JP2003516152A - アポプチン会合タンパク質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、アポプトーシスの分野に関する。本発明は、新規の治療上の可能性を提供し、たとえば、特にｐ５３が（部分的に）非機能的であるようなケースにおいて、単独で、アポプチンと逐次的に、またはアポプチンと合同で作用しうる新規の組合せ療法もしくは新規の治療用化合物を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 本発明は、アポプトーシスの分野に関する。アポプトーシスは、余剰の、改変
したまたは悪性の細胞を除去するための活性なおよびプログラミングされた生理
学的プロセスである（Ｅａｒｎｓｈａｗ，１９９５，Ｄｕｋｅ ｅｔ ａｌ．，
１９９６）。アポプトーシスは、細胞の収縮、核のセグメント化、ドメインサイ
ズのフラグメントへのＤＮＡの分割、と大部分の細胞においてその後につづくヌ
クレオソーム間分解により特徴づけされる。アポプトーシス細胞は、膜でとり囲
まれたアポプトーシス体へとフラグメント化する。最終的に、隣接する細胞およ
び／またはマクロファージは、これらの死枯しつつある細胞を急速に貧食するこ
とになる（Ｗｙｌｌｉｅ ｅｔ ａｌ．，１９８０，Ｗｈｉｔｅ，１９９６）。
組織培養条件下で成長させられた細胞および組織材料からの細胞は、例えば正常
なＤＮＡを強くかつ規則的に染色するもののアポプトーシス性ＤＮＡを弱くおよ
び／または不規則に染色するＤＡＰＩといったようなＤＮＡ染色作用物質を用い
てアポプトーシス性について分析することができる。（Ｎｏｔｅｂｏｒｎ ｅｔ
ａｌ．，１９９４，Ｔｅｌｆｏｒｄ ｅｔ ａｌ．，１９９２）。

【０００２】 アポプトーシスプロセスは、さまざまな規則的刺激によって開始されうる（Ｗ
ｙｌｌｉｅ，１９９５，Ｗｈｉｔｅ １９９６，Ｌｅｖｉｎｏ，１９９７）。細
胞生存率の変化は、増殖の増強または細胞死の減少（Ｋｅｒｒ ｅｔ ａｌ．，
１９９４，Ｐａｕｌｏｖｉｃｈ，１９９７）が観察される例えば癌の発達および
自己免疫疾患といった疾病の人間の病因において１つの重要な役割を果たす。さ
まざまな化学療法化合物および放射線が、野生型ｐ５３タンパク質を介して数多
くの例において腫瘍細胞内でアポプトーシスを誘発することが実証されてきた（
Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，１９９５，Ｂｅｌｌａｍｙ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｓｔ
ｅｌｌｅｒ，１９９５，ＭｃＤｏｎｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，１９９５）。

【０００３】 しかしながら多くの腫瘍は、往々にして癌療法に対する応答性が低いことと相
関関係をもつｐ５３内の突然変異を、その発達中に獲得する。腫瘍発生ＤＮＡウ
イルスのいくつかの形質転換遺伝子は、直接結合することでｐ５３を不活性化す
ることができる（Ｔｅｏｄｏｒｏ，１９９７）。かかる作用物質の一例としては
、腫瘍ＤＮＡウイルスＳＶ４０の大型Ｔ抗原がある。いくつかの（白血病性の）
腫瘍については、プロトオンコジーンＢｃｌ−２またはＢｃｒ−ａｂｌの高い発
現レベルは、さまざまなアポプトーシス誘発性化学療法作用物質に対する強い耐
性と結びつけられる（Ｈｏｃｋｅｎｂｅｒｒｙ １９９４，Ｓａｃｈｓ ａｎｄ
Ｌｏｔｅｍ，１９９７）。

【０００４】 （腫瘍の半数以上を占める）機能的ｐ５３が欠如しているような腫瘍について
は、ｐ５３とは独立したアポプトーシスの誘発に基づく代替的な抗腫瘍療法が開
発中である（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ １９９５，Ｐａｕｌｏｖｉｃｈ ｅｔ ａｌ．
，１９９７）。ｐ５３を必要とせずおよび／またはＢｃｌ−２もしくはＢｃｒ−
ａｂｌ−様の活性といったような抗アポプトーシス活性により遮断され得ない、
アポプトーシスの誘発に関与する因子を探究する必要がある。これらの因子は、
全く異なるアポプトーシス経路の一部を成しているかもしれず、或いは又アポプ
トーシス阻害化合物の（はるか）下流側にあるかもしれない。

【０００５】 アポプチンは、ヒトの悪性かつ形質転換された細胞系統内でアポプトーシスを
誘発できるものの形質転換されていないヒト細胞培養中ではこれを誘発できない
、ニワトリ貧血症ウイルス（ＣＡＶ；Ｎｏｔｅｂｏｒｎ ａｎｄ Ｄｅ Ｂｏｅ
ｒ，１９９５，Ｎｏｔｅｂｏｒｎ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｎｏｔｅｂｏｒｎ
ｅｔ ａｌ．，１９９４；１９９８ａ）由来の小さいタンパク質である。Ｉｎ
ｖｉｔｒｏで、アポプチンは、正常なリンパ球、皮ふ、表皮、内皮および平滑
筋細胞内で、プログラミングされた細胞死を誘発することができない。しかしな
がら、正常な細胞は、形質転換された時点で、アポプチンによるアポプトーシス
を受けやすくなる。正常なヒトの線維芽細胞中のアポプチンの長期発現は、アポ
プチンがこれらの細胞内で毒性または形質転換活性を全くもたないことを明らか
にした。（Ｄａｎｅｎ−ｖａｎ Ｏｏｒｓｃｈｏｔ，１９９７ ａｎｄ Ｎｏｔ
ｅｂｏｒｎ，１９９６）．

【０００６】 正常な細胞において、アポプチンは細胞質内に優勢に見い出されたが、形質転
換されたまたは悪性の細胞、すなわち過形成、化生、形成異常により特徴づけさ
れる細胞内では、それは核内にあり、このことはすなわちアポプチンの局在化が
その活性に関係づけされることを示唆していた（Ｄａｎｅｎ−ｖａｎ Ｏｏｒｓ
ｃｈｏｔ ｅｔ ａｌ．１９９７）．

【０００７】 アポプチンにより誘発されるアポプトーシスは機能的ｐ５３の不在下で発生し
（Ｚｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９５ａ），Ｂｃｌ−２，Ｂｃｒ−ａｂｌ（
Ｚｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９５）またはＢｃｌ−２会合タンパク質ＢＡ
Ｇ−１（Ｄａｎｅｎ−ｖａｎ Ｏｏｒｓｃｈｏｔ，１９９７ａ，Ｎｏｔｅｂｏｒ
ｎ，１９９６）により遮断され得ない。

【０００８】 従って、アポプチンは、腫瘍細胞の選択的破壊するための、または、特に、機
能的ｐ５３の欠如ならびにＢｃｌ−２およびその他のアポプトーシス阻害作用物
質の（過剰）発現に起因してアポプトーシスの（化学）−療法による誘発に対し
耐性をもつようになった腫瘍細胞についての他の過形成、化生または形成異常を
選択的に破壊するための治療用化合物である（Ｎｏｔｅｂｏｒｎ ａｎｄ Ｐｉ
ｅｔｅｒｓｅｎ，１９９８）。悪性前の最小限の形質転換しか受けていない細胞
でさえ、アポプチンの死渇誘発効果に対する感応性をもつと思われる。さらにＮ
ｏｔｅｂｏｒｎおよびＺｈａｎｇ（１９９８）は、アポプチン誘発されたタンパ
ク様物質を癌化しやすい細胞の診断および癌化しやすい細胞の治療として使用で
きるということを示した。

【０００９】 アポプチンが少なくともｉｎ ｖｉｔｒｏでは、正常な人間の細胞中でアポプ
トーシスを誘発しないという事実は、ｉｎ ｖｉｖｏ でのアポプチン処置の毒
性効果が非常に低いものとなる、ということを示している。Ｎｏｔｅｂｏｒｎお
よびＰｉｅｔｅｒｓｅｎ（１９９８）およびＰｉｅｔｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．
（１９９９）は、アデノウイルスにより発現されたアポプチンがｉｎ ｖｉｖｏ
で急性の毒性効果をもたないという証拠を提供した。さらに、ヌードマウスにお
いては、アポプチンが強い抗腫瘍活性をもつことが示された。

【００１０】 しかしながら、当該技術分野において利用可能な治療用抗癌または抗自己免疫
疾患化合物の範囲をさらに拡大するためには、特にｐ５３が（部分的に）非機能
的であるようなケースにおいて、単独で、アポプチンに対し逐次的にまたはアポ
プチンと合同で作用するべく設計された付加的な治療用化合物が望まれる。

【００１１】 本発明は、アポプトーシスの分野に関する。本発明は、例えば、特にｐ５３が
（部分的に）非機能的であるようなケースにおいて、単独で、アポプチンと逐次
的にまたはアポプチンと合同で作用しうる新規の組合せ療法または新規の治療用
化合物といったような新規の治療上の可能性を提供する。

【００１２】 第１の実施形態においては、本発明は、核局在化またはアポプチンとの核同時
局在化可能でしかも、特に形質転換された細胞または腫瘍細胞の中で単独で、ま
たはアポプチンといったようなその他のアポプトーシス誘発物質と組合わさった
形でアポプトーシスを提供可能なアポプチン会合タンパク様物質をコードする、
分離されたもしくは組換え型の核酸またはその機能的等価物もしくはフラグメン
トを提供する。好ましい実施形態においては、それは、核のセグメント化、フラ
グメントへのＤＮＡの縮合および分割と前記細胞の大部分においてそれに続くヌ
クレオソーム間分解にまで導く初期アポプトーシス段階において、細胞の核内で
クロマチン／ＤＮＡ構造と共に同時局在化する。本発明のもう１つの好ましい実
施形態においては、前記物質は、特にヘテロクロマチンを含有する核の部域にお
いて前記核内に円形構造が形成されるように、幾分か組織立ったパターンで起こ
る同時局在化を可能にする。しかしながら、フラグメントへのＤＮＡの縮合およ
び分割による核の上述のアポプトーシスのセグメント化の間、真性クロマチンも
当然同様にもたらされる。

【００１３】 本書におけるタンパク様物質は、任意には例えばグリコシル化、ミリスチル化
、ホスホリル化、脂質の添加、相同または非相同的２量体化または多量体化、ま
たは、当該技術分野において既のその他のあらゆる（翻訳後）修飾によって修飾
された、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を含む物質として定義づけさ
れる。

【００１４】 本書におけるアポプチン会合という語は、アポプチンにより誘発可能なものと
してアポプトーシス経路内に見い出される事象カスケードに特異的に関与する物
質のカスケードに属するもの、特にｐ５３独立型アポプトーシス経路に特異的に
関与するような物質として、定義づけされる。

【００１５】 好ましい実施形態においては、本発明は、分離されたもしくは組換え型の核酸
、またはその機能的等価物もしくはフラグメントであって、ｃＤＮＡライブラリ
由来の、好ましくは、家禽から誘導可能であるような脊椎動物のｃＤＮＡライブ
ラリ由来の、ただしより好ましくは哺乳動物のｃＤＮＡライブラリ由来の、好ま
しくはヒトｃＤＮＡを含んでいるｃＤＮＡライブラリ由来のアポプトーシスを提
供可能なアポプチン会合タンパク様物質をコードする、分離されたもしくは組換
え型の核酸、またはその機能的等価物もしくはフラグメントを提供する。無脊椎
動物のｃＤＮＡライブラリ由来のアポプチン会合タンパク様物質の脊椎動物類似
体（好ましくはヒト）を決定することによって得られるアポプチン会合タンパク
様物質も同様に内含される。

【００１６】 もう１つの実施形態においては、本発明は、特に本書ではＡＡＰ−４としても
略記されているアポプチン会合タンパク質４と呼ばれるアポプトーシスを提供で
きる新しいタンパク質またはその機能的等価物もしくは機能的フラグメントをコ
ードする、図１または５に示されているようなアポプトーシスを提供できるアポ
プチン会合タンパク様物質をコードする核酸分子に対しハイブリッド形成可能な
アポプトーシスを提供できるアポプチン会合タンパク様物質をコードする分離さ
れたもしくは組換え型の核酸、またはその機能的等価物もしくフラグメントを提
供する。図１は、図５に描かれているような完全なＡＡＰ−４フラグメントの約
７５０ｂｐのフラグメントを示す。両方のヌクレオチド配列は共に、少なくとも
アポプチンに結合しアポプトーシスを提供可能なタンパク質をコードする。当然
のことながら、部分的または完全なＡＡＰ−４タンパク質と会合可能な付加的な
アポプチン会合タンパク様物質をコードする、分離されたもしくは組換え型の核
酸、またはその機能的等価物もしくはフラグメントもここで提供されており、ア
ポプチンカスケード内にあるかかる付加的なタンパク質に到達するための手段お
よび方法は、本書の詳細な記述に記されているものに準ずる。部分長または全長
ＡＡＰ−４を研究することで導出された知識を利用して、部分または全長ＡＡＰ
−４が関与する機能的経路が決定され、かくして、かかる経路内の治療的介入手
段の設計が可能となる。

