DE69836484T2

DE69836484T2 - Endogenes Retrovirales Genomnukliinelement, das mit einer Autoimmunkrankheit und/oder Schwengerschaftsstörungen verbunden ist, Verwendung als Marker

Info

Publication number: DE69836484T2
Application number: DE69836484T
Authority: DE
Inventors: Frederic Beseme; Jean-Luc Blond; Olivier Bouton; Bernard Mandrand; Francois Mallet; Herve Perron
Original assignee: Biomerieux SA
Current assignee: Biomerieux SA
Priority date: 1997-07-07
Filing date: 1998-07-06
Publication date: 2007-09-13
Anticipated expiration: 2018-07-07
Also published as: JP2002512530A; JP4249269B2; CA2298834C; DE69836484D1; CA2298834A1; WO1999002696A1; ATE346153T1; ES2276468T3; AU8447098A; EP1000158B1; EP1000158A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues endogenes retrovirales Genomnukleinelement, verschiedene Nukleotidfragmente, die es umfassen oder aus diesem Element gewonnen werden, sowie ihre Verwendung, um die multiple Sklerose zu markieren.
Das Klassieren der DNAc-Bank mit Hilfe der Ppol-MSRV-Sonde (SEQ ID NO: 29) ermöglichte es, überlappende Klone zu erfassen, die die Rekonstruktion einer putativen Genom-RNA von 7582 Nukleotiden ermöglichen. Unter rekonstruierter Sequenz ist die Sequenz zu verstehen, die von der Ausrichtung der überlappenden Klone abgeleitet wird. Diese Genom-RNA hat die Struktur R-U5-gag-pol-env-U3-R. Eine Abfrage „blastn" in mehreren Datenbasen mit Hilfe des rekonstruierten Genoms zeigt, dass eine große Menge an Genomsequenzen (DNA) vorhanden ist, die zum menschlichen Genom passen. Ungefähr 400 Sequenzen wurden in GenBank (siehe 1) identifiziert und mehr als 200 Sequenzen in der Bank EST (Expressed Sequence Tag), die meisten in Gegenrichtung. Diese Sequenzen werden auf mehreren Chromosomen gefunden, insbesondere den Chromosomen 5, 7, 14, 16, 21, 22, X, mit einer starken sichtbaren LTR-Konzentration am X-Chromosom.
Die rekonstruierte Sequenz (RNAm) ist zur Gänze im Inneren des Genomklons RG083M05 (gb AC00064) (9,6 kb) enthalten und hat eine Ähnlichkeit zu 96% mit zwei diskontinuierlichen Regionen dieses Klons, der auch wiederholte Regionen an jedem Ende enthält. Die Ausrichtung der experimentellen Sequenzen, die den Regionen 5' und 3' der rekonstruierten Genom-RNA entsprechen, mit der DNA des Klons RG083M05 ermöglichte es, eine LTR-Sequenz abzuleiten und charakteristische Elemente der Retroviren zu identifizieren, insbesondere jene, die an der inversen Transkription beteiligt sind, nämlich PBS (Primer Binding Site) stromabwärts zur LTR 5' und PPT (PolyPurine Tract) stromaufwärts zur LTR 3'. Es ist zu beobachten, dass das Element U3 äußerst kurz im Vergleich mit dem bei den Retroviren des Typs C der Säugetiere ist und hinsichtlich der Größe mit der Region U3 verglichen werden kann, die im Allgemeinen bei den Retroviren des Typs D und den Retroviren der Vögel beschrieben ist. Die Region PBS ist homolog mit dem PBS der Retroviren der Vögel, wobei die Verwendung der tRNA^Trp als Kern für die inverse Transkription angenommen wird. Folglich wird diese neue HERV-Familie HERV-W (Human Endogenous RetroVirus) genannt.
Die phylogene Analyse in der pol-Region hat gezeigt, dass die Familie HERV-W phylogen mit den Familien ERV-9 und RTVL-H verbunden ist und somit der Familie der endogenen Retroviren des Typs I angehört. Die phylogenetische Analyse des offenen Leserahmens (ORF) von env hat gezeigt, dass er näher den Simiens-Retroviren des Typs D und den Retroviren der Retikuloendotheliose der Vögel als den Säugetierretroviren des Typs C ist, wobei eine chimäre Genomstruktur C/D angenommen wird.
Die phylogenen Zweige, die von hohen Werten von „bootstrap" getragen werden, zeigen, dass die Familien ERV-9 und HERV-W von zwei unabhängigen Insertionswellen abgeleitet sind. So ist (sind) das (die) aktive(n) Element(e), die der Familie HERV-W zu Grunde liegen, von jenem (jenen) unterschiedlich, von dem (denen) sich die Familie ERV-9 ableitet. Ferner verwendet das PBS von HERV-W wahrscheinlich ein tRNA^Trp, während ERV-9 wahrscheinlich ein tRNA^Arg verwendet.
Schließlich sind die Mitglieder der Familie HERV-W in der Plazenta ausgedrückt, während die RNA ERV-9 in diesem Gewebe nicht erfasst werden.
BIOLOGISCHE FUNKTIONEN VON HERV-W
Die auf die Plazenta beschränkte Expression von HERV-W und der lange Leserahmen, der potentiell für eine retrovirale Hülle codiert, ermöglichen es, physiologische biologische Funktionen anzubieten, deren Verschlechterung mit Pathologien zusammenhängen könnte.
Die auf die Plazenta beschränkte Expression lässt annehmen, dass die Expression von retroviralen und/oder nicht retroviralen Genen unter der Abhängigkeit der LTR hormonabhängig sein kann. Diese Gene können aneinander grenzen oder unter der Abhängigkeit von isolierten LTR stehen. Eine Pathologie kann nun von einer falschen Expression nach der Reaktivierung einer stillen LTR durch diverse Faktoren stammen: Virusinfektion (zum Beispiel durch ein Mitglied der Familie der Herpesviren) oder lokale Immunaktivierung. Ein Polymorphismus im Bereich der LTR könnte diese Ereignisse ebenfalls begünstigen.
Die Hülle von HERV-W könnte eine fusogene Rolle spielen, insbesondere im Bereich der Zelluntertypen der Plazenta. Das Immunsupressor-Peptid dieser Hülle könnte den Fötus vor Angriffen des mütterlichen Immunsystems schützen. Schließlich könnte die Hülle von HERV-W durch einen Sättigungsmechanismus von Rezeptoren eine Schutzrolle vor den exogenen retroviralen Infektionen spielen. Die Verschlechterung der lokalen Zellimmunität kann von einem Immunstimulatorsignal, das von der Hülle getragen wird, ausgehen. Diese Wirkung kann mit einer Region, die eine Superantigenaktivität trägt, oder mit der Immunsuppressionsregion verbunden sein, die in der Folge immunstimulierend wird, entweder für eine Polymorphose oder einen Dosiseffekt (Überexpression).
Die Überprüfung dieser Vorgänge und das Verständnis der mit einer Verschlechterung der biologischen Funktionen der LTR oder der endogenen retroviralen Hülle verbundenen Folgen kann zur Erstellung von Diagnose- oder Untersuchungsmethoden führen für:

– pathologische Schwangerschaftszustände oder erfolglose Schwangerschaft,
– Autoimmunkrankheiten, wie multiple Sklerose oder rheumatische Polyarthritis.

