JPH06504195A - 鶏貧血症ウィルス（ｃａｖ）組換え核酸、それを含むｃａｖ診断キット、および原核細胞または真核細胞、ならびにｃａｖ２本鎖ｄｎａの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の名称 組替えＤＮＡとＲＮＡおよびそれらから導かれた生産物 １艷立上１ 本発明は、ＤＮＡ（およびＲＮＡ）組替え技術、診断、免疫、ワクチンによる遺 伝子技術（遺伝子組替え）の分野に関する。さらに鶏貧血症ウィルス（ＣＡＶ） のＤＮＡ遺伝子の検出とクローニングと、継続分析およびその応用に関する発明 である。

及１と１１ 鶏の伝染性貧血症の原因は現在のところＣＡＶに分類されていない、そのウィル スは１９７９年日本で最初に分離され、若鶏中でこれによって起こる一連の貧血 症にその名が与えられた（　Ｙｕａｓａら、１９７９）、ＣＡＶ伝染の他の症状 は、骨髄の萎縮症、胸腺中のリンパ球の死亡症である。傷害は腎臓と肝臓に起こ る。

１８雛は、最も影響を受ける。これらの動物は昏睡状態で、食欲不振と一時的貧 血症が４〜７日観察され、約半分はＣＡＶ感染後に２〜３週間で死ぬ。岬化後の 日数が増加すると、自然抵抗もまた増加する。７日派は感染後一時的貧血症だけ が起こる。１４日雛は感染しても貧血症にならない。

ＣＡＶ感染に対する予防とＣＡＭ症状の減少は、体液の免疫性の欠乏機構に強く 関係する。Ｖｉｅｌｉｔｚ（１９８９）は、層の中でＣＡＶに感染した肝臓の懸 濁液によって制御して暴露することによって免疫性物質を入手し、効果的に予防 する方法を発達させた。ドイツでは、この免疫法が実際に使われたが全く危険が ないわけではなかった。

ＬｅｌｙｓｔａｄにおけるＣｅｎｔｒａａｌ　Ｄｔｅｒｇｅｎｅｅｓｋｕｎｄｉ ｇＩｎｓｔｉｔｕｕｔ　（ＣＤ　Ｉ　）で分離された家畜舎内に飼育された動物 実験では、抗体物質の防護値を確立した。ここで制御された暴露とは、組織培養 で繁殖されたＣＡＶで実行されている。ＣＡＶに対する抗体物質の存在は、予防 接種された母親動物から１８雛のＣＡＶ感染を完全に予防する。ＣＡＶ症状はほ とんど起こらない。この有効な予防はまた免疫された層を入手することによって 得られ、特別の無菌原菌（ＳＰＦ）の雛を同じ免疫された層の卵黄で接種するこ とで得られる。ＣＡＶ抗体の管理によってＣＡＶ感染に関する効果的予防は４週 間持続する。そして予防が完成する。これらの実験は、母親動物のワクチンによ る抗体物質が実際の立場で重要な予防の役割を果すことを示している。

ＣＡＶ感染を免れた雛の中で胸腺リンパ球の特別な固体群の減少が起こる（　Ｊ ｅｕｒｉｓｓｅｎら、１９８９）、＊腺萎縮症は、ＣＡＶに起因する免疫低下の 原因の可能性がある。その結果、特別なワクチンは、たとえばＮｅｗｃａｓｔｌ ｅ病のように効果が少なくなる。ＣＡＶは、Ｍａｒｅｋ病およびＧｕｍｂｏｒｏ 病に認められる増加した損失で群の中で分離され、（Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ　Ｂｕ ｒｓａｌ　Ｄｉｓｅａｓｅ　Ｖｉｒｕｓ、Ｉ　Ｂ　Ｄ　Ｖ　；Ｙｕａｓａら、１ ９８０）そしてレオウィルスと関連して前翼病の動物の中で分離された（　Ｅｎ ｇｓｔｒＯｅｍ。

１９８８　ａ　；　Ｅｎｇｓｔｒｏｅｍら、１９８８ｂ’）。二重免疫の実験で 他の雛ウィルスに関連してＣＡＶの強めた性質が公開されたくたとえば１ｌａｒ ｅｋ病ウイルス、ＭＤＶ、Ｄｅ　Ｂｏｅｒら、１９８９ａ）、最近急激に減少さ れた接種反応はＮｅｗｃａｓｔｌｅ病とＣＡＶにおいて免疫管理にエアゾールワ クチン処理後の我々自身の実験で観察された。そのためＣＡＶは、他のウィルス 免疫における免疫抑制と強化効果を導く。

これらのＣＡＶの性質は、実際にウィルス性疾患の発生減少に影響をおよぼす。

ＣＡＶは、世界中に拡がっているようだ。ＣＡＭは日本でスタートしたと考えら れるが、その後最初のＣＡＶの単離はヨーロッパ、すなわちドイツでＶｏｎ　Ｂ ｊｌｏｗ（１９８３）によって、英国てＭｃＮｕｌｔｙら（１９９０）によって 行われた。オランダにおいて、アメリカ、イスラエル、チュニジアからの物質か らＣＡＶの単離がＢｏｅｒら（１９８８）によって行われた。利用しうる文献デ ータは、単離が１つの血清型に関して行われたことを示している。しかしいくつ かの単離の分野は、それらの相互の関係のためにそして病原体の中での異なって いる可能性のためにテストされている（ＭｃＮｕｌｔｙら、　＋９９０）　、ブ ロックの中でＣＡＶの伝播は、おそらく排泄物と空気を介する感染によって起こ る。子孫にウィルスの縦への伝播は、しかしまたＣＡＶ疫学の中で重要な役割を 演じている。

各国でＣＡＶの存在は、血清学的に証明された。

組織培養の条件下で、ＣＡＶは増加している。

ＣＡＶは、従来リンパ様白血病（１１０４−Ｘ５細胞；　Ｙｕａｓａ、　１９８ ３　）からのリンパ芽球細胞列で転位された。細胞変位効果（ＣＰＥ）のみによ るＭ　Ｄ　Ｖ中て゛（ＭＤＣＣ−ＭＳＢ　１細胞〉またはＭａｒｅｋ病のリンパ 球からのリンパ芽球細胞列に転移された。

Ｔｏｄｄらによる最近の研究（１９９０＞は、Ｃ５ＣＩＪ配中で１　、３３〜１ 　、３４　ｇ　、”　ｍ　ｌの比重で濃縮した２３．５ｎｍの直径をもつウィル ス粒子（精製されたＣＡＶ物質中での）が記載されている。ウィルスは１つの主 なポリペプチド（Ｍｒ；　５０．０００）と２３キロベースの長さをもつ単一鎖 のＤＮＡ遺伝子とをもつ。２つの小さいウィルス、すなわちＰｏｒｃｉｎｅ　Ｃ ４ｒｃｏｖｉｒｕｓおよびウィルスは、Ｐｓｉｔｔａｃｉｎｅ　ＢｅａｋとＦｅ ａｔｈｅｒ　Ｄｉｓｅａｓｅとを単一１１ＤＮＡと類似のＣＡＶとに結合させる 。

しかしより小さい遺伝子とより小さいウィルス粒子半径の（Ｒｉｔｃｈｉｅら、 １９８９　；　Ｔｉ５ｃｈｅｒら、１９８２）ＣＡＭは、バルボウィルスに属す ることは長い間受入れられた６パルボウイルスの多くは単一鎖ＤＮＡウィルスで あるけれども、それらは直［ＤＮＡと、より大きい遺伝子とを有し、生きたポリ ペプチドの他の組成物の可能性がある。

の　ｔ　看　、 ウィルスの複製と転写を含む細胞の構成は、もしもＤＮＡが２重鎮型であれば、 機能的であるということは一般に受入れられいる。単一鎖ＤＮＡを有するウィル スは、２重鎖ＤＮＡから成る層の中で細胞中で生じる。本発明はこの事実を用い ている。

本発明者は、ＣＡＶ感染１１０４−Ｘ５とＭＤＣＣ−ＭＳＢＩ細胞中で２．３キ ロベースの対の長さを有し、ＰＩＣ−２０Ｈ中でそれをクローンされた２重ｊｌ ｃＡＶ−ＤＮＡである特徴を有する。

ＤＮＡは図１に示すように十分な長さに配列されている１区分されることによる 診断テストにおいてクローンされたＣＡＶ−ＤＮＡおよびＣＡＶ核酸は、ウィル スの生体と組織培養標本中で表示されうる。クローンされたＣＡＶは、組織培養 と同一実験の中で野生型ＣＡＶの生物学的な特性と病原性の性質とを有すること がわかった。

ＰＣＲとハイブリッド形成の実験は、クローンされた完全なＣＡＶ遺伝子の場に おけるＣＡＶの典型である。Ｐ−３２で区分されたＤＮＡプローブのサザン分析 で、全ての場での単離によって２゜３キロベースのＤＮＡ分子を含むということ が示された。制限酵素分析は、クローンされたＣＡＶ−ＤＮＡが単離された場合 におけるＤＮＡに相当することを示す１煮染検定でジゴキシゲニンで区分され、 クローンされたＣＡＶ−ＤＮＡは異なった場での単離によって特別にＤＮＡで複 雑化されることが表された。オリゴヌクレオチドを用いるＰＣＲ実験で、クロー ンされたＣＡＶ配列（図４）から導かれたＣＡＶ−ＤＮＡの配列が特別に拡大さ れ、見分けがついた。

の詳細を辛述 本発明の第１の課題は、鶏貧血症ウィルス（ＣＡＶ）遺伝子またはその一部のヌ クレオチド配列に応答し、またはそれを補充するＣＡＶ特異、ヌクレオチド配列 からなる差別化されまたは差別化されないＤＮＡまたはＲＮＡの個体中での組替 え遺伝子情報である。

本発明の好ましい実施態様は、前記ＣＡＶ遺伝子またはその一部のヌクレオチド 配列が、図１で示される均一なヌクレオチド配列を少なくとも６０％含むことを 特徴とする。

可能な表現として、ＤＮＡとＲＮＡから選ばれた核酸、たとえば裸のＤＮＡまた はＲＮＡの固体中でおよびある方法（たとえば蛋白質またはウィルス粒子中）で 包まれたＤＮＡまたはＲＮＡの固体中で他の物質（たとえば担体または標識とし て機能する物質）と結合される。ＤＮＡは単一鎖または２重鎖ＤＮＡであり得る し、また直鎖状および円状でありうる。

本発明に関する組替え遺伝子情報の特徴は、ＣＡＶ特殊ヌクレオチド配列の中に 存在する。このＣＡＶ配列は、ＣＡＶ全遺伝子を覆う必要はない。

実験的な観点から特別な部分は本出願で最も必要であり好ましい。

第１の好ましい実施態様は、前記ＣＡＶ遺伝子またはその一部のヌクレオチド配 列が、ＣＡ　Ｖ遺伝子中で生じるＣＡＭ蛋白質のためにコード化するヌクレオチ ド配列かその一部であることを特徴とすることであり、このようなコード化配列 からなる組替えＤＮＡが、たとえばＣＡＶの検出に用いられ、試料中のメツセン ジャＲＮＡがＣＡＶ蛋白質またはその一部を製造するための方法として用いられ る。「その一部」という語は、原理的にＣＡＶ特殊性として設計されうる全ての 部分から成る。蛋白質レベルでこれは本出願の最も重要な、たとえば抗体による 認識されうる抗原決定のような課題であろう。

他の実験態様は、前記ＣＡＶ遺伝子またはその一部のヌクレオチド配列が、ＣＡ Ｖ遺伝遺伝子牛じる制御因子を有するヌクレオチド配列かその一部であることを 特徴とする。その−例は、ＣＡＶ蛋白以外の蛋白質のためにコード化する配列と 結合するＣ　Ａ　Ｖ促進物／増強物の使用である。たとえば鶏のような家畜やＣ ＡＶの制御信号が効果的である他の動物の中の非ＣＡＶ蛋白質の可能な拡張に使 用することである。

上の場合と一般の場合とに、本発明に関する組替え遺伝子情報は、またはＣＡＶ 遺伝子から誘導されないヌクレオチド配列からなる。ここで「ＣＡＶ遺伝子から 誘導されないヌクレオチド配列」とは、たとえば無核または有核発現ベクターか ら誘導されたヌクレオチド配列によって形成される。

かくて本発明は、真植生物の組織中で発現されるために適した（ウィルス性また は非ウィルス性）ベクター中で、または細菌中で発現するために適したプラスミ ド中へＣＡＶ特定物質配列の挿入の可能性からなる。さらにｒＣＡＶ遺伝子から 誘導されないヌクレオチド配列」として本発明に関する組替え遺伝子情報は、Ｃ ＡＶ遺伝遺伝子牛じないで制御因子を有するヌクレオチド配列からなる。

