HU220102B - Csirkeanémiavírus-DNS, klónozása és alkalmazásai - Google Patents

Csirkeanémiavírus-DNS, klónozása és alkalmazásai Download PDF

Info

Publication number
HU220102B
HU220102B HU9300716A HU71693A HU220102B HU 220102 B HU220102 B HU 220102B HU 9300716 A HU9300716 A HU 9300716A HU 71693 A HU71693 A HU 71693A HU 220102 B HU220102 B HU 220102B
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
cav
dna
nucleic acid
recombinant nucleic
nucleotide sequence
Prior art date
Application number
HU9300716A
Other languages
English (en)
Other versions
HU9300716D0 (en
HUT65974A (en
Inventor
Gerben Foppe De Boer
Matheus Hubertus Maria Noteborn
Original Assignee
Leadd B.V.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Leadd B.V. filed Critical Leadd B.V.
Publication of HU9300716D0 publication Critical patent/HU9300716D0/hu
Publication of HUT65974A publication Critical patent/HUT65974A/hu
Publication of HU220102B publication Critical patent/HU220102B/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56983—Viruses
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/10011—Circoviridae
    • C12N2750/10022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/10011—Circoviridae
    • C12N2750/10041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2750/10043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/008—Vector systems having a special element relevant for transcription cell type or tissue specific enhancer/promoter combination
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/60—Vector systems having a special element relevant for transcription from viruses
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S424/00—Drug, bio-affecting and body treating compositions
    • Y10S424/816—Viral vaccine for avian species, e.g. poultry or other birds
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/81—Packaged device or kit

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)

Abstract

A találmány tárgya rekombináns nukleinsav, amely a csirkeanémia-vírus(CAV) genom vagy egy része nukleo- tidszekvenciájának megfelelő, CAV-specifikus nukleotidszekvenciát tartalmazó, kettős szálú DNS-molekula,ennek alkalmazása diagnosztikai célra, vakcinálásra vagyproteintermelésre, továbbá vakcinakészletek és diagnosztikaireagenskészletek. ŕ

Description

Budapest (54) Csirkeanémiavírus-DNS, klónozása és alkalmazásai
KIVONAT
A találmány tárgya rekombináns nukleinsav, amely a csirkeanémia-vírus (CAV) genom vagy egy része nukleotidszekvenciájának megfelelő, CAV-specifikus nukleotidszekvenciát tartalmazó, kettős szálú DNS-molekula, ennek alkalmazása diagnosztikai célra, vakcinálás· ra vagy proteintermelésre, továbbá vakcinakészletek és diagnosztikai reagenskészletek.
A leírás terjedelme 20 oldal (ezen belül 6 lap ábra)
HU 220 102 B
HU 220 102 Β
A találmány tárgya rekombináns nukleinsav, amely a csirkeanémia-vírus (CAV) genom vagy egy része nukleotidszekvenciájának megfelelő, CAV-specifikus nukleotidszekvenciát tartalmazó, kettős szálú DNS-molekula, ennek alkalmazása diagnosztikai célra, vakcinálásra vagy proteintermelésre, továbbá vakcinakészletek és diagnosztikai reagenskészletek. A találmány tárgyát képezi még rekombináns CAV-protein, és ennek alkalmazása diagnosztikai célra, vakcinálásra és CAV-specifikus antitestek termelésére, valamint az így nyert CAVspecifikus antitestek alkalmazása.
A találmány szerinti megoldás előnyösen alkalmazható CAV-fertőzések megelőzése, kezelése, valamint kutatása területén.
A találmány a génsebészet (génmanipuláció) tárgykörébe tartozik, ezen belül a rekombináns DNS- (és RNS-) technológia, diagnosztikumok és immunizálás/vakcinálás területére. Közelebbről, a találmány tárgya csirkeanémia-vírus [Chicken Anaemia Vírus, a továbbiakban (CAV)] DNS-genom kimutatása, klónozása és szekvenciaanalízise, valamint az ezáltal lehetővé váló alkalmazások.
A CAV-vírus, amelyet ez ideig nem soroltak osztályba, csirkék fertőző anémiáját okozza. A vírust először Japánban izolálták 1979-ben, és nevét arról kapta, hogy fiatal csirkék körében súlyos anémiát okozott [Yuasa, N., Taniguchi, T. és Yoshida, I.: Avian Diseases 23, 366-385 (1979)]. A CAV-fertőzés további tünetei a csontvelősorvadás és a csecsemőmirigy nyiroksejtjeinek pusztulása. Sérülések jelennek meg a lépben és a májban is.
A legérzékenyebbek az egynapos csirkék. Ezeknél az állatoknál letargiát, étvágytalanságot és múló anémiát (passing anémia) észlelhetünk a CAV-fertőzést követő 4-7. napokon, és az állatoknak mintegy fele elpusztul a fertőzést követő 2. és 3. hét között. Az életkor előrehaladtával a természetes ellenállás növekszik. Ha 7 napos csirkéket fertőzünk meg, csak múló anémia fejlődik ki a fertőzést követően, és a 14 napos állatok fertőzésekor már nem következik be anémia.
A CAV-fertőzésekkel szembeni védelem és a CAVkór tünetei jelentős mértékben a humorális immunológiai védelmi mechanizmuson alapulnak. Vielitz, E., [Poultry Science 68, 34-35 (1989)] kifejlesztett egy gyakorlati, meglehetősen hatékony megelőzési módszert, amely abban áll, hogy a tojókat „szabályozott mértékben teszik ki” CAV-fertőzött májszuszpenzióknak, így az utódok anyai immunitással bírnak. Németországban az immunizálásnak ezt a módját alkalmazzák a gyakorlatban, de ez a módszer nem tűnik teljesen kockázatmentesnek.
A lelystadi Centraal Diergeneeskundig Institut (CDI) környezettől elzárt baromfiházaiban végzett állatkísérletek megerősítették azt a feltevést, hogy az anyai antitestek védőhatásúak. Itt szövettenyészeten szaporított CAV alkalmazásával végeztek „szabályozott fertőzésnek való kitételt”. A CAV elleni anyai antitestek teljesen meggátolták a CAV szaporodását olyan, egynapos korukban fertőzött csirkékben, amelyek vakcináit anyaállatoktól származnak. A CAV tünetei sem jelentkeztek. Ez a paszszív védelem nyerhető az immunizált tojók utódaiban, valamint akkor is, ha specifikusan patogénmentes (SPF) csirkéket injektálunk a fenti immunizált tojók tojássárgájának kivonatával. A CAV-fertőzés elleni paszszív védelem CAV-antitestek adagolása révén mintegy 4 hetes korig tartott. Ezt követően a passzív védelem már nem bizonyult tökéletesnek. Ezek a vizsgálatok azt mutatták, hogy az anyai antitestek, amelyek az anyaállat vakcinálása útján jöttek létre, fontos megelőző szerepet játszanak az adott gyakorlati helyzetben.
Kísérletes úton azt is bizonyították, hogy azokban a csirkékben, amelyek a CAV-fertőzést túlélik, a csecsemőmirigy-limfociták egy sajátos populációjának múló fogyása lép fel [Jeurissen, S. Η. M., Pol, J. M. A., De Boer, G. F.; Thymus 14,115-123 (1989)]. A csecsemőmirigy-sorvadás a CAV által okozott immundepresszió egy lehetséges következménye, amely azt eredményezi, hogy specifikus vakcinálások, például a Newcastlekór elleni vakcinálás kevésbé hatékonnyá válnak. Néhányszor izoláltak CAV-t olyan állatcsoportokból, amelyekben a Marek-féle kór és a Gumboro-féle kór [fertőző nyálkatömlőkór vírusa (IBDV), Yuasa, N., Taniguchi, T. és Yoshida, I: Avian Diseases 24, 202-209 (1980)] folytán megnövekedett veszteségek léptek fel, és olyan állatokból, amelyek reovírusokkal kapcsolatos kékszámykórban (Blue Wing Disease) szenvednek [Engström, Β. E., Avian Pathology 17, 23-32 (1988)]. Kísérleti úton létrehozott kettős fertőzéssel igazolták a CAV más csirkevírusok [például Marek-féle kór vírusa (MDV), De Boer, G. F., Jeurissen, S. Η. M., Van Roozelaar, D. J., Vos, G. J. és Koch, G.: Proceedings of the Thirty-eigth Western Poultry Disease Conference, Tempe, Arizona, USA, 1989,28. oldal] fokozó jellegét. Közelmúltban saját vizsgálatainkban jelentősen megnövekedett oltási reakciót észleltünk azt követően, hogy CAV-fertőzéssel egyidejűleg Newcastle-kór vakcinájával aeroszolvakcinálást végeztünk. A CAV ezek folytán immunszuppresszív hatású, és más vírusfertőzések hatását fokozza. A CAV-nak ezek a jellemzői feltehetően megnövelik a gyakorlatban a virulens kórok kitörésének gyakoriságát.
Úgy tűnik, hogy a CAV az egész világon elteijedt. Jelentős idő múltán, azt követően, hogy Japánban megkezdődött a CAV-kutatás, az első CAV-izolálást Európában, nevezetesen Németországban végezték Von Bülow és munkatársai [Von Bülow, V., Fuchs, B., Vielitz, B. és Landgraf, H.: Zentralblatt fúr Veterinarmedizin B. 30, 742-750 (1983)], majd később az Egyesült Királyságban McNulty és munkatársai [McNulty, M. S., Connor, T. J., McNeilly, F., McLoughlin, M. F. és Kirkpatrick,
K. S.; Avian Pathology, 1990 (nyomdában)]. Hollandiában az első CAV-izolálásokat az Amerikai Egyesült Államokból, Izraelből és Tunéziából származó anyagokból De Boer és munkatársai [De Boer, G. F., Pol. J. M. A. és Jeurissen, S. Η. M.; Proceedings First International Poultry and Poultry Diseases Symposium, Manisa, Törökország, 1988, 38-48. oldal (török nyelvű, angol kivonattal)] végezték. A hozzáférhető szakirodalom adatai azt mutatják, hogy az izolátumok azonos szerotípushoz tartoznak, de néhány mezei izolátumot
HU 220 102 Β meg kell vizsgáim egymáshoz való kapcsolatuk és patogenitásukban esetleg előforduló különbségek tekintetében [McNulty, M. S., Connor, T. J., McNeilly, F., McLoughlin, M. F. és Kirkpatrick, K. S.; Avian Pathology, 1990 (nyomdában)]. A CAV terjedése egy állatcsoporton belül feltehetőleg a bélsár és a levegő útján történik. CAV epidemiológiájában fontos szerepet játszik azonban a vírus vertikális átvitele az utódokba. Különböző országokban a CAV jelenlétét szerológiás módszerrel mutatják ki.
Szövettenyésztési körülmények között a CAV-t nehéz szaporítani. Marek-kór-limfómából származó MDV-vel transzformált limfoblasztoid sejtvonalakban (MDCC-MSB1 sejtek) vagy limfoid leukózisból származó számyasleukémia-vírussal (Avian Leukaemia Vírus, ALV) transzformált limfoblasztoid sejtvonalakban [1104-X5 sejtek; Yuasa, N.; National Institute of Animál Health Quarterly 23, 13-20 (1983)] a CAV ez ideig csak egy citopatológiás hatást (CPE) váltott ki.