Gemäß der vorliegenden Erfindung wurde im endogenen Zustand ein neues Nukleinelement entdeckt, wie nachstehend erklärt und beschrieben, das die Organisation eines Retrovirus aufweist und mit der multiplen Sklerose in Korrelation gesetzt werden kann.
Das erfindungsgemäße Nukleinelement in Form von RNAm, hat ungefähr 8 Kb, ist in 1 dargestellt und durch SEQ ID: 11 beschrieben und ist in 2 in Form einer Genom-DNA dargestellt.
Unter dem Ausdruck „retroviralen Typs" ist das Merkmal zu verstehen, nach dem das betreffende Nukleinelement eine oder mehrere Nukleotidsequenzen umfasst, die der Organisation eines Retrovirus und/oder seinen funktionellen oder codierenden Sequenzen ähnlich sind.
Dieses Referenznukleinelement ist ähnlich einem endogenen menschlichen Retrovirus, das mit dem Ausdruck HERV-W bezeichnet ist. Folglich kann es durch jede geeignete Abfragetechnik („screening") jeder Human-DNA-Bank oder Plazenta-DNAc-Bank, wie nachstehend dargestellt, insbesondere mit synthetisierten Nukleinkernen oder -sonden erhalten werden, um sich mit der Gesamtheit oder einem Teil von SEQ ID NO: 11 zu hybridisieren.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch jedes Nuklein- oder Peptidprodukt, das aus dem Referenznukleinelement nach SEQ ID NO: 11 erhalten oder abgeleitet wird.
Schließlich betrifft die Erfindung die verschiedenen Korrelationen, die zwischen dem vorgenannten Nukleinelement und/oder seinen Derivaten mit der multiplen Sklerose hergestellt werden können.
Die vorliegende Erfindung betrifft zuerst ein endogenes retrovirales Genomnukleinelement im isolierten oder gereinigten Zustand, das zumindest teilweise funktionell oder nicht funktionell ist.
Dieses Element ist dadurch gekennzeichnet, dass sein Genom eine Referenznukleotidsequenz umfasst, die in der Gruppe ausgewählt wird, die die Sequenzen SEQ ID NOs: 1 bis 15 und ihre komplementären Sequenzen umfasst.
Insbesondere umfasst dieses Element ein Nukleinfragment, das zwischen zwei Sequenzen eingesetzt ist, die der Region LTR bzw. dem Gen gag der retroviralen Genomstruktur entsprechen, insbesondere ein Nukleinfragment, das von der Sequenz SEQ ID NO: 12 gebildet ist oder diese umfasst.
Die Erfindung betrifft auch ein retrovirales Subgenomnukleinelement, das von einer Nukleotidsequenz identisch mit SEQ ID NO: 11 mit einer Deletion gebildet ist, wie durch die Klone cl.PH74 (SEQ ID NO: 7), cl.PH7 (SEQ ID NO: 8) und cl.Pi5T (SEQ ID NO: 9) dargestellt, wobei diese Deletion von einer Spleißstrategie stammt oder nicht.
Das vorher definierte Nukleinelement umfasst mindestens eine funktionelle Nukleotidsequenz, die für mindestens ein retrovirales Protein codiert, und/oder mindestens eine Regulierungs-Nukleotidsequenz.
Die Erfindung betrifft auch jede Nukleinsonde zur Erfassung eines erfindungsgemäßen Nukleinelements, das in eine Nukleinsäure eingesetzt ist oder nicht, dadurch gekennzeichnet, dass sie unter SEQ ID NO. 16–18 und 21–28 ausgewählt wird.
Eine solche Sonde umfasst einen Marker oder nicht.
Die Erfindung betrifft auch einen Nukleinkern für die Verstärkung eines erfindungsgemäßen Nukleinelements durch Polymerisation, dadurch gekennzeichnet, dass er unter SEQ ID NO: 16–18 und 21–28 ausgewählt wird.
Die Erfindung betrifft auch jedes Peptid, das durch jeden offenen Leserahmen codiert ist, der einem Nukleotidfragment, wie vorher definiert, angehört, insbesondere ein Polypeptid, beispielsweise Oligopeptid, das eine Antigendeterminante bildet, die von Sera von Patienten, die an multipler Sklerose leiden, erkannt wird.
Zum Beispiel ist dieses Polypeptid durch ein Nukleotidfragment codiert, das einen offenen Leserahmen umfasst, der für eine oder mehrere retrovirale Proteine ENV codiert.
Schließlich betrifft die Erfindung:

– die Verwendung eines Nukleinelements oder eines Nukleotidfragments oder eines oben definierten Peptids, wie vorher definiert, als Molekularmarker der multiplen Sklerose,
– die Verwendung eines Nukleinelements oder eines Nukleotidfragments, wie vorher definiert, als Chromosomenmarker einer Prädisposition für multiple Sklerose,
– die Verwendung eines Nukleinelements oder eines Nukleotidfragments, wie vorher definiert, als Marker für die Nähe eines Prädispositionsgens für multiple Sklerose.

Vor der detaillierten Beschreibung der Erfindung sind vorher verschiedene in der Beschreibung und den Ansprüchen verwendete Begriffe zu definieren:

– unter Humanvirus ist ein Virus zu verstehen, das einen Menschen infizieren oder vom Menschen aufgenommen werden kann,
– auf Grund aller Variationen und/oder natürlichen oder eingeleiteten Rekombinationen, die in der Praxis der vorliegenden Erfindung anzutreffen sind, wurden die Gegenstände dieser letztgenannten, die oben und in den Ansprüchen definiert sind, ausgedrückt, wobei die Äquivalente oder Derivate der verschiedenen nachstehend definierten biologischen Elemente, insbesondere die homologen Nukleotid- oder Peptidsequenzen, einbezogen wurden,
– die Variante eines Virus oder pathogenen und/oder infizierenden Wirkstoffes gemäß der Erfindung umfasst mindestens ein Antigen, das von mindestens einem Antikörper erkannt wird, der gegen mindestens ein Antigen gerichtet ist, das dem Virus und/oder dem pathogenen und/oder infizierenden Wirkstoff entspricht, und/oder ein Genom, das in seiner Gesamtheit von mindestens einer Hybridisierungssonde erfasst wird, und/oder mindestens einen Kern zur spezifischen Nukleotidverstärkung des Virus und/oder des pathogenen und/oder infizierenden Wirkstoffes, insbesondere ein Genom, das der Familie NERV-W angehört, unter den dem Fachmann gut bekannten bestimmten Hybridisierungsbedingungen,
– erfindungsgemäß ist ein Nukleotidfragment oder ein Oligonukleotid oder ein Polynukleotid eine Aneinanderkettung von Monomeren oder ein Biopolymer, gekennzeichnet durch die informationelle oder nicht informationelle Sequenz der natürlichen Nukleinsäuren, die sich an jedem anderen Nukleotidfragment unter vorbestimmten Bedingungen hybridisieren kann, wobei die Aneinanderkettung Monomere mit unterschiedlichen chemischen Strukturen enthalten kann und aus einem natürlichen Nukleinsäuremolekül und/oder durch genetische Rekombination und/oder durch chemische Synthese erhalten werden kann; ein Nukleotidfragment kann mit einem Genomfragment eines Elements der Familie HERV-W, das in der vorliegenden Erfindung enthalten ist, insbesondere einem Gen dieses letztgenannten, beispielsweise pol oder env im Falle des Elements, identisch sein;
– so kann ein Monomer ein natürliches Nukleotid der Nukleinsäure sein, dessen Bestandteile ein Zucker, eine Phosphatgruppe und eine Stickstoffbase sind; in der RNA ist der Zucker Ribose, in der DNA ist der Zucker Dexoy-2-ribose; je nachdem, ob es sich um die DNA oder RNA handelt, wird die Stickstoffbase unter Adenin, Guanin, Uracil, Zytosin, Thymin ausgewählt; oder das Nukleotid kann in mindestens einem der drei Bestandteile modifiziert werden; zum Beispiel kann die Modifizierung im Bereich der Basen erfolgen, wodurch modifizierte Basen, wie beispielsweise Inosin, Methyl-5-desoxyzytidin, Desoxyuridin, Diemthylamino-5-desoxyuridin, Diamino-2,6-purin, Brom-5-desoxyuridin und jede andere modifizierte Base, die die Hybridisierung begünstigt, erzeugt werden; im Bereich des Zuckers kann die Modifizierung im Ersatz von mindestens einer Desoxyribose durch ein Polyamid bestehen, und im Bereich der Phosphatgruppe kann die Modifizierung in ihrem Ersatz durch Ester bestehen, die insbesondere unter den Estern von Diphosphat, Alkyl und Arylphosphonat und Phosphorthioat ausgewählt werden,
– unter „funktionell" ist das Merkmal zu verstehen, nach dem eine Nukleotidsequenz, ein Nukleinelement oder ein Nukleotidfragment eine „informationelle Sequenz" umfasst,
– unter „informationeller Sequenz" ist jede geordnete Abfolge von Monomeren zu verstehen, deren chemische Natur und Reihenfolge in eine Referenzrichtung eine funktionelle Information von derselben Qualität wie jene der natürlichen Nukleinsäuren darstellen oder nicht, beispielsweise ein Leserahmen, der für ein Protein codiert, eine Regelsequenz, eine Spleißstelle, eine Rekombinationsstelle,
– unter Hybridisieren ist der Vorgang zu verstehen, bei dem sich unter geeigneten Durchführungsbedingungen, insbesondere Stringenzbedingungen, zwei Nukleotidfragmente, die ausreichend komplementäre Sequenzen haben, einander annähern, um eine komplexe Struktur, insbesondere doppelte oder dreifache Struktur, vorzugsweise in Form einer Spirale, zu bilden,
– eine Sonde umfasst ein Nukleotidfragment, das insbesondere auf chemischem Weg oder durch Polymerisation synthetisiert oder durch Enyzmverdauung oder Enzymabschneiden eines längeren Nukleotidfragments erhalten wurde, umfassend mindestens sechs Monomere, vorteilhafterweise 10 bis 100 Monomere, vorzugsweise 10 bis 30 Monomere, und eine Hybridisierungsspezifität unter bestimmten Bedingungen; vorzugsweise wird eine Sonde, die weniger als 10 Monomere umfasst, nicht alleine verwendet, sondern im Beisein von anderen Sonden von gleich kurzer Größe oder nicht; unter gewissen besonderen Bedingungen kann es nützlich sein, Sonden von größerer Größe als 100 Monomere zu verwenden; eine Sonde kann insbesondere zu Diagnosezwecken verwendet werden, und es handelt sich beispielsweise um Fühler- und/oder Erfassungssonden,
– die Fühlersonde kann auf einem festen Träger durch jedes geeignete Mittel festgestellt werden, d.h. direkt oder indirekt, beispielsweise durch Kovalenz oder passive Adsorption,
– die Erfassungssonde kann mit Hilfe eines Markers markiert werden, insbesondere ausgewählt unter den radioaktiven Isotopen, Enzymen, die insbesondere unter der Peroxydase und der alkalischen Phosphatase und jenen, die ein chromogenes, fluorgenes oder lumineszierendes Substrat hydrolysieren können, ausgewählt werden, chromophoren chemischen Verbindungen, chromogenen, fluorgenen oder lumineszierenden Verbindungen, Analoga von Nukleotidbasen und Biotin,
– die zu Diagnosezwecken verwendeten erfindungsgemäßen Sonden können in allen dem Fachmann bekannten Hybridisierungstechniken eingesetzt werden, insbesondere den so genannten Techniken „DOT-BLOT", „SOUTHERN BLOT", „NORTHERN BLOT", die eine zur Technik „SOUTHERN BLOT" identische Technik ist, allerdings RNA als Ziel verwendet, der SANDWICH-Technik; vorteilhafterweise wird die SANDWICH-Technik bei der vorliegenden Erfindung verwendet, umfassend eine spezifische Fühlersonde und/oder eine spezifische Erfassungssonde, wobei es sich versteht, dass die Fühlersonde und die Erfassungssonde eine zumindest teilweise unterschiedliche Nukleotidsequenz aufweisen müssen,
– jede erfindungsgemäße Sonde kann sich in vivo oder in vitro auf der RNA und/oder der DNA hybridisieren, um die Replikationsphänomene, insbesondere Übersetzung und/oder Transkription, zu blockieren, und/oder um die DNA und/oder RNA zu degradieren,
– ein Kern ist eine Sonde, umfassend mindestens sechs Monomere und vorteilhafterweise 10 bis 30 Monomere, die eine Hybridisierungsspezifität unter bestimmten Bedingungen für die Initiierung einer Enzympolymerisation besitzen, beispielsweise in einer Verstärkungstechnik, wie der PCR (Polymerase Chain Reaction), in einem Elongationsverfahren, wie beispielsweise der Sequenzierung, bei einer Methode der inversen Transkription oder dergleichen,
– zwei Nukleotid- oder Peptidsequenzen werden gleichwertig oder zueinander oder zu einer Referenzsequenz abgeleitet genannt, wenn funktionell die entsprechenden Biopolymere im Wesentlichen gegenüber der betreffenden Anwendung oder Verwendung oder in der Technik, in der sie eingesetzt werden, dieselbe Rolle spielen können, ohne identisch zu sein; insbesondere sind zwei Sequenzen gleichwertig, die auf Grund der natürlichen Variabilität innerhalb eines selben Individuums oder der natürlichen Diversität von einem Individuum zum anderen innerhalb einer selben Gattung erhalten werden, insbesondere spontane Mutation der Gattung, auf deren Basis sie identifiziert wurden, oder induzierte Mutation, sowie zwei homologe Sequenzen, wobei die Homologie nachstehend definiert ist,
– unter „Variabilität" ist jede spontane oder induzierte Modifizierung einer Sequenz zu verstehen, insbesondere durch Substitution und/oder Insertion und/oder Deletion von Nukleotiden und/oder Nukleotidfragmenten, und/oder Erweiterung und/oder Kürzung der Sequenz an mindestens einem der Enden; eine nicht natürliche Variabilität kann sich aus den verwendeten Verfahren der Gentechnik ergeben, beispielsweise aus der Wahl der Synthesekerne, die degeneriert sind oder nicht, und die verwendet werden, um eine Nukleinsäure zu verstärken; diese Variablität kann sich in Modifizierungen jeder Ausgangssequenz, die als Referenz betrachtet wird, zeigen, die durch einen Homologiegrad im Vergleich mit der Referenzsequenz ausgedrückt werden können,
– die Homologie kennzeichnet, den Identitätsgrad zweier verglichener Nukleotid- oder Peptidfragmente; sie wird durch den Prozentsatz der Identität gemessen, der insbesondere durch direkten Vergleich von Nukleotid- oder Peptidsequenzen mit Referenznukleotid- oder -peptidsequenzen bestimmt wird,
– dieser Identitätsprozentsatz wurde spezifisch für die Nukleotidfragmente bestimmt, insbesondere Klone, die in den Bereich der vorliegenden Erfindung fallen und von einem selben Individuum stammen; als nicht einschränkendes Beispiel ist der kleinste zwischen den verschiedenen Klonen eines selben Individuums (siehe SEQ ID NO: 13 und 14) beobachtete Identitätsprozentsatz mindestens 90%, und der kleinste zwischen den verschiedenen Klonen von zwei Individuen beobachtete Identitätsprozentsatz ist mindestens 80%;
– jedes Nukleotidfragment wird gleichwertig oder von einem Referenzfragment abgeleitet genannt, wenn es eine gleichwertige Nukleotidsequenz mit der Sequenz des Referenzfragments aufweist; nach der vorhergehenden Definition sind insbesondere gleichwertig mit einem Referenznukleotidfragment:
(a) jedes Fragment, das sich zumindest teilweise mit der Ergänzung des Referenzfragments hybridisieren kann,
(b) jedes Fragment, dessen Ausrichtung mit dem Referenzfragment dazu führt, identische aneinander grenzende Basen in einer größeren Anzahl als mit jedem anderen Fragment, das von einer anderen taxonomischen Gruppe stammt, aufzuzeigen,
(c) jedes Fragment, das sich aus der natürlichen Variabilität innerhalb eines selben Individuums und aus der natürlichen Diversität von einem Individuum zum anderen in derselben Gattung, aus denen es erhalten wurde, ergibt oder ergeben kann,
(d) jedes Fragment, das sich aus den Verfahren der Gentechnik, die am Referenzfragment angewandt werden, ergeben kann,
(e) jedes Fragment, umfassend mindestens acht aneinander grenzende Nukleotide, die für ein homologes oder mit dem durch das Referenzfragment codierten Peptid identisches Peptid codieren,
(f) jedes Fragment, das sich vom Referenzfragment durch Insertion, Deletion, Substitution mindestens eines Monomers, Erweiterung oder Kürzung an mindestens einem seiner Enden unterscheidet; beispielsweise jedes Fragment, das dem Referenzfragment entspricht, das an mindestens einem seiner Enden von einer Nukleotidsequenz flankiert ist, die nicht für ein Polypeptid codiert,
– unter teilweiser oder totaler Nukleotidsequenz eines Referenznukleinelements ist auch jede Sequenz zu verstehen, die durch Coverkapselung oder Coexpression oder Rekombination mit dem Referenznukleinelement verbunden ist,
– unter Polypeptid ist insbesondere jedes Peptid von mindestens zwei Aminosäuren zu verstehen, insbesondere Oligopeptid, Protein, extrahiert, separiert oder substantiell isoliert oder synthetisiert durch manuelle Intervention des Menschen, insbesondere jene, die durch chemische Synthese oder Expression in einem rekombinanten Organismus erhalten werden,
– unter teilweise durch ein Nukleotidfragment codiertes Polypeptid ist ein Polypeptid zu verstehen, das mindestens drei Aminosäuren aufweist, die durch mindestens neun aneinander grenzende Monomere, die in dem Nukleotidfragment enthalten sind, codiert sind,
– eine Aminosäure wird analog zu einer weiteren Aminosäure genannt, wenn ihre jeweiligen physikalisch-chemischen Eigenschaften, wie Polarität, Hydrophobizität und/oder Basizität und/oder Azidität und/oder Neutralität im Wesentlichen dieselben sind; so ist ein Leukin analog zu einem Isoleukin,
– jedes Polypeptid wird gleichwertig oder abgeleitet von einem Referenzpolypeptid genannt, wenn die verglichenen Polypeptide im Wesentlichen dieselben Eigenschaften haben, insbesondere dieselben Antigeneigenschaften, immunologischen, enzymologischen Eigenschaften und/oder Molekularerkennungseigenschaften; mit einem Referenzpolypeptid gleichwertig sind insbesondere:
(a) jedes Polypeptid, das eine Sequenz besitzt, bei der mindestens eine Aminosäure durch eine analoge Aminosäure substituiert wurde,
(b) jedes Polypeptid, das eine gleichwertige Peptidsequenz hat, die durch natürliche oder induzierte Variation des Referenzpolypeptids und/oder des für das Polypeptid codierenden Nukleotidfragments erhalten wurde,
(c) ein Mimotop des Referenzpolypeptids,
(d) jedes Polypeptid, in dessen Sequenz eine oder mehrere Aminosäuren der Serie L durch eine Aminosäure der Serie D ersetzt ist und umgekehrt,
(e) jedes Polypeptid, in dessen Sequenz eine Modifizierung der seitlichen Ketten der Aminosäuren eingeführt wurde, wie beispielsweise eine Azetylierung der Aminfunktionen, eine Carboxylierung der Thiolfunktionen, eine Veresterung der Carboxylfunktionen,
(f) jedes Polypeptid, in dessen Sequenz eine oder mehrere Peptidverbindungen modifiziert wurden, wie beispielsweise die Verbindungen carba, retro, inverso, retro-inverso, die reduzierten Verbindungen und die Methylen-oxy-Verbindungen,
(g) jedes Polypeptid, bei dem mindestens ein Antigen durch einen gegen ein Referenzpolypeptid gerichteten Antikörper erkannt wird,
– der Identitätsprozentsatz, der die Homologie zweier verglichener Peptidfragmente kennzeichnet, beträgt erfindungsgemäß mindestens 80% und vorzugsweise mindestens 90%.