【００１７】 特に、本発明は、図１または５に示されているようなアポプチン会合タンパク
様物質をコードする核酸分子、またはその機能的等価物もしくは機能的フラグメ
ントに対し、少なくとも６０％好ましくは少なくとも７０％，より好ましくは少
なくとも８０％，さらに一層好ましくは９０％，そして最も好ましくは少なくと
も９５％の相同性をもつ、アポプトーシスを提供可能なアポプチン会合タンパク
様物質をコードする分離されたもしくは組換え型の核酸またはその機能的等価物
もしくはフラグメントを提供する。

【００１８】 さらに本発明は、本発明に従った核酸を含むベクターを提供している。かかる
ベクターの例は、ベクターｐＭＴ２ＳＭ−ＡＡＰ−４，Ｍｙｃでタグ付けされた
ＡＡＰ−４ｃＤＮＡを発現するｐＭＴ２ＳＭベクター、アポプチン会合タンパク
質フラグメントを発現するプラスミドといったように、本書で記される詳細な説
明の中で与えられている。これらのおよびその他のベクターは例えば、以上で定
義づけした通り、カスケードから付加的なアポプチン会合タンパク様物質を発見
する上で有用である。

【００１９】 さらにもう１つの実施形態においては、本発明は、本発明に従った核酸を含み
、かつ遺伝子送達ビヒクルを含んで成り、本発明を遺伝子療法において非常に有
用なものにする、ベクターを提供している。遺伝子送達ベクターに本発明に従っ
た核酸を具備すること、および過剰増殖しつつあったかつ／または低い死滅率を
示した単数または複数の細胞に対し該ビヒクルをターゲティングすることにより
、前記遺伝子送達ビヒクルは、前記単数または複数の細胞に対し、アポプトーシ
スのために必要な手段を提供し、到達度の高い治療上の可能性を提供することに
なる。

【００２０】 その上、本発明は、本発明に従った核酸またはベクターを含む宿主細胞を提供
する。例としては、本書の詳細な説明の中で記述されているような形質転換され
たまたはトランスフェクションを受けた細菌または酵母細胞が含まれる。好まし
いのは、本発明に従った核酸またはベクターで形質転換またはトランスフェクシ
ョンされた哺乳動物またはＣｏｓ細胞といったような脊椎動物細胞または酵母細
胞といった形質転換された真核細胞である本発明に従った宿主細胞である。前記
細胞は一般に、アポプチンと会合する能力をもつアポプトーシスを提供できるタ
ンパク様物質を発現または産生することができる。

【００２１】 本発明はさらに、アポプトーシスを提供することのできる分離されたまたは組
換え型のアポプチン会合タンパク様物質を提供する。例えば本書図３に示されて
いるように、腫瘍細胞またはその他の過剰増殖細胞といった細胞内のかかるアポ
プチン会合タンパク様物質の発現は、アポプトーシスプロセスを誘発する。それ
は、単独でも、アポプチンといったようなその他のアポプトーシス誘発性物質の
存在下でも、又特にｐ５３と独立した形でも可能であり、（機能的）ｐ５３が存
在しないようなケースにおいても、アポプトーシスは、本発明に従った物質によ
って誘発され得る。特に、本発明は、例えば、単独でまたはアポプチンといった
ようなその他のアポプトーシス誘発物質と組合せた形で好ましくはそれと同時局
在化してアポプトーシスを提供する可能性のある、図２または６に示されている
ようなアミノ酸配列の少なくとも１部分、またはその機能的等価物もしくは機能
的フラグメントを含む、本発明に従った核酸によりコードされる本発明に従った
タンパク様物質を提供する（例えば、アポプチンおよび提供された状態の物質が
形質転換された細胞または腫瘍細胞の中で同時局在化することが発見された円形
構造を示す図４を参照のこと）。

【００２２】 本発明は同様に、本発明に従ったタンパク様物質またはその機能的等価物もし
くはフラグメントを特異的に認識する分離されたまたは合成の抗体をも提供して
いる。かかる抗体は例えば、アポプチン会合タンパク様物質またはその免疫原性
フラグメントもしくは等価物で実験動物を免疫化し、この免疫化された動物から
ポリクローナル抗体を収獲することによって得ることもできるし（本書の詳細な
説明中で示されているように）、そうでなければ、モノクローナル抗体または（
１本鎖）抗体を産生することまたは例えばファージ表示技術を介して得られる核
酸ライブラリ由来の組換え型核酸から発現されるタンパク質を結合させることに
よるものといった当該技術分野で既知のその他の方法により得ることができる。

【００２３】 かかる抗体の場合、本発明は同様に、例えば免疫沈降法、ウェスタンブロット
法またはその他の当該技術分野において既知の免疫学的技術を介して得ることの
できる、本発明に従ったかかる抗体によって特異的に認識可能なタンパク様物質
をも提供する。

【００２４】 さらに、本発明は、例えば図３に示されているように、アポプトーシスの誘発
のための本発明に従った核酸，ベクター、宿主細胞またはタンパク様物質の使用
を提供する。特に、前記アポプトーシスがｐ５３独立型であるようなかかる使用
が提供される。特に、アポプチンをコードする核酸またはその機能的等価物もし
くはフラグメントの使用またはアポプチンまたはその機能的等価物もしくはフラ
グメントの使用をさらに含んで成るような使用も同様に提供されている。図３を
みればわかるように、これらのアポプチン誘発物質を組合わせることで、処理さ
れた腫瘍細胞のアポプトーシス百分率は増大する。

【００２５】 本発明によって提供されるようなかかる使用は、治療的見地からみて特に有用
である。本発明は、ここで、本発明に従った核酸，ベクター、宿主細胞またはタ
ンパク様物質を含む薬学組成物を提供している。さらに、アポプチンまたはその
機能的等価物もしくはフラグメントをコードする核酸、または、アポプチンまた
はその機能的等価物もしくはフラグメントをさらに含む本発明に従ったかかる薬
学組成物も提供されている。

【００２６】 かかる薬学組成物は特に、アポプトーシスの誘発のため、特に前記アポプトー
シスがｐ５３独立型である場合、一般にその疾病が癌または自己免疫疾患である
場合にそうであるように細胞増殖の増強または細胞死の減少が見られる疾患の治
療のために、提供されている。ここで本発明は、細胞増殖の増強または細胞死の
減少が見られる疾病のキャリヤである個体を治療するための方法において、この
個体を本発明に従った薬学組成物で処置することを含んで成る方法を提供してい
る。特に、これらの組成物は、形質転換された細胞および癌化しやすい細胞に特
異的であるアポプトーシス経路の１因子を含んで成る。従って、これらの組成物
は、癌および自己免疫疾患といったようなアポプトーシスプロセスにおける異常
に関連した疾病の新しい治療のためのみならずその診断のためにも不可欠である
。さらに、本発明は、特に本発明によって提供されるような物質の影響下で（例
えばトランスフェクションによる）、図４に記述されるようなクロマチン／ＤＮ
Ａまたは円形構造の縮合を示すような細胞を検出することによって、癌化しやす
い細胞の診断を提供する。

【００２７】 本発明は、同様に、図７に示されているようなアミノ酸配列を含むタンパク様
物質をコードする分離されたまたは組換え型の核酸をも提供している。

【００２８】 さらなる実施形態においては、本発明は、図５に示されているような核酸によ
ってコードされたタンパク様物質の活性の推定上のエフェクタを同定するための
検定において、図６に示されたアミノ酸配列のアミノ酸８５２〜９００を含むタ
ンパク様物質を前記エフェクタと接触させる段階および前記エフェクタの結合を
見極める段階を含んで成る検定を提供している。

【００２９】 本発明について、制限的意味を全くもたない以下の詳細な説明において以下で
より詳しく説明する。

【００３０】 詳細な説明 我々は、アポプトーシスの誘発に不可欠であるアポプチン会合細胞化合物を同
定するために、酵母−２ハイブリッドシステム（Ｄｕｒｆｅｅ ｅｔ ａｌ．，
１９９３）を使用した。使用されたシステムは、アポプチンと物理的に会合する
能力をもつヒトタンパク質を同定するためのｉｎ ｖｉｖｏ戦略である。これは
、問題のタンパク質に対する結合能力をもつタンパク質をコードするクローンに
ついてｃＤＮＡライブラリをスクリーニングするために使用されてきたものであ
る（Ｆｉｅｌｄｓ ａｎｄ Ｓｏｎｇ，１９８９，Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，１
９９２）。本発明は、例えば、新しいアポプチン会合タンパク質を提供しており
、そのうちの１つは、ＡＡＰ−４と略されるアポプチン会合タンパク質４と命名
されている。本発明は同様に、この新しく発見されたＡＡＰ−４タンパク質また
はその機能的等価物もしくはフラグメントの機能との干渉を通して、および／ま
たは、ＡＡＰ−４もしくは関連の遺伝子またはその機能的等価物もしくはフラグ
メントの（過剰）発現によるアポプトーシスの誘発を通して、アポプトーシスを
誘発する方法も提供している。

【００３１】 本発明は同様に、ＡＡＰ−４様のタンパク質の機能および／またはその（過剰
）発現との干渉に基づく抗腫瘍療法をも提供している。ＡＡＰ−４様タンパク質
の異常に高いレベルは結果として、細胞形質転換とは反対のプロセス、すなわち
アポプトーシスの誘発をもたらす。本発明はさらに、腫瘍特異的であるアポプチ
ン誘発型アポプトーシスの媒介物質を提供する。本発明は、単独で、または、ア
ポプチンおよび／またはアポプチン様の化合物と組合せた形でのＡＡＰ−４様タ
ンパク質に基づく癌、自己免疫疾患または関連疾患のための療法を提供する。

【００３２】 ｐＧＢＴ９−ＹＰ３の構築 酵母−２−ハイブリッドシステムを用いたアポプチン会合タンパク質の同定を
可能にするおとりプラスミドの構築のため、プラスミドｐＥＴ−１６ｂ−ＶＰ３
（Ｎｏｔｅｂｏｒｎ，結果未公表）をＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩで処理した。低
融点アガロースから０．４ｋｂのＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩ ＤＮＡフラグメントを
分離した。

【００３３】 制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩでプラスミドｐＧＢＴ９（Ｃｌｏｎｔｅ
ｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＵＳＡ）を処
理した。約５．４−ｋｂのＤＮＡフラグメントを分離し、それ自身のＡＴＧ開始
コドンから出発してアポプチンコーディング配列を含有する０．４ｋｂのＤＮＡ
フラグメントおよびＥｃｏＲＩ−ＮｄｅＩリンカーに連結させた。酵母プロモー
タＡＤＨの調節下のアポプチンおよびＧＡＬ４−結合ドメイン配列の融合遺伝子
を含有する最終構成体はｐＧＢＴ−ＶＰ３と呼ばれ、Ｓａｎｇｅｒ方法（１９７
７）に従ったＤＮＡ配列決定および制限酵素分析により正しいものであることが
証明された。

【００３４】 全てのクローニング段階は、基本的にＭａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．（１９
９２）によって記述された通りに実施した。プラスミドｐＧＢＴ−ＶＰ３を、Ｓ
ｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ５００（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）内でのＣｓＣｌ勾配および
カラムクロマトグラフィにおける遠心分離により精製した。

【００３５】 ＧＡＬ４活性ドメインでタグ付けられたｃＤＮＡライブラリ ＧＡＬ４転写活性ドメインに融合されたエプスタイン−バールウイルス形質転
換ヒトＢ細胞からのｃＤＮＡを含有する発現ベクターｐＡＣＴを、アポプチン会
合タンパク質を検出するために使用した。ｐＡＣＴｃ−ＤＮＡライブラリは、Ｄ
ｕｒｆｅｅ ｅｔ ａｌ，１９９３が記述している通りにラムダ−ＡＣＴｃＤＮ
Ａライブラリに由来する。

【００３６】 細菌および酵母菌株 Ｅ．ｃｏｌｉ菌株ＪＭ１０９は、プラスミドｐＧＢＴ９およびｐＧＢＴ−ＶＰ
３のための形質転換受容体であった。アポプチン会合ｐＡＣＴ−ｃＤＮＡの回収
に必要とされる形質転換のためには、細菌株Ｅｌｅｃｔｒｏｍａｘ／ＤＨ１０Ｂ
が使用され、これはＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ，ＵＳＡから入手された。

【００３７】 ｃＤＮＡライブラリをスクリーニングするため、および、使用された酵母２ハ
イブリッドシステムの一部であるその他の全ての形質転換について、酵母菌株Ｙ
１９０が使用された。

【００３８】 培地 薬物の選択のためには、Ｅ．ｃｏｌｉ用のＬｕｒｉａ Ｂｒｏｔｈ（ＬＢ）平
板に、アンピシリン（１ｍｌあたり５０マイクログラム）を補足した。Ｒｏｓｅ
ｅｔ ａｌ．（１９９０）によって記述されている通りに酵母ＹＰＤおよびＳ
Ｃ培地を調製した（１９９０）。

【００３９】 プラスミドｐＧＢＴ−ＶＰ３およびｐＡＣＴ−ｃＤＮＡでのコンピーテント酵
母菌株Ｙ１９０の形質転換およびベータガラクトシダーゼ活性についてのスクリ
ーニング 酵母菌株Ｙ１９０を、Ｋｌｅｂｅ ｅｔ ａｌ．（１９８３）によって記述さ
れている方法に従って応答能あるものにし形質転換させた。まず最初に、酵母細
胞をｐＧＢＴ−ＶＰ３で形質転換させ、その後ｐＡＣＴ−ｃＤＮＡで形質転換さ
せ、これらの形質転換された酵母細胞を、同じくロイシンおよびトリプトファン
が欠如したヒスチジン−マイナス平板上で成長させた。

