NL9002008A - Recombinant dna en rna en daarvan afgeleide produkten. - Google Patents

Recombinant dna en rna en daarvan afgeleide produkten. Download PDF

Info

Publication number
NL9002008A
NL9002008A NL9002008A NL9002008A NL9002008A NL 9002008 A NL9002008 A NL 9002008A NL 9002008 A NL9002008 A NL 9002008A NL 9002008 A NL9002008 A NL 9002008A NL 9002008 A NL9002008 A NL 9002008A
Authority
NL
Netherlands
Prior art keywords
cav
protein
dna
genetic information
nucleotide sequence
Prior art date
Application number
NL9002008A
Other languages
English (en)
Original Assignee
Stichting Centr Diergeneeskund
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Stichting Centr Diergeneeskund filed Critical Stichting Centr Diergeneeskund
Priority to NL9002008A priority Critical patent/NL9002008A/nl
Priority to ZA917065A priority patent/ZA917065B/xx
Priority to IL99435A priority patent/IL99435A/en
Priority to US08/030,335 priority patent/US5491073A/en
Priority to EP98202968A priority patent/EP0905246A1/en
Priority to DK91917088T priority patent/DK0548234T3/da
Priority to ES91917088T priority patent/ES2144399T3/es
Priority to SI9111508A priority patent/SI9111508B/sl
Priority to CA002091181A priority patent/CA2091181C/en
Priority to AU86580/91A priority patent/AU651999B2/en
Priority to JP3517451A priority patent/JP2846116B2/ja
Priority to UA93004515A priority patent/UA48936C2/uk
Priority to RU93005170A priority patent/RU2146292C1/ru
Priority to PCT/NL1991/000165 priority patent/WO1992004446A1/en
Priority to HU9300716A priority patent/HU220102B/hu
Priority to DE69131903T priority patent/DE69131903T2/de
Priority to EP91917088A priority patent/EP0548234B1/en
Priority to YU150891A priority patent/YU49095B/sh
Priority to AT91917088T priority patent/ATE188739T1/de
Priority to MX9101042A priority patent/MX9101042A/es
Publication of NL9002008A publication Critical patent/NL9002008A/nl
Priority to US08/454,121 priority patent/US6071520A/en
Priority to HR940668A priority patent/HRP940668B1/xx
Priority to US08/482,161 priority patent/US6162461A/en
Priority to US08/480,020 priority patent/US5932476A/en
Priority to US08/489,666 priority patent/US5922600A/en
Priority to US08/484,939 priority patent/US6319693B1/en
Priority to US08/485,001 priority patent/US5981502A/en
Priority to US08/910,322 priority patent/US6238669B1/en
Priority to US08/910,618 priority patent/US5958424A/en
Priority to US09/057,963 priority patent/US6217870B1/en
Priority to US09/384,472 priority patent/US6509446B2/en
Priority to GR20000400866T priority patent/GR3033173T3/el
Priority to US09/740,676 priority patent/US7427658B2/en
Priority to US11/238,653 priority patent/US20060073160A1/en
Priority to US11/888,039 priority patent/US20080234466A1/en

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56983—Viruses
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/10011—Circoviridae
    • C12N2750/10022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/10011—Circoviridae
    • C12N2750/10041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2750/10043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/008—Vector systems having a special element relevant for transcription cell type or tissue specific enhancer/promoter combination
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/60—Vector systems having a special element relevant for transcription from viruses
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S424/00—Drug, bio-affecting and body treating compositions
    • Y10S424/816—Viral vaccine for avian species, e.g. poultry or other birds
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/81—Packaged device or kit