Die Ausdrücke der Reihenfolge, die in der vorliegenden Beschreibung und den Ansprüchen verwendet werden, wie „erste Nukleotidsequenz" dienen nicht dazu, eine besondere Reihenfolge auszudrücken, sondern die Erfindung deutlicher zu definieren.
Unter Erfassung einer Substanz oder eines Wirkstoffes sind nachstehend sowohl eine Identifizierung, als auch eine Quantifizierung oder Abtrennung oder Isolierung der Substanz oder des Wirkstoffes zu verstehen.
Die Erfindung wird durch die Studie der nachfolgenden detaillierten Beschreibung besser verständlich, die sich auf die beiliegenden Figuren bezieht, wobei:
1 einerseits die Organisation des endogenen retroviralen Elements gemäß der vorliegenden Erfindung in Form einer putativen Genom-RNAm und andererseits die Lokalisierung der gemäß der vorliegenden Erfindung eingesetzten Klone in Bezug auf diese Organisation darstellt; die Längenstufen sind in Kb ausgedrückt; die flankierenden Regionen (5' UTR und 3' UTR) sind in schraffierten Feldern angegeben; die wiederholten Regionen in diesen beiden flankierenden Regionen sind durch schwarze Pfeile angezeigt; die den Genen gag, pol und env entsprechenden Regionen sind schwarz, weiß bzw. grau angegeben; die Positionierung der Sonde Ppol-MSRV ist angezeigt;
2 eine Möglichkeit der genetischen Organisation (DNA), die durch das Klon RG083M05 dargestellt wird, und eine Spleißstrategie, die die experimentellen Klone (RNAm) mit dieser Sequenz verbindet, zeigt; wobei diese Figur auch die Spleißstellen zeigt, die in Bezug auf die retrovirale Organisation beobachtet wurden; in dieser Figur sind ferner angegeben:
die Lokalisierung der verwendeten Sonden (Pgag-LB19, Ppro-E, Ppol-MSRV und Penv-C15);
die Geberstandorte (DS1 und DS2) und Annehmerstandorte (AS1 bis AS3) des Spleißens;
die Sequenzen, die von dem Klon RG083M05 kommen, in den Kästchen in Kleinbuchstaben, und die Sequenzen, die von den experimentellen Plazentaklonen abgeleitet wurden (RNAm), in den Kästchen in Großbuchstaben;
die putativen ORFs (ORF1, ORF2 und ORF3); und
ein Insert von 2 Kb, das in Form von DNA vorliegt, aber nicht in Form von RNA erfasst wird, und in Form einer vertikalen Schraffierung dargestellt ist.
Die anderen in dieser Figur verwendeten Konventionen sind dieselben wie in 1.
3 eine Darstellung von Genomklonen (DNA) ist, die den isolierten DNAc-Klonen entsprechen; in dieser Figur sind angegeben:
der Ähnlichkeitsprozentsatz gegenüber der rekonstruierten Genom-RNA (RNA Recons);
das Vorhandensein von wiederholten Sequenzen an jedem Ende dieser Genome (Wiederholungen); und
das Vorhandensein und die Größe der offenen Leserahmen (ORFs).
4 eine phylogene Analyse darstellt, die die Familie HERV-W identifiziert;
5 die Ausrichtung der flankierenden Regionen 5' und 3' des Klons RG083M05 mit den Endregionen 5' und/oder 3' gewisser Plazentaklone darstellt; das Tandem CAAC, das die LTR 3' und 5' flankiert, ist unter den DNA-Sequenzen doppelt unterstrichen, die Sequenz LTR Konsens von 783 Bp (Basenpaare) ist unten an der Ausrichtung angegeben; das stromaufwärtige PPT zum Ende 5' von LTR und das stromabwärtige PBS zum Ende 3' von LTR sind angegeben; die Regionen U3R und U5 sind angegeben; die Standorte, die der Fixierung des Transkriptionsfaktors entsprechen, sind unterstrichen und von 1 bis 6 nummeriert; die Region –73 bis 284 entspricht der bewerteten Sequenz „CAT assay"; * entspricht putativen „capping"-Standorten; [polyA] zeigt das Polyadenylationssignal an;
6 eine putative Sequenz eines Hüllenpolypeptids (ORF1) von NERV-W darstellt, das aus 3 unterschiedlichen DNAc-Plazentaklonen erhalten wurde; das Leaderpeptid (L), das Oberflächenprotein (SU) und das Transmembranprotein (TM) sind durch Pfeile angegeben; das hydrophobe Fusionspeptid und die Transmembrancarboxyregion sind mit einer einfachen Linie bzw. einer doppelten Linie unterstrichen; die Immunsuppressionsregion ist kursiv angezeigt; die potentiellen Glykosylierungsstandorte sind durch Punkte angezeigt; die divergierenden Aminosäuren sind auf der unteren Linie angezeigt; 6 stellt auch die offenen Leserahmen entsprechend ORF2 und ORF3 dar, wie in 2 beschrieben, und insbesondere ihre Homologien mit den retroviralen Regulierungsgenen.
Das vorher dargelegte Nukleinelement wurde nach dem nachstehend beschriebenen Versuchsprotokoll entdeckt und charakterisiert, wobei es sich versteht, dass dieses Protokoll die Reichweite der vorliegenden Erfindung und der beiliegenden Ansprüche nicht einschränken kann.
Beispiel 1
Isolierung und Sequenzierung von überlappenden DNAc-Fragmenten
Die Informationen hinsichtlich der Organisation von HERV-W wurden durch Testen einer DNAc-Plazentabank (Clontech cat#HL5014a) mit den Sonden Ppol-MSRV (SEQ ID NO: 29) und Penv-C15 (SEQ ID NO: 31) (siehe Beispiel 8) erhalten, wobei anschließend eine Technik des „gene walking" mit Hilfe der neuen erhaltenen Sequenzen eingesetzt wurde. Die Experimente wurden eingesetzt unter Bezugnahme auf die Empfehlungen des Bereitstellers der Bank. Verstärkungen PCR auf DNA wurden ebenfalls eingesetzt, um diese Organisation zu verstehen.
Eine gewisse Anzahl von Klonen wurde ausgewählt und sequenziert, siehe 1:

– Klon cl.6A2 (SEQ ID NO: 1): Region 5', nicht übersetzt, von HERV-W und ein Teil von gag
– Klon cl.6A1 (SEQ ID NO: 2): gag und ein Teil von pol
– Klon cl.7A16 (SEQ ID NO: 3): Region 3' von pol
– Klon cl.Pi22 (SEQ ID NO: 4): Region 3' von pol und Anfang von env
– Klon cl.24.4 (SEQ ID NO: 5): RNA gespleißt, umfassend einen Teil der nicht übersetzten Region 5' von HERV-W, das Ende von pol und die Region 5' von env
– Klon cl.C4C5. (SEQ ID NO: 6): Ende von env und nicht übersetzte Region 3' von HERV-W
– Klon cl.PH74 (SEQ ID NO: 7): Subgenom-RNA: nicht übersetzte Region 5' von HERV-W, Ende von pol, env, und nicht übersetzte Region 3' von HERV-W
– Klon cl.PH7 (SEQ ID NO: 8): mehrfach gespleißte RNA: nicht übersetzte Region 5' von HERV-W, Ende von env und nicht übersetzte Region 3' von HERV-W
– Klon cl.Pi5T (SEQ ID NO: 9): teilweises Gen pol und Region U3-R
– Klon cl.44.4 (SEQ ID NO: 10): Region R-U5, Gen gag und teilweises Gen pol.

