AT411262B

AT411262B - Humanes endogenes retrovirus

Info

Publication number: AT411262B
Application number: AT0153901A
Authority: AT
Original assignee: Wolff Klaus Dr; Muster Thomas Dr
Priority date: 2001-09-27
Filing date: 2001-09-27
Publication date: 2003-11-25
Also published as: US7510862B2; US8008460B2; WO2003029460A1; ATA15392001A; US20120237527A1; US20080008717A1; EP1430127A1; US20040241642A1; US20090180975A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft humane endogene Retroviren, Fragmente davon, einen bio- logisch funktionellen Vektor, der Sequenzen dieser Retroviren umfasst.

Endogene Retroviren (ERVs) sind integrale Teile im Genom vieler, wenn nicht aller, Spezies.

ERVs ergaben sich vermutlich aus der Infektion von Keimbahn-Zellen mit exogenen Retroviren und darauf folgender Fixierung ihrer genetischen Informationen im Wirts-Genom.

Viele Arten humaner endogener Retroviren (HERVs) wurden bereits früher charakterisiert, und sie wurden, teilweise auf Grund ihrer Sequenz-Identität und teilweise gemäss der Ähnlichkeit ihrer Primer-Bindungsstellen (PBSs) mit den Wirt-tRNAs, in verschiedene Gruppen oder Familien einge- teilt. So enthalten die Mitglieder der HERV.H-Familie eine PBS mit einer Sequenz ähnlich einer Region von tRNANHIS wogegen die HERV.E-Familie durch tRNANGiu geprimed ist.

Trotz der grossen Menge verfügbarer Daten wurde die Klassifizierung der vielen verschiedenen HERV-Familien in einem phylogenetischen Gesamt-Rahmen aus mehreren Gründen behindert : einige stark diver- gierende Retroviren werden vom selben t-RNA-Typ geprimed; (ii) viele HERV-Familien wurden nicht vollständig charakterisiert, und die berichtete Sequenz-Information stammt oft aus verschie- denen Genom-Regionen, was interfamiliäre Vergleiche problematisch macht ; und(iii) durch das relative Fehlen von Sequenz-Informationen über andere Wirts-Taxonomien war es schwierig, zwischen echt monophyletischen HERV-Familien und polyphyletischen Familien, die nur monophy- letisch erscheinen, weil ähnliche Viren in anderen Wirten noch nicht beschrieben wurden, zu unter- scheiden.

Ein pathogenes Potential nicht-defekter endogener Retroviren wurde bisher nur bei Mäusen nachgewiesen, in welchen sie Tumoren und immunologische Erkrankungen induzieren können. Bei humaner DNA sind endogene Retrovirus-Sequenzen (HERVs) gut bekannte geneti- sche Elemente. Sie alle scheinen auf Grund multipler Terminations-Codons, Deletionen oder des Fehlens eines 5'-langen terminalen Repeats (LTR) defekt zu sein. Replikations-kompetente huma- ne endogene Retrovirus-Genome wurden bisher nicht isoliert.

Umfangreiche Untersuchungen an tienschen Melanomen (insbesondere jener des Hamsters), die als Modell für humane maligne Melanome dienen, zeigten das Vorkommen von Virus-Partikeln in den Tumoren. Eine RNA-Spezies mit hohem Molekulargewicht (70S) sowie eine RNA- spezifische DNA-Polymerase, zwei diagnostische Merkmale für Onkorna-(onkogene RNA)-Viren wurden mit diesen Partikeln in Verbindung gebracht. Zellfreie Transmissionsexperimente führen zur Schlussfolgerung, dass Hamster-Melanome von einem RNA-Virus verursacht werden.

Auf Grund dieser Erkenntnisse wurde die Arbeitshypothese vorgeschlagen, dass Human- Melanome ebenfalls eine virale Etiologie aufweisen könnten. Aus Versuchen wurde das Vorkom- men Virus-artiger Partikel sowie eine Reverse-Transkriptase-Aktivität in Metastasen von Human- Melanomen in den frühen 70er-Jahren berichtet. (Birkmayer et al., Europ. J.Cancer 10 (1974) 419- 422).

Diese Virus-artigen Partikel sind kugelförmig oder leicht eiförmig und haben einen Durchmes- ser von 90-120 nm. Sie haben ein Elektronen-dichtes Nukleoid mit einer Breite von 50-70 nm und sind von einer dreilagigen, 100 A dicken Membran begrenzt. Manchmal ragen feine Fortsätze radial vom Nukleoid zur Membran hin, und in diesem Fall ähneln die Partikel jenen, die man beim Hamster-Melanom findet. Ihre Anzahl ist im Vergleich zu jener beim Hamster-Melanom relativ gering. Bisher fand man sie nur im Zytoplasma, und es wurde bei diesen Partikeln keine Infektiosi- tät festgestellt (Birkmayer et al., Die Naturwissenschaften 59 (8) (1972), 369-370).

Auch Balda et al. (Proc.Nat.Acad.Sci, USA 72 (9) (1975, 3697-3700) beschrieben eine RNA mit hohem Molekulargewicht, die mit einer aus RNA extrahierten DNA-Polymerase in Partikel einge- kapselt war, die die für RNA-Tumor-Viren charakteristische Identität hatten, welche man bei huma- nen malignen Melanomen fand. Jedoch wurden auch hier keine infektiösen Partikel festgestellt.

Erst viele Jahre später wurde die Expression einer Familie humaner endogener Retrovirus-
Sequenzen (HERV-K) in GH-Zellen, einer Teratokarzinom-Zelllinie, die von humanem Teratokarzi- nom stammende Retrovirus(HTDV)-Partikel erzeugt, beschrieben (Löwer et al., Proc.Natl.Acad.Sci.

USA 90 (1993) : 4480-4484). Detaillierte elektronenmikroskopische Untersuchungen offenbarten das Vorhandensein von Retrovirus-artigen Partikeln in humanen Plazentas und Teratokarzinom-
Zelllinien. Es zeigte sich jedoch, dass auch diese entdeckten HERV-K/HTDV-Partikel nicht infektiös waren : Sie besitzen eine andere Morphologie: (i) es fehlt ihnen der Elektronen-durchsichtige
Raum, den man normalerweise zwischen Virus-Hülle und Kern vorfindet, (ii) sie scheinen vorwie- gend im Knospungstadium stecken geblieben zu sein, und (iii) kollabierte Kerne, eine Folge eines

letzten Proteolyse-Schrittes bei der Virus-Reifung, wurden niemals beobachtet. Solang der gag- Vorläufer ungespaltet bleibt, ist es nicht wahrscheinlich, dass die resultierenden Partikel infektiös sind.

Es zeigte sich, dass ein weiterer HERV-K-Provirus bei Gorilla- und Schimpansen-Genomen, jedoch nicht im Humangenom, vorhanden ist (Barbulescu et al., Current Biology 11 (10) (2001), 779-783).

Es zeigte sich also, dass humane endogene Retroviren exprimiert werden, jedoch waren alle diese bisher gefundenen Virus-Partikel nicht-infektiöse Virus-Partikel. Es zeigte sich, dass einige endogene Retrovirus-artige Partikel in Melanom-Zellen exprimiert waren. Jedoch waren die einzi- gen infektiösen endogenen Retroviren, die man fand, einige tierische endogene Retroviren, z.B.

MelARV, ein Retrovirus, der gezüchtete Maus-Melanozyten infizieren kann, von welchen es sich auch zeigte, dass sie in einigen Fällen maligne Transformationen induzieren.

Im Artikel von Reus et al. (Journal of Virology, Oktober 2001, 8917-8926) wird festgestellt, dass das durchschnittliche Alter der HERV-K-Proviren ca. 28 Millionen Jahre ist. Es wird beschrieben, dass zu dieser Zeit die HERV-Ks wahrscheinlich infektiös waren.

Die WO 01/62937 betrifft Retrovirus Sequenzen und Psoriasis.

In der WO 00/53789 werden lediglich verschiedene retrovirale Expressionsvektoren genannt.

Die WO 00/20460 A1 betrifft die Detektion einer HERV-K10 gag-Sequenz im Zusammenhang mit der Krebserkrankung Seminoma, wobei die Anwendung der HERV-K10 gag-Sequenz als Tumormarker sowie zu therapeutischen Zwecken beschrieben ist.

In der WO 00/06598 A1 ist ein HERV-AVL3-B-Sequenzfragment in Zusammenhang mit Me- thoden zur Behandlung eines malignen Melanoms beschrieben.

Die WO 99/67395 A1 betrifft eine 600bp Sequenz eines env-Genes einer Virusfamilie HERV- 7q und behandelt die Anwendung für oder in Zusammenhang mit multipler Sklerose bzw. Autoim- munerkrankungen.

In der WO 98/24454 A1 ist die Anwendung einer retroviralen Ribozymsequenz HERV-PTN zur Inhibierung von Tumorwachstum beschrieben.

Die JP 9252780 A betrifft eine Methode, in der ein Retrovirusolypeptid vom Typ HERV-E als surrogatemarker für Krebs und andere Erkrankungen detektiert wird.

Die WO 01/70941 A2 betrifft eine retrovirale Sequenz mit hoher Homologie zur Familie HERV- H, wobei diese Sequenz in Zusammenhang mit multipler Sklerose gebracht wird.

Die DE 198 11 692 A1 betrifft Sonnenschutzformulierung mit Wirkung gegen Herpes Simplex- Viren, wobei die Formulierungen organische bzw. anorganische Lichtschutzfilter umfassen.

Es ist daher das Ziel der vorliegenden Erfindung, mindestens ein Fragment einer Nukleotid- Sequenz vorzusehen, die für einen weiteren humanen endogenen Retrovirus codiert, welcher infektiös ist.

Das Ziel der vorliegenden Erfindung wird durch ein Polynukleotid-Molekül gelöst, das ein Frag- ment einer Nukleotid-Sequenz eines infektiösen humanen endogenen Retrovirus ist, welches Po- lynukleotid-Molekül eine Sequenz umfasst, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus (a) einer Sequenz mit mindestens 98%, vorzugsweise 99%, noch mehr bevorzugt 99,5%, Identität mit einer Sequenz gemäss SEQ ID Nr. 1, (b) einer Sequenz, die unter stringenten Bedingungen mit einer Nukleotid-Sequenz gemäss SEQ ID Nr. 1 hybridisiert, (c) einer Sequenz, die sich von den Sequenzen (a) oder (b) infolge einer Degeneration des geneti- schen Codes unterscheidet, und (d) einer Sequenz, welche Sequenzen umfasst, die in die Vektoren pCR4-Topo insertiert und als "MERV-env", "MERV-gag", "MERV-prt", und "MERV-pol" am DSMZ am 26. September 2001 hinterlegt wurden, oder Fragmente davon.

Man stellte überraschenderweise fest, dass ein Polynukleotid-Molekül, wie oben erwähnt, für einen infektiösen humanen endogenen Retrovirus (bzw. Teile davon) codiert. Mit der vorliegenden Erfindung ist es möglich, erstmalig zu zeigen, dass es nicht nur infektiöse tierische endogene Retroviren gibt, sondern auch infektiöse humane endogene Retroviren. Dies ist deswegen beson- ders überraschend, weil man humane endogene Retroviren seit mehr als 30 Jahren kennt und beschrieben hat, jedoch infektiöse humane endogene Retroviren bisher nicht isoliert oder nachge- wiesen werden konnten, obwohl viele Gruppen jahrzehntelang Forschungen auf diesem Gebiet

unternommen haben.

Das Polynukleotid-Molekül gemäss der vorliegenden Erfindung ist vorzugsweise ein isoliertes und gereinigtes DNA- oder RNA-Molekül.

"Infektiös" bezieht sich im Rahmen der vorliegenden Erfindung insbesondere auf Retrovirus- Partikel, die fähig sind, an den Rezeptor einer Zelle über das env-Protein zu binden und in die Zelle einzudringen und eine reverse Transkription durchzuführen, um eine cDNA zu erzeugen, die in die Wirtszellen-DNA integriert werden kann. Die Unterschiede zwischen den Lebenszyklen verschie- dener Retro-Elemente und zwischen infektiösen und nicht-infektiösen Retroviren sind im Artikel von Löwer et al. (Proc.Natl.Acad.Sci 93 (1996), 5177-5184) beschrieben.

Vorzugsweise können "infektiöse" humane endogene Retroviren gemäss der vorliegenden Er- findung bovine MDBK-Zellen infizieren und in das Genom dieser Zellen integriert werden.

Die Sequenz gemäss SEQ ID Nr. 1 umfasst eine Region, die im Polynukleotid-Molekül anwe- send sein muss, um für einen infektiösen humanen endogenen Retrovirus (HERV) zu codieren. An beiden Enden kann das Polynukleotidmolekül gemäss der vorliegenden Erfindung jedoch weitere, hierin nicht spezifisch beschriebene Sequenz-Regionen aufweisen, insbesondere LTR-Regionen, die bei solchen Viren üblich sind. Mit dem vorliegenden Polynukleotid-Molekül können alle, hier nicht definierten Sequenz-Regionen identifiziert werden, beispielsweise durch Amplifikation dieser Sequenzen mit Hilfe von optimal entworfenen Gen-spezifischen Pnmern, welche beispielsweise an die oben definierten Sequenz-Regionen binden. Die Amplifikationsprodukte können danach se- quenziert werden. Solche Verfahren sind dem Fachmann wohlbekannt.

"Stnngente Bedingungen" betreffen Hybridisierungsreaktionen unter bestimmten Hybridisie- rungsbedingungen, die von Faktoren, wie Konzentration von Salz oder Formamid im Hybridisie- rungspuffer, Temperatur der Hybridisierung und Waschbedingungen nach der Hybridisierung, abhängen. Solche Bedingungen für die Northern-Blot-Analyse sind z. B. Hybridisierung bei 68 C mit einem MERV-spezifischen Polynukleotid-Molekül, welches mit Dioxigenin oder radioaktiv in einem 0,1% SDS enthaltenden Standard-SSC-Hybridisierungs-Puffer markiert worden ist, gefolgt von stringentem Waschen in einem Wasch-Puffer mit derselben Temperatur. Stringentes Waschen kann beispielsweise durch zweimaliges Waschen mit 2xSSC-Puffer, gefolgt von zwei Waschschrit- ten mit 0,5xSSC-Puffer, erfolgen.