Description

Recombinant DNA en RNA en daarvan afgeleide produkten Gebied van de uitvinding
De uitvinding ligt op de gebieden van genetic engineering (genetische manipulatie) met behulp van de recombinant DNA (en RNA) technologie, diagnostiek en immunisatie/vaccinatie. Meer in het bijzonder houdt de uitvinding zich bezig met de detectie, clonering en sequentie-analyse van het Chicken Anaemia Virus (CAV) DNA genoom en daardoor mogelijk gemaakte toepassingen.
Achtergrond van de uitvinding
Het tot dusver nog niet geklassificeerde CAV virus veroorzaakt infectieuze anaemie bij kippen. Het virus werd voor het eerst geïsoleerd in Japan in 1979 en kreeg zijn naam vanwege de ernstige anemie die het veroorzaakte in jonge kuikens (Yuasa et al., 1979). De overige symptomen van CAV infectie zijn een atrofie van het beenmerg en destructie van lymphocyten in de thymus. Lesies treden op in de milt en lever.
Eéndagskuikens zijn het meest gevoelig. Bij deze dieren wordt lethargie, anorexia en een voorbijgaande anemie waargenomen vanaf 4 a 7 dagen na inoculatie met CAV en ongeveer de helft van de dieren sterft tussen 2 en 3 weken na infectie. Met toenemende leeftijd neemt ook de natuurlijke resistentie toe.
Bij besmetting op een leeftijd van zeven dagen ontwikkelen de kuikens slechts een voorbijgaande anemie na infectie en bij besmetting van 14 dagen oude dieren volgt geen anemie.
Bescherming tegen CAV-infectie en CAV-ziekteverschijnselen is in hoge mate gebaseerd op humorale immunologische afweermechanismen. Vielitz (1989) ontwikkelde een praktische, redelijk effectieve methode van preventie door middel van een "controlled exposure” met CAV-besmette leversuspensies bij leghennen, waarmee nakomelingen maternale immuniteit verkrijgen. Deze wijze van immunisatie wordt in Duitsland in de praktijk toegepast, maar lijkt niet geheel zonder risico's te zijn.
Bij dierexperimenten, verricht in geïsoleerde pluimvee-hokken bij het Centraal Diergeneeskundig Instituut (CDI) te Lelystad, is de beschermende waarde van maternale antistoffen bevestigd. Hierbij werd de "controlled exposure" verricht met CAV, dat in weefselkweek werd vermeerderd. De aanwezigheid van maternale antistoffen tegen CAV verhinderde volledig de CAV-replicatie bij besmetting van ééndagskuikens afkomstig van aldus gevaccineerde moederdieren. Ook de CAV-symptomen bleven uit.
Deze passieve protectie werd ook verkregen bij nakomelingen van geïmmuniseerde leghennen, en ook- na injectie van specifiek pathogeen-vrije (SPF) kuikens met dooierextracten van eieren van dezelfde geïmmuniseerde leghennen. De passieve protectie t.a.v. CAV besmetting door middel van toediening van CAV-antistoffen duurde tot een leeftijd van 4 weken. Daarna bleek de passieve bescherming niet compleet. Deze experimenten toonden aan dat maternale antistoffen, opgewekt door vaccinatie van moederdieren, in de praktische situatie een belangrijke preventieve rol zullen hebben.
Ook is experimenteel aangetoond dat bij kuikens, die de CAV besmetting overleven, een voorbijgaande depletie van een bepaalde populatie thymus lymphocyten optreedt (Jeurissen et al., 1989). De thymus atrofie is mogelijk de oorzaak van de immunodepressie, die CAV veroorzaakt, waardoor bepaalde vaccinaties minder effectief zijn, bijv. tegen Newcastle Disease. CAV is diverse malen geïsoleerd bij koppels met verhoogde uitval ten gevolge van de ziekte van Marek, de ziekte van Gumboro (Infectious Bursal Disease Virus, IBDV; Yuasa et al., 1980) en bij dieren met Blue Wing Disease in associatie met Reovirussen (Engström, 1988a; Engström et al·., 1988b). Bij experimentele dubbelinfecties zijn de 'enhancing* eigenschappen van CAV t.o.v. andere kippe-virussen (bijv. Marek's Disease Virus, MDV, De Boer et al., 1989a) aangetoond. Recent werd in eigen proeven een sterk verhoogde entreaktie geconstateerd na o aerosolvaccinatie met Newcastle Disease vaccin en gelijktijdige besmetting met CAV. CAV heeft derhalve immuunsuppressieve en enhancing effecten op andere virus-infecties tot gevolg. Deze eigenschappen van CAV zijn vermoedelijk de reden van een verhoogde incidentie van virulente ziekte uitbraken in de praktijk.
CAV lijkt een wereldwijde verspreiding te hebben. Geruime tijd nadat het CAV-onderzoek in Japan op gang was gekomen werden in Europa de eerste CAV-isolaties in Duitsland verricht door Von Bülow (1983) en later door McNulty et al. (1990) in het Verenigd Koninkrijk. In Nederland werden de eerste isolaties van CAV uit materiaal afkomstig uit USA, Israel en Tunesie verricht door De Boer et al. (1988). De beschikbare literatuurgegevens geven aan, dat de isolaten tot één serotype, behoren, maar meerdere veld-isolaten dienen onderzocht te worden op hun onderlinge verwantschap en mogelijk verschil in pathogeniteit (McNulty et al., 1990). De verspreiding van CAV binnen een koppel vindt waarschijnlijk plaats door besmetting via faeces en lucht. Verticale overdracht van virus op de nakomelingen speelt echter ook een belangrijke rol in de CAV-epidemiologie. In diverse landen werd de aanwezigheid van CAV serologisch aangetoond.
Onder weefselkweek condities is CAV moeilijk te vermenigvuldigen. CAV veroorzaakt tot dusver alleen een cytopathologisch effect (CPE) in MDV-getransformeerde lymphoblastoide cellijnen afkomstig van lymfomen van de ziekte van Marek (MDCC-MSB1 cellen) of Aviair Leukemie Virus (ALV)-getransformeerde lymphoblastoide cellijnen afkomstig van lymphoide leukose (1104-X5 cellen; Yuasa, 1983) .
Recent onderzoek door Todd et al. (1990) beschrijft viruspartikels (in gezuiverd CAV materiaal) met een diameter van 23.5 nm die concentreren bij een dichtheid van 1.33-1.34 g/ml in een CsCl gradient. Het virus heeft één overheersend polypeptide (Mr: 50 000) en een circulair, enkelstrengs DNA genoom met een grootte van 2.3 kilo-basen. Twee kleine virussen, het Porcine Circo Virus en een virus dat geassocieerd wordt met Psittacine Beak and Feather Disease, lijken op CAV voor wat betreft het circulaire, enkelstrengs DNA, maar hebben een kleiner genoom en
Tischer et al., 1982). Geruime tijd werd aangenomen dat CAV tot de parvovirussen behoort. De meeste parvovirussen zijn weliswaar enkelstrengs-DNA virussen maar ze bezitten lineair DNA, een groter genoom en vermoedelijk ook een andere samenstelling van virale polypeptiden.
Algemeen wordt aangenomen dat cellulaire componenten, die betrokken zijn bij de replicatie en transcriptie van een virus, alleen functioneel zijn wanneer het DNA een dubbelstrengs vorm heeft. Virus dat een circulair enkelstrengs DNA bezit, kan in de cel voorkomen in een fase waarin het bestaat uit dubbelstrengs DNA. De onderhavige uitvinders hebben van dit gegeven gebruik gemaakt.
De onderhavige uitvinders hebben het dubbelstrengs CAV DNA met een grootte van 2.3 kilobaseparen gekarakteriseerd in met CAV geïnfecteerde 1104-X5 en MDCC-MSB1 cellen en het gedoneerd in pIC-20H. Het DNA werd volledig gesequenced (zie fig. 1). In een diagnostische test met behulp van gelabeld gedoneerd CAV DNA konden CAV nucleïnezuren aangetoond worden in virus-, lever-- en weefselkweekpreparaten. Gedoneerd CAV bleek alle biologische en pathogene eigenschappen te bezitten van wild-type CAV, zowel in weefselkweek als in dierproeven.
Korte beschrijving van de uitvinding
De onderhavige uitvinding verschaft nu in een eerste aspect recombinante genetische informatie in de vorm van al dan niet gelabeld DNA of RNA, omvattende een Chicken Anaemia Virus (CAV)-specifieke nucleotidensequentie die overeenkomt met of complementair is aan de nucleotidensequentie van een CAV genoom of een deel daarvan.
Een voorkeursuitvoeringsvorm van de onderhavige uitvinding bestaat uit dergelijke recombinante genetische informatie welke een CAV-specifieke nucleotidensequentie die overeenkomt met of complementair is aan de in fig. 1 getoonde nucleotidensequentie, een daarmee voor ten minste 60% homologe nucleotidensequentie, of een deel daarvan omvat.
Dit aspect van de uitvinding bestaat uit een nucleïnezuur, gekozen uit DNA en RNA, in elke mogelijke verschijningsvorm, dus zowel in de vorm van naakt DNA of RNA, als in de vorm van DNA of RNA, dat op enigerlei wijze verpakt is (bijv. in eiwitten of in viruspartikels) of met andere materie is verbonden (bijv. met een drager of met een als merker fungerend materiaal). Het DNA kan zowel enkelstrengs als dubbelstrengs DNA zijn, en kan zowel in lineaire als in circulaire vorm verkeren.
Kenmerkend voor recombinante genetische informatie volgens de uitvinding is de aanwezigheid daarin van een CAV-specifieke nucleotidensequentie. Deze CAV-specifieke sequentie behoeft niet het totale genoom van CAV te beslaan en praktisch gezien zal voor de meeste toepassingen slechts een bepaald gedeelte nodig en gewenst zijn.
Een eerste geprefereerde mogelijkheid is een CAV-specifieke nucleotidensequentie die overeenkomt met of complementair is aan een in een CAV genoom voorkomende, voor een CAV eiwit coderende nucleotidensequentie, of een deel daarvan. Recombinant DNA, dat zo'n coderende sequentie omvat, kan bijvoorbeeld worden gebruikt voor het in een monster detecteren van CAV boodschapper RNA, of kan bijv. gebruikt worden in het kader van een werkwijze voor het produceren van CAV eiwitten of delen daarvan. Met de woorden "deel daarvan" wordt in beginsel elk gedeelte omvat, dat nog CAV-specifiek kan worden genoemd. Op eiwitniveau zal het daarbij voor de meeste toepassingen om een epitoop gaan, d.w.z. een door antilichamen herkenbare antigene determinant.
Een andere mogelijkheid is, dat de recombinante genetische informatie volgens de uitvinding een CAV-specifieke nucleotidensequentie die overeenkomt met of complementair is aan een in een CAV genoom voorkomende nucleotidensequentie met een regulerende functie, of een deel daarvan, omvat. Hierbij valt te denken aan het gebruik van CAV promoter/enhancer elementen in combinatie met sequenties die voor een ander eiwit dan CAV eiwit coderen, bijvoorbeeld om expressie van dergelijke non-CAV eiwitten in pluimvee (zoals kippen) en andere dieren, waarin de regulatie-signalen van CAV effectief zijn, mogelijk te maken.
Zowel in het bovenstaand genoemde geval als ook in het algemeen kan de recombinante genetische informatie volgens de uitvinding tevens een niet van een CAV genoom afgeleide nucleotidensequentie omvatten. Deze "niet van een CAV genoom afgeleide nucleotidensequentie" kan bijvoorbeeld worden gevormd door een van een prokaryotische of eukaryotische expressievector afgeleide nucleotidensequentie. Zo omvat de uitvinding de mogelijkheid van een insertie van een CAV-specifieke sequentie in een voor expressie in eukaryotische organismen geschikte (virale of niet-virale) vector of in een voor expressie in bacteriën geschikt plasmide. Verder is ook mogelijk dat recombinante genetische informatie volgens de uitvinding een niet in het CAV genoom voorkomende nucleotidensequentie met regulerende functie als "niet van een CAV genoom afgeleide nucleotidensequentie" omvat.
De "niet van een CAV genoom afgeleide nucleotidensequentie" kan echter ook bestaan uit een voor (een deel van) een ander eiwit dan een CAV eiwit coderende nucleotidensequentie, bijvoorbeeld indien CAV regulatiesignalen gebruikt worden om zo'n non-CAV eiwit (of deel daarvan) in een voor het CAV virus toegankelijke gastheer tot expressie te brengen, of indien men het recombinante DNA wil gebruiken om een hybride- of fusieeiwit te kunnen produceren, waarin een CAV eiwit als drager voor een epitoop van een non-CAV eiwit of, omgekeerd, een non-CAV eiwit als drager voor een epitoop van een CAV eiwit fungeert.
Indien de recombinante genetische informatie volgens de uitvinding gebruikt moet worden in het kader van werkwijzen voor het in een monster detecteren van complementair DNA of RNA, kan de aanwezigheid van een label nodig zijn. Met een label wordt een voor gebruik bij DNA of RNA geschikte merker bedoeld, die detectie van het gelabelde DNA resp. RNA mogelijk maakt of vergemakkelijkt. Aan de deskundige zijn vele soorten van voor dit doel geschikte merkers bekend, zoals radioisotopen (bijv.
32P), enzymmolekulen (bijv. peroxidasen), haptenen (bijv. biotine), fluorescente stoffen, kleurstoffen, pigmenten (bijv. anorganische fosfors), en deeltjesvormige merkers (bijv. goud-of seleendeeltjes).
In een tweede aspect betreft de uitvinding het gebruik van recombinante genetische informatie zoals hierboven gedefinieerd, in het bijzonder voor diagnostische doeleinden, immunisatie- of vaccinatiedoeleinden, of voor de produktie van al dan niet CAV eiwitten.
Meer in het bijzonder gaat het bijvoorbeeld om een gebruik van recombinante genetische informatie volgens de uitvinding als CAV-specifieke probe of primer in een werkwijze voor het detecteren van CAV DNA of RNA, bijv. in een werkwijze van DNA/RNA slot blotting, Southern blotting, Northern blotting, in situ hybridisatie, DNA amplificatie d.m.v. PCR, SI mapping en primer extension, waarbij de uitvinding zich tevens uitstrekt over een diagnostische kit voor het detecteren van CAV DNA of RNA in een werkwijze zoals DNA/RNA slot blotting, Southern blotting, Northern blotting, in situ hybridisatie, DNA amplificatie d.m.v. PCR, SI mapping of primer extension, welke diagnostische kit recombinante genetische informatie volgens de uitvinding als CAV-specifieke probe of primer bevat.