Mit Hilfe dieser Klone wurde ein Modell einer Totalsequenz von HERV-W ausgearbeitet, wobei Sequenzausrichtungen vorgenommen wurden. Die gespleißten RNA wurden aufgedeckt, sowie die potentiellen Geber- und Annehmerstandorte des Spleißens. Die Gesamtheit dieser Informationen ist in 2 dargestellt. Durch Ähnlichkeitsstudie mit bestehenden Retroviren wurden die Einheiten LTR, gag, pol und env definiert.
Die putative genetische Organisation von HERV-W in Form von RNA ist folgende (SEQ ID NO: 11):
Gen 1..7582 Lokalisierung der Klone auf der rekonstruierten Genom-RNA-Sequenz
Beispiel 2:
Identifikation von Genomklonen (DNA), die den isolierten DNA-Klonen entsprechen
Eine Abfrage „blastn" in mehreren Datenbasen mit Hilfe des rekonstruierten Genoms zeigt, dass eine große Menge an verwandten Genomsequenzen vorhanden ist, die zum menschlichen Genom passen. Ungefähr 400 Sequenzen wurden in GenBank identifiziert und mehr als 200 Sequenzen in der Bank EST, die meisten in Gegenrichtung. Die 4 hinsichtlich Größe und Ähnlichkeit signifikantesten Sequenzen, die in 3 dargestellt sind, sind die folgenden Genomklone (DNA):
der menschliche Klon RG083M05 (gb AC000064), dessen Chromosomenlokalisierung 7q21–7q22 ist,
der menschliche Klon BAC378 (gb U85196, gb AE000660) entsprechend dem locus alpha delta des Rezeptors der Zellen T, lokalisiert bei 14q11–12,
der menschliche Kosmid Q11M15 (gb AF045450) entsprechend der Region 21q22.3 des Chromosoms 21,
der Kosmid U134E6 (embl Z83850) auf dem Chromosom Xq22.
Die Lokalisierung der ausgerichteten Regionen für jeden der Klone ist angegeben, und die Zugehörigkeit zu einem Chromosom ist in Klammern angeführt. Der Ähnlichkeitsprozentsatz (ohne die weitläufigen Deletionen) zwischen den 4 Sequenzen und der rekonstruierten Genom-RNA ist angeführt, sowie das Vorhandensein von wiederholten Sequenzen an jedem Ende des Genoms und die Größe der größten Leserahmen (ORF). Wiederholte Sequenzen sind an den Enden von 3 dieser Klone zu finden. Die rekonstruierte Sequenz ist zur Gänze im Inneren des Klons RG083M05 (9,6 kb) enthalten und hat eine Ähnlichkeit von 96%. Allerdings weist der Klon RG083M05 eine Insertion von 2 Kb auf, die sich unmittelbar stromabwärts zur nicht übersetzten Region 5' (5' UTR) befindet. Diese Insertion ist auch in zwei weiteren Genomklonen zu finden, die eine Deletion von 2,3 Kb unmittelbar stromaufwärts zur nicht übersetzten Region 3' (3' UTR) aufweisen. Kein Klon enthält die drei funktionellen Leserahmen (ORFs) gag, pol und env. Der Klon RG083M05 zeigt einen ORF von 538 Aminosäuren (AA) entsprechend einer ganzen Hülle. Der Kosmid Q11M15 enthält zwei große ORF angrenzend an 413 AA (Rahmen 0) und 305 AA (Rahmen +1) entsprechend einem gekürzten Polyprotein pol.
Beispiel 3
Phylogene Analyse
Eine phylogene Analyse wurde im Bereich der Nukleinsäuren an 11 unterschiedlichen Unterregionen der rekonstruierten Genom-DNA und im Proteinbereich an 2 unterschiedlichen Unterregionen von env durchgeführt. Alle erhaltenen Zweige weisen dieselbe Topologie auf, unabhängig von der untersuchten Region. Dies ist in 4 im Bereich der Nukleinsäuren in den am meisten bewahrten Regionen LTR und pol zwischen den erhaltenen Sequenzen und ERV-9 und RTLV-H dargestellt. Die Zweige zeigen deutlich, dass die experimentellen Sequenzen eine neue unterschiedliche Familie zu ERV-9 und ganz unterschiedlich zu RTLV-H beschreiben, wie durch die Analyse „bootstrap" unterstrichen wird. Diese Sequenzen sind auf mehreren Chromosomen zu finden, insbesondere den Chromosomen 5, 7, 14, 16, 21, 22 und X mit einer starken sichtbaren Konzentration von LTR auf dem X-Chromosom.
Der Vergleich im Proteinbereich zwischen den am meisten bewahrten Regionen der retroviralen Proteine env zeigt, dass die Familie HERV-W den Simiens-Retroviren des Typs D und den Retroviren der Retikuloendotheliose der Vögel näher ist als den Retroviren der Säugetiere des Typs C.
Dies lässt eine chimäre Genomstruktur C/D annehmen.
Beispiel 4
Identifikation der Elemente LTR, PPT und PBS
Die rekonstruierte Sequenz (RNA) ist zur Gänze im Inneren des Genomklons RG083M05 (9,6 Kb) enthalten und weist eine Ähnlichkeit von 96% mit zwei diskontinuierlichen Regionen dieses Klons auf, der ebenfalls an jedem Ende wiederholte Regionen aufweist. Die Ausrichtung der experimentellen Sequenzen entsprechend den Regionen 5' und 3' der rekonstruierten Genom-RNA mit der DNA des Klons RG083M05 [5'(5-RG-28000–28872) und 3'(3-RG-37500–38314)] ermöglichte es, eine LTR-Sequenz abzuleiten und charakteristische Elemente der Retroviren zu identifizieren, insbesondere jene, die an der inversen Transkription beteiligt sind, nämlich PBS stromabwärts zu LTR 5' und PPT stromaufwärts zu LTR 3' (siehe 5). Es ist festzustellen, dass das Element U3 äußerst kurz ist im Vergleich mit dem bei den Retroviren des Typs C der Säugetiere beobachteten und hinsichtlich der Größe mit der Region U3 vergleichbar ist, die im Allgemeinen bei den Retroviren des Typs D und den Retroviren der Vögel beschrieben ist. Die Region, die den Basen 2364 bis 2720 des Klons cl.PH74 (SEQ ID NO: 7) entspricht, wurde durch PCR verstärkt und in dem Vektor pCAT3 (Promega) untergeklont, um die Bewertung der Promotoraktivität durchzuführen. Eine signifikante Aktivität wurde in Zellen HeLa durch die so genannte Methode „CAT assay" gefunden, die die Funktionalität der Promotorsequenz des LTR zeigt.
Die Region PBS ist homolog mit dem PBS der Retroviren der Vögel.
Beispiel 5
Genetische Organisation und Regulierung der Expression
Organisation in DNA-Form
Verstärkungen PCR wurden an ganzen Klonen HERV-W durchgeführt, die der Humangenombank entnommen wurden (siehe Beispiel 1 für die Art der Entnahme), wobei die folgenden Paare von Oligonukleotiden verwendet wurden:
U5 4992 (SEQ ID NO: 16), GAG 4619 (SEQ ID NO: 17)
GAG 4782 (SEQ ID NO: 18), POL 3167 (SEQ ID NO: 19)
POL 3390 (SEQ ID NO: 20), POL 5144 (SEQ ID NO: 21)
POL 5145 (SEQ UD NO: 22), U5 4991 (SEQ UD NO: 23).
Die PCR sind unter folgenden Bedingungen verwirklicht:
Oligonukleotide mit der Konzentration von 0,33 Mikromol
Puffer TAQ Polymerase Boerhinger 1X
0,5 Einheiten von TAQ Polymerase Boehringer
Mischen von dNTP mit 0,25 mM jeweils
0,5 mg Human-DNA
Endvolumen 100 ml
Bedingungen von PCR (95°C, 5 min) × 1, (95°C, 30 sec + 54°C, 30 sec + 72°C 3 min) × 35.
Die Produkte von PCR wurden dann auf Agarosegel 1% aufgebracht, um nach der Migration analysiert zu werden. Die Gesamtheit der PCR ergibt Verstärkungsfragmente von erwarteter Größe, mit Ausnahme von PCR LTR-4991--gag-4619, das ein Fragment von größerer Größe von ungefähr 2 Kb im Vergleich mit der erwarteten Größe (abgeleitet von den cDNA der Plazentabank) ergibt. Die Rekonstitution von HERV-W in Form von endogener DNA stellt somit eine Einheit von ungefähr 10 Kb dar.
Nach dem Klonen, Sequenzieren und nach der Analyse des PCR-4992 gag-4619 ist das Vorhandensein einer Insertionsregion zwischen LTR und gag von SEQ ID NO: 12 (Klon cl.6A5) festzustellen. Diese Region entspricht nicht einer herkömmlichen nicht übersetzten Region eines Retrovirus: weder eine Region Ψ noch PBS.
Die Produkte von PCR pol-3390, pol-5144 wurden ebenfalls geklont, und zwei der erhaltenen Klone wurden sequenziert. Das Resultat dieser Sequenzen ist durch die Klone 7A20 (SEQ ID NO: 13) und cl.7A21 (SEQ ID NO: 14) angegeben. Der Vergleich dieser beiden Nukleotidsequenzen ergibt ein Ergebnis von 90% Homologie für die betreffende Region, die somit die Variabilität von HERV-W bei einem selben Individuum zeigt.
HERV-W in DNA-Form ist in 2 dargestellt.
Allgemeine Organisation: Transkriptionsverfahren
Wenn die verschiedenen DNAc-Klone erhalten sind, wird von den erworbenen Resultaten bei PCR auf DNA abgleitet:

– eine DNA-Organisation von 10 Kb, die eine Insertionssequenz von 2 Kb zwischen LTR und gag besitzt. Das Resultat von PCR auf DNA zeigt das Vorhandensein eines Inserts von 2 Kb zwischen den Regionen LTR und gag und lässt annehmen, dass die isolierten DNAc in der Plazenta von der Expression eines Genoms des Typs RG083M05 stammen.
– eine RNA-Organisation von 8 Kb, die sich aus einer Transkription von 10 Kb, gefolgt von einem Spleißen zwischen LTR und gag ergibt, wodurch es möglich ist, eine Kontinuität RF (flankierende Region) 5' gag wiederherzustellen und somit eine RNA von 8 Kb zu ergeben, wie bei Northern Blot aufgezeigt.