【００４０】 ヒスチジン陽性であった酵母コロニー上にハイボンド−Ｎフィルタを設置し、
完全に湿潤化させた。フィルタをもち上げ、液体窒素内に沈めて、酵母細胞を透
過性にした。フィルタを解凍し、０．２７％のベータ−メルカプト−エタノール
と１ｍｇ／ｍｌのＸ−ｇａｌを含有するｚ緩衝液（１リットルあたり：１６．１
グラムのＮａ₂ＨＰＯ₄・７Ｈ₂Ｏ，５．５グラムのＮａＨ₂ＰＯ₄・Ｈ₂Ｏ，０．７
５グラムのＫＣｌおよび０．２４６グラムのＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ，ｐＨ７．０）
の入ったペトリ皿の中でＷｈａｔｔｍａｎ３ＭＭ紙上でコロニー側を上にして置
いた。フィルタを少なくとも１５分間または一晩中インキュベートした。

【００４１】 酵母からのプラスミドの回収 ヒスチジンおよびベータガラクトシダーゼ陽性である酵母細胞からの全ＤＮＡ
を、ＨｏｆｆｍａｎとＷｉｎｓｔｏｎ（１９８７）により記述されているような
グルスラーゼ−アルカリ性溶解方法を用いることによって調製し、メーカーの仕
様に従ってＢｉｏ−Ｒａｄ Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒを用いた電気泳動を介して
Ｅｌｅｃｔｒｏｍａｘ／ＤＨ１０Ｂ細菌を形質転換するためにこれを使用した。
形質転換体を、抗生剤アンピシリンを含有するＬＢ培地上で平板固定した。

【００４２】 アポプチン会合ｐＡＣＴクローンの分離 コロニー−フィルタ検定を用いて、コロニーを溶解させ、ｐＡＣＴについて特
異的である放射線標識付けされた１７−ｍｅｒオリゴマにハイブリッド形成させ
た（配列分析の項も参照のこと）。プラスミドＤＮＡをｐＡＣＴクローンから分
離し、ＸｈｏＩ消化を用いて、ｃＤＮＡインサートの存在について分析した。

【００４３】 配列分析 アポプチン会合タンパク質をコードする配列を含有するサブクローンをＥｕｒ
ｏｇｅｎｔｅｃ（Ｓｅｒａｉｎｇ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）により実施されたＳａｎｇ
ｅｒ方法に従ってジデオキシＮＴＰを用いて部分的に配列決定した。使用された
配列決定用プライマは、ＤＮＡ配列５′−ＴＡＣＣＡＣＴＡＣＡＡＴＧＧＡＴＧ
−３′から成るｐＡＣＴ−特異的１７−ｍｅｒであった。

【００４４】 アポプチン会合ｃＤＮＡの配列を、ＥＭＢＬ／Ｇｅｎｂａｎｋからの既知の遺
伝子と比較した。

【００４５】 抗体の生成と試験 ＡＡＰ−４タンパク質に対するポリクローナル抗血清を生成するために、我々
は３つのペプチドを設計した。これらのペプチドは以下のとおりであった： １）ＥＥＳＴＰＶＨＤＳＰＧＫＤＤＡ ２）ＤＳＦＫＴＫＤＳＦＲＴＡＫＳＫ ３）ＩＤＩＤＩＳＳＲＲＲＥＤＱＳＬ これらのペプチドは、Ｃ末端システイン残基を標準的に追加すると共にＥｕｒ
ｏｇｅｎｔｅｃ（ベルギー）で合成され、その後の抗体合成も全てそこで行なわ
れた。これらのペプチドをキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）にカッ
プリングさせ、１つのカクテルとして、１回の注射およびその後の３回のブース
トという免疫化スケジュールで、２匹の別々の特異的病原菌をもたないウサギの
体内に注射した。免疫化の前後に血液標本を採取した。血清を、ＥＬＩＳＡによ
りペプチドカクテルに対する特異的反応性について内部でテストした。各ウサギ
からの力価は高いものであった（＞２０万以上）。その上、その後の一定の目的
のため、メーカーのプロトコルに従って、免疫化されたジアミノジプロピルアミ
ンアガロースカラム（Ｐｉｅｒｃｅ）にカップリングされたペプチドカクテルを
用いて、ＡＡＰ−４抗体を免疫精製した。

【００４６】 生成された２つのうちの最良のＡＡＰ−４抗体調製物を、さらなる使用のため
選択した。我々は、５μｇのＡＡＰ−４−ｍｙｃ構成体および対照としてのトラ
ンスフェクションを受けていない細胞を用いたリン酸カルシウム同時沈降法を使
用して、亜集密的霊長類ＣＯＳ−７およびヒトＵ２ＯＳ細胞の６ｃｍの平板をト
ランスフェクションすることによって、この抗体の効力をテストした。トランス
フェクションから２日後に、細胞をＰＢＳ内で短時間洗浄し、ＲＩＰＡ緩衝液（
１０ｍＭのトリス７．５，１５０ｍＭのＮａＣｌ，０．１％のＳＤＳ，１．０％
のＮＰ−４９および１．０％のデオキシキコール酸ナトリウム）中で溶解させ、
遠心分離により清澄させ、上清をＳＤＳ変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動上
で分留した。標準的な方法を用いて、タンパク質をＰＶＤＦ膜（Ｉｍｍｏｂｉｌ
ｏｎ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）にウェスタントランスファした。０．１％のＴｗｅ
ｅｎ−２０を含有するトリス緩衝食塩水中の５％の脱脂粉乳の中で膜を遮断し、
次に１：５０００の濃度で未精製ＡＡＰ−４抗血清中でインキュベートした。手
短かに洗浄した後、膜をさらに１：２０００の濃度でＨＲＰ接合されたヤギ−抗
ウサギＩｇ内でインキュベートした。徹底的な一連の洗浄段階の後、メーカーの
プロトコルに従って、増強したケミルミネセンス（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いて
タンパク質を検出し、Ｘ線フィルムに露呈し、標準的な自動化された機械を用い
て現像した。

【００４７】 さらに、我々は、遠心分離後に上清を、プロテインＡ−セファロースビーズに
予めカップリングされた１０μｌのＡＡＰ−４抗体に添加し、１時間タンブリン
グしながらインキュベートし、次にＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上での分留およびウェ
スタン分析の前に洗浄するという点を除いて、以上のものと同じ要領で免疫沈降
を用いて、精製済みＡＡＰ−４抗体をテストした。この場合検出は、抗−ｍｙｃ
タグモノクローナル抗体９Ｅ１０（Ｅｖａｎ ｅｔ ａｌ．１９８５）で実施さ
れた。

【００４８】 最後に、上述のトランスフェクションにガラス製カバースリップを内含するこ
とにより、免疫螢光における有用性について精製した抗体をテストした。カバー
スリップを４％のパラホルムアルデヒドで固定し、正常なヤギ血清で遮断し、１
：５で希釈したＡＡＰ−４抗体でインキュベートし、洗浄し、ＦＩＴＣ接合した
ヤギ−抗ウサギ−Ｉｇ内でインキュベートし、螢光顕微鏡にとりつけ視覚化させ
た。

【００４９】 ノーザンブロット分析 ＡＡＰ−４が腫瘍組織対正常組織内で示差的に発現されたか否かを検査するた
め、我々は、さまざまな組織型からの同じ患者に由来する腫瘍組織および正常組
織を含有する市販のノーザンブロット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，カタログ番号＃
Ｄ３１０００１）をテストした。ＤＮＡプローブは、ＡＡＰ−４の内部Ｈｉｎｄ
ＩＩＩ フラグメントに由来し、ＡｍｅｒｓｈａｍのＭｅｇａ Ｐｒｉｍｅキッ
トを用いて³²Ｐ−ｄＡＴＰで標識付けされた。予備ハイブリダイゼーション，ハ
イブリダイゼーションおよび洗浄段階は全て、ノーザンブロットメーカー推奨事
項に従って行なわれた。ブロットをオートラジオグラフィに付し、標準的な自動
化された方法を用いて現像した。

【００５０】 全長ＡＡＰ−４のクローニング Ｃｌｏｎｔｅｃｈからヒトの脳ｃＤＮＡライブラリを入手した（Ｍａｒａｔｈ
ｏｎ−Ｒｅａｄｙ（商標）ｃＤＮＡ）。ＡＡＰ−４のためのｃＤＮＡは、Ｍａｒ
ａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ（商標）ｃＤＮＡキット内に内含されたメーカーの指示
事項に従ってＲＡＣＥ−ＰＣＲ（ｃＤＮＡ末端の高速増幅）において生成された
。

【００５１】 ＲＡＣＥ−ＰＣＲのためには、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ９６００サーモサイ
クラの中で、以下の「タッチダウン」プログラムを使用した：９４℃３０秒を１
サイクル；９４℃５秒、７２℃３分を５サイクル；９４℃５秒、７０℃３分を５
サイクル；９４℃５秒、６８℃３分を２５サイクル。ＲＡＣＥ反応において使用
されるＡＡＰ−４プライマの配列は、以下の通りであった： ＡＡＰ−４＃３Ｆ ５′ＧＴＣ ＡＧＣ ＴＣＴ ＡＡＣ ＡＣＴ ＧＡＴ ＧＣＡ
ＧＡＴ ＡＣＣ ＡＣ３′ ＡＡＰ−４＃３Ｒ ５′ＧＴＧ ＧＴＡ ＴＣＴ ＧＣＡ ＴＣＡ ＧＴＧ ＴＴＡ
ＧＡＧ ＣＴＧ ＡＣ３′ ＲＡＣＥ産物を、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎからのＴＯＰＯ−ＴＡクローニングキッ
トの指示事項に従ってｐＣＲ（登録商標）４−ＴＯＰＯベクター内でクローニン
グした。クローニングされたＰＣＲ産物の配列を、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙ
ｓｔｅｍ（ＡＢＩ）Ｐｒｉｓｍ（登録商標）Ｂｉｇ Ｄｙｅ（商標）ターミネー
タ配列決定キットで増幅し、ＡＢＩ３１０毛細シーケンサ内で分析した。ＡＡＰ
−４の完全な読取り枠（ＯＲＦ）をその後、以下のＰＣＲ反応において増幅させ
た：９４℃３０秒で１サイクル；９４℃５秒、６８℃３分で３０サイクル。遺伝
子特異的プライマは以下の配列を有していた： ＡＡＰ−４＃８Ｆ ５′ ＧＡＧ ＡＧＴ ＧＡＣ ＴＡＡ ＡＴＧ ＣＡＣ ＣＴＧ
ＧＧＴ ＣＡＧ Ｇ ３′ ＡＡＰ−４＃９Ｒ ５′ ＧＴＴ ＡＴＣ ＣＣＡ ＧＧＴ ＣＡＡ ＧＴＴ ＡＡＧ
ＡＣＣ ３′ ｐＣＲ（登録商標）４−ＴＯＰＯベクター内にクローニングされた全長生成済み
産物を、前述のとおりに最終配列分析に付した。

【００５２】 結果と論述 アポプチンは、ヒト腫瘍由来の細胞系統といったような形質転換された細胞内
で特異的にアポプトーシスを誘発する。この細胞形質転換特異的および／または
腫瘍特異的アポプトーシス経路において不可欠な化合物を同定するため、酵母遺
伝子スクリーンを実施した。我々は、エプスタイン−バールウイルス形質転換ヒ
トＢ細胞から作られた完全なｃＤＮＡコピーを含有するプラスミドベクターｐＡ
ＣＴに基づく（ヒトｃＤＮＡライブラリを使用した（Ｄｕｒｆｅｅ ｅｔ ａｌ
．，１９９３）。

【００５３】 ＧＡＬ４−ＤＮＡ結合ドメインとアポプチンの融合遺伝子を発現するおとりプ
ラスミドの構築 ヒトの形質転換された／腫瘍発生ｃＤＮＡライブラリ内のアポプチン会合タン
パク質の存在を検査するためには、いわゆるおとりプラスミドを構築しなければ
ならなかった。この目的で、アポプチン遺伝子の下流側で約４０塩基対によって
フランキングされた完全なアポプチンコーディング領域を、プラスミドｐＧＢＴ
９の多数のクローニング部位でクローニングした。

【００５４】 ｐＧＢＴ−ＶＰ３と呼ばれる最終構成体を、制限酵素分析およびアポプチンと
ＧＡＬ４−ＤＮＡ結合ドメインの間の融合部域の配列決定により分析した。

【００５５】 アポプチン会合タンパク質をコードする遺伝子（フラグメント）が、酵母内の
ＧＡＬ４応答性プロモータのトランス活性化によって決定される。 形質転換されたヒトＢ細胞由来の全てのｃＤＮＡがプラスミドｐＡＣＴのＧＡ
Ｌ４活性化ドメインに融合される一方で、アポプチン遺伝子はプラスミドｐＧＢ
Ｔ−ＶＰ３のＧＡＬ４−ＤＮＡ結合ドメインに融合された。前記ｃＤＮＡにより
コードされたタンパク様物質のうちの１つがアポプチンに結合した場合、ＧＡＬ
４−ＤＮＡ結合ドメインは、ＧＡＬ４活性化ドメインの近辺にあることになり、
リポータ遺伝子 ＨＩＳ３およびＬａｃＺを調節するＧＡＬ４応答性プロモータ
の活性化を結果としてもたらす。