Voorts gaat het daarbij om een gebruik van recombinante genetische informatie volgens de uitvinding als levend virus vaccin om bescherming tegen CAV of een ander pathogeen te realiseren, waarbij de uitvinding zich ook uitstrekt over een vaccinpreparaat voor het immuniseren tegen CAV of een ander pathogeen, welk preparaat recombinante genetische informatie volgens de uitvinding en eventueel een of meerdere, voor levend virus vaccins bruikbare drager- en hulpstoffen omvat.
Ook gaat het daarbij om een gebruik van recombinante genetische informatie volgens de uitvinding als kloneringsvector, d.w.z. om een gebruik van CAV-DNA als een soort "eukaryotisch plasmide" voor aviaire systemen, waarbij genfragmenten in het gehele of nagenoeg gehele CAV-genoom worden ingebouwd.
Gebruik van recombinante genetische informatie volgens de uitvinding in een werkwijze voor het produceren van een CAV eiwit, een deel daarvan of een ander eiwit dan een CAV eiwit, door in vitro of in vivo translatie, wordt eveneens omvat. Het zelfde geldt voor een prokaryotische of eukaryotische cel, welke recombinante genetische informatie zoals hierboven gedefinieerd bevat, en met name zo’n prokaryo'tische of eukaryotische cel, die in staat is tot expressie van ten minste één, door recombinante genetische informatie volgens de uitvinding gecodeerd eiwit of eiwitgedeelte. Deze verschillende mogelijkheden zullen verder in deze beschrijving nog uitvoerig worden toegelicht.
Een volgend aspect van de uitvinding betreft CAV eiwit of deel daarvan, verkregen door in vitro translatie van recombinante genetische informatie volgens de uitvinding, welke een voor het CAV eiwit of deel daarvan coderende nucleotiden-sequentie omvat, alsmede CAV eiwit of deel daarvan, verkregen door isolatie uit een prokaryotische of eukaryotische cel, die recombinante genetische informatie volgens de uitvinding, omvattende een voor het CAV eiwit of deel daarvan coderende nucleotidensequentie, bevat en in staat is tot expressie daarvan.
Ook op het eiwitniveau strekt de uitvinding zich uit over de verschillende toepassingen, met name het gebruik van een CAV eiwit of eiwitgedeelte volgens de uitvinding voor diagnostische doeleinden, immunisatie- of vaccinatiedoeleinden, of voor de produktie van CAV-specifieke antilichamen.
Meer in concreto omvat de uitvinding het gebruik van een CAV eiwit of eiwitgedeelte zoals hierboven gedefinieerd als CAV-specifieke antilichamen bindend reagens in een immunoassay werkwijze voor het detecteren van CAV-specifieke antilichamen, bijv. een immunoperoxidase kleuring, een ELISA of een immuun-fluorescentie assay, en dienovereenkomstig een diagnostische kit voor het detecteren van CAV-specifieke antilichamen in een immunoassay werkwijze zoals een immunoperoxidase kleuring, een ELISA of een immuunfluorescentie assay, welke diagnostische kit een CAV eiwit of eiwitgedeelte volgens de uitvinding als CAV-specifieke antilichamen bindend reagens bevat.
Tevens omvat de uitvinding het gebruik van een CAV eiwit of eiwitgedeelte zoals hierboven gedefinieerd als sub-unit vaccin om bescherming tegen CAV te realiseren, alsmede een vaccinprepa-raat tegen CAV, welk preparaat een CAV eiwit of eiwitgedeelte volgens de uitvinding en eventueel een of meerdere, voor sub-unit vaccins bruikbare drager- en hulpstoffen omvat.
Gebruik van een CAV eiwit of eiwitgedeelte zoals hierboven gedefinieerd in een werkwijze voor het produceren van CAV-speci-fieke polyclonale of monoclonale antilichamen behoort eveneens tot de onder de uitvinding vallende mogelijkheden. Al deze toepassingen zullen verder in deze beschrijving nog uitvoeriger worden toegelicht.
In een verder aspect betreft de uitvinding ook nog CAV-specifieke antilichamen, opgewekt met behulp van een CAV eiwit of eiwitgedeelte zoals hierboven gedefinieerd, evenals de verschillende toepassingsmogelijkheden voor dergelijke CAV-specifieke antilichamen, bijv. voor diagnostische doeleinden, immunisatie- of vaccinatiedoeleinden of voor preparatieve doeleinden.
Meer in concreto gaat het hierbij bijv. om een gebruik van CAV-specifieke antilichamen volgens de uitvinding als CAV-eiwit bindend reagens in een immunoassay werkwijze voor het detecteren van CAV-eiwit, alsmede een diagnostische kit voor het detecteren van CAV-eiwit in een immunoassay werkwijze, welke diagnostische kit CAV-specifieke antilichamen volgens de uitvinding als CAV-eiwit bindend reagens bevat.
Voorts valt te denken aan een gebruik van CAV-specifieke antilichamen volgens de uitvinding voor passieve immunisatie tegen CAV-besmetting, alsmede een immunisatiepreparaat voor passieve immunisatie tegen CAV, welk preparaat CAV-specifieke antilichamen volgens de uitvinding en eventueel een of meerdere, voor passieve-immunisatiepreparaten bruikbare drager- en hulpstoffen omvat. Het gaat hierbij met name om een immunisatie van leghennen met recombinant produkten volgens de uitvinding.
Wat preparatieve toepassingen betreft valt te denken aan gebruik van CAV-specifieke antilichamen volgens de uitvinding in een werkwijze voor het isoleren en/of opzuiveren van CAV-eiwit. De belangrijkste toepassingsmogelijkheden zullen in de hierna volgende gedetailleerdere beschrijving van de uitvinding nog uitvoeriger worden toegelicht.
Gedetailleerde beschrijving van de uitvinding
Analyse van laag-moleculair DNA geïsoleerd uit CAV-geïnfecteerde cellen.
Het CAV genoom geïsoleerd uit een gezuiverd viruspreparaat bleek een circulair enkelstrengs DNA molekuul met een lengte van ongeveer 2300 basen (Todd et al., 1990). Onze verwachting was dat in CAV-geïnfecteerde cellen, naast circulair-enkelstrengs virus DNA ook circulair-dubbelstrengs CAV DNA voorkomt. Dubbel-strengs DNA kan met restrictie enzymen worden geknipt en kan derhalve direct gedoneerd worden, in tegenstelling tot enkelstrengs DNA. Op grond hiervan werd onderzocht of in de laag-moleculaire fractie van CAV-geïnfecteerde cellen een DNA produkt voorkomt, dat afwezig was in ongeïnfecteerde cellen.
Laag-moleculair DNA werd geïsoleerd uit CAV-geïnfecteerde MDCC-MSB1 en 1104-X5 cellen, en uit ongeïnfecteerde 1104-X5 cellen. Het DNA werd gefractioneerd op een agarose/ethidium-bromide gel. Een zeer zwak DNA bandje, met een (gemeten) lengte van ca. 3 kilobaseparen (kbp), was zichtbaar in de gel. Dit specifieke DNA produkt was afwezig in het DNA geïsoleerd uit ongeïnfecteerde cellen.
In het volgende experiment werd waarschijnlijker gemaakt dat het specifieke DNA alleen aanwezig was in CAV-geïnfecteerde cellen. DNA geïsoleerd uit geïnfecteerde cellen werd gescheiden op lengte m.b.v. een agarose gel·. DNA met een lengte van 2.7-3.5 kbp werd geïsoleerd. Deze DNA fractie zal het specifieke virus DNA moeten bevatten naast overig cellulair DNA. Het geïsoleerde DNA werd radioaktief gelabeld en gehybridiseerd met een Southern blot van laag-moleculair DNA uit CAV-geïnfecteerde cellen, en uit ongeïnfecteerde cellen. Ter hoogte van 3 kbp hybridiseerde een DNA product in de blot van CAV-geïnfecteerde cellen dat afwezig was in de DNA blot van ongeïnfecteerde cellen.
De lengte van 3 kbp werd bepaald met DNA markers bestaande uit dubbelstrengs lineaire DNA moleculen. Een circulair dubbel-strengs DNA molekuul gedraagt zich in een agarose gel anders dan lineaire DNA fragmenten. Het DNA van 3 kbp uit CAV-geïnfecteerde cellen zou een lineaire vorm kunnen zijn van een DNA dat in werkelijkheid 2.3 kbp lang is.
Als het circulair-dubbelstrengs DNA gedigereerd wordt met een restrictie enzym dat slechts 1 keer knipt in het DNA molecuul, zou dan een lineair DNA molecuul moeten ontstaan met een (gemeten) lengte van 2.3 kbp.
Dat deze veronderstelling juist is werd aangetoond door laag-moleculair DNA geïsoleerd uit CAV-geïnfecteerde 1104-X5 cellen afzonderlijk te incuberen met zes verschillende restrictie enzymen (BamHI, EcoRI, HindlII, Kpnl, PstI, en Xbal). Een Southern blot van laag-moleculair DNA geïsoleerd uit CAV-geïnfecteerde 1104-X5 cellen en geknipt met de genoemde restrictie enzymen werd gehybridiseerd met de hierboven beschreven radioactief-gelabelde DNA probe. Hieruit bleek dat behandeling met de restrictie enzymen BamHI, EcoRI, PstI en Xbal, een DNA molekuul met een gemeten lengte van 2.3 kbp opleverde. DNA van ongeïnfecteerde cellen, geincubeerd met BamHI, bevatte dit DNA produkt niet. Het restrictie-enzym HindlII knipte twee keer in het DNA, terwijl Kpnl niet knipte.
Uit de bovenbeschreven experimenten kan worden geconcludeerd dat in laag-moleculair DNA van CAV-geïnfecteerde cellen een 2.3 kbp circulair DNA molekuul voorkomt, dat afwezig is in ongeïnfecteerde cellen, en dat dit het CAV genoom is in de vorm van een circulair dubbelstrengs DNA molecuul.
Clonering en subclonering van dubbelstrengs CAV DNA in een bacteriële vector.
Laag-moleculair DNA van CAV-geïnfecteerde 1104-X5 cellen werd afzonderlijk geincubeerd met BamHI, EcoRI, PstI, en Xbal. Het DNA werd gescheiden op een 'Low melting point'-agarose gel. Van alle vier DNA preparaten werd het 2.3 kbp DNA molecuul geïsoleerd. De cloneringsvector pIC-20H werd afzonderlijk gedigereerd met dezelfde vier restrictie enzymen waarmee het laag-moleculaire DNA werd geknipt. De lineaire vector werd met 'calf intestine alkaline phosphatase' behandeld. Ieder 2.3 kbp DNA fragment werd in de overeenkomstige restrictie-enzym plaats van pIC-20H geligeerd. De ligeringsproducten werden getransfecteerd in de £. coli stam HB101. Alle 4 cloneringen leverden plasmiden op die geinserteerd DNA bevatten met een lengte van ongeveer 2.3 kbp. Nadere restrictie-enzym analyse toonde aan dat ten minste 7 plasmiden hetzelfde DNA fragment bevatten. De plaats van integratie van de vector was echter verschillend, wegens het gebruik van verschillende enzymen om het circulaire molekuul open te knippen. M.b.v. de restrictie-enzymen BamHI, EcoRI, PstI, en Xbal werd van alle vier CAV-DNA cloons een restrictie-enzym map bepaald.
Vier 'verschillende' CAV-DNA plasmiden werden radioaktief gelabeld en gehybridiseerd met Southern blots van BamHI-gedige-reerd DNA geïsoleerd uit CAV-geïnfecteerde en ongeïnfecteerde cellen. Alle geteste cloons hybridiseerden alleen met het 2.3 kbp DNA molecuul aanwezig in DNA van CAV-geïnfecteerde cellen.
Biologische aktiviteit van twee CAV DNA cloons.
De twee CAV-cloons pIC-20H/CAV-EcoRI en pIC-20H/CAV-PstI werden gedigereerd met restrictie enzymen zodat het CAV DNA in zijn geheel uit de vector werd geknipt. De lineaire CAV-DNA moleculen werden behandeld met T4-DNA ligase. De lineaire CAV DNA's werden op deze wijze gecirculariseerd. Het 'gedoneerde' CAV DNA bezat nu de dubbelstrengs-circulaire vorm die wild-type CAV DNA in geïnfecteerde cellen ook bezit. MDCC-MSB1 en 1104-X5 cellen werden getransfecteerd met de 'gedoneerde' circulaire CAV DNA's. Voor cloon pIC-20H/CAV-EcoRI werd in beide celtypen een zeer duidelijk cytopathogeen effect (CPE) gevonden. Cloon pIC-20H/CAV-PstI veroorzaakte een duidelijk CPE in MDCC-MSB1 cellen en een minder duidelijk CPE in 1104-X5 cellen. Echter, de supernatanten van pIC-20H/CAV-PstI getransfecteerde 1104-X5 cellen veroorzaakten in MDCC-MSB1 cellen een duidelijk CPE. Transfecties met DNA geïsoleerd uit CAV-geïnfecteerde cellen veroorzaakten in MDCC-MSBl ook een duidelijk CPE, terwijl in 1104-X5 cellen een minder duidelijk CPE te zien was. Het CPE werd niet verkregen na transfectie van MDCC-MSBl of 1104-X5 cellen met pIC-20H vector DNA.
In een Southern analyse werd aangetoond dat in cellysaten van MDCC-MSB1 en 1104-X5 cellen geïnfecteerd met virus (passage 6), verkregen door gedoneerd CAV DNA, CAV DNA aanwezig was.
In een neutralisatie test met MDCC-MSB1 cellen werd aangetoond dat het CPE veroorzaakt door gedoneerd DNA in de getransfecteerde cellen het gevolg was van een CAV-besmetting. Neutraliserende antilichamen gericht tegen CAV verhinderden het CPE van MDCC-MSB1 cellen die geïnfecteerd werden met CAV progeny van getransfecteerde cellen.
Eéndagskuikens werden intramusculair ingespoten met supernatant van getransfecteerde cellen. De supernatanten veroorzaakten in de kip hetzelfde klinische beeld als wild-type CAV: achterblijven in groei, welke tot uiting kwam door verschillen in het totale lichaamsgewicht, bleek beenmerg en verlaagde hematocriet-waarden (anemie), thymusatrofie (depletie van een bepaalde populatie T cellen) en sterfte. Supernatanten van cellen getransfecteerd met vector DNA veroorzaakten geen ziekteverschijnselen bij de controle kuikens.
Sequentie analyse van het dubbelstrengs CAV DNA genoom.
Het gehele dubbelstrengs CAV DNA genoom werd volledig gesequenced m.b.v. de Sanger methode (Sanger et al. 1977) en de Maxam-Gilbert methode. M.b.v. de M13-sequencing en M13-reverse sequencing primers werden van de 4 pIC-20H/CAV (BamHI; EcoRI; PstI; Xbal) cloons de DNA volgorde van ongeveer 2100 basen bepaald. Vervolgens werd het CAV genoom gesubcloneerd. Van de vijf verschillende sub-cloons van het CAV DNA genoom werd de DNA volgorde bepaald volgens de Sanger methode m.b.v. de M13-primers en/of de Maxam-Gilbert methode. Op deze wijze werd de DNA volgorde van beide strengen van het CAV genoom bepaald.
