SI9111508A - Rekombinantna DNA in RNA in iz njiju izvedeni produkti - Google Patents

Rekombinantna DNA in RNA in iz njiju izvedeni produkti Download PDF

Info

Publication number
SI9111508A
SI9111508A SI9111508A SI9111508A SI9111508A SI 9111508 A SI9111508 A SI 9111508A SI 9111508 A SI9111508 A SI 9111508A SI 9111508 A SI9111508 A SI 9111508A SI 9111508 A SI9111508 A SI 9111508A
Authority
SI
Slovenia
Prior art keywords
cav
dna
protein
genetic information
nucleotide sequence
Prior art date
Application number
SI9111508A
Other languages
English (en)
Other versions
SI9111508B (en
Inventor
Matheus Hubertus Maria Noteborn
Boer Gerben Foppe De
Original Assignee
Aesculaap B.V.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Aesculaap B.V. filed Critical Aesculaap B.V.
Publication of SI9111508A publication Critical patent/SI9111508A/sl
Publication of SI9111508B publication Critical patent/SI9111508B/sl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56983—Viruses
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/10011—Circoviridae
    • C12N2750/10022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/10011—Circoviridae
    • C12N2750/10041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2750/10043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/008—Vector systems having a special element relevant for transcription cell type or tissue specific enhancer/promoter combination
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/60—Vector systems having a special element relevant for transcription from viruses
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S424/00—Drug, bio-affecting and body treating compositions
    • Y10S424/816—Viral vaccine for avian species, e.g. poultry or other birds
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/81—Packaged device or kit

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)

Abstract

Rekombinanta genetska informacija (DNA ali RNA), ki obsega nukleotidno sekvenco, specifično za virus piščančje anemije (CAV), in njena uporaba za diagnostiko, vakcinacijo ali proizvodnjo proteina. Rekombinantni protein CAV in njegova uporaba za diagnostiko, vakcinacijo ali produkcijo protiteles, specifičnih za CAV. Uporaba tako dobljenih protiteles, specifičnih za CAV.ŕ

