、文献記載（Notebornら、1994）のようにＤＥＡＥ−デキストランの存在下でトランスフェクトした。マウスのクリップ（Ｃｒｉｐ）細胞ならびにヒトのＨｅｐ３Ｂ、ＶＨ１０，Ｐｒｅ −とＰｏｓｔ−およびＮＷ１８細胞、ＨＵＶＥＣｓおよびＳＭＣｓを、文献記載（Graham and Van der Eb，1973）のようにして燐酸カルシウム沈澱法によりプラスミドＤＮＡでトランスフェクトした。ＦＳＫ−１、ＨａＣａＴ，ＳＶＫ１４およびＳＳＣ−１５細胞をＤＯＴＡＰ「Ｄ．Ｆｉｓｃｈｅｒ、結果未発表」でトランスフェクトした。免疫蛍光法Ｔ細胞を懸濁状態で成長させ、顕微鏡のスライドグラス上に固定した。これ以外のすべての細胞は、被覆した顕微鏡スライドグラス上で成長させた。細胞を室温で１０分間８０％アセトンで固定し、文献記載（Notebornら 1994）のようにして間接的免疫蛍光法のために使用した。トランスフェクトした細胞中の（トランケートされた）アポプチンの存在および／または細胞内位置を示すために、マウスのモノクローナル抗体（ＭＡｂ）ＣＶＩ−ＣＡＶ−８５．１（８５．１）（Notebornら、1991）とＣＶＩ−ＣＡＶ−１１１．３（１１１．３；Ｋｏｃｈ、データ未発表）を用い、またヒトのデスミンのためにはマウスＭＡｂ３３（Mono san，Uden，オランダ）を用いた。フルオレセインイソチオシアネートで標識したヤギの抗マウス抗体（Jackson Immunoresearch Laboratories，Inc.，West Greove，PA）を２次抗体として用いた。核ＤＮＡを、２、４−ジアミジノー２ーフェニルインド−ル（ＤＡＰＩ）又はヨウ化プロピジウム（ＰＩ）で染色した。ＶＨ１０細胞の安定なＤＮＡトランスフェクションヒトの正常の二倍体ＶＨ１０繊維芽細胞を、フルサイズのアポプチン又はｐＣＭＶ−ｎｅｏ−Ｂａｍを発現しアボブチンをコードしているＣＡＶ配列のない空のプラスミドのｐＣＭＶｆｓで安定にトランスフェクトした。安定なクローンを、顕微鏡のスライドグラス上で成長させ８０％アセトンで固定したＧ４１８培地を用いて選択した。アポプチンの発現を、ＭＡｂ８５．１を用いる間接的免疫蛍光法で分析した。結果と討論マウス腫瘍細胞中のアポプチンのインビトロ発現我々は、アポプチンが非ヒト起源の哺乳動物腫瘍細胞中でもまたアポプートシスを誘発できるか否かを調べた。したがって、マウス腫瘍細胞系Ｃｒｉｐ（Dano s，1988）の細胞を、アポプチンをコード化するｐＣＭＶ−ｆｓＤＮＡでトランスフェクトした。トランスフェクションから３日後に細胞を固定した。免疫蛍光法とＰＩ染色法を用い、アポプチンの発現についておよびそれらがアポプトーシス化（apoptotic）になるか否かについて細胞を調べた。トランスフェクションから３日後には、アポプチン含有のマウス腫瘍細胞の５４％がアポプトーシス的になっていた。これらの結果は、アポプチンが種々の哺乳動物腫瘍細胞系においてアポプトーシスを誘発できることを示すものである。Ｈｅｐ３Ｂ細胞では、アポプチン誘発のアポプトース経路は、ｐ５３誘発のアポプトース経路とは異なる。最近、我々はワイルドタイプｐ５３の非存在下、アポプチンが骨軟骨腫細胞内でアポプトーシスを誘発することを示した（Zhuangら、1955，"Noteborn and Ko ch"，1994）。Chiouら（1994年）ならびにDebbasとWhite（1993年）は、Ｂｃ１ −２ならびにアデノウイルス５（Ａｄ５）Ｅ１Ｂ２１Ｋ蛋白質が、ｐ５３より下流側で作用することによりｐ５３−誘発／媒介アポプトーシスを遮断することができる旨の証拠を提供した。我々は、Ａｄ５Ｅ１Ｂ２１Ｋ蛋白質とＢｃ１−２が、ｐ５３依存のアポプトーシスと比較して、アポプチン誘発のアポプトーシスのｐ５３非依存経路を阻害し得るか否かを調査した。