De lengte van het CAV (dubbelstrengs) DNA is 2319 bp. De eerste base van de EcoRI site van het circulaire CAV genoom is +1 genummerd. De sequentie van de DNA streng die de meeste/ grootste 'open reading frames' bevat, is weergegeven in Fig. 1 en wordt (+)-streng genoemd. De samenstelling van de basen van deze streng is: 25.5% Adenine; 28.7% Cytosine; 27.7%; Guanine; 18.1% thymine. Computer studies naar mogelijke homologie van het CAV genoom met reeds bekende virus sequenties toonde aan dat het DNA niet eerder beschreven is en niet deel uitmaakt van een eerder beschreven virus groep. De aanvankelijke hypothese dat CAV een parvovirus is, is qua sequentie en vorm van het CAV DNA genoom (circulair) niet langer houdbaar.
M.b.v. computerstudies werd de organisatie van het CAV genoom gekarakteriseerd. De 'open reading frames', promoter/ enhancer elementen, polyadenyleringssignaal en site, en 'origin of replication' worden voorspeld. In Fig. 2 worden de voorspelde 'open reading frames', groter dan 300 basen, voor beide DNA strengen van CAV getoond. In Fig. 2A zijn de 'open reading frames' weergegeven die beginnen met het codon ATG. Het ATG-codon is het meest gebruikte initiatie-codon voor eiwitten. Opvallend is dat een van beide DNA strengen codeert voor 3 eiwitten met een lengte van 449 aminozuren (51.6 kDa), 216 aminozuren (24 kDa) en 121 aminozuren (13.3 kDa). Todd et al. (1990) hebben een 50-kDa eiwit aangetoond in gezuiverd CAV. Worden alle 'open reading frames daadwerkelijk gebruikt, dan wordt ongeveer 80% van het virus· genoom in eiwit vertaald.
Enkele gebieden zelfs dubbel. Het is zeer wel mogelijk dat de 3 'open reading frames' vertaald worden vanuit 1 RNA. De voorspelde start van het RNA molekuul is ongeveer op positie 350 (zie beneden) en de poly(A)-additie ongeveer op positie 2315.
Het enige poly(A) signaal bevindt zich op positie 2287 van de plus streng. Door alternatieve splicing kunnen de afzonderlijke messenger RNAs voor de verschillende eiwitten ontstaan.
Het is onwaarschijnlijk dat de 'open reading frames' op de andere DNA streng gebruikt worden omdat op deze streng enkele essentiele regulatie sequenties ontbreken. In Fig. 2B en 2C worden 'open reading frames' getoond die gebruik maken van respectievelijk CTG of GTG als startcodon. Echter, slechts voor enkele eiwitten is beschreven dat deze startcodons daadwerkelijk worden gebruikt (Hann et al., 1988).
Computer studies naar overeenkomsten tussen de afzonderlijke CAV eiwitten en reeds bekende eiwitten leverde slechts beperkte homologieën op met in de beschikbare programma's aanwezige sequenties. Het is daarom moeilijk te voorspellen op welk type eiwit de CAV eiwitten lijken. Relatief hoog scoorden virale capside, DNA-bindende en bloedstollingseiwitten. De resultaten zijn hier niet weergegeven.
De expressie van eiwitten wordt gereguleerd door promoter/ enhancer elementen (Jones, 1990). Meestal ligt een eukaryotische promoter vlak voor de start van het transcript. De CAV sequentie bevat upstream van de vermoedelijke cap-site de algemene elementen: TATA-box, SPl-box en CAAT-box. De sequentie en de positie van deze boxen komen zeer goed overeen met die beschreven in de meeste eukaryote promoters (Tabel 1). Rond positie 285 bevinden zich mogelijk bindingsplaatsen voor vier verschillende transcriptie-factoren: CREB, MLTF, GT, en PEA-I.
Een eukaryoot gen bevat ook enhancer elementen, die de sterkte bepalen van de eukaryote promoter. Mogelijke enhancer elementen zijn de vijf ’direct repeats' die allen 21 nucleotiden lang zijn en liggen tussen posities 144 en 260. Alle repeats hebben 19 identieke nucleotiden. Alleen de laatste 2 nucleotiden zijn verschillend. Repeat 1 is identiek aan 2, en 3 is gelijk aan 5. De repeats 1, 2 en 3 liggen naast elkaar, evenals 4 en 5. Tussen de repeats 3 en 4 is een 'onderbreking' van 12 nucleotiden. Een computer studie toont aan dat geen enkele beschreven (eukaryote) enhancer alle sequenties bevat, die gevonden zijn voor de vermoedelijke CAV-enhancer elementen. In alle direct repeats bevindt zich een ATF element dat mogelijk betrokken is bij de verhoging van de transcriptie van CAV RNAs. In de 'direct repeats' bevinden zich twee maal de sequentie CATCC en twee keer de sequentie CAGCC. De laatste sequentie overlapt met de CAAT-box. Deze vier sequenties hebben slechts 1 mismatch met de CACCC-box, beschreven voor β-globine (Tabel 1).
In Fig. 3 is weergegeven dat ongeveer tussen posities 55 en 135 en tussen posities 2180 en 2270 van de plus-DNA streng zeer grote hairpin structuren aanwezig zijn in de (enkelstrengs) DNA vorm van CAV. Hairpin structuren in het DNA zijn mogelijk betrokken bij de replicatie van het CAV DNA. De hairpins tussen 2180 en 2270 bevinden zich mogelijk niet alleen in CAV DNA maar ook in CAV RNA en spelen waarschijnlijk een rol in de stabiliteit van het CAV RNA.
De verschillende DNA vormen van CAV in geïnfecteerde cellen.
In een Southern blot van een onbehandeld DNA preparaat van CAV-geïnfecteerde cellen gehybridiseerd met radioaktief-gelabeld DNA van cloon pIC-2OH/CAV-EcoRI, zijn 3 verschillende CAV-DNA moleculen zichtbaar met een lengte van 3.0 kbp, 1.5 kbp en 0.8 kbp. Qua lengte en vorm van de DNA banden kunnen de DNA's de circulaire dubbelstrengs DNA, supercoiled dubbelstrengs DNA, en circulaire enkelstrengs DNA vorm van CAV zijn. Todd et al.
(1990) hebben voor het circulaire enkelstrengs DNA uit geïsoleerd CAV op een (niet-denaturerende) agarose gel een lengte gemeten van 0.8 kbp.
Detectie van CAV DNA in virus en leverpreparaten m.b.v. gelabeld 'gedoneerd' CAV DNA.
Totaal DNA werd geïsoleerd uit CAV, opgezuiverd volgens de methode beschreven door Von Bülow (1989), en uit leversuspensies van CAV-geïnfecteerde kuikens. De DNA preparaten werden geanalyseerd in een Southern assay met een gelabelde CAV DNA probe die alle CAV sequenties bevatte. DNA geïsoleerd uit gezuiverd CAV bevat een CAV DNA molekuul met een lengte van 0.8 kbp, terwijl het DNA van CAV-besmette lever alle CAV DNA molekulen bevat beschreven voor CAV-geïnfecteerde 1104-X5 en MDCC-MSB1 cellen. In een Southern-analyse van DNA, geïsoleerd uit gezuiverd CAV, werd aangetoond dat de minus-DNA streng is ingepakt in het virus. De resultaten bewijzen dat de CAV DNA cloons gebruikt kunnen in een diagnostische test voor CAV. Momenteel is een PCR test in ontwikkeling.
Toepassingen DNA.
CAV sequenties van bijvoorbeeld het pIC-2OH/CAV-EcoRI DNA plasmide of gedeelten daarvan kunnen gebruikt worden voor het aantonen van CAV DNA en/of RNA in te onderzoeken preparaten ten behoeve van onderzoek en diagnostiek. Het DNA kan radioaktief of op andere wijze, bijvoorbeeld met biotine/digoxygenine, gelabeld worden. M.b.v. DNA/RNA slot-blots, Southern/Northern analyses en in vitro hybridisaties kan de aanwezigheid van CAV nuclelnezuren worden vastgesteld. Onder gedeelten van de CAV sequenties worden ook DNA oligomeren verstaan.
Oligomeren afgeleid van de CAV sequenties van cloon pIC-2OH/CAV-EcoRI kunnen gebruikt worden in een 'Polymerase Chain Reaction' om zeer lage concentraties van CAV DNA/RNA op te sporen. De PCR is een zeer gevoelige methode die veel wordt gebruikt voor de detectie van virussen.
Diagnostische kits gebaseerd op bovenvermelde toepassingen zijn in de praktijk mogelijk.
Voor onderzoeksdoeleinden zijn technieken als SI mapping en primer extension met de CAV DNA fragmenten belangrijk. Met deze twee methoden kan men CAV RNA kwantificeren en nader karakteriseren.
Oligomeren in antisense configuratie kunnen worden gebruikt voor de bestudering van gen functies. Deze kunnen tevens dienen als model voor de bestudering van nieuwe methodes voor de remming van virus replicatie.
CAV DNA kan mogelijk worden gebruikt als carrier bij de transfectie voor kleine genfragmenten, met name als door deletie in het CAV-genoom de pathogene eigenschappen zijn verwijderd.
CAV-oligomeren in antisense configuratie kunnen mogelijk in virusvectoren tot expressie worden gebracht waarmee CAV replicatie of andere genfuncties in het levende dier of in vitro bestudeerd kunnen worden.
RNA.
CAV DNA fragmenten die gedoneerd zijn in Sp6/T7 vectoren leveren CAV RNA produkten op. Door in vitro transcriptie verkregen CAV RNAs kunnen gebruikt worden voor in vitro/in vivo synthese van CAV eiwitten. Zo kunnen RNA molekulen bijv. in een wheat germ extract vertaald worden in eiwitten (in vitro translatie). De CAV eiwitten verkregen door in vitro translatie kunnen dan bijvoorbeeld gebruikt worden voor het opsporen van antilichamen gericht tegen CAV in sera van kippen (zie beneden). CAV RNA molekulen kunnen ook door micro-injectie in cellen worden gebracht om daarin te worden vertaald in eiwitten. Aldus kunnen de effecten van CAV eiwitten op cellulair niveau worden bestudeerd. Ook kunnen eiwit/eiwit en/of eiwit/DNA interacties worden geanalyseerd.
CAV RNAs kunnen ook gebruikt worden als probe voor het opsporen van CAV nucleïnezuren in preparaten. De analyses kunnen uitgevoerd worden m.b.v. slot-blot, Southern, Northern en in situ hybridisatie analyses. Deze methoden kunnen gebruikt worden voor de ontwikkeling van diagnostische tests voor CAV.
Eiwitten.
Alle CAV eiwitten kunnen tot expressie worden gebracht in prokaryote of in eukaryote systemen. Daartoe moeten de gevonden open reading frames van CAV in een geschikte expressievector gedoneerd worden. Voor het bacteriële systeem bestaat een expressievector gebaseerd op de T7 promoter die geschikt is voor de expressie van CAV open reading frames. Het baculovirus systeem, gist, en het CHO-dhfr systeem zijn mogelijke eukaryote expressiesystemen. Virale vectoren, zoals bijv. retrovirale vectoren, komen hiervoor eveneens in aanmerking.
De CAV eiwitten of daarop gelegen epitopen kunnen gebruikt worden voor het opsporen van antilichamen gericht tegen CAV. Op deze wijze kunnen CAV-besmette kippen opgespoord worden. De CAV eiwitten of daarop gelegen epitopen kunnen toegepast worden in immunoassays zoals immunoperoxidase kleuringen, ELISA's en immuun-fluorescentie assays.
De CAV eiwitten of daarop gelegen epitopen kunnen gebruikt worden voor het opwekken van humorale en/of celgebonden immuniteit tegen CAV. De CAV eiwitten verkregen door expressie in eukaryote en prokaryote vector/gastheersystemen kunnen worden gebruikt voor toepassing in sub-unit vaccins.
M.b.v. de CAV eiwitten of daarop gelegen epitopen kunnen CAV-specifieke antilichamen worden verkregen waarmee in preparaten van CAV-besmette kippen CAV eiwitten kunnen worden opgespoord (zie beneden).
Antilichamen.
In een aantal besmettingsproeven bij jonge kuikens kon worden bevestigd dat maternale antistoffen effectief passieve bescherming kunnen bieden tegen CAV-besmetting. De maternale antistoffen werden daarbij via de natuurlijke route overgedragen aan de jonge kuikens, alsmede via injectie van pasgeboren kuikens met CAV-antistof houdende eidooierextracten. Passieve protectie tegen een CAV-besmetting werd ook opgewekt door middel van injectie van eidooier-extracten van eieren afkomstig van leghennen welke vlak voor de legperiode met CAV waren besmet.
Vaccinatie van leghennen met CAV eiwitten, tot expressie gebracht in een van de bovengenoemde expressiesystemen, zal resulteren in de vorming van maternale antistoffen. Jonge kuikens van deze leghennen zullen zijn beschermd tegen CAV besmetting.
Diagnostische tests kunnen worden ontwikkeld op basis van antilichamen tegen CAV. Hiervoor kunnen zowel polyclonale als monoclonale antilichamen worden aangewend. Met behulp van CAV-specifieke antilichamen kunnen preparaten worden onderzocht op de aanwezigheid van CAV eiwitten.
De bovenstaand vermelde toepassingen van CAV-antistoffen zijn voor antistoffen volgens de uitvinding, verkregen via werkwijzen zoals hierin beschreven, op dezelfde wijze mogelijk als voor natuurlijke CAV-antistoffen.
Levend-virus vaccins.
Het aanbieden van virale eiwitten aan het immuunsysteem m.b.v. een levend virus vector leidt vermoedelijk tot een betere immuunrespons dan een subunit vaccin. Een of meerdere CAV open reading frames (geheel of gedeeltelijk) zouden kunnen worden gedoneerd in levend virus vectoren. Bij het gevogelte kunnen alleen levend-virus vectoren worden gebruikt welke zelf een goede replicatie in het aviaire systeem vertonen. Voor toepassing bij de kip komen als vector bijv. in aanmerking: vogelpokken virus, retrovirale vectoren, herpesvirus vectoren (aviair herpesvirus serotypen 1, 2 en 3) en infectieuze laryngotrachitis virus, en mogelijk ook adenovirussen, zoals CELO. Immunisatie met bovengenoemde levend-virus vectoren beschermt tegen CAV en het carrier virus.
Door middel van het aanbrengen van een of meer deleties in het CAV genoom kunnen mogelijk vaccins worden ontwikkeld welke immuniseren tegen CAV besmetting bij jonge kuikens. Bij het aanbrengen van de deleties moet het pathogene karakter van CAV besmetting worden geëlimineerd/ maar moeten de replicatieve en daarmee immuniserende eigenschappen worden behouden.
Het CAV genoom kan ook zelf geschikt gemaakt worden als levend-virus vector voor de expressie van antigenen van andere virussen. Het CAV genoom moet daartoe zo worden veranderd dat naast of in plaats van CAV eiwitten, 'vreemde1 virus eiwitten tot expressie gebracht worden. CAV vectoren kunnen dus zo geconstrueerd worden dat bescherming optreedt tegen 'vreemde' virussen alleen of ook tegen CAV, afhankelijk van de expressie van de virale eiwitten door de recombinant vector in het gevaccineerde dier.
CAV-vaccins, welke als sub-unit vaccin, als deletie-vaccin dan wel als genfragment in een andere virusvector worden geproduceerd, zullen voornamelijk worden gebruikt voor vaccinatie van leghennen. Vaccinatie van de kuikens op jongere leeftijd, bijv. in combinatie met een vaccinatie tegen de ziekte van Marek, blijft echter ook een mogelijke toepassing van de uitvinding.