Description

Ta izum spada v področje genetskega inženiringa (genske manipulacije) s tehnologijo rekombinantne DNA (in RNA), diagnostike in imunizacije/vakcinacije. Podrobneje se izum nanaša na odkrivanje, kloniranje in analizo sekvenc genoma DNA virusa piščančje anemije (CAV) in na uporabe, ki so s tem omogočene.
Ozadje izuma
Virus CAV, ki doslej še ni bil klasificiran, povzroča infekcijsko anemijo pri piščancih. Virus so najprej izolirali na Japonskem leta 1979 in svoje ime je dobil zaradi resne anemije, ki jo povzroča pri mladih piščancih (Yuasa et al, 1979). Drugi simptomi okužbe s CAV so atrofija kostnega mozga in razkroj limfocitov v timusu. Do poškodb pride v vranici in v jetrih.
Najdovzetnejši so enodnevni piščanci. Pri teh živalih opazimo 4 do 7 dni po inokulaciji s CAV letargijo, anoreksijo in prehodno anemijo in okoli polovica živali pogine med 2 in 3 tedni po okužbi. Z naraščajočo starostjo se poveča tudi naravna odpornost. Po okužbi v starosti 7 dni se po okužbi pojavi pri piščancih samo prehodna anemija in pri 14 dni starih živalih po okužbi sploh ne pride do anemije.
Zaščita pred okužbami s CAV in simptomi obolenja s CAV temelji v veliki meri na mehanizmih humoralne imunske obrambe. Vielitz (1989) je razvil praktično, precej učinkovito metodo za preprečevanje s pomočjo kontrolirane izpostavitve suspenzijam s CAV inficiranih jeter kokoši nesnic, s čimer pridobi potomec imunost po materi. V Nemčiji uporabljajo to metodo imunizacije v praksi, vendar izgleda, da ni popolnoma brez tveganja.
Poskusi z živalmi, izvedeni v izoliranih kokošjih farmah v Centraal Diergeneeskundig Institut (CDI) v Lelystadu, so potrdili zaščitno vrednost materinih protiteles. Tu so izvedli kontrolirano izpostavitev s CAV, razmnoženim v tkivni kulturi. Prisotnost materinih protiteles proti CAV je popolnoma preprečila razmnoževanje CAV po okužbi enodnevnih piščancev tako vakciniranih živali-mater. Tudi simptomi CAV se niso pojavili. To pasivno zaščito so dosegli tudi pri potomcih imuniziranih kokoši nesnic in tudi po vbrizganju ekstraktov rumenjakov jajc istih imuniziranih kokoši nesnic piščancem, ki so bili specifično brez patogenih povzročiteljev (SPF). Pasivna zaščita glede na okužbo s CAV z dajanjem protiteles proti CAV je trajala do starosti tednov. Potem so ugotovili, da je bila pasivna zaščita nepopolna. Ti poskusi so pokazali, da bodo imela materina protitelesa, proizvedena z vakcinacijo živali-mater, v praktičnih okoliščinah važno preventivno vlogo.
poskusi so tudi dokazali, da pride pri piščancih, ki prežive okužbo s CAV, do prehodnega izginotja specifične populacije limfocitov timusa (Jeurissen et al, 1989). Atrofija timusa je možni vzrok za imunosupresijo, ki jo povzroči CAV, kar ima za posledico, da so specifične vakcinacije, npr. proti kuiji kugi (bolezen Newcastle), manj učinkovite. CAV so večkrat izolirali v jatah s povečanimi izgubami zaradi Marekove bolezni, Gumborove bolezni (virus infekcijske bolezni burze, IBDV; Yuasa et al, 1980) in pri živalih, obolelih za boleznijo Blue Wing, v povezavi z reovirusi (Engstrom, 1988a, Engstrom et al, 1988b). Z eksperimentalnimi dvojnimi okužbami so dokazali stopnjevalne lastnosti CAV glede na druge piščančje viruse, npr. virus Marekove bolezni, MDV, De Boer et al, 1989a). Pred kratkim smo opazili pri naših lastnih poskusih izrazito ojačano reakcijo na okulacijo po aerosolni vakcinaciji z vakcino proti kurji kugi in istočasni okužbi s CAV. CAV torej privede do imunosupresivnih in stopnjevalnih učinkov na druge virusne okužbe. Te lastnosti virusa CAV verjetno povzročijo povečano pogostnost izbruhov virulentnih bolezni v praksi.
Izgleda, daje CAV razprostranjen po vsem svetu. Precej časa potem, ko seje začelo raziskovanje CAV na Japonskem, so izvedli prve izolacije CAV v Evropi, namreč
Von Bulow v Nemčiji (1983) in kasneje McNulty et al v Zedinjeni kraljevini (1990). Na Nizozemskem so prve izolacije CAV iz materiala iz ZDA, Izraela in Tunizije izvedli De Boer et al (1988). Razpoložljivi literaturni podatki kažejo, da spadajo izolati v en serotip, vendar je treba različne terenske izolate testirati glede njihove medsebojne sorodnosti in možnih razlik v patogenosti (McNulty et al, 1990). CAV se v jati širi verjetno preko iztrebkov in zraka. Vendar ima važno vlogo v epidemiologiji CAV tudi vertikalno prenašanje virusa na potomce. Prisotnost CAV so seriološko dokazali v raznih državah.
Pod pogoji tkivne kulture se CAV težko razmnožuje. Doslej povzroča CAV samo citopatološki efekt (CPE) v limfoblastoidnih celičnih linijah iz limfomov Marekove bolezni, transformiranih z MDV (celice MDCC-MSB1) ali z virusom avianske levkemije (ALV) transformiranih limfoblastoidnih celičnih linijah iz limfoidne levkoze (celice 1104-Χ5; Yuasa, 1983).
V nedavni študiji opisujejo Todd et al (1990) virusne delce (v očiščenem materialu CAV) s premerom 23,5 nm, ki se koncentrirajo pri gostoti 1,33 do 1,34 g/ml v gradientu CsCl. Virus ima en prevladujoč polipeptid (Mr: 50000) in genom obročaste enoverižne DNA z dolžino 2,3 kilobaze. Dva majhna virusa, prašičji Circovirus in virus, ki je povezan z boleznijo kljuna in perja pri papagajih, sta glede obročaste enoverižne DNA podobna CAV, vendar imata manjši genom in manjši premer virusnih delcev (Ritchie et al, 1989; Tischer et al, 1982). Dolgo je veljalo, da spada CAV k parvovirusom. Čeprav so večina parvovirusov virusi z enoverižno DNA, imajo linearno DNA, večji genom in verjetno tudi drugačno sestavo virusnih polipeptidov.
Kratek opis izuma
Splošno velja, da so celične komponente, ki so udeležene pri podvajanju in prepisovanju virusa, funkcionalne le, če ima DNA dvojnoverižno obliko. Virus, ki ima obročasto enoverižno DNA, se lahko pojavi v celici v fazi, v kateri sestoji iz dvojnoverižne DNA. In to dejstvo smo izrabili mi, izumitelji.
Izumitelji smo karakterizirali dvojnoverižno CAV DNA z dolžino 2,3 kilobaznega para v celicah 1104-Χ5 in MDCC-MSB1, okuženih s CAV, in jo klonirali v pIC-20H. DNA smo v celoti določili sekvenco (glej SEO.ID NO: 1). V diagnostičnem testu z oznamovano klonirano CAV-DNA smo lahko dokazali nukleinske kisline virusa
CAV v preparatih virusa, jeter in tkivnih kultur. Ugotovili smo, da ima CAV vse biološke in patogene lastnosti divjetipskega CAV tako v tkivni kulturi kot pri testih z živalmi.
Verižna reakcija s polimerazo (PCR) in hibridizacijski poskusi so pokazali, da ustreza CAV, ki ga najdemo na terenu, kompletni klonirani genom CAV. S Southern analizami s sondami DNA, oznamovanimi s 32P, smo dokazali, da so vsi terenski izolati vsebovali molekule DNA z dolžino 2,3 kb. Analize z restrikcijskimi encimi so pokazale, da se ujema DNA kloniranega CAV z DNA terenskih izolatov. V testu s kapljičnim nanosom (dot blot) smo dokazali, da z digoksigeninom oznamovana DNA kloniranega CAV specifično hibridizira z DNA različnih terenskih izolatov. V poskusih s PCR ob uporabi oligonukleotidov, katerih sekvenca je bila izvedena iz sekvence kloniranega CAV (SEQ. ID NO: 5), smo specifično pomnožili ali prepoznali CAV-DNA.
Podroben opis izuma
Pričujoči izum zagotavlja v prvem vidiku rekombinantno genetsko informacijo v obliki oznamovane ali neoznamovane DNA ali RNA, ki obsega nukleotidno sekvenco, specifično za virus piščančje anemije (CAV), ki se ujema ali ki je komplementarna z nukleotidno sekvenco genoma CAV ali njegovega dela.
Prednostna izvedba pričujočega izuma obstoji iz take rekombinantne genetske informacije, ki obsega nukleotidno sekvenco, specifično za CAV, ki se ujema ali ki je komplementarna z nukleotidno sekvenco, prikazano na SEQ. ID NO: 1, nukleotidno sekvenco, ki je z njo najmanj 60 %-no homologna, ali njen del.
Ta vidik izuma sestoji iz nukleinske kisline, izbrane med DNA in RNA, v kateri koli možni pojavni obliki, to je tako v obliki gole DNA ali RNA in v obliki na kakršen koli način spakirane DNA ali RNA (to je v proteinih ali virusnih delcih) ali povezane z drugimi snovmi (npr. z nosilcem ali materialom, ki deluje kot marker). DNA je lahko tako enojnoverižna kot dvojnoverižna DNA in je lahko tako v linearni kot v obročasti obliki.
Za rekombinantno genetsko informacijo v skladu z izumom je značilno, da je v njej prisotna za CAV specifična nukleotidna sekvenca. Ni treba, da bi ta, za CAV specifična sekvenca, obsegala celotni genom CAV, in za večino uporab bo s praktičnega stališča potreben in zaželen samo specifičen del.
Prva prednostna možnost je nukleotidna sekvenca, specifična za CA V, ki se ujema ali je komplementarna z nukleotidno sekvenco, ki kodira za protein CAV in ki se pojavlja v genomu CAV, ali njen del. Rekombinantno DNA, ki obsega tako kodirno sekvenco, lahko uporabimo npr. za odkrivanje informacijske RNA virusa CAV v vzorcu, ali jo lahko uporabimo npr. v okviru postopka za pripravo proteinov CAV ali njihovih delov. Besedi njihov del obsegata načelno vsak del, ki se ga da še vedno označiti kot specifičnega za CAV. Na nivoju proteina bo to za večino uporab epitop, to je antigenska determinanta, ki jo lahko prepoznajo protitelesa.
Druga možnost je, da obsega rekombinantna genetska informacija v skladu z izumom nukleotidno sekvenco, specifično za CAV, ki se ujema ali je komplementarna z nukleotidno sekvenco, ki ima regulatorno funkcijo, ki se pojavlja v genomu CAV, ali njen del. En primer je uporaba promotorskih/spodbujevalskih elementov v kombinaciji s sekvencami, ki kodirajo za protein, ki je različen od proteina CAV, npr. da omogočimo izražanje takih proteinov, ki niso proteini CAV, pri perutnini (kot piščancih) in drugih živalih, v katerih učinkujejo regulatorni signali virusa CAV.
Tako v gornjem primeru kot na splošno lahko obsega rekombinantna genetska informacija v skladu z izumom tudi nukleotidno sekvenco, ki ni izvedena iz genoma CAV. To nukleotidno sekvenco, ki ni izvedena iz genoma CAV, lahko tvori npr. nukleotidna sekvenca, izvedena iz prokariotičnega ali evkariotičnega vektorja za izražanje. Tako obsega izum možnost vključevanja sekvence, specifične za CAV, v (virusni ali nevirusni) vektor, primeren za izražanje v evkariotičnih organizmih, ali v plazmid, primeren za izražanje v bakterijah. Nadalje je tudi možno, da obsega rekombinantna genetska informacija v skladu z izumom kot nukleotidno sekvenco, ki ni izvedena iz genoma CAV, nukleotidno sekvenco, ki se ne pojavlja v genomu CAV, ki ima regulatorno funkcijo.
Vendar pa lahko sestoji nukleotidna sekvenca, ki ni izvedena iz genoma CAV, tudi iz nukleotidne sekvence, ki kodira za protein (del proteina), ki je različen od proteina CAV, npr. če uporabimo regulacijske signale CAV za izražanje takega proteina, ki ni protein CAV, (ali njegovega dela) v gostitelju, ki je dostopen virusu CAV, ali če nameravamo rekombinantno DNA uporabiti za pripravo hibridnega ali fuzijskega proteina, v katerem deluje protein CAV kot nosilec za epitop proteina, ki ni protein CAV, ali, nasprotno, protein, ki ni protein CAV, deluje kot nosilec za epitop proteina CAV.
Če nameravamo uporabiti rekombinantno genetsko informacijo v skladu z izumom v okviru postopkov za odkrivanje komplementarne DNA ali RNA v vzorcu, je lahko potrebna prisotnost oznamovalnika. Oznamovalnik, kot ga uporabljamo tukaj, je marker, primeren za uporabo z DNA ali RNA, ki omogoči ali olajša odkrivanje oznamovane DNA ali RNA. Strokovnjak pozna mnogo vrst markerjev, primernih za ta namen, kot so radioizotopi (npr. 32P), encimske molekule (npr. peroksidaze), hapteni (npr. biotin), fluorescenčne snovi, barvila, pigmenti (npr. anorganski fosforji), in markerji v obliki delcev (npr. zlati ali selenovi delci).
V drugem vidiku se izum nanaša na uporabo rekombinantne genetske informacije, kot je definirana zgoraj, zlasti za diagnostične namene, namene imunizacije ali vakcinacije ali za pripravo proteinov CAV ali proteinov, ki niso proteini CA V.
Podrobneje se npr. nanaša na uporabo rekombinantne genetske informacije v skladu z izumom kot sonde, ali primerja, ki sta specifična za CAV, v postopku za odkrivanje CAV-DNA ali -RNA, npr. v postopku nanašanja DNA/RNA v obliki lise (slot blotting), Southern prepivnanja, Northern prepivnanja, hibridizacije in situ, pomnoževanja DNA s pomočjo PCR, Sl mapiranja in ekstenzije primerja, pri čemer zaobjema izum tudi diagnostični komplet za odkrivanje CAV-DNA ali -RNA v postopku, kot je nanašanje DNA/RNA v obliki lise (slot blotting), Southern prepivnanje, Northern prepivnanje, hibridizacija in situ, pomnoževanje DNA s pomočjo PCR, Sl-mapiranje ali ekstenzija primerja, pri čemer vsebuje ta diagnostični komplet rekombinantno genetsko informacijo v skladu z izumom kot sondo ali primer, ki sta specifična za CAV.
Nadalje se nanaša na uporabo rekombinantne genetske informacije v skladu z izumom kot žive virusne vakcine za zaščito proti CAV ali drugemu patogenemu povzročitelju, pri čemer zaobjema izum tudi vakcinski pripravek za imuniziranje proti CAV ali drugemu patogenemu povzročitelju, pri čemer obsega ta pripravek rekombinantno genetsko informacijo v skladu z izumom in v danem primeru enega ali več nosilcev in adjuvansov, primernih za žive virusne vakcine.