Im vorliegenden Fall gehören zu den stringenten Hybridisie- rungsbedingungen vorzugsweise eine Temperatur von 15 C bis 25 C unter dem Schmelzpunkt (Tm), wobei der Tm eines Hybridisierungsprodukts einer Nukleinsäure-Sonde unter Verwendung einer Formel berechnet werden kann, die auf den in den Nukleinsäuren enthaltenen g + c und unter Berücksichtigung der Kettenlängen basiert, wie die Formel Tm = 81,5 bis 16,6 (log [na+]) + 0,41 (% G + C) - 600/N), worin N = Kettenlänge (Sambrook et al. (1989). In der Praxis wird ein geschätzter Tm für eine Oligonukleotid-Sonde oft bestätigt, und somit kann ein Fachmann den Tm für jede gewählte Sonde, deren Nukleotid-Sequenz bekannt ist, berechnet werden.

Sequenzen, die sich von einer bestimmten Sequenz infolge der Degeneration des genetischen Codes unterscheiden, können von jedem Fachmann definiert werden. Dies kann elektronisch ohne unzulässige Belastung durchgeführt werden.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung beziehen sich die hinterlegten Vektoren MERV-env, MERV-gag, MERV-prt und MERV-pol auf Plasmide, die bei der DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH) gemäss dem Budapester Vertrag hinterlegt sind und die Hinterlegungsnummern DSM 1450, DSM 14538, DSM 14536 und DSM 14537 aufweisen.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wird, wenn in die hinterlegten Vektoren insertierte Se- quenzen betroffen sind, nicht nur auf identische Sequenzen Bezug genommen, sondern auch auf Sequenzen, (a) weiche eine mindestens 98%, vorzugsweise 99%, nochmehr bevorzugt 99,5% Identität mit den in die hinterlegten Vektoren insertierten Sequenzen aufweisen, (b) welche unter stringenten Bedingungen mit in die hinterlegten Vektoren insertierten Sequenzen hybridisieren, und (c) welche sich von den in die hinterlegten Vektoren insertierten Sequenzen auf Grund einer Dege- neration des genetischen Codes unterscheiden.

Das obige Polynukleotid-Molekül gemäss der vorliegenden Erfindung kann weiters eine Se- quenz aufweisen, welche zumindest zu 99,7%, 99,8% oder 99,9% mit SEQ ID Nr. 1 identisch ist.

Vorzugsweise weist das Polynukleotid-Molekül eine Sequenz gemäss SEQ ID Nr. 1 auf. Es

zeigte sich, dass dieses Polynukleotid-Molekül für ein vollständiges und aktives infektiöses Partikel eines HERV codiert. Die ORFs der SEQ ID Nr. 1 sind vorzugsweise wie folgt: @
Noch mehr bevorzugt wird ein Polynukleotid-Molekül vorgesehen, welches ein spezifisches Fragment des oben beschriebenen Polynukleotid-Moleküls mit einer Länge von mindestens 15 bp, vorzugsweise mindestens 20 bp, noch mehr bevorzugt mindestens 30 bp, aufweist. Der Ausdruck "spezifisch" bedeutet jedes Fragment, das eine Sequenz aufweist, welche sich von jeder bekann- ten HERV-Sequenz unterscheidet.

Daher ist jedes Fragment mit einer Länge von mindestens 15 bp, welches beispielsweise die in Tabelle 1 erwähnten Mutationen in Bezug auf den bekannten, nicht-infektiösen HERV K (GeneBank, Hinterlegungsnummer 164614) aufweist, vom Polynukleotid- Molekül gemäss der vorliegenden Erfindung mit umfasst. Diese angegebenen Längen sind jedoch Mindestlängen, und auch Fragmente, die länger sind, z. B. 100,1000, 1500 bp, sind vom Ausdruck "Fragment" mit umfasst.

"Fragmente" gemäss der vorliegenden Erfindung bezieht sich auch auf spezifische Fragmente der Sequenzen, die in den Vektor pCR4-Topo insertiert sind und als MERV-env, MERV-gag, MERV-prt und MERV-pol, wie oben erwähnt, hinterlegt sind.

Tabelle 1:
EMI4.1

<tb> Klon, <SEP> Be- <SEP> Position <SEP> in <SEP> Position <SEP> in <SEP> HERV <SEP> K108 <SEP> Nukleotid- <SEP> Aminosäure-
<tb>
<tb>
<tb> zeichnung <SEP> MERV <SEP> (Hinterlegung <SEP> 164614) <SEP> Änderung <SEP> Änderung
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> (MERV/HERV) <SEP> (MERV/HERV)

Gln/Arg
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 1348 <SEP> 2447 <SEP> A/G <SEP> Lys/Gly
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 1413 <SEP> 2512 <SEP> C/T <SEP> Ala/Ala
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 1642 <SEP> 2741 <SEP> G/A <SEP> Gly/Arg
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 1653 <SEP> 2752 <SEP> C/T <SEP> Tyr/Tyr
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 1668 <SEP> 2767 <SEP> C/T <SEP> lle/lle
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 1701 <SEP> 2800 <SEP> C/T <SEP> Asn/Asn
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 1989 <SEP> 3088 <SEP> A/G <SEP> Pro/Pro
<tb>

Gemäss einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Polynukleotid- Molekül, das für ein env-Protein eines infektiösen endogenen humanen Retrovirus codiert, vorge- sehen, welches Polynukleotid-Molekül eine Sequenz aufweist, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus (a)

einer Sequenz mit mindestens 98%, vorzugsweise 99%, noch mehr bevorzugt 99,5% Identität mit einer Sequenz gemäss SEQ ID Nr. 2, (b) einer Sequenz, welche unter stringenten Bedingungen mit einer Nukleotid-Sequenz gemäss der SEQ ID Nr. 2 hybridisiert, und (c) einer Sequenz, die sich von der Sequenz (a) oder (b) infolge einer Degeneration des geneti- schen Codes unterscheidet.

"Env" bezieht sich gemäss der vorliegenden Erfindung auch auf die Sequenz, die in das hinter- legte MERV-env Plasmid, wie oben erwähnt, insertiert ist, oder ein Fragment davon.

Es ist bekannt, dass Retroviren "Quasispezies" sind und bei einer bestimmten Virus-Population eine Sequenz-Variation gegeben ist. Solche Quasispezies-Variationen sind natürlich in der Defini- tion der vorliegenden Viren und der Sequenzen der Nukleinsäure-Moleküle gemäss der vorliegen- den Erfindung mit eingeschlossen, solange die Infektiosität der Virus-Population als Ganzes gege- ben ist.

"Env" bezieht sich auf das Hüllen-(envelope)-Protein, das ein Virusmembran-Protein ist, wel- ches die Bindung der Virus-Partikel an die Zellrezeptoren vermittelt und damit das Eindringen des Virus ermöglicht, was der erste Schritt in einem neuen Replikations-Zyklus ist. Das env-Protein ist wegen seiner Fähigkeit, sich unter Zellen und Individuen auszubreiten (Infektiosität) besonders wichtig.

Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft ein Polynukleotid-Molekül, welches für ein pol-Protein eines HERV codiert, wobei dieses Polynukleotid-Molekül eine Sequenz aufweist, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus (a) einer Sequenz mit mindestens 99%, vorzugsweise 99,5%, noch mehr bevorzugt 99,8% Identität mit einer Sequenz gemäss SEQ ID Nr. 3, (b) einer Sequenz, die unter stringenten Bedingungen mit einer Nukleotid-Sequenz gemäss der SEQ ID Nr. 3 hybridisiert, und (c) einer Sequenz, die sich von der Sequenz (a) oder (b) infolge einer Degeneration des geneti- schen Codes unterscheidet, "pol" bezieht sich auf die Polymerase, die ein Enzym mit von RNA abhängiger Reverse-Transkriptase-Aktivität ist. Auch dieses Protein ist für einen korrekten Virus- Replikationszyklus wichtig.

"Pol" bezieht sich gemäss der vorliegenden Erfindung auch auf die Sequenz, die in das hinter- legte MERV-pol-Plasmid, wie oben erwähnt, insertiert ist, oder auf ein Fragment davon.

Noch ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Polynukleotid-Molekül, das für ein gag-Protein eines HERV codiert, wobei das Polynukleotid-Molekül eine Sequenz umfasst, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus (a) einer Sequenz mit mindestens 98%, vorzugsweise 99%, noch mehr bevorzugt 99,5% Identität mit einer Sequenz gemäss SEQ ID Nr. 4, (b) einer Sequenz, die unter stringenten Bedingungen mit einer Nukleotid-Sequenz gemäss der SEQ ID Nr. 4 hybridisiert, und (c) einer Sequenz, die sich von der Sequenz (a) oder (b) infolge einer Degeneration des geneti- schen Codes unterscheidet.

Die gag-Gen-Produkte haben die Fähigkeit erworben, an die Zelloberfläche transportiert zu werden und liegen während dieses Vorgangs an der die env-Proteine inkorporierenden Zellmemb- ran an. Das gag-Gen codiert für ein langes Polyprotein, welches in einem ersten Schritt von der langen Molekülkette abgeschnitten wird und danach in eine Anzahl von Teilen geschnitten wird, die in Form von Capsomeren um die RNA herum vorliegen. Da diese gag-Proteine für die Knospung wesentlich sind, sind sie für den infektiösen Virus-Kreislauf wichtig.

"Gag" bezieht sich erfindungsgemäss auch auf die Sequenz, die in das hinterlegte MERV-gag- Plasmid, wie oben erwähnt, insertiert ist, oder auf ein Fragment davon.

Eine weitere Ausführungsform betrifft ein Polynukleotid-Molekül, das für ein pro-Protein eines HERV codiert, wobei dieses Polynukleotid-Molekül eine Sequenz aufweist, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus

(a) einer Sequenz mit mindestens 98%, vorzugsweise 99%, noch mehr bevorzugt 99,5% Identität mit einer Sequenz gemäss SEQ ID Nr. 5, (b) einer Sequenz, die unter stringenten Bedingungen mit einer Nukleotid-Sequenz gemäss der SEQ ID Nr. 5 hybridisiert, und (c) einer Sequenz, die sich von der Sequenz (a) oder (b) infolge einer Degeneration des geneti- schen Codes unterscheidet.

Das pro-Gen weist 3 Regionen von besonderem Interesse auf: 1. dUTPase, dUTPase hydrolysiert dUTP zu dUMP und Pyrophosphat; 2. prt-retrovirale Apartyl-Proteinase; 3. Gpatch, eine a-Glycin-reiche Nuklein-Bindungs-Domäne; eine vorausgesagte, Glycin-reiche Nuklein-Bindungs-Domäne, die man im Spleiss-Faktor 45 findet, SON-DNA-Bindungs-Protein und Retrovirus-Polyproteine vom Typ D.

"Pro" bezieht sich gemäss der vorliegenden Erfindung auch auf die Sequenz, die in das hinter- legte MERV-prt-Plasmid, wie oben erwähnt, insertiert ist, oder auf ein Fragment davon.

Vorteilhaft ist ein Polynukleotid-Molekül vorgesehen, welches eine Sequenz aufweist, die zu einer der oben erwähnten Sequenzen gemäss der vorliegenden Erfindung komplementär ist. Daher wird nicht nur die Sequenz gemäss dem RNA-Strang, der im Retrovirus-Partikel vorhanden ist, vorgesehen, sondern auch eine Sequenz gemäss der cDNA-Sequenz.

Noch mehr bevorzugt umfasst das Polynukleotid-Molekül eine detektierbare Markierung. Ins- besondere, wenn das Polynukleotid-Molekül ein Fragment der oben definierten Sequenz ist, kann das Polynukleotid-Molekül zur Detektion von infektiösem HERV in einer Probe verwendet werden.

Der Ausdruck "detektierbare Markierung" bezieht sich auf jeden Marker, der auf dem Gebiet wohl- bekannt ist, z. B. einen fluoreszierenden, radioaktiven, enzymatischen oder chemischen Marker.

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Polynukleotid-Molekül, das für ein Ribozym codiert, welches zwei Abschnitte aufweist, von welchen jeder eine Länge von mindestens 10 bis 15 Basenpaaren hat und welche zu spezifischen Sequenz-Abschnitten des oben identifizier- ten Polynukleotid-Moleküls gemäss der vorliegenden Erfindung komplementär sind, so dass das Ribozym die mRNA, die durch natürliche infektiöse humane endogene Retrovirus-DNA transkribiert ist, komplexiert und schneidet. Die Veröffentlichung von John M. Burg "Clearing the Way for Ribo- zymes" (Nat.Biotechnology 15 :414-415 (1997)) betrifft die allgemeine Funktionsweise von Ribozy- men. Das Ribozym erkennt die mRNA des infektiösen HERV durch komplementäre Basenpaarung mit der mRNA. Das Ribozym spaltet und zerstört dann die RNA in Sequenz-spezifischer Weise, bevor der HERV translatiert wird.

Nach der Dissoziierung vom geschnittenen Substrat hybridisiert das Ribozym wiederholt mit spezifischen RNA-Molekülen und wirkt als spezifische Endonuklease.

Im Allgemeinen können Ribozyme spezifisch zur Inaktivierung einer bestimmten mRNA erzeugt werden, selbst wenn nicht die gesamte DNA-Sequenz, die für den infektiösen HERV codiert, bekannt ist.

Ribozyme sind besonders effizient, wenn sich die Ribosome langsam die mRNA entlang be- wegen. In diesem Fall ist es für das Ribozym leichter, eine Ribosomen-freie Stelle an der mRNA zu finden. Daher sind auch langsame Ribosomen-Mutanten als System für Ribozyme geeignet (J.

Jayburg (1997), Nature Biotechnology 414-415). Eine weitere Möglichkeit ist auch die Verwendung einer variierten Form eines Ribozyms, d. h. eines Minizyms. Minizyme sind besonders effizient für die Spaltung grösserer mRNA-Moleküle. Ein Minizym ist ein Hammerkopf-Ribozym, das einen kurzen Oligonukleotid-Linker anstelle von Stiel/Schlinge 11 aufweist. Primer-Minizyme sind beson- ders effizient (Kuferbara et al. (1998), Nature Biotechnology 16,961-965).

Auch hier wieder weist das Ribozym Sequenzabschnitte auf, die zu "spezifischen" Sequenzab- schnitten des oben definierten Polyn#klecotid-Molek#ls gemäss der vorliegenden Erfindung komple- mentär sind. Es genügt, wenn mindestens einer der beiden Sequenzabschnitte spezifisch ist, was bedeutet, dass dieser spezifische Sequenzabschnitt nur an einen infektiösen HERV gemäss der vorliegenden Erfindung bindet und nicht an bereits bekannte und beschriebene nicht-infektiöse HERV-Sequenzen.