Enhancer/promoter elementen.
De CAV promoter en enhancer elementen kunnen gedoneerd worden in DNA vectoren. Onder de regulatie van de CAV promoter/ enhancer kunnen CAV eiwitten of 'vreemde' eiwitten tot expressie gebracht worden in zowel kippecellen als in andere celtypen.
Het is denkbaar dat de CAV promoter functioneel is in (kippe)beenmerg cellen. Als modelsysteem voor gentherapie kunnen m.b.v. CAV promoter/enhancer elementen, eventueel in combinatie met retrovirale vectoren, 'vreemde' eiwitten in vitro tot expressie gebracht worden in beenmerg cellen. De genetisch veranderde beenmerg cellen kunnen vervolgens getransplanteerd worden in het beenmerg van in dit geval de kip. Voor zeer kleine genfragmenten komt het CAV-genoom zelf ook in aanmerking voor toepassing als vector.
De CAV enhancer/promoter elementen zouden ook aktief kunnen zijn in andere organismen. Mocht dat het geval zijn dan kunnen de elementen ook in bijv. het muizesysteem gebruikt worden als model voor gentherapie.
Produkten van CAV zelf onder de regulatie van de eigen CAV promoter of een andere promoter biedt ook mogelijkheden voor het bestuderen en het ontwikkelen van technieken voor gentherapie.
De mogelijkheid van toepassing van het gehele of nagenoeg het gehele CAV-genoom als kloneringsvector, d.w.z. als een soort eukaryotisch plasmide voor aviaire systemen, is een ontwikkeling welke op grond van de gevonden struktuur van het CAV-genoom als reëel moet worden beschouwd.
Deponering van de CAV cloon pIC-20H/CAV-EcoRI
Een glycerol stock van HB101 cellen getransformeerd met het plasmide pIC-20H/CAV-EcoRI is gedeponeerd bij het Centraalbureau voor Schimmelcultures te Baarn, Nederland, op 7 september 1990 onder nummer CBS .... 90.
Figuurbespreking
Figuur 1 toont de nucleotidensequentie van het gekloneerde CAV DNA. De totale lengte is 2319 basen, waarbij de eerste G van de EcoRI site als nr. 1 is genomen.
Figuur 2 toont de voorspelde open leesramen (ORF’s) met een grootte van meer dan 300 basen voor de beide DNA strengen. De voor de 3 verschillende startcodons ATG, CTG en GTG voorspelde ORF's worden in resp. de 3 deelfiguren 2A, 2B en 2C getoond.
Figuur 3 toont enkele voorspelde hairpinstrukturen van het uit enkelstrengs DNA bestaande CAV genoom.
Materialen en Methoden Virus en cellen.
De Aviair Leukemie Virus-getransformeerde kippe B-cellijn 1104-X5 en de Marek's Disease Virus getransformeerde T-cellijn MDCC-MSB1 werden geïnfecteerd met het Cuxhaven-1 isolaat van CAV (Von Bülow et al., 1983; Von Bülow et al., 1985) . De cellen werden geïnfecteerd met ongeveer 0.1-1 TCID50/cel. Na twee dagen werden de cellen geoogst.
Isolering van totaal DNA.
Virus en leverpreparaten werden geresuspendeerd in 20 mM Tris HCl-pH 7.5, 2mM EDTA, 0.2% SDS, 0.6 mg/ml Proteinase-K en gedurende 1 uur geincubeerd bij 37°C. De preparaten werden geextraheerd met fenol-chloroform-isoamylalcohol (25:24:1) en het DNA werd geprecipiteerd m.b.v. ethanol. De DNA pellets werden geresuspendeerd in 100 μΐ 10 mM Tris HCl-pH 7.5, 1 mM EDTA.
Extractie en analyse van laag-moleculair DNA.
Laag-moleculair DNA werd geïsoleerd uit CAV-geïnfecteerde 1104-X5 en MDCC-MSB1 cellen en ongeïnfecteerde 1104-X5 cellen volgens de methode beschreven door Hirt (1967). Het DNA werd gescheiden op agarose gels en na kleuring met ethidium bromide direct geanalyseerd m.b.v. U.V. licht of geblot op een Biotrace filter volgens de methode beschreven door Southern (1982) . De blots werden gehybridiseerd met random-primed 32P-gelabeld DNA, geïsoleerd uit laag-moleculair DNA van CAV-geïnfecteerde 1104-X5 cellen met een lengte van 2.7-3.5 kb.
Cloneren van CAV DNA.
Het gehele CAV DNA genoom werd gedoneerd in de bacteriële vector pIC-20H. Gedeelten van het CAV DNA genoom werden gedoneerd in de vector pIC-19R. Alle plasmide DNA clonerings-stappen werden in principe uitgevoerd volgens de methoden beschreven door Maniatis et al. (1982).
Sequentie analyse van CAV DNA.
CAV DNA plasmiden werden gezuiverd m.b.v. een CsCl gradient en Sephacryl-S500 (Pharmacia) chromatografie. Dubbelstrengs DNA werd gesequenced m.b.v. T7 DNA polymerase (Pharmacia), of m.b.v. Taq DNA polymerase (Promega). Beide methoden werden uitgevoerd volgens de handleiding van Pharmacia of Promega. De oligonucleo-tiden werden gekineerd met T4 nucleotide kinase van Pharmacia. 'Strong-stops' werden gesequenced volgens de methode beschreven door Maxam en Gilbert (1977).
Circularisering van het gedoneerde CAV DNA genoom.
10 μg plasmide DNA van cloons die het gehele CAV-DNA genoom bevatten werd gedigereerd met restrictie enzymen zodat het gehele CAV-DNA insert gescheiden werd van het vector DNA. T4-DNA ligase behandeling van het 2.3 kilobaseparen lineaire CAV DNA molecuul resulteerde in een circulair dubbelstrengs CAV DNA. De ligeringsprodukten werden geanalyseerd op een 0.8% agarose gel.
DEAE-dextran transfectie.
Voor de transfectie van 1104-X5 en MDCC-MSB1 cellen werd twee maal 2 μg gereligeerd CAV DNA geresuspendeerd in 25 μΐ Milli-Q water en gemengd met 260 μΐ TBS-buffer. 15 μΐ 10 mg/ml DEAE-dextran werd toegevoegd aan het DNA mengsel en het mengsel werd bij kamertemperatuur geincubeerd gedurende 30 minuten.
1104-X5 cellen. Een 50 mm weefselkweekplaat met l-2xl06 1104-X5 cellen/plaat werd twee maal gewassen met TBS-buffer. De TBS-buffer werd volledig van de celmonolayer verwijderd en 300 μΐ DEAE-dextran/DNA-verdunning toegevoegd. De cellen werden 30 minuten geincubeerd bij kamertemperatuur. De DEAE-dextran/ DNA-mix werd vervangen door 2 ml 25% DMSO/TBS en de celmonolayer werd geincubeerd gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur. De cellen werden 2 maal gewassen met TBS-buffer, en vervolgens werd weefselkweek medium (RPMI1640 of E-MEM) toegevoegd. De cellen werden geincubeerd bij 37°C-5% CO2.
MDCC-MSB1 cellen. Ongeveer 2xl06 MDCC-MSB1 cellen werden gecentrifugeerd bij 1500 rpm in een tafelcentrifuge. Het medium werd vervangen door 5 ml TBS-buffer, en de cellen werden voorzichtig geresuspendeerd. De wasstap werd herhaald. Alle TBS-buffer werd verwijderd, het cel-pellet werd voorzichtig geresuspendeerd in 300 μΐ DEAE-dextran/DNA-mix, en geincubeerd bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten. 0.5 ml 25% DMSO/TBS werd toegevoegd, en de suspensie werd gedurende 3 minuten geincubeerd bij kamertemperatuur. 5 ml TBS werd toegevoegd en de cellen werden gecentrifugeerd bij 1500 rpm in een tafel-centrifuge. Het supernatant werd verwijderd en 5 ml weefsel-kweekmedium toegevoegd. De cellen werden geresuspendeerd en afgecentrifugeerd. De cellen werden in 5 ml weefselkweek-medium opgenomen en geincubeerd bij 37°C-5% CO2. Als controle werd 2 μg pIc-20H piasmide gebruikt voor transfectie.
In vitro neutralisatie test.
MDCC-MSB1 cellen werden geïnfecteerd met supernatant van MDCC-MSB1 en 1104-X5 cellen get rans f eet eerd met gedoneerd 'CAV DNA'. Ongeveer 2xl04 cellen werden geïnfecteerd. Het virusgehalte van dit inoculum was niet precies bekend. Bij de helft van de besmette celcultures werd polyclonaal serum met een neutraliserende aktiviteit gericht tegen CAV in verdunning 1:100 toegevoegd aan het medium. Als controle werd een serie 'wells' met CAV-besmette MSB1 cellen meegenomen waarbij geen antiserum gericht tegen CAV toegevoegd werd aan het medium.
CAV infectie van ééndagskuikens.
Supernatanten van CAV DNA- en controle DNA-getransfecteerde MDCC-MSB1 en 1104-X5 cellen werden intramusculair ingespoten in 1 dag oude kuikens. Zes dagen na infectie werd sectie verricht bij 5 kuikens per groep, nadat eerst de hernatoerietwaarde en het totale lichaamsgewicht waren bepaald. Voor virus-isolatie en immuno-histochemie werden heparinebloed, thymus en beenmerg verzameld. Het immunohistochemische onderzoek geschiedde d.m.v. een peroxidase kleuring van thymus coupes met o.a. het CAV-specifieke monoclonaal CVI-85.1. Veertien en achtentwintig dagen na infectie werd bij nog eens 5 kuikens sectie uitgevoerd en werden alle boven beschreven bepalingen uitgevoerd.
Tabel 1. Bekende transcriptie-factor-bindende sequentie elementen in het enhancer/promoter gebied van CAV.
Element Consensus CAV Positie in _sequentie_sequentie_CAV-.sequentie 1. -TATA-# GTATAa/tAa/t CTATATAT 321-330+ 2. SPI GGGCGG GGGCGG 305-310+ 3. CREB TGACGTCA TGACGTTT 290-297 4. PEA-I<py) GGAAGTGACTAAC GAAAGTGACTTTC 286-298 5. GT<SV40> Gg/cTGTGGAAa/tGT CGTTGCGAAAGT 279-290 6. MLTF GGCCACGTGACC TGCCACTGTCGA 274-285 7. CCAAT-TF AGCCAAT AGCCAAT 260-266+ 8. -CACCC-# CACCC CAGCC 259-263 9. ATF ACGTCA ACGTCA 253-258+ 10. -CACCC-# CACCC CAGCC 236-240 11. ATF ACGTCA ACGTCA 232-237+ 12. SPI (weak) GAGGCG 209-214 13. ATF ACGTCA ACGTCA 199-204+ • 14. -CACCC-# CACCC CATCC 182-186 15. ATF ACGTCA ACGTCA 178-183+ 16. -CACCC-# CACCC CATCC 161-165 17. ATF ACGTCA ACGTCA 157-162+ CAP site ligt vermoedelijk op ongeveer 350 + perfecte homologie tussen CAV en consensus sequentie _ consensus sequentie gevonden in meerdere virussen # DNA sequentie van een element
Referenties 1. De Boer, G.F., Pol, and Jeurissen, S.H.M. (1988).
Marek's disease vaccination strategies using vaccines made from three avian herpesvirus serotypes. Proceedings First International Poultry and Poultry Diseases Symposium, Manisa, Turkije, pp. 38-48 (in Turkish, English abstract) .
2. De Boer, G.F., Jeurissen, S.H.M., Van Roozelaar, D.J., Vos, G.J., and Koch, G. (1989a). Enhancing effects of chicken anaemia agent (CAA) on Marek's disease pathogenesis. Proceedings of the Thirty-eigth Western Poultry Disease Conference, Tempe, Arizona, Ü.S.A, p. 28.
3. De Boer, G.F., Pol, J.M.A., and Jeurissen, S.H.M. (1989b). Enhancing effects of chicken anaemia agent (CAA) on Marek's disease pathogenesis. Abstractbook IXth Intern. Congress of the WVPA, Brighton, U.K., p. 74.
4. Engström, B.E. (1988). Blue wing disease of chickens: Isolation of avian reovirus and chicken anaemia agent. Avian Pathology 17, 23-32.
5. Engström, B.E., Fossum, 0., and Luthman, M. (1988). Blue wing disease of chickens: Experimental infection with a Swedish isolate of Chicken Anaemia Agent and an avian Reovirus. Avian Pathology 17, 33-50.
6. Hann, S.R., King, M.W., Bentley, D.L., Anderson, C.W., and Eisenman, R.N. (1988). A non-AUG translational initiation in c-myc exon 1 generates an N-terminally distinct protein whose synthesis is disrupted in Burkitt's lymphomas. Cell 52, 185-195.
7. Hirt, B. (1967). Selective extraction of polyoma DNA from injected mouse cell cultures. Journal of Molecular Biology 26, 365-369.
8. Jeurissen, S.H.M., Pol, J.M.A., DeBoer, G.F. (1989). Transient depletion of cortical thymocytes induced by chicken anaemia agent. Thymus 14, 115-123.
9. Jones, N. (1990). Structure and function of transcription factors. Seminars in Cancer Biology 1, 5-19.
/ 10. Maniatis, T., Fritsch, E.F., and Sambrook, J. (1982). Molecular Cloning: A Laboratory Manual. New York: Cold Spring Harbor Laboratory.
11. Maxam, A.M., and Gilbert, W. (1977) . A new method for sequencing DNA. Proceedings National Academic Sciences U.S.A.
74, 560-564.
12. McNulty, M.S., Connor, T.J., McNeilly, F., McLoughlin, M.F., and Kirkpatrick, K.S. (1990). Preliminary characterisation of isolates of chicken anaemia agent from the United Kingdom. Avian Pathology, In Press.
13. Ritchie, B.W., Niagro, F.D., Lukert, Steffens, W.L., and Latimer, S. (1989). Characterization of a new virus from cockatoos with psittacine beak and feather disease. Virology 171, 83-88.
14. Sanger, F., Nicklen, S., and Coulsen, A.R. (1977). DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proceedings National Academic Sciences U.S.A. 74, 5463-5467.
15. Southern, E.M. (1975). Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis. Journal of Molecular Biology 98, 503-517.
16. Tischer, I., Gelderblom, H., Vetterman, W., and Koch, M.A.
(1982) . A very small porcine virus with circular, single-stranded DNA. Nature 295, 64-66.
17. Todd, D., Creelan, J.L., Mackie, D.P., Rixon, F., and McNulty, M.S. (1990). Purification and biochemical characterisation of chicken anaemia agent. Journal of General Virology 71, 819-823.
18. Vielitz, E. (1989). Protect your chicks from infectious anemia. Poultry Science 68, 34-35.
19. Von Bvilow, V., Fuchs, B., Vielitz, B., and Landgraf, H.
(1983) . Frusterblichkeitssyndrom bei Kiiken nach Doppelinfection mit dem Virus des Marekschen Krankheit (MDV) und eine Anamie-Erreger (CAA). Zentralblatt für Veterinarmedizin B. 30, 742-750.
20. Von Bülow, V., Fuchs, B., and Bertram, M. (1985). Untersuchungen über den Erreger der Infectiosen Anamie-Erreger bei Hühnerkücken (CAA) in vitro: Vermehrung, Titration, Serum- neutralisationstest und indirekter Immunofluoreszenstest. Zentralblatt für Veterinarmedizin B. 32, 679-693.
21. Yuasa, N., Taniguchi, T., and Yoshida, I. (1979). Isolation and some properties of an agent inducing anaemia in chicks.
Avian Diseases 23, 366-385.
22. Yuasa, N., Taniguchi, T., and Yoshida, I. (1980). Effect of infectious bursal disease virus infection on incidence of anaemia by chicken anaemia agent. Avian Diseases 24, 202-209.
23. Yuasa, N. (1983). Propagation and infectivity titration of the Gifu-1 strain of chicken anaenia agent in a cell line (MDCC-MSB1) derived from Marek's disease lymphoma. National Institute of Animal Health Quarterly 23, 13-20.