Nanaša se tudi na uporabo rekombinantne genetske informacije v skladu z izumom kot vektorja za kloniranje, to je na uporabo CAV-DNA kot nekakšnega evkariotičnega plazmida za avianske sisteme, v katerih so genski fragmenti vgrajeni v popolni ali skoraj popolni genom CAV.
Obsega tudi uporabo rekombinantne genetske informacije v skladu z izumom v pos7 topku za pripravo proteina CAV, njegovega dela ali proteina, ki je različen od proteina CAV, s prevajanjem in vitro ali in vivo. Isto velja za prokariotično ali evkariotično celico, ki vsebuje rekombinantno genetsko informacijo, kot je definirana zgoraj, in zlasti za prokariotično ali evkariotično celico, ki je sposobna izražanja vsaj enega proteina ali dela proteina, ki ga kodira rekombinantna genetska informacija v skladu z izumom. Te različne možnosti bomo bolj obširno razložili nižje v tem opisu.
Naslednji vidik izuma se nanaša na protein CAV ali njegov del, dobljen z in vitro prevajanjem rekombinantne genetske informacije v skladu z izumom, ki obsega nukleotidno sekvenco, ki kodira za protein CAV ali njegov del, kot tudi protein CAV ali njegov del, dobljen z izolacijo iz prokariotične ali evkariotične celice, ki vsebuje rekombinantno genetsko informacijo v skladu z izumom, ki obsega nukleotidno sekvenco, ki kodira za protein CAV ali njegov del in ki je sposobna za njegovo izražanje.
Na nivoju proteina zaobjema izum tudi različne uporabe, zlasti uporabo proteina CAV ali dela proteina v skladu z izumom za diagnostične namene, za imunizacijske ali vakcinacijske namene ali za proizvodnjo protiteles, specifičnih za CAV.
Konkretneje, izum obsega uporabo proteina CAV ali dela proteina, kot je definiran zgoraj, kot reagenta, ki veže za CAV specifična protitelesa, v postopku imunskega testa za odkrivanje za CAV specifičnih protiteles, npr. z obarvanjem z imunoperoksidazo, s testom ELISA ali z imunofluorescenčnim testom, in temu ustrezno diagnostičnega kompleta za odkrivanje za CAV specifičnih protiteles v postopku imunskega testa, kot je obarvanje z imunoperoksidazo, test ELISA ali imunofluorescenČni test, pri čemer obsega ta diagnostični komplet protein CAV ali del proteina v skladu z izumom kot reagent, ki veže za CAV specifična protitelesa.
Izum obsega tudi uporabo proteina CAV ali dela proteina, kot je definiran zgoraj, kot vakcine, ki obsega le podenoto, za zaščito proti CAV kot tudi vakcinskega pripravka proti CAV, pri čemer obsega ta pripravek protein CAV ali del proteina v skladu z izumom in v danem primeru enega ali več nosilcev in adjuvansov, primernih za vakcine, ki obsegajo le podenoto.
Uporaba proteina CAV ali dela proteina, kot je definiran zgoraj, v postopku za proizvodnjo za CAV specifičnih poliklonalnih ali monoklonalnih protiteles spada tudi k možnostim, ki so v okviru izuma. Vse te uporabe bomo bolj obširno razložili nižje v tem opisu.
V nadaljnjem vidiku se izum nanaša tudi na protitelesa, specifična za CA V, proizvedena s pomočjo proteina CAV ali dela proteina, kot je definiran zgoraj, kot tudi na različne uporabe takih, za CAV specifičnih protiteles, npr. za diagnostične namene, imunizacijske ali vakcinacijske namene ali za preparativne namene.
Bolj konkretno se nanaša na uporabo za CAV specifičnih protiteles v skladu z izumom kot reagenta za vezavo proteina CAV v postopku imunskega testa za odkrivanje proteina CAV, kot tudi diagnostičnega kompleta za odkrivanje proteina CAV v postopku imunskega testa, pri čemer vsebuje ta diagnostični komplet za CAV specifična protitelesa v skladu z izumom kot reagente za vezanje proteina CAV.
Nadaljnji primer je uporaba za CAV specifičnih protiteles v skladu z izumom za pasivno imunizacijo proti okužbi s CAV kot tudi imunizacijski pripravek za pasivno imunizacijo proti CAV, pri čemer obsega ta pripravek za CAV specifična protitelesa v skladu z izumom in v danem primeru enega ali več nosilcev in adjuvansov, primernih za pripravke za pasivno imunizacijo. Specifično gre za imunizacijo kokoši nesnic z rekombinantnimi produkti v skladu z izumom.
Kar se tiče preparativnih uporab, je en primer uporaba za CAV specifičnih protiteles v skladu z izumom v postopku za izoliranje in/ali čiščenje proteina CAV. Najvažnejše uporabe bomo bolj obširno razložili v sledečem podrobnem opisu izuma.
Primeri
Analiza nizkomolekulske DNA, izolirane iz celic, okuženih s CAV.
Izkazalo se je, da je genom CAV, izoliran iz očiščenega virusnega preparata, molekula obročaste enojnoverižne DNA z dolžino okoli 2300 baz (Todd et al, 1990). Domnevali smo, da se nahaja v celicah, okuženih s CAV, poleg obročaste enojnoverižne virusne DNA tudi obročasta dvojnoverižna CAV-DNA. Dvojnoverižno DNA se da razrezati z restrikcijskimi encimi in zato se jo da v nasprotju z enojnoverižno DNA direktno klonirati. Glede na to smo raziskali, ali se v nizkomolekulski frakciji celic, okuženih s CAV, nahaja produkt DNA, ki je bil v neokuženih celicah odsoten.
Nizkomolekulsko DNA smo izolirali iz celic MDCC-MSB1 in 1104-Χ5, okuženih s CAV, in iz neokuženih celic 1104-Χ5. DNA smo frakcionirali na agaroznem/etidium bromidnem gelu. V gelu je bila vidljiva zelo šibka lisa DNA z (izmerjeno) dolžino okoli 3 kilobaznih parov (kbp). Ta specifični produkt DNA je bil odsoten v DNA, izlirani iz neokuženih celic.
Večjo verjetnost, da je bila specifična DNA prisotna samo v celicah, okuženih s CAV, smo dokazali s tem-le poskusom: DNA, izolirano iz okuženih celic, smo ločili po dolžini s pomočjo agaroznega gela. Izolirali smo DNA z dolžino 2,7 do 3,5 kbp. Ta frakcija DNA naj bi vsebovala poleg drugih celičnih DNA specifično virusno DNA. Izolirano DNA smo radioaktivno oznamovali in z njo hibridizirali po Southernu prepivnano nizkomolekulsko DNA iz celic, okuženih s CAV, in iz neokuženih celic. Na višini 3 kbp je v prepivku celic, okuženih s CAV, hibridiziral produkt DNA, ki je bil odsoten v prepivku DNA neokuženih celic.
Dolžino 3 kbp smo določili z markerji DNA, ki sestoje iz molekul dvojnoverižne linearne DNA. V agaroznem gelu je obnašanje molekule obročaste dvojnoverižne DNA drugačno kot obnašanje fragmentov linearne DNA. DNA s 3 kbp iz celic, okuženih s CAV, bi bila lahko linearna oblika DNA, ki ima v resnici dolžino 2,3 kbp.
Če razgradimo obročasto dvojnoverižno DNA z restrikcijskim encimom, ki zareže v molekulo DNA samo enkrat, mora nastati molekula linearne DNA z (izmerjeno) dolžino 2,3 kbp.
Da je ta domneva pravilna, smo dokazali tako, da smo ločeno inkubirali nizkomolekulsko DNA, izolirano iz celic 1104-Χ5, okuženih s CAV, s šestimi različnimi restrikcijskimi encimi (BamHI, EcoRI, Hindlll, KpnI, Pstl in Xbal). Southern prepivek nizkomolekulske DNA, izolirane iz celic 1104-Χ5, okuženih s CAV, in razrezane z gornjimi restrikcijskimi encimi, smo hibridizirali z gornjo radioaktivno oznamovano sondo DNA. To je pokazalo, da je imela obdelava z restrikcijskimi encimi BamHI, EcoRI, Pstl in Xbal za posledico molekulo DNA z izmerjeno dolžino 2,3 kbp. DNA neokuženih celic, inkubiranih z BamHI, ni vsebovala tega produkta DNA. Restrikcijski encim Hindlll je dvakrat zarezal v DNA, KpnI pa je ni rezal.
Iz gornjih poskusov lahko sklepamo, da se pojavlja v nizkomolekulski DNA celic, okuženih s CAV, molekula obročaste DNA z dolžino 2,3 kbp, ki je v neokuženih celicah odsotna, in da je to genom CAV v obliki molekule obročaste dvojnoverižne DNA.
Kloniranje in subkloniranje dvojnoverižne CAV-DNA v bakterijski vektor.
Nizkomolekulsko DNA celic 1104-Χ5, okuženih s CAV, smo ločeno inkubirali z BamHI, EcoRI, Pstl in Xbal. DNA smo ločili na agaroznem gelu z nizkim tališčem. Iz vseh štirih preparatov DNA smo izolirali molekulo DNA z dolžino 2,3 kbp. Klonirni vektor pIC-20H smo ločeno razgradili z istimi štirimi restrikcijskimi encimi, s katerimi smo razrezali nizkomolekulsko DNA. Linearni vektor smo obdelali s telečjo črevesno alkalno fosfatazo. Vsak fragment DNA z dolžino 2,3 kbp smo zvezali na ustreznem mestu za restrikcijski encim na pIC-20H. Produkte vezanja smo transfektirali v sev E. coli HB101. Vsa 4 kloniranja so dala plazmide, ki so vsebovali vključke DNA z dolžino okoli 2,3 kbp. Nadaljnja analiza z restrikcijskim encimom je pokazala, da je najmanj 7 plazmidov vsebovalo isti fragment DNA. Mesto vključitve v vektorju pa je bilo zaradi uporabe različnih encimov za odpiranje obročaste molekule različno. S pomočjo restrikcijskih encimov BamHI, EcoRI, Pstl in Xbal smo določili restrikcijsko encimsko mapo vseh štirih klonov CAV-DNA.
Štiri različne plazmide CAV-DNA smo radioaktivno oznamovali in hibridizirali s Southern prepivnanjem z BamHI razgrajene DNA, izolirane iz celic, okuženih s CAV, in iz neokuženih celic. Vsi testirani kloni so hibridizirali samo z molekulo DNA z dolžino 2,3 kbp, ki je prisotna v DNA celic, okuženih s CAV.
Biološka aktivnost dveh klonov CAV-DNA.
Dva klona CAV, pIC-20H/CAV-EcoRI in pIC-20H/CAV-PstI, smo razgradili z restrikcijskimi encimi tako, da smo CAV-DNA popolnoma odrezali od vektorja. Molekule linearne CAV-DNA smo obdelali s T4-DNA ligazo. S tem smo linearne CAV-DNA sklenili v obroč. Klonirana CAV-DNA je imela sedaj dvojnoverižno obročasto obliko, ki jo ima tudi divjetipska CAV-DNA v okuženih celicah. Celice MDCC-MSB1 in 1104-Χ5 smo transfektirali s kloniranimi obročastimi CAV-DNA. Za klon pIC-20H/CAV-EcoRI smo v obeh celičnih tipih ugotovili zelo jasen citopatogeni učinek (CPE). Klon pIC-20H/CAV-PstI je povzročil zelo jasen CPE v celicah MDCC-MSB1 in manj jasen CPE v celicah 1104-Χ5. Vendar pa so supernatanti celic 1104-Χ5, transfektiranih s pIC-20H/CAV-PstI, povzročili jasen CPE v celicah MDCC-MSB1. Transfekcije z DNA, izolirano iz celic, okuženih s CAV, so tudi povzročile jasen CPE v celicah MDCC-MSB1, medtem ko je bil v celicah 1104X5 opazen manj jasen CPE. Po transfekciji celic MDCC-MSB1 ali 1104-Χ5 z vektorjem pIC-20H DNA nismo dobili CPE.
Southern analiza je pokazala, daje bila v celičnih lizatih celic MDCC-MSB1 in 1104X5, okuženih z virusom (pasaža 6), dobljenih s klonirano CAV-DNA, prisotna CAV-DNA.
Nevtralizacijski test s celicami MDCC-MSB1 je pokazal, da je bil CPE, ki ga je povzročila klonirana DNA v transfektiranih celicah, posledica okužbe s CAV. Nevtraliziranje protiteles, usmerjenih proti CAV, je preprečilo CPE celic MDCCMSB1, okuženih s CAV-potomstvom transfektiranih celic.
Enodnevnim piščancem smo intramuskularno vbrizgali supernatant transfektiranih celic. Pri piščancih so supernatanti povzročili isto klinično sliko kot divjetipski CAV: zapoznelo rast, ki je razvidna iz razlik v skupni telesni masi, bled kostni mozeg in zmanjšane vrednosti hematokrita (anemija), atrofija timusa (zmanjšanje specifične populacije celic T) in smrtnost. Supernatanti celic, transfektiranih z vektorsko DNA, niso povzročili bolezenskih simptomov pri piščancih kontrole.
Analiza sekvenc genoma dvojnovijačne CAV-DNA.
V celotnem genomu dvojnovijačne CAV-DNA smo določili vse sekvence s pomočjo Sangerjeve metode (Sanger et al, 1977) in Maxam-Gilbertove metode. S pomočjo primerja za določanje sekvence M13 in primerja za določanje sekvenc v obratni smeri M13 smo določili sekvenco DNA okoli 2100 baz 4 klonov pIC-20H/CAV (BamHI; EcoRI; Pstl; Xbal). Nato smo subklonirali genom CAV. Od petih različnih subklonov genoma CAV-DNA smo določili sekvenco DNA po Sangerjevi metodi s pomočjo primerjev M13 in/ali po Maxam-Gilbertovi metodi. Na ta način smo določili sekvenco DNA obeh verig genoma CAV.
Dolžina (dvojnoverižne) DNA virusa CAV je 2319 bp. Prvo bazo mesta EcoRI obročastega genoma CAV oštevilčimo s +1. Sekvenca verige DNA, ki vsebuje večino/največji odprti bralni okvir, je prikazana s SEQ. ID NO: 1 in jo imenujemo (+)-verigo. Sestava baz te verige je 25,5 % adenina, 28,7 % citozina, 27,7 % gvanina in 18,1 % timina. Računalniške raziskave o možni homolognosti genoma CAV z že znanimi virusnimi sekvencami so pokazale, da DNA še ni bila opisana in da ni tvorila dela kakšne prej opisane skupine virusov. Prvotna domneva, da je CAV parvovirus, ne drži več, v kolikor gre za sekvenco in obliko genoma CAV-DNA (obročasta).
S pomočjo računalniških raziskav smo karakterizirali organizacijo genoma CAV. Napovedani so odprti bralni okviri, promotorski/spodbujevalski elementi, signal in mesto poliadenilacije in izvor podvajanja. Sl. 1 - sl. 3 kažejo napovedane odprte bralne okvire, večje od 300 baz, za obe verigi DNA virusa CAV. Sl. 1 kaže odprte bralne okvire, začenši s kodonom ATG. Kodon ATG je začetni kodon, ki se najpogosteje uporablja za proteine. Omembe vredno je, da ena od obeh verig DNA kodira za 3 proteine z dolžino 449 aminokislin (51,6 kDa), 216 aminokislin (24 kDa) in 121 aminokislin (13,3 kDa). Todd et al (1990) so dokazali v očiščenem CAV protein s 50 kDa. Če so dejansko uporabljeni vsi odprti bralni okviri, se prevede v protein okoli 80 % virusnega genoma. Nekatera področja se celo podvojijo. Popolnoma možno je, da so 3 odprti bralni okviri prevedeni iz 1 RNA. Napovedani začetek molekule RNA je v legi 354 in poli(A) adicija v legi 2317. Edini poli(A) signal je v legi 2287 plus verige.