Vorzugsweise sind jedoch beide Sequenzabschnitte für das oben definierte Polynukleotid- Molekül gemäss der vorliegenden Erfindung spezifisch, was bedeutet, dass beide Sequenzab- schnitte nur infektiöse HERV-Sequenzen binden.

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Primer-Paar, wobei die Primer spezi-

fisch mit einem Polynukleotid-Molekül gemäss der vorliegenden Erfindung hybridisieren zwecks einer Amplifikationsreaktion eines Fragments des Polynukleotid-Moleküls. Auch hier bezieht sich der Ausdruck "spezifisch" auf Primer, die nur an das oben definierte Polynukleotid-Molekül gemäss der vorliegenden Erfindung und nicht an irgendeinen bekannten, bereits beschriebenen HERV binden. Es genügt, wenn nur einer der Primer für das erfindungsgemässe Polynukleotid-Molekül spezifisch ist, doch binden vorzugsweise beide Primer spezifisch nur das erfindungsgemässe HERV-Polynukleotid-Molekül.

Dieses Primer-Paar kann für jede Detektionsreaktion verwendet werden, um das Vorhandensein eines HERV in einer Probe zu detektieren, wobei der Ausdruck "Amplifikationsreaktion" jede Reaktion betrifft, welche eine Sequenz gemäss der oben beschriebe- nen HERV-Sequenz gemäss der vorliegenden Erfindung spezifisch amplifiziert. Dies kann bei- spielsweise eine herkömmliche PCR sowie eine RT-PCR sein, die beide dem Fachmann gut bekannt sind. Das Primer-Paar kann jedoch auch verwendet werden, um weitere, hierin nicht definierte Teile des infektiösen HERV-Provirus gemäss der vorliegenden Erfindung zu finden. Das Primer-Paar kann weiters verwendet werden, um andere infektiöse HERVs zu identifizieren, wel- che mindestens teilweise Sequenzen aufweisen, die der Sequenz des infektiösen HERV gemäss der vorliegenden Erfindung ähnlich sind.

Der Fachmann findet leicht Bedingungen, unter welchen Primer, die für die infektiösen HERV- Sequenzen gemäss der vorliegenden Erfindung (die sich z. B. von Sequenzen bekannter (nicht- infektiöser) HERVs durch nur 1,2 oder 3 Nukleotide unterscheiden) spezifisch sind, nur an die Sequenzen der infektiösen HERVs gemäss der vorliegenden Erfindung hybridisiert oder anlagert, jedoch nicht z. B. an die bekannten, nicht-infektiösen HERV-Sequenzen. Beispiele für solche spezi- fische Regionen sind z. B. die Regionen, die eine oder mehrere der in Tabelle 1 angeführten Muta- tionen beinhalten. Weitere Beispiele können vom Fachmann beispielsweise durch Vergleichen der Sequenzen des vorliegenden infektiösen HERV mit den bekannten (nicht-infektiösen) HERV-K- Sequenzen (z.B. HERV-K108) abgeleitet werden.

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft einen biologisch funktionellen Vektor, der ein Polynukleotid-Molekül gemäss der vorliegenden Erfindung aufweist. Der biologisch funktio- nelle Vektor umfasst alle Elemente, die für eine effiziente Expression des Polynukleotid-Moleküls gemäss der vorliegenden Erfindung notwendig sind, wobei diese Elemente, z. B. der Promotor, ausgewählt wird nach dem Wirt, in welchen der funktionelle Vektor transfektiert wird und in wel- chem das Polynukleotid-Molekül exprimiert wird, z. B. um ein Protein oder Polypeptid zu erzeugen, das von den vorliegenden infektiösen HERV-Sequenzen codiert wird. Der Fachmann kann den optimalen biologisch funktionellen Vektor ohne grosse Belastung auswählen.

Noch mehr bevorzugt ist ein biologisch funktioneller Vektor vorgesehen, welcher ein Poly- nukleotid-Molekül, wie oben gemäss der vorliegenden Erfindung definiert, in umgekehrter Onentie- rung in Bezug auf den Promotor aufweist. Dieser Vektor ermöglicht die Erzeugung einer antisense- mRNA, die zur mRNA des infektiösen HERV gemäss der vorliegenden Erfindung komplementär ist.

Die antisense-mRNA bindet an die jeweilige Region der mRNA des infektiösen HERV und blockiert daher jegliche weitere Translation und die Produktion von Virus-Proteinen und daher infektiösen Virus-Partikeln. Dabei genügt es, wenn ein wesentlicher Teil der mRNA des infektiösen HERV blockiert wird, um die Erzeugung eines kompletten, infektiösen Virus-Partikels zu blockieren, z.B. ein Teil von gag, pol, pro oder env-mRNA. Daher kann dieser biologisch funktionelle Vektor in Zellkulturen verwendet werden, um die Virusproduktion zu stoppen, sowie als Gen-Therapie gegen oder Vorbeugung gegen Virus-Replikation bei einem Patienten.

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft eine rekombinante Wirtszelle, die mit dem biologisch funktionellen Vektor gemäss der vorliegenden Erfindung wie oben definiert stabil transfektiert worden ist. Dabei wählt der Fachmann den Vektor und die Wirtszelle aus, um ein wirksames Ergebnis zu erzielen, z. B. eine hohe Expression des infektiösen HERV oder von dessen Fragmenten. Die Transfektionsmethoden zur Erzeugung einer rekombinanten Wirtszelle sind dem Fachmann wohl bekannt und können jede Elektroporation, Lipofectamin-Transfektion, Salz- Transfektion usw. umfassen. Je nach dem Vektor, welcher in die Wirtszelle transfektiert wird, exprimiert die Wirtszelle Virus-Peptide, Proteine oder Partikel oder erzeugt antisense-mRNA.

Noch mehr bevorzugt ist die Wirtszelle eine Säuger-Zelle. Dies ermöglicht die Erzeugung von infektiösen HERV-Proteinen oder Peptiden mit korrekten post-translationalen Modifikationen. Die Säuger-Zelle kann beispielsweise von einer humanen Zelllinie stammen.

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Erzeugung eines in- fektiösen humanen endogenen Retrovirus oder zumindest eines Fragments davon, umfassend die Schritte des (a) Transfektierens einer Wirtszelle mit einem Vektor, wie oben definiert, gemäss der vorliegenden Erfindung, (b) Selektierens und Züchtens von Zellen, die mit den Vektor stabil transferiert sind, und (c) des Isoherens und Reinigens des Retrovirus oder des Fragments.

Auch hier gelten die oben erwähnten Definitionen und bevorzugten Ausführungsformen, insbe- sondere in Bezug auf den Transfektionsschritt und die Selektion von Wirtszelle und Vektor. Die Selektion der stabil transferierten Zellen kann gemäss jedem im Stand der Technik wohl bekannten Verfahren durchgeführt werden, beispielsweise eine Selektion mit einer Antibiotika-Resistenz oder eine optische Selektion. Der Ausdruck "Fragment" bezieht sich auf jedes Peptid, das vom oben definierten Polynukleotid-Molekül gemäss der vorliegenden Erfindung codiert ist. Das Fragment bezieht sich jedoch vorzugsweise auf ein Peptid, das als Antigen verwendet werden kann.

Um Fragmente zu detektieren, die als Antigene verwendet werden können, können bekannte homolo- ge Fragmente entsprechender HERVs oder ERVs verwendet werden, solche Fragmente können jedoch auch detektiert werden durch Vorsehen einer Probe infektiöser HERV-Antikörper, welche Probe von einem infizierten Patienten genommen werden kann, Inkubieren des Antikörpers oder der Antikörper mit einem oder mehreren Fragmenten der infektiösen HERV-Proteine unter Bedin- gungen, so dass eine Bindung zwischen entsprechenden Antigenen und Antikörpern stattfindet, und Identifizieren der entsprechenden Fragmente, die an infektiöse HERV-Antikörper gebunden wurden.

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft einen infektiösen humanen endogenen Retrovirus, welcher als RNA ein Polynukleotid-Molekül gemäss der vorliegenden Erfindung auf- weist. Vorzugsweise umfasst der infektiöse HERV gemäss der vorliegenden Erfindung das vollstän- dige Polynukleotid-Molekül, wobei er beispielsweise die pol-, env-, gag-, pro-Gene sowie LTR- Sequenzen umfasst. Es ist jedoch auch möglich, dass die RNA nur eines oder einige wenige, jedoch nicht alle der oben erwähnten Gene umfasst. Wichtig ist, dass der HERV einen vollständi- gen Retrovirus-Replikationszyklus ausführen und weitere Zellen infizieren kann.

Weiters ist ein infektiöser humaner endogener Retrovirus vorgesehen, welcher von einem Po- lynukleotid-Molekül, wie oben definiert, gemäss der vorliegenden Erfindung codiert ist.

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft eine Präparation, die einen infektiösen HERV gemäss der vorliegenden Erfindung aufweist. Die Präparation kann eine pharmazeutische Präparation sein, in welchem Fall vorzugsweise ein pharmazeutisch akzeptabler Träger vorgese- hen ist. Die Präparation kann jedoch auch für diagnostische Zwecke sowie für analytische oder andere Zwecke entworfen sein, beispielsweise, um Antikörper zu erzeugen, die Auswirkungen in Tieren zu untersuchen, usw. Natürlich umfasst die Präparation gemäss der vorliegenden Erfindung jegliche zusätzliche Substanzen, je nach der Verwendung der Präparation. Die Präparation kann weitere Virus-Partikel, wie nicht-infektiöse HERVs, aufweisen.

Es muss jedoch mindestens ein infektiöser HERV gemäss der vorliegenden Erfindung oder ein wesentlicher Teil der Präparation, der zur insgesamten Infektiosität dieser Präparation führt, vorhanden sein.

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein env-Protein, ein pol-Protein, ein gag-, ein pro-Protein, welches von einem Polynukleotid-Molekül, wie oben gemäss der vorliegenden Erfindung definiert, codiert ist. Diese Proteine können für jegliche Analyse-, Diagnose- oder Pro- duktions-Verfahren verwendet werden, und sie werden in jeder beliebigen Form, z. B. mit zusätzli- chen Substanzen, je nach der Verwendung des Proteins vorgesehen.

Weiters ist ein Peptid vorgesehen, weiches ein spezifisches Fragmentdes Retrovirus, wie oben gemäss der vorliegenden Erfindung definiert, ist. Auchhier bezieht sich "spezifisch" auf jedes Fragment, das nicht mit einem bereits bekannten, nicht-infektiösen HERV-Fragment identisch ist.

Wie oben erwähnt, kann bereits das Fragment jegliches Fragment des Retrovirus-Partikels sein, vorzugsweise kann das Fragment jedoch als Antigen verwendet werden (z. B. ein T- oder B-Zellen- Epitop) und daher bei Diagnose-Verfahren sowie zur Induktion der Produktion entsprechender Antikörper in einem Patienten oder einem Tier und/oder zur Induktion spezifischer T-Zellen- Antworten, sowohl TH1 als auch TH2, verwendet werden. Die Detektion solcher Fragmente kann wie oben beschrieben, durchgeführt werden.

Die folgenden Fragmente sind Beispiele für solche Antigene:
Fragmente des gag-Proteins können sein: LMQNEAIEQVRAICL, IPYDWEILAKSSLSP, ADQLLGIGQNWSTIS, TISQQALMQNEAIEQ, EKARKVIVELMAYEN, MAYENANPECQSAIK, PVLNKQNITIQATTT, RSKFDKNGQPLSGNE, LSGNEQRGQPQAPQQ, QPPLSQVFQGISQLP, EIIDKSRKEGDTEAW, VSTKNLIKL, GIGQNWSTI, QYGPNSPYM, CPVLNKQNI, LTVWNDWAI, KFDKNGQPL, GKCYNCGQI, HLKKNCPVL, GRKGNIIPL, FSIKMLKDM
Fragmente des env-Proteins können sein:

PAVDSDLTESLDKHK, WNSQSSIDQKLANQI, VSMDRPWEASPSVHI, PAVQNWLVEVPTVSP, LRPRVNYLQDFSYQR, NTEVLVWEECVANSA, SAVILQNNEFGTIID, QFYHNCSGQTQSCPS, NRSKRFIFTLIAVIM, PYMLVVGNI, IFKASKAHL, KTIGSTTII, GYHYPPICL, SYQRSLKFR, KGKPCPKEI, VEVPTVSPI, SLRPRVNYL, TFNWQHRIL
Vorzugsweise enthalten solche Peptid-Fragmente mindestens 6 Aminosäure-Reste, wobei mindestens ein Rest für die vorliegenden infektiösen HERV-Sequenzen spezifisch ist, insbesonde- re mindestens einer der Aminosäure-Reste, die nicht im (nicht-infektiösen) HERV-K vorhanden sind (HERV-K108). Mehr bevorzugt haben diese Peptide eine Länge von 7 bis 15 Aminosäuren, insbesondere von 8 bis 11. Solche Peptid-Fragmente dieser Längen sind vorzugsweise Fragmente der oben erwähnten gag- und env-Fragmente.

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft einen Antikörper, der gegen ein Antigen gerichtet ist, das vom wie oben definierten Retrovirus gemäss der vorliegenden Erfindung abgeleitet ist. Die Produktion von Antikörpern gegen jedes spezifische Antigen kann gemäss irgendeinem, im Stand der Technik wohl bekannten Verfahren durchgeführt werden, beispielsweise durch Immuni- sierung eines Tieres und Erzeugung der Antikörper in einer Zellkultur. Der Ausdruck "Antikörper" bezieht sich auf jede Form von Antikörper, z. B. einen monoklonalen, polyklonalen, humanisierten Antikörper usw.. Die Antikörper, die gegen Antigene vom infektiösen HERV gemäss der vorliegen- den Erfindung gerichtet sind, können bei Immunisierungsverfahren, Diagnoseverfahren oder thera- peutischen Verfahren verwendet werden.