【００５６】 アポプチンを発現するプラスミドおよびアポプチン会合タンパク質フラグメン
トを発現するプラスミドを含有する酵母クローンは、ヒスチジンマイナス培地上
で成長でき、ベータガラクトシダーゼ検定において青色に着色することになる。
その後、アポプチン会合タンパク質をコードするｃＤＮＡインサートを伴うプラ
スミドを分離し特徴づけすることができる。

【００５７】 しかしながら、我々は、これを行なう前に、ｐＧＢＴ−ＶＰ３プラスミドを単
独、または空のｐＡＣＴベクターと組合せた形で用いて酵母細胞を形質転換する
ことによってＧＡＬ４応答性プロモータを活性化するという結果はもたらされな
いということを見極めた。

【００５８】 ヒト形質転換Ｂ細胞系統由来のｃＤＮＡによりコードされたアポプチン会合タ
ンパク質の同定 我々は、ｐＧＢＴ−ＶＰ３およびｐＡＣＴ−ｃＤＮＡでの形質転換の時点で、
ヒスチジンマイナス培地（同様にロイシンおよびトリプトファンが欠如している
）上で成長できかつベータ−ガラクトシダーゼ検定で青に染色する１つの酵母コ
ロニーを発見した。これらの結果は、観察された酵母コロニーがおとりプラスミ
ドｐＧＢＴ−ＶＰ３の他に潜在的アポプチン会合タンパク質をコードするｐＡＣ
Ｔプラスミドをも含有していたことを表している。

【００５９】 プラスミドＤＮＡを、陽性酵母コロニーから分離し、細菌中で形質転換させた
。ｐＡＣＴ特異的な標識づけされたＤＮＡプローブを用いたフィルタハイブリダ
イゼーション検定を用いて、ｐＡＣＴプラスミドを含有するクローンを決定する
ことができた。その後、ｐＡＣＴ ＤＮＡを分離し、制限酵素ＸｈｏＩで消化さ
せ、結果として２．１−ｋｂｐのｃＤＮＡインサートが存在した。最終的に、ｃ
ＤＮＡインサートを含有するｐＡＣＴプラスミドのインサートを、Ｓａｎｇｅｒ
方法（Ｓａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９７７）を用いて完全に配列決定した。

【００６０】 アポプチン会合タンパク質の説明 アポプチン会合タンパク質についての酵母遺伝子スクリーンは結果として、単
一のタイプのタンパク質すなわちアポプチン会合タンパク質４，略してＡＡＰ−
４と呼ばれる新規のタンパク質を含むｃＤＮＡクローンの検出をもたらした。

【００６１】 ＡＡＰ−４ｃＤＮＡクローンの決定されたＤＮＡ配列部分は図１に示されてい
る。クローンＡＡＰ−４の検出されたＤＮＡ配列由来のアミノ酸配列は、図２に
示されている。

【００６２】 哺乳動物の細胞におけるＡＡＰ−４の同定のための発現構成体の構築 クローニングされたｃＤＮＡ ＡＡＰ−４が実際にタンパク質産物をコードす
る（アポプチン会合）が否かを研究するため、我々は以下の実験を実施した。

【００６３】 ＤＮＡプラスミドｐＭＴ２ＳＭは、アデノウイルス５主要後期プロモータ（Ｍ
ＬＰ）、および、ＳＶ−４０形質転換Ｃｏｓ細胞といったような形質転換された
哺乳動物細胞内の外来性遺伝子の高い発現レベルを可能にするＳＶ４０ ｏｒｉ
を含有する。さらに、ｐＭＴ２ＳＭベクターは、外来性遺伝子産物と同一枠内に
あるＭｙｃ−タグ（アミノ酸：ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ）を含有する。このＭｙｃ
−タグはＭｙｃ−タグ特異的９Ｅ１０抗体を用いて例えばアポプチン会合タンパ
ク質の認識を可能にする。

【００６４】 Ｍｙｃでタグ付けされたＡＡＰ−４ｃＤＮＡを発現するｐＭＴ２ＳＭベクター
は、以下の通りに構築された。ｐＡＣＴ−ＡＡＰ−４ｃＤＮＡクローンを制限酵
素ＸｈｏＩで消化し、ｃＤＮＡインサートを分離した。発現ベクターｐＭＴ２Ｓ
ＭをＸｈｏＩで消化し、子ウシ腸アルカリホスファターゼで処理し、分離したＡ
ＡＰ−４ｃＤＮＡインサートに連結させた。配列分析により、適正な配向でＡＡ
Ｐ−４ｃＤＮＡを含有するｐＭＴ２ＳＭ構成体を同定した。

【００６５】 Ｍｙｃでタグ付けされたＡＡＰ−４タンパク質の合成を、プラスミドｐＭＴ２
ＳＭ−ＡＡＰ−４でのＣｏｓ細胞のトランスフェクションにより分析した。負の
対照として、Ｃｏｓ細胞をモックトランスフェクションした。トランスフェクシ
ョンの２日後に、細胞を溶解させ、Ｍｙｃタグ特異的抗体９Ｅ１０を用いて、ウ
ェスタンブロット分析を実施した。

【００６６】 ｐＭＴ２ＳＭ−ＡＡＰ−４でトランスフェクションされたＣｏｓ細胞は、約６
０〜６５ｋＤａのサイズをもつ特異的なＭｙｃタグ付けされたＡＡＰ−４産物を
合成することが証明された。予想されたように、モックトランスフェクションさ
れたＣｏｓ細胞の溶解産物は、Ｍｙｃタグ特異的抗体と反応するタンパク質産物
を含有していなかった。

【００６７】 これらの結果は、我々がアポプトーシス誘発タンパク質アポプチンに会合する
能力をもつタンパク質産物を産生することのできるｃＤＮＡを分離できたという
ことを表わしている。

【００６８】 形質転換された哺乳動物細胞システム内でのＭｙｃタグ付けされたＡＡＰ−４
タンパク質とアポプチンの同時免疫沈降 次に、我々は、Ｍｙｃ−タグ−特異的抗体９Ｅ１０を用いた同時免疫沈降法を
利用してアポプチンとＡＡＰ−４の会合を分析した。９Ｅ１０抗体は、アポプチ
ンに直接結合しないことが示されており、このことにより、（ｍｙｃタグ付けさ
れた）アポプチン会合タンパク質とアポプチンを用いて同時免疫沈降法を実施す
るために９Ｅ１０を使用することが可能である。

【００６９】 このため、Ｃｏｓ細胞を、アポプチンをコードするプラスミドｐＣＭＶ−ＶＰ
３およびプラスミドｐＭＴ２ＳＭ−ＡＡＰ−４で同時にトランスフェクションし
た。負の対照として、細胞を、アポプチンを発現するｐＣＭＶ−ＶＰ３および、
アポプチンと会合しないｍｙｃタグ付けされたベータ−ガラクトシダーゼをコー
ドするプラスミドｐｃＤＮＡ３．１．ＬａｃＺ−ｍｙｃ／Ｈｉｓ−ＬａｃＺでト
ランスフェクションした。

【００７０】 トランスフェクションの２日後、細胞を、５０ｍＭのトリス（７．５），２５
０ｍＭのＮａＣｌ，５ｍＭのＥＤＴＡ，０．１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ１００，１
ｍｇ／ｍｌのＮａ₄Ｐ₂Ｏ₇そして添加されたばかりのＰＭＳＦトリプシン−阻害
物質、ロイペプシンおよびＮａ₃ＶＯ₄といったようなプロテアーゼ阻害物質から
成る緩衝液の中で溶解させた。特異的タンパク質を、Ｍｙｃ−タグ特異的抗体９
Ｅ１０を用いてＮｏｔｅｂｏｒｎ ｅｔ ａｌ．（１９９８）により記述された
とおりに免疫沈降させ、ウェスタンブロット法により分析した。

【００７１】 それぞれｍｙｃ−タグおよびアポプチンに対し特異的に導かれた９Ｅ１０抗体
および１１１．３抗体を用いたウェスタンブロット法の染色は、「全」細胞溶解
産物が、１６−ｋＤａのアポプチン産物およびＭｙｃ−タグ付けされたＡＡＰ−
４タンパク質またはベータガラクトシダーゼ産物を含有することを示した。Ｍｙ
ｃ−タグ付けされたＡＡＰ−４産物の免疫沈降には、１６ｋＤａのアポプチン産
物の免疫沈降が随伴していた。これに対し、ｍｙｃ−タグ付けされたベータガラ
クトシダーゼの免疫沈降は、結果としてアポプチンタンパク質の有意な同時沈降
を結果としてもたらさなかった。さらに、アポプチンのＣ末端部分（Ｎｏｔｅｂ
ｏｒｎおよびＤａｎｅｎ，未公表結果）に対して導かれたポリクローナル抗体を
用いたアポプチンタンパク質の免疫沈降には、６０−６５ｋＤａのｍｙｃ−タグ
付けされたＡＡＰ−４産物の免疫沈降が随伴していた。

【００７２】 合計して、３つの独立した免疫沈降実験が実施され、その全てがＡＡＰ−４タ
ンパク質に対するアポプチンの会合能力を示した。

【００７３】 これらの結果は、新規に決定されたＡＡＰ−４タンパク質が、酵母の背景にお
いてのみならず哺乳動物の形質転換された細胞システムにおいてもアポプチンと
特異的に会合することができるということを表わしている。

【００７４】 機能的ｐ５３が欠如したヒト骨肉腫Ｓａｏｓ−２細胞内の新規のＡＡＰ−４タン
パク質の過剰発現が、アポプトーシスプロセスを誘発する。 我々は、ＡＡＰ−４がＳａｏｓ−２細胞内でアポプトーシス活性の担体である
か否かを検査した。まず第１に、我々は、ヒトの形質転換された細胞内での新規
のＡＡＰ−４タンパク質の細胞局在化を分析した。この目的のため、Ｄａｎｅｎ
−ｖａｎ Ｏｏｒｓｃｈｏｔ（１９９７年）によって記述されているように、そ
れぞれｍｙｃ−タグ付けされたＡＡＰ−４タンパク質をコードするプラスミドｐ
ＭＴ２ＳＭ−ＡＡＰ−４で、骨肉腫由来のＳａｏｓ−２細胞をトランスフェクシ
ョンした。

【００７５】 核ＤＮＡを染色するｍｙｃ−タグ特異的抗体９Ｅ１０およびＤＡＰＩを用いた
間接的免疫螢光により、細胞の核内にＡＡＰ−４タンパク質が存在することが示
された。それは、クロマチン／ＤＮＡ構造と同時局在化することが最も多い。

【００７６】 腫瘍の発達中、大部分の腫瘍には、機能的腫瘍サプレッサｐ５３が欠如するこ
とになる。機能的ｐ５３が欠如した腫瘍細胞は一般に（化学）療法作用物質に対
する応答性が低い。従って、ＡＡＰ−４が機能的ｐ５３の不在下でヒト腫瘍細胞
内でアポプトーシスを誘発できるか否かを証明することが重要である。

【００７７】 この目的で、我々は、ＡＡＰ−４タンパク質の（過剰）発現がアポプトーシス
の誘発を結果としてもたらすか否かを検査した。トランスフェクションから４日
後に、大部分のＡＡＰ−４陽性細胞は、ＤＡＰＩで異常に染色され、これはアポ
プトーシスの誘発を表わしている（Ｔｅｌｆｏｒｄ，１９９２，Ｄａｎｅｎ−ｖ
ａｎ Ｏｏｒｓｃｈｏｔ，１９９７）。アポプチンを発現する細胞は、同様にア
ポプトーシスを受けたがＡＡＰ−４産生細胞よりはわずかに少なく、一方予想さ
れたとおり、非アポプトーシスベータガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）タンパク質
を合成する細胞は、これを受けなかった。結果は図３に示されている。

【００７８】 Ｓａｏｓ−２細胞といったようなヒト腫瘍細胞中のアポプチンおよびＡＡＰ−
４タンパク質の同時発現は、アポプチンまたはＡＡＰ−４タンパク質単独の発現
としてより速いアポプトーシスプロセスを結果としてもたらす（図３）。

【００７９】 ＡＡＰ−４タンパク質がｐ５３マイナスＳａｏｓ−２細胞内でアポプトーシス
を誘発できるという事実は、ＡＡＰ−４がｐ５３独立型アポプトーシスを誘発で
きるということを表わす。これらの結果は、その他の（化学）療法作用物質が良
好に作用しない場合において抗腫瘍剤としてＡＡＰ−４を使用することができる
、ということを暗示している。さらに、アポプチンおよびＡＡＰ−４の両方が、
ｐ５３独立型経路を誘導するという発見事実は、ＡＡＰ−４がアポプチンで誘発
されたアポプトーシス経路に適合するということを表わしている。

【００８０】 結論として、我々は、アポプチン会合タンパク質，すなわち核の中に存在しヒ
ト腫瘍細胞内で（ｐ５３独立型）アポプトーシスを誘発することのできる新規の
ＡＡＰ−４タンパク質を同定した。