Malo je verjetno, da so odprti bralni okviri uporabljeni pri drugi verigi DNA, ker tej verigi manjkajo nekatere bistvene regulacijske sekvence. Sl. 2 in 3 kažeta odprte bralne okvire, ki uporabljajo CTG oz. GTG kot začetni kodon. Vendar je opisano le za malo proteinov, da so ti začetni kodoni dejansko uporabljeni (Hann et al, 1988).
Računalniške raziskave o podobnostih med posebnimi proteini CAV in že znanimi proteini so pokazale le omejeno homologijo na sekvencah, ki so prisotne v programih, ki so na razpolago. Zato je težko napovedati, kakšni vrsti proteinov so podobni proteini CAV, Sorazmerno blizu so proteini virusne kapside, proteini, ki vežejo DNA, in proteini za koagulacijo krvi. Rezultati tukaj niso navedeni.
Izražanje proteinov regulirajo elementi promotorja/spodbujevalca (Jones, 1990). Evkariotični promotor leži najpogosteje prav pred začetkom prepisa. Sekvenca CAV vsebuje navzgorno od mesta modifikacije (cap) splošne elemente: boks TATA, boks SPI in boks CAAT. Sekvenca in lega teh boksov se izvrstno ujema s tistimi, ki so opisani pri večini evkariotičnih promotorjev (tabela 1). Okoli lege 285 so lahko mesta vezave za štiri različne faktorje za prepisovanje: CREB, MLTF, GT in PEA-I.
Evkariotični gen vsebuje tudi elemente spodbujevalca, ki določajo moč evkariotičnega promotorja. Možni elementi spodbujevalca je pet direktnih ponovitev, ki imajo vse dolžino 21 nukleotidov in ki leže med legama 144 in 260. Vse ponovitve imajo 19 identičnih nukleotidov. Samo zadnja dva nukleotida sta različna. Ponovitev 1 je identična z 2 in 3 je enaka 5. Ponovitve J, 2 in 3 se nahajajo druga ob drugi podobno kot 4 in 5. Med ponovitvama 3 in 4 je presledek z 12 nukleotidi.
Računalniška raziskava kaže, da noben opisani (evkariotični) spodbujevalec ne vsebuje vseh sekvenc, ugotovljenih za verjetne elemente spodbujevalca CAV. Vse direktne ponovitve vsebujejo element ATF, ki je lahko vpleten v povečanje pri prepisovanju ribonukleinskih kislin CAV. Direktne ponovitve vsebujejo dvakrat sekvenco CATCC in dvakrat sekvenco CAGCC. Zadnja sekvenca se prekriva z boksom CAAT. Te štiri sekvence se samo enkrat ne ujemajo z boksom CACCC, opisanim za β-globin (tabela 1).
SEQ. ID NO: 2, SEQ. ID NO: 3 in SEQ. ID NO: 4 prikazujejo, da so približno med legama 55 in 135 in med legama 2180 in 2270 plus verige DNA prisotne zelo velike lasnične strukture v (enojnoverižni) obliki DNA virusa CAV. Lasnične strukture v DNA so lahko vpletene pri podvajanju CAV-DNA. Lasnice med 2180 in 2270 so lahko prisotne ne le v CAV-DNA, temveč tudi v CAV-RNA, in verjetno imajo določeno vlogo pri stabilnosti CAV-RNA.
Različne oblike DNA virusa CAV v okuženih celicah.
V Southern prepivku preparata DNA iz celic, okuženih s CAV, so vidne štiri različne molekule CAV-DNA. DNA smo hibridizirali z radioaktivno oznamovano DNA klona pIC-20H/CAV-EcoRI. Molekule CAV-DNA so glede njihovih izmerjenih dolžin in oblik v agaroznem gelu, ki ne povzroča denaturiranja, oz. občutljivosti za sl nukleazo, dvojnoverižni odprti obroči (3 kbp), superzvita dvojnoverižna DNA (2 kbp), obročasta enojnoverižna DNA (0,8 kbp) in enojnoverižna linearna DNA (1,5 kbp). Včasih je vidna tudi linearna dvojnoverižna oblika DNA virusa CAV (2,3 kbp). Todd et al (1990) so izmerili za obročasto enojnoverižno DNA iz izoliranega CAV na osnovi elektroforetske gibljivosti v agaroznem gelu, ki ne povzroča denaturiranja, dolžino 0,8 kbp.
Odkrivanje CAV-DNA v virusnih preparatih.
Iz CAV smo izolirali celokupno DNA in jo očistili v skladu z metodo, ki jo je opisal Von Biilow (1989). Preparat DNA smo analizirali v Southern analizi z oznamovano sondo CAV-DNA, ki vsebuje celotno klonirano sekvenco CAV. DNA, izolirana iz očiščenega CAV, vsebuje molekulo DNA z dolžino 0,8 kbp, izmerjeno v agaroznem gelu, ki ne povzroča denaturiranja. V Southern analizi DNA, izolirane iz očiščenega
CAV, z oligonukleotidi, izvedenimi iz klonirane sekvence CAV-DNA kot sondami, smo dokazali, da je v virusu vsebovana minus veriga DNA. Iz tega lahko sklepamo, da je enojnoverižna DNA virusa CAV v kapsidi minus veriga.
Southern analiza DNA iz terenskih izolatov CAV.
Preparate DNA smo pripravili iz izolatov CAV, dobljenih iz piščancev iz jat, v katerih se je pojavila Marekova bolezen v povečanem obsegu. Preparate DNA iz izolatov CAV, dobljenih v 12 firmah na Nizozemskem, smo neselektivno zbrali iz zbirke 60 vzorcev. Samo v eni firmi so poročali o večji smrtnosti zaradi Marekove bolezni. Poleg tega je izviral en izolat CAV iz pegatke. Izolate CAV, ki smo jih preiskali, smo dobili predvsem potem, ko je veterinarska zdravstvena služba pri pregledu ugotovila atrofijo timusa.
Z namenom, da bi preučili stopnjo podobnosti med klonirano CAV-DNA (pIC20H/CAV-EcoRI) in DNA iz različnih terenskih izolatov CAV, smo celice MDCCMSB1 okužili z izoliranimi sevi CAV. Izvedli smo Southern analizo. Vsi preparati DNA so vsebovali molekule DNA, ki so specifično hibridizirale s klonirano CAVDNA, oznamovano s 32P. Molekule DNA različnih terenskih izolatov CAV imajo dolžine, ki ustrezajo dolžinam kloniranega CAV in so dvojnoverižne ali enojnoverižne. Z analizami s Southern prepivnanjem, ki smo jih izvedli direktno na vzorcih tkiva piščancev s terena, okuženih s CAV, smo ugotovili, da vsebujejo ti vzorci molekule DNA, ki so hibridizirale z oznamovanim pIC-20H/CAV-EcoRI.
Restrikcijska encimska analiza DNA iz terenskih izolatov CAV.
Podobnost DNA iz različnih terenskih izolatov CAV s kloniranim genomom CAV smo še nadalje raziskali s pomočjo restrikcijske encimske analize. Preparata DNA iz izolatov CAV in iz kloniranega CAV smo ločeno razrezali s sedmimi restrikcijskimi encimi. Pokazalo se je, da so encimi BamHi, Bgll. Sstl in Xbal razrezali vse deoksiribonukleinske kisline identično. DNA iz večine terenskih izolatov je vsebovala dve mesti AccI in/ali dve mesti Hindlll. medtem ko je DNA iz samo nekaj izolatov vsebovala mesto EcoRI. Na sl. 4 so povzete restrikcijske encimske mape kloniranega CAV in različnih terenskih izolatov. Za vsako mesto restrikcijskega encima je v oklepaju navedeno število terenskih izolatov, ki vsebujejo relevantno mesto.
Verižna reakcija s polimerazo (PCR) DNA iz terenskih izolatov CA V.
Sintetizirali smo oligonukleotida CAV-1 in CAV-2 (SEQ. ID NO: 5), izvedena iz klonirane sekvence CAV-DNA. Ob uporabi teh sintetičnih oligonukleotidov smo izvedli PCR, da bi specifično dokazali DNA iz terenskega CAV. DNA, izolirano iz celic MDCC-MSB1, okuženih z različnimi izolati CAV, in DNA, izolirano iz neokuženih celic, smo pomnožili. Po pomnoževanju DNA smo DNA elektroforetsko ločili po dolžini na agaroznem/etidium bromidnem gelu. V vseh vzorcih DNA iz celic, okuženih z različnimi izolati CAV, je bila vidna pomnožena lisa s 186 bp (to je teoretično pričakovana vrednost). Ta specifična lisa ni bila prisotna po pomnoževanju DNA, izolirane iz neokuženih celic. Lise pomnožene DNA iz vseh terenskih izolatov so pokazale v agaroznem gelu identično potovalno hitrost. Ta rezultat pomeni, da v tem delu genoma različnih terenskih izolatov CAV ne pride do večjih delecij ali insercij. Southern analiza z oligonukleotidom CAV-3, oznamovanim s 32P (SEQ. ID NO: 5), je pokazala, da je pomnožena DNA s 186 bp specifična za CAV in da s sondo CAV-3 ni hibridizirala nobena druga lisa DNA.
Preiskali smo občutljivost odkrivanja CAV-PCR. DNA smo izolirali iz celic, okuženih s CAV, postopno razredčili, pomnožili in analizirali na agaroznem/etidium bromidnem gelu. Po pomnoževanju vzorcev, ki vsebujejo množino DNA, ki ustreza množini DNA v okoli 100 celicah, okuženih s CAV, smo dokazali fragment DNA s 186 bp, ki je specifičen za CAV. Če pa smo s pomnoženo DNA izvedli Southern analizo CAV-3 DNA, oznamovane s 32P, smo ugotovili, da ima že množina DNA, ki ustreza DNA iz 1 celice, za posledico jasno vidno liso DNA specifične za CAV. PCR CAV je zelo občutljiva metoda odkrivanja, ki je specifična za doslej preiskane izolate CAV.
Analiza s kapljičnim nanosom (dot blot) DNA iz terenskih izolatov CAV s sondami CAV-DNA, oznamovanimi z digoksigeninom.
Poleg PCR smo razvili test za odkrivanje DNA iz terenskih izolatov CAV. Ta test ne uporablja radioaktivnih sond. Vključek CAV-DNA klona pIC-20H/CAV-EcoRI smo oznamovali z 11-dUTP-digoksigeninom. Preparate DNA iz celic MDCC-MSB1, ki smo jih ločeno okužili z različnimi izolati CAV, smo nanesli na filter in analizirali glede njihove sposobnosti, da hibridizirajo s sondo DNA, oznamovano z digoksigeninom. Preparati DNA iz celic MDCC-MSB1, okuženih z različnimi izolati CAV, so hibridizirali s sondo z digoksigeninom oznamovane DNA, medtem ko DNA iz kultur neokuženih celic ni hibridizirala. Ta test, ki uporablja neradioaktivno oz16 namovano sondo CAV DNA, je zato primeren za odkrivanje DNA iz terenskih izolatov CAV.
Uporabe
DNA.
CAV sekvence, npr. plazmidne DNA pIC-20H/CAV-EcoRI, ali njenih delov lahko uporabimo za dokaz CAV-DNA in/ali -RNA v preparatih, ki jih je treba preiskati za raziskovalne in diagnostične namene. DNA lahko oznamujemo radioaktivno ali na drug način, npr. z biotinom/digoksigeninom. S pomočjo nanašanja v obliki lis (slot blots) DNA/RNA, Southern/Northern analiz in hibridizacij in vitro lahko dokažemo prisotnost nukleinskih kislin CAV. Deli sekvenc CAV, kot jih uporabljamo tukaj, so tudi oligomeri DNA.
Oligomere, izvedene iz sekvenc CAV klona pIC-20H/CAV-EcoRI, lahko uporabimo v verižni reakciji s polimerazo (PCR), da zasledimo zelo nizke koncentracije CAV DNA/RNA. PCR je zelo občutljiva metoda, ki se pogosto uporablja za odkrivanje virusov.
V praksi so možni diagnostični kompleti, ki temelje na gornjih uporabah.
Za raziskovalne namene so važne tehnike, kot SI mapiranje in ekstenzija primerja s fragmenti CAV-DNA. S tema dvema metodama lahko CAV-RNA kvantificiramo in dalje karakteriziramo.
Za študij genskih funkcij lahko uporabimo oligomere v nasprotnosmiselni konfiguraciji. Ti lahko rabijo tudi kot model za študij novih metod za preprečevanje razmnoževanja virusov.
CAV-DNA lahko uporabimo kot nosilec pri transfekciji majhnih genskih fragmentov, zlasti če smo v genomu CAV patogene lastnosti odstranili z delecijo.
Oligomere CAV v nasprotnosmiselni konfiguraciji lahko izrazimo v virusnih vektorjih, s čimer je omogočeno preučevanje podvajanja CAV ali drugih genskih funkcij v živem bitju ali in vitro.
RNA.
Fragmenti CAV-DNA, klonirani v vektorje Sp6/T7, imajo za posledico produkte CAV-RNA. CAV-RNA, dobljene z in vitro prepisovanjem, lahko uporabimo za in vitro/in vivo sintezo proteinov CAV. Tako lahko prevedemo molekule RNA, npr. v ekstraktu pšeničnih kalčkov, v proteine (prevajanje in vitro). Proteine CAV, dobljene s prevajanjem in vitro, lahko nato uporabimo npr. za iskanje protiteles, usmerjenih proti CAV v serumih piščancev (glej niže). Molekule CAV-RNA lahko tudi vrinemo v celice z mikroinjekcijo, da jih v celicah prevedemo v proteine. Tako lahko preučujemo učinke proteinov CAV na nivoju celice. Analiziramo lahko tudi vzajemno delovanje protein/protein in/ali protein/DNA.
CAV RNA lahko uporabimo tudi kot sonde za iskanje nukleinskih kislin CAV v preparatih. Analize lahko izvedemo s pomočjo analiz z nanašanjem v obliki lise (slot blot), Southern, Northern in hibridizacije in situ. Te metode lahko uporabimo za razvijanje diagnostičnih testov za CAV.
Proteini.
Vse proteine CAV lahko izrazimo v prokariotičnih ali v evkariotičnih sistemih. Za to je potrebno, da ugotovljene odprte bralne okvire CAV kloniramo v primeren vektor za izražanje. Za bakterijski sistem je za izražanje odprtih bralnih okvirov CAV primeren vektor za izraženje, ki temelji na promotorju T7. Možni evkariotični sistemi za izražanje so sistem bakulovirusa, kvas in sistem CHO-dhfr. V ta namen so primerni tudi virusni vektorji, kot retrovirusni vektorji.
Proteine CAV ali epitope, ki se nahajajo na njih, lahko uporabimo za odkrivanje protiteles, usmerjenih proti CAV. Tako lahko odkrijemo piščance, okužene s CAV. Proteine CAV ali epitope, ki se nahajajo na njih, lahko uporabimo v imunskih testih, kot obarvanjih z imunoperoksidazo, testih ELISA in imunofluorescenčnih testih.
Proteine CAV ali epitope, ki se nahajajo na njih, lahko uporabimo, da zagotovimo humoralno in/ali na celico vezano imunost proti CAV. Proteine CAV, dobljene z izražanjem v evkariotskih in prokariotskih sistemih vektor/gostitelj, lahko uporabimo za uporabo v vakcinah, ki obsegajo le podenoto.
S pomočjo proteinov CAV ali epitopov, ki se nahajajo na njih, lahko dobimo za CAV specifična protitelesa, kar omogoča, da ugotovimo proteine CAV v preparatih piščancev, okuženih s CAV (glej niže).
Protitelesa.