Vorzugsweise ist ein Antikörper-Fragment vorgesehen, welches gegen ein Antigen gerichtet ist, das vom oben definierten Retrovirus gemäss der vorliegenden Erfindung stammt. Solche Anti- körper-Fragmente können beispielsweise Fa, F (ab)2 oder Fv sein, die fähig sind, an Epitop- Determinanten zu binden. Weiters sind Einzelketten-Antikörper vom Ausdruck "Antikörper- Fragment" mit umfasst. Diese Antikörper-Fragmente können, wie oben für die Antikörper beschrie- ben, verwendet werden, infolge ihrer geringeren Grösse können sie jedoch hinsichtlich Stabilität, Produktion usw. Vorteile aufweisen. Auch hier ist das Antikörper-Fragment spezifisch, was bedeu- tet, dass das Antikörper-Fragment eine Sequenz aufweist, die für infektiösen HERV gemäss der vorliegenden Erfindung spezifisch ist.

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft einen festen Träger, der an seiner Ober- fläche die oben definierten Antikörper gemäss der vorliegenden Erfindung oder die oben definierten Antikörper-Fragmente gemäss der vorliegenden Erfindung befestigt hat. Der feste Träger gemäss der vorliegenden Erfindung kann jede beliebige Grösse oder Form haben, beispielsweise die Form eines flachen Objektträgers, einer Mikrotiterplatte, eines Chips, Filters, einer Säule, Membran usw. und kann aus jedem, im Allgemeinen für feste Träger verwendeten Material bestehen, z. B. aus modifiziertem oder nicht-modifiziertem Glas, Polymermaterial usw.. Dabei kann der Antikörper oder das Antikörper-Fragment an der vollständigen Oberfläche des festen Trägers befestigt sein. Er (es) kann jedoch auch an begrenzten Regionen, wie z. B. an Punkten, befestigt sein.

Auch die Menge, in welcher der Antikörper an den festen Träger gebunden ist, kann gemäss der Grösse des Antikör- pers oder Antikörper-Fragments variieren. Für Tests mit hohem Druchsatz ist es natürlich vorteil- haft, Mikro-Anordnungs-Chips zu verwenden, an welche die Antikörper oder Antikörper-Fragmente in hoher Dichte gebunden sind. Die Wahl des festen Trägers und die Befestigungsweise des Antikörpers an der Oberfläche desselben hängen von der Verwendung des festen Trägers ab, beispielsweise zur Präparation, bei Reinigungsverfahren, Detektionsverfahren usw., und ein Fachmann ist in der Lage, den am besten geeigneten festen Träger und die optimale Befesti- gungsweise des Antikörpers oder Antikörper-Fragments am festen Träger auszuwählen.

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Diagnostizierung kan- zeröser Zellen, umfassend die Schritte des (a) Vorsehens einer Probe der zu testenden Zellen oder des Überstandes davon, (b) Analysierens, ob der infektiöse endogene Retrovirus gemäss der vorliegenden Erfindung, wie oben beschrieben, oder ein Fragment davon in der Probe vorhanden ist oder nicht, wobei (c) das Vorhandensein des Retrovirus oder des Fragments davon in der Probe kanzeröse Zellen diagnostiziert.

Der Ausdruck "kanzeröse Zellen" bezieht sich auf maligne Tumorzellen. Überraschenderweise stellte man fest, dass der infektiöse HERV gemäss der vorliegenden Erfindung mit der Transforma- tion von Zellen zu kanzerösen Zellen, insbesondere Melanomen, in Beziehung steht. Daher ist es durch die Detektion des Vorhandenseins von infektiösem HERV möglich, kanzeröse Zellen schon in einem sehr frühen Stadium zu diagnostizieren. Daher umfasst der Ausdruck "Diagnostizierung kanzeröser Zellen" auch die Diagnostizierung von Zellen, die zu kanzerösen Zellen transformiert werden, wobei jedoch mit herkömmlichen Methoden diese Zellen noch nicht als transformiert diagnostiziert würden.

Es ist jedoch nicht notwendig, den kompletten, infektiösen endogenen Retrovirus zu detektie- ren. Es genügt, mindestens ein spezifisches Fragment desselben zu detektieren. Auch hier bezieht sich der Ausdruck "spezifisch" auf ein Fragment, das eine Sequenz enthält, die sich von den Se- quenzen der bekannten, nicht-infektiösen HERVs unterscheidet. Das Detektionsverfahren kann gemäss jedem, auf dem Gebiet bekannten Protokoll erfolgen, mit welchem es möglich ist, den infektiösen HERV oder ein Fragment davon auf DNA-, RNA- oder Protein-Ebene zu detektieren. Es ist weiters möglich, das Krebsstadium zu bestimmen, indem man die Menge an infektiösem HERV bestimmt.

Vorzugsweise umfasst der Analyse-Schritt eine Antigen-Antikörper-Reaktion unter Verwendung eines Antikörpers oder Antikörper-Fragments, wie oben gemäss der vorliegenden Erfindung be- schrieben, um Proteine oder Protein-Fragmente des Retrovirus zu detektieren. Dabei kann jede bekannte Antigen-Antikörper-Reaktion durchgeführt werden, beispielsweise auf einem festen Träger, in flüssiger Phase, mittels Sandwich-ELISA usw.. Es ist natürlich möglich, Antikörper in dieser Probe nachzuweisen, doch da die Produktion von Antikörpern variieren kann, ist es bevor- zugt, ein Antigen in der Probe zu detektieren, indem ein oder mehrere spezifische Antikörper vorgesehen werden, wobei diese Antikörper an einen festen Träger gebunden sein können und/oder eine Markierung, die detektiert und quantifiziert werden kann, aufweisen kann.

Gemäss einem bevorzugten Verfahren umfasst der Analyseschritt die Detektion der Polynukleo- tid-Sequenz des Retrovirus bzw. eines Fragments der Polynukleotid-Sequenz, die (das) für den Retrovirus spezifisch ist, wobei eine Hybridisierungsreaktion oder Amplifikationsreaktion unter Verwendung eines wie oben definierten Polynukleotids gemäss der vorliegenden Erfindung durch- geführt wird. Dabei umfasst der Ausdruck "Polynukleotid-Sequenz" RNA-Sequenzen, beispielswei- se das aus der Transknption der entsprechenden DNA stammende Polynukleotid-Molekül, oder das im Virus-Partikel vorhandene Polynukleotid-Molekül, sowie DNA, z.B. cDNA, die sich aus der nachfolgenden reversen Transkriptase-Reaktion ergibt, wobei die cDNA noch immer im Virus- Partikel vorhanden sein kann oder auch die DNA bereits in die Wirts-DNA integriert sein kann.

Daher umfasst die Amplifikationsreaktion PCR sowie auch RT-PCR. Dazu wird vorzugsweise das oben erwähnte Primer-Paar verwendet.

Vorteilhaft wird die Polynukleotid-Sequenz in die cDNA in einem reversen Transkriptionsschritt vor dem Hybridisierungsschritt bzw. der Amplifikationsreaktion transformiert. Der Hybridisierungs- schntt wird vorzugsweise mit einem der oben definierten Fragmente des Polynukleotid-Moleküls gemäss der vorliegenden Erfindung, wie oben erwähnt, durchgeführt. Dabei ist es natürlich möglich, markierte Fragmente oder markierte Nukleotide, z. B. retroaktive Nukleotide, zu verwenden, um die Polynukleotid-Sequenz leicht zu detektieren bzw. zu quantifizieren.

Gemäss einem weiter bevorzugten Verfahren umfasst der Analyseschritt (a) das Vorsehen von Zellen, welchen der endogene Retrovirus fehlt, (b) das Zusetzen des Überstandes der Probe zu den Zellen, (c) das Züchten der Zellen, und (d) das Detektieren eines wie oben definierten Polynukleotid-Moleküls gemäss der vorliegenden Erfindung in der DNA der Zellen.

Da der HERV gemäss der vorliegenden Erfindung infektiös ist, infiziert der Überstand der Probe - wenn er einen infektiösen HERV aufweist - die Zellen, welchen dieser endogene Retrovirus fehlt.

Nach der Infektion werden die infektiösen HERVs in den Zellen integriert, und weitere HERV- Partikel werden produziert. Nach dem Züchten der Zellen wird daher das integrierte Polynukleotid- Molekül des infektiösen HERV, wie oben definiert, in der DNA der Zellen detektierbar sein. Dies ist ein sehr verlässliches und rasches Verfahren zur Detektion infektiöser HERVs. Wiederum kann die Detektion des Polynukleotid-Moleküls durch einen Hybridisierungsschritt bzw. eine Amplifikations- reaktion durchgeführt werden.

Vorzugsweise sind die Zellen nicht-humane Zellen. Da nicht-humane Zellen keine HERVs auf- weisen, ist die Detektion eines HERV-Polynukleotid-Moleküls in den Human-Zellen ein eindeutiges Verfahren zur Detektion infektiöser HERV-Partikel. Vorzugsweise sind die nicht-humanen Zellen bovine Zellen. Die Infektiosität der Virus-Partikel gegenüber diesen nicht-humanen Zellen ist auch ein Weg zur Definition der Infektiosität gemäss der vorliegenden Erfindung.

Bevorzugt ist die Probe eine Hautgewebeprobe eines Patienten. Da die infektiösen HERVs vorzugsweise Hautgewebezellen infizieren, wird eine Probe eines Hautgewebes vorzugsweise verwendet, um die infektiösen HERVs zu detektieren.

Noch mehr bevorzugt umfasst die Probe Melanozyten. Da die infektiösen HERVs in einem Be- zug zu kanzerösen Zellen stehen, ist eine Melanozyten umfassende Probe eine bevorzugte Probe zur Detektion von infektiösen HERVs gemäss der vorliegenden Erfindung.

Gemäss einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Diagnostizierung von Krebs bei einem Patienten vorgesehen, umfassend die Schritte des (a) Vorsehens einer Probe vom zu testenden Patienten, (b) Analysierens, ob mindestens ein wie oben definierter Antikörper oder ein wie oben definiertes Antikörper-Fragment gemäss der vorliegenden Erfindung in der Probe vorhanden ist oder nicht, wobei (c) das Vorhandensein des Antikörpers oder Fragments davon in der Probe Krebs diagnostiziert.

Auch hier gelten dieselben Definitionen und bevorzugten Ausführungsformen, wie oben er- wähnt.

Vorzugsweise ist die Probe eine Blutprobe des Patienten. Eine Blutprobe kann sehr leicht und rasch von einem Patienten genommen werden, ohne dass teure Vorrichtungen notwendig sind.

Weiters ist es möglich, eine unbegrenzte Menge an Proben in einer sehr kurzen Zeit zu diagnosti- zieren. Wie oben erwähnt, ist es für Tests mit hohem Durchsatz bevorzugt, Mikroanordnungen zu verwenden.

Gemäss einem vorteilhaften Verfahren umfasst der Analyseschritt eine Antigen-Antikörper- Reaktion unter Verwendung eines Antigens, das vom wie oben definierten Retrovirus gemäss der vorliegenden Erfindung stammt. Auch hier gelten die oben erwähnten Definitionen und bevorzug- ten Ausführungsformen.

Gemäss einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform ist ein Set zur Diagnostizierung kanzerö- ser Zellen gemäss dem oben erwähnten Verfahren gemäss der vorliegenden Erfindung vorgesehen, umfassend (a) ein erstes Reagens, welches ein wie oben definiertes Polynukleotid-Molekül gemäss der vorlie- genden Erfindung, einen wie oben definierten Antikörper gemäss der vorliegenden Erfindung oder ein wie oben definiertes Antikörper-Fragment gemäss der vorliegenden Erfindung oder einen wie oben definierten festen Träger gemäss der vorliegenden Erfindung umfasst, (b) als positive Kontrolle, ein zweites Reagens, welches ein Polynukleotid aufweist, das eine Se- quenz umfasst, welche zur Sequenz des Polynukleotids im ersten Reagens komplementär ist, oder einen wie oben definierten Retrovirus gemäss der vorliegenden Erfindung,

ein wie oben definiertes env-Protein gemäss der vorliegenden Erfindung, ein wie oben definiertes pol-Protein, ein wie oben definiertes gag-Protein oder ein wie oben definiertes Peptid gemäss der vorliegenden Erfindung umfasst. Auch hier gelten dieselben Definitionen und bevorzugten Ausführungsformen, wie oben beschrieben. Natürlich ist es auch möglich, zusätzlich zum ersten Reagens einen weiteren festen Träger ohne daran befestigte Antikörper oder Antikörper-Fragmente vorzusehen. In diesem Fall können der Antikörper oder das Antikörper-Fragment sowie die Befestigungsweise variiert weren.

Gemäss einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Set zur Durchfüh- rung eines Verfahrens zur Diagnostizierung von Krebs bei einem Patienten, wie oben beschrieben,

vorgesehen, welches (a) ein erstes Reagens, das ein vom oben definierten Retrovirus stammendes Antigen aufweist, und (b) als positive Kontrolle, ein zweites Reagens umfasst, das einen für das Antigen im ersten Rea- gens spezifischen Antikörper gemäss der vorliegenden Erfindung oder ein wie oben definiertes Antikörper-Fragment aufweist. Auch hier gelten dieselben Definitionen und bevorzugten Ausfüh- rungsformen, wie oben beschrieben.

Vorzugsweise ist das Antigen mit einem detektierbaren Marker markiert. Dieser Marker kann beispielsweise radioaktiv, fluoreszierend, ein enzymatischer oder chemisch detektierbarer Marker sein. Solche Marker sind im Stand der Technik wohl bekannt und der Fachmann kann den optima- len Marker auswählen.

Noch mehr bevorzugt ist das Antigen auf einem festen Träger immobilisiert. Dies ermöglicht eine einfache Handhabung des Sets, und das Verfahren kann sofort ohne vorherige Vorbereitun- gen durchgeführt werden.

Gemäss einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung Ist ein PNA-Molekül vor- gesehen, welches eine Basen-Sequenz aufweist, die zur Sequenz des oben beschriebenen Poly- nukleotid-Moleküls gemäss der vorliegenden Erfindung komplementär ist. PNA (Peptid-Nuklein- säure) ist eine DNA-artige Sequenz, wobei die Nuklein-Basis an ein Pseudo-Peptid-Gerüst gebun- den ist. PNA hybridisiert im Allgemeinen mit komplementärer DNA, RNA oder DNA-Polymeren mittels einer Watson-Creek-Basenpaar- und Helix-Bildung. Das Peptid-Gerüst gewährleistet einen grösseren Widerstand gegen enzymatischen Abbau. Das PNA-Molekül ist somit ein verbessertes antisense-Agens.