Die Sonden gag (Pgag-LB19, SEQ ID NO: 30) und Protease (Ppro-E, SEQ ID NO: 32) zeigen eine RNA mit einer Größe nahe 8 Kb, die Sonde Penv-C15 (SEQ ID NO: 31) zeigt ferner eine RNA nahe 3,1 Kb. Zwei in der nicht übersetzten Region 5' definierte Sonden, die durch Abfragen der oben erwähnten cDNA-Bank erhalten werden (Sonde P5'-gag-cl.6A2 abgeleitet vom Klon cl.6A2 und Sonde P5'-env-cl.24.4 abgeleitet vom Klon cl.24.4) zeigen die beiden vorhergehenden RNA und eine RNAs von ungefähr 1,3 Kb. Diese Verteilung der RNAs ist typisch für komplexe Transkripte von Retroviren: eine Genom-RNA, die für gag-pro-pol codiert, eine Subgenom-RNA, die für die Hülle codiert, und eine/mehrere mehrfach gespleißte RNA/s, die potentiell für Regulierungsgene codieren.
Die Halbwertszeit einer solchen RNA (LTR-R-U5-Insertion-GAG-POL-ENV-U3-R-HERV-W) ist wahrscheinlich sehr kurz, da keine RNA von 10 Kb in Northern Blot entdeckt wird. Durch Analyse und Vergleich von Sequenzen wurden die potentiellen Geber- (DS1 und DS2) und Annehmerstandorte (AS1 bis AS3) des Spleißens in 2 definiert und beschrieben.
Beispiel 6
Transkription in gesunden Geweben
Verschiedene gesunde menschliche Gewebe wurden durch eine Technik Northern Blot (Human Multiple Tissue Northern Blot, Clontech cat# 7760-1) mit Hilfe der Sonden Ppol-MSRV (SEQ ID NO: 29), Pgag-LB19 (SEQ ID NO: 30), Penv-C15 (SEQ ID NO: 31), Ppro-E (SEQ ID NO: 32), P5'-gag-cl.6A2 und P5'-env-cl.24.4 getestet und, wie in Beispiel 1 beschrieben, markiert. Die Experimente wurden nach den Empfehlungen der Hersteller durchgeführt, und die Autoradiografien wurden 5 Tage lang exponiert. Die Analyse der Resultate zeigt Transkriptionsprodukte nur in der Plazenta und in keinem der anderen getesteten menschlichen Gewebe (Herz, Gehirn, Lunge, Leber, Skelettmuskulatur, Niere und Bauchspeicheldrüse).
Durch eine Technik Dot Blot RNA (Clontech: Human RNA Master Blot cat# 7770-1) und unter Verwendung des vom Hersteller empfohlenen Testprotokolls wurden ungefähr vierzig weitere Gewebe, unter anderem Fötusgewebe, getestet: nur die Plazenta gibt eine spezifische Antwort nach Hybridisierung mit den Sonden Pgag-LB19 (SEQ ID NO: 30) und Penv-C15 (SEQ ID NO: 31).
Es ist festzustellen, dass ein Signal in der Niere mit Dot-Blot RNA zu beobachten ist, was durch die Analyse in Northern Blot entkräftet wird.
Beispiel 7
Identifikation einer RNAm, die für eine Hülle codiert, und Mittel, um sie spezifisch zu erfassen
Das Abfragen einer cDNA-Plazentabank mit Hilfe einer in der nicht übersetzten Region 5' definierten Sonde ermöglichte es, eine durch eine nicht übersetzte Region 5' definierte DNAc (5'NTR), eine Spleißverbindung, eine codierende Sequenz, eine nicht übersetzte Region 3' (3' NTR) und ein Polyadenylende, cl.PH74 (SEQ ID NO: 7) zu definieren. Dieser Klon entspricht einer gespleißten RNA, die für eine Hülle codiert. Durch Vergleich von Sequenzen zwischen dieser cDNA und dem Modell von endogenem NERV-W, das in 2 dargestellt ist, wird eine Spleißverbindung auf der RNAm identifiziert, wobei diese Spleißverbindung eine Kontinuität der Region 5' NTR und des Gens env herstellt, was zur Erstellung einer gespleißten Subgenom-RNA führt, die für das Hüllengen codiert. Diese Informationen ermöglichten es, ein spezifisches Oligonukleotid dieser RNAm zu definieren, wobei eine Lokalisierung gewählt wird, die sich auf dem Spleißstandort befindet (Oligo 5307, nach SEQ ID NO: 24).
Das Aufzeigen dieser Verbindungsregion ermöglicht es, ein Diskriminationsverfahren zwischen RNA und endogener retroviraler DNA zu erstellen, wobei in einem PCR ein auf dieser Verbindungsregion definiertes Oligonukleotid verwendet wird, insbesondere ein Oligonukleotid, das in dem Gen env ausgewählt wird (Oligo 4986, nach SEQ ID NO: 25).
Die PCR sind unter folgenden Bedingungen hergestellt:
Oligonukleotide mit der Konzentration von 0,33 Mikromol
Puffer TAQ Polymerase Boerhinger 1x
0,5 Einheiten von TAQ Polymerase Boerhinger
Mischen von dNTP zu 0,25 mM jeweils
0,5 mg Human-DNA
Endvolumen 100 ml
Bei 10 verschiedenen getesteten DNA ermöglichte es dieser PCR-Typ nicht, Verstärkungsprodukte zu erhalten. Bei der DNAc, die von der Plazenta-RNA oder von NERV-W ausdrückenden Zellen kommt, ergibt dieses PCR hingegen ein Verstärkungsprodukt. Dieses Resultat bestätigt somit die RNA-spezifische Art dieses Subgenom-Fragments.
Beispiel 8
Identifikation von codierenden Sequenzen, die in einer spezifischen RNAm enthalten sind
Die in Beispiel 5 beschriebene Spleißstrategie ist mit dem Vorhandensein von drei Leserahmen ORF1 (SEQ ID NO: 33), ORF2 (SEQ ID NO: 34) und ORF3 (SEQ ID NO: 35) (siehe 6) vereinbar.
Das Abfragen einer DNAc-Plazentabank ermöglichte es, eine DNAc (SEQ ID NO: 7, cl.PH74) zu isolieren, die durch eine nicht übersetzte Region 5' (5' NTR), eine Spleißverbindung, eine codierende Sequenz, eine nicht übersetzte Region 3' (3' NTR) und ein Polyadenylende definiert ist. Die codierende Sequenz hat 538 Aminosäuren (SEQ ID NO: 33). Die in den Datenbanken durchgeführten Analysen ermöglichen es, Merkmale einer kompletten retroviralen Hülle aufzuzeigen: Anfang der Übersetzung eines Hüllenpolyproteins, eines stark hydrophoben Leader-Peptids mit ungefähr 21 Aminosäuren, eines Oberflächenproteins SU, eines Transmembranproteins TM. Diese beiden Proteineinheiten weisen unterschiedliche potentielle Glykosylierungsstandorte auf. Innerhalb des Proteins TM wird eine Immunsuppressionsregion identifiziert.
22 Bp und 95 Bp stromaufwärts zum Spleißannahmerstandort wurden zwei Initiierungscodons gefunden, die die Synthese von 52 AA (ORF2, SEQ ID NO: 34) und von 48 AA (ORF3, SEQ ID NO: 35) lenken können. OFR2 besteht in einem Teil des carboxyendes von env und ORF3 entspricht einer unterschiedlichen aber überlappenden Übersetzung.
Es wurde keine signifikante Homologie durch Abfrage „blast" gefunden. Während einer Abfrage LFASTA in einer Subdatenbank, die auf die Retroviridae beschränkt ist, haben ORF2 und ORF3 einen Identitätsprozentsatz von 35 mit Rex des T-lymphotropen Virus des Menschen und Primaten und mit Tat des Simien-Virus des Immundefizits gezeigt.
Beispiel 9
Komplexität der Familie HERV-W
Die Anzahl von Kopien, die in dem menschlichen Genom von jeder der Sequenzen vorhanden ist, wird durch eine Technik Dot Blot mit Hilfe der Sonden Pgag-LB19 (SEQ ID NO: 30), Ppro-E (SEQ ID NO: 32) und Penv-C15 (SEQ ID NO: 31) bewertet.
Jede der Sonden ist denaturiert und auf eine Membran Hybond N+ zu 2,5, 5, 10, 25, 50, 100 pg pro Schicht aufgebracht. 0,5 mg menschlicher DNA sind ebenfalls auf dieselbe Membran aufgebracht. Die Membranen werden 2 Stunden lang im Vakuum bei 80°C getrocknet. Die Membranen werden dann mit der aufgebrachten Sonde hybridisiert. Die Techniken der Markierung der Sonden, der Hybridisierung und des Waschens der Membranen sind dieselben wie bei Southern Blot. Nach der Autoradiografie der Membranen sind Signalintensitätsniveaus proportional zu den Schichten auf der Membran festzustellen. Nach Abschneiden der Hybrdisierungszonen erfolgt ein Zählen in Szintillation. Durch Vergleich zwischen dem Verdünnungsbereich der auf die Membran aufgebrachten Sonde und dem mit der menschlichen DNA erhaltenen Resultat kann die Kopiezahl pro Haploidgenom jeder der mit den Sonden abgedeckten Regionen bewertet werden:

– die Anzahl von endogenem gag beträgt 56 bis 112 Kopien (76)
– die Anzahl von endogener Protease beträgt 166 bis 334 Kopien (260)
– die Anzahl von endogenem env ist geringer als 52 Kopien (13).

Das Abfragen von 10⁶ Klonen einer menschlichen DNA-Plazentabank (Clontech cat#H15014b) ermöglichte es, 144 von der Sonde Pgag-LB19 erkannte Klone aufzuzählen und 64 von der Sonde Penv-C15 erkannte Klone. 13 Klone, die gemeinsam von den Sonden Penv-C15 und Pgag-LB19 hybridisiert wurden, wurden isoliert und bestätigen das Vorhandensein von mehreren Kopien eines Genoms, das sowohl gag als auch env besitzt, ohne Berücksichtigung der Funktionalität.
Das Nukleinelement, die Nukleotidsequenzen und die Peptide oder Proteine, die eventuell durch die Elemente und Sequenzen ausgedrückt werden, können verwendet werden, um die multiple Sklerose zu entdecken, vorherzusehen, zu behandeln und zu verfolgen.
Die objektiven und experimentellen Daten ermöglichen es nämlich, Retroviren und die multiple Sklerose zu verbinden.

(1) Gemeinsame Mechanismen werden in den retroviralen Pathologien und den Autoimmunerkrankungen eingesetzt (Vorhandensein von Autoantikörpern, von Immunkomplexen, Zellinfiltration gewisser Gewebe, neurologische Störungen).
(2) Pathologische Störungen, vergleichbar mit manchen Autoimmunerkrankungen treten bei Infektionen mit den Retroviren HIV und HTLV auf (Sjögren-Syndrom, verstreuter Lupus erythematodes, rheumatoide Arthritis ...).
(3) Eine Aktivität der inversen Transkriptase wurde erfasst, und Partikel retroviralen Typs wurden in der aufschwimmenden Schicht von Zellkulturen von Patienten, die an multipler Sklerose (Perron et coll, Res. Virol. 1989; 140: 551–561/Lancet 1991; 337: 862–863/Res. Virol. 1992; 143: 337–350) oder an rheumatoider Polyarthritis leiden, beobachtet.
(4) Entzündliche chronische oder Autoimmunerkrankungen bei Tieren sind mit den endogenen Retroviren verbunden; manche von ihnen werden als Tiermodelle für Krankheiten des Menschen verwendet (Insulinabhängiger Diabetes, verstreuter Lupus eryhtematodes).
(5) Signifikante Mengen an endogenen Retrovirus-Antikörpern wurden im Rahmen der systemischen oder entzündlichen Autoimmunerkrankungen beschrieben; weitere Daten in dieser Richtung wurden von mehreren Autoren bei der IV. Europakonferenz zu den endogenen Retroviren (Uppsala, Oktober 1996) übermittelt. Nach Venables (übermittelt von der IV. Europakonferenz zu den endogenen Retroviren, Uppsala, Oktober 1996) ist eine signifikant erhöhte HERV-H'-Antikörpermenge während der Schwangerschaft, aber auch im Rahmen von diversen Autoimmunerkrankungen festzustellen, wie beispielsweise das Sjögren-Syndrom, verstreuter Lupus erythematodes oder rheumatoide Polyarthritis, ohne dass allerdings derzeit ein Beweis für eine direkte Beteiligung erbracht werden kann.

Die Beteiligung der Retroviren am Autoimmunphänomen bleibt mit dem multifaktoriellen Charakter der systemischen oder entzündlichen Autoimmunerkrankungen vereinbar, die genetische, hormonelle, umweltbedingte und infektiöse Faktoren aufweisen.
Die in der aufschwimmenden Schicht von Zellkulturen von an multipler Sklerose erkrankten Patienten beobachteten Partikel (Perron et coll, Res. Virol. 1989,; 140: 551–561/Lancet 1991; 337: 862–863/Res. Virol. 1992; 143: 337–350) oder von an rheumatoider Polyarthritis erkrankten Patienten (Daten nicht veröffentlicht) können aus der Expression: (i) eines für die Replikation kompetenten endogenen Retrovirus, (ii) von mehreren defektiven endogenen Retroviren, die durch ein Phänomen der Transkomplementation zusammenwirken oder (iii) eines exogenen Retrovirus stammen.
Alle diese Beobachtungen ermöglichen es, die vorher beschriebenen biologischen Elemente als Marker für die multiple Sklerose zu verwenden und zu betrachten.
Insbesondere werden die folgenden Markierungstechniken berücksichtigt:

– Abtasten des Humangenoms mit Hybridisierungssonden mit starker Stringenz, die von dem vorher beschriebenen Nukleinelement abgeleitet sind,
– Direkte Verstärkung von Genom-DNA durch PCR unter Verwendung der spezifischen Kerne für die betreffende Region
– Analyse der flankierenden Regionen von fremden Zellgenen.

Claims

Endogenes retrovirales Genomnukleinelement HERV-W im isolierten oder gereinigten Zustand, umfassend eine Nukleotidsequenz, die unter SEQ ID NOs: 1 bis 15 und ihren komplementären Sequenzen ausgewählt wird.
Nukleinsonde zur Erfassung eines Nukleinelements nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass sie unter SEQ ID NO: 16–18 und 21–28 ausgewählt wird.
Sonde nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass sie einen Marker umfasst.
Nukleinkern für die Verstärkung eines Nukleinelements durch Polymerisation nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass sie unter SEQ ID NO: 16–18 und 21–28 ausgewählt wird.
Peptid, das durch jeden offenen Leserahmen der Sequenz SEQ ID NO: 11, die für eine oder mehrere retrovirale Proteine ENV codiert, codiert ist.
Peptid nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass es eine Antigendeterminante bildet, die von Sera von Patienten, die an multipler Sklerose leiden, erkannt wird.
Verwendung eines Nukleinelements nach Anspruch 1 oder eines Peptids nach Anspruch 5 oder 6 als Molekularmarker der multiplen Sklerose unter Ausschluss jeder Diagnosemethode, die am menschlichen oder tierischen Körper angewandt wird.
Verwendung eines Nukleinelements nach Anspruch 1 als Chromosomenmarker einer Prädisposition für multiple Sklerose unter Ausschluss jeder Diagnose methode, die am menschlichen oder tierischen Körper angewandt wird.
Verwendung eines Nukleinelements nach Anspruch 1 als Marker für die Nähe eines Prädispositionsgens für multiple Sklerose unter Ausschluss jeder Diagnosemethode, die am menschlichen oder tierischen Körper angewandt wird.