V več infekcijskih testih smo pri mladih piščancih lahko potrdili, da lahko materina protitelesa zagotove učinkovito pasivno zaščito proti okužbam s CAV. Materina protitelesa so prejeli mladi piščanci po prirodni poti kot tudi preko injekcije ekstraktov jajčnega rumenjaka, ki vsebujejo protitelo proti CAV, pravkar izleženim piščancem. Pasivno zaščito proti okužbi s CAV smo zagotovili tudi s pomočjo vbrizganja ekstraktov iz jajčnega rumenjaka jajc kokoši nesnic, ki smo jih tik pred dobo nesnosti okužili s CAV.
Vakcinacija kokoši nesnic s proteini CAV, izraženimi v enem od gornjih sistemov za izražanje, bo imela za posledico tvorbo materinih protiteles. Mladi piščanci teh kokoši nesnic bodo zaščiteni pred okužbo s CAV.
Na osnovi protiteles proti CAV lahko razvijemo diagnostične teste. V ta namen lahko uporabimo tako poliklonalna kot monoklonalna protitelesa. S pomočjo protiteles, specifičnih za CAV, lahko preiščemo preparate na prisotnost proteinov CAV.
Gornje uporabe protiteles proti CAV so možne za protitelesa v skladu z izumom, dobljena po tukaj opisanih postopkih, enako kot za naravna protitelesa proti CAV.
Žive virusne vakcine.
Verjetno je, da bo imelo oskrbovanje imunskega sistema z virusnimi proteini s pomočjo vektorja živega virusa za posledico boljši imunski odziv kot vakcina, ki obsega le podenoto. V vektorje živega virusa lahko kloniramo enega ali več odprtih bralnih okvirov CAV (v celem ali deloma). Pri perutnini lahko uporabimo samo vektorje živega virusa, ki sami kažejo dobro podvajanje v avianskem sistemu. Kot vektorji za uporabo pri piščancih so primerni npr. kurji poksvirus, vektorji retrovirusov, vektorji herpesvirusa (avianski herpesvirus, serotipi 1, 2 in 3) in virus nalezljivega laringotraheitisa in morebiti tudi adenovirusi, kot CELO. Imunizacija z gornjimi vek19 torji živega virusa ščiti pred CAV in virusom-nosilcem.
Z uporabo ene ali več delecij v genomu CAV lahko razvijemo vakcine, ki imunizirajo proti okužbam s CAV pri mladih piščancih. Če uporabimo delecije, je treba odstraniti patogeni značaj okužbe s CAV, ohraniti pa je treba podvojitvene in zato imunizirne lastnosti.
Tudi iz genoma CAV samega lahko napravimo primeren živ virusni vektor za izražanje antigenov drugih virusov. To zahteva, da spremenimo genom CAV tako, da izraža poleg ali namesto proteinov CAV proteine tujega virusa. Zato lahko skonstruiramo take vektorje CAV, da bo prišlo do zaščite samo proti tujim virusom ali tudi proti CAV, kar je odvisno od izražanja virusnih proteinov s strani rekombinantnega vektorja v vakcinirani živali.
Vakcine CAV, proizvedene kot vakcina, ki obsega le podenoto, vakcina z delecijo ali genski fragment v vektorju drugega virusa, bomo v glavnem uporabljali za vakciniranje kokoši nesnic. Vendar ostaja kot možna uporaba izuma tudi vakcinacija piščancev v mlajši dobi, npr. v kombinaciji z vakcinacijo proti Marekovi bolezni.
Spodbujevalni/promotorski elementi.
Promotorske in spodbujevalne elemente CAV lahko kloniramo v vektorje DNA. Z regulacijo promotorja/spodbujevalca CAV lahko v piščančjih celicah in v celicah drugačne vrste izrazimo proteine CAV ali tuje proteine.
Možno je, da deluje promotor CAV v celicah (piščančjega) kostnega mozga. Kot modelni sistem za gensko terapijo lahko tuje proteine izražamo in vitro v celicah kostnega mozga s pomočjo promotorskih/spodbujevalnih elementov CAV, v danem primeru v kombinaciji z retrovirusnimi vektorji. Genetsko modificirane celice kostnega mozga lahko nato presadimo v kostni mozeg, v našem primeru v kostni mozeg piščancev. Za zelo majhne genske fragmente je za uporabo kot vektor primeren tudi genom CAV sam.
Spodbujevalni/promotorski elementi CAV bi bili lahko aktivni tudi v drugih organizmih. V tem primeru bi lahko elemente uporabili tudi npr. v mišjem sistemu kot modelu za gensko terapijo.
Produkti CAV samega zagotavljajo pod kontrolo našega lastnega promotorja CAV ali drugega promotorja tudi možnosti za preučevanje in razvijanje tehnik za gensko terapijo.
Možnost uporabe celotnega ali v bistvu celotnega genoma CAV kot vektorja za kloniranje, to je kot neke vrste evkariotičnega plazmida za avianske sisteme, je razvoj, ki gaje treba smatrati kot realnega glede na odkrito strukturo genoma CAV.
Deponiranje klona pIC-20H/CAV-EcoRI CAV
Zalogo celic HB101, transformiranih s plazmidom pIC-20H/CAV-EcoRI, v glicerolu smo deponirali pri Centraalbureau voor Schimmelcultures, Baarn, Nizozemska, 7. septembra 1990 pod številko CBS 361.90.
Opis slik
Sl. 1 - sl. 3 kažejo napovedane odprte bralne okvire (ORF), ki imajo za obe verigi DNA dolžino več kot 300 baz. Na sl. 1, 2 in 3 so prikazani napovedani odprti bralni okviri (ORF) za tri različne začetne kodone ATG, CTG in GTG.
Sl. 4 kaže restrikcijsko encimsko mapo klonirane CAV-DNA. V oklepaju je število izolatov CAV od skupnih 21, ki ga ima relevantno mesto restrikcijskega encima v genomu.
SEQ. ID NO: 1 kaže nukleotidno sekvenco klonirane DNA CAV. Skupna dolžina je 2319 baz, pri čemer vzamemo prvi G mesta EcoRI kot štev. 1.
SEQ. ID NO: 2, SEQ. ID NO: 3 in SEQ. ID NO: 4 kažejo nekaj napovedanih lasničnih struktur genoma CAV, ki sestoji iz enojnoverižne DNA.
SEQ. ID NO: 5 kaže oligonukleotide, ki smo jih uporabili pri PCR. Prikazani sta sekvenca DNA in lega oligonukleotidov na genomu CAV. Lega oligonukleotidov na genomu CAV se ujema s tisto, prikazano s SEQ. ID NO: 1.
Materiali in metode
Celične kulture in virusi.
Izolate CAV smo gojili v linijah transformiranih limfoblastoidnih celic iz tumorjev piščancev, induciranih z virusom avianske levkoze podskupine A (1104-Χ-5) ali z virusom Marekove bolezni (MDCC-MSB1). Celične kulture smo okužili z okoli 0,1-1 TCID50 na celico. Po dveh dneh smo celice pobrali. Celice smo okužili z virusnim zarodom klonirane CAV-DNA ali terenskimi izolati. CAV-Cux-1, ki so ga prvotno izolirali v Nemčiji iz jate piščancev, obolelih za Marekovo boleznijo (Von Biilow et al, 1983, 1985), je dobavil dr. M.S. McNulty, Veterinary Research Laboratories, Belfast, Northern Ireland. Januarja 1988 nam je dr. J.P. Rosenberger, University of Delaware, Newark, USA, poslal dva vzorca krvi za določitev virulentnosti seva T-1704 Marekove bolezni in njegovega derivata MDV-Del-S, ki je prva pasaža v piščancu. Dobili smo izolata CAV-T-1704 in CAV-Del-S iz piščancev SPF, okuženih s sevom T-1704 MDV in njegovim derivatom MDV-Del-S. Holandske izolate CAV smo neselektivno izbrali iz serije šestdesetih, ki smo jih vse gojili v kulturah celic MDCC-MSB1. Terenski material sta dobavila J.C. van den Wijngaard, Gezondheidsdienst Brabant, Boxtel, in J. Naber, Gezondheidsdienst voor Pluimvee, Doorn, predvem zato, ker so ugotovili pri raztelesenju atrofijo timusa. Seriji smo dodali izolate CAV, dobljene iz naših lastnih jat SPF.
Izolacija celokupne DNA.
Virusne in jetrne preparate smo ponovno suspendirali v 20 mM Tris HCl-pH 7,5, 2 mM EDTA, 0,2 % SDS, 0,6 mg/ml proteinaze-K in inkubirali 1 uro pri 37°C. Preparate smo ekstrahirali s fenolom-kloroformom-izoamil alkoholom (25:24:1) in DNA oborili z etanolom. Pelete DNA smo ponovno suspendirali v 100 /ri 10 mM Tris HCl-pH 7,5,1 mM EDTA.
Ekstrakcija in analiza nizkomolekulske DNA.
Nizkomolekulsko DNA smo izolirali iz celic 1104-Χ5 in MDCC-MSB1, okuženih s CAV, in neokuženih celic 1104-Χ5 v skladu z metodo, ki jo je opisal Hirt (1967). DNA smo ločili na agaroznih gelih in po obarvanju z etidijevim bromidom direktno analizirali v UV svetlobi ali prepivnali na filter Biotrace v skladu z metodo, ki jo je opisal Southern (1982). Prepivke smo hibridizirali z naključno inicirano DNA, oznamovano s 32P, izolirano iz nizkomolekulske DNA celic 1104-Χ5, okuženih s CAV, z dolžino 2,7-3,5 kb.
Kloniranje CAV-DNA.
Celotni genom CAV-DNA smo klonirali v bakterijski vektor pIC-20H. Dele genoma CAV-DNA smo klonirali v vektor pIC-19R. Vse stopnje kloniranja plazmidne DNA smo izvedli načelno v skladu z metodami, ki sojih opisali Maniatis et al (1982).
Analiza sekvenc CAV-DNA.
Plazmide CAV-DNA smo očistili z gradientom CsCl in kromatografijo na Sephacryl-S500 (Pharmacia). V dvojnoverižni DNA smo določili sekvence s pomočjo T? DNA polimeraze (Pharmacia) ali s Taq DNA polimerazo (Promega). Obe metodi smo izvedli po navodilih, ki sta jih dala Pharmacia ali Promega. Oligonukleotide smo obdelali (kinirali) s T4 nukleotid kinazo firme Pharmacia. Na mestih, kjer gre določanje sekvenc težko (strong stops), smo določili sekvence v skladu z metodo, ki sta jo opisala Maxam in Gilbert (1977).
Sklenitev kloniranega genoma CAV-DNA v obroč.
μ% plazmida DNA klonov, ki vsebujejo celotni genom CAV-DNA, smo razgradili z restrikcijskim encimom tako, da smo celotni vključek CAV-DNA ločili od vektorja DNA. Obdelava 2,3 kilobaznih parov molekule linearne CAV-DNA s T4-DNA ligazo je imela za posledico obročasto dvojnoverižno CAV-DNA. Produkte vezanja smo analizirali na 0,8 %-nem agaroznem gelu.
Transfekcija z DEAE-dekstranom.
Za transfekcijo celic 1104-Χ5 in MDCC-MSB1 smo 2 μ% ponovno zvezane CAVDNA suspendirali dvakrat v 25 μ\ Milli-Q vode in zmešali z 260 μ] puferja TBS. Zmesi DNA smo dodali 15 μ] 10 mg/ml DEAE-dekstrana in zmes inkubirali 30 minut pri sobni temperaturi.
Celice 1104-Χ5. 50 mm ploščo za tkivno kulturo z l-2xl06 celic 1104-X5/ploščo smo sprali dvakrat s puferjem TBS. Pufer TBS smo popolnoma odstranili z enoceličnega sloja in dodali 300 μ\ razredčine DEAE-dekstran/DNA. Celice smo inkubirali 30 minut pri sobni temperaturi. Zmes DEAE-dekstran/DNA smo nadomestili z 2 ml 25 %-nega DMSO/TBS in enocelični sloj inkubirali 2 minuti pri sobni temperaturi. Celice smo sprali dvakrat s puferjem TBS in nato dodali medij za tkivno kulturo (RPMI1640 ali E-MEM). Celice smo inkubirali pri 37°C - 5 % CO2.
Celice MDCC-MSB1. V namizni centrifugi smo centrifugirali pri 1500 vrt./min okoli 2xl06 celic MDCC-MSB1. Medij smo nadomestili s 5 ml puferja TBS in celice previdno ponovno suspendirali. Stopnjo izpiranja smo ponovili. Odstranili smo ves pufer TBS, celični pelet previdno ponovno suspendirali v 300 ml mešanice DEAEdekstran/DNA in inkubirali pri sobni temperaturi 30 minut. Dodali smo 0,5 ml 25 %-nega DMSO/TBS in suspenzijo inkubirali 3 minute pri sobni temperaturi. Dodali smo 5 ml TBS in celice centrifugirali v namizni centrifugi pri 1500 vrt./min. Supernatant smo odstranili in dodali 50 ml medija za tkivno kulturo. Celice smo ponovno suspendirali in odcentrifugirali. Celice smo dali v 5 ml medija za tkivno kulturo in inkubirali pri 37°C - 5 % CO2. Za kontrolo smo uporabili za transfekcijo 2 μ% plazmida p!c-2OH.
Test nevtralizacije in vitro.
Celice MDCC-MSB1 smo okužili s supernatantom celic MDCC-MSB1 in celice 1104-Χ5 transfektirali s klonirano CAV-DNA. Okužili smo okoli 2xl04 celic. Vsebnost virusa v tem inokulumu ni bila točno znana. V polovici okuženih celičnih kultur smo dodali k mediju poliklonalni serum z nevtralizirno aktivnostjo, usmerjeno proti CAV, razredčen 1 : 100. Za kontrolo smo vzeli serijo vdolbinic s celicami MSB1, okuženimi s CAV, pri čemer mediju nismo dodali nič antiseruma, usmerjenega proti CAV.
Okuženje enodnevnih piščancev s CAV.
Supernatante celic MDCC-MSB1 in 1104-Χ5, transfektiranih s CAV-DNA in kontrolno DNA, smo vbrizgali intramuskularno enodnevnim piščancem. Šest dni po okuženju smo raztelesili po 5 piščancev iz vsake skupine, potem ko smo najprej določili vrednost hematokrita in skupno telesno maso. Za izolacijo virusa in imunohistokemijo smo zbrali heparinizirano kri, timus in kostni mozeg. Imunohistokemične raziskave so se vršile s pomočjo peroksidaznega obarvanja režnjev timusa z, med drugim, za CAV specifičnim monoklonalnim CV1-85.1. Štirinajst in osemindvajset dni po okužbi smo raztelesili še 5 piščancev in izvedli vse gornje določitve.
Verižna reakcija s polimerazo (PCR).
Oligonukleotide smo sintetizirali s pomočjo priprave Cyclone DNA synthesizer (Biosearch Inc. USA). Sekvenco smo izvedli iz sekvence CAV-DNA, prikazane na SEQ. ID. NO: 1. PCR smo izolirali na DNA iz celic MDCC-MSB1, okuženih s CAV, in iz neokuženih celic MDCC-MSB1. Končna koncentracija reagentov je bila 50 mM KCI, 10 mM Tris-HCl (pH 8,3), 3 mM MgCl2, 0,01 % albumina iz telečjega seruma, po 200 μΜ dNTP, po 1 μΜ oligonukleotida in 2 enoti Tag-DNA polimeraze (CETUS, USA) v skupno 100 μΐ. Vzorce DNA smo ciklično inkubirali 30-krat pri 93°C po 1 minuto, pri 55°C po 1 minuto in pri 72°C po 3 minute v programirnem termostatu Perkin Elmer/Cetus thermal cycler. Eno desetino pomnožene DNA smo direktno analizirali na 2 %-nem agaroznem/etidium bromidnem gelu ali z analizo s Southern prepivnanjem. Sonda DNA, ki smo jo uporabili, je bil oligonukleotid, ki je bil terminalno oznamovan s 32P v skladu z Maniatisom et al (1982).
Analiza s kapljičnim nanosom (dot blot)