Todd és munkatársai legújabb vizsgálataiban [Todd, D., Creelan, J. L., Mackie, D. P., Roxin, F. és McNulty, M. S.; Journal of General Virology 71, 819-823 (1990)] olyan vírusrészecskéket (tisztított CAV-anyagban) írnak le, amelyeknek átmérője 23,5 nm, és CsClgradiens 1,33-1,34 g/ml sűrűségű részében koncentrálódnak. A vírus domináló polipeptidje (M=50 000) egy cirkuláris egyszálú DNS-genom, amelynek hossza
2,3 kilobázis. Két kisebb vírus, a sertés-Circovirus és egy, a papagálycsőr- és tolikórral (Psittacine Beák and Feather Disease) kapcsolatos vírus hasonlít a CAV-ra cirkuláris egyszálú DNS-e tekintetében, de genomja kisebb, és a vírusrészecske átmérője kisebb [Ritchie, B. W., Niagro, F. D., Lukért, Steffens, W. L. és Latimer, S.; Virology 171, 83-88 (1989), Tischer, I., Gelderblom, H., Vetterman, W. és Koch, M. A.; Natúré 295,64-66 (1982)]. Hosszú ideig elfogadott volt, hogy a CAV a parvovírusok közé tartozik. A parvovírusok többsége azonban egyszálú DNS-vírus, lineáris DNSsel rendelkeznek, genomjuk nagyobb, és feltehetően víruspolipeptidjük szerkezete is más.
Általában elfogadott, hogy egy vírus replikációjában és transzkripciójában részt vevő sejtkomponensek csak akkor működőképesek, ha a DNS kettős szálú formában van. Egy cirkuláris egyszálú DNS-t tartalmazó vírus olyan fázisban fordulhat elő a sejtben, amelyben az kettős szálú DNS-t tartalmaz. Munkánkban ezt a tényt hasznosítottuk.
CAV-fertőzött 1104-X5 és MDCC-MSB1 sejtekben lévő, 2,3 kilobázispár hosszúságú kettős szálú CAVDNS-t jellemeztünk, és klónoztuk pICF-20H-ba. A DNS-t teljesen szekvenáltuk (lásd az 1. ábrán). Jelzett, klónozott CAV-DNS alkalmazásával végzett diagnosztikus tesztben ki tudtuk mutatni a CAV-nukleinsavakat vírus-, máj- és szövettenyészet-készítményekben. Azt találtuk, hogy a klónozott CAV a vad típusú CAV minden biológiai és patogén jellemzőjével bírt mind a szövettenyészetben, mind állatkísérletekben.
PCR (polimeráz-láncreakció) és hibridizációs vizsgálatok kimutatták hogy a klónozott teljes CAV-genom megfelel a mezei CAV-nak. 32P-jelzett DNS-minták alkalmazásával végzett Southem-analízissel kimutattuk, hogy minden mezei izolátum tartalmazott 2,3 kb-os DNS-molekulákat. Restrikciósenzim-analízis eredményei szerint a klónozott CAV-DNS megfelel a mezei DNS-nek. Dot-blot-vizsgálatban kimutattuk, hogy digoxigeninnel jelzett, klónozott CAV-DNS specifikusan hibridizálódik különböző mezei DNS-sel. Olyan oligonukleotidok alkalmazásával végzett PCR-vizsgálatokban, amelyek a klónozott CAV-szekvenciából származtak (4. ábra), a CAV-DNS amplifikációja vagy felismerése specifikus.
A találmány első szempontját tekintve rekombináns genetikai információt nyújt olyan jelzett vagy jelzetlen DNS vagy RNS formájában, amely magában foglal egy csirkeanémia-vírusra (CAV) jellemző specifikus nukleotidszekvenciát, amely megfelel egy CAV-genom vagy annak egy része nukleotidszekvenciájának, vagy egy ilyen szekvencia komplementere.
A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint, egy olyan rekombináns genetikai információból áll, amely egy CAV-specifikus nukleotidszekvenciát tartalmaz, amely megfelel az 1. ábrán szereplő nukleotidszekvenciának vagy annak komplementere, azzal vagy annak egy részével legalább 60%-ban homológ nukleotidszekvencia.
Ezt a szempontját tekintve a találmány egy DNSvagy RNS-nukleinsav - annak bármely lehetséges manifesztációja -, azaz a csupasz DNS vagy RNS formájában vagy bármely módon becsomagolt (azaz proteinekbe vagy vírusrészecskékbe) DNS vagy RNS formájában, vagy más anyaggal kapcsolatos (például hordozóanyaggal vagy egy markerként működő anyaggal). A DNS lehet egyszálú vagy kettős szálú, és lehet lineáris vagy cirkuláris formában is.
A találmány szerinti rekombináns genetikai információ jellemzője a benne lévő CAV-specifikus nukleotidszekvencia. Ez a CAV-specifikus szekvencia nem feltétlenül fedi a CAV teljes genomját, egy gyakorlati szempont figyelembevételével, a legtöbb alkalmazásnál csak egy specifikus rész szükséges és kívánatos.
Egy első, előnyös lehetőség egy olyan CAV-specifikus nukleotidszekvencia, amely megfelel a CAV genomjában előforduló CAV-proteint kódoló nukleotidszekvenciának vagy annak egy részének, vagy komplementere egy ilyennek. Egy ilyen kódolószekvenciát tartalmazó rekombináns DNS használható például CAVmessenger-RNS kimutatására egy mintában, vagy használható például egy olyan eljárásban, amely CAV-proteinek vagy részeik előállítására szolgál. A „része” lényegében minden olyan részt magában foglal, amely még CAV-specifikusként megjelölhető. A proteinszinten ez, a legtöbb alkalmazás esetén egy epitóp, azaz egy olyan antigéndetermináns, amely az antitestek által felismerhető.
Egy másik lehetőség abban áll, hogy a találmány szerinti rekombináns genetikai információ egy olyan CAV-specifikus nukleotidszekvenciát tartalmaz, amely megfelel egy, a CAV-genomjában vagy egy részében előforduló, regulátor funkciójú nukleotidszekvenciának vagy komplementer azzal. A CAV-promoter/enhancer
HU 220 102 Β elemek alkalmazásának egy példája a CAV-proteintől eltérő proteint kódoló szekvenciával kombinált alkalmazása, például az ilyen nem CAV-proteinnek baromfiban (például csirkékben) és más, olyan állatban való kifejezésének lehetővé tétele, amelyben a CAV-regulátor szignáljai hatásosak.
Mind a fenti esetben, és általában is, a találmány szerinti rekombináns genetikai információ magában foglalhat egy nem CAV-genomból származó nukleotidszekvenciát is. Az ilyen „nem CAV-genomból származó nukleotidszekvencia” kialakítható például egy prokarióta vagy eukarióta expressziós vektorból származó nukleotidszekvenciával. így a találmány magában foglalja egy CAV-specifikus szekvencia inszerciójának lehetőségét egy eukarióta organizmusban kifejeződésre képes (vírus- vagy nem vírus-) vektorba, vagy baktériumban kifejeződésre képes plazmidba. Továbbá az is lehetséges, hogy „nem CAV-genomból származó nukleotidszekvencia”-ként a találmány szerinti rekombináns genetikai információ egy olyan nukleotidszekvenciát foglal magában, amely a CAV-genomban nem fordul elő, és regulátor funkcióval bír.
Azonban, a „nem CAV-genom eredetű nukleotidszekvencia” állhat egy olyan nukleotidszekvenciából, amely egy, a CAV-proteintől eltérő proteint (vagy annak egy részét) kódolja, például ha CAV-regulációs szignálokat alkalmazunk ilyen nem CAV-protein (vagy annak egy része) kifejezésére a CAV-vírus számára hozzáférhető gazdaszervezetben, vagy ha rekombináns DNS-t alkalmazunk egy hibridben vagy fúziós proteinben, amelyben a CAV-protein egy nem CAV-protein epitópjának hordozójaként működik, vagy fordítva, egy nem CAV-protein működik a CAV-protein epitópjának hordozójaként.
Ha a találmány szerinti rekombináns genetikai információt komplementer DNS vagy RNS egy mintában való kimutatására szolgáló eljárásban alkalmazzuk, jelzés jelenléte szükséges lehet. Jelzésként - amint azt itt értjük - egy olyan markert értünk, amely DNS-sel vagy RNS-sel együtt alkalmazható, és amely lehetővé teszi vagy megkönnyíti a jelzett DNS vagy RNS kimutatását. Szakember számára az ilyen célra alkalmas markerek számos típusa ismert, köztük a radioizotópok (például a 32P), enzimmolekulák (például peroxidázok), haptének (például biotin), fluoreszcens anyagok, színezékek, pigmentek (például szervetlen foszforok) és részecske formájú markerek (például arany- vagy szelénrészecskék).
A találmány tárgya, egy másik szempontját tekintve, a fenti rekombináns genetikai információ alkalmazása különösen diagnosztikai célokra, immunizálásra vagy vakcinálásra, vagy CAV- vagy nem CAV-proteinek előállítására.
Közelebbről, a találmány tárgya például egy, a találmány szerinti rekombináns genetikai információ alkalmazása CAV-specifikus próbaként vagy primerként CAV-DNS vagy -RNS kimutatására szolgáló eljárásban, például egy DNS/RNS lemez-blot-, Southem-blot-, Northem-blot-eljárásban, in situ hibridizálásban, PCReljárással végzett DNS-amplifikálásban, Sl térképezés és primer extenzió esetén, a találmány továbbá kiteljed egy diagnosztikai kitre, amely CAV-DNS vagy -RNS kimutatási eljárásában használható, például DNS/RNS lemez-blot-, Southem-blot- Northem-blot eljárásban, in situ hibridizálásban, PCR-eljárással végzett DNS-amplifikálásnál, Sl térképezés vagy primer extenzió esetén, az ilyen diagnosztikai reagenskészlet a találmány szerinti rekombináns genetikai információt CAV-specifikus próbaként vagy primerként tartalmazza.
A találmány tárgyát képezi továbbá a találmány szerinti rekombináns genetikai információ alkalmazása élővírus-vakcinaként CAV vagy más patogén elleni védelem megvalósítására, a találmány kiterjed CAV vagy más patogének elleni immunizálásra szolgáló vakcinakészítményre, amely készítmény magában foglalja a találmány szerinti rekombináns genetikai információt, és adott esetben élővírus-vakcinák esetén megfelelő, egy vagy több hordozóanyagot és segédanyagot.
A találmány tárgyát képezi a találmány szerinti rekombináns genetikai információ alkalmazása klónozóvektorként is, azaz a CAV-DNS alkalmazása egyfajta „eukarióta plazmidként” számyasrendszerekben, ahol génfragmentumok vannak beépítve a teljes vagy közel teljes CAV-genomba.