【００８１】 野生型ｐ５３を発現するヒト骨肉腫Ｕ２ＯＳ細胞内の新規のＡＡＰ−４タンパ
ク質の過剰発現がアポプトーシスプロセスを誘発する。 我々は同様に、付加的な細胞系統内でのＡＡＰ−４の活性を検査することにも
関心をもった。この目的で、我々は、ｍｙｃでタグ付けされたＡＡＰ−４タンパ
ク質をコードするプラスミドｐＭＴ２ＳＭ−ＡＡＰ−４を用いて野生型ｐ５３を
発現するヒト骨肉腫由来のＵ２ＯＳ細胞をトランスフェクションした。対照とし
て、Ｕ２ＯＳ細胞を、ｍｙｃタグ付けされたＬａｃＺをコードするプラスミドｐ
ＣＭＶ−ＬａｃＺでトランスフェクションした。トランスフェクションから４〜
５日後、細胞を固定し、ｍｙｃタグ特異的抗体９Ｅ１０を用いた免疫螢光を用い
てｍｙｃタグ付けされたＡＡＰ−４発現について、又、ＤＡＰＩ染色によりアポ
プトーシス活性について分析した。Ｕ２ＯＳ細胞はＤＡＰＩで異常に染色され、
一方ｍｙｃタグ付けされたＬａｃＺを含有する細胞は染色されず、これは、ＡＡ
Ｐ−４特異的アポプトーシスの誘発を表わしている。

【００８２】 これらの実験は３回くり返され、ＡＡＰ−４単独が同じくＵ２ＯＳ腫瘍細胞を
も殺すことを明らかに示した（図３）。かくして、ｐ５３の有無は、（アポプチ
ンと同様）ＡＡＰ−４活性にとって関連性のないことであり、こうして、ＡＡＰ
−４の腫瘍−標的スペクトルは広がることになる。

【００８３】 ＡＡＰ−４はアポプトーシス構造を局在化する。 ＣＡＶ誘発されたアポプトーシスの衝撃的な特長の１つは、アポプトーシスプ
ロセス中に発生する「円形」アポプチン陽性構である（Ｎｏｔｅｂｏｒｎ ｅｔ
ａｌ．，１９９４）。これらの構造は、アポプトーシス中の早期の時点で核の
中で目に見え、後の段階で円または円形の外観または構造としてより一層明確に
構造化されることになる。我々は今や、ＡＡＰ−４がアポプチンについて記述し
たのと同じ「円形」構造で位置設定されていることを発見した。我々は、（ｍｙ
ｃタグ付けされた）ＡＡＰ−４およびアポプチンの両方を同時発現する細胞を分
析した。Ｓａｏｓ−２細胞は、ｐＭＴ２ＳＮ−ＡＡＰ−４およびｐＣＭＶ−アポ
プチンで同時トランスフェクションされた（Ｄａｎｅｎ−ｖａｎ Ｏｏｒｓｃｈ
ｏｔ，１９９７）。ＡＡＰ−４またはアポプチンを検出する抗体およびＦＩＴＣ
またはローダミン標識付けされた二次抗体接合体を検出する両方の抗体を用いた
間接的免疫螢光法を、Ｄａｎｅｎ−ｖａｎ Ｏｏｒｓｃｈｏｔ １９９７ａによ
り記述された通りに実施し、これは、「円形」構造がアポプチンおよびＡＡＰ−
４タンパク質の両方を含有することを証明した。これらの構造内で、アポプチン
およびＡＡＰ−４は互いに部分的に同時局在化する。ＣＡＶ−および／またはア
ポプチンと会合したアポプトーシス構造と会合するのは（ヒト（腫瘍）細胞に由
来する）第１の細胞タンパク質である。これらの構造の概略的表現は図４に与え
られている。

【００８４】 ＡＡＰ−４が単独でＳａｏｓ−２腫瘍細胞内で発現された時点で、染色パター
ンは、染色が欠如した大きい円形構造に加えて拡散的に中断した核染色であり、
核内でブラックホールの外観を与えていた。これとは対照的に、ＡＡＰ−４構成
体を発現する正常なＶＨ１０細胞はかかるブラックホールの形跡の全く無い拡散
した核染色のみを示していた。これらの結果は、アポプチンの不在下でのＡＡＰ
−４の腫瘍特異的分布を強く示唆している。

【００８５】 結論として、我々は、ＡＡＰ−４タンパク質の機能との特異的因子の干渉がア
ポプトーシスの誘発を結果としてもたらすという証拠を提供した。（ｐ５３と独
立した）アポプトーシスの誘発に基づく療法は、ＡＡＰ−４タンパク質の機能と
の干渉を利用して可能である。かかる干渉因子の一例がアポプチンである。アポ
プチンを誘発するものとして知られて同じくアポプチン活性を増強するものとし
ても知られているもう１つのＣＡＶ由来のタンパク質はＶＰ２である（Ｎｏｔｅ
ｂｏｒｎ ｅｔ ａｌ．，１９９７）。

【００８６】 ＡＡＰ−４抗血清の有用性 生成された２つのうち最高のＡＡＰ−４抗体を、さらなる使用のために選択し
た。我々は、霊長類ＣＯＳ−７およびヒトＵ２ＯＳ細胞をＡＡＰ−４−ｍｙｃ構
成体でトランスフェクションすることにより、この抗体の効力をテストした。ウ
ェスタン分析は、ＤＮＡがトランスフェクションされた標本内でのみおよそ６０
〜６５ｋＤａのＡＡＰ−４ｍｙｃタンパク質が強く検出されることを示した。同
様にして、免疫沈降実験では、ＡＡＰ−４−ｍｙｃが同じく強く検出された。最
後に、我々は、免疫螢光分析においてこのＡＡＰ−４抗体を使用して核内のＡＡ
Ｐ−４の存在を検出することができた。

【００８７】 ノーザンブロット分析 ＡＡＰ−４が腫瘍組織対正常組織内で示差的に発現されたか否かを検査するた
め、我々は、さまざまな組織型からの同じ患者に由来する腫瘍組織および正常組
織を含有する市販のノーザンブロット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，カタログ番号＃
Ｄ３１０００１）をテストした。

【００８８】 同じ患者の関与していない脳からの同量のＲＮＡの中には存在しなかった正常
な脳の組織の中で発現された約６〜７ｋｂの非常に大きいＲＮＡが存在した。し
かしながら、正常な脳の標本内では、スプライス変異体の存在を表わしうるはる
かに小さなかすかなバンドが見受けられた。

【００８９】 全長ＡＡＰ−４のクローニングおよび配列分析 ヒトＡＡＰ−４ＤＮＡ配列のさらなる配列分析は、図５に示された長さ５６９
０ｂｐの核酸配列を生み出した。位置２３６〜２８６６で、この核酸配列内で読
取り枠が発見された。演繹されたアミノ酸配列は、図６に示されている。

【００９０】 ヒトＡＡＰ−４タンパク質のアミノ酸配列内で、ＳＥＴドメインと呼ばれるタ
ンパク質ドメインが発見された。これは、アミノ酸１８５からアミノ酸３０４ま
での領域にまたがっている。

【００９１】 ＳＥＴドメインは、酵母から哺乳動物まで遺伝子活性を変調させる上で機能す
る染色体タンパク質の中に存在する１３０アミノ酸の進化的に保存された配列モ
チーフである。当初Ｐｏｌｙｃｏｍｂ−およびｔｒｉｔｈｏｒａｘ−基（Ｐｃ−
Ｇおよびｔｒｘ−Ｇ）遺伝子ファミリーの成員として同定されたこれらの遺伝子
は、クロマチン構造の一部の側面が関与すると考えられている１つのメカニズム
を通してホメオチック遺伝子の発現を調節する。このモチーフをもつその他のタ
ンパク質が同様に、ＳＥＴドメインがクロマチン媒介遺伝子調節そして場合によ
っては染色体アーキテクチャの決定に関与するという示唆を裏付ける付加的なド
メインまたは特徴を有する。これらの観察事実は、真性クロマチンおよびヘテロ
クロマチンの両方における活性をもつ多機能クロマチン調節因子としてのＳＥＴ
ドメインタンパク質を含意している（Ｔ．Ｊｅｎｕｗｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，１
９９８，Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．５４，８０−９３）。

【００９２】 最近になって、ＳＥＴドメインが、転写活性化または抑制またはリン酸化反応
に関与する多成分複合体の活性のために重要なタンパク質−タンパク質相互作用
ドメインであることが立証されてきた（Ｔ．Ｒｏｚｏｖｓｋａｉａ ｅｔ ａｌ
２０００，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １９，３５１−３５７）。ＳＥＴドメインは、
全てが高い割合のヒト白血病に発見される染色体転座由来の異常な融合タンパク
質の一部であるＨＲＸ／ＡＬＬ１／ＭＬＬ／Ｈｔｒｘ，ＭＯＺおよびＭＭＳＥＴ
といったようなヒト腫瘍発生と密に関連する一定数のタンパク質の中に発見され
る（Ｓ．Ｊａｃｏｂｓｏｎ ａｎｄ Ｌ．Ｐｉｌｌｕｓ １９９９，Ｃｕｒｒ．
Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｇｅｎ ＆ Ｄｅｖ，９，１７５−１８４）。

【００９３】 かかるＳＥＴドメインをアポプチン会合タンパク質内で同定したのは本発明が
初めてであり、従って、ＡＡＰ−４のＳＥＴドメインの機能的活性に影響を及ぼ
すことは、腫瘍に対する治療効果を有するはずである。ＳＥＴドメインは、ＳＥ
Ｔドメインに結合する物質を同定するために使用可能である。これは、例えば、
ＳＥＴドメインを含むＡＡＰ−４ペプチドが１つの基質に結合されテスト物質が
ＡＡＰ−４ペプチドに結合するか否かがテストされる結合研究によって、または
ＳＥＴドメインを含むＡＡＰ−４ペプチドに対して生成される抗体を用いてテス
ト物体とＳＥＴドメインを含むＡＡＰ−４ペプチドを同時免疫沈降させることに
よって、といったような当業者にとっては既知の方法によって行なわれることに
なる。テスト物質は、例えば、化合物ライブラリに由来する小さな有機化合物、
または、ペプチドライブラリまたは細胞抽出物といったような天然供給源に由来
する、ペプチドまたはタンパク質である。テスト物質は例えば、より容易に検出
するため標識付けされる。ＳＥＴドメインに結合することがわかっている物質は
、ＡＡＰ−４の単数または複数の効果を、増強または阻害することができる。こ
れは、前記物質の存在下で上述の通りＡＡＰ−４のアポプトーシス活性を測定す
ることおよび前記物質の存在下で上述の通りＡＡＰ−４の核局在化を決定するこ
とによって、テストされる。

【００９４】

【図面の簡単な説明】

【図１】 ベクターｐＭＴ２ＳＭ−ＡＡＰ−４の部分配列を示す。ＡＡＰ−４ｃＤＮＡの
ＤＮＡ配列は、ＤＮＡ配列の位置１２で開始し、「開始ＡＡＰ−４ｃＤＮＡ」と
して表わされている。

【図２】 アポプチン会合クローンＡＡＰ−４（太字）の分析された領域のアミノ酸配列
を示す。さらに、ｐＡＣＴの多数のクローニング部位の３つのＣ末端アミノ酸Ｈ
−Ｅ−Ｇは、ＡＡＰ−４アミノ酸配列がＧＡＬ４活性化ドメインと同一枠内にあ
ることを例示するために与えられている。この特長は、ＡＡＰ−４領域が実際に
酵母細胞内で合成されることを証明している。

【図３】 ヒト骨肉腫由来のＳａｏｓ−２細胞およびヒト骨肉腫Ｕ２ＯＳ細胞内のＡＡＰ
−４タンパク質および／またはアポプチンのアポプトーシス活性を示す。（−）
：アポプトーシス活性無し；（＋＋）：強いアポプトーシス活性；（＋＋＋）：
非常に強いアポプトーシス活性。合計３つの独立した実験が、両方の細胞型につ
いて実施された。

【図４】 アポプトーシスを受けるヒト腫瘍細胞内で見られる、ＡＡＰ−４タンパク質を
含む核「円形」アポプトーシス構造の概略的表示を示す。

【図５】 全長ＡＡＰ−４の核酸配列を示す。

【図６】 図５の核酸配列から演繹されたアミノ酸配列を示す。

【図７】 ＡＡＰ−４タンパク質のＳＥＴドメインを示す。

【手続補正書】

【提出日】平成１４年１０月２５日（２００２．１０．２５）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００９４