ｒＣＡＶ遺伝子から誘導されないヌクレオチド配列」は、しかしまたＣＡＶ蛋白 質以外の蛋白質（の一部）のためにコード化するヌクレオチド配列からなる。た とえばＣＡＶ制御信号が非ＣＡＶ蛋白質（またはその一部）にＣＡＭに接触しや すい宿主中に発現するために用いられる。

組替えＤＮＡがハイブリッドの生産またはＣＡＭ蛋白質が、非ＣＡＶ蛋白質のエ ピトープのための担体として機能する、または逆に非ＣＡＶ蛋白質がＣＡＶ蛋白 質のエピトープのために担体としもし本発明に従う組替え遺伝子情報が、試料中 の補充ＤＮＡまたはＲＮＡの検出のために用いられるならば差別化が必要である にこで用いる差別化は、ＤＮＡＪ？？ＲＮＡに用いるのに適する差別化されたＤ ＮＡまたはＲＮＡの検出を可能にし、容易にする標識である。当業者の中ではこ の目的に適した多くの標識、たとえば（Ｐ−３２のような）放射性同位元素、（ パーオキシダーゼのような）酵素分子、（ビオチンのような）ハプテン、染料、 （無機リン発光物のような）蛍光物質、および（金やセレンのような）粒子状標 識物が知られている。

また本発明の第２の課題は、特に、診断、免疫化または予防接種の目的またはＣ ＡＶもしくは非ＣＡＶ蛋白質の製造のために上で定義された組替え遺伝子情報の 使用に関する。

さらに本発明は、ＣＡＶ−ＤＮＡまたハＣＡ　Ｖ−ＲＮＡを検出する方法、たと えばＤＮＡ／ＲＮＡスロットブロッティング、サザンブロツティング、ノーザン ブロッティグ、特定部位における組替え、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によ るＤＮＡ拡張、Ｓ１マツピング、プライマエクステンションの方法におけるＣＡ Ｖ特殊プローブまたはプライマとして前記の組替え遺伝子情報を使用する方法で あり、Ｄ　Ｎ　Ａ　、／　ＲＮ　Ａスロットブロッティング、サザンプロツティ ング、ノーザンブロッティング、特定部位における組替え、ＰＣＨによるＤＮＡ 拡張、Ｓ１マツピングのようなＣＡＶ−ＤＮＡまたはＣＡＶ−ＲＮＡ検出のため の診断器具においてＣＡＭ特殊プローブまたはプライマとして前記の組替え遺伝 子情報を用いることを特徴とする診断器具である。

さらに本発明は、ＣＡＶまたは他の病原体に対する予防を実現するための生きた ウィルスワクチンとして、前記の組替え遺伝子情報を使用する方法であり、ＣＡ Ｖまたは他の病ｙ１＃に対する免疫化のためのワクチン調合法において、前記の 組替え遺伝子情報および生きたウィルスワクチンのために適する１つまたはそれ 以上の抗体または補助物からなることを特徴とするワクチン調合法である。

また本発明は、ＣＡＶ蛋白質、ＣＡＶ蛋白以外の蛋白を試験中または生体中で製 造するための方法において、前記の組替え遺伝子情報を使用する方法であり、前 記の組替え遺伝子情報を含むことを特徴とする原核生物または真核生物の細胞で あり、特に前記の組替え遺伝子情報を含み、前記遺伝子組替え情報によってエン コードされた少なくとも１つの蛋白質ｉたは蛋白質の部分の実現を可能にするこ とを特徴とする原核生物または真核生物の細胞である。これらの異なった可能性 はこの記述の中で広く説明されるだろう。

本発明の次の課題は、前記の組替え遺伝子情報の試験管内の転位によって得られ 、ＣＡＶ蛋白質またはそ一部のためにコード化するヌクレオチド配列からなるこ とを特徴とするＣ　Ａ　Ｖ蛋白質またはその一部であり、前記の組替え遺伝子情 報を含み、Ｃ、Ａ　Ｖ蛋白質またはその一部のためにコード化するヌクレオチド 配列からなり、その実現を可能にする原核生物または真核生物の細胞から単離に よって得られることを特徴とするＣＡＶ蛋白質またはその一部である。

また蛋白質のレベルについて、本発明は異なった応用に拡大されている。その実 施態様は、診断、免疫化もしくは予防接種の目的、またはＣＡＭ特殊抗体の製造 のために前記のＣＡＶ蛋白質またはその一部を使用する方法である。

より具体的に、ＣＡＶ特殊抗体を検出するための免疫的方法、たとえば免疫性過 酸化酵素、染料、ＥＬＩＳＡ、免疫性蛍光染料を用いる方法において、ＣＡＶ特 殊抗体を結合する試薬として前記のＣＡ　Ｖ蛋白質またはその一部を使用する方 法であり、免疫性過酸化＃素、染料、ＥＬＩＳＡｔたは、免疫性蛍光染料のよう な免疫的方法を用いて、ＣＡＶ特殊抗体を検出するための診断器具において、Ｃ ＡＶ特殊抗体を結合する試薬として前記のＣＡＭ蛋白質またはその一部を含むこ とを特徴とする診断器具である。

また本発明は、ＣＡＶに対する防護を実現するためのサブユニットワクチンとし て前記のＣＡＶ蛋白質またはその一部を使用する方法であり、同様にＣＡＶに対 する免疫を有するワクチン調整法において、前記のＣＡＶ蛋白質またはその一部 とサブユニットワクチンのために適する任意の１つまたはそれ以上の抗体と補助 体とからなることを特徴とする調整法である。

また本発明は、ＣＡＶ特殊ポリクロナールまたはモノクロナール抗体を製造する ための過程で、前記のＣＡＶ蛋白質またはその一部を使用する方法であり、これ らの応用例は、この記述の中で広く述べられている。

さらに本発明の次の課題は、また前記のＣＡＶ蛋白質またはその一部によって製 造されたＣＡＶ特殊抗体であり、同様に診断、免疫もしくは予防接種の目的また は調整法の目的のために、前記のＣＡＶ特殊抗体を使用する方法である。

より具体的にＣＡＶ蛋白質を検出する免疫的方法において試薬を結合するＣＡＶ 蛋白質として、前記のＣＡＶ特殊抗体を使用する方法であり、同様に免疫的方法 でＣＡＶ蛋白質を検出するための診断器具において、試薬を結合するＣＡＶ蛋白 質として、前記のＣＡＶ特殊抗体を含むことを特徴とする診断器具である。

さらにその実施態様は、ＣＡＶ感染に対する受動免疫のために、前記のＣＡＶ特 殊抗体を使用する方法であり、同様にＣＡＶに対する受動免疫調整法において、 前記のＣＡＶ特殊抗体との任意の１つまたはそれ以上の受動免疫に適した抗体ま たは補助体とからなることを特徴とする調整法である。特に、本発明に従う組替 え生産物の層で免疫化することである。

調剤法の応用に関しての一例は、ＣＡＶ蛋白質の単層および／まなは精製のため の方法で前記の特殊抗体を使用する方法である。最も重要な用途は、以下の実施 例中でより具体的に説明されるであろう。

え１」 ＣＡＶ感染細胞から分離した低分子ＤＮＡの分析。

精製したウィルスの標本から分離したＣＡＶ遺伝子は、約２３００塩基の長さを 有する１本ｌＤＮＡ分子であることが証明された（　Ｔｏｄｄら、１９９０）。

我々の予想は、ＣＡＶ感染細胞においてウィルスの環状１本鎖ＤＮＡを加えるこ とによって、環状の２本ｇＤＮＡがまた生じるということである。

環状の２本ＭＤＮＡは、制限酵素によって切断することができ、そしてそれゆえ に１本ｌＤＮＡとは対象的に直接クローンすることができる。それゆえに、非感 染細胞が存在しないＣＡＶ−感染細胞の低分子断片において、ＤＮＡ生産物が生 じるかどうか調べられた。

低分子ＤＮＡは、ＣＡＶ感染ＭＤＣＣ−ＭＳＢｌ、１１０４−Ｘ５細胞および非 感染１１０４−Ｘ５細胞から分離された。そのＤＮＡは、アガロース／エチジウ ムプロミドゲルで分別された。約３キロベースベア（ｋｂｐ）の長さを有する（ 測定値として）大変弱いＤＮＡバンドは、ゲルによって認識できる。この特定の ＤＮＡ生産物は、非感染細胞から分離されたＤＮＡには存在しない。

次のような実験において、その特定ＤＮＡは、ＣＡＶ−感染細胞においてのみ存 在することがより確実になった。感染細胞から分離されたＤＮＡは、アガロース ゲル法によって長さで分別された。

２．７〜３．５ｋｂＰの長さを有するＤＮＡが分離された。このようなりＮＡ断 片は、他の細胞のＤＮＡの他に、特定のウィルスＤＮＡを含まなければならない だろう９分離されたＤＮＡは、放射能で標識化され、そしてＣＡＶ−感染細胞か らの低分子ＤＮＡと非感染細胞からの低分子ＤＮＡとのサザン法で、ハイブリッ ドを形成した。

最高Ｔ３ｋｂｐのＤＮＡ生産物が、ＣＡＶ感染細胞のプロットでハイブリッドを 形成し、前記ＤＮＡ生産物は、非感染細胞のＤＮＡプロットには存在しなかった 。

３ｋｂｐの長さは、２本ＭＤＮＡ分子からなるＤＮＡマーカーで限定される。ア ガロースゲル中での２本鎖の環状ＤＮＡ分子の動きは、線状ＤＮＡ断片の動きと は異なっている。ＣＡＶ−感染細胞からの３ｋｂｐのＤＮＡは、実際には、２． ３ｋｂｐの長さの線状形のＤＮＡであり得た。

もし環状の２本１ｊＤＮＡのＤＮＡ分子を１カ所だけ切断する制御酵素で処理す るならば、２．３ｋｂｐの長さく測定値）を有する線状ＤＮＡ分子が形成されな ければならない。

この仮定の正しいことは、ＣＡ　Ｖ−感染１１０４−Ｘ５細胞から分離された低 分子ＤＮＡを６つの異なった制御酵素（ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩ ｌ、Ｋｐｎｌ、ＰｓｔＩ、およびＸｂａＩ）と−緒に保温することによって個々 に証明された。ＣＡＶ惑染感染０４−Ｘ５細胞から分離され、上記制限酵素で切 断された低分子のＤＮＡのサザンプロットは、上述した放射能で標識化されたＤ ＮＡプローブとハイブリッドを形成する。

このことは、制限酵素ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ、ＰｓｔＩおよびＸｂａｌでの処 理が２．３ｋｂｐの測定された長さを有するＤＮＡ分子を生じさせるということ を示している。ＢａｍＨＩと保温した非感染細胞のＤＮＡは、このＤＮＡ生産物 を含まない、その制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩは、ＤＮＡ内を２カ所切断するが、一 方、制限酵素Ｋｐｎｌは切断しない。

上記実験から、ＣＡＶ感染細胞の低分子ＤＮＡについて、２．３ｋｂｐ環状ＤＮ Ａ分子が生じ、前記低分子ＤＮＡは非感染細胞には存在しない。

そして低分子ＤＮＡは、環状２本１１１ＤＮＡ分子の形を有するＣＡＶ遺伝子で あるという結論を下すことができる。

バクテリアのベクターでの２本１１１ｃＡＶ−ＤＮＡのクローニングとサブクロ ーニング。

ＣＡＶ−感染１１０４−Ｘ５細胞の低分子ＤＮＡは、ＢａｍＨｌ、ＢｃｏＲｌ、 ＰｓｔＩおよびＸｂａＩと別々に保温された。そのＤＮＡは、低融点のアガロー スゲルで分離された。４つのＤＮＡの標本全てから２．３ｋｂｐのＤＮＡ分子が 分離された。クローニングベクターｐｌｃ−２０８は、低分子のＤＮＡを切断す る同じ４つの制限酵素で、別々に処理された。

線状ベクターは、“牛の腸のアルカリフォスファターゼ”で処理された。

各２．３ｋｂｐＤＮＡフラグメントは、ｐＩＣ−２０Ｈの制限酵素活性部位に相 当するところで連結された。連結生産物は、大腸菌株ＨＢ　１０１に転移された 。

４つのクローニング全てには、約２．３ｋｂｐの長さを存する挿入ＤＮＡを含む プラスミドが与えられた。さらに制限酵素による分析では、少なくとも７つのプ ラスミドが、同じＤＮＡフラグメントに含すれていることを示している。