Ugyancsak a találmány körébe tartozik a találmány szerinti rekombináns genetikai információ alkalmazása a CAV-protein vagy annak része, vagy egy CAV-proteintől eltérő protein in vitro vagy in vivő transzlációval történő előállítására szolgáló eljárásban. Ugyanez vonatkozik egy, a fentiek szerinti rekombináns genetikai információt tartalmazó prokarióta és eukarióta sejtre, különösen olyan prokarióta vagy eukarióta sejtre, amely legalább egy, a találmány szerinti rekombináns genetikai információ által kódolt protein vagy proteinrész expressziójára képes. Ezeket a különböző lehetőségeket a leírás további részében részletesen megmagyarázzuk.
A találmány tárgyát képezi továbbá egy, a CAV-proteint vagy annak egy részét kódoló nukleotidszekvenciát tartalmazó, találmány szerinti rekombináns genetikai információ révén in vitro transzlációval nyert CAV-protein vagy annak egy része, valamint egy, a CAV-protein vagy annak egy része kódolására alkalmas nukleotidszekvenciát magában foglaló találmány szerinti rekombináns genetikai információt tartalmazó, a protein vagy a protein egy része kifejezésére képes prokarióta vagy eukarióta sejtből történő izolálással nyert CAV-protein vagy annak egy része.
A proteinszinten is különféle alkalmazási területekre teljed ki a találmány, különösen a találmány szerinti CAV-protein vagy annak egy része diagnosztikai célokra, immunizálásra és vakcinálási célokra, vagy CAVspecifikus antitestek előállítására való alkalmazására.
Konkrétabban, a találmány magában foglalja az előzőekben meghatározott CAV-protein vagy annak egy része CAV-specifikus antitestek kötésére szolgáló reagensként való alkalmazását immunológiai vizsgálatban a CAV-specifikus antitestek kimutatására szolgáló eljárásban, például immunperoxidázos színezés, ELISA- vagy immunfluoreszcens vizsgálat során, és ennek megfelelően egy, a CAV-specifikus antitestek immunológiai
HU 220 102 Β vizsgálattal, például immunperoxidázos színezéssel, ELISA- vagy immunfluoreszcens eljárással való kimutatására szolgáló diagnosztikai kit, amely diagnosztikai reagenskészlet CAV-specifikus antitesteket kötő reagensként egy, a találmány szerinti CAV-proteint vagy proteinrészt tartalmaz.
A találmány magában foglalja az előzőekben meghatározott CAV-protein vagy annak egy része alkalmazását alegységvakcinaként CAV elleni védelem megvalósítására, valamint a CAV elleni vakcinakészítményt, amely készítmény egy, a találmány szerinti CAV-proteint vagy annak egy részét, és adott esetben alegységvakcina készítésére alkalmas egy vagy több hordozóanyagot és segédanyagot tartalmaz.
A találmány oltalmi körén belül eső lehetőségek közé tartozik az előzőekben meghatározott CAV-protein vagy annak egy része alkalmazása egy CAV-specifikus poliklonális- vagy monoklonálisantitest-előállítási eljárásban. Ezeket a lehetőségeket a következőkben, a leírásban részletesebben bemutatjuk.
A találmány egy további szempontja szerint az előzőekben meghatározott CAV-proteinnel vagy annak egy részével előállított CAV-specifikus antitestekre vonatkozik, valamint az ilyen CAV-specifikus antitestek különféle alkalmazásaira, például diagnosztikai célokra, immunizálás és vakcinálás céljára vagy preparatív célokra.
Közelebbről, a találmány egy, a találmány szerinti CAV-specifikus antitest alkalmazására vonatkozik CAV-protein-kötő reagensként CAV-protein kimutatására szolgáló immunológiai eljárásban, valamint a találmány tárgyát képezi egy, a CAV-proteinnek immunológiai eljárással való kimutatására szolgáló diagnosztikai kit, amely reagenskészlet CAV-protein-kötő reagensekként a találmány szerinti CAV-specifikus antitesteket tartalmazza.
Egy további példa a találmány szerinti CAV-specifikus antitestek alkalmazása CAV-fertőzések elleni passzív immunizálásra, valamint az ilyen, CAV elleni passzív immunizálásra szolgáló immunizálókészítmény, amely készítmény a találmány szerinti CAV-specifikus antitesteket és adott esetben a passzív immunizálásra szolgáló készítményekben alkalmas, egy vagy több hordozóanyagot és segédanyagot tartalmaz. A találmány tárgyát képezi különösen tojós tyúkok immunizálása a találmány szerinti rekombináns termékekkel.
A preparatív felhasználások tekintetében a találmány szerinti CAV-specifikus antitestek alkalmazásának egy példája a CAV-proteinek izolálására és/vagy tisztítására szolgáló eljárásban való alkalmazás. A legfontosabb alkalmazási módokat részletesebben mutatjuk be a találmány alább következő részletes, példákkal leírt részében.
CA V-fertőzött sejtekből izolált alacsony molekulatömegű DNS analízise
Tisztított víruskészítményből izolált CAV-genom cirkuláris egyszálú DNS-molekulának bizonyult, amelynek hossza mintegy 2300 bázis [Todd, D., Creelan, J. L., Mackie, D. P., Rixon, F. és McNulty, M. S.; Journal of General Virology 71, 819-823 (1990)]. Azt vártuk, hogy a C A V-fertőzött sejtekben a cirkuláris egyszálú vírus-DNS mellett cirkuláris kettős szálú CAV-DNS is előfordul. A kettős szálú DNS restrikciós enzimekkel hasítható, ezért közvetlenül klónozható, ellentétben az egyszálú DNS-sel. Ezt figyelembe véve vizsgáltuk, hogy a CAV-fertőzött sejtek alacsony molekulatömegű frakciójában előfordul-e egy DNS-termék, amely nincs jelen a fertőzetlen sejtekben.
Alacsony molekulatömegű DNS-t izoláltunk CAVfertőzött MDCC-MSB1 és 1104-X5 sejtekből és fertőzetlen 1104-X5 sejtekből. A DNS-t agaróz/etidium-bromid gélen frakcionáltuk. Egy nagyon gyenge DNS-sáv volt látható a gélen, amelynek hossza (mérés szerint) 3 kilobázispár (kbp). Ez a sajátos DNS-termék nem volt jelen a fertőzetlen sejtekből izolált DNS-ben.
A következő vizsgálatokban azt tettük valószínűvé, hogy a sajátos DNS csak a CAV-fertőzött sejtekben van jelen. A fertőzött sejtekből származó DNS-t hosszúság szerint agarózgélen szeparáltuk. A 2,7-3,5 kbp hosszúságú DNS-t izoláltuk. Ennek a DNS-frakciónak kell tartalmaznia a sajátos vírus-DNS-t az egyéb celluláris DNS-ek mellett. Az izolált DNS-t radioaktív jelzéssel láttuk el, és CAV-fertőzött sejtekből és fertőzetlen sejtekből származó, alacsony molekulatömegű DNS Southem-blotjával hibridizáltuk. Három kbp magasságban egy DNS-termék hibridizált a CAV-fertőzött sejtek blotjában, amely nem volt jelen a fertőzetlen sejtekből származó DNS-blotban.
A 3 kbp hosszúságot kettős szálú lineáris DNS-molekulákat tartalmazó DNS-markerekkel határoztuk meg. Egy cirkuláris kettős szálú DNS-molekula viselkedése agarózgélben különbözik a lineáris DNS-fragmentumok viselkedésétől. A CAV-fertőzött sejtekből származó 3 kbp hosszúságú DNS lehetett volna egy olyan lineáris DNS, amelynek hosszúsága a valóságban 2,3 kbp.
Ha egy cirkuláris kettős szálú DNS-t restrikciós enzimmel úgy emésztünk, hogy csak egyszer hasítjuk a DNS-molekulát, egy olyan lineáris DNS-molekulát kell kapnunk, amelynek hossza (mérés szerint) 2,3 kbp.
Azt, hogy ez a feltételezés korrekt, külön mutattuk ki CAV-fertőzött 1104-X5 sejtekből izolált, alacsony molekulatömegű DNS hat különböző restrikciós enzimmel (BamHI, EcoRI, HindlII, KpnI, PstI és Xbal) történő inkubálásával. A CAV-fertőzött 1104-X5 sejtekből izolált, majd a fenti restrikciós enzimekkel hasított alacsony molekulatömegű DNS Southem-blotját a fenti radioaktívan jelzett DNS-próbával hibridizáltuk. Ez azt mutatta, hogy a BamHI, EcoRI, PstI és Xbal restrikciós enzimekkel történő kezelés eredményeként, egy mért hossza szerint 2,3 kbp hosszúságú DNS-molekula képződött. A fertőzetlen sejtekből származó DNS BamHI enzimmel való inkubálása nem eredményezi ezt a DNSterméket. A HindlII enzim kétszer hasította a DNS-t, míg a KpnI nem hasította.
A fenti vizsgálati eredményekből arra következtethetünk, hogy a CAV-fertőzött sejtekből származó, alacsony molekulatömegű DNS-ben egy 2,3 kbp hosszúságú cirkuláris DNS-molekula fordul elő, amely nincs jelen a fertőzetlen sejtekben, és hogy ez a cirkuláris kettős szálú DNS-molekula formájú CAV-genom.
HU 220 102 Β
Kettős szálú CA V-DNS klónozása és szubklönozása bakteriális vektorba
CAV-fertőzött 1104-X5 sejtekből származó, alacsony molekulatömegű DNS-t külön-külön inkubálunk BamHI-vel, BcoRI-vel, Pstl-vel és Xbal-vel. A DNS-t alacsony olvadáspontú agarózgélen szeparáljuk. Mind a négy DNS-készítményből izoláltuk a 2,3 kbp DNSmolekulát. A pIC-20H klónozóvektort külön emésztettük mind a négy restrikciós enzimmel, amelyekkel az alacsony molekulatömegű DNS-t hasítottuk. A lineáris vektort „borjúbél lúgos foszfatázzal” kezeltük. Minden
2,3 kbp DNS-fragmentumot a pIC-20H megfelelő restrikciós enzim helyéhez ligáltunk. A ligálás termékét E. coli HB101 törzsbe transzfektáltuk. Mind a 4 klónozás révén az inszertált, mintegy 2,3 kbp hosszúságú DNS-t tartalmazó plazmidot nyertünk. További restrikciósenzim-analízis azt mutatta, hogy legalább 7 plazmid tartalmazta az azonos DNS-fragmentumot. A vektor integrálásának helye azonban különböző volt, annak következtében, hogy különböző enzimeket alkalmaztunk a cirkuláris molekula nyílttá hasítására. A BamHl, EcoRI, PstI és Xbal restrikciós enzimek alkalmazásával restrikciósenzim-térképet határoztunk meg mind a négy CAV-DNS-klónra.
Négy „különböző” CAV-DNS-plazmidot radioaktívan jelöltünk, és CAV-fertőzött és fertőzetlen sejtekből izolált, BamHl enzimmel emésztett DNS Southem-blotjával hibridizáltuk. A vizsgált kiónok mindegyike csak a CAV-fertőzött sejtekből származó DNS-ben jelen lévő
2,3 kbp DNS-sel hibridizált.