Izolirali smo vključek CAV-DNA v pIC-20H/CAV-EcoRI in ga oznamovali z digoksigenin-ll-dUTP (Boehringer, Mannheim, Nemčija) v skladu s pravilnikom dobavitelja. Filtre Biotrace-RP smo nasitili z 1,5 M NaCl in 0,15 M Na citratom. Vzorce DNA smo ponovno suspendirali v 10 mM Tris HCl (pH 7,5) in 1 mM EDTA, kuhali 3 minute, ohladili na ledu in položili na filter. Filter smo posušili pri sobni temperaturi in inkubirali 30 minut pri 65°C. Filtre smo hibridizirali z DNA, oznamovano z digoksigeninom. DNA, oznamovano z digoksigeninom, smo napravili vidno s pomočjo imunološkega obarvanja v skladu s pravilnikom dobavitelja.
Tabela 1: Znani elementi sekvence za vezavo faktorja za prepisovanje področju spodbujevalca/promotorja virusa CAV.
Element Konsenzna sekvenca Sekvenca CAV Lega v sekvenci CAV
1. -TATA-# GTATAa/tAa/t GTATATAT 321-330+
2. SPI GGGCGG GGGCGG 305-310+
3. CREB TGACGTCA TGACGTTT 290-297
4 . PEA-I<pY> GGAAGTGACTAAC GAAAGTGACTTTC 286-298
5. gt(SV40) G<5/cTGTGGAAa/tGT CGTTGCGAAAGT 279-290
6. MLTF GGCCACGTGACC TGCCACTGTCGA 274-285
7 . CCAAT-TF AGCCAAT AGCCAAT 260-266+
8. -CACCC-# CACCC CAGCC 259-263
9. ATF ACGTCA ACGTCA 253-258+
10. -CACCC-# CACCC CAGCC 236-240
11. ATF ACGTCA ACGTCA 232-237+
12. spl(šibek) GAGGCG 209-214
13. ATF ACGTCA ACGTCA 199-204+
14. -CACCC-# CACCC CATCC 182-186
15. ATF ACGTCA ACGTCA 178-183+
16. -CACCC-# CACCC CATCC 161-165
17. ATF ACGTCA ACGTCA 157-162+
mesto CAP je verjetno pri okoli 350 + popolna homolognost med sekvenco CAV in konsenzno sekvenco — konsenzna sekvenca, ugotovljena v več virusih # sekvenca DNA elementa
Reference
1. De Boer, G.F., Pol, and Jeurissen, S.H.M. (1988). Marek’s disease vaccination strategies using vaccines made from three avian herpesvirus serotypes. Proceedings First International Poultry and Poultry Diseases Symposium, Manisa, Turkey, str. 34-48 (v turščini, angleški povzetek).
2. De Boer, G.F., Jeurissen, S.H.M., Van Roozelaar, D.J., Vos, G.J., and Koch, G. (1989a). Enhancing effects of chicken anaemia agent (CAA) on Marek’s disease pathogenesis. Proceedings of the Thirty-eigth Western Poultry Disease Conference, Tempe, Arizona, U.S.A, str. 28.
3. De Boer, G.F., Pol, J.M.A., and Jeurissen, S.H.M. (1989b). Enhancing effects of chicken anaemia agent (CAA) on Marek’s disease pathogenesis. Abstractbook IXth Intern. Congress of the WVPA, Brighton, U.K., str. 74.
4. Engstrom, B.E. (1988). Blue wing disease of chickens: Isolation of avian reovirus and chicken anaemia agent. Avian Pathology 17, 23-32.
5. Engstrom, B.E., Fossum, O., and Luthman, M. (1988). Blue wing disease of chickens: Experimental infection with a Swedish isolate of Chicken Anaemia Agent and an avian Reovirus. Avian Pathology 17,33-50.
6. Hann, S.R., King, M.W., Bentley, D.L., Anderson, C.W., and Eisenman, R.N. (1988). A non-AUG translational initiation in c-myc exon 1 generates an N-terminally distinct protein whose synthesis is disrupted in Burkitfs lymphomas. Celi 52,185-195.
7. Hirt, B. (1967). Selective extraction of polyoma DNA from injected mouse celi cultures. Journal of Molecular Biology 26, 365-369.
8. Jeurissen, S.H.M., Pol, J.M.A., De Boer, G.F. (1989). Transient depletion of cortical thymocytes induced by chicken anaemia agent. Thymus 14,115-123.
9. Jones, N. (1990). Structure and function of transcription factors. Seminars in Cancer Biology 1, 5-19.
10. Maniatis, T., Fritsch, E.F., and Sambrook, J. (1982). Molecular Cloning: A Laboratory Manual. New York: Cold Spring Harbor Laboratory.
11. Maxam, A.M., and Gilbert, W. (1977). A new method for sequencing DNA. Proceedings National Academic Sciences U.S.A. 74,560-564.
12. McNulty, M.S., Connor, T.J., McNeilly, F., NcLoughlin, M.F., and Kirkpatrick, K.S. (1990). Preliminary characterisation of isolates of chicken anaemia agent form the United Kingdom. Avian Pathology, In Press.
13. Ritchie, B.W., Niagro, F.D., Lukert, Steffens, W.L., and Latimer, S. (1989). Characterization of a new virus from cockatoos with psittacine beak and feather disease. Virology 171, 83-88.
14. Sanger, F., Nicklen, S. and Coulsen, A.R. (1977). DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proceedings National Academic Sciences U.S.A. 74, 5463-5467.
15. Southern, E.M. (1975). Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis. Journal of Molecular Biology 98, 503-517.
16. Tischer, I., Gelderblom, H., Vetterman, W., and Koch, M.A. (1982). A very small porcine virus with circular, singlestranded DNA. Nature 295, 64-66.
17. Todd, D., Creelan, J.L., Mackie, D.P., Rixon, F., and McNulty, M.S. (1990). Purification and biochemical characteristation of chicken anaemia agent. Journal of General Virology 71, 819-823.
18. Vielitz, E. (1989). Protect your chicks from infectious anemia. Poultry Science 68, 34-35.
19. Von Bulow, V., Fuchs, B., Vielitz, B., and Landgraf, H. (1983). Frusterblichkeitssyndrom bei Kuken nach Doppelinfection mit dem Virus des Marekschen Krankheit (MDV) und eine Anamie-Erreger (CAA). Zentralblatt fiir Veterinarmedizin B. 30, 742-750.
20. Von Bulow, V., Fuchs, B., and Bertram, M. (1985). Untersuchungen iiber den Erreger der Infectiosen Anamie-Erreger bei Huhnerkiicken (CAA) in vitro: Vermehrung, Titration, Serumneutralisationstest und indirekter Immunofluoreszenstest. Zentralblatt fur Veterinarmedizin B. 32,679-693.
21. Yuasa, N., Taniguchi, T., and Yoshida, I. (1979). Isolation and some properties of an agent inducing anaemia in chicks. Avian Diseases 23, 366385.
22. Yuasa, N., Taniguchi, T., and Yoshida, I. (1980). Effect of infectious bursal disease virus infection on incidence of anaemia by chicken anaemia agent. Avian Diseases 24, 202-209.
23. Yuasa, N. (1983). Propagation and infectivity titration of the Gifu-1 strain of chicken anaemia agent in a celi line (MDCC-SB1) derived from Marek’s disease lymphoma. National Institute of Animal Health Quarterly 23,13-20.
20 30 40 SO 60 70 80 90 100
CAATTCCCAC TCCTTACTAT TCCATCACCA TTCTACCCTC TACACACAAA CTCAACATCG ACGAATCCCT CCACTTCGCT CGCCATTCCT CCAACCCCCC
o u e < O 3 o 3 O a 0 3 21 2 3 0 a 0 μ-
o 3 o a O 3 O tf 0 μ- 0 3 0 fr 0 a 0 fr Ή 3
rt| m tj tf tj irt a KO α rt a ao tf σι tf a fr a
u fr 3 a a a a t* fr
a fr □ fr a 3 fr fr tj a
tj tj L· μ- a ί- (— a 3
tj tj U μ- < fr α a a a
u tj tj α fr fr a a a a
u 3 a a a P— 3 Ι- 3 3
3 a tj a a a 3 α 3 3
O tj O I- o < c 3 0 μ- 0 a 0 3 O tf 0 a 0 a
o < σι tj σι < 01 tf 0 fr 0 fr 0 a σι μ- o a σι a
—1 h- rsi «r m tj τ a 1/3 3 to a rt tf ao fr o tf 0 a
tj 3 a >- 0 < 3 fr — 3
tj 3 tj a a •t μ— — a
U u tj a ,a tf < — Ι-
μ— u 3 <? a fr a — α
tf tj tj θ μ- a a a fr
tj tj ι- < a a a fr
Ι- L ί- ί- a a 3 a 3 1—
Ο o O tj ο 3 ο μ- 0 < 0 3 0 a 0 a 0 a 0 a
OO tj oo tj ao tj ao tf 00 a ao a ao a ao tf ao a 00 μ—
—Ί tf I— rn o μ- m 3 a et rt a 3 ao a 3 013 23
tj tj α a 3 3 3 a < μ—
U tj s a a 3 a a 3 μ- α a a G tj a
tj a a a μ- 3 a < a a
u tj a a α a a a μ- a
a < ί- a < a 3 3 < 3
o 3 o 3 Ο a o a O a 0 a 0 V 0 a O h- P 3
rt tj rt 3 rt a r». a fs. fr r» a rt- < rt a rt a μ» a
•H < rt! tf m a tf < m a to ί- rt H ao a σι a 0 a
fr a 0 a α a Ι- a t
tj μ- a a a 3 3 α g fr
tj tj 3 3 a a a 3 a a a 3 0 a a
μ- o 0 a a a a 3 a
ό u tj a a a a a G C a 3 < a μ-
O μ- o < o < o 3 O a 0 μ- 0 a 0 a o a o 3
tO tj tO tj to μ- to a KO μ- lO tf to a tO < to a 2 fr
<-l tj rti tf m tf tf a tn ί- to a rt u ao tf σι < 0 a
< O μ- a α 3 < a a 3
μ— α a a 3 a a a a
o tj a a μ- a a a μ-
tj tj < 0 a α a 1- μ- 3
u < μ- a a a fr < 3 fr
H α a a a a g a a
tj VJ < a < < a < < 3
o a O tj o a o a O a 0 a 0 1- 0 < 0 a 2 fr
trt tf Irt tj m a v* a m f- •rt a Irt tf μ- i/ι a trt a
i-t tj rti tj rn a * fr m fr to a rt a ao a σι fr 0 μ-
tf a a □ g μ- a fr t 5
μ— υ μ- g < α a a 3
tj < α < < a < tf a
tj 0 a < a a 3 a tf a
< 3 a a < a a 3 tf a
□ h— a a 3 a < 3 i— a
»J tj < a a μ- 3 μ- < a
O 3 O a o μ— o a O a o a 0 a o < 0 μ- 2 5
tf a tf tj tf <; tf a v 3 tf a tf a tf 1— * tf 3
-t tj H rti tj tf m a tf m tj a to μ3 C ao a a σι a 3 0 a a
tj 0 0 tf a 3 a a 3 a
< h- a a a a a a a a
tj tj a a 3 a Ι- tf a fr
U tj a a a a α 3 3 a
tf 3 • < a ι- a a tf a a
i O < ί- a a 3 a a
O tj O <J o fr 0 fr O α 0 μ- 0 < 0 < 2 t 0 3
frt tj m tj frt fr m fr m H m tj m tf m a i fr m a
Ή 1— rti IJ rti < tf a m a to a rt 0 ao a o a 0 μ-
U tj μ- a a a a a < -* fr
tj tj < a a μ- a a a
U tj μ- a 3 α 3 a a
tj tf 3 a μ- 3 3 a 3
tj 0 ί- a a α a a 3 i—
tj tf α H μ- μ- i- a 3 3
<J μ- ί- 3 < α < a a Ι-
O tj O tj ο a O < O a o a 0 a 0 a ° fr Ο a
ΓΜ i— rti tj rti fr rti a fM a «tf a «m a p* a na a rt a
r-l O rti tj m a tf μ- i/> < to μ- rt a ao tf o a 0 3
tj a a α a 3 < a 3
tj μ- a a μ- a a a u
tj ί- tf 0 a α a a a u
U α 3 a a μ- < a 3 • u
u tj a a a α a 3 a
tj a a a 3 < Ι- a a L/
tj a a a a a Ι- a a KJ
O tj o < o a 0 a O a 0 μ- ο a 0 a 2 fr O KJ
Ή tj r-t tj a —1 μ- fr -1 tf rM tf r-t μ- 1-1 a r-4 {J
«H tf rti tf m a tf a iz> U to 3 rt a ao a σ» a O KJ
(J a a < a a < a •-4 KJ
tj tf a a fr 3 a fr .3 KJ
tj tj 3 a t- a a g t a a a 3 a a KJ i
a tj < a < fr U .3
u u F— tj 3 a a < a 3 a i- a < a < KJ <
1110 1120 1130 1140 11S0 1160 1170 1180 1190 1200
TCTCCCTAAA AACACCACAC CCCCCCCCTA TGCACACCAC ATGTACCCCG CCAGACTCCC CAAGATCTCT GTCAACCTCA AAGACTTCCT GCTACCCICA
1210 1220 1230 1240 1250 1260 1270 1280 1290 1300
ATCAACCTCA CATACCTCAC CAAAATCCCA CCCCCCATCC CCGGTCAGTT CATTGCCCAC CGCTCTAAAT CACAACCCCC CCACAATTCC CCTAATTCCI
O b O Ι- o u O b O LJ o — O kj o 1“ O
o rf Ο o O <J o f” O LJ o L· o (- o b o
ut rf kO IJ f» kj ao U σι rf O LJ r-t b (-1 kj m
-t t— —1 kj U -· 4 -· rf ru J ru «r ru b rsl
L» C kj b 0 d rf b LJ
0 «t b < u kj rf
F d kj 3 3 b kj LJ kj 0 LJ
a j a Ι- 3 3 a ί- 3 J b- 1- < LJ rf
u Ο b- O <J O b ο O LJ O f— O b O LJ O
j σ> U Ok rf tn u Ok k Ok kj Ok k Ol u Ok kj σ>
u ~r Ό m b <o u r. b OO tj σι rf O b- r-l tj PM
t —< brf -1 tj LJ r4 kj rf rM kj U ^4 rf H nj3 rj tj LJ PM
u <j kj b- LJ kj b b H
H < kj rf b- «s rf LJ b
J 0 kj H < d d rf <
rf b— rf U t- lj rf U 1—
b k kj LJ rf < LJ <
b O H O LJ O b- O b- O kj o LJ o < o t— O
kj 00 kj ao rf ao U 00 rf oo rf 00 ao kj ao rf oo
rf T b tn tj kO b r-. kj ao b σι b O b- r-l kj PM
d -t b -t < r-t tj ** -t tj r4 LJ ru rf ri tj PM
b b 1— O kj rf rf rf
J b b H rf kj b b- LJ
b rf 5 b < O b 3 3 b u LJ rf
0 b- 0 LJ o 1— b 0
b b k < b- < < b <
O K O H o a o rf o rf O b O u O kj O < O
r> < s» t f>» h·· r- b b- d b» LJ b. tj «i b. tj r*»
m O -r < m < kO U b- b- ao rf σι u o □ r-l kj rsi
^4 F·» 0 0 -t tj r-t kj r4 kj ru LJ ru LJ ΓΜ
i3 u
b b
a a
u j
u j
a u?
t u
kj b
b
C
H o t- O b- O U O kj O b O b- o b O b O
kj kO r— kO LJ ω < kO LJ kO b kO b kO b to H 10
kj -r LJ m tj to d r. rf oo b- ΟΊ b- o b r-l (J Γ4
kj ^4 rU LJ rU rf rU rf -1 tj rU < ru < ru b P4
kj b kj LJ d b d 1- <
LJ u < b- LJ b < < b
1- < kj rf kj < b- d b
< d ' I- rf < b b < b
d IJ b rf d < b b- b-
< LJ u 4 b Ι- < b <
LJ O h- o < O LJ O < Ο b O b O b O b O
LJ l/> C m b- m kj m 1— tn f- m < m < irt kj m
b— T kj tn tj kO LJ i oo F σι d O d r-l tj P4
kj r-4 LJ -4 r-l U S r* l·- rM b ru < ru < Γ4
kj LJ d U d b b d b-
1— LJ < < H < b <
< U LJ d < d d b d
d f- kj u d H 1— b b
LJ F LJ LJ b r— < ι- b
b P- < b- i- b d Ι- b
O b O b O b O < O b O b o b o b O rf O
b— b- -f b T F b • v 'T rf «T v b v
rn rf T < m b kO F b oo σι b o e »H rf P4
^4 d •H d b- ^4 u ^4 b rf ij d rsj
b b b b b- b d < b
< b F> b- b b b h- b
d b— b 1- < b b b rf
< b ι- rf rf rf rf rf d
H b Ε b d d d d rf
b b U b b b b < rf
O b o b- O b- O b O b o — o b O < O b- O
m b m rf m b rn b m < m ϋ m b m d m b m
m b V d m rf 0 b r*. d ao b Ol b- O b r4 b PM
^4 < -4 b ^4 b r4 b ^4 ^4 b Γ4 b nj b Psi
b d b b b — b b- Η-
b «r b b rf b b ϋ
b rf b rf rf — b rf b
b d b— b d U b < rf
H b b 1- b h- H b- d
b b- b rf b b b rf b
O b .-4 rf m —ί F»
I<
b <
m tj -> b b b ΙΟ b b
O b ru tj T b
O b o b O b O b O b o < o b O
PM b ru b Psi rf PM b- ru b~ ru rf ru b- PM
in b kO b d ao < σι b o d r4 (j Psi
b rf ^4 rf r4 rf »M b ru rf ru b- PM
rf rf b- d b d b
d d b rf rf b b
ι- < rf d d b b
Ε b b- b rf b-
u o b b~ d rf b
b b b b b d rf
o a
<
a
K3 kO
O b rH tj r.
h·
Irf b
O LJ r-l tj 00 b-t b u
<
O b r-t b~ <
u u
kj b
b b
<
bO b
<
t
2310
ATAGATTTAT CCCACTATC
SEQ. ID NO: 2
A
T
G
G
G
G
G
G
G
G
G
G
A
A
I
A
A
G
G C C T A
C G C A
G
G
G
G
G
T
C
A
T
G
2181
A
A
C
C
C c
c c
c c
c
C A T A A T C C
A G G T T C
I c
c c
c c
A
G
I
A
C
2266
SEQ. ID NO: 3
T T c c A G G C C T T C C G G C C G T A A T A T G C C G A T G C G G T A
93
C
C C G T G
SEQ. ID NO: 4
C C
C c G G
A G G G G T C G C G G C G C G C G C G C G C C T G C G C A A A A G C C G T A
135
SEQ. ID NO: 5
O E- U
H fC H
U rt E-
O E- O
u O rt
u rt rt
□ rt U
□ U rt
u o rt
u o υ
o rt O O o υ
o rt r- o <T rt
u c· rt in υ
rt □ υ
O 0 □
□ υ o
u o rt
u u υ
o υ E-
u o E-
rt rt □
rt o E-
o □ o CM
o u □ 1
o □ υ >
u rt c rt
rt υ rt υ
u u υ
o u E-
E- □ rt
o rt o o o υ 1
00 O in u CM U 1
n o V E- m rt 1
H U o v
U u o
O rt υ
0 rt u
u υ u
u o rt
H o u
□ o υ
O o E-
U rt υ
Čl Λ o rt
o I rt E-
rt 1 o rt
rt 1 u O
u ui Λ rt
o o 1 rt
u rt O
o rt r-4 O E- 1 o rt
O H 1 n E- o rt
(*> rt > «j« □ in u
H rt □ U
0 υ υ m Ε-
O □ l υ
rt o > Ε-
E- u rt υ
O E- U o
rti rt υ
υ rt rt
čl o rt
o E- o
u o E-
c-> rt rt
O u rt
O o rt
u o υ
υ o E-
< o f-
Za
AESCULAAP B.V.:
&ΤΈΝΤΝΑ «SARKA, ~OPOVA H