最後に、我々は、ヒト血腫Ｈｅｐ３Ｂセルライン中でアポプチンまたはｐ５３とともに、これら蛋白質の発現効果を研究した。Ｈｅｐ３Ｂを、アポロチンとｐＣＭＶ−ｎｅｏ−ＢａｍＤＮＡ（ネガティプコントロール）をコード化するｐＣＭＶ−ｆｓと、Ａｄ５Ｅ１Ｂ２１Ｋ蛋白質をコード化するｐＣＭＶ−Ｅ１Ｂ２１ＤＮＡ、あるいはヒトＢｃ１−２をコード化するｐＣＭＶ−Ｂｃ１−２（Zhuangら、1995b）といっしよに、トランスフェクションさせた。アポプチン発現細胞の数を、細胞がアポプトーシス化した場合には、弱かったりおよび／または不規則である蛍光抗体間接法やＤＡＰＩ−染色法によって審査した。驚くべきことに、トランスフェクション後のいくつかの時点において、アポプトーシス化したアポプチン発現Ｈｅｐ３Ｂ細胞の割合は、アポプチンとＥ１Ｂ− ２１Ｋの両方あるいはアポプチンとＢｃ１−２の両方を含むＨｅｐ３Ｂ細胞と類似していた。簡素化するために、トランスフェクションから６日後に得られたデータのみを、図１に示す。Ｅ１Ｂ−２１ＫまたはＢｃ１−２が、実際、Ｈｅｐ３Ｂ細胞中で抗アポプトーシス効果を有することを示すため、我々は、これら２つの蛋白質がＨｅｐ５３細胞中のｐ５３の過発現に起因するアポプトーシスを阻害し得るか否かを調査した。ワイルドタイプのｐ５３（Bakerら、1990）をコード化するｐＣＭＶ−５３とｐＣＭＶ−Ｅ１Ｂ２１と共に、Ｈｅｐ３Ｂ細胞を発現させることに較べて、プラスミドｐＣＭＶ−ｐ５３とｐＣＭＶ−Ｅ１Ｂ２１またはｐＣＭＶ−Ｂｃ１２と共に発現させることによって、蛍光抗体法やＰＩ染色法（図２）によって分析した如く、ｐ５３誘発のアポプトーシスは、大幅に減少した。かくして、アポプチン誘発アポプトーシスにおいて、Ｅ１Ｂ２１ＫやＢｃ１− ２蛋白質の効果がないことは、これら蛋白質がｐ５３誘発アポプトーシス経路を阻害することができるため、Ｈｅｐ３Ｂ細胞中で発現した蛋白質の非機能性によっては、説明することができない。アポプチン誘発アポプトーシスは阻害できなくとも、Ｅ１Ｂ２１ＫとＢｃ１２が、まだＨｅｐ３Ｂ細胞内で、ｐ５３規制アポプトーシス経路に消極的に影響し得ると云う事実は、少なくともＨｅｐ３Ｂ細胞内では、ｐ５３依存アポプチン誘発性ｐ５３非依存アポプトーシス経路は、別のルートであろうことを示唆している。大多数の腫瘍においては、種々の化学療養剤中でアポプトーシスが誘発できないという事実は、ｐ５３の分裂機能と関連しているように思われる（Loweら、19 93）。それ故、ｐ５３非依存アポプトーシス経路の誘発は、腫瘍療法の代替法として、有用なアプローチである。Ｓａｏｓ−２細胞内のアポプチン誘発アポプトーシス経路の特徴付けアポプチン誘発アポプトーシス経路は、ｐ５３誘発のものとは、異なるものと思われる（前述）。アポプトーシス経路を経由する腫瘍形成に含まれることが知られているＢｃ１−２は、アポプチン誘発アポプトーシスを遮断することはできなかったが、ｐ５３経路を遮断することはできた。最近になって、アポプトーシスの場合のように思われるため、所謂、Ｂｃ１−２非依存アポプトーシスを阻害するためには、Ｂｃ１−２とＢａｇ−１（Takayamaら、1995）といっしょに用いることが必要であろうとの報告が、他よりなされた。Ｂａｇ−１が、それ自身またはＢｃ１−２との併用において、アポプチン誘発のアポプトーシスに消極的に影響するか否かを調査するために、Ｓａｏｓ−２細胞ｐＣＭＶ−ｆｓとｐＣＭＶ−Ｂｃ１−２、またはｐＣＭＶ−Ｂａｇ−１、またはｐＣＭＶ−Ｂｅ１−２とｐＣＭＶ−Ｂａｇ−１に対してコトランスフェクションを施した。平行して、コントロールとして、ｐ５３についても、同様にコトランスフェクションを施した。Ｂａｇ−１やＢａｇ−１とＢｃ１−２の組み合わせは、アポプチン誘発アポプトーシスを阻害しなかったが、ｐ５３誘発アポプトーシスは、Ｂａｇ−１やＢａｇ−１とＢｃ１−２の組合せによって、大幅に阻害された。