Claims (37)

1. Recombinante genetische informatie in de vorm van al dan niet gelabeld DNA of RNA, omvattende een Chicken Anaemia Virus (CAV)-specifieke nucleotidensequentie die overeenkomt met of complementair is aan de nucleotidensequentie van een CAV genoom of een deel daarvan.
2. Recombinante genetische informatie volgens conclusie 1, omvattende een CAV-specifieke nucleotidensequentie die overeenkomt met of complementair is aan de in fig. 1 getoonde nucleotidensequentie, een daarmee voor ten minste 60% homologe nucleotidensequentie, of een deel daarvan.
3. Recombinante genetische informatie volgens conclusie 1 of 2, omvattende een CAV-specifieke nucleotidensequentie die overeenkomt met of complementair is aan een in een CAV genoom voorkomende, voor een CAV eiwit coderende nucleotidensequentie, of een deel daarvan.
4. Recombinante genetische informatie volgens conclusie 1 of 2, omvattende een CAV-specifieke nucleotidensequentie die overeenkomt met of complementair is aan een in een CAV genoom voorkomende nucleotidensequentie· met een regulerende functie, of een deel daarvan.
5. Recombinante genetische informatie volgens een of meer van de voorgaande conclusies, welke tevens een niet van een CAV genoom afgeleide nucleotidensequentie omvat.
6. Recombinante genetische informatie volgens conclusie 5, welke een van een prokaryotische of eukaryotische expressie-vector afgeleide nucleotidensequentie als niet van een CAV genoom afgeleide nucleotidensequentie omvat.
7. Recombinante genetische informatie volgens conclusie 5, welke een voor een ander eiwit dan een CAV eiwit coderende nucleotidensequentie, of een voor een deel van zo'n ander eiwit coderende nucleotidensequentie, als niet van een CAV genoom afgeleide nucleotidensequentie omvat.
8. Recombinante genetische informatie volgens conclusie 5, welke een niet in het CAV genoom voorkomende nucleotiden-sequentie met regulerende functie als niet van een CAV genoom afgeleide nucleotidensequentie omvat.
9. Recombinante genetische informatie volgens een van de voorgaande conclusies in de vorm van DNA.
10. Recombinante genetische informatie volgens conclusie 9, waarbij het DNA gelabeld is met een of meerdere, voor labeling van DNA bruikbare merkers, zoals radioisotopen, enzymmolekulen, haptenen, fluorescente stoffen, kleurstoffen, pigmenten, en deeltjesvormige merkers.
11. Recombinante genetische informatie volgens een van de voorgaande conclusies in de vorm' van RNA.
12. Recombinante genetische informatie volgens conclusie 11, waarbij het RNA gelabeld is met een of meerdere, voor labeling van RNA bruikbare merkers, zoals radioisotopen, enzymmolekulen, haptenen, fluorescente stoffen, kleurstoffen, pigmenten, en deeltjesvormige merkers.
13. Recombinante genetische informatie volgens een van de voorgaande conclusies, verpakt in recombinante virusdeeltjes.
14. Gebruik van recombinante genetische informatie volgens een van de voorgaande conclusies voor diagnostische doeleinden, immunisatie- of vaccinatiedoeleinden, of voor de produktie van al dan niet CAV eiwitten.
15. Gebruik van recombinante genetische informatie volgens een van de conclusies 1-12 als CAV-specifieke probe of primer in een werkwijze voor het detecteren van CAV DNA of RNA, bijv. in een werkwijze van DNA/RNA slot blotting, Southern blotting, Northern blotting, in situ hybridisatie, DNA amplificatie d.m.v. PCR, SI mapping en primer extension.
16. Diagnostische kit voor het detecteren van CAV DNA of RNA in een werkwijze zoals DNA/RNA slot blotting, Southern blotting, Northern blotting, in situ hybridisatie, DNA amplificatie d.m.v. PCR, SI mapping of primer extension, welke diagnostische kit recombinante genetische informatie volgens een van de conclusies 1-12 als CAV-specifieke probe of primer bevat.
17. Gebruik van recombinante genetische informatie volgens conclusie 13 als levend virus vaccin om bescherming tegen CAV of een ander pathogeen te realiseren.
18. Vaccinpreparaat voor het immuniseren tegen CAV of een ander pathogeen, welk preparaat recombinante genetische informatie volgens conclusie 13 en eventueel een of meerdere, voor levend virus vaccins bruikbare drager- en hulpstoffen omvat.
19. Gebruik van recombinante genetische informatie volgens een van de conclusies 1-13 in een werkwijze voor het produceren van een CAV eiwit, een deel daarvan of een ander eiwit dan een CAV eiwit, door in vitro of in vivo translatie.
20. Gebruik van recombinante genetische informatie volgens een van de conclusies 1-13 als kloneringsvector voor aviaire systemen.
21. Prokaryotische of eukaryotische cel, welke recombinante genetische informatie volgens een van de conclusies 1-13 bevat.
22. Prokaryotische of eukaryotische cel, welke recombinante genetische informatie volgens een van de conclusies 1-13 bevat en in staat is tot expressie van ten minste één daardoor gecodeerd eiwit of eiwitgedeelte.
23. CAV eiwit of deel daarvan, verkregen door in vitro translatie van recombinante genetische informatie volgens een van de conclusies 1-13, welke een voor het CAV eiwit of deel daarvan coderende nucleotidensequentie omvat.
24. CAV eiwit of deel daarvan, verkregen door isolatie uit een prokaryotische of eukaryotische cel, die recombinante genetische informatie volgens een van de conclusies 1-13, omvattende een voor het CAV eiwit of deel daarvan coderende nucleotidensequentie, bevat en in staat is tot expressie daarvan.
25. Gebruik van een CAV eiwit of eiwitgedeelte volgens een van de conclusies 23-24 voor diagnostische doeleinden, immunisatie-of vaccinatiedoeleinden, of voor de produktie van CAV-specifieke antilichamen.
26. Gebruik van een CAV eiwit of eiwitgedeelte volgens een van de conclusies 23-24 als CAV-specifieke antilichamen bindend reagens in een immunoassay werkwijze voor het detecteren van CAV-specifieke antilichamen, bijv. een imirmnoperoxidase kleuring, een ELISA of een immuunfluorescentie assay.
27. Diagnostische kit voor het detecteren van CAV-specifieke antilichamen in een immunoassay werkwijze zoals een immuno-peroxidase kleuring, een ELISA of een immuunfluorescentie assay, welke diagnostische kit een CAV eiwit of eiwitgedeelte volgens een van de conclusies 23-24 als CAV-specifieke antilichamen bindend reagens bevat.
28. Gebruik van een CAV eiwit of eiwitgedeelte volgens een van de conclusies 23-24 als sub-unit vaccin om bescherming tegen CAV te realiseren.
29. Vaccinpreparaat voor het immuniseren tegen CAV, welk preparaat een CAV eiwit of eiwitgedeelte volgens een van de conclusies 23-24 en eventueel een of meerdere, voor sub-unit vaccins bruikbare drager- en hulpstoffen omvat.
30. Gebruik van een CAV eiwit of eiwitgedeelte volgens een van de conclusies 23-24 in een werkwijze voor het produceren van CAV-specifieke polyclonale of monoclonale antilichamen.
31. CAV-specifieke antilichamen, opgewekt met behulp van een CAV eiwit of eiwitgedeelte volgens een van de conclusies 23-24.
32. Gebruik van CAV-specifieke antilichamen volgens conclusie 31 voor diagnostische doeleinden, immunisatie- of vaccinatie-doeleinden of voor preparatieve doeleinden.
33. Gebruik van CAV-specifieke antilichamen volgens conclusie 31 als CAV-eiwit bindend reagens in een immunoassay werkwijze voor het detecteren van CAV-eiwit.
34. Diagnostische kit voor het detecteren van CAV-eiwit in een immunoassay werkwijze, welke diagnostische kit CAV-specifieke antilichamen volgens conclusie 30 als CAV-eiwit bindend reagens bevat.
35. Gebruik van CAV-specifieke antilichamen volgens conclusie 31 voor passieve immunisatie tegen CAV-besmetting.
36. Immunisatiepreparaat voor passieve immunisatie tegen CAV, welk preparaat CAV-specifieke antilichamen volgens conclusie 31 en eventueel een of meerdere, voor passieve-immunisatie-preparaten bruikbare drager- en hulpstoffen omvat.
37. Gebruik van CAV-specifieke antilichamen volgens conclusie 31 in een werkwijze voor het isoleren en/of opzuiveren van CAV-eiwit.
NL9002008A 1990-09-12 1990-09-12 Recombinant dna en rna en daarvan afgeleide produkten. NL9002008A (nl)