しかしながらベクターの組替え位置は、環状の分子を切断、開口するために異な った酵素を使用したために異なっていた。制限酵素ＢａｍＨＩ、ＥｅｏＲｌ、Ｐ ｓｔＩおよびＸｂａｌによる制限酵素地図は、４つの全てのＣＡＶ−ＤＮＡクロ ーンで決定された。

４つの異なった”ＣＡＭ−ＤＮＡＮシアミドは、放射能で標識化され、そしてＣ ＡＶ−感染および非感染細胞から分離されたＤＮＡ　（ＢａｍＨＩで分解された サザンプロット〉とハイブリッドを形成する。全ての検査クローンは、ＣＡＶ− 感染細胞中に存在した２、３ｋｂｐＤＮＡ分子とだけハイブリッドを形成した。

２つのＣＡＶ−ＤＮＡクローンの生物学的活性。

２つのＣＡＶ−７０−ンｐ　ＩＣ−２０Ｈ／ＣＡＶ−ＥｃｏＲＩとｐｒｃ−２０ Ｈ／ＣＡＶ−ＰｓｔＩは、ベクターからＣＡＶを完全に分離するために制限酵素 で加水分解された。線状のＣＡＶ−ＤＮＡ分子はＴ、−ＤＮＡリガーゼで処理さ れた。

線状のＣＡＶ−ＤＮＡｓは、このように環状化される。現在２本鎖環状形を有し た“クローン化した”ＣＡＶ−ＤＮＡは、感染細胞である野生型ＣＡＶ−ＤＮＡ に取りついた。

ＭＤＣＣ−ＭＳＢＩと１１０４−Ｘ５細胞には、“クローン化した”環状ＣＡＶ −ＤＮＡｓが導入された。ｐ　ＩＣ−２０Ｈ／ＣＡＶ−ＥｃｏＲＩのクローン化 によって、非常に細胞変性効果（ＣＰＥ）が両細胞タイプに発見された。クロー ンｐＩＣ−２０８、、／’　ＣＡ　Ｖ　−Ｐ　ｓ　ｔ　Ｉは、ＭＤＣＣ−ＭＳＢ １細胞において鮮明なＣＰＥを起こし、そして１１０１−Ｘ５４［１１胞におい て不鮮明なＣＰＥを起こした。しかしながら１１０４−Ｘ５細胞に導入されたｐ 　ＩＣ−２０Ｈ／ＣＡＶ−Ｐｓｔ　ｒの上澄み液は、ＭＤＣＣＭＳＢＩ細胞で鮮 明なｃｐＥを起こす。ＣＡ　Ｖ−感染細胞から分離したＤＮＡのトランスフェク ションは、またＭＤＣＣ−ＭＳＢＩ細胞において鮮明なＣＰＥを起こし、一方１ １０４−Ｘ５．ｌ１ｌＩ胞においては、鮮明なＣＰＥが見られなかった。ＭＤＣ Ｃ−ＭＳＢ　１細胞はまたは１１０４−Ｘ５細胞のトランスフェクション後は、 ＣＰＥは、ｐｌｃ−２０ＨベクターＤＮＡでは認められなかった。

サザン分析は、クローン化したＣＡＶ−ＤＮＡによって得られたウィルスで感染 した（６節）ＭＤＣＣ−ＭＳＢ　Ｉおよび１１０４−Ｘ５細胞の細胞溶菌液にお いて、ＣＡＶ−ＤＮＡが存在していたことな示していた。

！ｖ７Ｄｃｃ−ＭＳＢＩ細胞での中和試験は、導入細胞においてクローン化され たＤＮＡによって起こったＣＰＥは、ＣＡ　ｖ　感染の結果であったことを示し ていた。Ｃ、Ａ　Ｖを支配した抗体の中和は、導入された細胞のＣＡ　Ｍ世代で 感染されたＭＤＣＣ−ＭＳＢＩ細胞のＣＰＥを妨げた。

１８雛に、その際その筋肉に導入細胞の上澄み液を注入した。鶏において、その 上澄みは野生型のＣＡＶと同じ臨床症状を起こした。それは総体重で違いが示さ れる成長の遅れ、青白い骨髄やヘマトリット値の減少（貧血症）、胸腺萎縮（特 定のＴ細胞の集団の不足）および死亡率などである。

ベクター−ＤＮＡに導入された細胞の上澄みは、対照の鶏において全く病気のき ざしを示さなかっな６ ２本鎖ＣＡＶ−ＤＮＡ遺伝子の配列分析。

完全な２本ＭＣＡＶ−ＤＮＡ遺伝子は、サンガー法（Ｓａｎｇｅｒら、１９７７ ）とマクサム・ギルバート法によって完全に配列が決定された。Ｍ１３配列アラ イマとＭ１３逆配何重ライマによって、４つのｐＩＣ−２０Ｈ／ＣＡＶ　（Ｂａ ｍＨＩ　：ＥｃｏＲＩ　：ＰｓｔＩ　；ＸｂａＩ）クローンの約２１００塩基の ＤＮＡ配列が決定された。それからＣＡＶ遺伝子は、サブクローン化された。Ｃ ＡＶ−ＤＮＡ遺伝子の５つの異なったサブクローンのＤＮＡ配列は、Ｍ　Ｂプラ イマと／またはマクサム・ギルバート法によるサンガー法で決定された。

このようにして両鎖のＣＡＶ遺伝子のＤＮＡ配列が決定された。

ＣＡＶ（２本ｊｉ）ＤＮＡの長さは、２３１９ｂｐである。環状ＣＡＶ遺伝子の ＥｃｏＲＩ部位の最初の塩基は、＋１と番号を付けられた。多くの７／最大の読 取り枠を含むＤＮＡ鎖の配列が、図１に示されている。そして（＋）Ｈと呼ばれ ている。

この鎖の塩基の構成は、アデニン２５．５％、シスチン２８．７％、グアニン２ ７．７％、チミン１８．１％である。ＣＡＶ遺伝子とすでに知られているウィル ス配列との起こりうる相同関係のコンピュータ解析は、そのＤＮＡが以前は記述 されてなく、また初期に記述されたつ゛イルス属の分野では形成されていないこ とを示している。ＣＡＶ−ＤＮＡ遺伝子の配列と形（環状）に関係する限りにお いては、ＣＡＭが微小ウィルスであるという最初の仮説はもはや正しくはない。

コンピュータ解析によるＣＡＶ遺伝子の組織化が、特徴付けられた。読取り枠、 プロモータ／エンパーサ−エレメント、ポリアデニル化シグナルと位置、および ゛複製の起源は”は予想される。

図２はＣＡＶの両ＤＮＡに関する予想した読取り枠（それは３００塩基以上であ るが）を示している０図２ａは、ＡＴＧコドンで始まる読取り枠を示している。

ＡＴＧコドンは、蛋白質に関して最も頻繁に使用される開始コドンである。この ことは、４４９アミノ酸（５１，６ｋＤａ）、２１６アミノ酸（２４Ｄａ）およ び１２１アミノ＃（１３，３ｋＤａ）の長さを有する３つの蛋白質に関して５両 ＤＮＡＨの１つとして、注目すべきである。　Ｔｏｄｄら（１９９０）は、精製 したＣＡＶにおいて５Ｏ−ｋＤａの蛋白質を示している。もし全ての読取り枠が 正確に利用されるならば、約８０％のウィルス遺伝子が、蛋白に読取られている 。

いくつかの領域が重なっているとしても３つの読取り枠が、１つのＲＮＡから読 取られることは十分に可能である。ＲＮＡ分子の予想した出発点は、位置３５４ と位置２３１７に加えられたポリ（Ａ）である、ポリ（Ａ）シグナルのみが、プ ラス鎖の位置２２８７である。

この読取り枠が他のＤＮＡ鎖に利用されたことは残念である。なぜならばこの鎖 は、幾つかの重要な正規の配列が欠けているからである１図２ｂと図２０とは、 開始コドンとしてＣＴＧとＧＴＧとを各々に使用した読取り枠を示している。し かしながらこれらの開始コドンが正確に使用されたことは、はんの偏かな蛋白質 に関してしか記載されていない（Ｈａｎｎら、１９８８）。

分別されたＣＡＶ蛋白質とすでに知られている蛋白との間の票似性についてのコ ンピュータ解析は、有能な１０グラマをもっても配列の存在に関しては、はんの 僅かな相同した与えられなかった。

したがってＣＡＶ蛋白質に似ている蛋白質のタイプが何かを予想することは、困 難である。比較的高い成功が、ウィルスコート、ＤＮＡ結合蛋白質および血液凝 固蛋白質で行われた。これらの結果はここには記載していない。

蛋白質の発現は、プロモータ／エンハンサ−エレメントで規定される（Ｊｕｎｅ ｓ、１９９０　）　、真核生物のプロモータは、転写物の開始以前はほとんど右 側に位置する。ＣＡＶ配列は、ＴＡＴＡボックス、ＳＰＩボックスおよびＣＡＡ Ｔボックスなどのような一般要素をキャップ部位の上流に含む。

これらのボックスの配列および部位は、真植生物のプロモータのほとんどに記述 されているそれらのボックスと非常によく一致する。２８５位置周辺には、ＣＲ ＥＢ、ＭＬＴＦ、ＧＴおよびＰＥＡ−１などの４つの異なつった転移因子に間す る結合部位が、存在するかもしれない。

真植生物の遺伝子は、真植生物のプロモータの強さを決定するエンハンサ−エレ メントを含む。

かなりのエンハンサ−エレメントは、２１ヌクレオチドの長さを有し、１４４位 １と２６０位１との間に位置する。５つの直列繰返し体である。全ての繰返し体 は、１９の同一のヌクレオチドをもつ。最後の２つのヌクレオチドだけが異なる 。繰返し体１は２と同一であり、そして３は５と等しい、繰返し体１．２および ３は、４および５のようにお互いのそばに位置している。繰返し体３と４との間 の位置には、１２のヌクレオチドの“欠陥”がある、コンピュータ解析は、原核 生物に記載されたエンハンサ−は、充分なＣＡＶエンハンサ−エレメントが備わ っている全ての配列を含んでいることを示している。全ての直列繰返し体は、Ｃ ＡＶ−ＲＮＡｓの転移物の増加を伴うがもじれないＡＴＦ要素を含む、その直列 繰返し体は、２つのＣＡＴＣＣ配列と２つのＣＡＧＣＣ配列とを含む、最後の配 列は、ＣＡＴＴボックスで重なっている。これら４つの配列は、β−グロムリン について記載されたＣＡＣＣＣボックスでわずか１つのミスマツチを有する（表 １）。

図３は、ＣＡＶ−ＤＮＡ　（１本鎖）における（＋）ＤＮＡ［の５５位置と１３ ５位１どの間と２１８０１８０位置７０２７０位置には大変大きなヘアピン構造 が概ね存在していることを示している。ＤＮＡのヘアピン構造は、ＣＡＶ−ＤＮ Ａの複製に伴うものかもしれない。２１８０と２２７０との間のヘアピン構造は 、ＣＡＶ−ＤＮＡのみでなく、ＣＡＶ−ＲＮＡにも存在し、ＣＡＶ−ＲＮＡの安 定化の役割を果しているらしい。

感染細胞におけるＣＡＶ型ＤＮＡの相違。

４つの異なツタＣＡ　Ｖ　−Ｄ　Ｎ　Ａ分子は、ＣＡＶ−感染細胞のＤＮＡ標本 のサザン点染で確認することができる。そのＤＮＡは、放射能で標示されたりｏ −ンｐ　ＩＣ−２０ＨＤＮＡ／ＣＡＶ−ＥｃｏＲＩのＤＮＡとでハイブリッドを 形成した。ＣＡＶ−ＤＮＡ分子は、非変性アガロースゲルとＳ■−ヌクレアーゼ の感受性で測定した長さと形から、それぞれ２本Ｈ開環（３ｋｂｐ）　、超螺旋 ２本鎖ＤＮＡ　（２ｋｂｐ）　、環状１本鎖ＤＮＡ（０゜８ｋｂｐ）および１本 鎖線状ＤＮＡである。ときどきＣＡＶの線状２本鎖ＤＮＡ型を確認することがで きる（　２　、３　ｋ　ｂ　ｐ　）　、　Ｔｏｄｄら（１９９０）は、非変性ア ガロースゲルでの電気泳動移動度をもとにして、ＣＡＶから分離された環状１本 １ＦＤＮＡについて０．８ｋｂｐの長さを測定した。