二重蛍光顕微鏡観察やビデオ増感蛍光顕微鏡観察によって、アポプロチンが、バックス（Ｂａｘ）発現を規制し得るか否かを分析した。バックスは、アポプトーシスを誘発することができる細胞内蛋白質であり、Ｂｃ１−２蛋白質や、まだ知られていないが、他の細胞内蛋白質に合併する。ｐ５３は、バックスの発現を過剰化し、その結果、アポプトーシスの誘発をもたらす（Oltvaiら、1993）。我々は、アポプチンは、バックス蛋白質レベルを過剰化はしないが、同様の実験では、ｐ５３は過剰化し得るとの証拠を発見した。これらは、アポプロチンは、ｐ５３アポプトーシス経路を介しては作用しないように思われるとのもう一つの論拠である。インターロイキン−１−β−転換酵素（ＩＣＥ）様蛋白質は、アポプトーシス法の決定カスケードの最終段階のもの或いはその一つとして知られている（Kuma r，1995）。ＩＣＥ様蛋白質が、アポプチン誘発アポプトーシスにおいて役目を果たすのか否かを調査するために、ＩＣＥ阻害剤ｃｒｍＡを、アポプチンといっしょに発現させた。我々は、牛痘蛋白質ｃｒｍＡの発現によるＩＣＥ様蛋白質の阻害が、アポプチン誘発アポプトーシスの阻害には至らないとの証拠を得た。しかしながら、平行する実験において、ｃｒｍＡ発現が、ｐ５３誘発アポプトーシスを減少することができることを示した（図４）。それ故、我々は、アポプチンは、アポプトーシス決定カスケード内において、不可逆的に非常に近いかは、或いはそれを超えていることさえもあると結論する。さらに、アポプチン誘発アポプトーシスは、ｐ５３誘発アポプトーシス経路を利用しないか、或いはその非常にマイナーな部分を利用するだけである。正常なヒト細胞でのアポプチンの発現３種類のヒトプライマリ細胞、すなわち、血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）、平滑筋細胞（ＨＳＭＣ）、およびＴ細胞をプラスミド上にコードされた完全な長さのアポプチン（ｐＭＣＶ−ｆｓ）で一過的にトランスフェクトさせた。アポプチンを発現する細胞をＭＡｂ８５．１［８］または１１１．３を用いた比直接的免疫蛍光法により選択した。アポプチン陽性細胞におけるアポプチンの誘導は、完全な核は一様に染色するがアポトーシス性の場合は不完全又は弱くしか染色しないＤＡＰＩまたはＰＩを用いて解析した。トランスフェクションから５日後、アポプチン発現プライマリ細胞の約２０％しかＤＡＰＩまたはＰＩで異常に染色されなかった（データは示さず）。Menkeらは、他のアポトーシス系のデータ（未公開）を報告しており、このＤＡＰＩ−異常細胞の率が低いことは、特定のアポトーシス誘導剤によるものではなく、トランスフェクション現象によるものであるとしている。また、以下に示す実験もこのことを証明している。同様の実験において、アポプチンを有する悪性細胞の６０から９０％がアポトーシス性であった［Zhuang et al.，1995，1995a,b］。これらのプライマリ細胞におけるアポプチンの局在性もまた腫瘍細胞とは異なる。正常細胞のすべてにおいて、アポプチンは細胞質に見られたが、様々な腫瘍細胞株に観察される核内には見られなかった（Zhuang et al.，1995，1995a,b）。これらの結果は、様々は培養されたヒトの非形質転換、非腫瘍形成性細胞においては、アポプチンがアポトーシスを引き起こせなかったこと、および、アポプチンの細胞内での局在がアポプチン活性に重要であることを示唆している。ヒト正常細胞とその悪性派生細胞でのアポプチンの発現我々は、腫瘍細胞株でのアポプチンの発現とそれが由来する正常細胞におけるアポプチンの発現を比較した。