Claims (31)

  1. PATENTNI ZAHTEVKI
    1. Rekombinantna genetska informacija v obliki oznamovane ali neoznamovane DNA ali RNA, označena s tem, da obsega nukelotidno sekvenco, specifično za virus piščančje anemije (CAV), ki se ujema ali je komplementarna z nukleotidno sekvenco genoma CAV ali njegovega dela.
  2. 2. Rekombinantna genetska informacija po zahtevku 1, označena s tem, da obsega nukleotidno sekvenco, specifično za CAV, ki se ujema ali je komplementarna z nukelotidno sekvenco, prikazano s SEQ. ID NO: 1, nukleotidno sekvenco, ki je z njo najmanj 60 %-no homologna, ali njen del.
  3. 3. Rekombinantna genetska informacija po zahtevku 1 ali 2, označena s tem, da obsega nukleotidno sekvenco, specifično za CAV, ki se ujema ali je komplementarna z nukleotidno sekvenco, ki kodira za protein CAV, ki se pojavlja v genomu CAV, ali njegov del.
  4. 4. Rekombinantna genetska informacija po zahtevku 1 ali 2, označena s tem, da obsega nukleotidno sekvenco, specifično za CAV, ki se ujema ali je komplementarna z nukleotidno sekvenco, ki ima regulatorno funkcijo, ki se pojavlja v genomu CAV, ali njen del.
  5. 5. Rekombinantna genetska informacija po katerem koli od prejšnjih zahtevkov, označena s tem, da obsega tudi nukleotidno sekvenco, ki ni izvedena iz genoma CAV.
  6. 6. Rekombinantna genetska informacija po zahtevku 5, označena s tem, da obsega kot nukleotidno sekvenco, ki ni izvedena iz genoma CAV, nukleotidno sekvenco, izvedeno iz prokariotičnega ali evkariotičnega vektorja za izražanje.
  7. 7. Rekombinantna genetska informacija po zahtevku 5, označena s tem, da obsega nukleotidno sekvenco, ki ni izvedena iz genoma CAV, nukleotidno sekvenco, ki kodira za protein, različen od proteina CAV, ali nukleotidno sekvenco, ki kodira za del takega različnega proteina.
  8. 8. Rekombinantna genetska informacija po zahtevku 5, označena s tem, da obsega kot nukleotidno sekvenco, ki ni izvedena iz genoma CAV, nukleotidno sekvenco, ki se ne pojavlja v genomu CAV in ki ima regulatorno funkcijo.
  9. 9. Rekombinantna genetska informacija po katerem koli od prejšnjih zahtevkov, označena s tem, da je v obliki DNA.
  10. 10. Rekombinantna genetska informacija po zahtevku 9, označena s tem, da je DNA oznamovana z enim ali več markerji, primernimi za oznamovanje DNA, kot radioizotopi, encimskimi molekulami, hapteni, fluorescenčnimi snovmi, barvili, pigmenti in markerji v obliki delcev.
  11. 11. Rekombinantna genetska informacija po katerem koli od prejšnjih zahtevkov, označena s tem, da je v obliki RNA.
  12. 12. Rekombinantna genetska informacija po zahtevku 11, označena s tem, da je RNA oznamovana z enim ali več markerji, primernimi za oznamovanje RNA, kot radioizotopi, encimskimi molekulami, hapteni, fluorescenčnimi snovmi, barvili, pigmenti in markerji v obliki delcev.
  13. 13. Rekombinantna genetska informacija po katerem koli od prejšnjih zahtevkov, označena s tem, daje vsebovana v delcih rekombinantnega virusa.
  14. 14. Uporaba rekombinantne genetske informacije po katerem koli od zahtevkov 1 do 12 kot sonde ah primerja, ki sta specifična za CAV, v postopku za odkrivanje CAV-DNA ali -RNA, npr. v postopku nanašanja DNA/RNA v obliki lise (DNA/RNA slot blotting), prepivnanja po Southernu (Southern blotting), prepivnanja po Northemu (Northern blotting), hibridizacije in situ, pomnoževanja DNA s PCR, Sl-mapiranja in ekstenzije primerja.
  15. 15. Diagnostični komplet za odkrivanje CAV-DNA ali -RNA v postopku, kot je nanašanje DNA/RNA v obliki lise (DNA/RNA slot blotting), prepivnanje po Southernu (Southern blotting), prepivnanje po Northemu (Northern blotting), hibridizacija in situ, pomnoževanje DNA s PCR, Sl-mapiranje ali ekstenzija primerja, označen s tem, da vsebuje ta diagnostični komplet rekombinantno genetsko informacijo po katerem koli od zahtevkov 1 do 12 kot sondo ali primer, ki sta specifična za CAV.
  16. 16. Vakcinski pripravek za imunizacijo proti CAV ali drugemu patogenemu povzročitelju, označen s tem, da vsebuje ta pripravek rekombinantno genetsko informacijo po zahtevkih 1 do 13 in po želji enega ali več nosilcev in adjuvansov, primernih za žive virusne vakcine.
  17. 17. Uporaba rekombinantne genetske informacije po katerem koli od zahtevkov 1 do 13 v postopku za pripravo proteina CAV, njegovega dela ali proteina, ki je drugačen od proteina CAV, s prevajanjem in vitro ali in vivo.
  18. 18. Uporaba rekombinantne genetske informacije po katerem koli od zahtevkov 1 do 13 kot vektorja za kloniranje za avianske sisteme.
  19. 19. Prokariotična ali evkariotična celica, označena s tem, da vsebuje rekombinantno genetsko informacijo po katerem koli od zahtevkov 1 do 13.
  20. 20. Prokariotična ali evkariotična celica, označena s tem, da vsebuje rekombinantno genetsko informacijo po katerem koli od zahtevkov 1 do 13 in ki je sposobna, da izrazi vsaj en protein ali del proteina, ki ga kodira ta rekombinantna genetska informacija.
  21. 21. Protein CAV ali njegov del, označen s tem, da je dobljen z in vitro prevajanjem rekombinantne genetske informacije po katerem koli od zahtevkov 1 do 13, ki obsega nukleotidno sekvenco, ki kodira za protein CAV ali njegov del.
  22. 22. Protein CAV ali njegov del, označen s tem, da je dobljen z izolacijo iz prokariotične ali evkariotične celice, ki vsebuje rekombinantno genetsko informacijo po katerem koli od zahtevkov 1 do 13, ki obsega nukleotidno sekvenco, ki kodira za protein CAV ali njegov del in ki je sposobna, da ga izrazi.
  23. 23. Uporaba proteina CAV ali dela proteina CAV po zahtevku 21 ali 22 kot reagenta, ki veže protitelesa, specifična za CAV, v postopku imunskega testa za odkrivanje protiteles, specifičnih za CAV, npr. v obarvanju z imunoperoksidazo, testu ELISA ali imunofluorescenčnem testu.
  24. 24. Diagnostični komplet za odkrivanje protiteles, specifičnih za CAV, v postopku imunskega testa, kot obarvanju z imunoperoksidazo, testu ELISA ali imunofluorescenčnem testu, označen s tem, da vsebuje ta diagnostični komplet protein CAV ali del proteina CAV po zahtevku 21 ali 22 kot reagent, ki veže protitelesa, specifična za CAV.
  25. 25. Vakcinski pripravek za imuniziranje proti CAV, označen s tem, da vsebuje ta pripravek protein CAV ali del proteina CAV po zahtevku 21 ali 22 in po želji enega ali več nosilcev in adjuvansov, primernih za vakcine, ki obsegajo le podenoto.
  26. 26. Uporaba proteina CAV ali dela proteina CAV po zahtevku 21 ali 22 v postopku za pripravo poliklonalnih ali monoklonalnih protiteles, specifičnih za CAV.
  27. 27. Protitelesa, specifična za CAV, označena s tem, da so pripravljena s pomočjo proteina CAV ali njegovega dela po zahtevku 21 ali 22.
  28. 28. Uporaba protiteles, specifičnih za CAV, po zahtevku 27 kot reagenta, ki veže protein CAV, v postopku imunskega testa za dokaz proteina CAV.
  29. 29. Dagnostični komplet za dokaz proteina CAV v postopku imunskega testa, označen s tem, da vsebuje ta diagnostični komplet kot reagent za vezavo proteina CAV protitelesa po zahtevku 26, specifična za CAV.
  30. 30. Imunizacijski pripravek za pasivno imunizacijo proti CAV, označen s tem, da obsega protitelesa po zahtevku 27, specifična za CAV, in po želji enega ali več nosilcev in adjuvansov, primernih za pasivno imunizacijo.
  31. 31. Uporaba protiteles po zahtevku 27, specifičnih za CAV, v postopku za izoliranje in/ali čiščenje proteina CAV.
SI9111508A 1990-09-12 1991-09-11 Recombinant DNA and RNA and products derived therefrom SI9111508B (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
NL9002008A NL9002008A (nl) 1990-09-12 1990-09-12 Recombinant dna en rna en daarvan afgeleide produkten.
YU150891A YU49095B (sh) 1990-09-12 1991-09-11 Rekombinantna dnk i rnk i proizvodi dobijeni od njih