ウィルス標本でのＣＡＶ−ＤＮＡの検出。

全Ｄ　Ｎ　Ａ　ｉ、ｔ　ＣＡ　Ｖから分離され、そしてＶｏｎＢｊｉｌｏｗ　（ １９８９）によって記載された方法に従って精製された。そのＤＮＡ標本は、完 全なりローン化したＣＡＶ配列を含む標示されたＣＡＶ−ＤＮＡプローブを用い て、サイン法で分析した。

精製したＣＡＭから分離したＤＮＡは、０．８ｋｂｐの長さを有するＤＮＡ分子 を含む。その長さは非変性アガロースゲルで測定された。プローブとしてクロー ン化されたＣＡＶ−ＤＮＡ配列に由来するオリゴヌクレオチドを用いる、精製し たＣＡＭから分離したＤＮＡのサザン分析によって、（−）ＤＮＡ差がウィルス に含まれていることが証明された。このことから、カプシド中のＣＡＶの１本＠ ＤＮＡは、マイナス鎖であるという結論を下せるかもしれない。

ＣＡＶ体分析物からのＤＮＡのサザン分析。

ＤＮＡの標本は、１ｌａｒｅｋ病が広い範囲で起こっている群の鶏から得られた ＣＡＶ分離物から調整した。オランダの１２の会社で入手したＣＡＶ分離物のＤ ＮＡ標本は、６０のサンプルの収集物から選択的に選ばれた。その中の１社で、 Ｍａｒｅｋ病に関する高い死亡率が報告された。そのうえ、ＣＡＶ分離物は、は ろほろ鶏から由来した。我々によって調べられたＣＡＶ分離物は、アニマルヘル スサービスによって試験で立証された胸腺の萎縮後に得られた。

クローン化したＣＡＶ−ＤＮＡ　（ｐ　ＩＣ−２０Ｈ／ＣＡＶ−ＥｃｏＲＩ　） と他のＣＡＶフィールド分離物との間の類似の度合を研究する目的で、ＭＤＣＣ −ＭＳＢ　Ｉ細胞を、分離されたＣＡＶＭで感染させた。サザン分析で処理され た。サザン分析で処理された全てのＤＮＡ標本は、３２−Ｐを標示したクローン 化したＣＡＶ−ＤＮＡとハイブリッドを形成したＤＮＡ分子が含まれていた。

他のＣＡＶフィルード分離物のＤＮＡ分子は、クローン化したＣＡＶのＤＮＡ分 子の長さに相当する長さを有し、そのＤＮＡ分子は、２本鎖または１本鎖である 。サザン点染分析で直接処理されるＣＡＶ感染の野生の鶏の組繊細胞のサンプル は、標示されたｐＩＣ−２０Ｈ／ＣＡＶ−ＥｃｏＲＩでハイブリッドを形成した ＤＮＡ分子を含むことをか発見された。

ＣＡ　Ｖフィルード分離物からのＤＮＡの制限酵素分析。

クローン化したＣＡＶ遺伝子に関して他のＣＡＶフィルード分離物からのＤＮＡ の類似性は、制限酵素分解などによってさらによく調べられる。

ＣＡＶ分Ｍ物のＤＮＡ原本と、クローン化したＣＡＶのＤＮＡ１１本は、７つの 制＠酵素で切断されている。その酵素であるＢａｍ８丁、Ｂｇ　Ｉ　Ｉ、５ｓｔ ｌおよびＸｂａｌは、全てＤＮＡ５と同一に切断することを実証した。フイルー ド分離物のほとんどのＤＮＡは、２つのＡｃｃＩ部位および／または２つのＨｉ ｎｄＩ１１部位を含んでいた。

一方はんの偏かの分離物のＤＮＡは、）：ｃｏＲ１部位を含む０図５は、クロー ン化した制限酵素地図と他のフィルード分離物とを要約している。制限酵素部位 によれば、関連しな位置を含むフィルード分離物の数は、括弧で囲まれている。

ＣＡＶフィルード分離物からのＤＮＡのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）。

クローン化したＣＡＶ−ＤＮＡ配列に由来するオリゴヌクレオチドＣＡＶ−１と ＣＡＶ−２（図４）とが合成された。これらの合成オリゴヌクレオチドを使用す るＰＣＲは、ＣＡＶの分野からＤＮＡを特異的に検出するために処理された。他 のＣＡＶ分離物で感染されたＭＤＣＣ−ＭＳＢ　１ｍ胞から分離されたＤＮＡと 、非感染細胞から分離されたＤＮＡとは拡大された。拡大された後、そのＤＮＡ は、アガロース／エチジウムプロミドゲルを用いて電気泳動により長さで分別し た。拡大された１８６ｂＰバンド（その値は理論的に予想される）は、他のＣＡ Ｖ分離物で感染した全ての細胞のＤ　Ｎ　Ａサンプルで確認できた。この特異的 なバンドは、非感染細胞から分離した拡大後のＤＮＡには存在しなかった。全て のフィルード分離物の拡大されたＤＮＡバンドは、アガロースゲルにおいて、同 一泳動の割合を示している。この結果は、他のＣＡＶフィルード分離物の遺伝子 の部分に、大きな欠失や挿入が生じていないことを示している。３２−Ｐで標識 化されたオリゴヌクレオチドＣＡＶ−３（図４）を用いたサザン分析は、１８６ ｂｐの拡大されたＤＮＡはＣＡＶ特異性であり、そして他のＤＮＡバンドはＣＡ Ｖ−３プローブとハイブリッドを形成していないことを示す。

ＣＡＶ−ＰＣＨの検出感受性を調べた。ＣＡＶ感染細胞から分離されたＤＮＡは 、除々に溶解され、拡大され、そしてアガロース／エチジウムプロミドゲルで分 析された。約１００のＣＡＶ感染細胞の中のＤＮＡ総量に相当する総量のＤＮＡ を含むサンプルの拡大後、１８６ｂｐのＣＡＶ特異性ＤＮＡフラグメントが検出 された。しなしながら拡大されたＤＮＡが、３２−Ｐで標識化されたＣＡＶ−Ｄ ＮＡを用いたサザン分析法で指示されたときはいつでも、１細胞からのＤＮＡに 相当するＤＮＡ量は、すでに鮮明に確認できるＣＡＶ−特異性ＤＮＡバンドとし て生じることが発見され７’、：、ＣＡＶ−ＰＣＲは、今まで調査したＣＡＶ− 分離物に対して特異的である非常に高感度の検出方法である。

ジコキシゲニンを標示したＣＡＶ−ＤＮＡ１０−プを用いてＣＡＶフィールド分 離物からのＤＮＡのドツトプロット。

ＰＣＲを加えることにより、分析物はＣＡＶフィールド分離物からのＤＮＡの検 出に関して発現された。この試験は、放射能のプローブを使用していない、りｏ −７ｐ　ＩＣ−２０Ｈ／ＣＡＶ−ＥｃｏＲＩの挿入したＣＡＶ−ＤＮＡは、１ｌ −ｄＵＴＰ−ジコキシゲニンで標示された。ＭＤＣＣ−ＭＳＢＩ細胞からのＤＮ Ａ標本は、それらは別々に他のＣＡＶ分離物に感染しているが、これらはフィル タで吸取られ、ジコキシゲニンを標示したＤＮＡプローブとハイブリッドを形成 する活性が分析された。

ＭＤＣＣ−ＭＳＢ　１細胞からのＤＮＡ標本は、ジコキシゲニンの標示されたＤ ＮＡプローブとハイブリッドを形成した他のＣＡＶ分離物で感染されており、一 方、感染していない細胞の培養液からのＤＮＡは、ハイブリッドを形成しなかっ た。

放射能に標示されていないＣＡＶ−ＤＮＡプローブを使用するこのテストは、そ れゆえにＣＡＶフィールド分離物からのＤＮＡの検出について安定である。

（月 ＤＮＡ。

ＣＡＶ配列たとえばｐＩＣ−２０Ｈ／ＣＡＶ−ＥｃｏＲＩ−ＤＮＡプラスミドま たは部分などは、研究や特殊症状の用途に関して調べられるための標本として、 ＣＡＶ−ＤＮＡおよび／まなはＲＮＡを証明するために利用することができる。

ＤＮＡは、放射能でまたは他の方法でたとえばビオチン／ノコキシゲニンで標識 化されるかもしれない。

ＤＮＡ／ＲＮＡスラット点染、サザン／ノーザン分析および試験管内でのハイブ リッド形成によって、ＣＡＶ核酸の存在を立証することができる。

ここで使用したＣＡＶ配列の部分は、またＤＮＡオリゴマーでもある。

クローンｐ　ＩＣ−２’ＯＨ／ＣＡＶ−ＥｃｏＲＩのＣＡＶ配列に由来するオリ ゴマーは、非常に低い濃度のＣＡＶ−ＤＮＡ／ＲＮＡの由来を明らかにする。“ ポリメラーゼ連鎖反応”　（ＰＣＨ２）に利用することができる。ＰＣＲは、ウ ィルスの検出にしばしば利用される大変感度の高い方法である。

上記の応用をもとにした診断用の器具は、実用化が可能である。

研究目的のためには、ＣＡＶ−ＤＮＡフラグメントを用いたＳＩマツピングやプ ライマーエクステンションのような技術が重要である。これら２つの方法により 、ＣＡＶ−ＲＮＡの量を計ることができ、そしてより特徴を表すことができる。

非転写原子配列でのオリゴマーは、遺伝子の作用を研究するために利用すること ができる。これらはまたウィルスの複製を阻害する新しい方法の研究に関するモ デルとしても役立つかもしれない。

もしＣＡＶ遺伝子の欠失によって、病原性の特性が著しく取除かれるならば、Ｃ ＡＶ−ＤＮＡは、低分子の遺伝子フラグメントに関するトランスフィクションに おいて、キャリアとして利用されているかもしれない。

非転写原子配列中のＣＡＶオリゴマーはウィルスのベクターを表し、それは生き ている動物や試験管内でのＣＡＶ複製または他の遺伝子の作用の研究を可能とす るかもしれない。

ＲＮＡ。

Ｓ　ｐ　６　／　Ｔ　７ベクターでクローン化したＣＡＶ−ＤＮＡフラグメント が、ＣＡＶ−ＲＮＡ生産物を生じる。試験管内転写によって得られたＣＡＶ−Ｒ ＮＡｓは、試験管内または試験管外でのＣＡＶ蛋白質の合成に利用することがで きる。このようにたとえば小麦遺伝子抽出において、ＲＮＡ分子は、蛋白質に翻 訳されることができる（試験管内翻訳）。試験管内翻訳によって、得られたＣＡ Ｖ蛋白質は、たとえば鶏のリンパ液において、直接ＣＡＶに抗する抗体の由来を 明らかにするために利用できるかもしれない（下記参照）。ＣＡＶ−ＲＮＡ分子 はまたその中で蛋白質を翻訳させるために、顕微注射によって挿入されるかもし れない、このようにＣＡＶ蛋白質の効果は、細胞レベルで研究されることができ る。蛋白質と蛋白質および／または蛋白質とＤＮＡの相互作用はまた分析するこ とができる。

ＣＡＶ−ＲＮＡｓはまた、標本中のＣＡＶ核酸の由来を明らかにするためにプロ ーブとして利用することができる。この分析は、ソルトプロット、サザン、ノー ザンおよびサイトでのハイブリッド形成分析によって、結論を下すことができる 。このような方法は、ＣＡＶに間する診断試験の発展に利用することができる。

蛋白質。

全てのＣＡＶ蛋白質は、原核生物または真核生物において発現することができる 。このことは、安定した発現ベクター中で、クローン化されることが見出せるＣ ＡＶ読取り枠を必要としている。

バクテリアの組織は、ＣＡＭ読取り枠の発現に関して安定なＴ７−プロモータを もとにした発現ベクターが存在する。バキュロウィルス組織、酵母およびＣＨＯ −テエファ組織は、真核生物の発現組織を可能とする。それゆえにレトロウィル スベクターのようなライスルベクターもまた望ましい。

それらの上に位置するＣＡＶ蛋白質またはエピトー１は、ＣＡＶに向かう抗体の 由来を明らかにするために利用することができる。このようにして、ＣＡＶ感染 鶏は追跡された。

それらの上に位置するＣＡＶ蛋白質またはエピトープは、免疫性パーオキシター ゼ着色、ＥＬＩＳＡｓ、および免疫性蛍光分析などのような免疫検定に利用され ることができる。