Két CA V-DNS-klón biológiai aktivitása
A két CAV-klónt, a pIC-20H/CAV-EcoRI-t és a pIC-20H/CAV-PstI-t restrikciós enzimekkel emésztettük úgy, hogy a CAV-DNS-t teljesen lehasítsuk a vektorról. A lineáris CAV-DNS-molekulákat T4-DNS-ligázzal kezeltük. A lineáris CAV-DNS-ek így cirkulárissá váltak. A „klónozott” CAV-DNS igy kettős szálú cirkuláris formájúvá vált, ez az a forma, amellyel a fertőzött sejtekben a vad típusú CAV-DNS is bír. MDCC-MSB1 és 1104-X5 sejteket transzfektáltunk a „klónozott” cirkuláris CAV-DNS-ekkel. A pIC-20H/CAV-EcoRI klón esetén egy igen tiszta citopatogén hatást (CPE) találtunk minden sejttípus esetén. A pIC-20H/CAV-PstI klón tiszta CPE-t okozott MDCC-MSB1 sejtekben, és kevésbé tiszta CPE-t 1104-X5 sejtekben. Azonban a pIC20H/CAV-PstI-vel transzfektált 1104-X5 sejtek felülúszója tiszta CPE-t okozott MDCC-MSB1 sejtekben. CAV-fertőzött sejtekből izolált DNS-sel végzett transzfekció ugyancsak tiszta CPE-t okozott MDCC-MSB1 sejtekben, míg 1104-X5 sejtekben kevésbé tiszta CPE volt látható. Nem jelentkezett CPE MDCC-MSB1 vagy 1104-X5 sejteknek pIC-20H vektor-DNS-sel való transzfekcióját követően.
Egy Southem-analízis azt mutatta, hogy klónozott CAV-DNS-sel nyert, vírussal fertőzött MDCC-MSB1 vagy 1104-X5 sejtek (6 passzálás) sejtlizátumában CAV-DNS volt jelen.
Egy MDCC-MSB1 sejtekkel végzett semlegesítési vizsgálat azt mutatta, hogy a transzfektált sejtekbe klónozott DNS által okozott citopatogén hatás CAVfertőzés eredménye. A CAV ellen irányuló semlegesítő antitestek megelőzték a transzfektált sejtek CAV-szaporulatával fertőzött MDCC-MSB1 sejtek citopatogén hatását.
Egynapos csirkéket intramuszkulárisan injektáltunk a transzfektált sejtek felülúszójával. A csirkékben a felülúszók ugyanazt a klinikai képet hozták létre, mint a vad típusú CAV: elmaradt növekedést, amely a teljes testtömegben jelentkező különbségként jelent meg, halvány színű csontvelőt és csökkent hematokritszámot (anémia), csecsemőmirigy-atrófiát (a sajátos T-sejt-populáció kiürülése) és mortalitást. A kontrollcsirkékben a DNS-vektorral transzfektált sejtek felülúszója nem okozott tüneteket.
Kettős szálú CA V-DNS-genom szekvenciaanalízise
A teljes kettős szálú CAV-DNS-genomot teljes mértékben szekvenáltuk Sanger [Sanger, F., Nicklen, S. és Coulsen, A. R.; Proceedings National Academic Sciences U. S. A. 74,5463-5467 (1977)] és Maxam-Gilbert [Maxam, A. M., Gilbert, W.; Proceedings National Academic Sciences U. S. A. 74, 560-564 (1977)] eljárásával. M13 szekvenáló és M13 reverzszekvenáló primerek alkalmazásával a 4 pIC-20H/CAV (BamHl, EcoRI, PstI, Xbal) kiónok mintegy 2100 bázisának DNS-szekvenciáját határoztuk meg. Ezt követően a CAV-genomot szubklónoztuk. A CAV-DNS-genom öt különböző szubklónjának DNS-szekvenciáját Ml3 primerek alkalmazásával a Sanger-eljárás szerint és/vagy a MaxamGilbert-eljárassal határoztuk meg. így a CAV-genom mindkét szálának DNS-szekvenciáját meghatároztuk.
A (kettős szálú) CAV-DNS hossza 2319 bp. A cirkuláris CAV-genom EcoRI helyének első bázisát jelöljük +1 számmal. A legnagyobb nyílt leolvasási keretek közül a legtöbbet tartalmazó DNS-szál szekvenciáját az 1. ábrán mutatjuk be, ezt a szálat (+) szálként jelöljük. Ennek a szálnak a bázisösszetétele a következő: 25,5% adenin; 28,7% citozin; 27,7% guanin; és 18,1% timin. A CAV-genomnak más, már ismert vírusszekvenciákkal való lehetséges homológiáját vizsgáló komputeres vizsgálódásaink azt mutatták, hogy ezt a DNS-t korábban még nem írták le, és ezek nem képezik korábban leírt víruscsoport részét. Az a kezdeti hipotézis, hogy a CAV egy parvovírus, a CAV-DNS-genom formáját (cirkuláris) és szekvenciáját tekintve nem áll fenn.
A CAV-genom szerkezetét komputeres vizsgálatokkal jellemeztük. Előre várhatók a nyílt leolvasási keretek, promoter/enhancer elemek, poliadeniláló szignálok és helyek, és a „replikációs origó”. A 2. ábrán a CAV mindkét DNS-szálára vonatkozóan bemutatjuk az előre jelzett nyílt leolvasási kereteket, amelyek hossza a CAV-DNS mindkét szálánál a 300 bázist meghaladja. A 2a. ábrán az ATG kodonnal kezdődő nyílt leolvasási kereteket mutatjuk be. Az ATG kodon a leggyakrabban használt iniciátor kodon proteinek esetén. Említésre méltó, hogy a két DNS-szál egyike 3 proteint kódol, amelyek hossza 449 aminosav (51,6 kD), 216 aminosav (24 kD), illetve 121 aminosav (13,3 kD). Todd és munkatársai [Todd, D., Creelan, J. L., Mackie, D. P., Rixon, F. és McNulty, M. S.; Journal of General Virology 71, 819-823 (1990)] tisztított CAV-ban kimutat6
HU 220 102 Β tak egy 50 kD-os proteint. Ha a nyílt leolvasási keretek mindegyike aktuálisan használódik, a vírusgenomnak mintegy 80%-a transzlálódik proteinné. Egyes régiók még duplázódnak is. Igen valószínű, hogy a 3 nyílt leolvasási keret 1 RNS-ből transzlálódik. Az RNS-molekula előre várható kezdete a 354-helyzetben van, a poli(A) addíció a 2317-helyzetben. Az egyetlen poli(A) szignál a pluszszál 2287-helyzetében van.
Nem valószínű, hogy a nyílt leolvasási keretek a másik DNS-szálnál hasznosulnak, mivel erről a szálról néhány fontos regulációs szekvencia hiányzik. A 2b. és 2c. ábrákon olyan nyílt leolvasási keretek láthatók, amelyekben startkodonként CTG, illetve GTG szerepel. Azonban csak néhány protein esetén írják le, hogy ezek a startkodonok valóban működnek [Hann, S. R., Ring, M. W., Bentley, D. L., Anderson, C. W. és Eisenman, R. N.;Cell 52,185-195 (1988)].
A különböző CAV-proteinek és a már ismert proteinek hasonlóságainak feltárására irányuló komputeres vizsgálatok során a hozzáférhető programokban lévő szekvenciákkal csak korlátozott homológiát találtunk. Ennek megfelelően nehéz előre jelezni, hogy a CAVproteinek a proteinek mely típusával rokonok. Viszonylag sok jel utalt a víruskapszidokra, a DNS-kötő és vérkoaguláló proteinekre. Az erre vonatkozó eredményeket itt nem közöljük.
A proteinek expresszióját promoter/enhancer elemek szabályozzák [Jones, N.; Seminars in Cancer Biology 1, 5-19 (1990)]. Többnyire közvetlenül a transzkriptum kezdete előtt egy eukarióta promoter helyezkedik el. A CAV-szekvencia a cap-helytől az 5’-vég irányában a TATA box, SP1 box és CAAT box általános elemeket tartalmazza. Ezen boxok szekvenciája és helyzete kiválóan megfelel az eukarióta promoterekre leírtaknak (lásd az 1. táblázatban). A 285-helyzet környékén négy különböző transzkripciós faktor, a CREB, MLTF, GT és PEA-I számára lehetnek kötőhelyek.
Egy eukarióta gén az eukarióta promoter erősségét meghatározó enhancer elemeket is tartalmaz. Lehetséges enhancer elemek az öt direkt ismétlődés, amelyek mindegyikének hossza 21 nukleotid, és elhelyezkedésük a 144- és 260-helyzetek közötti. Minden ismétlődés 19 azonos nukleotidot tartalmaz. Csak a két utolsó nukleotidjuk különböző. Az első ismétlődés azonos a másodikkal, és a harmadik azonos az ötödikkel, az első, második és harmadik ismétlődés egymás mellett helyezkedik el, hasonlóképpen a negyedik és ötödik. A harmadik és negyedik ismétlődés között egy 12 nukleotidból álló „törés” van. Komputeres vizsgálat azt mutatta, hogy egyetlen leírt (eukarióta) enhancer sem tartalmazza mindegyik, a CAV-enhancer elemekként valószínűsített szekvenciát. Minden direkt ismétlődés tartalmaz egy ATF elemet, amelynek szerepe lehet a CAV-RNS-ek transzkripciójában bekövetkező növekedésnek. A direkt ismétlődések a CATCC szekvenciát kétszer, és a CAGCC szekvenciát kétszer tartalmazzák. Az utolsó szekvencia a CAAT boxszal átlapoló. Ennek a négy szekvenciának a CACCC boxszal csak egy rossz illeszkedése („mismatch”) van leírva β-globinra (1. táblázat).
A 3. ábrán látható, hogy a plusz-DNS-szálnak mintegy 55- és 135-, illetve 2180- és 2270-helyzetei között igen nagy hajtűszerkezet van jelen az (egyszálú) CAVDNS formában. A DNS hajtűszerkezetének szerepe lehet a CAV-DNS replikációjában. A 2180- és 2270-helyzeteknél jelentkező hajtűszerkezet nemcsak a CAVDNS-ben lehet jelen, hanem a CAV-RNS-ben is, és feltehetően szerepet játszik a CAV-RNS stabilitásában.
A CAV-val fertőzött sejtek különböző DNS-formái
A CAV-fertőzött sejtek DNS-készítményei Southem-blotjában négy különböző CAV-DNS-molekula látható. A DNS-t a pIC-20H/CAV-EcoRI klón radioaktívan jelzett DNS-ével hibridizáltuk. A CAV-DNS-molekulák agarózgélben mért hosszúságukat és formájukat, valamint sl nukleáz iránti érzékenységüket tekintve kettős szálú nyitott körök (3 kbp), szupercsavart (supercoiled) kettős szálú DNS (2 kbp), cirkuláris egyszálú DNS (0,8 kbp) és egyszálú lineáris DNS (1,5 kbp). Egyes esetekben a CAV lineáris kettős szálú DNS (2,3 kbp) formája is látható. Todd és munkatársai [Todd, D., Creelan, J. L., Mackie, D. P., Rixon, F. és McNulty, M. S.; Journal of General Virology 71,819-823 (1990)] izolált CAV-ból származó cirkuláris egyszálú DNS hoszszát nemdenaturáló agarózgélben mért elektroforetikus mozgékonysága alapján 0,8 kbp-nek mérték.