Publications (2)

Publication Number Publication Date
SI9111508A true SI9111508A (sl) 1998-10-31
SI9111508B SI9111508B (en) 2001-12-31

Family

ID=19857669

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SI9111508A SI9111508B (en) 1990-09-12 1991-09-11 Recombinant DNA and RNA and products derived therefrom

Country Status (21)

Country Link
US (6) US5491073A (sl)
EP (2) EP0905246A1 (sl)
JP (1) JP2846116B2 (sl)
AT (1) ATE188739T1 (sl)
AU (1) AU651999B2 (sl)
CA (1) CA2091181C (sl)
DE (1) DE69131903T2 (sl)
DK (1) DK0548234T3 (sl)
ES (1) ES2144399T3 (sl)
GR (1) GR3033173T3 (sl)
HR (1) HRP940668B1 (sl)
HU (1) HU220102B (sl)
IL (1) IL99435A (sl)
MX (1) MX9101042A (sl)
NL (1) NL9002008A (sl)
RU (1) RU2146292C1 (sl)
SI (1) SI9111508B (sl)
UA (1) UA48936C2 (sl)
WO (1) WO1992004446A1 (sl)
YU (1) YU49095B (sl)
ZA (1) ZA917065B (sl)

Families Citing this family (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NL9301272A (nl) * 1993-07-20 1995-02-16 Aesculaap Bv Chicken Anemia Virus mutanten en vaccins en toepassingen gebaseerd op de virale eiwitten VP1, VP2 en VP3 of daarvoor coderende sequenties van dat virus.
US20020061296A1 (en) * 2000-09-08 2002-05-23 Noteborn Mathieu H.M. Delivery method for the tumor specific apoptosis inducing activity of apoptin
US20030138443A1 (en) * 1993-03-08 2003-07-24 Noteborn Mathews H.M. Cloning of chicken anemia virus DNA
US5922600A (en) * 1990-09-12 1999-07-13 Leadd Bv Chicken anemia virus mutants and vaccines and uses based on the viral proteins VP1 VP2 and VP3 or sequences of that virus coding therefor
US20080234466A1 (en) * 1990-09-12 2008-09-25 Noteborn Mathieu H M Delivery method for the tumor-specific apoptosis-inducing activity of apoptin
ZA918426B (en) * 1990-10-31 1992-12-30 Akzo Nv Chicken anemia virus vaccine and diagnostic
EP0878546A1 (en) * 1997-04-15 1998-11-18 Leadd B.V. A gene delivery vehicle expressing the apoptosis-inducing proteins VP2 and/or apoptin
US5789567A (en) * 1994-07-06 1998-08-04 Cornell Research Foundation, Inc. Chicken infectious anemia virus vaccine
GB9414888D0 (en) * 1994-07-23 1994-09-14 Univ Belfast Method and composition
CA2221570A1 (en) * 1995-06-07 1996-12-19 Aesculaap B.V. Neutralizing conformation epitopes of chicken anemia virus
US6127115A (en) * 1995-11-14 2000-10-03 Ragland; William L. Efficient method of detecting an infectious agent in blood
AU756587B2 (en) 1997-08-12 2003-01-16 Leadd B.V. Determining the transforming capability of agents
WO1999045956A1 (en) * 1998-03-13 1999-09-16 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Vaccines against circovirus infections
DK1083224T3 (da) * 1999-09-02 2007-04-10 Leadd Bv Apoptin-associerende protein
CA2393859A1 (en) * 1999-12-10 2001-06-14 Leadd B.V. Apoptin-associating protein
US6593134B1 (en) 2000-03-10 2003-07-15 Cornell Research Foundation, Inc. Method of propagating chicken infectious anemia virus
CN100589746C (zh) * 2000-07-10 2010-02-17 尤妮佳股份有限公司 清扫物品
EP1199363A1 (en) * 2000-10-20 2002-04-24 Leadd B.V. Phosphorylation modifications of apoptin
US20050169939A1 (en) * 2001-09-05 2005-08-04 Leonard Joan D. Chicken anemia virus vaccine from cell line
US7566548B2 (en) * 2004-08-13 2009-07-28 University Of Massachusetts Methods for identifying therapeutic agents and for treating disease
CN102636646A (zh) * 2012-05-15 2012-08-15 扬州大学 快速检测禽白血病抗原的试纸条及其制备方法

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB2042888B (en) 1979-03-05 1983-09-28 Teijin Ltd Preparation for administration to the mucosa of the oral or nasal cavity
JPS6034925B2 (ja) 1979-07-31 1985-08-12 帝人株式会社 持続性鼻腔用製剤およびその製造法
JPS6032714A (ja) 1983-08-01 1985-02-19 Teijin Ltd 鼻腔粘膜に適用するための安定化された粉末状薬学的組成物
DE3583799D1 (de) 1985-01-11 1991-09-19 Abbott Lab Ltd Feste zubereitung mit langsamer freisetzung.
US4683195A (en) * 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US5059587A (en) 1987-08-03 1991-10-22 Toyo Jozo Company, Ltd. Physiologically active peptide composition for nasal administration
GB8723846D0 (en) 1987-10-10 1987-11-11 Danbiosyst Ltd Bioadhesive microsphere drug delivery system
US5079005A (en) 1988-06-17 1992-01-07 Gupta Kashmiri L Time release protein
JP3292371B2 (ja) * 1988-09-13 2002-06-17 メリアル ウイルスのヌクレオチド配列
GB2237510B (en) 1989-11-04 1993-09-15 Danbiosyst Uk Small particle drug compositions for nasal administration
US5271961A (en) 1989-11-06 1993-12-21 Alkermes Controlled Therapeutics, Inc. Method for producing protein microspheres
ZA918426B (en) 1990-10-31 1992-12-30 Akzo Nv Chicken anemia virus vaccine and diagnostic

Also Published As

Publication number Publication date
WO1992004446A1 (en) 1992-03-19
IL99435A (en) 2006-10-31
ES2144399T3 (es) 2000-06-16
ATE188739T1 (de) 2000-01-15
US6509446B2 (en) 2003-01-21
HUT65974A (en) 1994-08-29
ZA917065B (en) 1992-05-27
AU8658091A (en) 1992-03-30
DK0548234T3 (da) 2000-06-19
EP0905246A1 (en) 1999-03-31
YU49095B (sh) 2003-12-31
US5491073A (en) 1996-02-13
UA48936C2 (uk) 2002-09-16
JPH06504195A (ja) 1994-05-19
US5932476A (en) 1999-08-03
CA2091181A1 (en) 1992-03-13
YU150891A (sh) 1995-10-24
IL99435A0 (en) 1992-08-18
HRP940668A2 (en) 1997-12-31
US5958424A (en) 1999-09-28
DE69131903D1 (de) 2000-02-17
HRP940668B1 (en) 2000-10-31
DE69131903T2 (de) 2000-07-20
NL9002008A (nl) 1992-04-01
EP0548234B1 (en) 2000-01-12
HU220102B (hu) 2001-10-28
JP2846116B2 (ja) 1999-01-13
RU2146292C1 (ru) 2000-03-10
CA2091181C (en) 2006-02-21
GR3033173T3 (en) 2000-08-31
US6319693B1 (en) 2001-11-20
SI9111508B (en) 2001-12-31
MX9101042A (es) 1992-08-10
US6238669B1 (en) 2001-05-29
HU9300716D0 (en) 1993-06-28
US20020103336A1 (en) 2002-08-01
AU651999B2 (en) 1994-08-11
EP0548234A1 (en) 1993-06-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
SI9111508A (sl) Rekombinantna DNA in RNA in iz njiju izvedeni produkti
Noteborn et al. Characterization of cloned chicken anemia virus DNA that contains all elements for the infectious replication cycle
Sakaguchi et al. Protection of chickens with or without maternal antibodies against both Marek's and Newcastle diseases by one-time vaccination with recombinant vaccine of Marek's disease virus type 1
KR0153005B1 (ko) 제조합 마레크병 바이러스
AU703187B2 (en) Chicken anemia virus mutants and vaccines and uses based on the viral proteins VP1, VP2 and VP3 or sequences of that virus coding therefor
EP4028510A1 (en) Recombinant herpesvirus of turkey vectors expressing antigens of avian pathogens and uses thereof
EP0486106A2 (en) Marek&#39;s disease virus vaccine
US20060073160A1 (en) Cloning of chicken anemia virus DNA
US5789567A (en) Chicken infectious anemia virus vaccine
JPH09505726A (ja) 組換え感染性喉頭気管炎ウイルス及びそれらの使用
US5693530A (en) Marek&#39;s disease virus nucleotide sequence and methods of use
WO1996003507A1 (en) Method of isolating attenuated virus and vaccine thereof
Yan et al. Application of ORF3 Subunit Vaccine for Avian Hepatitis E Virus. Vet. Sci. 2022, 9, 676
CA2185097A1 (en) Activating virus
JPH06141853A (ja) 組換え鶏伝染性喉頭気管炎ウイルス及びその製法

Legal Events

Date Code Title Description
IF Valid on the event date