Dabei liegt der Vorteil darin, dass weder Nukleasen noch Proteasen ein PNA-Molekül angreifen können. Daher ist das PNA-Molekül sehr stabil, wenn es an eine komplementäre Sequenz gebun- den ist, da es eine ausreichende sterische Blockierung der DNA- und RNA-Polymeräsen, reversen Transkriptase, Telemorase und Ribosomen aufweist (Buga et al., "Gell Penetrating DNA Constructs Regulate Alanin Receptor Levels and Modify Transmission in vivo", Nature Biotechno- logy 16 :857-861 (1998)).

Wie im Falle der antisense-RNA, bindet das PNA-Molekül, wenn es die oben definierte Se- quenz aufweist, an die DNA/RNA bzw. an eine Stelle der DNA/RNA, die für infektiöse HERV- Peptide codiert. Auf diese Weise inhibiert das PNA-Molekül die Transkription des Virus. Das PNA- Molekül wird synthetisch hergestellt, beispielsweise mittels der T-boc-Technik, da es weder transk- ribiert noch translatiert wird.

Die vorliegende Erfindung betrifft auch die Verwendung von anti-retroviralen Substanzen zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Melanomen. Die vorliegende Erfindung sieht daher ein Verfahren zur Behandlung von Patienten vor, die ein Melanom haben oder bei welchen ein Risiko besteht, dass sie ein Melanom bekommen, welches die Verabreichung einer wirksamen Menge von gegen Retroviren wirkenden Substanzen, beispielsweise Substanzen, die die Replika- tion und Polymerisation retroviraler (infektiöser HERV) Genome inhibieren, umfasst. Beispiele für eine solche Behandlung sind z. B. für die Behandlung von HIV-Infektionen bekannt.

Vorzugsweise ist eine pharmazeutische Zusammensetzung vorgesehen, welche ein wie oben definiertes Polynukleotid gemäss der vorliegenden Erfindung, einen wie oben definierten Vektor gemäss der vorliegenden Erfindung, einen wie oben definierten Antikörper, ein wie oben definiertes Antikörper-Fragment bzw. ein wie oben definiertes PNA-Molekül und einen pharmazeutisch akzep- tablen Träger aufweist. Natürlich kann die pharmazeutische Zusammensetzung jegliche weitere Moleküle oder Substanzen, die für ein therapeutisches Verfahren nützlich sind, aufweisen. Die pharmazeutische Zusammensetzung kannbeispielsweise als Hautcreme oder Lotion, die bei- spielsweise als After Sun-Lotion auf präventive Weise verwendet werden kann, vorgesehen wer- den.

Vorzugsweise weist die pharmazeutische Zusammensetzung weiters mindestens eine antivira- le Substanz, insbesondere anti-retrovirale Substanzen, auf. Diese können alle auf diesem Gebiet wohlbekannten Substanzen sein, beispielsweise die Mittel, die bei der bekannten Dreifach-anti- retroviralen Therapie verwendet werden, vgl. beispielsweise Bartlett JA, DeMasi R, Qunn J, Mox- ham C, Rousseau F. Oberview of the effectiveness of triple combination therapy in antiretroviral- naive HIV-2 infected adults. AIDS. 2001 Jul 27;15(11):1369-77; Marimoutou C, Chene G, Mercie P,

Neau D, Farbos S, Morlat P, Ceccaldi J, Dabis F. Prognostic factors of combined viral load and CD4+ cell count responses under triple antiretroviral therapy, Aquitaine cohort, 1996-1998.

J Acquir Immune Defic Syndr. 2001 Jun 1 ; (2) :161-7, die durch Hinweis darauf hierin mit einbezo- gen sind.

Gemäss einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist eine Sonnencreme vor- gesehen, welche ein wie oben definiertes Polynukleotid gemäss der vorliegenden Erfindung, einen Antikörper, ein Antikörper-Fragment wie oben definiert, bzw. ein PNA-Molekül, wie oben definiert, und mindestens eine UV-Schutz-Substanz aufweist. Daher verhindert oder inhibiert das Auftragen einer Sonnencreme mit diesen Substanzen die Produktion von oder Infektion mit infektiösem HERV gemäss der vorliegenden Erfindung.

Vorzugsweise umfasst die Sonnencreme weiters mindestens eine antivirale Substanz. Dabei wird dieselbe antivirale Substanz, wie oben, für die pharmazeutische Zusammensetzung erwähnt, bevorzugt.

Gemäss einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Vakzin vorgesehen, welches als Antigen einen abgeschwächten Retrovirus, wie oben erwähnt, ein env-Protein, ein pol- Protein, ein gag-Protein bzw. ein Peptid, wie oben erwähnt gemäss der vorliegenden Erfindung und gegebenenfalls ein Adjuvans umfasst. Ein solches Vakzin induziert, wenn es einem Patienten verabreicht wird, die Produktion von Antikörpern und/oder T-Zellen, die infektiöse HERVs gemäss der vorliegenden Erfindung inhibieren können. Daher ist ein solches Vakzin eine sehr wirksame Substanz zur Behandlung infektiöser HERV-Infektionen.

Die Erzeugung von Vakzinen gegen Retroviren ist in "Hyperattenuated Recombinant Influenza A Virus Non-structural-protein-Encoding Vectors Induce Human Immunodeficiency Virus Type 1 Nef-Specific Systemic and Mucosal Immu- ne Responses in Mice", Boris Ferko, Jana Stasakova, Sabine Sereinig, Julia Romanova, Dietmar Katinger, Brigitte Niebier, Hermann Katinger und Andrej Egorov. Journal of Virology, Oktober 2001, S. 8899-9808, Bd. 75, Nr. 19 beschrieben, welches durch Hinweis darauf hierin mit einbezogen ist.

Die vorliegende Erfindung ist anhand der folgenden Beispiele und Figuren näher beschrieben, auf welche sie jedoch nicht eingeschränkt werden soll.

In den Zeichnungen zeigt
Fig. 1 die Charakterisierung von Partikel-Präparationen aus Melanom-Zellüberständen;
Fig. 2 eine Elektronen-Mikroskopie von Überständen, die von Melanom-Zellen stammen ;
Fig. 3 die Expression des retroviralen pol-Gens bei Melanomen;
Fig. 4 eine Immunfluoreszenz-analyse mit HERV-K-spezifischen Antikörpern gegen gag, cORF und env;
Fig. 5 Zellen, die mit Melanom-assoziierten Partikeln infiziert sind;
Fig. 6 die Expression von cORF in mit Melanom-assoziierten Partikeln infizierten MDBK-Zellen,
Fig. 7 den Vektor pCR4Topo sowie die gag-, prot-, Pol- und env-Primer.

BEISPIELE
Beispiel 1
Human-Melanom-Zellen enthalten in ihren Überständen eine RT-Aktivität
Zur Detektion extrazellulärer Virionen wurden Überstände der Melanom-Zelllinien SKMel-28, SKMel-1 518A2 sowie primäre Melanom-Zellen auf pelletierbare RT (Reverse Transkriptase) analysiert. Die Überstände aus gezüchteten humanen, neonatalen Melanozyten (NHEM) dienten als Kontrollen. Die zellfreien Überstände von etwa 106 Zellen wurden durch Zentrifugieren konzent- riert. Die RT-Aktivität der resultierenden Pellets wurde mittels F-PERT-Test analysiert.

Die Überstände von Melanom-Zelllinien und normale Human-Melanozyten wurden bei 3000xg bei 4 C zentrifugiert und durch eine 0,22 um Niedrig-Protein-Membran (Nunc) steril filtriert, um Zellen und Zellabfall zu entfernen. Die geklärten Überstände wurden 20 min lang bei 250000xg bei 4 C in einem Beckman SW50.1 Rotor zentrifugiert. Die Pellets wurden mit mit Phosphat gepuffer- ter Kochsalzlösung (PBS) gespült und 15 min lang bei 250000xg zentrifugiert und re-suspendiert.

Die resultierenden Partikel-Suspensionen wurden als Enzymquelle für RT-Tests verwendet.

Pelletierte Partikel, die von 4 ml zellfreien Überständen von etwa 106-Zellen stammten, wurden analysiert. Die RT-Aktivität wurde mittels eines verbesserten Produkt-RT-Tests aus Basis einer

fluoriszierenden Sonde (fluorescent probe-based product enhanced RT, F-PERT), wie beschrie- ben, mit Modifikationen bestimmt. Zuerst wurden die Pellets in Lysepuffer (Roche) suspendiert.

Danach wurde die RT durchgeführt, wobei das suspendierte Pellet als Enzymquelle, der Primer 3'A10 (5'-CACAGGT-CAAACCGCCTAGGAATG-3') und 0,3 ug MS2-RNA als Matrize (Roche &num; 165948) verwendet wurden. Zur Begrenzung der unspezifischen reversen Transkription wurden 0,5 ug Kalb-Thymus-DNA (Sigma &num; D4522) zugegeben. Nach einstündiger Inkubation bei 42 C wurde ein 5 pl-Aliquot dieser Reaktionsmischung mittels Echtzeit-PCR amplifiziert, indem 25 ul TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems &num; 4304437,1 ul der Primer 3'A10 und 5'A11 (5'TCCTGCTCAACTTCCTGTCGAG-3') mit einer Konzentration von je 10 uM, 1 ul F-PERT- Sonde (genXpress, 10 uM, 5' (FAM) -TCTTTAGCGAGACGCTACCATGGCTA-(TAMRA)3') und 17 ul AD zugegeben wurden.

Die resultierende Mischung wurde dann durch 10min#tige Inkubation bei 95 C, gefolgt von 40 Zyklen während 20 Sekunden bei 94 C und 1 Minute bei 64 C, in einem SD 7700 (Perkin Eimer) amplifiziert. Die Eichkurve wurde durch Auftragen der RT-Aktivität einer Serien-Verdünnung von Moloney Murine Leukemia Virus (M-MLV) RT (Superscript 11 Gibco &num; 18064 - 014) erzeugt. Alternativ wurde die Detektion der reversen Transkriptase mit einem im Handel erhältlichen reversen Transkriptions-Test (Boehringer Mannheim) durchgeführt. Bei dieser Vorgangsweise werden Dioxigenin (DIG) und Biotin-markierte Nukleotide, die mittels der reversen Transkriptase synthetisiert wurden, in das DNA-Molekül inkorporiert. Die mit Biotin markierte DNA wird dann durch die mit Streptavidin beschichtete Oberfläche der Mikrotiterplatten eingefangen.

In einem nachfolgenden Schritt wird ein Antikörper gegen mit Peroxidase konjugiertes DIG an die mit Dioxigenin markierte DNA gebunden. Im letzten Schritt wurden das Peroxidase-Substrat ABTS und ein Substrat-Verstärker zugegeben. Die Absorption der Proben wurde unter Verwendung eines Mikrotiterplatten-Lesegeräts bestimmt. Die Eichkurve wurde durch Auftragen einer Serien- Verdünnung einer von HIV-1 stammenden RT mit einer definierten Aktivität erzeugt.

Es zeigte sich, dass die Überstände eine schwankende, doch ständig vorhandene RT-Aktivität enthalten, welche der Aktivität von bis zu 10000 u-Einheiten von M-MLV-RT (Superscript 1, Gibco) pro ml Überstand entspricht. Anderseits enthielten Überstände von gezüchteten Melanozyten keine detektierbare RT-Aktivität (Detektionsgrenze 10 uEinheiten). Die Tatsache, dass Überstände, die von Melanom-Zellen, jedoch nicht von Melanozyten, stammten, pelletierbare RT-Aktivität enthalten, zeigt, dass Melanom-Zellen provirale Sequenzen mit einer ausreichenden genetischen Information enthalten, um Partikel zu bilden, die eine funktionelle RT enthalten.

Da in den Überständen von Melanozyten keine RT-Aktivität detektiert wurde, scheint die Produktion von RT-enthaltenden Partikeln während der Transformation von Melanozyten zu malignen Zellen aktiviert zu werden.

Beispiel 2
Von Human-Melanom-Zellen stammende Partikel verpacken Sequenzen mit hoher Homo- logie zu HERV-K
Retrovirale pol-Gene sind im Allgemeinen die am meisten konservierten Sequenzen unter den Retroviren. Beim Versuch, die Partikel-Präparationen auf molekularer Ebene zu analysieren, wurde eine Sequenz amplifiziert, indem degenerierte Primer verwendet wurden, welche konservierten Sequenzen des pol-Gens entsprachen. Partikel-Präparationen der Melanom-Zelllinie 518A2 und SK-Mel28 wurden für die RT-PCR-Analyse verwendet. Die Partikel wurden mit DNAse behandelt, um kontaminierende Spuren von Genom-DNA zu entfernen.

Die Oligonukleotid-Primer 3'ABDPOLS 5'dCATTCCTTGTGGTAAAACTTTCCA[T/C]TG3' und 5'ABDPOLAS 5'dCCCCTTGGAATACTCCTGTTTT[T/C]TG3' (Codon Genetic Systems, Öster- reich), welche aus konservierten Regionen innerhalb der retroviralen reversen Transkriptase (RT) stammten, wurden von Medstrand und Blomberg übernommen. Um eine Virus-RNA freizusetzen, wurde die Partikel-Suspension in ein 0,5 ml Polypropylen-Mikrozentrifugen-Röhrchen (Sörensen Inc., USA) transferiert. Danach wurden 10 ul steriles Wasser, welches 0,1% Triton X-100 und 10 E Rnase-Inhibitor (Gibco) enthielt, zugegeben und es wurde 10 min lang bei 65 C inkubiert. Die reverse Transknption wurde in denselben Röhrchen durchgeführt.

Eine Mischung, enthaltend 50 mM Tris-HCI-Puffer, pH 8,3,50 mM Kcl, 7,5 mM MgCI2, 5 mM DTT, 1 mM dNTPs, 20 pmol Primer 3'ABDPOLA, 10 E Rnase-Inhibitor und 100 E Superscript II RT (Gibco) in einem Endvolu-

men von 20 ul, wurde zugegeben, während die Röhrchen auf Eis gehalten wurden. Die Umsetzung wurde 45 min lang bei 42 C durchgeführt.