ここで、正常個体からの２倍体皮膚繊維芽細胞と角化細胞、および、それに対応する腫瘍性細胞を、完全な長さのアポプチンを発現するｐＣＭＶ−ｆｓ、長さを短くしたアポプチンを発現するｐＣＭＶ−ｔｒ、またはデスミンをコードするプラスミド（ｐＣＭＶ−ｄｅｓ）で一過的にトランスフェクトした。デスミンは、アポトーシス活性を有しない（Menke et al.、未公開データ）。トランスフェクション５日後、アポプチン陽性ＶＨ１０繊維芽細胞（図５）とＦＳＫ−１角化細胞（図６）でアポトーシス性になった割合は１５％よりも高くはなかった。この異常なかたちでＤＡＰＩで染色された細胞の割合は、長さを短くしたアポプチンまたはデスミンを有する細胞に類似していた。これらのアポプチン陽性細胞におけるアポトーシスの低い割合は、アポプチン特異的な細胞死の誘導によるものではなく、トランスフェクション現象によるものであろう。腫瘍性繊維芽細胞と角化細胞がアポプチンの影響を受けやすいかどうかを調べるため、ＮＷ１８とＳＣＣ−１５をアポプチン（完全な長さのものと長さを短くしたもの）またはデスミンをコードするプラスミドでトランスフェクトした。アポプチンと、それよりも少ない程度ではあるが長さを短くしたアポプチンも、ＮＷ１８（図５）とＳＣＣ−１５（図６）腫瘍細胞においてアポトーシスを誘導した。トランスフェクション５日後において、これらのアポプチン陽性細胞の最大６５から７５％がアポトーシス性であり、報告されている骨肉腫細胞株でのアポプチン誘導細胞死の割合と同様である（Zhuang et al.，1995a）。異常なＤＡＰＩ染色デスミン陽性ＮＷ−１８およびＳＣＣ−１５細胞の割合は、正常な繊維芽細胞や角化細胞の値に比べて顕著には高くなかった（図５および６）。ＶＨ１０繊維芽細胞とＳａｏｓ−２骨肉腫細胞における増殖率は類似しているので、正常細胞と腫瘍細胞においてアポプチンの活性が異なることを、増殖率が異なるためであると説明することはできない。我々の観察は、アポプチンが正常な繊維芽細胞や角化細胞においてはアポトーシスを引き起こさないが、それに対応する腫瘍性細胞においてはアポトーシスを引き起こすことを示す。ヒトのトランスフォームされた細胞におけるアポプチンの発現アポプチンが細胞死を引き起こすために必要な腫瘍形成性が細胞死に必要なのか、または、単なる細胞のトランスフォーメーションで十分なのであろうか。この質問に回答するため、我々は、トランスフォームされた非腫瘍形成性繊維芽細胞と角化細胞でのアポプチンの効果を調べた。アポプチン、長さを短くしたアポプチン、およびデスミンを、ＳＶ４０でトランスフォームして不死にした繊維芽細胞でトランスフォーム前（Ｐｒｅ）とトランスフォーム後（Ｐｏｓｔ）、ＳＶ４０でトランスフォームして不死にしたＳＶＫ１４角化細胞で、および、自発的にトランスフォームしたＨａＣａＴ角化細胞で一過的に発現させた。これらのトランスフォームされた細胞において、アポプチンは、腫瘍細胞と同様に（図５、６）アポトーシスを引き起こすことができた。（長さを短くした）アポプチンを有する細胞においてアポトーシス性となった割合は、デスミン陽性細胞における割合よりも顕著に高かった。これらのデータはアポプチンが悪性細胞とトランスフォームされた細胞の両者においてアポトーシスを引き起こすことを意味している。いくつかの化学療法剤や放射線はトランスフォームされた細胞においてアポトーシスを引き起こすことができるが、トランスフォームされていない細胞においてはアポトーシスを引き起こすことができない（Thompson，1995，McDonell et al.，1995）。トランスフォーメーションはアポトーシス刺激に対して細胞をより敏感にするようである。いくつかの他のタンパク質が腫瘍細胞を特異的に殺すことが知られている。パルボウィルス構造遺伝子ＮＳ−１は新生物細胞の特異的な細胞溶解を引き起こす（VanAcker and Rommelaere，1995）。