Priority Applications (35)

Application Number Priority Date Filing Date Title
NL9002008A NL9002008A (nl) 1990-09-12 1990-09-12 Recombinant dna en rna en daarvan afgeleide produkten.
ZA917065A ZA917065B (en) 1990-09-12 1991-09-05 Recombinant dna and rna and products derived therefrom
IL99435A IL99435A (en) 1990-09-12 1991-09-06 Recombinant DNA and RNA and products derived therefrom
YU150891A YU49095B (sh) 1990-09-12 1991-09-11 Rekombinantna dnk i rnk i proizvodi dobijeni od njih
RU93005170A RU2146292C1 (ru) 1990-09-12 1991-09-11 Последовательность днк, гибридизационная проба, олигонуклеотид (варианты), вакцины, cav-белок (варианты), диагностические наборы и штамм e.coli
DK91917088T DK0548234T3 (da) 1990-09-12 1991-09-11 Kloning af kyllingeanæmivirus DNA
ES91917088T ES2144399T3 (es) 1990-09-12 1991-09-11 Clonado del adn de virus de anemia de los pollos.
SI9111508A SI9111508B (en) 1990-09-12 1991-09-11 Recombinant DNA and RNA and products derived therefrom
CA002091181A CA2091181C (en) 1990-09-12 1991-09-11 Cloning of chicken anaemia dna
AU86580/91A AU651999B2 (en) 1990-09-12 1991-09-11 Cloning of chicken anaemia DNA
JP3517451A JP2846116B2 (ja) 1990-09-12 1991-09-11 鶏貧血症ウィルス（ｃａｖ）組換え核酸、それを含むｃａｖ診断キット、および原核細胞または真核細胞、ならびにｃａｖ２本鎖ｄｎａの製造方法
UA93004515A UA48936C2 (uk) 1990-09-12 1991-09-11 Спосіб одержання вірусу курячої анемії (cav) у дволанцюговій формі, рекомбінантна нуклеїнова кислота (варіанти), діагностичний набір (варіанти), вакцинний препарат (варіанти), культура клітин (варіанти), спосіб одержання діагностичного набору (варіанти)
EP98202968A EP0905246A1 (en) 1990-09-12 1991-09-11 Cloning of chicken anaemia DNA
PCT/NL1991/000165 WO1992004446A1 (en) 1990-09-12 1991-09-11 Cloning of chicken anaemia dna
HU9300716A HU220102B (hu) 1990-09-12 1991-09-11 Csirkeanémiavírus-DNS, klónozása és alkalmazásai
DE69131903T DE69131903T2 (de) 1990-09-12 1991-09-11 Klonierung hühner-anaemia-virus-dna
EP91917088A EP0548234B1 (en) 1990-09-12 1991-09-11 Cloning of chicken anaemia dna
US08/030,335 US5491073A (en) 1990-09-12 1991-09-11 Cloning of chicken anaemia DNA
AT91917088T ATE188739T1 (de) 1990-09-12 1991-09-11 Klonierung hühner-anaemia-virus-dna
MX9101042A MX9101042A (es) 1990-09-12 1991-09-11 Adn y arn recombinantes y productos derivados de los mismos
US08/454,121 US6071520A (en) 1990-09-12 1994-07-19 Chicken anemia virus mutants and vaccines and uses based on the viral proteins VP1, VP2 and VP3 or sequences of that virus coding therefor
HR940668A HRP940668B1 (en) 1990-09-12 1994-10-12 Recombinant dna and rna and products derived therefrom
US08/482,161 US6162461A (en) 1990-09-12 1995-06-07 Chicken anemia virus mutants and vaccines and uses based on the viral proteins VP1, VP2 and VP3 or sequences of that virus coding therefor
US08/480,020 US5932476A (en) 1990-09-12 1995-06-07 Cloning of chicken anemia virus DNA
US08/489,666 US5922600A (en) 1990-09-12 1995-06-07 Chicken anemia virus mutants and vaccines and uses based on the viral proteins VP1 VP2 and VP3 or sequences of that virus coding therefor
US08/484,939 US6319693B1 (en) 1990-09-12 1995-06-07 Cloning of chicken anemia virus DNA
US08/485,001 US5981502A (en) 1990-09-12 1995-06-07 Methods and compositions for inducing apoptosis in tumor cells
US08/910,618 US5958424A (en) 1990-09-12 1997-08-13 Recombinant chicken anemia virus particle
US08/910,322 US6238669B1 (en) 1990-09-12 1997-08-13 Proteins encoded by chicken anemia virus DNA and diagnostic kits and vaccines employing said proteins
US09/057,963 US6217870B1 (en) 1990-09-12 1998-04-09 Chicken anemia virus mutants and vaccines and uses based on the viral proteins VP1 VP2 and VP3 or sequences of that virus coding therefor
US09/384,472 US6509446B2 (en) 1990-09-12 1999-08-27 Cloning of chicken anemia DNA
GR20000400866T GR3033173T3 (en) 1990-09-12 2000-04-07 Cloning of chicken anaemia dna.
US09/740,676 US7427658B2 (en) 1990-09-12 2000-12-18 Chicken anemia virus mutants and vaccines and uses based on the viral proteins VP1, VP2 and VP3 or sequences of that virus coding therefor
US11/238,653 US20060073160A1 (en) 1990-09-12 2005-09-28 Cloning of chicken anemia virus DNA
US11/888,039 US20080234466A1 (en) 1990-09-12 2007-07-30 Delivery method for the tumor-specific apoptosis-inducing activity of apoptin