Für die PCR enthielt die Reaktionsmischung 10 mM Tris-HCI-Puffer, pH 8,3,50 mM Kcl,
1,5 mM MgCI2, 0,005% (Gew.Nol.) Gelatine, 0,2 mM dNTPs, 25 pmol 3'ABDPOLS und 5'ABDPOLAS, 10 ul der reversen Transkriptionsreaktion und 1,25 E Taq-Polymerase (Boehringer
Mannheim) in einem Endvolumen von 50 ul. Die Reaktionsmischungen wurden mit Mineralöl überlagert und 3 thermischen Denaturierungszyklen bei 92 C während 45 s, einer PnmerAnlagerung bei 45 C während 45 s, und einer Verlängerung bei 72 C während 60 s, unterzogen, gefolgt von 45 Zyklen bei 92 C während 45 s, 55 C während 45 s und 72 C während 60 s. 10 ul jedes Amplifikations-Produkts wurden mittels Elektrophorese in einem 1,5% Agarose-Gel analysiert und mit Ethidiumbromid-Färbung sichtbar gemacht. Ein Aliquot des Amplifikations-Produkts wurde kloniert und sequenziert.

Die RT-PCR dieser Präparationen zeigte die erwarteten Amplifikations-Produkte von 298 Nukleotiden. Da keine Amplifikations-Produkte erhalten wurden, wenn die RT weggelassen wurde, können mögliche DNA-Verunreinigungen ausgeschlossen werden (Fig. 1a). (A) RT-PCR. PartikelPräparationen der Melanom-Zelllinie Mel-Juso wurden mit DNAse behandelt und für die Analyse verwendet. Die PCR (Bahn 1) oder RT-PCR (Bahn 2) mit degenerierten Primern entsprechend Sequenzen, welche in retroviralen Polymerase(pol)-Genen konserviert sind, wurde durchgeführt; M : Molekulargewicht-Marker (Boehringer Mannheim VIII). Bei den Kontrollreaktionen ohne RT wurden keine Amplifikations-Produkte erhalten, was das Fehlen einer Verunreinigung mit DNA zeigt (Bahn 1).Dagegen zeigte die RT-PCR die erwarteten Amplifikations-Produkte von 298 Nukleotiden (Bahn 2). (B) Immunoblotten.

Partikel-Präparationen aus SK-Me128-#berstanden wurden mittels SDS-PAGE getrennt, geblottet, und die HERV-K-spezifischen Proteine wurden mit Antiserum, das env (Bahn 1),gag (Bahn 3) und die entsprechenden Prä-Immunseren, pre-env (Bahn 2) und pre-gag (Bahn 4) erkennt, detektiert. Das Molekulargewicht ist links angegeben. Ausserdem war die RT-PCR des GAPDH-Gens negativ, was das Fehlen einer Verunreinigung mit Zell-mRNA widerspiegelt (Daten nicht gezeigt). Das Amplifikations-Produkt wurde in einen Expressionsvektor kloniert und sequenziert. Die Sequenzanalyse zeigte, dass das amplifizierte Fragment eine hohe Homologie zur entsprechenden pol-Region des endogenen Retrovirus HERV-K aufweist. Die Translation der erhaltenen Nukleotid-Sequenz offenbarte die Aminosäure-Sequenz IKKKSGKWRMLTDLRAINSVLIQPMGALQPGLPSALLPKNWPLVVIDLKDSFFTIPLADQDCEWFAFIIPAVNNLQPAKHF.

Diese Sequenz ist mit den entsprechenden Sequenzen der HERV-KHML2- und -HML3-Familien sehr homolog. Innerhalb dieser Gruppen wurde die höchste Identität (90%) für den Klon NMWV5 (GenBank Hinterlegung AF0115998) beobachtet. Die Homologie mit Sequenzen von Retroviren vom Typ A, B und C war geringer als 70%. Die Sequenzanalyse schliesst eine Verunreinigung mit jedem bekannten nicht-humanen Retrovirus aus und lässt auf einen endogenen Ursprung der verpackten RNA schliessen.

Beispiel 3
Von Human-Melanom stammende Partikel enthalten reife gag- und env-Proteine
Partikel, die von SK-Mel28-Melanom-Zellen stammten, wurden auf lodixanol-Kissen ("cushions") gereinigt und in Western blots auf das Vorhandensein von HERV-K-spezifischen env- und gag-Proteinen analysiert.

Mit lodixanol-Kissen gereinigte Partikel aus SK-Mel28-Überständen wurden pelletiert, in PBS resuspensiert und analysiert. Die Menge der löslichen Proteine wurde mittels einer modifizierten Bradford-Analyse (Bio-rad, Richmond CA) quantifiziert. 5 ug des gesamten Proteins wurden pro Bahn aufgetragen und mittels SDS-PAGE (10%) aufgetrennt. Die Proteine wurden auf PVDFMembranen (Millipore, Bedford, MA) mittels Western-blotting transferiert, und die erzeugten Blots wurden mit den, gag- und env- spezifischen Antiseren inkubiert. Die Membranen wurden zweimal mit Blockierungslösung gewaschen, und HERV-K-spezifische Proteine wurden mit einem mit alkalischer Phosphatase konjugierten Zweitschritt-Antikörper detektiert.

Das Hüllen(env) -Gen von Retroviren zeigt einen ORF für das Oberflächen-Protein (SU) und ein Membran-überspannendes Protein (TM). Der env-Vorläufer wird üblicherweise vor der Translo-

kation an die Zelloberfläche und dem Einbau in Virus-Partikel in die SU- und TM-Untereinheiten gespaltet. Um zu bestimmen, ob das env-Protein an den Partikeln vorhanden ist, wurden Immu- noblots mit einem Antiserum, das die TM-Domäne erkennt, durchgeführt. Wie in Fig. 1bgezeigt, sind im Western blot zwei Banden sichtbar. Die obere Bande entspricht dem Vorläufer, der bei etwa 80 bis 90 kDa wandert. Ausserdem ist eine untere Bande, die bei etwa 37 kDa wandert, sicht- bar, was auf eine Spaltung des Vorläufers in Untereinheiten schliessen lässt.

Immunoblotten mit einem HERV-K-anti-gag-Antiserum zeigten eine doppelte Bande bei etwa 76 kDa, welche gag-Vorläufern entspricht, sowie prozessierte intermediäre gag-Proteine bei etwa 61 kDa, 30 kDa und eine Bande, die mit der Front (weniger als 19 kDa) wandert. Das 30 kDa- Protein entspricht dem putativen Hauptkernprotein von HERv-K. Das Vorhandensein prozessierter gag-Proteine in den Western-blots weist auf eine funktionelle Protease hin.

Beispiel 4
Human-Melanom-Zellen erzeugen Retrovirus-artige Partikel
Um das Vorhandensein von Partikeln zu bestätigen, wurde eine Elektronen-Mikroskopie (EM) durchgeführt.

15 pl-Aliquots der mit lodixanol-Dichtegradienten gereinigten Partikelsuspensionen von SK- Mel28-Überständen wurden auf mit Formvar beschichtete Gitter ("grids") aufgetragen und 15 min dort belassen. Überschüssige Suspension wurde von den Rändern des Gitters mit Filterpapier entfernt. Das Gitter mit der übrigen Probe wurde 1 h lang luftgetrocknet. Die Probe wurde entweder zwecks Negativfärbung 1 % Uranylacetat direkt ausgesetzt oder zwecks Immunoelektronen- Mikroskopie 15 min lang in Paraformaldehyd-Lysin-Periodat fixiert, in destilliertem Wasser gespült, in PBS/1 % BSA gequencht und in anti-env-Antiserum, 1:25 in PBS/1 %BSA verdünnt, 1 h lang bei RT inkubiert.

Nach dem Waschen wurde das Gitter 1 h lang 5 nM mit kolloidalem Gold konjugier- tem Kaninchen-anti-Ziegen-Antikörper (British Biocell, Cardiff, UK), 1:50 in PBS/1%BSA verdünnt, ausgesetzt. Nach Fixierung in 2,5% Glutaraldehyd, Waschen und Negativfärbung mit 1 % Uranyl- acetat liess man das Gitter lufttrocknen. Alle Gitter wurden mit einem JEOL 1010-Elektronenmikro- skop untersucht.

Für die Elektronen-Mikroskopie, das Immunoblotten und die Infektionsuntersuchungen wurden zellfreie Überstände auf lodixanol-Dichtegradienten oder-Kissen gereinigt. lodixanol ist ein iodier- tes, nicht-ionisches Dichtegradienten-Medium (Nycomed Pharma, Oslo, Norwegen). Es hat eine geringe Viskosität und sieht iso-osmotische Bedingungen bis zu Dichten von 1,32 g/ml vor. Die Überstände wurden auf einem Kissen von 5 ml 50% lodixanol überlagert. Die Röhrchen wurden in einem SW28-Rotor bei 45000xg 2 h lang bei 4 C zentrifugiert, und der Überstand wurde aus den Röhrchen durch Absaugen entfernt, wobei ein Volumen von 4 ml des Mediums in der Nähe des Kissens belassen wurde. Diese Fraktion wurde geerntet, in einem SW41-Rotor bei 150000xg 90 min lang bei 4 C pelletiert, in PBS resuspendiert und analysiert.

Alternativ wurde die vom Kis- sen stammende Fraktion zwecks weiterer Reinigung auf lodixanol-Dichtegradienten geladen, und die Fraktion, welche einer Dichte von etwa 1,16 g/ml entsprach, wurde geerntet. Die geernteten Fraktionen wurden in PBS verdünnt und in einem SW41-Rotor bei 150000xg 90 min lang bei 4 C pelletiert und in PBS resuspendiert.

Die Pellets wurden auf lodixanol-Kissen (Fig. 2, oberer Teil) teilweise gereinigt. Alternativ wur- den diese Fraktionen auf lodixanol-Dichtegradienten (Fig. 2, unterer Teil) weiter gereinigt. Diese Präparationen wurden mittels Immunelektronen-Mikroskopie unter Verwendung eines env-spezifi- schenAntiserums und eines mit kolloidalem Gold konjugierten Reporter-Antikörpers analysiert.Die EM-Analyse dieser Präparationen zeigte das Vorhandensein von Retrovirus-artigen Partikeln, die durch Membran-gebundene kugelförmige Strukturen mit Durchmessern im Bereich zwischen 80 und 120 nm gekennzeichnet sind. Das Vorhandensein von Immunogold auf den Partikeln zeigt an, dass das env-Protein in der Hülle vorhanden ist.

Beispiels 5
Das pol-Gen ist in von Melanomen stammenden Tumor-Zellen exprimiert

Es zeigte sich, dass die Integrationsstellen humaner endogener Retrovirus-Elemente über das ganze Human-Genom verteilt sind. Beispielsweise wurde berichtet, dass die HERV-K-Familie in etwa 30 Kopien pro humanem Haploid-Genom vorhanden ist. Auf Grund der Beobachtung, dass Melanom-Zellen (jedoch nicht Melanozyten) Retrovirus-artige Partikel erzeugen, kann man die Hypothese erstellen, dass die Bildung Virus-artiger Partikel auf die Aktivierung retroviraler Gene, die üblicherweise unterdrückt sind, zurückzuführen sein kann. Daher wurde die aus den PartikelPräparationen stammende klonierte pol-Sequenz als Sonde verwendet, und man suchte nach einer Expression dieser Sequenz im Zytoplasma von Melanom-Zellen durch in situ-Hybridisierung.

Touch-Präparate eines Naevus, eines primären Melanoms und einer Melanom-Metastase wurden durch Eintauchen frisch herausgeschnittenen Gewebes auf beschichtete Objektträger hergestellt (DAKO, Biotek Solutions). Die Objektträger wurden in 4% Paraformaldehyd 20 min lang fixiert, in PBS gewaschen, durch abgestufte Alkohole bis zu absolutem Ethanol dehydriert und luftgetrocknet. Die Hybridisierungsmischungen bestanden aus Hybrisol VI (Oncor, Gaithersburg) und mit DIG markierten cDNA-Sonden, was eine Endkonzentration von 2 ng/pl ergab. Die Objektträger wurden mit Glas-Deckgläschen bedeckt und mit Gelbond (ICN) versiegelt. Sonde und Zellmaterial wurden durch 5minütiges Erhitzten auf 80 C denaturiert. Die Hybridisierung erfolgte in einer Feuchtkammer bei 37 C über Nacht.

Nach dem Entfernen der Deckgläschen wurden die Objektträger dreimal bei 46 C mit 50% Formamid/2xSSC, einmal 10 min lang mit 2xSSC, gefolgt von einem einzigen 10minütigen Waschschritt in 2xSSC, enthaltend 0,1% NP40, gewaschen. Die Signal-Detektion erfolgte nach einem 30minütigen Blockierungsschritt in 1% Blockierungs-Reagens (Boehringer Mannheim) bei 37 C durch Inkubation mit anti-TIG-Antikörper, 30 min lang konjugiert mit Rhodamin in einer Verdünnung von 1:10 in 1% Blockierungsreagens bei 37 C in einem angefeuchteten Behälter. Nach extensiven Waschungen in PBS wurden die Objektträger mit 10 ug/ml DAPI 20 min lang gegengefärbt und mit einem Zeiss-Fluoreszenz-Mikroskop unter Verwendung eines Dreifach-Bandpassfilters und Software von PSI sichtbar gemacht.

Um die Spezifität der pol-Sequenz für Melanome zu bestimmen, wurden Touch-Präparationen eines knotenförmigen Melanoms, einer Lymphknoten-Metastase, und einer Haut-Metastase, die von Melanom-Patienten chirurgisch entfernt worden waren, analysiert. Wie in Fig. 3 gezeigt, (Touch-Präparationen eines primären Melanoms (a), einer Lymphknoten-Metastase (b), einer Haut-Metastase (c), eines Naevus (d) und eines tumorfreien Wächter ("sentinel")-Lymphknotens (e), die chirurgisch von Patienten entfernt worden waren, wurden durch in situ-Hybridisierung mit Sonden, die für Nukleotid-Sequenzen des pol-Gens (POL), des Melanom-inhibierenden Aktivivitäts-Gens (MIA) und des Influenza-Virus-Nukleoproteins (FLU) spezifisch waren, analysiert.

Die Nukleotid-Sequenzen des pol- und des Melanom-inhibierenden Aktivitäts-Gens findet man im primären Melanom und Lymphknoten- und Haut-Metastasen, jedoch nicht im Naevus und im tumorfreien Lymphknoten. Man fand eine hohe Kopienzahl der pol-Sequenz in Tumorzellen aller getesteten Melanom-Proben. Im Vergleich dazu waren jene Zellen, die aus dem Lymphknoten und dem gutartigen Naevus gesunder Individuen stammten, negativ. Eine für das Nukleoprotein-Gen von Influenza-Virus spezifische Sonde war immer negativ. Als positive Kontrolle wurde eine Sonde, die das Melamon-inhibierende Aktivitäts-Gen erkennt, verwendet. Die Rate der Tumorzellen, die das pol-Gen exprimierten, lag im Bereich von 60-90%, ein Prozentsatz ähnlich jenem, den man mit der für Melanom-inhibierende Aktivität spezifischen Sonde erhielt.