それらの上に位置するＣＡＶ蛋白質またはエピトープは、ＣＡＶに抗する体液お よび／または細胞定着免疫を証明するのに利用することができる。

真植生物および原核生物のベクター７・′宿主組織の発現によって得られたＣＡ Ｖ蛋白質は、サブユニットワクチンの効力に関して利用することができる。

それらの上に位置するＣＡＶ蛋白質またはエピトープによってＣＡＶ感染鶏の標 本内で、ＣＡＶ蛋白質と蛋白質とを追跡することを可能とするＣＡＭ特異性の抗 体が得られる（以下を参照）。

抗体。

幾つもの感染テストをへて、母性抗体がＣＡＶ感染に対し、効果的な受動防御を 規定することが確認された。母性抗体は、新しく生まれたひよこに卵黄抽出液を 含んだＣＡＶ抗体を注射するような自然な道筋を通して若いひよこに伝えられた 。

ＣＡＶ５染に対する受動の防衛はまた、卵を生むほんの少し前にＣＡＶに感染し た産卵鶏からの卵の卵黄抽出液を注射する方法によっても供給される。

上述したシステムの１つについて表されるＣＡＶ蛋白の産卵鶏への予防注射は、 母性抗体の形成をもたらす。これら産卵鶏の若いひよこは、ＣＡＭ感染に対して 守られる。

診断テストはＣＡ　Ｖに対する抗体に基づいて展開される。ポリクローナルおよ びモノクローナル抗体のどちらも、このために使用される。ＣＡＶ特異性抗体に よって、標本はＣＡＶ蛋白の存在について試験される。

上記ＣＡＶ抗体の適用は、本発明に関する抗体で可能であり、その中で述べられ たようなプロセスにて得られ、自然のＣＡＶ抗体に関する限りは同じ方法である 。

生体ウィルスワクチン。

生体ウィルスベクターの方法による免疫系のウィルス性蛋白の供給は、サブユニ ットワクチンよりも免疫応答が、結果として良くなるらしい、１つもしくはそれ 以上のＣＡＶ読み取り枠（全体または一部分）は、生体ウィルスベクター内でク ローンされる。家畜においては、鶏組織中でそれ自身が良好な複製を示す生体ウ ィルスベクターのみが使われる。鶏への適用のため、ベクターとして好適なもの は、たとえば鶏痘ウィルス、リドローバルベクター、ヘルプスウイルスベクター （鶏、ヘルプスウィルス血清型１，２．３）、感染性喉頭気管ビールスそしてま たＣＥＬＯのようなアデノウィルスである。上記生体ウィルスベクターを用いて 免疫性付与は、ＣＡＶやキャリアウイルスに対して防衛性を有する。

ＣＡＶ遺伝子中に１つまたはそれ以上の欠失を適用することにより、若いひよこ のＣＡＶ！！ｉ染に対する免疫性を与えるワクチンを開発することができよう。

欠失を適用するときはＣＡＶ感染の病原性形質は削除されなければならないが免 疫にする特性は保持されなければならない。

ＣＡＭ遺伝子はまた、他のウィルスの抗原の発現のための生体ウィルスベクター として都合がよい、これはＣＡＶ蛋白の代わりにまたは加えて「外来」ウィルス 蛋白を発現するようにＣＡＶ遺伝子を変化させることが必要である。ＣＡＶベク ターは、したがってワクチン接種された動物が組替えベクターにより、ウィルス 性蛋白質の発現に「外来」ウィルスのみまたはＣＡＶに対して防衛を生ずるよう に構成される。

サブユニットワクチン、欠失ワクチンとして生産されたＣＡＶワクチンまたは他 のウィルスベクターは、主に産卵鶏の予防接種に使われる。けれどもひよこへの ワクチン接種、たとえばマークス病に対するワクチンとの組合わせは、また本発 明の使用可能性に残されている。

エンハンサ−／プロモータ成分。

ＣＡＶプロモータおよびエンハンサ−エレメントは、ＤＮＡベクターにてクロー ン・できる。ＣＡＭプロモータ、′エンハンサー調節のもと、ＣＡ■蛋白または 「外来」蛋白は、鶏細胞と他のタイプの細胞のどちらにおいても発現することが できる。

ＣＡＶ蛋白は（鶏）の骨髄細胞の機能によるものであると考えられる。遺伝子療 法のモデルシステムとして、「外来」蛋白は、ＣＡＶプロモータ／エンハンサ− エレメントにより、随時もとのウィルス姓ベクターと組合わせることで試験管内 に骨髄細胞にて発現される。遺伝学的に変性された骨髄されたは、骨髄、この場 合は鶏の骨髄に移植される。遺伝子フラグメントがとても小さいために、ＣＡＶ 遺伝子自身もまた、ベクターとして使用に好適である。

ＣＡＶエンハンサ−／プロモータ成分はまた、他の生物にも活性を有する。ケー スとしては、この成分はたとえば遺伝療法のモデルとしてねずみ組織にも使うこ とができる。

我々のＣＡＶプロモータまたは他のプロモータのｍ整のもとてのＣＡＶ自身の生 成もまた、遺伝療法技術の研究と開発の可能性を供給する。

クローニングベクターとしての完全または充分なＣＡＭ遺伝子使用の可能性すな わち、鶏組織への真核細胞プラスミドの一種のようならのは、発現されたＣ　、 Ａ　Ｖ遺伝子の構造の見地より現実に考えられる展開である。

ＣＡＶクローン　ＩＣ−２０８／ＣＡＶ−ＥｃＬ影土ＬＩＩ Ｐ　ＩＣ−２０Ｈ／ＣＡＶ−ＥｃｏＲＩプラスミド変換したＨＢ　１０１細胞の グリセロールストックは、１９９０年９月７日、％６ｊｈ６ｒｌａｎｄｓのＣｅ ｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ　ｖｏｏｒ　Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ　ａ ｔＢｕａｒｎにて沈殿され、番号はＣＢ５３６１．９０である。

図面の簡単な説明 図１はクローン化されたＣＡＶ−ＤＮＡ塩基配列である。全長は、２３１９の塩 基であり、ＥｃｏＲＩの最初のＧがＮｏ、１の位置で占めている。

図２は、両ＤＮＡ鎖について、３００以上に塩基の長さを有する予測の読み取り 枠（ＯＲＦ）である、０ＲＦｓには、３つの異なる開始コドンＡＴＧ、ＣＴＧ、 ＧＴＧが予想され、３つの図面２Ａ、２Ｂ、２Ｃがそれぞれ示されている。

図３は、１本１１ＤＮＡから成るＣＡＶ遺伝子のヘアピン構造のいくつかの予想 図を示している。

図４は、ＰＣＲに使われるオリゴヌクレオチドを示す、ＤＮＡの配列とＣＡＭ遺 伝子上のオリゴヌクレオチドの位１が示される。ＣＡＶ遺伝子中のヌクレオチド の位置は、図１のそれと一致する。

図５は、クローン化したＣＡＶ−ＤＮＡの制限酵素地図を示す。括弧内は遺伝子 中で適切な制限酵素部位により所有される総計２１のうちの単離ＣＡＶの数であ る。

Ｌ且亙１１ 細胞培養とウィルス。

単離ＣＡＶは、サブグループＡ（１１０４−Ｘ−５）の鶏白血病ウィルスまたは マークス病ウィルス（ＭＤＣＣ−ＭＳＢ　１　）により引起こされた、鶏腫瘍か らのトランスフオームされたリンパ芽球症質の細胞系にて培養された。細胞培養 は約０゜１〜ＩＴＣＩＤ５０／細胞に感染させる。２日後、細胞は収穫される。

細胞はクローンされなＣＡＶ−ＤＮＡの子ウィルスまたは単離フィールドに感染 させる。ＣＡＶ−Ｃｕｘ−１，初めはドイツにて１ｌａｒｅｋ病にかかった鶏の 群れから単離されたもの（Ｖｏｒ　Ｂｕｌｏｗら、１９８３．１９８５＞は、化 アイルランドＢｅ１ｆａｓｔのＶｅｔｅｒｉｎａｒｙ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈＬａｂ ｏｒａｔｏｒｉｅｓのＤｒＪ、Ｓ、ＭｃＮｕｌｔｙによって提供された、１９８ ８年１月アメリカ、　Ｎｅｗａｒｋ、Ｄｅｌａｗａｒｅ大学のＤｒ、Ｊ、Ｐ、Ｒ ｏｓｅｎｂｅｒｇｅｒは、鷺ａｒｅｋ病系統Ｔ−１７０４の病毒性の法廷のため の２種類の血液サンプルと、その派生物、鶏の初代継体であるＭＤＶ−Ｄｅｌ− ５を送った。我々はＣＡＶ−Ｔ−１７０４と単離ＣＡＶ−Ｄｅｌ−３をＭＤＶ− 系Ｔ−１７０４そしてその派生物ＭＤＶ−Ｄｅｌ−５に感染させた５ＰＦ−鶏か ら得た。単離オランダＣＡＶは、６０１Ｍの培養された全てのＭＤＣＣ−ＭＳＢ Ｉから選択された。フィルード原料はＧｅｚｏｎｄｈｅｉｄｓｄｉｅｎｓｔ　Ｂ ｒａｂａｎｔ　ａｔ　ＢｏｘｔｅｌのＪ、Ｃ，ｖｏｎｄｅｎ　Ｉｌｉｊｎｇａａ ｒｄとＧｅｚｏｎｄｈｅｉｄｓｄｉｅｎｓｔ　ｖｏｏｒＰｌｕｉｓｖｅｅ　ａｔ 　ＤｏｏｒｎのＪ、Ｎａｂｅｒより供給された。我々のＳＰＲ群から得られた単 離ＣＡＶはその系列に添加した。

全ＤＮＡの単離。

ウィルスと肝臓の調整品は、２０ｍＭのトリス塩酸液ｐＨ７，５，２ｍＭのＥＤ ＴＡ、０．２％のＳＤＳ、０．６ｍｇ／ｍｌのブロティナーゼにと再懸濁し、３ ７℃で１時間インキュベートされる。調整品はフェノール−クロロフォルム−イ ソアミルアルコール（２５：２４：１）で抽出され、ＤＮＡはエタノール法で沈 殿される。ＤＮＡベレットは、再び１００μｌの１．０　ｍ　Ｍ　トリス塩酸ｐ Ｈ７，５，１ｍＭＥＤＴＡに懸濁される。

低分子ＤＮＡの抽出分析。

低分子ＤＮＡは、Ｈｉｒｔにより述べられた方法（１９６７）に従い、ＣＡＶ感 染した１１０４−Ｘ５とＭＤＣＣ−ＭＳＢＩ細胞および未感染の１１０４−Ｘ５ から単離された。このＤＮＡはアガロースゲル上にて分離され、エチジウムプロ ミドにて染色した後、直接紫外線によりまたはサザンにて述べられた方法（１９ ８２）にてベトレースフィルタ上にてプロットして分析する。このプロットはラ ンダムプライムした３２−Ｐで標識化されたＤＮＡとハイブリッドを形成し、２ ．７〜３．５ｋｂの長さを持−’）ＣＡＶ感染１１０４−Ｘ５細胞の低分子ＤＮ Ａから単離される。

ＣＡＶ−ＤＮＡのクローニング。

完全なＣＡＶ−ＤＮＡ遺伝子は細菌ベクターｐＩＣ−２０Ｈ中にクローンされる 。ＣＡＶ−ＤＮＡ遺伝子の一部分は、ベクターｐＩＣ−１９Ｈにクローンされる 。クローニング段階の全てのプラスミドは、　１ｌａｎｉａｔｉｓらによって述 べられた方法（１９８２）に原理的に従って遂行された。

ＣＡＶ−ＤＮＡの配列分析。

ＣＡＶ−ＤＮＡプラスミドは、ＣｓＣ１グラジェントとセファクリール５５００ 　（ファルマシア）クロストグラフィにて精製された。２本鎖ＤＮＡは、Ｔ、Ｄ ＮＡポリメラーゼ（ファルマシア）またはＴａｑ　ＤＮＡポリメラーゼ（１０メ ガ）を用いる方法により配列される６固方法はファルマシアとプロメガの教えに 従って行われた。オリゴヌクレオチドは、ファルマシアのＴ、ヌクレオチドキナ ーゼによりリン酸化される。「ストロンゲストツブ、はｉｌａｘａｍとＧ１１ｂ ｅｒｔによる方法（１９７７）に従って配列される。

クローンＣＡＶ−ＤＮＡ遺伝子の環状化。

完全なＣＡ　Ｖ　−Ｄ　Ｎ　Ａ遺伝子を含んだ１０μｇのクローンＤＮＡの７ラ スミドは制限酵素と温浸され、完全なＣＡＶ挿入ＤＮＡはベクタＤＮＡから分離 される。２３キロベースを有する１対の線状のＣＡＶ−ＤＮＡ分子のＴ、−ＤＮ Ａリガーゼ処理によって、環状２本鎖ＣＡＶ−ＤＮＡが生じる６リガーゼ生産物 は０．８％アガロースゲルで分析された。