G4 V-DNS kimutatása viruskészitményekben
CAV-ból a teljes DNS-t izoláltuk és von Bülow [Von Bülow, V., Fuchs, B. és Bertram, M.; Zentralblatt fúr Veterinarmedizin B. 32, 679-693 (1985)] eljárásával tisztítottuk. A DNS-készítményt Southern-vizsgálatban, a teljes klónozott CAV-szekvenciát tartalmazó jelzett CAV-DNS-próbával analizáltuk. A tisztított CAV-ból izolált DNS egy 0,8 kbp hosszúságú DNSmolekulát tartalmaz, a mérés nemdenaturáló agarózgélen történt. Tisztított CAV-ból származó DNS-nek olyan oligonukleotiddal való Southem-analízisében, amelynél próbaként klónozott CAV-DNS-szekvenciából származó oligonukleotidokat alkalmazunk, kimutattuk, hogy a vírus a mínusz-DNS-szálat tartalmazza. Ebből arra a következtetésre jutottunk, hogy a kapszidban az egyszálú CAV-DNS-e a mínusz szál.
Mezei CA V-izolátumok DNS-ének Southem-analizise
Olyan csirkecsoportokból származó CAV-izolátumokból készítettünk DNS-preparátumokat, amelyek körében a Marek-féle kór a szokásosnál nagyobb gyakorisággal fordult elő. A 12 holland társaságtól kapott CAV-izolátumokból származó DNS-preparátumok gyűjtése egy 60 mintából álló gyűjteményből nem szelektíven történt. A társaságok közül csak egy jelentett nagyobb mortalitást Marek-féle kór következtében. Továbbá a CAV-izolátumok közül egy gyöngytyúkból származott. Az általunk vizsgált CAV-izolátumokat általában akkor nyerték, amikor az állat-egészségügyi szolgálat vizsgálata alapján már megállapították a csecsemőmirigy-sorvadást (atrópiát).
Annak érdekében, hogy a klónozott CAV-DNS (pIC-20H/CAV-EcoRI) és a különböző mezei CAVizolátumok DNS-e közötti hasonlóság fokát vizsgáljuk, az izolált CAV-törzsekkel MDCC-MSB1 sejteket fertőztünk. Southem-analízist végeztünk. Minden DNS7
HU 220 102 Β készítmény tartalmazott olyan DNS-molekulákat, amelyek 32P-jelzett klónozott CAV-DNS-sel specifikusan hibridizáltak voltak. A különböző mezei CAV-izolátumokból származó DNS-molekulák hossza megfelel a klónozott CAV hosszának, és ezek a DNS-molekulák kettős szálúak vagy egyszálúak. A mezei CAV-fertőzött csirkék szövetmintáin közvetlenül végrehajtott Southem-blot-analízisek jelzett pIC-20H/CAV-EcoRI-vel hibridizálódó DNS-molekulák jelenlétét mutatták.
Mezei CAV-izolátumokból származó DNS restrikciós enzimes analízise
A különböző mezei CAV-izolátumokból származó DNS és a klónozott CAV-genom hasonlóságának további vizsgálatára restrikciós enzimes analízist végeztünk. A CAV-izolátumokból és a klónozott CAV-ból származó DNS-készítményeket külön-külön hét restrikciós enzimmel hasítottuk. Az enzimek, a BamHI, BglI, SstI és az Xbal minden DNS-t azonosan hasítottak. A mezei izolátumok legtöbbjének DNS-e két Acél helyet és/vagy két Hindin helyet tartalmazott, míg EcoRI helyet csak néhány izolátumból származó DNS tartalmazott. Az 5. ábrán összefoglalóan bemutatjuk a klónozott CAV és a különböző mezei izolátumok restrikciósenzim-térképét. A restrikciós helyek mellett az ábrán zárójelben megadjuk azon mezei izolátumok számát, amelyek a megfelelő helyet tartalmazzák.
Mezei CAV-izolátumokból származó DNS polimeráz-láncreakciója (PCR)
Klónozott CAV-DNS-szekvenciából származó CAV-1 és CAV-2 oligonukleotidokat (4. ábra) szintetizáltunk. Ezen szintetikus oligonukleotidok alkalmazásával PCR-t végeztünk, hogy a mezei CAV-ból a DNS-t specifikusan kimutassuk. A különböző CAV-izolátumokkal fertőzött MDCC-MSB1 sejtekből izolált DNS-t és fertőzetlen sejtekből izolált DNS-t sokszoroztunk. A DNS-sokszorozást követően a DNS-t hosszúsága szerint elektroforetikus eljárással agaróz/etidium-bromid gélen elválasztottuk. Egy sokszorozott 186 bp sáv (azaz a várt elméleti értéknek megfelelő) volt látható minden olyan DNS-mintában, amely a különböző CAV-izolátumokkal fertőzött sejtekből származott. Ez a sajátos sáv nem volt jelen a fertőzetlen sejtekből származó DNS sokszorozása után. Minden mezei izolátumból származó sokszorozott DNS-sáv azonos arányú vándorlást mutat agarózgélben. Ez az eredmény azt jelzi, hogy a különböző mezei CAV-izolátumok genomjának ebben a részében nem következik be nagyobb mértékű deléció vagy inszerció. 32P-jelzett CAV-3 oligonukleotiddal (4. ábra) végzett Southem-analízis azt mutatta, hogy a 186 bp sokszorozott DNS CAV-specifikus, és hogy semmiféle más DNS-sáv nem hibridizálódott a CAV-3-próbával.
A CAV-PCR kimutathatóságának érzékenységét vizsgáltuk. CAV-fertőzött sejtekből DNS-t izoláltunk, lépésenként hígítottuk, sokszoroztuk, majd agaróz/etidium-bromid gélen analizáltunk. A minták olyan mértékű sokszorozása után, hogy a DNS-mennyiség mintegy 100 CAV-fertőzött sejt DNS-mennyiségének megfelelő, egy CAV-specifikus, 186 bp méretű DNS-ffagmentet mutattunk ki. Akkor azonban, ha a sokszorozott DNS-t 32P-jelzett CAV-3-DNS-sel Southem-analízisnek tettük ki, már egy sejtből származó DNS-nek megfelelő mennyiségű DNS is egyértelműen látható CAVspecifikus DNS-sávot adott. A CAV-PCR igen érzékeny kimutatási módszer, amely specifikus az eddig vizsgált CAV-izolátumokra.
Mezei CA V-izolátumokból származó DNS dot-blotanalízise digoxigeninnel jelzett CAV-DNS-próbákkal
A PCR mellett kifejlesztettünk egy vizsgálati módszert mezei CAV-izolátumokból származó DNS kimutatására. Ebben a vizsgálatban nem alkalmazunk radioaktív próbát. A pIC-20H/CAV-EcoRI klón CAV-DNS-inzertjét 11-dUTP-digoxigeninnel jelezzük. A különböző CAV-izolátumokkal külön-külön megfertőzött MDCCMSB1 sejtekből származó DNS-készítményeket szűrőre foltként felviszünk (biot), és megvizsgáljuk a digoxigeninnel jelzett DNS-próbával való hibridizálódásra való képességüket. A különböző CAV-izolátumokkal fertőzött MDCC-MSB1 sejtből származó DNS-készítmények a digoxigeninnel jelzett DNS-próbával hibridizálódtak, míg a nem fertőzött sejttenyészetből származó DNS nem hibridizálódott. így ez a nem radioaktívan jelzett CAVDNS-próbával végzett vizsgálat alkalmas mezei CAVizolátumokból származó DNS kimutatására.
Alkalmazások
DNS
A CAV-DNS és/vagy -RNS kimutatására olyan készítményekben, amelyeket a kutatási és diagnosztikus célok érdekében vizsgálunk, CAV-szekvenciák, például a pIC-20H/CAV-EcoRI DNS-plazmid CAV-szekvenciái vagy annak részei használhatók. A DNS radioaktívan vagy más módon jelezhető, például biotion/digoxigeninnel. A CAV-nukleinsavak jelenléte megállapítható DNS/RNS slot-blot, Southem/Northem analízis és in vitro hibridizálások alkalmazásával. Az itt alkalmazott CAV-szekvencia-részek is DNS-oligomerek.
Igen alacsony koncentrációjú CAV-DNS/-RNS kimutatására polimeráz-láncreakcióban a pIC-20H/CAVEcoRI klón CAV-szekvenciájából származó oligomerek használhatók. A PCR egy igen érzékeny, vírusok kimutatására gyakran használt módszer.
A gyakorlatban lehetségesek a fenti alkalmazásra szolgáló diagnosztikai kitek is.
Kutatási célokra fontosak az olyan eljárások, mint az Sí-térképezés és a CAV-DNS-fragmentummal végzett primer extenzió. Ezzel a két eljárással a CAV-RNS mennyiségileg meghatározható és tovább jellemezhető.
A génfunkciók vizsgálatára antiszenz konfigurációjú oligomerek használhatók. Ezek modellül szolgálhatnak vírusreplikáció gátlására szolgáló új módszerek vizsgálatához is.
A CAV-DNS-transzfekciónál kis génffagmentumok hordozójaként szolgálhat, különösen ha a patogén tulajdonságokat a CAV-genomból delécióval eltávolítjuk.
Az antiszenz konfigurációjú CAV-oligomerek vírusvektorokban kifejezhetők, ez lehetővé teszi a CAV-replikáció és más génfünkciók élő állatban vagy in vitro történő tanulmányozását.
RNS
SP6/T7 vektorokba klónozott CAV-DNS-fragmentumok CAV-RNS-termékeket eredményeznek. Az in
HU 220 102 Β vitro transzkripcióval kapott CAV-RNS-ek CAV-proteinek in vitro/ín vivő szintézisére használhatók. így RNS-molekulák, például búzacsíraextraktban, proteinekként fejezhetők ki (in vitro transzláció). Az in vitro transzlációval kapott CAV-proteinek ezt követően felhasználhatók például CAV elleni antitestek csirkék szérumában való kimutatására (lásd később). A CAVRNS molekulák bejuttathatok sejtekbe mikroinjektálásos módszerrel is, hogy ott proteinekként fejeződjenek ki. így a CAV-proteinek hatása sejtszinten tanulmányozható. Tanulmányozhatók a protein/protein és/vagy protein/DNS kölcsönhatások is.
A CAV-RNS-eket felhasználhatjuk CAV-nukleinsavak készítményekben való kimutatásánál próbaként is. A vizsgálat végrehajtható slot-blot-, Southern- vagy Northem-analízissel és in situ hibridizációs analízissel. Ezek a módszerek használhatók CAV iránti diagnosztikus tesztek kifejlesztésére.