Die Beobachtung, dass die Sequenzen nicht in allen Tumorzellen zu finden sind, könnte auf die Empfindlichkeit des Tests und Variationen in den Expressionsmengen zurückzuführen sein.

Beispiel 6
Retrovirale gag-, cORF- und env-Proteine werden in Melanomen exprimiert
Um festzustellen, ob HERV-spezifische Proteine in Melanomzellen detektierbar waren, wurde eine Immunofluoreszenz-Analyse mit Antiseren, die die gag-, cORF- und env-Proteine von HERVK erkennen, durchgeführt.

Zellen, die auf Kammer-Objektträgern gezüchtet wurden, sowie Touch-Präparationen von einem Naevus und einem primären Melanom auf beschichteten Objektträgern (DAKO) wurden in 4% Paraformaldehyd 20 min lang fixiert, in PBS gewaschen und durch abgestufte Alkohole bis zu

absolutem Ethanol dehydriert und luftgetrocknet. Ausserdem wurden fünf Mikrometer-Schnitte, die aus routinemässig prozessierten Paraffinwachsblöcken von einem Naevus und einem Melanom hergestellt worden waren, auf beschichtete Objektträger (DAKO) gegeben. Die Gewebe wurden in Xylol einer Wachsentfernung unterzogen, sie wurden durch sequenzielles Eintauchen in abgestufte Ethanole und PBS rehydratisiert und danach durch Mikrowellenbehandlung permeabilisiert.

Die Immunfluoreszenz-Färbung erfolgte durch einstündiges Inkubieren von Kammer-Objekt- trägern, Touch-Präparationen und Paraffin-Schnitten mit HERV-K-spezifischen Antikörpern bei einer Verdünnung von 1:100 bei 37 C in einem angefeuchteten Behälter, gefolgt von dreimaligem Waschen mit PBS und nachfolgender einstündiger Inkubation mit mit Alexafluor-488 konjugierten Antikörpern bei einer Verdünnung von 1:200 bei 37 C. Die Gegenfärbung erfolgte durch Auftragen in Vectashield-enthaltendem DAPI (Vector). Die Präparationen wurden unter Verwendung eines Zeiss-Fluoreszenz-Mikroskops mit geeigneten Filtern analysiert.

Fig. 4a zeigt, dass die Melanom-Zelllinien Mel-Juso und SK-Mel28 die gag-, cORF- und env- Proteine exprimieren. Der Prozentsatz der gag-exprimierenden Zellen lag im Bereich von 1-10%, cORF erwies sich als in etwa 20% vorhanden, wogegen die Expression des env-Proteins in etwa 10% der analysierten Zellen detektiert wurde. Die Expression von gag und env fand man im Zytop- lasma, wogegen cORF hauptsächlich im Nukleus gefunden wurde. Dagegen reagierten gezüchtete Human-Melanozyten (Nhem) und Vero-Zellen nicht mit HERV-K-spezifischen Antiseren. Keines der entsprechenden Präimmun-Seren war mit irgendwelchen der getesteten Zellen reaktiv.

Die Immunfluoreszenz-Analyse erfolgte mit einer Touch-Präparation eines primären Melanoms (erste Spalte); einer Touch-Präparation eines Naevus (zweite Spalte); einer Paraffin-Präparation eines primären Melanoms (dritte Spalte); einer Paraffin-Präparation von Naevus (vierte Spalte der Fig 4b). Retrovirale Proteine sind in den Melanom-Präparationen vorhanden, fehlen jedoch im Naevus-Gewebe.

Danach wurde analysiert, ob diese Proteine auch im primären Melanom exprimiert sind. Fig. 4b zeigt, dass gag, cORF und env in Touch-Präparationen und in Paraffinschnitten eines primären Melanoms detektiert wurden, jedoch nicht in den entsprechenden Präparationen eines Naevus.

Beispiel 7
Von Melanomzellen stammende Partikel sind infektiös
Die humane Epithel-Zelllinie 293 ist ein gut etabliertes Ziel für Retrovirus-Infektion. Immunfluo- reszenz mit HERV-K-spezifischen gag-Antikörpern wurde drei Wochen nach der Infektion (p.i.) durchgeführt. Kontroll-Zellen wurden pseudo ("mock")-behandelt. Die 293-Zellen wurden mit den vom Melanom stammenden Virus-Partikeln behandelt und zeigen, dass sie nach der Behandlung das HERV-K-spezifische gag-Protein exprimieren (Fig. 5a). Ausserdem korrelierte die Expression der retroviralen Proteine der Menge der pelletierbaren RT-Aktivität in den Überständen (Fig. 5b), was nahelegt, dass die 293-Zellen produktiv mit den vom Melanom stammenden Zellen infiziert waren.

Auf Grund der hohen Kopienzahl verschiedener HERV-Sequenzen, die im Human-Genom vorhanden sind, war es jedoch nicht möglich nachzuweisen, dass die Expression von Proteinen und die Produktion von RT-enthaltenden Partikeln aus de novo in das Wirts-Genom integrierter retroviraler DNA stammte. Daher wurde diese Frage in bovinen MDBK-Zellen untersucht. Genom- DNA aus MDBK-Zellen, die von Melanom stammenden Partikeln ausgesetzt waren, wurde isoliert.

Die Detektion von de novo-insertierten HERV-Sequenzen erfolgte mittels PCR mit pol-Primern, die für Virus-Genom-RNA aus von Melanom stammenden Partikeln spezifisch sind, und mit gag- Primern, die konservierte Regionen der HERV-K-Sequenzen erkennen.

Die Überstände von etwa 108 Melanom-Zellen wurden auf 30% Saccharose-Kissen geladen und bei 28000U/min zentrifugiert. Die resultierenden Pellets wurden gewaschen und in 500 ul PBS resuspendiert. Für Infektionsuntersuchungen wurden humane 293- und bovine MDBK-Zellen auf etwa 30% Konfluenz gezüchtet und über Nacht den Partikel-Präparationen in Gegenwart von 8 ug/ml Polybren ausgesetzt. Als Kontrollen wurden Zellen mit Partikel-Präpartionen behandelt, die 30 min lang bei 60 C einer Hitzeinaktivierung oder Pseudo-Behandlung unterzogen worden waren.

Die 293-Zellen wurden Partikel-Präparationen aus den Melanom-Zelllinien SK-Mel28 und 518A2, die RT-Aktivitäten enthielten, ausgesetzt. Die MDBK-Zellen wurden Partikel-Präparationen ausge-

setzt, die von den Melanom-Zelllinien SK-Mel1 und 518-A2, die RT-Aktivitäten enthielten, stamm- ten. 24h nach der Infektion (p.i.) wurde das Inokulum entfernt, die Zellen wurden zweimal mit PBS gewaschen und mit normalen Medien inkubiert. 7 Tage p.i. wurden die Zellen in einem Verhältnis von 1 :3 und die Infektion wurde mittels Immunhistochemie mit HERV-K-spezifischen Antikörpern und Analysieren pelletierbarer RT-Aktivität in den Überständen mittels PERT-Test überwacht. Nach einer weiteren 1:3-Passage wurde die gesamte DNA von 2x106 Zellen extrahiert.

Die Integration von Virus-Genom-RNA wurde mittels PCR-Amplifikation von 200 ng Gesamt-DNA mit den pol-Gen-spezifischen Primern und den gag-Primern bestimmt. Fig. 6a zeigt, dass pol- und gag-Gen-spezifische Produkte mit Genom-DNA, die aus MDBK-Zellen isoliert wurde, welche von Melanom stammenden Partikeln ausgesetzt worden waren, erhalten wurden. Kein PCR- Amplifikations-Produkt war in der Genom-DNA von pseudo-behandelten Zellen (Fig. 6c) oder von Zellen, die Hitze-inaktivierten Partikeln ausgesetzt worden waren (Fig. 6b), detektierbar. Eine Immunfluoreszenz-Analyse mit HERV-spezifischen Antikörpern, die das cORF-Protein erkennen, korreliert mit diesen Ergebnissen (Fig. 6b). Die Daten zeigen, dass die Melanom-assoziierten Viren für humane und bovine Zellen infektiös sind.

Ausserdem scheinen, da die Virus-DNA in den Zellen selbst nach deren Passagierung detektierbar war, die Melanom-assoziierten Viren fähig zu sein, bei einer Infektion ihr Genom in das Wirtszellen-Genom zu insertieren.

Diese Daten zeigen, dass retrovirale Sequenzen und infektiöse Partikel in Melanom-Zellen exprimiert werden.

Eine Teilsequenz-Analyse, Immunoblotten und immun-elektronenmikroskopische Untersuchun- gen zeigen, dass die Partikel zur HERV-K-Familie gehören. Im Gegensatz zu anderen bekannten HERV-K-artigen Viren, welche nicht infektiös sind, scheint der env-Vorläufer in den von Melanom stammenden Partikeln gespalten zu sein, was zu etwa äquimolaren Mengen des Vorläufers und der putativen Transmembran-Domäne führt. Zellfreie Partikel-Präparationen aus den Melanomzel- len konnten sowohl humane als auch bovine Zellen infizieren, wie durch das Auftreten der Virus- Proteine gag, cORF und env, und durch die pelletierbare RT-Aktivität in den Überständen infizierter Zellen angezeigt ist.

Ausserdem zeigt die Tatsache, dass humane pol- und gag-Sequenzen im Genom der infizierten bovinen MDBK-Zellen detektiert wurden, an, dass die Melanom-assoziierten Viren zu einer de novo-Ingegration ihres Genoms fähig sind. Diese Beobachtung lässt auch auf das Vorhandensein einer funktionellen Integrase in den Virus-Partikeln schliessen.

Fig. 7a zeigt den pCR4-Topo-Vektor, in welchen die MERV-gag-,-pro-, -pol- und-env- Sequenzen, die aus den oben beschriebenen, infizierten bovinen Zellen isoliert worden waren, insertiert wurden. Die in den obigen Beispielen verwendeten Primer sind in den eingerahmten Stellen jeder Sequenz von Vektoren, die in Fig. 7b angegeben sind, gezeigt. Diese Vektoren wur- den am 26. September 2001 am DSMZ unter den Bezeichnungen MERV-env, MERV-gag, MERV- prt und MERV-pol gemäss dem Budapester Vertrag hinterlegt.

SEQUENZPROTOKOLL < 110 > Wolff Prof., Klaus
Muster Prof., Thomas < 120 > infektiöser HERV < 130 > R 35128 < 140 > < 141 > < 160 > 5 < 170 > Patentin Ver. 2.1 < 210 > 1 < 211 > 7475

< 212 > DNA < 213 > Humaner endogener Retrovirus < 400 > 1
5 gctagggtga taatggggca aactaaaagt aaaattaaaa gtaaatatgc ctcttatctc 60 agctttatta aaattctttt aaaaagaggg ggagttaaag tatctacaaa aaatctaatc 120 aagctatttc aaataataga acaattttgc ccatggtttc cagaacaagg aactttagat 180 ctaaaagatt ggaaaagaat tggtaaggaa ctaaaacaag caggtaggaa gggtaatatc 240 attccactta cagtatggaa tgattgggcc attattaaag cagctttaga accatttcaa 300 10 acagaagaag atagcgtttc agtttctgat gcccctggaa gctgtataat agattgtaat 360 gaaaacacaa ggaaaaaatc ccagaaagaa acggaaggtt tacattgcga atatgcagca 420 gagccggtaa tggctcagtc aacgcaaaat gttgactata atcaattaca ggaggtgata 480 tatcctgaaa cgttaaaatt agaaggaaaa ggtccagaat

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cgtaattcaa cccatggggc ctctccaacc tgggttgccc tctctggcca tgatcccaaa 3120 agactggcct ttaattataa ttgatctaaa ggattgcttt tttaccatcc ctctggcgga 3180 gcaggattgc gaaaaatttg cctttactat accagccata aataataaag aaccagccac 3240 caggtttcag tggaaagtgt tacctcaggg aatgcttaat agtccaacta tttgtcagac 3300 ttttgtaggt cgagctcttc aaccagttag agaaaagttt tcagactgtt atattattca 3360 ttatattgat gatattttat gtgctgcaga aacgaaagat aaattaattg actgttatac 3420 atttctgcaa gcagaggttg ccaatgctgg

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< 213 > Humaner endogener Retrovirus < 400 > 4 gctagggtga taatggggca aactaaaagt aaaattaaaa gtaaatatgc ctcttatctc 60 agctttatta aaattctttt aaaaagaggg ggagttaaag tatctacaaa aaatctaatc 120 aagctatttc aaataataga acaattttgc ccatggtttc cagaacaagg aactttagat 180 ctaaaagatt ggaaaagaat tggtaaggaa ctaaaacaag caggtaggaa gggtaatatc 240 attccactta cagtatggaa tgattgggcc attattaaag cagctttaga accatttcaa 300 acagaagaag atagcgtttc agtttctgat gcccctggaa gctgtataat agattgtaat 360 gaaaacacaa ggaaaaaatc ccagaaagaa acggaaggtt tacattgcga

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cattgcttag ggccagataa tcaagaaagt actgttcagc 600 caatgattac ttcaattcct cttaatctgt ggggtcgaga tttattacaa caatggggtg 660

Claims

cggaaatcac catgcccgct ccatcatata gccccacgag tcaaaaaatc atgaccaaga 720 tgggatatat accaggaaag ggactaggga aaaatgaaga tggcattaaa attccagttg 780 aggctaaaat aaatcaagaa agagaaggaa tagggtatcc tttttagggg cggccactgt 840 agagcctcct aaacccatac cattaacttg gaaaacagaa aaaccggtgt gggtaaatca 900 gtggccgcta ccaaaacaaa aactggaggc tttacattta ttagcgaatg aacagttaga 960 aaagggtcat attgagcctt cattctcacc ttggaattct cctgtgtttg taattcagaa 1020 gaaatcaggc aaatggcgta tgttaactga cttaagggcc gtaaacgccg taattcaacc 1080 catggggcct ctccaacctg ggttgccctc tctggccatg atcccaaaag actggccttt 1140 aattataatt gatctaaagg attgcttttt taccatccct ctggcggagc aggattgcga 1200 aaaatttgcc tttactatac cagc 1224 PATENTANSPRÜCHE: 1.