また、ｂｃｌ− ｘｓ発現アデノウィルスは、ヒトの乳ガン、直腸ガン、および神経芽細胞腫の細胞でアポトーシスを引き起こすが、正常なヒト造血細胞やヒト白血病細胞株Ｋ５６２では誘導しないように構成されている（Clarke et al.，1995）。アポプチンをコードしているプラスミドを用いたＶＨ１０細胞の安定なトランスフェクション正常なＶＨ１０細胞においてアポプチンが、僅かであるが有意なアポプトーシス作用を持つことを除外するために、コントロールとしてこれらの細胞をｐＣＭＶ−ｆｓまたはｐＣＭＶ−ｎｅｏ−Ｂａｍで安定にトランスフェクトさせた。我々は、いずれのトランスフェクションからも同量のコロニーを得た。得られた細胞は、ｐＣＭＶ−ｆｓで安定にトランスフェクトされたものでは、アポプチンを発現しており、それは核周辺領域に局在していた（データなし）。したがって、アポプチンは、アポプトーシスを誘発できないか、または正常なＶＨ１０細胞の増殖を他のいかなる意味においても阻害できないことが結論される。形質転換および悪性細胞と対比させた、正常細胞におけるアポプチンの細胞内局在性正常細胞と対比させた、悪性および形質転換細胞におけるアポプチンの種々のアポプトーシス活性とは別に、我々は、これらの細胞種におけるアポプチンの細胞内の局在性の差異について調べた。形質転換および悪性細胞においては、アポプトーシス形態変化が見られる前に、アポプチンは微粒子として主に核内に分布している。細胞がアポプトーシスを開始した後では、アポプチンは核内に凝集していた。それに対し、正常な繊維芽細胞および角化細胞におけるアポプチンは、主として細胞質または核の周囲に、いずれも微粒子および、より大きい凝集体として局在している。一次細胞ＨＵＶＥＣおよびＨＳＭＣ、およびＴ細胞においても、アポプチンはこれらの特徴的な核周辺の構造内に局在していた。これまでのところ、調べたすべての悪性および形質転換細胞株では、アポプチンは核に局在しており、それに対しこれまでに分析されたすべての正常細胞では否であった。他の研究者等は、形質転換細胞が機能喪失突然変異を受け、その結果として正常に機能する阻害剤がスイッチオフされたと提案した。これらの変化により、癌細胞においては、核での蛋白質の輸送が促進されるか、または妨げられると考えられる（Csermelyら、1995）。正常細胞においては、アポプチンは、一つ以上の細胞因子に結合および／または修飾され、核周辺の構造物内に局在する結果となることが可能である。悪性細胞においては、このような（機能上の）因子（または複数の因子）の喪失が、アポプチンを核へ侵入させていると考えられる。アポプチンは、推定される核内への輸送配列だけでなく（Notebornら、1991，1994，1 995，Zhuangら、1995，1995a，ｂ）、プロテインキナーゼインヒビター（ＰＫＩ）およびＨＩＶ−Ｒｅｖ蛋白質のアミノ酸領域と類似した、核外への輸送シグナルに似たアミノ酸領域（３３〜４６番アミノ酸：ＩＲＩＧＩＡＧＩＴＩＴＬＳＬ）も潜ませている（Wenら、1995，Fischerら、1995，Gerace，1995）。この潜在性の核輸送シグナルが、調べた種々の悪性および形質転換細胞内では認識されないことは、好都合となるはずである。ここに記載した結果は、アポプチンの核内局在が、アポプトーシスを誘発する能力にとって重要であることを示している。このことは、アポプトーシス活性の減少した（図５および図６）トランケート・アポプチンの一部が、細胞質内に存在するとの観察と一致する。電子顕微鏡によるトリの単核細胞についての考察によって、アポプチンが細胞内クロマチンといっしょになって局在することが判った（Notebornら、1994）。クロマチンとアポプチンの交互作用によって、その超構造の巻き戻しをもたらすことができた。