Ｄ　Ｅ　Ａ　Ｅ−デキストラン　トランスフェクション。

１１０４−Ｘ５とＭＤＣＣ−ＭＳＢ　１細胞のトランスフェクションのため、２ μｇの再リガーゼ処理したＣＡＭ−ＤＮＡは、２回２５μｌのＭｉｌｌｉ−Ｑ水 に懸濁され、２６０μｌのＴＢＳバッファと混合される。１０ｍｇ／ｍｌ　ＤＥ ＡＥ−デキストラン１５ｍ１を、ＤＮＡ混合液に加えられ、混合液は３０分温室 にてインキュベートされる。

１１０４−Ｘ５１１１１胞、１〜２Ｘ１０’の１１０４−Ｘ５細胞を１プレート 上に持つ５０ｍｍの組織培養プレートは、２度ＴＢＳバッファで洗浄される。Ｔ ＢＳバッファはＩＩＩＩＩ胞単一層から完全に除かれ、３００μｌのＤＥＡＥ− デキストラン／ＤＮＡ−希釈液が加えられる。細胞は３０分間、室温でインキュ ベートされる。ＤＥＡＥ−デキストラン／ＤＮＡ混合物は、２ｍｌの２５％ＤＭ ＳＯ／ＴＢＳに置換えられ、細胞単一層は２分間室温にてインキュベートされる 。細胞はＴＢＳバッファで２度洗浄され、それから組織培養培地（ＲＰＭ１１６ ４０またはＥ−ＭＥＭ）に加えられる。

細胞は５％ＣＯ２のもと３７℃でインキュベートされる。

ＭＤＣＣ−ＭＳＢ　［１胞、　約２ｘ　１０’　ＭＤＣＣ−ＭＳＢＩ細胞は卓上 遠心分離機にて１５００ｒｐｍで遠心分離される。培地は５ｍｌのＴＢＳバッフ ァにて置換えられ、細胞は注意深く再度懸濁される。洗浄は繰返される。ＴＢＳ バッファは全て除かれ、細胞ベレットは３００μｌのＤＥＡＥ−デキストラン／ ＤＮＡ混合物に注意深く再度懸濁され、室温にて３０分間インキュベートされる 。０．５ｍｌの２５％ＤＭＳＯ／ＴＢＳが添加され、懸濁液は室温で３分間イン キュベートする。

５ｍｌのＴＢＳが添加され、細胞は卓上遠心分離機にて１５００ｒｐｍにて遠心 分離される。上澄み液は除かれ、５０ｍ１の組織培養培地が加えられる。細胞は 再度懸濁され遠心分離される。

細胞は５ｍｌの組織培養培地に入れられ、５％Ｃ○２のもと、３７℃でインキュ ベートされる。

管理の方法によって、２μｇのｐＩＣ−２０Ｈプラスミドがトランスフェクショ ンに使われる。

試験管内における中和テスト。

ＭＤＣＣ−ＭＳＢＩ細胞はＭＤｃｃ−ＭＳＢＩの上澄み液に感染され、１１０４ −Ｘ５細胞はクローン化シた“’ＣＡＶ　ＤＮＡ”とトランスフェクトされる。

約２×１０４の細胞が感染させられた。この接種材料のウィルス含有量は、正確 にはわからない。５染細胞培養の培地の半分にＣＡＶに対して直接の中和活性を 持つポリクローナル血清が１　：　１００に希釈され、培地に加えられる。

管理によって、ＣＡＭ感染ＭＳＢＩ細胞の「良」の系列は取除かれ、培地に加え られるＣＡＶに対する抗血清は存在しない。

１日ひなのＣＡＶ感染。

ＣＡＶ−ＤＮＡ上澄み液とトランスフェクトされたＭＤＣＣ−ＭＳＢＩ７）調整 ＤＮＡと１１０４−Ｘ５細胞は、１日ひなに筋肉内注射される。ヘマトリット値 と体重が最初に測定された後、感染６日後に検死（解剖）が５羽／１グループの ひなで行われる。ウィルスの分離と免疫組織化学のため、ヘパリン血液、胸腺、 骨髄が集められる。免疫組織化学的調査は胸腺クーへと特にＣＡＶ特異性モノク ロールＣＶＩ−８５，１につきパーオキシダーゼ染色法によって行なわれる。感 染後１４日および２８日さらに５羽のひよこの検死（解剖）を行い、上述の全て の測定が行われる。

ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）。

オリゴヌクレチドはサイクロンＤＮＡシンセサイザー（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ　Ｉ ｎｃ、ＵＳＡ）の方法にて合成される。配列は図１に示したＣＡＶ−ＤＮＡ配列 から導き出される。ＰＣＲはＣＡＶ感染そして非怒染のＭＤＣＣ−ＭＳＢ　１細 胞からＤＮＡを単離される。本試剤の最終濃度は５０ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭの トリス塩酸（ｐＨ８，３＞３ｍＭのＭｇＣ１□、０．０１％の牛血清アルブミン 、２００μＭの各ｄＮＴＰ、１μＭの各オリゴヌクレチド、そして２ユニツトの Ｔａｑ−ＤＮＡポリメラーゼ（ＣＥＴＵＳ、ＵＳＡ）が１００μｍに入っている 。ＤＮＡサンプルは循環的にＰｅｒｋｉｎ　Ｅ１ｍｅｒ／Ｃｅｔｕｓサーマルサ イクラ−中にて３０回９３℃で１分間、５５℃で１分間、７２℃で３分間インキ ュベートされる。増幅されたＤＮＡの１／１０は、２％アガロース／エチジウム プロミドゲル上にてまたはサザンプロット分析法にて特設分析される。

使用されたＤＮＡプローブは、ｌ１ａｎｉａｔｉｓらの方法（１９８２）に従っ て末端に３２−Ｐで標識化されたオリゴヌクレオチドである。

ドツトプロット分析。

Ｐ　ＩＣ−２０Ｈ／ＣＡＶ−ＥｃｏＲＩに挿入されたＣＡＶ−ＤＮＡは分離され 、供給者のプロトコールに従い、ジゴキシゲニンーｄＵＴＰ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇ ｅｒ、　Ｍａｎｎｈｅｉｍ、　ドイツ）で標識化される。

Ｂｉｏｔｒａｃｅ−ＲＰフィルタは、１．５ＭＮａＣ１と０．１５Ｍクエン酸ナ トリウムで飽和された。ＤＮＡサンプルは１ｍＭのＥＤＴＡを含む１０ｍＭのト リス塩酸で再度懸濁され、３分間煮沸され、氷上で冷却され、フィルタ上に１か れる。フィルタは室温で乾燥され、３０分間６５℃でインキュベートされる。そ のフィルタは、ジゴキシゲニンで標識化されたＤＮＡとハイブリッドを形成した 。ジゴキシゲニンで標識化されたＤＮＡは、供給者のプロトコールによる免疫学 的染色法により可視化された。

（以下余白） 表Ｉ　ＣＡＶのエンハンサ−１・′プロモータ領域における既知の結合配列要素 転写因子 要素　共通配列　ＣＡＶ配列　Ｃ、Ａ　Ｖ配列中の部位！、　−ＴＡ丁Ａ−＃　 ＧＴＡＴＡＡ／７ＡＡ／Ｔ　Ｇ丁ＡＴＡＴＡＴ　３２１−３３０＋２、ＳＰＩ　 ＧＧＧＣＧＧ　ＧＧＧＣＧＧ　３０５−３１０＋３、ＣＲＥＢ　ＴＧＡＣＧＴＣ Ａ　ＴＧＡＣＧＴＴＴ　２９０−２９７４、ＰＥＡ−１”’□　ＧＧＡＡＧＴＧ ＡＣＴＡＡＣＧＡＡＡＧＴＧＡＣＴＴＴＣ２８６−２９８５、ＧＴ”””　ＧＧ ／ＣＴＧＴＧＧＡＡＡ／ＴＧＴ　ＣＧＴＴＧＣＧＡＡＡＧＴ　２７９−２９０６ 、　１ｉｌＬＴＦ　ＧＧＣＣＡＣＧＴＧＡＣＣＴＧＣＣＡＣＴＧＴＣＧＡ　２７ ４−２８５？、　ＣＣＡＡＴ−ＴＦ　ＡＧＣＣＡＡＴ　ＡＧＣＣＡＡＴ　２６０ −２６６＋　１８、　−ＣＡＣＣＣ−＃　ＣＡＣＣＣＣＡＧＣＣ２５９−２６３ ９、ＡＴＦ　ＡＣＧＴＣＡ　ＡＣＧＴＣＡ　２５３−２５８＋１０、−ＣＡＣＣ Ｃ−＃　ＣＡＣＣＣＣＡＧＣＣ２３６−２４０１１、ＡＴＦ　ＡＣＧＴＣＡ　Ａ ＣＧＴＣＡ　２３２〜２３７＋１２、　ＳＰＩ（ｗｅａｋ）　ＧＡＧＧＣＧ　２ ０９−２１４＋３．ＡＴＦ　ＡＣＧＴＣＡ　ＡＣＧＴＣＡ　１９９−２０４＋＋ ４．−ＣＡＣＣＣ−＃　ＣＡＣＣＣＣＡＴＣＣ１１１２−１８６＋５．ＡＴＦ　 ＡＣＧＴＣＡ　ＡＣＧＴＣＡ　１７８−１８３＋＋６．−ＣＡＣＣＣ−＃　ＣＡ ＣＣＣＣＡＴＣＣ１６１−１６５＋７．ＡＴＦ　ＡＣＧＴＣＡ　ＡＣＧＴＣＡ　 １５７−１６２＋−ＣＡＰ部位はおそらく約３５０゜ ＋　ＣＡＶと共通配列が完全に相関的。

−いくつかのウィルスで見られる共通配列。

＃　ある要素のＤＮＡ配列。

艶ｉｆ菖 １、　Ｄｏ　Ｂｏｅｒ、Ｇ、Ｆ、、Ｐｏｌ、Ｊ、Ｍ、Ａ、、ａｎｄ　Ｊａｕｒｉ ｓｓｅｎ。

Ｓ、Ｈ，Ｍ、（１９８８）、Ｍａｒｅｋ’ｓ　ｄｉｓｅａｓｅ　ｖａｃｃｉｎａ ｔｉｏｎｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ　ｕｓｉｎｇ　ｖａｃｃｉｎｅｓ　ｍａｄｅ　ｆ ｒｏｍ　ｔｈｒｅｅ　ａｖｉａｎｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ　５ａｒｏｔｙｐｅｓ 、　Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　Ｆｉｒｓｔ工ｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｐｏｕ ｌｔｒｙ　ａｎｄ　Ｐｏｕｌｔｒｙ　ＤｉｓｅａｓｅｓＳｙｍｐｏｓｉｕｍ、　 Ｍａｎｉｓａ、　Ｔｕｒｋｅｙ、　ｐｐ、　３８−４８　（ｉｎＴｕｒｋｉｓｈ 、Ｅｎｇｌｉｓｈｉ　ａｂｓｔｒａｃｔ）。

２、　Ｄａ　Ｂｏａｒ、Ｇ、Ｆ、、Ｊａｕｒｉｓｓｅｎ、Ｓ−Ｈ，Ｍ、、Ｖａｎ Ｒｏｏｚｅｌａａｒ、Ｄ、Ｊ、、Ｖｏｓ、Ｇ、Ｊ＋、ａｎｄ　Ｋｏｃｈ、Ｇ。

（１９８９ａ）、Ｅｎｈａｎｃｉｎｇ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｃｈｉｃｋｅｎ 　ａｎａｅｍｉａａｇｅｎｔ　（ＣＡＡ）　ｏｎ　Ｍａｒｅｋ’　ｄｉｓｅａｓ ｅ　ｐａｔｈｏｇａｎｅｓｉｓ。

Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｔｈｉｒｔｙ−ｅｉｇｈｔ　Ｗｅｓｔ ａｒｎ　ＰｏｕｌｔｒｙＤｉｓｅａｓｅ　Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ、Ｔｅｍｐｏ、 Ａｒ１ｚｏｎａ、Ｕ、Ｓ−Ａ、ｐ。