Polynukleotid-Molekül, welches ein Fragment einer Nukleotid-Sequenz eines infektiösen, humanen endogenen Retrovirus ist, wobei das Polynukleotid-Molekül eine Sequenz auf- weist, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus (a) einer Sequenz mit mindestens 98%, vorzugsweise 99%, noch mehr bevorzugt 99,5% Identität mit einer Sequenz gemäss SEQ ID Nr. 1, (b) einer Sequenz, die unter stringenten Bedingungen mit einer Nukleotid-Sequenz gemäss SEQ ID Nr. 1 hybridisiert, (c) einer Sequenz, die sich von den Sequenzen (a) oder (b) infolge einer Degeneration des genetischen Codes unterscheidet, und (d) einer Sequenz, welche Sequenzen umfasst, die in die Vektoren pCR4-Topo insertiert und als "MERV-env" (DSM 14540), "MERV-gag" (DSM 14538), "MERV-prt" (DSM 14536), und "MERV-pol" (DSM 14537) am DSMZ am 26. September 2001 hinterlegt wurden, oder Fragmente davon.
2. Polynukleotid-Molekül nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es eine Sequenz gemäss SEQ ID Nr. 1 aufweist.
3. Polynukleotid-Molekül, dadurch gekennzeichnet, dass es ein spezifisches Fragment des Polynukleotid-Moleküls nach Anspruch 1 oder 2 mit einer Länge von mindestens 15 bp, vorzugsweise mindestens 20 bp, noch mehr bevorzugt mindestens 30 bp, aufweist.
4. Polynukleotid-Molekül, welches für ein env-Protein eines infektiösen humanen endogenen Retrovirus codiert, wobei das Polynukleotid-Molekül eine Sequenz aufweist, die ausge- wählt ist aus der Gruppe bestehend aus (a) einer Sequenz mit mindestens 98%, vorzugsweise 99%, noch mehr bevorzugt 99,5% Identität mit einer Sequenz gemäss SEQ ID Nr. 2, (b) einer Sequenz, welche unter stringenten Bedingungen mit einer Nukleotid-Sequenz gemäss der SEQ ID Nr. 2 hybridisiert, und (c) einer Sequenz, die sich von der Sequenz (a) oder (b) infolge einer Degeneration des genetischen Codes unterscheidet.
5. Polynukleotid-Molekül, welches für ein pol-Protein eines infektiösen humanen endogenen Retrovirus codiert, wobei dieses Polynukleotid-Molekül eine Sequenz aufweist, die ausge- wählt ist aus der Gruppe bestehend aus (a) einer Sequenz mit mindestens 99%, vorzugsweise 99,5%, noch mehr bevorzugt 99,8% Identität mit einer Sequenz gemäss SEQ ID Nr. 3, (b) einer Sequenz, die unter stringenten Bedingungen mit einer Nukleotid-Sequenz gemäss der SEQ ID Nr. 3 hybridisiert, und (c) einer Sequenz, die sich von der Sequenz (a) oder (b) infolge einer Degeneration des genetischen Codes unterscheidet.
6. Polynukleotid-Molekül, welches für ein gag-Protein eines infektiösen humanen endogenen Retrovirus codiert, wobei das Polynukleotid-Molekül eine Sequenz umfasst, die ausge- wählt ist aus der Gruppe bestehend aus (a) einer Sequenz mit mindestens 98%, vorzugsweise 99%, noch mehr bevorzugt 99,5% Identität mit einer Sequenz gemäss SEQ ID Nr. 4, <Desc/Clms Page number 27> (b) einer Sequenz, die unter stringenten Bedingungen mit einer Nukleotid-Sequenz gemäss der SEQ ID Nr. 4 hybridisiert, und (c) einer Sequenz, die sich von der Sequenz (a) oder (b) infolge einer Degeneration des genetischen Codes unterscheidet.
7. Polynukleotid-Molekül, welches für ein pro-Protein eines infektiösen humanen endogenen Retrovirus codiert, wobei dieses Polynukleotid-Molekül eine Sequenz aufweist, die ausge- wählt ist aus der Gruppe bestehend aus (a) einer Sequenz mit mindestens 98%, vorzugsweise 99%, noch mehr bevorzugt 99,5% Identität mit einer Sequenz gemäss SEQ ID Nr. 5, (b) einer Sequenz, die unter stringenten Bedingungen mit einer Nukleotid-Sequenz gemäss der SEQ ID Nr. 5 hybridisiert, und (c) einer Sequenz, die sich von der Sequenz (a) oder (b) infolge einer Degeneration des genetischen Codes unterscheidet.
8. Polynukleotid-Molekül, dadurch gekennzeichnet, dass es eine Sequenz aufweist, die zu der Sequenz, die in einem der Ansprüche 1 bis 7 definiert ist, komplementär ist.
9. Polynukleotid-Molekül nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass es eine detektierbare Markierung aufweist.
10. Polynukleotid-Molekül, das für ein Ribozym codiert, dadurch gekennzeichnet, dass es zwei Sequenz-Abschnitte aufweist, von welchen jeder eine Länge von mindestens 10 bis 15 Basenpaaren hat und welche zu spezifischen Sequenz-Abschnitten des Polynukleotid- Moleküls nach einem der Ansprüche 1 bis 7 komplementär sind, so dass das Ribozym die mRNA, die durch eine natürliche infektiöse endogene Retrovirus-DNA transkribiert ist, komplexiert und schneidet.
11. Primer-Paar, dadurch gekennzeichnet, dass die Primer spezifisch mit einem Polynukleotid- Molekül nach einem der Ansprüche 1 bis 8 zwecks einer Amplifikationsreaktion eines Fragments des Polynukleotid-Moleküls hybndisieren.
12. Biologisch funktioneller Vektor, welcher ein Polynukleotid-Molekül nach einem der Ansprü- che 1 bis 10 aufweist.
13. Biologisch funktioneller Vektor, welcher ein Polynukleotid-Molekül nach einem der Ansprü- che 1 bis 8 in inverser Orientierung in Bezug auf den Promotor aufweist.
14. Rekombinante Wirtszelle, welche mit dem biologisch funktionellen Vektor nach Anspruch 12 oder 13 stabil transfektiert ist.
15. Wirtszelle nach Anspruch 14, dadurch gekennzeihnet, dass sie, eine Säugerzelle ist.
16. Verfahren zur Erzeugung eines infektiösen humanen endogenen Retrovirus oder zumin- dest eines Fragments davon, umfassend die Schritte des (a) Transfektierens einer Wirtszelle mit einem Vektor nach Anspruch 12, (b) Selektierens und Züchtens von Zellen, die mit dem Vektor stabil transfektiert sind, und (c) des Isolierens und Reinigens des Retrovirus oder des Fragments.
17. Infektiöser humaner endogener Retrovirus, welcher als RNA ein Polynukleotid-Molekül nach einem der Ansprüche 1 bis 8 aufweist.
18. Infektiöser humaner endogener Retrovirus, welcher von einem Polynukleotid-Molekül nach Anspruch 1 oder 2 codiert ist.
19. Präparation, welche einen infektiösen humanen endogenen Retrovirus nach Anspruch 17 oder 18 aufweist.
20. Env-Protein, welches von einem Polynukleotid-Molek#l nach Anspruch 4 codiert ist
21. Pol-Protein, welches von einem Polynukleotid-Molekül nach Anspruch 5 codiert ist.
22. Gag-Protein, welches von einem Polynukleotid-Molekül nach Anspruch 6 codiert ist.
23. Peptid, dadurch gekennzeichnet, dass es ein spezifisches Fragment des Retrovirus nach einem der Ansprüche 16 bis 18 ist.
24. Antikörper, dadurch gekennzeichnet, dass er gegen ein Antigen gerichtet ist, welches vom Retrovirus nach einem der Ansprüche 16 bis 18 stammt.
25. Antikörper-Fragment, dadurch gekennzeichnet, dass es gegen ein Antigen gerichtet ist, das vom Retrovirus nach einem der Ansprüche 16 bis 18 stammt.
26. Fester Träger, dadurch gekennzeichnet, dass er an seiner Oberfläche den Antikörper nach Anspruch 24 oder das Antikörper-Fragment nach Anspruch 25 befestigt hat. <Desc/Clms Page number 28>
27. Verfahren zur Diagnostizierung kanzeröser Zellen, umfassend die Schritte des (a) Vorsehens einer Probe der zu testenden Zellen oder des Überstandes davon, (b) Analysierens, ob der infektiöse endogene Retrovirus nach Anspruch 16 oder 17 oder ein Fragment davon in der Probe vorhanden ist oder nicht, wobei (c) das Vorhandensein des Retrovirus oder des Fragments davon in der Probe kanzeröse Zellen diagnostiziert.
28. Verfahren nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, dass der Analyseschritt eine Anti- gen-Antikörper-Reaktion unter Verwendung eines Antikörpers nach Anspruch 24 oder ei- nes Antikörper-Fragments nach Anspruch 25 zur Detektion des Proteins oder Protein- Fragments des Retrovirus umfasst.
29. Verfahren nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, dass der Analyse-Schritt die De- tektion der Polynukleotid-Sequenz des Retrovirus bzw. eines Fragments der Polynukleotid- Sequenz, die (das) für den Retrovirus spezifisch ist, wobei eine Hybridisierungsreaktion oder Amplifikationsreaktion unter Verwendung eines Polynukleotids nach einem der An- sprüche 1 bis 8 durchgeführt wird.
30. Verfahren nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, dass die Polynukleotid-Sequenz in einem reversen Transkriptions-Schritt vor dem Hybridisierungs-Schritt bzw. der Amplifika- tions-Reaktion in cDNA transformiert wird.
31. Verfahren nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, dass der Analyseschritt aufweist: (a) das Vorsehen von Zellen, welchen der endogene Retrovirus fehlt, (b) das Zusetzen des Überstandes der Probe zu den Zellen, (c) das Züchten der Zellen, und (d) das Detektieren eines Polynukleotid-Moleküls nach einem der Ansprüche 1 bis 7 in der DNA der Zellen.
32. Verfahren nach Anspruch 31, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellen nicht-humane Zel- len sind.
33. Verfahren nach einem der Ansprüche 27 bis 32, dadurch gekennzeichnet, dass die Probe eine Hautgewebeprobe von einem Patienten ist.
34. Verfahren nach Anspruch 32, dadurch gekennzeichnet, dass die Probe Melanozyten auf- weist.
35. Verfahren zur Diagnostizierung von Krebs bei einem Patienten, umfassend die Schritte des (a) Vorsehens einer Probe vom zu testenden Patienten, (b) Analysierens, ob mindestens ein Antikörper nach Anspruch 24 oder ein Antikörper- Fragment nach Anspruch 25 in der Probe vorhanden ist oder nicht, wobei (c) das Vorhandensein des Antikörpers oder Fragments davon in der Probe Krebs diagno- stiziert.
36. Verfahren nach Anspruch 35, dadurch gekennzeichnet, dass die Probe eine Blutprobe des Patienten ist.
37. Verfahren nach Anspruch 35, dadurch gekennzeichnet, dass der Analyse-Schritt eine Antigen-Antikörper-Reation unter Verwendung eines Antigens, das vom Retrovirus nach einem der Ansprüche 16 bis 18 stammt, umfasst.
38. Set zur Durchführung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 27 bis 34, welches (a) ein erstes Reagens, das ein Polynukleotid-Molekül nach einem der Ansprüche 1 bis 8, einen Antikörper nach Anspruch 24 oder ein Antikörper-Fragment nach Anspruch 25 oder einen festen Träger nach Anspruch 26 aufweist, und (b) als positive Kontrolle ein zweites Reagens umfasst, das ein Polynukleotid mit einer Sequenz aufweist, die zur Sequenz des Polynukleotids im ersten Reagens komplementär ist, oder einen Retrovirus nach einem der Ansprüche 16 bis 18, ein env-Protein nach An- spruch 20, ein pol-Protein nach Anspruch 21, ein gag-Protein nach Anspruch 22, oder ein Peptid nach Anspruch 23 aufweist.
39. Set zur Durchführung eines Verfahrens nach Anspruch 37, welches (a) ein erstes Reagens, das ein Antigen aufweist, welches vom Retrovirus nach einem der Ansprüche 16 bis 18 stammt, und (b) als positive Kontrolle ein zweites Reagens umfasst, welches einen Antikörper nach <Desc/Clms Page number 29> Anspruch 24 oder ein Antikörper-Fragment nach Anspruch 25 aufweist, der (das) für das Antigen im ersten Reagens spezifisch ist.
40. Set nach Anspruch 39, dadurch gekennzeichnet, dass das Antigen mit einem detektier- baren Marker markiert ist.
41. Set nach Anspruch 39 oder 40, dadurch gekennzeichnet, dass das Antigen auf einem festen Trager immobilisiert ist.
42. PNA-Molekül, dadurch gekennzeichnet, dass es eine Basen-Sequenz aufweist, die zur Sequenz des Polynukleotid-Moleküls nach einem der Ansprüche 1 bis 7 komplementär ist.
43. Pharmazeutische Zusammensetzung, welche ein Polynukleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 9, einen Vektor nach Anspruch 11 oder 12, einen Antikörper nach Anspruch 24, ein Antikörper-Fragment nach Anspruch 25, bzw. ein PNA-Molekül nach Anspruch 42, und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger aufweist.
44. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 43, dadurch gekennzeichnet, dass sie weiters mindestens eine antivirale Substanz aufweist.
45. Sonnencreme, dadurch gekennzeichnet, dass sie ein Polynukleotid nach einem der An- sprüche 1 bis 9, einen Vektor nach Anspruch 12 oder 13, einen Antikörper nach Anspruch 24, ein Antikörper-Fragment nach Anspruch 25 bzw. ein PNA-Molekül nach Anspruch 42, und mindestens eine UV-Schutzsubstanz aufweist.
46. Sonnencreme nach Anspruch 45, dadurch gekennzeichnet, dass sie weiters mindestens eine antivirale Substanz aufweist.
47. Vakzin, dadurch gekennzeichnet, dass es als Antigen einen abgeschwächten Retrovirus nach einem der Ansprüche 16 bis 18, ein env-Protein nach Anspruch 20, ein pol-Protein nach Anspruch 21, ein gag-Protein nach Anspruch 22 bzw. ein Peptid nach Anspruch 23 und gegebenenfalls ein Adjuvans aufweist.

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