【補正方法】変更

【補正の内容】

【００９４】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> レアト ベー．フェー． <120> アポプチン会合タンパク質 <160> 15 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: pACT-primer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(17) <400> 1 taccactaca atggatg 17 <210> 2 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: peptides to generate polyclonal antibodies <220> <221> SITE <222> (1)..(15) <400> 2 Glu Glu Ser Thr Pro Val His Asp Ser Pro Gly Lys Asp Asp Ala 1 5 10 15 <210> 3 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: peptides to generate polyclonal antibodies <220> <221> SITE <222> (1)..(15) <400> 3 Asp Ser Phe Lys Thr Lys Asp Ser Phe Arg Thr Ala Lys Ser Lys 1 5 10 15 <210> 4 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: peptides to generate polyclonal antibodies <220> <221> SITE <222> (1)..(15) <400> 4 Ile Asp Ile Asp Ile Ser Ser Arg Arg Arg Glu Asp Gln Ser Leu 1 5 10 15 <210> 5 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer AAP-4#3F <220> <221> misc_feature <222> (1)..(29) <400> 5 gtcagctcta acactgatgc agataccac 29 <210> 6 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer AAP-4#3R <220> <221> misc_feature <222> (1)..(29) <400> 6 gtggtatctg catcagtgtt agagctgac 29 <210> 7 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence < 220> <223> Description of Artificial Sequence: primer AAP-4#8F <220> <221> misc_feature <222> (1)..(28) <400> 7 gagagtgact aaatgcacct gggtcagg 28 <210> 8 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer AAP-4#9R <220> <221> misc_feature <222> (1)..(24) <400> 8 gttatcccag gtcaagttaa gacc 24 <210> 9 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Myc-tag <220> <221> SITE <222> (1)..(10) <400> 9 Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu 1 5 10 <210> 10 <211> 770 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: sequence of AAP-4 <220> <221> CDS <222> (12)..(512) <400> 10 gccacgaagg c cgg gag agc tcg ccc tgc acc tac ata act cgg cgg tca 50 Arg Glu Ser Ser Pro Cys Thr Tyr Ile Thr Arg Arg Ser 1 5 10 gtg agg aca aga aca aat ctg aag gag gcc tct gac atc aag ctt gaa 98 Val Arg Thr Arg Thr Asn Leu Lys Glu Ala Ser Asp Ile Lys Leu Glu 15 20 25 cca aat acg ttg aat ggc tat aaa agc agt gtg acg gaa cct tgc ccc 146 Pro Asn Thr Leu Asn Gly Tyr Lys Ser Ser Val Thr Glu Pro Cys Pro 30 35 40 45 gac agt ggt gaa cag ctg cag cca gct cct gtg ctg cag gag gaa gaa 194 Asp Ser Gly Glu Gln Leu Gln Pro Ala Pro Val Leu Gln Glu Glu Glu 50 55 60 ctg gct cat gag act gca caa aaa ggg gag gca aag tgt cat aag agt 242 Leu Ala His Glu Thr Ala Gln Lys Gly Glu Ala Lys Cys His Lys Ser 65 70 75 gac aca ggc atg tcc aaa aag aag tca cga caa gga aaa ctt gtg aaa 290 Asp Thr Gly Met Ser Lys Lys Lys Ser Arg Gln Gly Lys Leu Val Lys 80 85 90 cag ttt gca aaa ata gag gaa tct act cca gtg cac gat tct cct gga 338 Gln Phe Ala Lys Ile Glu Glu Ser Thr Pro Val His Asp Ser Pro Gly 95 100 105 aaa gac gac gcg gta cca gat ttg atg ggt ccc cat tct gac cag ggt 386 Lys Asp Asp Ala Val Pro Asp Leu Met Gly Pro His Ser Asp Gln Gly 110 115 120 125 gag cac agt ggc act gtg ggc gtg cct gtg agc tac aca gac tgt gct 434 Glu His Ser Gly Thr Val Gly Val Pro Val Ser Tyr Thr Asp Cys Ala 130 135 140 cct tca ccc gtc ggt tgt tca gtt gtg aca tca gat agc ttc aaa aca 482 Pro Ser Pro Val Gly Cys Ser Val Val Thr Ser Asp Ser Phe Lys Thr 145 150 155 aaa gac agc ttt aga act gca aaa aag taa aaagaagagg cgaatcacaa 532 Lys Asp Ser Phe Arg Thr Ala Lys Lys 160 165 ggtatgatgc acagttaatc ctagaaaata actctgggag tcccaaattg actcttcgta 592 ggcgtcatga tagcagcagc aaaacaaatg gaccaagaga atgatgggaa tgaaactctt 652 cccaaaatta agcatcaagt ttaagccaaa gaccatgaca acgataacaa tctcgatgta 712 gcaaagttat aagggtttag ctcaggatta ggaatgtttc acaaaattaa aaaggcat 770 <210> 11 <211> 166 <212> PRT <213> Homo sapiens <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: sequence of AAP-4 <400> 11 Arg Glu Ser Ser Pro Cys Thr Tyr Ile Thr Arg Arg Ser Val Arg Thr 1 5 10 15 Arg Thr Asn Leu Lys Glu Ala Ser Asp Ile Lys Leu Glu Pro Asn Thr 20 25 30 Leu Asn Gly Tyr Lys Ser Ser Val Thr Glu Pro Cys Pro Asp Ser Gly 35 40 45 Glu Gln Leu Gln Pro Ala Pro Val Leu Gln Glu Glu Glu Leu Ala His 50 55 60 Glu Thr Ala Gln Lys Gly Glu Ala Lys Cys His Lys Ser Asp Thr Gly 65 70 75 80 Met Ser Lys Lys Lys Ser Arg Gln Gly Lys Leu Val Lys Gln Phe Ala 85 90 95 Lys Ile Glu Glu Ser Thr Pro Val His Asp Ser Pro Gly Lys Asp Asp 100 105 110 Ala Val Pro Asp Leu Met Gly Pro His Ser Asp Gln Gly Glu His Ser 115 120 125 Gly Thr Val Gly Val Pro Val Ser Tyr Thr Asp Cys Ala Pro Ser Pro 130 135 140 Val Gly Cys Ser Val Val Thr Ser Asp Ser Phe Lys Thr Lys Asp Ser 145 150 155 160 Phe Arg Thr Ala Lys Lys 165 <210> 12 <211> 256 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> SITE <222> (1)..(256) <223> /note="Amino-acid sequence of the analysed region of the Apoptin-associating clone AAP-4, wherein X on position 170, 179, 187, 197, 200, 201, 237 and 247 is a stopcodon" <400> 12 His Glu Gly Arg Glu Ser Ser Pro Cys Thr Tyr Ile Thr Arg Arg Ser 1 5 10 15 Val Arg Thr Arg Thr Asn Leu Lys Glu Ala Ser Asp Ile Lys Leu Glu 20 25 30 Pro Asn Thr Leu Asn Gly Tyr Lys Ser Ser Val Thr Glu Pro Cys Pro 35 40 45 Asp Ser Gly Glu Gln Leu Gln Pro Ala Pro Val Leu Gln Glu Glu Glu 50 55 60 Leu Ala His Glu Thr Ala Gln Lys Gly Glu Ala Lys Cys His Lys Ser 65 70 75 80 Asp Thr Gly Met Ser Lys Lys Lys Ser Arg Gln Gly Lys Leu Val Lys 85 90 95 Gln Phe Ala Lys Ile Glu Glu Ser Thr Pro Val His Asp Ser Pro Gly 100 105 110 Lys Asp Asp Ala Val Pro Asp Leu Met Gly Pro His Ser Asp Gln Gly 115 120 125 Glu His Ser Gly Thr Val Gly Val Pro Val Ser Tyr Thr Asp Cys Ala 130 135 140 Pro Ser Pro Val Gly Cys Ser Val Val Thr Ser Asp Ser Phe Lys Thr 145 150 155 160 Lys Asp Ser Phe Arg Thr Ala Lys Lys Xaa Lys Glu Glu Ala Asn His 165 170 175 Lys Val Xaa Cys Thr Val Asn Pro Arg Lys Xaa Leu Trp Glu Ser Gln 180 185 190 Ile Asp Ser Ser Xaa Ala Ser Xaa Xaa Gln Gln Gln Asn Lys Trp Thr 195 200 205 Lys Arg Met Met Gly Met Lys Leu Phe Pro Lys Leu Ser Ile Lys Phe 210 215 220 Lys Pro Lys Thr Met Thr Thr Ile Thr Ile Ser Met Xaa Gln Ser Tyr 225 230 235 240 Lys Gly Leu Ala Gln Asp Xaa Glu Cys Phe Thr Lys Leu Lys Arg His 245 250 255 <210> 13 <211> 5690 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: nucleic acid sequence of full-length AAP-4 <220> <221> CDS <222> (236)..(2866) <400> 13 cggcagggca gcggggcgat gaggtgagga cgcccgggaa ccggaggcgg caccgcgcgg 60 cgcacggacc tgggacgcgg agtcctgaag ccggcggacg gttttcgtac gggcggccgt 120 gcgcgaggcg aggagagaac attgaaagta ttctctaagc tatttgaaga gagtgactaa 180 atgcacctgg gtcaggctgt ctgtgggtat gaagtggttg ggagaatcca agaac atg 238 Met 1 gtg gtg aat ggc agg aga aat gga ggc aag ttg tct aat gac cat cag 286 Val Val Asn Gly Arg Arg Asn Gly Gly Lys Leu Ser Asn Asp His Gln 5 10 15 cag aat caa tca aaa tta cag cac acg ggg aag gac acc ctg aag gct 334 Gln Asn Gln Ser Lys Leu Gln His Thr Gly Lys Asp Thr Leu Lys Ala 20 25 30 ggc aaa aat gca gtc gag agg agg tcg aac aga tgt aat ggt aac tcg 382 Gly Lys Asn Ala Val Glu Arg Arg Ser Asn Arg Cys Asn Gly Asn Ser 35 40 45 gga ttt gaa gga cag agt cgc tat gta cca tcc tct gga atg tcc gcc 430 Gly Phe Glu Gly Gln Ser Arg Tyr Val Pro Ser Ser Gly Met Ser Ala 50 55 60 65 aag gaa ctc tgt gaa aat gat gac cta gca acc agt ttg gtt ctt gat 478 Lys Glu Leu Cys Glu Asn Asp Asp Leu Ala Thr Ser Leu Val Leu Asp 70 75 80 ccc tat tta ggt ttt caa aca cac aaa atg aat act agc gcc ttt cct 526 Pro Tyr Leu Gly Phe Gln Thr His Lys Met Asn Thr Ser Ala Phe Pro 85 90 95 tcg agg agc tca agg cat ttt tca aaa tct gac agt ttt tct cac aac 574 Ser Arg Ser Ser Arg His Phe Ser Lys Ser Asp Ser Phe Ser His Asn 100 105 110 aac cct gtg aga ttt agg cct att aaa gga agg cag gaa gaa cta aag 622 Asn Pro Val Arg Phe Arg Pro Ile Lys Gly Arg Gln Glu Glu Leu Lys 115 120 125 gaa gta att gaa cgt ttt aag aaa gat gaa cac ttg gag aaa gcc ttc 670 Glu Val Ile Glu Arg Phe Lys Lys Asp Glu His Leu Glu Lys Ala Phe 130 135 140 145 aaa tgt ttg act tca ggc gaa tgg gca cgg cac tat ttt ctc aac aag 718 Lys Cys Leu Thr Ser Gly Glu Trp Ala Arg His Tyr Phe Leu Asn Lys 150 155 160 aat aaa atg cag gag aaa tta ttc aaa gaa cat gta ttt att tat ttg 766 Asn Lys Met Gln Glu Lys Leu Phe Lys Glu His Val Phe Ile Tyr Leu 165 170 175 cga atg ttt gca act gac agt gga ttt gaa ata ttg cca tgt aat aga 814 Arg Met Phe Ala Thr Asp Ser Gly Phe Glu Ile Leu Pro Cys Asn Arg 180 185 190 tac tca tca gaa caa aat gga gcc aaa ata gtt gca aca aaa gag tgg 862 Tyr Ser Ser Glu Gln Asn Gly Ala Lys Ile Val Ala Thr Lys Glu Trp 195 200 205 aaa cga aat gac aaa ata gaa tta ctg gtg ggt tgt att gcc gaa ctt 910 Lys Arg Asn Asp Lys Ile Glu Leu Leu Val Gly Cys Ile Ala Glu Leu 210 215 220 225 tca gaa att gag gag aac atg cta ctt aga cat gga gaa aac gac ttc 958 Ser Glu Ile Glu Glu Asn Met Leu Leu Arg His Gly Glu Asn Asp Phe 230 235 240 agt gtc atg tac tcc aca agg aaa aac tgt gct caa ctc tgg ctg ggt 1006 Ser Val Met Tyr Ser Thr Arg Lys Asn Cys Ala Gln Leu Trp Leu Gly 245 250 255 cct gct gcg ttt ata aac cat gat tgc aga cct aat tgt aag ttt gtg 1054 Pro Ala Ala Phe Ile Asn His Asp Cys Arg Pro Asn Cys Lys Phe Val 260 265 270 t ca act ggt cga gat aca gca tgt gtg aag gct cta aga gac att gaa 1102
Ser Thr Gly Arg Asp Thr Ala Cys Val Lys Ala Leu Arg Asp Ile Glu 275 280 285 cct gga gaa gaa att tct tgt tat tat gga gat ggg ttc ttt gga gaa 1150 Pro Gly Glu Glu Ile Ser Cys Tyr Tyr Gly Asp Gly Phe Phe Gly Glu 290 295 300 305 aat aat gag ttc tgc gag tgt tac act tgc gaa aga cgg ggc act ggt 1198 Asn Asn Glu Phe Cys Glu Cys Tyr Thr Cys Glu Arg Arg Gly Thr Gly 310 315 320 gct ttt aaa tcc aga gtg gga ctg cct gcg cct gct cct gtt atc aat 1246 Ala Phe Lys Ser Arg Val Gly Leu Pro Ala Pro Ala Pro Val Ile Asn 325 330 335 agc aaa tat gga ctc aga gaa aca gat aaa cgt tta aat agg ctt aaa 1294 Ser Lys Tyr Gly Leu Arg Glu Thr Asp Lys Arg Leu Asn Arg Leu Lys 340 345 350 aag tta ggt gac agc agc aaa aat tca gac agt caa tct gtc agc tct 1342 Lys Leu Gly Asp Ser Ser Lys Asn Ser Asp Ser Gln Ser Val Ser Ser 355 360 365 aac act gat gca gat acc act cag gaa aaa aac aat gca act tct aac 1390 Asn Thr Asp Ala Asp Thr Thr Gln Glu Lys Asn Asn Ala Thr Ser Asn 370 375 380 385 cga aaa tct tca gtt ggc gta aaa aag aat agc aag agc aga acg tta 1438 Arg Lys Ser Ser Val Gly Val Lys Lys Asn Ser Lys Ser Arg Thr Leu 390 395 400 acg agg caa tct atg tca aga att cca gct tct tcc aac tct acc tca 1486 Thr Arg Gln Ser Met Ser Arg Ile Pro Ala Ser Ser Asn Ser Thr Ser 405 410 415 tct aag cta act cat ata aat aat tcc agg gta cca aag aaa ctg aag 1534 Ser Lys Leu Thr His Ile Asn Asn Ser Arg Val Pro Lys Lys Leu Lys 420 425 430 aag cct gca aag cct tta ctt tca aag ata aaa ttg aga aat cat tgc 1582 Lys Pro Ala Lys Pro Leu Leu Ser Lys Ile Lys Leu Arg Asn His Cys 435 440 445 aag cgg ctg gag caa aag aat gct tca aga aaa ctc gaa atg gga aac 1630 Lys Arg Leu Glu Gln Lys Asn Ala Ser Arg Lys Leu Glu Met Gly Asn 450 455 460 465 tta gta ctg aaa gag cct aaa gta gtt ctg tat aaa aat ttg ccc att 1678 Leu Val Leu Lys Glu Pro Lys Val Val Leu Tyr Lys Asn Leu Pro Ile 470 475 480 aaa aaa gat aag gag cca gag gga cca gcc caa gcc gca gtt gcc agc 1726 Lys Lys Asp Lys Glu Pro Glu Gly Pro Ala Gln Ala Ala Val Ala Ser 485 490 495 ggg tgc ttg act aga cac gcg gcg aga gaa cac aga cag aat cct gtg 1774 Gly Cys Leu Thr Arg His Ala Ala Arg Glu His Arg Gln Asn Pro Val 500 505 510 aga ggt gct cat tcg cag ggg gag agc tcg ccc tgc acc tac ata act 1822 Arg Gly Ala His Ser Gln Gly Glu Ser Ser Pro Cys Thr Tyr Ile Thr 515 520 525 cgg cgg tca gtg agg aca aga aca aat ctg aag gag gcc tct gac atc 1870 Arg Arg Ser Val Arg Thr Arg Thr Asn Leu Lys Glu Ala Ser