後者の現象は、ラットの去勢後アポプトーシス化したラットの腹壁前立腺のものとして記載されている（Kyprianou an d lsaacs，1989）。抗腫瘍剤としてのアポプチン我々の結果は、アポプチンは、抗腫瘍剤であることを示している。先ず、アポプチンは、特に、悪性細胞や形質転換細胞中では活性であるが、少なくとも、インビトロでは、試験に供した正常細胞中では活性ではない。それ故、アポプチン療法の毒性効果は、非常に低いものとなろう。次に、アポプチンは、ｐ５３非依存方式では、アポプトーシスを誘発する。いくつかの化学療法剤が、大多数の腫瘍中でアポプトーシスを誘発することのできるこの能力を失うと云う事実は、ｐ５３機能の崩壊と関連しているように思われる。それ故、ｐ５３非依存アポプトーシス経路の誘発は、腫瘍療法の代替法の候補として有用なアプローチとなろう。さらに、アポプチンは、明らかにＢｃ１−２によっては遮断されず、このことは、例えば、白血病腫瘍の展開に含まれるものとして知られており、化学療法剤によって誘発されるアポプトーシスを阻害できるものである。また、我々は、Ｂｃ１−２関連蛋白質であるＢＡＧ−１は、アポプチン誘発アポプトーシスを遮断し得ないことを観察した。図面の説明図１は、ｐ５３−マイナスＨｅｐ３Ｂ細胞においてＶＰ３によるアポプトーシス誘発に及ぼすＥ１Ｂ−２１ｋＤおよびＢｃｌ−２の発現効果を示している。示されている百分率はトランスフェクションの６日後にアポトーシスを起こしたアポプチン陽性細胞のものである。アポプチン陽性細胞は２．５μｇのｐＣＭＶ− ＶＰ３と５μｇのｐＣＭＶ−ｎｅｏ−Ｂａｍ（空白の棒グラフ）、５μｇのｐＣＭＶ−Ｅ１Ｂ２１（線影棒グラフ）、または５μｇのｐＣＭＶ−Ｂｃ１２プラスミドＤＮＡ（点線棒グラフ）と共に同時トランスフェクションされた。少なくとも３つの独立した実験が行われた。実験毎に、少なくとも２００個のアポプチン陽性細胞を検査した。図２は、Ｈｅｐ３Ｂ細胞系においてｐ５３によるアポプトーシス誘発に及ぼすＥ１Ｂ−２１ＫおよびＢｃｌ−２の蛋白質の効果を示している。該細胞は２．５ＥμｇのｐＣＭＶ−ｐ５３と５ＥμｇのｐＣＭＶ−ｎｅｏ−Ｂａｍ、５μｇのｐＣＭＶ−Ｅ１Ｂ２１Ｋ、または５μｇのｐＣＭＶ−Ｂｃ１２プラスミドＤＮＡと共に同時トランスフェクションされた。２つの独立したトランスフェクションが行われた。トランスフェクション後４〜５日で細胞を分析した。示される百分率はアポプトーシスを起こしたｐ−５３陽性細胞のものである。実験毎に、少なくとも２００個のｐ５３陽性細胞を検査した。図３は、ｐ−５３誘発アポプトーシスまたはアポプチン誘発アポプトーシスに及ぼすＢｃｌ−２およびＢａｇ−１発現の効果を示す。Ｓａｏｓ−２細胞は、２．５μｇのｐＣＭＶ−ｆｓ、５μｇのｐＣＭＶ−Ｂｃｌ−２、ｐＣＭＶ−Ｂａｇ −１、またはＰＣＭＶ−Ｂａｇ−１とｐＣＭＶ−Ｂｃｌ−２と共に同時トランスフェクションされた。平行した実験において、細胞は、２．５μｇのｐＣＭＶ− ｐ５３および５μｇのｐＣＭＶ−Ｂｃｌ−２、ｐＣＭＶ−Ｂａｇ−１、またはｐＣＭＶ−Ｂａｇ−１とｐＣＭＶ−Ｂｃｌ−２と共に同時トランスフェクションされた。対照として、ｐＣＭＶ−ｐ５３またはｐＣＭＶ−ｆｓが、ｐＣＭＶーｎｅｏ−Ｂａｍと共に同時トランスフェクションされた。両方のシリーズについて少なくとも３つの独立した実験が行われた。細胞はトランスフェクション後４日で収穫された。示されている百分率はアポプトーシスを起こしたｐ５３−またはアポプチン陽性の細胞のものである。実験毎に、少なくとも２００個の細胞を検査した。図４は、ｐ５３−またはアポプチン誘発アポプトーシスの誘発に及ぼすＩＣＥ −阻害剤ｃｒｍＡの効果を示す。Ｓａｏｓ−２細胞は、２．５μｇのｐＣＭＶ− ｆｓおよび５μｇのｐＣＭＶ−ｃｒｍＡ（＋ｃｒｍＡ）またはｐＣＭＶ−ｎｅｏ −Ｂａｍ（−ｃｒｍＡ）で同時トランスフェクションされた。