Proteinek
Minden CAV-protein kifejezhető prokarióta vagy eukarióta rendszerekben. Ehhez az szükséges, hogy a talált CAV nyílt leolvasási keretek megfelelő expressziós vektorba legyenek klónozva. Bakteriális rendszer számára megfelelő egy, a T7 promoteren alapuló expressziós vektor a CAV nyílt leolvasási keretek expressziójára. A baculovírus-rendszer, az élesztő és a CHO-dhfr rendszer lehetséges eukarióta expressziós rendszerek. A vírusvektorok, például a retrovírusvektorok ugyancsak megfelelőek.
A CAV-proteinek vagy az azokon elhelyezkedő epitópok felhasználhatók CAV elleni antitestek kimutatására. Például a CAV-fertőzött csirkék vizsgálhatók így. A CAV-proteinek vagy azokon elhelyezkedő epitópok immunológiai vizsgálatokban, például immunperoxidázos színezésnél, ELISA- és immunfluoreszcens vizsgálatban alkalmazhatók.
A CAV-proteinek és azon elhelyezkedő epitópok alkalmazhatók CAV elleni humorális és/vagy sejthez kötött immunitás nyújtására. Az eukarióta és prokarióta vektor/gazdaszervezet rendszerekben történő expresszióval nyert CAV-proteinek felhasználhatók alegységvakcinákhoz.
A CAV-proteinek vagy azon elhelyezkedő epitópok alkalmazásával CAV-specifikus antitestek nyerhetők, amelyek lehetővé teszik CAV-proteinek kimutatását CAV-fertőzött csirkékből származó készítményekben (lásd alább).
Antitestek
Számos, fiatal csirkéken végrehajtott fertőzési vizsgálatban sikerült megerősíteni, hogy az anyai antitestek hatékony passzív védelmet tudnak nyújtani CAV-fertőzésekkel szemben. Az anyai antitesteket a fiatal csirkékbe természetes úton, valamint az újszülött csirkék CAV-antitestet tartalmazó tojássárgája-kivonattal való injektálása révén vittük be. CAV-fertőzés elleni passzív védelmet tojó időszakuk előtt közvetlenül CAV-val fertőzött tojós tyúkok tojássárgájának kivonatát beinjektálva is létrehoztunk.
Tojós tyúkoknak a fenti expressziós rendszerek valamelyikében kifejeződött CAV-proteinekkel történő vakcinálása anyai antitestek képződését eredményezi.
Az ilyen tojók fiatal csirkéi védettek lesznek CAVfertőzéssel szemben.
A CAV elleni antitestek alapján diagnosztikai vizsgálatok fejleszthetők ki. Erre a célra mind poliklonális, mind monoklonális antitestek használhatók. CAV-specifikus antitestek alkalmazásával megvizsgálható, hogy adott készítmények tartalmaznak-e CAV-proteineket.
A CAV-antitestek fenti alkalmazási módjai az előzőekben leírt módon előállított találmány szerinti antitestek alkalmazásával éppúgy elvégezhetők, mint természetes CAV-antitestekkel.
Élövirus-vakcinák
Ha az immunrendszerbe élővírus-vektorok révén vírusproteineket juttatunk, az várhatóan jobb immunválaszt vált ki, mint egy alegységvakcina. Egy vagy több CAV nyílt leolvasási keret (teljes vagy egy része) beépíthető élővírus-vektorokba. Baromfiak esetén csak olyan élővírus-vektorok alkalmazhatók, amelyek önmaguk jól replikálódnak a számyasrendszerekben. Csirkékben való alkalmazásra megfelelő vektorok például a számyashimlővírus, a retrovírusvektorok, a herpeszvírusvektorok (számyasherpeszvírus 1, 2 és 3 szerotípusok) és a fertőző gége-légcső hurut (laringotracheitis) vírusa, és esetleg adenovírusok, például a CELO is. A fenti élővírus-vektorokkal való immunizálás védelmet nyújt CAV-val és a hordozóvírussal szemben.
A CAV-genomban egy vagy több deléció végrehajtásával olyan vakcinák fejleszthetők ki, amelyek fiatal csirkék CAV-fertőzések elleni immunizálására alkalmasak. A deléciók alkalmazásánál a CAV-fertőzések. patogén jellegét kell megszüntetni, de a replikációs és ennek folytán immunizáló tulajdonságát meg kell őrizni.
A CAV-genom önmaga is alkalmassá tehető élővírus-vektorként más vírusok antigénjeinek expressziójára. Ehhez az szükséges, hogy a CAV-genomot úgy változtassuk meg, hogy a CAV-proteinek mellett vagy helyett „idegen” vírusproteinek expresszálódjanak. A CAV-vektorokat ezért úgy konstruáljuk, hogy a védelem csak az „idegen” vírus ellen vagy a CAV-vírus ellen is létrejöjjön a vírusproteineknek a vakcináit állatban a rekombináns vektor által bekövetkező expressziójától függően.
Az alegységvakcinaként, deléciós vakcinaként vagy génffagmentként más vírusvektorban létrehozott CAVvakcinákat elsősorban tojós tyúkok vakcinálására alkalmazzuk. Azonban egy, a találmány szerinti lehetséges felhasználás marad a fiatalabb korú csirkék vakcinálása, például Marek-féle kórral szembeni vakcinálással kombinálva.
Enhancer/promoter elemek
A CAV-promoter és enhancer elemek DNS-vektorokba klónozhatok. A CAV-promoter/-enhancer szabályozása alatt CAV-proteinek vagy „idegen” proteinek fejezhetők ki mind csirkesejtekben, mind más típusú sejtekben.
Elképzelhető, hogy a CAV-promoter (csirke)-csontvelősejtekben működőképes. Génterápiás modell rendszereként „idegen” proteinek fejezhetők ki in vitro, csontvelőben CAV-promoter/-enhancer elemek alkal9
HU 220 102 Β mazásával, adott esetben retrovírusvektorokkal kombinálva. A genetikusán módosított csontvelősejtek azután csontvelőbe transzplantálhatók, jelen esetben csirkék csontvelőjébe igen kis génfragmentumok számára vektorként való alkalmazásra önmaga a CAV-genom is elegendő.
A CAV-enhancer/-promoter elemek más organizmusokban is aktívak lehetnek. Ha ez az eset fennáll, az elemek alkalmazhatók például egérrendszerben génterápia modelljeként.
Génterápiás eljárások tanulmányozására és kifejlesztésére lehetőséget nyújtanak a CAV-nak önmagának a termékei a saját CAV-promoterünk vagy más promoter szabályozása alatt is.
Az a lehetőség, hogy a CAV-genom egészét vagy lényegében egészét klónozóvekorként alkalmazzuk, azaz egy számyasrendszerek számára szolgáló eukarióta plazmidként, előrehaladás, amely a CAV-genom szerkezetének felismerésével válik realitássá.
plC-20H/CAV-EcoRI CAV-klón letétbe helyezése
A pIC-20H/CAV-EcoRI plazmiddal transzformált HB101 sejtek glicerines törzsoldatát helyeztük letétbe Baamban a Centraalbureau voor Schimmelcultures letéti helyen, a CBS 361.90 letéti számon.
A következőkben az ábrák magyarázatát adjuk.
Az 1. ábrán a klónozott CAV-DNS nukleotidszekvenciáját mutatjuk be, amelynek teljes hossza 2319 bázis, 1-helyzetnek az EcoRI hely első G-jét tekintjük.
A 2. ábrán az előre jelzett nyílt leolvasási keretek (ORF-k) láthatók mindkét DNS-szál esetén, ezek hossza több mint 300 bázis. A három különböző startkodon, az ATG, CTG és GTG esetére jelzett ORF-k a 2a., 2b. és 2c. ábrán láthatók.
A 3. ábrán az egyszálú DNS-t tartalmazó CAV-genom előre jelzett hajtűszerkezete látható.
A 4. ábrán a PCR-nél használt oligonukleotidokat mutatjuk be. Az ábrán látható a DNS-szekvencia, és az oligonukleotid helyzete a CAV-genomon. A nukleotidok helyzete a CAV-genomban megfelel az 1. ábrán bemutatottnak.
Az 5. ábrán a klónozott CAV-DNS restrikciósenzimtérképét mutatjuk be. Zárójelben azoknak a CAV-izolátumoknak a száma áll az összes 21-ből, amelyek genomjukban az adott restrikciósenzim-helyet tartalmazzák.
A következőkben az alkalmazott anyagokat és módszereket ismertetjük.
Sejttenyészetek és vírusok
A CAV-izolátumokat olyan transzformált limfoblasztoid sejtvonalakban tenyésztettük, amelyek számyasleukózis-vírus A alcsoportja (1104-X5) vagy Marek-féle kór vírusa (MDCC-MSB1) által csirkékben kiváltott tumorokból származnak. A sejttenyészeteket mintegy 0,1-1 TCID50 per sejt mértékben fertőztük. 2 nap múlva a sejteket összegyűjtöttük. A sejteket klónozott CAVDNS-vírus szaporulatával vagy mezei izolátumokkal fertőztük. CAV-Cux-l-hez, amelyet eredetileg Németországban, Marek-féle kórban szenvedő csirkék csoportjából izoláltak [Von Bülow, V., Fuchs, B., Vielitz, B. és Landgraf, H.; Zentralblatt für Veterinarmedizin B. 30, 742-750 (1983); Von Bülow, V., Fuchs, B. és Bertram, M.; Zentralblatt für Veterinarmedizin B. 32, 679-693 (1985)] Dr. M. S. McNulty [Veterinary Research Laboratories, Belfast, Eszak-Irország] szívességéből jutottunk. 1988 januárjában Dr. J. P. Rosenberger [University of Delaware, Newark, USA] két vérmintát küldött hozzánk a Marek-féle kór T-1704 törzse és származéka, az MDV-Del-S - amely csirkében az első passzálás - virulenciájának meghatározására. A CAVT-1704 és CAV-Del-S izolátumokat az MDV T-1704 törzssel és az MDV-Del-S jelölésű származékával fertőzött SPF csirkékből nyertük. A holland CAV-izolátumokat aszelektíven választottuk 60 tagból álló sorozatból, amelyeket MDCC-MSB1 sejttenyészetben tenyésztettünk. A mezei anyagot J. C. van den Wijngaard [Gezondheidsdienst Brabant at Boxtel] és J. Naber [Gezondheidsdienst voor Pluimvee at Doom] juttatta számunkra, többnyire azért, mert autopszia során a csecsemőmirigy sorvadását észlelte. A sorozathoz hozzátettük saját SPF állatcsoportunkból nyert CAV-izolátumokat is.
A teljes DNS izolálása
Vírus- és májkészítményeket újraszuszpendáltunk 20 mmol/l-es, pH=7,5-es trisz-HCl-pufferben, amely 2 mmol/1 EDTA-t, 0,2% SDS-t (nátrium-dodecil-szulfát) és 0,6 mg/ml Proteináz-K-t tartalmazott, és az elegyet 1 órán át 37 °C hőmérsékleten inkubáltuk. A készítményeket fenol, kloroform és izoamil-alkohol 25:24:1 arányú elegyével extraháltuk, és a DNS-t etanollal kicsaptuk. A DNS-üledéket 100 μΐ 10 mmol/l-es, pH=7,5-es, 1 mmol/1 EDTA-t tartalmazó trisz-HCl-pufferben újraszuszpendáltuk.