Asp Ile 530 535 540 545 aag ctt gaa cca aat acg ttg aat ggc tat aaa agc agt gtg acg gaa 1918 Lys Leu Glu Pro Asn Thr Leu Asn Gly Tyr Lys Ser Ser Val Thr Glu 550 555 560 cct tgc ccc gac agt ggt gaa cag ctg cag cca gct cct gtg ctg cag 1966 Pro Cys Pro Asp Ser Gly Glu Gln Leu Gln Pro Ala Pro Val Leu Gln 565 570 575 gag gaa gaa ctg gct cat gag act gca caa aaa ggg gag gca aag tgt 2014 Glu Glu Glu Leu Ala His Glu Thr Ala Gln Lys Gly Glu Ala Lys Cys 580 585 590 cat aag agt gac aca ggc atg tcc aaa aag aag tca cga caa gga aaa 2062 His Lys Ser Asp Thr Gly Met Ser Lys Lys Lys Ser Arg Gln Gly Lys 595 600 605 ctt gtg aaa cag ttt gca aaa ata gag gaa tct act cca gtg cac gat 2110 Leu Val Lys Gln Phe Ala Lys Ile Glu Glu Ser Thr Pro Val His Asp 610 615 620 625 tct cct gga aaa gac gac gcg gta cca gat ttg atg ggt ccc cat tct 2158 Ser Pro Gly Lys Asp Asp Ala Val Pro Asp Leu Met Gly Pro His Ser 630 635 640 gac cag ggt gag cac agt ggc act gtg ggc gtg cct gtg agc tac aca 2206 Asp Gln Gly Glu His Ser Gly Thr Val Gly Val Pro Val Ser Tyr Thr 645 650 655 gac tgt gct cct tca ccc gtc ggt tgt tca gtt gtg aca tca gat agc 2254 Asp Cys Ala Pro Ser Pro Val Gly Cys Ser Val Val Thr Ser Asp Ser 660 665 670 ttc aaa aca aaa gac agc ttt aga act gca aaa agt aaa aag aag agg 2302 Phe Lys Thr Lys Asp Ser Phe Arg Thr Ala Lys Ser Lys Lys Lys Arg 675 680 685 cga atc aca agg tat gat gca cag tta atc cta gaa aat aac tct ggg 2350 Arg Ile Thr Arg Tyr Asp Ala Gln Leu Ile Leu Glu Asn Asn Ser Gly 690 695 700 705 att ccc aaa ttg act ctt cgt agg cgt cat gat agc agc agc aaa aca 2398 Ile Pro Lys Leu Thr Leu Arg Arg Arg His Asp Ser Ser Ser Lys Thr 710 715 720 aat gac caa gag aat gat gga atg aac tct tcc aaa ata agc atc aag 2446 Asn Asp Gln Glu Asn Asp Gly Met Asn Ser Ser Lys Ile Ser Ile Lys 725 730 735 tta agc aaa gac cat gac aac gat aac aat ctc tat gta gca aag ctt 2494 Leu Ser Lys Asp His Asp Asn Asp Asn Asn Leu Tyr Val Ala Lys Leu 740 745 750 aat aat gga ttt aac tca gga tca ggc agt agt tct aca aaa tta aaa 2542 Asn Asn Gly Phe Asn Ser Gly Ser Gly Ser Ser Ser Thr Lys Leu Lys 755 760 765 atc cag cta aaa cga gat gag gaa aat agg ggg tct tat aca gag ggg 2590 Ile Gln Leu Lys Arg Asp Glu Glu Asn Arg Gly Ser Tyr Thr Glu Gly 770 775 780 785 ctt cat gaa aat ggg gtg tgc tgc agt gat cct ctt tct ctc ttg gag 2638 Leu His Glu Asn Gly Val Cys Cys Ser Asp Pro Leu Ser Leu Leu Glu 790 795 800 tct cga atg gag gtg gat gac tat agt cag tat gag gaa gaa agt aca 2686 Ser Arg Met Glu Val Asp Asp Tyr Ser Gln Tyr Glu Glu Glu Ser Thr 805 810 815 gat gat tcc tcc tct tct gag ggc gat gaa gag gag gat gac tat gat 2734 Asp Asp Ser Ser Ser Ser Glu Gly Asp Glu Glu Glu Asp Asp Tyr Asp 820 825 830 gat gac ttt gaa gac gat ttt att cct ctt cct cca gct aag cgc ttg 2782 Asp Asp Phe Glu Asp Asp Phe Ile Pro Leu Pro Pro Ala Lys Arg Leu 835 840 845 agg tta ata gtt gga aaa gac tct ata gat att gac att tct tca agg 2830 Arg Leu Ile Val Gly Lys Asp Ser Ile Asp Ile Asp Ile Ser Ser Arg 850 855 860 865 aga aga gaa gat cag tct tta agg ctt aat gcc taa gctcttggtc 2876 Arg Arg Glu Asp Gln Ser Leu Arg Leu Asn Ala 870 875 ttaacttgac ctgggataac tactttaaag aaataaaaaa ttccagtcaa ttattcctca 2936 actgaaagtt tagtggcagc acttctattg tcccttcact tatcagcata ctattgtaga 2996 aagtgtacag catactgact caattcttaa gtctgatttg tgcaaatttt tatcgtactt 3056 tttaaatagc cttcttacgt gcaattctga gttagaggta aagccctgtt gtaaaataaa 3116 ggctcaagca aaattgtaca gtgatagcaa ctttccacac aggacgttga aaacagtaat 3176 gtggctacac agttttttta actgtaagag catcagctgg ctctttaata tatgactaaa 3236 caataattta aaacaaatca tagtagcagc atattaaggg tttctagtat gctaatatca 3296 ccagcaatga tctttggctt tttgatttat ttgctagatg tttccccctt ggagttttgt 3356 cagtttcaca ctgtttgctg gcccaggtgt actgtttgtg gcctttgtta atatcgcaaa 3416 ccattggttg ggagtcagat tggtttctta aaaaaaaaaa aaaaatgaca tacgtgacag 3476 ctcacttttc agttcattat atgtacgagg gtagcagtgt gtgggatgag gttcgataca 3536 gcgtatttat tgcttgtcat gtaaattaaa aaccttgtat ttaactcttt tcaatccttt 3596 tagataaaat tgttctttgc aagaatgatt ggtgcttatt ttttcaaaaa tttgctgtga 3656 a caacgtgat gacaacaagc aacatttatc taatgaacta cagctatctt aatttggttc 3716
ttcaagtttt ctgttgcact tgtaaaatgc tacaaggaat attaaaaaaa tctattcact 3776 ttaacttata atagtttatg aaataaaaac atgagtcaca gcttttgttc tgtggtaacc 3836 tataaaaaaa gtttgtcttt gagattcaat gtaaagaact gaaaacaatg tatatgttgt 3896 aaatatttgt gtgttgtgag acatttttgt cataagaaat taaaagaact taccaggaag 3956 gtttttaagt ttagaaatat tcatgccaat aaaataggaa attataaata tatagtttta 4016 agcactgcat cagtgggagt tcttggctta tgttagttta tgttagttta ttatgaaaac 4076 atcaaagatt tttttgacta tattatcagt taaacaaaaa ggagtcagat ttaatttgtt 4136 ttttgaagca ctttgagaaa ttaattttaa ttaacttaat gagcaaattt ttattactac 4196 tttatgttca ataccaggtt cttttcattt ctctggatta ttttgcaaat cattggacag 4256 agaatttggg aatataaatc tgtaacaggt gttgacacca gtaggtctct ttatttctgg 4316 gaaatgtgta cctgtacttt ctgatataca gtgttcctaa gtaaaaatca attcagggga 4376 tttgtatagt gtctatagga aagtagccca tgtcttgaaa tatgaaaagg aatctgaagg 4436 tcatgaaaag tccagtggag aaaatctcaa tgcttactgt tactactaat tgattcctac 4496 tagtttccag gtttgggggg atattgtttc aatgacgctc cttaagactg ttgattgccc 4556 ataggttcca aatagaaatt aagactcatg aacattttta gaaagtagat tgttttctcc 4616 tggttctcta aggaactact tctgcagtct tacatagtct catccttgtt tgttgtggtg 4676 cagtcgaact cctcaggcgt ttggaaagca tgtggtagac cttcttccac acccacccat 4736 acccccgttc actgcgtctg gaggtcttca acagtgaagt agggcagccc acacagcctc 4796 tcaggagcac ctgtccgagg cacccggagc actttgcaga gcacgtccag ccctcatggg 4856 gtccctgcat agaaatgtga acccctgcca ctgaggaaga tgaaggtaga ccctgtgtct 4916 ggaggtgctg gagggcagcg ggtcacctct tgtattccca ccttagtttg gggtgttttg 4976 aagaggttca gagactaaat cttaaacctt atttgaatac caacgatagc tattttggga 5036 atttcgatct taaaaagtga caaaacacat ttcccatttt catttttcag ctgaatttta 5096 gtaacttatt tttgatgttt taattttatc atggcctcct ctttggaggc caaccttccc 5156 atgggtctca aagcagtgac atttggtagt aaatcactgc ctctcaggag tcggtatgca 5216 caagcactca gcagccactg ttgatgcctt ctagggaaac ctaatttccg ttggtaaagg 5276 taggggcctc ggaactgttc cggatctgct gtagaacttc accgtgtgga atggtgacag 5336 ccacacaccg ttgaccagtt tagaagaggt tgcattcaat aaaactctta gcttgagctt 5396 atgcaatgat tggttaagat tttggcattg taagaattag gagatgatca tagaaatata 5456 tgtaaagtat tcaattttca atcattttca aattactgtt ataaattgtt tttgctgagt 5516 tgtaatactt ttgagataca atgtattcct tgtactgaaa gaatgaaaaa ggactttttc 5576 agcatttgag gtaagttctt taacgtttca ttaaaaacat tttttacaaa tattttgtac 5636 atgcacttgc agtattgagg ttaatcattt taataaattc ggaaattaaa aaaa 5690 <210> 14 <211> 876 <212> PRT < 213> Homo sapiens <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: nucleic acid sequence of full-length AAP-4 <400> 14 Met Val Val Asn Gly Arg Arg Asn Gly Gly Lys Leu Ser Asn Asp His 1 5 10 15 Gln Gln Asn Gln Ser Lys Leu Gln His Thr Gly Lys Asp Thr Leu Lys 20 25 30 Ala Gly Lys Asn Ala Val Glu Arg Arg Ser Asn Arg Cys Asn Gly Asn 35 40 45 Ser Gly Phe Glu Gly Gln Ser Arg Tyr Val Pro Ser Ser Gly Met Ser 50 55 60 Ala Lys Glu Leu Cys Glu Asn Asp Asp Leu Ala Thr Ser Leu Val Leu 65 70 75 80 Asp Pro Tyr Leu Gly Phe Gln Thr His Lys Met Asn Thr Ser Ala Phe 85 90 95 Pro Ser Arg Ser Ser Arg His Phe Ser Lys Ser Asp Ser Phe Ser His 100 105 110 Asn Asn Pro Val Arg Phe Arg Pro Ile Lys Gly Arg Gln Glu Glu Leu 115 120 125 Lys Glu Val Ile Glu Arg Phe Lys Lys Asp Glu His Leu Glu Lys Ala 130 135 140 Phe Lys Cys Leu Thr Ser Gly Glu Trp Ala Arg His Tyr Phe Leu Asn 145 150 155 160 Lys Asn Lys Met Gln Glu Lys Leu Phe Lys Glu His Val Phe Ile Tyr 165 170 175 Leu Arg Met Phe Ala Thr Asp Ser Gly Phe Glu Ile Leu Pro Cys Asn 180 185 190 Arg Tyr Ser Ser Glu Gln Asn Gly Ala Lys Ile Val Ala Thr Lys Glu 195 200 205 Trp Lys Arg Asn Asp Lys Ile Glu Leu Leu Val Gly Cys Ile Ala Glu 210 215 220 Leu Ser Glu Ile Glu Glu Asn Met Leu Leu Arg His Gly Glu Asn Asp 225 230 235 240 Phe Ser Val Met Tyr Ser Thr Arg Lys Asn Cys Ala Gln Leu Trp Leu 245 250 255 Gly Pro Ala Ala Phe Ile Asn His Asp Cys Arg Pro Asn Cys Lys Phe 260 265 270 Val Ser Thr Gly Arg Asp Thr Ala Cys Val Lys Ala Leu Arg Asp Ile 275 280 285 Glu Pro Gly Glu Glu Ile Ser Cys Tyr Tyr Gly Asp Gly Phe Phe Gly 290 295 300 Glu Asn Asn Glu Phe Cys Glu Cys Tyr Thr Cys Glu Arg Arg Gly Thr 305 310 315 320 Gly Ala Phe Lys Ser Arg Val Gly Leu Pro Ala Pro Ala Pro Val Ile 325 330 335 Asn Ser Lys Tyr Gly Leu Arg Glu Thr Asp Lys Arg Leu Asn Arg Leu 340 345 350 Lys Lys Leu Gly Asp Ser Ser Lys Asn Ser Asp Ser Gln Ser Val Ser 355 360 365 Ser Asn Thr Asp Ala Asp Thr Thr Gln Glu Lys Asn Asn Ala Thr Ser 370 375 380 Asn Arg Lys Ser Ser Val Gly Val Lys Lys Asn Ser Lys Ser Arg Thr 385 390 395 400 Leu Thr Arg Gln Ser Met Ser Arg Ile Pro Ala Ser Ser Asn Ser Thr 405 410 415 Ser Ser Lys Leu Thr His Ile Asn Asn Ser Arg Val Pro Lys Lys Leu 420 425 430 Lys Lys Pro Ala Lys Pro Leu Leu Ser Lys Ile Lys Leu Arg Asn His 435 440 445 Cys Lys Arg Leu Glu Gln Lys Asn Ala Ser Arg Lys Leu Glu Met Gly 450 455 460 Asn Leu Val Leu Lys Glu Pro Lys Val Val Leu Tyr Lys Asn Leu Pro 465 470 475 480 Ile Lys Lys Asp Lys Glu Pro Glu Gly Pro Ala Gln Ala Ala Val Ala 485 490 495 Ser Gly Cys Leu Thr Arg His Ala Ala Arg Glu His Arg Gln Asn Pro 500 505 510 Val Arg Gly Ala His Ser Gln Gly Glu Ser Ser Pro Cys Thr Tyr Ile 515 520 525 Thr Arg Arg Ser Val Arg Thr Arg Thr Asn Leu Lys Glu Ala Ser Asp 530 535 540 Ile Lys Leu Glu Pro Asn Thr Leu Asn Gly Tyr Lys Ser Ser Val Thr 545 550 555 560 Glu Pro Cys Pro Asp Ser Gly Glu Gln Leu Gln Pro Ala Pro Val Leu 565 570 575 Gln Glu Glu Glu Leu Ala His Glu Thr Ala Gln Lys Gly Glu Ala Lys 580 585 590 Cys His Lys Ser Asp Thr Gly Met Ser Lys Lys Lys Ser Arg Gln Gly 595 600 605 Lys Leu Val Lys Gln Phe Ala Lys Ile Glu Glu Ser Thr Pro Val His 610 615 620 Asp Ser Pro Gly Lys Asp Asp Ala Val Pro Asp Leu Met Gly Pro His 625 630 635 640 Ser Asp Gln Gly Glu His Ser Gly Thr Val Gly Val Pro Val Ser Tyr 645 650 655 Thr Asp Cys Ala Pro Ser Pro Val Gly Cys Ser Val Val Thr Ser Asp 660 665 670 Ser Phe Lys Thr Lys Asp Ser Phe Arg Thr Ala Lys Ser Lys Lys Lys 675 680 685 Arg Arg Ile Thr Arg Tyr Asp Ala Gln Leu Ile Leu Glu Asn Asn Ser 690 695 700 Gly Ile Pro Lys Leu Thr Leu Arg Arg Arg His Asp Ser Ser Ser Lys 705 710 715 720 Thr Asn Asp Gln Glu Asn Asp Gly Met Asn Ser Ser Lys Ile Ser Ile 725 730 735 Lys Leu Ser Lys Asp His Asp Asn Asp Asn Asn Leu Tyr Val Ala Lys 740 745 750 Leu Asn Asn Gly Phe Asn Ser Gly Ser Gly Ser Ser Ser Thr Lys Leu 755 760 765 Lys Ile Gln Leu Lys Arg Asp Glu Glu Asn Arg Gly Ser Tyr Thr Glu 770 775 780 Gly Leu His Glu Asn Gly Val Cys Cys Ser Asp Pro Leu Ser Leu Leu 785 790 795 800 Glu Ser Arg Met Glu Val Asp Asp Tyr Ser Gln Tyr Glu Glu Glu Ser 805 810 815 Thr Asp Asp Ser Ser Ser Ser Glu Gly Asp Glu Glu Glu Asp Asp Tyr 820 825 830 Asp Asp Asp Phe Glu Asp Asp Phe Ile Pro Leu Pro Pro Ala Lys Arg 835 840 845 Leu Arg Leu Ile Val Gly Lys Asp Ser Ile Asp Ile Asp Ile Ser Ser 850 855 860 Arg Arg Arg Glu Asp Gln Ser Leu Arg Leu Asn Ala 865 870 875 <210> 15 <211> 120 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> SITE <222> (1)..(120) <223> /note="SET domain of the AAP-4 protein, location 185-304" <400> 15 Gly Phe Glu Ile Leu Pro Cys Asn Arg Tyr Ser Ser Glu Gln Asn Gly 1 5 10 15 Ala Lys Ile Val Ala Thr Lys Glu Trp Lys Arg Asn Asp Lys Ile Glu 20 25 30 Leu Leu Val Gly Cys Ile Ala Glu Leu Ser Glu Ile Glu Glu Asn Met 35 40 45 Leu Leu Arg His Gly Glu Asn Asp Phe Ser Val Met Tyr Ser Thr Arg 50 55 60 Lys Asn Cys Ala Gln Leu Trp Leu Gly Pro Ala Ala Phe Ile Asn His 65 70 75 80 Asp Cys Arg Pro Asn Cys Lys Phe Val Ser Thr Gly Arg Asp Thr Ala 85 90 95 Cys Val Lys Ala Leu Arg Asp Ile Glu Pro Gly Glu Glu Ile Ser Cys 100 105 110 Tyr Tyr Gly Asp Gly Phe Phe Gly 115 120