２８゜ ３、ＤａＢｏｅｒ、　Ｇ、Ｆ＋、　Ｐｏｌ、　Ｊ−Ｍ＋Ａ＋、ａｎｄ　Ｊｅｕｒ ｉｓｓｅｎ。

Ｓ、Ｈ，Ｍ、（１９８９ｂ）、Ｅｎｈａｎｃｉｎｇ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｃ ｈｉｃｋｅｎａｎａｅｍｉａ　ａｇｅｎｔ　（ＣＡＡ）　ｏｎ　Ｍａｒａｋ’ｄ ｉｓｅａｓｅｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ、　Ａｂｓｔｒａｃｔｂｏｏｋ工Ｘｔｈ 　Ｉｎｔｅｒｎ、　Ｃｏｎｇｒｅｓｓｏｆ　ｔｈｅ　ＷＶＰＡ、Ｂｒｉｇｈｔｏ ｎ、Ｕ、に、、ｐ、７４゜４、Ｅｎｇｓｔｒ５ｍ、　Ｂ、Ｅ、（１９８８）、Ｂ ｌｕｅ　ｗｉｎｇ　ｄｉｓｅａｓｅ　ｏｆｃｈｉｃｋｅｎｓ：　工５ｏｌａｔｉ ｏｎ　ｏｆ　ａｖｉａｎ　ｒｅｏｖｉｒｕｓ　ａｎｄｃｈｉｃｋｅｎ　ａｎａｅ ｍｉａ　ａｇｅｎｔ、　Ａｖｉａｎ　Ｅ’ａｔｈｏｌｏｇｙ　１７．　２３−３ ２゜ ５、Ｅｎｇｓｔｒ５ｍ、Ｂ、Ｅ、、Ｆｏｓｓｕｍ、Ｏ，、ａｎｄ　Ｌｕｔｈｍａ ｎ、Ｍ。

（１９８８）、Ｂｌｕｅ　ｗｉｎｇ　ｄｉｓｓａｓｅ　ｏｆ　ｃｈｉｃｋｅｎｓ ：Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　１ｎｆｅｃｔｉｏｎ　ｗｉｔｈ　ａ　Ｓｗｅｄｉ ｓｈ　１ｓｏｌａｔｅ　ｏｆＣｈｉｃｋｅｎ　Ａａｅｍｉａ　Ａｇｅｎｔ　ａｎ ｄ　ａｎ　ａｖｉａｎ　Ｒｅｏｖｉｒｕｓ。

Ａｖｉａｎ　Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ　１７，３３−５０゜６、）Ｉａｎｎ、Ｓ、Ｒ ，、Ｋｉｎｇ、Ｍ、Ｗ、、Ｂｅｎｔｌａｙ、Ｄ、Ｌ、。

Ａｎｄｅｒｓｏｎ、Ｃ，Ｗ、、ａｎｄ　Ｅｉｓｅｎｍａｎ、Ｒ，Ｎ、（１９８８ ）、Ａｎｏｎ−ＡＵＧ　ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ　１ｎｉｔｉａｔｉｏｎ　 ｉｎ　ｃ−ｍｙｃ　ａｘｏｎ　１ｇｅｎａｒａｔｅｓ　ａｎ　Ｎ−ｔｅｒｍｉｎ ａｌｌｙ　ｄｉｓｔｉｎｃｔ　ｐｒｏｔｅｉｎｗｈｏｓｅ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ 　ｉｓ　ｄｉｓｒｕｐｔｅｄ　ｉｎ　Ｂｕｒｋｉｔｔ’ｓｌｙｍｐｈｏｍａｓ、 Ｃｅ１ｌ　５２，１８５−１９５゜７、Ｈｉｒｔ、Ｂ、（１９６７）、５ｅｌｅ ｃｔｉｖｅ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｏｆｐｏｌｙｏｍａ　ＤＮＡ　ｆｒｏｍ　 １ｎｊｅｃｔｅｄ　ｍｏｕｓｅ　ｃｅｌｌ　ｃｕｌｔｕｒｅｓ。

Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　２６，３６５− ３６９゜８、Ｊｅｕｒｉｓｓａｎ、Ｓ、Ｈ，Ｍ−、Ｐｏｌ、Ｊ、Ｍ、Ａ、、Ｄａ 　Ｂｏｅｒ。

Ｇ、Ｆ、（１９８９）、Ｔｒａｎｓｉｅｎｔ　ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃｏ ｒｔｉｃａｌｔｈｙｍｏｃｙｔｅｓ　１ｎｄｕｃｅｄ　ｂｙ　ｃｈｉｃｋｅｎ　 ａｎａｅｍｉａ　ａｇｅｎｔ。

Ｔｈｙｍｕｓ　１４，１１５−１２３゜９、Ｊｏｎｅｓ、Ｎ、（１９９０）、５ ｔｒｕｃｔｕｒｅ　ａｎｄ　ｆｕｎｃｔｉｏｎ　ｏｆｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏ ｎ　ｆａｃｔｏｒｓ、Ｓｅｍ１ｎａｒｓ　ｉｎ　ＣａｎｃｅｒＢｉｏｌｏｇｙ　 １，５−１９゜ １０、Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｔ、、Ｆｒ１ｔｓｃｈ、Ｅ、Ｆ、、ａｎｄ　Ｓａｍｂ ｒｏｏｋ。

Ｊ、（１９８２）、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａ ｔｏｒｙＭａｎｕａｌ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ：　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒ ｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ。

１１、Ｍａｘａｍ、Ａ、Ｍ、、ａｎｄ　Ｇ１１ｂｅｒｔ、Ｗ、（１９７７）、Ａ 　ｎｅｗｍｅｔｈｏｄ　ｆｏｒ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ＤＮＡ、Ｐｒｏｃｅｅ ｄｉｎｇｓ　ＮａｔｉｏｎａｌＡｃａｄｅｍｉｃ　５ｃｉｅｎｃｅｓ　Ｕ、Ｓ、 Ａ、７４，５６０−５６４゜１２、ＭｃＮｕｌｔｙ、Ｍ、Ｓ、、Ｃｏｎｎｏｒ、 Ｔ、Ｊ、、ＭｃＮｅｉｌｌｙ、Ｆ、。

ＭｃＬｏｕｇｈｌｉｎ、Ｍ、Ｆ、、ａｎｄ　Ｋｉｒｋｐａｔｒｉｃｋ、に、Ｓ、 （１９９０）。

Ｆ’ｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓａｔｉｏｎ　ｏｆ　１ｓｏ ｌａｔｅｓ　ｏｆｃｈｉｃｋｅｎ　ａｎａａｍｉａ　ａｇｅｎｔ　ｆｒｏｍ　ｔ ｈｅ　Ｕｎｉｔｅｄ　Ｋｉｎｇｄｏｍ。

Ａｖｉａｎ　Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ、Ｉｎ　Ｐｒｅｓｓ。

１３、Ｒｉｔｃｈｉｅ、Ｂ、Ｗ、、Ｎｉａｇｒｏ、Ｆ、Ｄ、、Ｌｕｋｅｒｔ。

５ｔｅｆｆａｎｓ、Ｗ、Ｌ、、ａｎｄ　Ｌａｔｉｍｅｒ、Ｓ、（１９８９）。

Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａ　ｎｅｗ　ｖｉｒｕｓ　ｆｒｏｍ 　ｃｏｃｋａｔｏｏｓｗｉｔｈ　ｐｓｉｔｔａｃｉｎｅ　ｂｅａｋ　ａｎｄ　ｆ ｅａｔｈｅｒ　ｄｉｓｅａｓｅ。

Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　１７１，８３−８８゜１４、Ｓａｎｇｅｒ　Ｆ−、Ｎ１ｃｋ ｌｓｎ、Ｓ、、ａｎｄ　Ｃｏｕｌｓｅｎ、Ａ、Ｒ。

（１９フフ）、ＤＮＡ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ｗｉｔｈ　ｃｈａｉｎ−ｔｅｒ ｍｉｎａｔｉｎｇｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　Ｎａｔｉｏ ｎａｌ　ＡｃａｄｅｍｉｃＳｃｉｅｎｃｅｓ　Ｕ、Ｓ、Ａ、７４，５４６３−５ ４６７゜１５、　５ｏｕｔｈｅｒｎ、Ｅ、Ｍ、（１９７５）、Ｄｅｔｅｃｔｉｏ ｎ　ｏｆｓｐｅｃｉｆｉｃ　５ｅｑｕｅｎｃｅｓ　ａｍｏｎｇ　ＤＮＡ　ｆｒａ ｇｍｅｎｔｓ　５ｅｐａｒａｔｅｄｂｙ　ｇｅｌ　ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓ ｉｓ、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ　９８，５０ ３−５１７゜１６、Ｔｉ５ｃｈｅｒ、工、、Ｇｅｌｄｅｒｂｌｏｍ、Ｈ，，Ｖｅ ｔｔｅｒｍａｎ、Ｗ、。

ａｎｄ　Ｋｏｃｈ、Ｍ、Ａ、（１９８２）、Ａ　ｖｅｒｙ　ｓｍａｌｌ　ｐｏｒ ｃｉｎｅｖｉｒｕｓ　ｗｉｔｈ　ｃｉｒｃｕｌａｒ、ｓｉｎｇｌｅｓｔｒａｎｄ ｅｄ　ＤＮＡ、　Ｎａｔｕｒｅ２９５．６４−６６゜ １７．　Ｔｏｄｄ、Ｄ、、Ｃｒｅｅｌａｎ、Ｊ、Ｌ、、Ｍａｃｋｉｅ、Ｄ、Ｐ、 。

Ｒｉｘｏｎ、Ｆ、、ａｎｄ　ＭｃＮｕｌｔｙ、Ｍ、Ｓ、（１９９０）。

Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　ｃｈａｒａｃｔ ｅｒｉｓａｔｉｏｎ　ｏｆｃｈｉｃｋｅｎ　ａｎａｅｍｉａ　ａｇｅｎｔ、Ｊｏ ｕｒｎａｌ　ｏｆ　ＧｅｎｅｒａｌＶｉｒｏｌｏｇｙ　７１，８１９−８２３゜ １Ｂ、Ｖｉｅｌｉｔｚ、Ｅ、（１９８９）、Ｐｒｏｔａｃｔ　ｙｏｕｒ　ｃｈｉ ｃｋｓｆｏｒｍ　１ｎｆｅｃｔｉｏｕｓ　ａｎｅｍｉａ、Ｐｏｕｌｔｒｙ　５ｃ ｉａｎｃｅ　６８，３４−３５゜ １９、Ｖａｎ　Ｂ（ｌｌｏｗ、Ｖ、、Ｆ’ｕｃｈｓ、Ｂ、、Ｖｉｓｌｉｔｚ、Ｂ 、、ａｎｄＬａｎｄｇｒａｆ、　Ｈ，（１９８３）　、　Ｆｒｕｓｔｅｒｂｌｉ ｃｈｋｅｉｔｓｓｙｎｄｒｏｍ　ｂｅｉＫ（ｌｋｅｎ　ｎａｃｈ　Ｄｏｐｐｅｌ ｉｎｆａｃｔｉｏｎ　ｍｉｔ　ｄｅｎ　Ｖｉｒｕｓ　ｄｅｓＭａｒｅｋｓｃｈｅ ｎ　Ｋｒａｎｋｈｅｉｔ　（ＭＤＶ）ｕｎｄ　５ｉｎｓ　Ａｎｊｌｍｉｅ−Ｅｒ ｒｅｇｅｒ　（ＣＡＡ）、Ｚｅｎｔｒａｌｂｌａｔｔ　ｆｔ１ｒ　Ｖｅｔｅｒｉ ｎａｒｍｅｄｉｚｉｎＢ、３０，７４２−７５０゜ ２０、Ｖｏｎ　ＢｃＸｌｏｗ、Ｖ、、Ｆｕｃｈｓ、Ｂ、、ａｎｄ　Ｂａｒｔｒａ ｍ、Ｍ。

（１９８５）、Ｕｎｔｅｒｓｕｃｈｕｎｇｅｎ　ｔｌｂａｒ　ｄａｎ　Ｅｒｒｅ ｇｅｒ　ｄｅｒ工ｎｆｅｃｔｉｏｓｅｎ　Ａｎｌｍｉｅ−Ｅｒｒｅｇｅｒ　ｂｅ ｉ　Ｈｔｌｈｎｅｒｋ（ｌｃｋｅｎ（ＣＡＡ）ｉｎ　ｖｉｔｒｏ：　Ｖｅｒｍａ ｈｒｕｎｇ、Ｔｉｔｒａｔｉｏｎ。

Ｓｅｒｕｍｎｅｕｔｒａｌｉｓａｔｉｏｎｓｔａｓｔ　ｕｎｄ　１ｎｄｉｒｅｋ ｔｅｒ工ｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｚｅｎｓｔｅｓｔ、Ｚｅｎｔｒａｌｂｌａｔ ｔ　ｆｕｒＶｅｔｅｒｉｎａｒｍｅｄｉｚｉｎ　Ｂ、３２，６７９−６９３゜２ １、Ｙｕａｓａ、Ｎ、、Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ、Ｔ、、ａｎｄ　Ｙｏｓｈｉｄａ、 工。