Az alacsony molekulatömegű DNS extrahálása és elemzése
Alacsony molekulatömegű DNS-t izoláltunk Hirt, B. [Journal of Molecular Biology 26,365-369 (1967)] eljárásával CAV-fertőzött 1104-X5 és MDCC-MSB1 sejtekből, valamint fertőzetlen 1104-X5 sejtekből. A DNS-t agarózgélen elválasztottuk, és etidium-bromiddal történő festés után ultraibolya fénnyel közvetlenül elemeztük, vagy Biotrace-szűrőre vittük (biot) Southern, E. M. eljárása szerint [Journal of Molecular Biology 98, 503-517 (1975)]. A biotokat 2,7-3,5 kb hosszúságú, CAV-fertőzött 1104-X5 sejtek alacsony molekulatömegű DNS-éből izolált, random primerrel indított (random-primed) 32P-jelzett DNS-sel hibridizáltuk.
A CA V-DNS klónozása
A teljes CAV-DNS-genomot pIC-20H bakteriális vektorba klónoztuk. A CAV-DNS-genom részeit pIC19R vektorba klónoztuk. Minden plazmid-DNS-klónozási lépést lényegében a Maniatis és munkatársai [Maniatis, T., Fritsch, E. F., és Sambrook, J.; Molacular Cloning: A Laboratory Manual. New York: Cold Spring Harbor Laboratory, (1982)] által leírt eljárás szerint végeztünk.
CA V-DNS szekvenciaanalízise
CAV-DNS-plazmidokat CsCl-gradiens alkalmazásával és Sephacryl-S500 (Pharmacia) kromatografálással tisztítottunk. A kettős szálú DNS-t T7-DNS-polimeráz (Pharmacia) vagy Taq-DNS-polimeráz (Promega) alkalmazásával szekvenáltuk. Mindkét eljárást a Pharmacia, illetve a Promega által adott instrukciók sze10
HU 220 102 Β rint végeztük. Az oligonukleotidokat a Pharmacia T4 nukleotidkinázzal kezeltük. Az „erős stop” (strong stop) helyeket Maxam és Gilbert [Maxam, A. M., és Gilbert, W.; Proceedings National Academic Sciences U. S. A. 74, 560-564 (1977)] által leírt eljárás szerint szekvenáltuk.
A klónozott CA V-DNS-genom cirkulárissá tétele
A teljes CAV-DNS-genomot tartalmazó klónokból 10 pg plazmid-DNS-t restrikciós enzimmel emésztettünk úgy, hogy a teljes CAV-DNS-inszertet elkülönítettük a vektor-DNS-ből. A 2,3 kilobázispár méretű lineáris CAV-DNS-molekula T4-DNS-ligázzal történő kezelésének eredményeként cirkuláris kettős szálú CAVDNS-t nyertünk. A ligálás termékét 0,8%-os agarózgélen elemeztük.
DEAE-dextrán transzfekció
1104-X5 és MDCC-MSB1 sejtek transzfekciójához 2 pg újraligált CAV-DNS-t kétszer szuszpendálunk 25 pl Milli-Q vízben, és 260 pl TBS-pufferrel elegyítünk. A DNS-elegyhez 15 pl 10 mg/ml-es DEAE-dextránt adunk, és az elegyet szobahőmérsékleten 30 percig inkubáljuk.
1104-X5 sejtek mm-es, lemezenként 1-2 χ 106 1104-X5 sejtet tartalmazó szövettenyésztő lemezt TBS-pufferrel kétszer mosunk. A TBS-puffert tökéletesen eltávolítjuk az egy rétegben lévő sejtekről, és 300 pl DEAE-dextrán/DNShígítást adunk hozzá. A sejteket 30 percig szobahőmérsékleten inkubáljuk. A DEAE-dextrán/DNS elegyet 2 ml 25%-os DMSO/TBS eleggyel helyettesítjük, és a sejtegyréteget szobahőmérsékleten 2 percig inkubáljuk. A sejteket TBS-pufferrel kétszer mossuk, és a szövettenyészethez RPMI 1640 vagy E-MEM tápközeget adunk. A sejteket 5% szén-dioxidot tartalmazó légtérben 37 °C hőmérsékleten tenyésztjük.
MDCC-MSB1 sejtek
Mintegy 2χ 106 MDCC-MSB1 sejtet centrifugálunk 1500 fordulat/perc mellett asztali centrifugán. A tápközeget 5 ml TBS-pufferrel helyettesítjük, és a sejteket gondosan újraszuszpendáljuk. A mosási lépést megismételjük. Minden TBS-puffert eltávolítunk, a sejtüledéket gondosan újraszuszpendáljuk 300 pl DEAE-dextrán/DNS elegyben, és szobahőmérsékleten 30 percig inkubáljuk. Az elegyhez 0,5 ml 25%-os DMSO/TBS-t adunk, és a szuszpenziót 3 percig szobahőmérsékleten inkubáljuk. 5 ml TBS-t adunk hozzá, és a sejteket asztali centrifugán 1500 fordulat/perc mellett centrifugáljuk. A felülúszót eltávolítjuk, és 50 ml szövettenyésztő tápközeget adunk a maradékhoz. A sejteket felszuszpendáljuk, majd centrifugáljuk. A sejteket 5 ml szövettenyésztő tápközegben felvesszük, és 5% szén-dioxidot tartalmazó légtérben 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk. Kontrollként 2 pg pIc-20H plazmidot használunk a transzfekcióhoz.
In vitro neutralizációs vizsgálat
MDCC-MSB1 sejteket MDCC-MSB1 sejtek felülúszójával infektálunk, és 1104-X5 sejteket klónozott „CAV-DNS”-sel transzfektálunk. Mintegy 2χ 104 sejtet infektálunk. Az inokulum vírustartalma nem pontosan ismert. Az infektált sejttenyészetek felének tápközegébe CAV iránt semlegesítőaktivitással bíró, 1:100 hígítású poliklonális szérumot adunk. Kontrollként egy sor olyan „lyukat” veszünk, amely CAV-fertőzött MSB1 sejteket tartalmaz, és tápközegében nincs CAV ellen irányuló antiszérum.
Egynapos csirkék CA V-fertőzése
Egynapos csirkékbe intramuszkulárisan beinjektáljuk CAV-DNS és kontroll-DNS által transzfektált MDCC-MSB1 és 1104-X5 sejtek felülúszóit. Az infekció után 6 nappal a hematokritérték és a teljes testtömeg meghatározását követően csoportonként 5 csirkét felboncolunk. A vírus izolálására és immunohisztokémiai vizsgálatok céljára heparinos vért, csecsemőmirigyet és csontvelőt gyűjtünk. Az immunohisztokémiai kutatást csecsemőmirigynek többek között CAV-specifikus monoklonális CAV 1-85.1-gyel együtt való peroxidázfestésével végezzük. Az infekciót követő 14. és 28. napon további 5-5 csirkét boncolunk fel, és az előzőekben leírt meghatározásokat elvégezzük.
Polimeráz-láncreakció (PCR)
Az oligonukleotidokat Cyclone DNS-szintetizátorral (Biosearch Inc. USA) szintetizáljuk. A szekvencia a CAV-DNS 1. ábrán bemutatott szekvenciájából származik. A PCR-t CAV-fertőzött és fertőzetlen MDCCMSB1 sejtekből származó DNS-en izoláljuk. A reagensek végkoncentrációja 50 mmol/1 KC1, 10 mmol/1 triszHC1 (pH=8,3), 3 mmol/1 MgCL, 0,01% borjú-szérumalbumin, 200 pmol/l minden dNTP-ből, 1 pmol/l minden oligonukleotidból és 2 egység Taq-DNS-polimeráz (CETUS, USA) minden 100 pl elegyben. A DNS-mintákat ciklikusan inkubáljuk 30-szor 1 percig 93 °C hőmérsékleten, 1 percig 55 °C hőmérsékleten, és 3 percig 72 °C hőmérsékleten egy Perkin Elmer/Cetus hőciklizálóban. A sokszorozott DNS egytized részét közvetlenül elemezzük 2%-os agaróz/etidium-bromid gélen vagy Southem-blot-analízissel. DNS-próbaként olyan oligonukleotidot alkalmazunk, amely terminálisán 32P-jelzett Maniatis és munkatársai szerint [Maniatis, T., Fritsch, E. F. and Sambrook, J.; Molecular Cloning: A Laboratory Manual. New York: Cold Spring Harbor Laboratory, 1982],
Dot-blot-analizis
A pIC-20H/CAV-EcoRI CAV-DNS-inszertet izoláljuk és digoxigenin-ll-dUTP-vel (Boehringer, Mannheim, Németország) jelezzük a gyártó előírása szerint. Biotrace-RP-szűrőket 1,5 mol/l nátrium-kloriddal és 0,15 mol/l nátrium-citráttal telítünk. A DNS-mintákat 10 mmol/l-es, pH=7,5-es, 1 mmol/1 EDTA-t tartalmazó trisz-HCl-ben újraszuszpendáljuk, 3 percig forraljuk, jégbe hűtjük, majd a szűrőre visszük. A szűrőt szobahőmérsékleten szárítjuk, majd 65 °C hőmérsékleten 30 percig inkubáljuk. A szűrőket digoxigeninnel jelzett DNS-sel hibridizáljuk. A digoxigeninnel jelzett DNS-t a gyártó előírása szerint végzett immunológiai színezéssel tesszük láthatóvá.
HU 220 102 Β
1. táblázat
C A V-enhancer/-promoter régiójában lévő ismert transzkripciósfaktor-kötő szekvenciaelemek
Elem Konszenzusszekvencia CAV-szekvencia Pozíció a CAV-szckvenciában
1. -TATA-# GTATAa/tAa/t GTATATAT 321-330+
2. SP1 GGGCGG GGGCGG 305-310+
3. CREB TGACGTCA TGACGTTT 290-297
4. PEA-Id’y) GGAAGTGACTAAC GAAAGTGACTTTC 286-298
5. QT(SV40) G°/cTGTGGAAa/tGT CGTTGCGAAAGT 279-290
6. MLTF GGCCACGTGACC TGCCACTGTCGA 274-285
7. CCAAT-TF AGCCAAT AGCCAAT 260-266+
8. -CACCC-# CACCC CAGCC 259-263
9. ATF ACGTCA ACGTCA 253-258+
10. -CACCC-# CACCC CAGCC 236-240
11. ATF ACGTCA ACGTCA 232-237+
12. SP1 (gyenge) GAGGCG 209-214
13. ATF ACGTCA ACGTCA 199-204+
14. -CACCC-# CACCC CATCC 182-186
15. ATF ACGTCA ACGTCA 178-183+
16. -CACCC# CACCC CATCC 161-165
17. ATF ACGTCA ACGTCA 157-162+
- CAP-hcly valószínű mintegy 350-nél.