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 37/06 Ｃ０７Ｋ 14/47 43/00 １０５ 16/18 Ｃ０７Ｋ 14/47 Ｃ１２Ｎ 1/15 16/18 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/15 15/00 ＺＮＡＡ 1/19 5/00 Ｂ 5/10 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ， ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，Ｊ Ｐ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ， ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，Ｒ Ｏ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ， ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ダネン−ファン オールスホット，アスト リト アドリアナ アンナ マリア オランダ国 ベルケル エン ローデンレ イス ベルリオーズプレイン 19 (72)発明者 ロン，ジェニファー リー オランダ国 アムステルダム ヘモネイス トラート 32ベー (72)発明者 ヴァイス，バートラム ドイツ国 ベルリン イム シュヴァルツ ェン グルント ４ (72)発明者 トスキ，ルイセッラ ドイツ国 ベルリン ゾマリングシュトラ ーセ 40 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA80 CA04 DA02 DA11 EA04 HA08 4B065 AA72X AA90X AA90Y AB01 CA24 CA44 4C084 AA02 AA06 AA07 AA13 BA44 CA53 CA56 DA27 MA02 NA14 ZB09 ZB21 ZB26 4C087 AA01 AA02 BC83 MA02 NA14 ZB08 ZB21 ZB26 4H045 AA10 AA30 BA09 CA40 DA75 EA20 EA22 FA72 FA74

Claims (26)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 核局在化およびアポプトーシスを提供可能なアポプチン会合タ
   ンパク様物質をコードする、分離されたもしくは組換え型の核酸、またはその機
   能的等価物もしくは機能的フラグメント。
2. 【請求項２】 ｃＤＮＡライブラリ由来の請求項１に記載の核酸。
3. 【請求項３】 前記ｃＤＮＡライブラリがヒトｃＤＮＡを含んで成る請求項１
   または２に記載の核酸。
4. 【請求項４】 図１または５に示されているようなアポプチン会合タンパク様
   物質をコードする核酸分子に対しハイブリッド形成可能な請求項１〜３のいずれ
   か１項に記載の核酸。
5. 【請求項５】 図１または５に示されているようなアポプチン会合タンパク様
   物質をコードする、核酸分子に対し、またはその機能的等価物もしくは機能的フ
   ラグメントに対し少なくとも６０％の相同性をもつ請求項１〜４のいずれか１項
   に記載の核酸。
6. 【請求項６】 請求項１〜５のいずれか１項に記載の核酸を含んで成るベクタ
   ー。
7. 【請求項７】 遺伝子送達ビヒクルを含んで成る、請求項６に記載のベクター
   。
8. 【請求項８】 請求項１〜５のいずれか１項に記載の核酸または請求項６また
   は７に記載のベクターを含んで成る宿主細胞。
9. 【請求項９】 酵母細胞といったような真核細胞または脊椎動物細胞である、
   請求項８に記載の宿主細胞。
10. 【請求項１０】 核局在化およびアポプトーシスを提供可能な分離されたまた
    は組換え型のアポプチン会合タンパク様物質。
11. 【請求項１１】 請求項１〜５のいずれか１項に記載の核酸によってコードさ
    れた請求項１０に記載のタンパク様物質。
12. 【請求項１２】 図２または６に示されているようなアミノ酸配列の少なくと
    も一部分、またはその機能的等価物もしくは機能的フラグメントを含んで成る、
    請求項１０または１１に記載のタンパク様物質。
13. 【請求項１３】 請求項１０〜１２のいずれか１項に記載のタンパク様物質ま
    たは機能的フラグメントを特異的に認識する分離されたまたは合成の抗体。
14. 【請求項１４】 請求項１３に記載の抗体により特異的に認識可能なタンパク
    様物質。
15. 【請求項１５】 アポプトーシスの誘発を目的とする、請求項１〜５のいずれ
    か１項に記載の核酸，請求項６または７に記載のベクター、請求項８または９に
    記載の宿主細胞，請求項１０〜１２および請求項１４のいずれか１項に記載のタ
    ンパク様物質の使用。
16. 【請求項１６】 前記アポプトーシスがｐ５３独立型である、請求項１５に記
    載の使用。
17. 【請求項１７】 アポプチンまたはその機能的等価物もしくはフラグメントを
    コードする核酸の使用、または、アポプチンまたはその機能的等価物もしくはフ
    ラグメントの使用をさらに含んで成る、請求項１５または１６に記載の使用。
18. 【請求項１８】 請求項１〜５のいずれか１項に記載の核酸，請求項６または
    ７に記載のベクター、請求項８または９に記載の宿主細胞，請求項１０〜１２お
    よび１４のいずれか１項に記載のタンパク様物質を含んで成る薬学組成物。
19. 【請求項１９】 アポプチンまたはその機能的等価物もしくはフラグメントを
    コードする核酸、または、アポプチンまたはその機能的等価物もしくはフラグメ
    ントをさらに含んで成る、請求項１８に記載の薬学組成物。
20. 【請求項２０】 アポプトーシスの誘発のための請求項１８または１９に記載
    の薬学組成物。
21. 【請求項２１】 前記アポプトーシスがｐ５３独立型である、請求項２０に記
    載の薬学組成物。
22. 【請求項２２】 細胞増殖の増強または細胞死の減少がみられる疾病の治療の
    ための請求項１８〜２１のいずれか１項に記載の薬学組成物。
23. 【請求項２３】 前記疾病には癌または自己免疫疾患が含まれる、請求項２２
    に記載の薬学組成物。
24. 【請求項２４】 細胞増殖の増強または細胞死の減少がみられる疾病のキャリ
    ヤである個体を治療するための方法において、この個体を請求項１８〜２３のい
    ずれか１項に記載の薬学組成物で処置することを含んで成る方法。
25. 【請求項２５】 図７に示されているようなアミノ酸配列を含んで成る、タン
    パク様物質をコードする分離されたまたは組換え型の核酸。
26. 【請求項２６】 図５に示されているような核酸によってコードされたタンパ
    ク様物質の活性の推定上のエフェクタを同定するための検定において、図６に示
    されたアミノ酸配列のアミノ酸１８５〜３０４を含むタンパク様物質を前記エフ
    ェクタと接触させ、前記エフェクタの結合を見極めることを含んで成る検定。