平行して、細胞は、２．５μｇのｐＣＭＶ−ｐ５３および５μｇのｐＣＭＶ−ｃｒｍＡまたはｐＣＭＶ−ｎｅｏ−Ｂａｍで同時トランスべくションされた。少なくとも２つの独立した実験が行われた。細胞はトランスフェクション後５日に収穫された。示される百分率はアポプトーシスを起こしたｐ５３−またはアポプチン陽性の細胞のものである。実験毎に、少なくとも２００個の細胞を検査した。図５は、正常に対する形質転換または悪性のヒト線維芽細胞におけるアポプチン活性を示す。ＤＡＰＩで異常に染色された細胞の百分率が、正常なＶＨ１０に対する一時的にｐＣＭＶ−ｆｓ、ｐＣＭＶ−ｔｒまたはｐＣＭＶ−ｄｅｓでトランスフェクションされた形質転換（前と後）および腫瘍（ＮＷ１８）線維芽細胞におけるアポプトーシスについての相対的な測定値として示されている。細胞はトランスフェクション後５日で固定され、間接的蛍光抗体法により分析された。結果は少なくとの３つの独立した実験の平均である。各実験において、少なくとも２００個の完全なサイズまたは頭部切り欠いたアポプチンまたはデスミンの陽性細胞を検査した。細胞はトランスフェクション後５日で固定され、間接的蛍光抗体法により分析された。図６は、正常対形質転換または悪性のケラチノサイトにおけるアポプチン活性を示す。ＤＡＰＩで異常に染色された細胞の百分率が、正常なケラチノサイト（ＦＳＫ−１）に対する、一時的にｐＣＭＶ−ｆｓ、ｐＣＭＶ−ｔｒまたはｐＣＭＶ−ｄｅｓでトランスフェクションされた形質転換（ＳＶＫ１４，ＨａＣＡＴ）および腫瘍（ＳＣＣ−１５）のケラチノサイトにおけるアポプトーシスについての相対的な測定値として示されている。細胞はトランスフェクション後５日で固定され、間接的蛍光抗体法により分析された。結果は少なくとの３つの独立した実験の平均である。各実験において、少なくとも２００個の完全なサイズまたは頭部切り欠いたアポプチンまたはデスミンの陽性細胞を検査した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．トランスフォームされた、および／または悪性、および／または腫瘍細胞と正常細胞を区別する方法であって、該細胞にウイルス性蛋白質３（ＶＰ３；アポプチン）を与え、該細胞中の該蛋白質の局在性を測定する工程を含むことを特徴とする方法。２．対象となる核酸をターゲット細胞に運搬するための媒介物であって、さらにアポプチンをコードする遺伝子またはその機能的同等物を含むことを特徴とする媒介物。３．ターゲット腫瘍治療のための抱合体であって、主に結合する分子に対して結合親和性を持つが、腫瘍細胞の表面には全く存在しないターゲティング部分と、アポプチンまたはその機能的同等物を含むことを特徴とする抱合体。４．腫瘍形成性物質あるいは腫瘍形成性物質をコードする遺伝子を、腫瘍細胞の表面には全く存在しないが、主に結合する分子に運搬する媒介物であって、該腫瘍形成物質がアポプチンまたはその機能的同等物であることを特徴とする媒介物。５．ターゲット細胞の個体数を低減するための方法に用いるためのアポプチンまたはその機能的同等物であって、該方法が主にターゲット細胞に特異的ではあるが、完全に特異的ではなく、アポプチンまたはその機能的同等物が細胞毒性物質であることを特徴とするアポプチンまたはその機能的同等物。６．ターゲット細胞の個体数を低減するための用途に用いるためのアポプチンまたはその機能的同等物であって、該細胞が、他のアポトーシス誘発剤に対して感受性がないことを特徴とするアポプチンまたはその機能的同等物。７．細胞核局在化シグナルを備えたアポプチンまたはその機能的同等物。８．ターゲット細胞集合の細胞を除く方法に用いられる請求項８記載のアポプチンまたはその機能的同等物。９．請求項８のアポプチンまたはその機能的同等物をコードする核酸。