（１９７９）　、工５ｏｌａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｓｏｍｅ　ｐｒｏｐｅｒｔｉｅ ｓ　ｏｆ　ａｎａｇｅｎｔ　ｉｎｄｕｃｉｎｇ　ａｎａｅｍｉａ　ｉｎ　ｃｈｉ ｃｋｓ、Ａｖｉａｎ　Ｄｉｓｅａｓｅｓ２３．３６６−３８５゜ ２２、Ｙｕａｓａ、　Ｎ、、　Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ、　Ｔ＋、　ａｎｄ　Ｙｏｓ ｈｉｄａ、　工。

（１９８０）、Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　１ｎｆｅｃｔｉｏｕｓ　ｂｕｒｓａｌ　ｄ ｉｓｅａｓｅｖｉｒｕｓ　１ｎｆｅｃｔｉｏｎ　ｏｎ　１ｎｃｉｄｅｎｃｅ　ｏ ｆ　ａｎａａｍｉａ　ｂｙｃｈｉｃｋｅｎ　ａｎａｅｍｉａ　ａｇｅｎｔ、　Ａ ｖｉａｎ　Ｄｉｓｅａｓｅｓ　２４．２０２−２０９゜ ２３、Ｙｕａｓａ、Ｎ、（１９８３）、Ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ　ａｎｄｉｎｆ ｅｃｔｉｖｉｔｙ　ｔｉｔｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｇｉｆｕ−１５ｔｒａ ｉｎ　ｏｆｃｈｉｃｋｅｎ　ａｎａｅｍｉａ　ａｇｅｎｔ　ｉｎ　ａ　ｃｅｌｌ 　１ｉｎｅ　（ＭＤＣＣ−ＭＳＢＩ）ｄｅｒｉｖｅｄ　ｆｒｏｍ　Ｍａｒｅｋ’ ｓ　ｄｉｓｅａｓｅ　ｌｙｍｐｈｏｍａ、　Ｎａｔｉｏｎａｌ工ｎ５ｔｉｔｕｔ ｅ　ｏｆ　Ａｎｉｍａｌ　Ｈｅａｌｔｈ　Ｑｕａｒｔｅｒｌｙ　２３．１３−２ ０゜Ｆｉｇ、２ａ ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・口＝＝：＝・・・・二＝＝＝＝コ ・・・・・・・・・・・・・Ａ ＦＩＧ、３ｂ　ＦＩＧ、３ｃ 国際調査報告 ｆｃｒｍ１＋Ｃ丁＋１５１−ノア＋０１１ｕ９Ｄｌ曖唸ｆｆ１ｅｎ電ａｌｌｈｌ ｌ帽７１．９ｋ１２１！＃＠１国際調査報告 ＮＬ　９１００１６５ フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，５識別記号　庁内整理番号Ｃ０７Ｋ　１３１００　 ８５１７−４ＨＣ１２Ｐ　２１１０２　Ｃ８２１４−４ＢＣ１２Ｑ　１／７０　 ７８２３−４Ｂ ＧＯＩＮ　３３１５３　Ｄ　８３１０−２Ｊ３３１５６９　Ｌ　９０１５−２Ｊ Ｉ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、鶏貧血症ウィルス（ＣＡＶ）遺伝子またはその一部のヌクレオチド配列に応 答し、またはそれを補充するＣＡＶ特異性ヌクレオチド配列からなる差別化され または差別化されないＤＮＡまたはＲＮＡの個体中での組替え遺伝子情報。 ２、前記ＣＡＶ遺伝子またはその一部のヌクレオチド配列が、図１で示される均 一なヌクレオチド配列を少なくとも６０％含むことを特徴とする請求項１記載の 組替え遺伝子情報。 ３、前記ＣＡＶ遺伝子またはその一部のヌクレオチド配列が、ＣＡＶ遺伝子中で 生じるＣＡＶ蛋白質のためにコード化するヌクレオチド配列かその一部であるこ とを特徴とする請求項１または請求項２記載の組替え遺伝子情報。 ４、前記ＣＡＶ遺伝子またはその一部のヌクレオチド配列が、ＣＡＶ遺伝子中で 生じる制御因子を有するヌクレオチド配列かその一部であることを特徴とする請 求項１または請求項２記載の組替え遺伝子情報。 ５、ヌクレオチド配列がＣＡＶ遺伝子から誘導されないことを特徴とする請求項 １〜請求項４のいずれか１項に記載の組替え遺伝子情報。 ６、前記ＣＡＶ遺伝子から誘導されないヌクレオチド配列が、真核生物または原 核生物において発現するベクターから誘導されたヌクレオチド配列であることを 特徴とする請求項５記載の組替え遺伝子情報。 ７、前記ＣＡＶ遺伝子から誘導されないヌクレオチド配列が、ＣＡＶ蛋白質以外 の蛋白質のためにコード化するヌクレオチド配列または同様の他の蛋白質の一部 のためにコード化するヌクレオチド配列であることを特徴とする請求項５記載の 組替え遺伝子情報。 ８、前記ＣＡＶ遺伝子から誘導されないヌクレオチド配列が、ＣＡＶ遺伝子中で 生じることがなく、制御因子を有するヌクレオチド配列であることを特徴とする 請求項５記載の組替え遺伝子情報。 ９、前記ＤＮＡまたはＲＮＡ個体が、ＤＮＡ個体であることを特徴とする請求項 １〜請求項８のいずれか１項に記載の組替え遺伝子情報。 １０、前記ＤＮＡが放射性同位元素、酸素分子、ハブテン、蛍光物質、染料色素 および特殊な標識物のようなＤＮＡの差別化に適した標識物で差別化されたＤＮ Ａであることを特徴とする請求項９記載の組替え遺伝子情報。 １１、前記ＤＮＡまたはＲＮＡ個体が、ＲＮＡ個体であることを特徴とする請求 項１〜請求項８のいずれか１項に記載の組替え遺伝子情報。 １２、前記ＲＮＡが放射性同位元素、酵素分子、ハブテン、蛍光物質、染料、色 素および特殊な標識物のようなＲＮＡの差別化に適した標識物で差別化されたＲ ＮＡであることを特徴とする請求項９記載の組替え遺伝子情報。 １３、ＤＮＡまたはＲＮＡ個体中でさらに組替えウィルス粒子に包囲されたこと を特徴とする請求項１〜請求項１２のいずれか１項に記載の組替え遺伝子情報。 １４、請求項１〜請求項１３のいずれか１項に記載の組替え遺伝子情報を診断、 免疫化もしくは予防接種の目的またはＣＡＶ蛋白質もしくは非ＣＡＶ蛋白質の生 産のために使用する方法。 １５、ＣＡＶ−ＤＮＡまたはＣＡＶ−ＲＮＡを検出する方法、たとえばＤＮＡ／ ＲＮＡスロットブロッティング、サザンブロッティング、ノーザンブロッティグ 、特定部位における組替え、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によるＤＮＡ拡張 、Ｓ１マッピング、アライマエクステンションの方法におけるＣＡＶ特殊プロー ブまたはプライマとして請求項１〜請求項１２のいずれか１項記載の組替え遺伝 子情報を使用する方法。 １６、ＤＮＡ／ＲＮＡスロットブロッティング、サザンブロッティング、ノーザ ンブロッティング、特定部位における組替え、ＰＣＲによるＤＮＡ拡張、Ｓ１マ ッピングのようなＣＡＶ−ＤＮＡまたはＣＡＶ−ＲＮＡ検出のための診断器具に おいてＣＡＶ特殊プローブまたはプライマとして請求項１〜請求項１２のいずれ か１項に記載の組替え遺伝子情報を用いることを特徴とする診断器具。 １７、ＣＡＶまたは他の病原体に対する予防を実現するための生きたウィルスワ クチンとして請求項１３に記載の組替え遺伝子情報を使用する方法。 １８、ＣＡＶまたは他の病原体に対する免疫化のためのワクチン調合法において 、請求項１〜請求項１３のいずれか１項に記載の組替え遺伝子情報および生きた ウィルスワクチンのために適する１つまたはそれ以上の抗体または補助物からな ることを特徴とするワクチン調合法。 １９、ＣＡＶ蛋白質、ＣＡＶ蛋白以外の蛋白を試験中または生体中で製造するた めの方法において請求項１〜請求項１３のいずれか１項に記載する組替え遺伝子 情報を使用する方法。 ２０、鳥類のクローニングベクターとして請求項１〜請求項１３のいずれか１項 に記載の組替え遺伝子情報を使用する方法。 ２１、請求項１〜請求項１３のいずれか１項に記載の組替え遺伝子情報を含むこ とを特徴とする無核または有核細胞。 ２２、請求項１〜請求項１３のいずれか１項に記載の組替え遺伝子情報を含み、 前記遺伝子紺替え情報によってエンコードされた少なくとも１つの蛋白質または 蛋白質の部分の実現を可能にすることを特徴とする無核または有核細胞。 ２３、請求項１〜請求項１３のいずれか１項に記載の組替え遺伝子情報が試験管 内の転位によって得られ、ＣＡＶ蛋白質またはそ一部のためにコード化するヌク レオチド配列からなることを特徴とするＣＡＶ蛋白質またはその一部。 ２４、請求項１〜請求項１３のいずれか１項に記載の組替え遺伝子情報を含み、 ＣＡＶ蛋白質またはその一部のためにコード化するヌクレオチド配列からなり、 その実現を可能にする原核生物または真核生物の細胞から単離によって得られる ことを特徴とするＣＡＶ蛋白質またはその一部。 ２５、診断、免疫化もしくは予防接種の目的、またはＣＡＶ特殊抗体の製造のた めに請求項２３または請求項２４のいずれか１項記載のＣＡＶ蛋白質またはその 一部を使用する方法。 ２６、ＣＡＶ特殊抗体を検出するための免疫的方法、たとえば免疫性過酸化酵素 、染料、ＥしＩＳＡ、免疫性蛍光染料を用いる方法において、ＣＡＶ特殊抗体を 結合する試薬として請求項２３または請求項２４のいずれか１項記載のＣＡＶ蛋 白質またはその一部を使用する方法。 ２７、免疫性過酸化酸素、染料、ＥＬＩＳＡまたは、免疫性蛍光染料のような免 疫的方法を用いて、ＣＡＶ特殊抗体を検出するための診断器具において、ＣＡＶ 特殊抗体を結合する試薬として請求項２３または請求項２４のいずれか１項記載 のＣＡＶ蛋白質またはその一部を含むことを特徴とする診断器具。 ２８、ＣＡＶに対する防護を実現するためのサブユニットワクチンとして請求項 ２３または請求項２４のいずれか１項記載のＣＡＶ蛋白質またはその一部を使用 する方法。 ２９、ＣＡＶに対する免疫を有するワクチン調整法において、請求項２３または 請求項２４のいずれか１項記載のＣＡＶ蛋白質またはその一部とサブユニットワ クチンのために適する任意の１つまたはそれ以上の抗体と補助体とからなること を特徴とする調整法。 ３０、ＣＡＶ特殊ポリクロナールまたはモノクロナール抗体を調造するための過 程で請求項２３または請求項２４のいずれか１項記載のＣＡＶ蛋白質またはその 一部を使用する方法。 ３１、請求項２３または請求項２４のいずれか１項記載のＣＡＶ蛋白質またはそ の一部によって製造されたＣＡＶ特殊抗体。 ３２、診断、免疫もしくは予防接種の目的または調整法の目的のために請求項３ １に記載のＣＡＶ特殊抗体を使用する方法。 ３３、ＣＡＶ蛋白質を検出する免疫的方法において試薬を結合するＣＡＶ蛋白質 として請求項３１に記載のＣＡＶ特殊抗体を使用する方法。 ３４、免疫的方法でＣＡＶ蛋白質を検出するための診断器具において、試薬を結 合するＣＡＶ蛋白質として請求項３０に記載のＣＡＶ特殊抗体を含むことを特徴 とする診断器具。 ３５、ＣＡＶ感染に対する受動免疫のために請求項３１に記載のＣＡＶ特殊抗体 を使用する方法。 ３６、ＣＡＶに対する受動免疫調整法において、請求項３１のＣＡＶ特殊抗体と の任意の１つまたはそれ以上の受動免疫に適した抗体または補助体とからなるこ とを特徴とする調整法。 ３７、ＣＡＶ蛋白質の単離および／または精製のための方法で請求項３１に記載 の特殊抗体を使用する方法。