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
NL9002008A NL9002008A (nl) 1990-09-12 1990-09-12 Recombinant dna en rna en daarvan afgeleide produkten.
NL9002008 1990-09-12

Publications (1)

Publication Number Publication Date
NL9002008A true NL9002008A (nl) 1992-04-01

Family

ID=19857669

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
NL9002008A NL9002008A (nl) 1990-09-12 1990-09-12 Recombinant dna en rna en daarvan afgeleide produkten.

Country Status (21)

Country Link
US (6) US5491073A (nl)
EP (2) EP0905246A1 (nl)
JP (1) JP2846116B2 (nl)
AT (1) ATE188739T1 (nl)
AU (1) AU651999B2 (nl)
CA (1) CA2091181C (nl)
DE (1) DE69131903T2 (nl)
DK (1) DK0548234T3 (nl)
ES (1) ES2144399T3 (nl)
GR (1) GR3033173T3 (nl)
HR (1) HRP940668B1 (nl)
HU (1) HU220102B (nl)
IL (1) IL99435A (nl)
MX (1) MX9101042A (nl)
NL (1) NL9002008A (nl)
RU (1) RU2146292C1 (nl)
SI (1) SI9111508B (nl)
UA (1) UA48936C2 (nl)
WO (1) WO1992004446A1 (nl)
YU (1) YU49095B (nl)
ZA (1) ZA917065B (nl)

Families Citing this family (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NL9301272A (nl) * 1993-07-20 1995-02-16 Aesculaap Bv Chicken Anemia Virus mutanten en vaccins en toepassingen gebaseerd op de virale eiwitten VP1, VP2 en VP3 of daarvoor coderende sequenties van dat virus.
US20030138443A1 (en) * 1993-03-08 2003-07-24 Noteborn Mathews H.M. Cloning of chicken anemia virus DNA
US20080234466A1 (en) * 1990-09-12 2008-09-25 Noteborn Mathieu H M Delivery method for the tumor-specific apoptosis-inducing activity of apoptin
US20020061296A1 (en) * 2000-09-08 2002-05-23 Noteborn Mathieu H.M. Delivery method for the tumor specific apoptosis inducing activity of apoptin
US5922600A (en) * 1990-09-12 1999-07-13 Leadd Bv Chicken anemia virus mutants and vaccines and uses based on the viral proteins VP1 VP2 and VP3 or sequences of that virus coding therefor
ZA918426B (en) * 1990-10-31 1992-12-30 Akzo Nv Chicken anemia virus vaccine and diagnostic
EP0878546A1 (en) * 1997-04-15 1998-11-18 Leadd B.V. A gene delivery vehicle expressing the apoptosis-inducing proteins VP2 and/or apoptin
US5789567A (en) * 1994-07-06 1998-08-04 Cornell Research Foundation, Inc. Chicken infectious anemia virus vaccine
GB9414888D0 (en) * 1994-07-23 1994-09-14 Univ Belfast Method and composition
JPH11510367A (ja) * 1995-06-07 1999-09-14 アエスキュラープ ビー．ヴィ． ニワトリ貧血ウイルスの中和性立体配座エピトープ
EP0954597A4 (en) * 1995-11-14 2002-05-29 William L Ragland EFFICIENT METHOD FOR DETECTING INFECTIOUS SUBSTANCE IN BLOOD
CA2301401C (en) 1997-08-12 2008-10-21 Leadd B.V. Determining the transforming capability of agents
WO1999045956A1 (en) * 1998-03-13 1999-09-16 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Vaccines against circovirus infections
PL204275B1 (pl) * 1999-09-02 2009-12-31 Leadd Bv Kwas nukleinowy kodujący apoptynę i AAP-1, kompozycja białka, wektor, komórka gospodarza, zastosowanie kwasu nukleinowego jako farmaceutyku, zastosowanie sekwencji kwasu nukleinowego do wytwarzania leku i zastowanie AAP-1 do wytwarzania leku
CA2393859A1 (en) * 1999-12-10 2001-06-14 Leadd B.V. Apoptin-associating protein
US6593134B1 (en) 2000-03-10 2003-07-15 Cornell Research Foundation, Inc. Method of propagating chicken infectious anemia virus
ATE390882T1 (de) * 2000-07-10 2008-04-15 Uni Charm Corp Reinigungsartikel
EP1199363A1 (en) * 2000-10-20 2002-04-24 Leadd B.V. Phosphorylation modifications of apoptin
EP1436001A4 (en) * 2001-09-05 2006-01-11 Biomune VACCINE AGAINST INFECTIOUS CHICKEN ANEMIA VIRUS MANUFACTURED FROM A CELL LINE
US7566548B2 (en) * 2004-08-13 2009-07-28 University Of Massachusetts Methods for identifying therapeutic agents and for treating disease
CN102636646A (zh) * 2012-05-15 2012-08-15 扬州大学 快速检测禽白血病抗原的试纸条及其制备方法

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB2042888B (en) 1979-03-05 1983-09-28 Teijin Ltd Preparation for administration to the mucosa of the oral or nasal cavity
JPS6034925B2 (ja) 1979-07-31 1985-08-12 帝人株式会社 持続性鼻腔用製剤およびその製造法
JPS6032714A (ja) 1983-08-01 1985-02-19 Teijin Ltd 鼻腔粘膜に適用するための安定化された粉末状薬学的組成物
EP0188040B1 (en) 1985-01-11 1991-08-14 Abbott Laboratories Limited Slow release solid preparation
US4683195A (en) * 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US5059587A (en) 1987-08-03 1991-10-22 Toyo Jozo Company, Ltd. Physiologically active peptide composition for nasal administration
GB8723846D0 (en) 1987-10-10 1987-11-11 Danbiosyst Ltd Bioadhesive microsphere drug delivery system
US5079005A (en) 1988-06-17 1992-01-07 Gupta Kashmiri L Time release protein
JP3339854B2 (ja) * 1988-09-13 2002-10-28 メリアル ウイルスワクチン
GB2237510B (en) 1989-11-04 1993-09-15 Danbiosyst Uk Small particle drug compositions for nasal administration
US5271961A (en) 1989-11-06 1993-12-21 Alkermes Controlled Therapeutics, Inc. Method for producing protein microspheres
ZA918426B (en) 1990-10-31 1992-12-30 Akzo Nv Chicken anemia virus vaccine and diagnostic

Also Published As

Publication number Publication date
AU651999B2 (en) 1994-08-11
JP2846116B2 (ja) 1999-01-13
IL99435A0 (en) 1992-08-18
ES2144399T3 (es) 2000-06-16
RU2146292C1 (ru) 2000-03-10
EP0548234B1 (en) 2000-01-12
HRP940668B1 (en) 2000-10-31
YU49095B (sh) 2003-12-31
EP0905246A1 (en) 1999-03-31
US6509446B2 (en) 2003-01-21
US6238669B1 (en) 2001-05-29
ZA917065B (en) 1992-05-27
WO1992004446A1 (en) 1992-03-19
HUT65974A (en) 1994-08-29
US6319693B1 (en) 2001-11-20
DE69131903D1 (de) 2000-02-17
US5958424A (en) 1999-09-28
UA48936C2 (uk) 2002-09-16
MX9101042A (es) 1992-08-10
CA2091181A1 (en) 1992-03-13
AU8658091A (en) 1992-03-30
DE69131903T2 (de) 2000-07-20
ATE188739T1 (de) 2000-01-15
HRP940668A2 (en) 1997-12-31
HU9300716D0 (en) 1993-06-28
US20020103336A1 (en) 2002-08-01
JPH06504195A (ja) 1994-05-19
US5491073A (en) 1996-02-13
HU220102B (hu) 2001-10-28
SI9111508B (en) 2001-12-31
US5932476A (en) 1999-08-03
SI9111508A (sl) 1998-10-31
DK0548234T3 (da) 2000-06-19
CA2091181C (en) 2006-02-21
GR3033173T3 (en) 2000-08-31
YU150891A (sh) 1995-10-24
IL99435A (en) 2006-10-31
EP0548234A1 (en) 1993-06-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Noteborn et al. Characterization of cloned chicken anemia virus DNA that contains all elements for the infectious replication cycle
NL9002008A (nl) Recombinant dna en rna en daarvan afgeleide produkten.
RU2389506C2 (ru) Вакцина против рсv-2
AU703187B2 (en) Chicken anemia virus mutants and vaccines and uses based on the viral proteins VP1, VP2 and VP3 or sequences of that virus coding therefor
AU2002315560B2 (en) Attenuated circovirus
AU2002315560A1 (en) Attenuated circovirus
Spackman et al. Comparison of a putative second serotype of chicken infectious anemia virus with a prototypical isolate II. Antigenic and physicochemical characteristics
KR0183368B1 (ko) 페스트바이러스 뉴클레오티드 서열 및 폴리펩티드
US20060073160A1 (en) Cloning of chicken anemia virus DNA
US6217870B1 (en) Chicken anemia virus mutants and vaccines and uses based on the viral proteins VP1 VP2 and VP3 or sequences of that virus coding therefor
US20050100552A1 (en) Chicken anemia virus mutants and vaccines and uses based on the viral proteins VP1, VP2 and VP3 or sequences of that virus coding therefor
CA2402237A1 (en) Improved methods to isolate, identify, quantify, and propagate chicken infectious anemia virus and high titer vaccine
FR2741631A1 (fr) Adn recombinant codant pour les proteines de capside du parvovirus du canard

Legal Events

Date Code Title Description
A1B A search report has been drawn up
CNR Transfer of rights (patent application after its laying open for public inspection)

Free format text: AESCULAAP B.V.

BV The patent application has lapsed