- Tökéletes homológia a CAV- és a konszenzusszekvencia között. _Néhány vírusban talált konszenzusszekvencia.
# Egy elem DNS-szekvenciája.
SZABADALMI IGÉNYPONTOK

Claims (10)

1. Rekombináns nukleinsav, azzal jellemezve, hogy csirkeanémia-vírus (CAV) genom vagy egy része nukleotidszekvenciájának megfelelő, CAV-specifikus nukleotidszekvenciát tartalmazó, kettős szálú DNS-molekula.
2. Az 1. igénypont szerinti rekombináns nukleinsav, 40 azzal jellemezve, hogy az 1. ábrán bemutatott nukleotidszekvenciának megfelelő, vagy azzal komplementer CAV-specifikus nukleotidszekvenciát vagy azzal legalább 60%-ban homológ, vagy annak részét képező CAV-specifikus nukleotidszekvenciát tartalmaz.
3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti rekombináns nukleinsav, azzal jellemezve, hogy CAV-genomban előforduló, CAV-proteint kódoló nukleotidszekvenciának vagy egy részének megfelelő, vagy azzal komplementer CAV-specifikus nukleotidszekvenciát tartalmaz.
4. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti rekombináns nukleinsav, azzal jellemezve, hogy CAV-genomban előforduló, regulátor funkciót betöltő nukleotidszekvenciának vagy egy részének megfelelő, vagy azzal komplementer CAV-specifikus nukleotidszekvenciát tartalmaz.
5. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti rekombináns nukleinsav, azzal jellemezve, hogy egy, nem CAV-genomi eredetű nukleotidszekvenciát is tartalmaz.
6. Az 5. igénypont szerinti rekombináns nukleinsav, azzal jellemezve, hogy a nem CAV-genomi erede- 60 tű nukleotidszekvencia prokarióta vagy eukarióta expressziós vektorból származó nukleotidszekvenciát tartalmaz.
7. Az 5. igénypont szerinti rekombináns nukleinsav, azzal jellemezve, hogy a nem CAV-genomi eredetű nukleotidszekvencia egy, CAV-proteintől eltérő egyéb proteint vagy ilyen protein egy részét kódoló nukleotidszekvencia.
8. Az 5. igénypont szerinti rekombináns nukleinsav, azzal jellemezve, hogy nem CAV-genomi eredetű nukleotidszekvenciaként egy olyan nukleotidszekvenciát
45 tartalmaz, amely a CAV-genomban nem fordul elő, és regulátor funkcióval bír.
9. Az 1-8. igénypontok bármelyike szerinti rekombináns nukleinsav, azzal jellemezve, hogy a DNS egy vagy több, DNS jelölésére alkalmas markerrel, célsze50 rűen radioizotóppal, enzimmolekulával, hapténnel, fluoreszcens anyaggal, színezékkel, pigmenttel vagy részecske formájú markerrel jelzett.
10. Az 1 -9. igénypontok bármelyike szerinti rekombináns nukleinsav, azzal jellemezve, hogy rekombináns
55 vírusrészecskékbe bezárt.
11. Eljárás rekombináns nukleinsav alkalmazására diagnosztikai célokra vagy CAV-proteinek, vagy nem CAV-proteinek előállítására, azzal jellemezve, hogy az 1-10. igénypontok bármelyike szerinti, rekombináns nukleinsavat alkalmazzuk.
HU 220 102 Β
12. All. igénypont szerinti eljárás rekombináns nukleinsav alkalmazására, azzal jellemezve, hogy diagnosztikai célként CAV-DNS vagy -RNS kimutatására CAV-specifikus próbaként vagy láncindítóként, DNS/RNS slot-blotolás során, Southem-blotolás során, Northem-blotolás során, in situ hibridizálás során, DNS-PCR-amplifikálása során, SÍ-térképezés vagy láncindító-hosszabbítás során az 1 -9. igénypontok bármelyike szerinti rekombináns nukleinsavmolekulát alkalmazunk.
13. Diagnosztikai reagenskészlet CAV-DNS vagy -RNS kimutatására DNS/RNS slot-blotolás során, Southem-blotolás során, Northem-blotolás során, in situ hibridizálás során, DNS-PCR-amplifikálása során, Sltérképezés vagy láncindító-hosszabbítás során, azzal jellemezve, hogy CAV-specifikus próbaként vagy láncindítóként az 1 -9. igénypontok bármelyike szerinti rekombináns nukleinsavat tartalmaz.
14. Eljárás CAV vagy más patogén elleni védelem megvalósítására szolgáló készítmény előállítására, azzal jellemezve, hogy a 10. igénypont szerinti rekombináns nukleinsavat alkalmazzuk.
15. Vakcinakészítmény CAV vagy más patogén elleni immunizálásra, azzal jellemezve, hogy az 1-10. igénypontok bármelyike szerinti rekombináns nukleinsavat, és adott esetben egy vagy több hordozót és élővírusvakcinákban alkalmazható adjuvánst tartalmaz.
16. Eljárás rekombináns nukleinsav alkalmazására CAV-fehéije, annak része vagy CAV-tól eltérő fehérje előállítására szolgáló eljárásban, azzal jellemezve, hogy az 1-10. igénypontok bármelyike szerinti rekombináns nukleinsavat in vitro vagy in vivő transzlatáljuk.
17. Eljárás rekombináns nukleinsav madárrendszerekben alkalmazható klónozóvektorként történő alkalmazására, azzal jellemezve, hogy az 1-10. igénypontok bármelyike szerinti nukleinsavat alkalmazzuk.
18. Prokarióta vagy eukarióta sejt, azzal jellemezve, hogy az 1-10. igénypontok bármelyike szerinti rekombináns nukleinsavat tartalmazza.
19. A 18. igénypont szerinti, rekombináns nukleinsavat tartalmazó prokarióta vagy eukarióta sejt, azzal jellemezve, hogy alkalmas legalább egy, az 1-10. igénypontok bármelyike szerinti rekombináns nukleinsav által kódolt protein vagy proteinrész expresszálására.
HU 220 102 B
Int. Cl.7: C 12 N 15/35
10 20 30 40 $0 60 70 80 90 100
CAATTCCCAG tgcttactat tccatcacca ttctaccctc tacacagaaa ctcaacatcc acgaatccct cgacttccct ccccattcct ccaacgcccg
O O < β < o < o kJ o < O kJ o < o < o 0 «1 ►“ m VJ t O ΙΛ kJ 10 kJ K < kJ kJ u r □ H kJ u »- ö VJ o kJ 3 kJ kJ ΰ ►5 $ 5 kJ kJ kJ kJ U u O kJ Ο H- o < o < o t Ok < Φ VJ Ok < Ok < Ok η Ι- ej m kJ ▼ kJ 5 Ο kJ k- vj kJ u u kJ * u U u < vj 0 o □ t £ t 5
kJ
o kJ ο a © ot- © o < © VJ O kJ © VJ o «0 kJ «Ο kJ eo vj ao < co O eo kJ ao VJ eo <c OO VJ oo < t— m Q *5 vög eo kJ ’δ O r-4 u kJ 3 δ * í kJ < o H o μ kJ kJ kJ G kJ VJ kJ u u ο b δ 3 δ kj h· kJ < h- a < ο 5 < <
δ
o δ É o X O kJ O kJ O kJ O kJ o kj O K 2δ o u 1 ΓΜ « K. kJ m kJ kJ tx kJ *Ö Sb u · kJ ’b r- < ** Ι- Ο vj 00 kJ b Si 3 kJ u l·· kJ kJ u < kJ H u < < kJ kj < kJ kj < u < kJ < 0 kJ δ □ kj »- kJ □ kJ < kJ kJ 3 kj δ kJ kJ kJ kJ 3 < υ b b <j < kj o ►— 3δ O < 2δ O kJ O h- O kJ O kJ O kJ o < KO o 10 l·— Et U3 < <0 kJ 10 U io < <0 kj Sb rH u ~δ μ- <*» < » u kJ eo Ot * É t- 3 u ο 3 3 δ □ kJ 3 u α < kj 0 u kJ V k- kJ < u íj o < X £ »- u § 3 3 b δ § b vj a < < < u < < o kJ O kJ O kJ S3 O kJ O kJ O K o < O kJ sb < KI VJ w»kj Et l/Ί VJ εδ V» ►- IA kJ •M kJ rl kJ m kJ *b kJ kO kJ eo kJ σι f- o ►- í 8 fcÍ y b υ b E 3 3 □ 3 s 5 u u 3 3 □ u < < u < a □ < u ο ί- >j kJ < kj 3 H* u □ ο < kJ □ ►— < u
o < O kJ o t- O kJ O kj * kJ kJ £δ V kJ eö fX VJ Al VJ w < kJ δ δ 3 u u < vj u u kJ u u u δ kJ u a u 3 < H- δ s t O kJ O VJ st OH O kJ m kJ ÍA VJ m h» -· k* U » kJ kJ lAg kJ vS < kJ Ö kJ VJ K kJ < kJ kJ δ í kJ kJ δ kJ < u H H kJ ►» Ι- < < O kJ O VJ Ο kj O kJ Al K Al kJ Al I— m (j Al kJ Al kJ .-4 kJ Al kJ H IA < kJ kJ kJ kJ kJ kJ kJ t kJ < δ 3 kJ kJ <j u kJ kJ kJ a ο kJ a kJ vj < kJ vj kJ ű □ O kJ o < O kJ O kJ O kJ H kJ rl kJ -k kJ t rl 1- Ή < Al < ΓΑ kJ v U IA Ij kJ kJ a < kJ kJ u K kJ Vj kJ u < kJ kJ δ k· < 3 kJ <r kJ u < kJ O kj kJ
o kJ σ kj o < o»- o < T VJ W VJ ▼ ►— Ϊ3 Ι- IO h· b eo u Ο kJ < kJ < rl VJ < <j kJ kJ □ u kJ □ kJ kJ kJ h VJ Ü < ü kJ kJ kJ kJ 3 3 3 o >— o < SŐ Ο H O δ r«i kJ »A J n l— n 10 3 A- 0 eo VJ σι u O H kJ kJ < rl kJ H kJ kJ □ H kJ < < kj VJ H- « < kJ < kJ 0 kJ < b 1- kJ < < kJ ü Ír O ο O kJ O kJ Sb o kJ Al ο Al kJ Al VJ Al kJ 10 1— a. kJ eo < σι vj o < 6 δ kJ kJ δ rl b § t- kJ kJ v> b δ kJ δ δ a a υ μ υ kJ vj O h· O kJ O kJ O H o kJ < rl < rl ►· rl VJ vj 10 3 A. kJ eo vj σι kj o kJ □ kJ < kJ vj É < kJ kJ 3 b δ u u 3 3 G vj □ □ < < <
1110 1120 11)0 1140 1150 1160 1170 1180 1190 1200
TCTCCCTAAA AACACCACAC CCCCCCGCTA TGCACACCAC ATGTACCCCG CGAGACTCCC CAAGATCTCT GTGAACCTCA AAGACTTCCT CCTACCCTCA
HU 220 102 B
Int. Cl.7: C 12 N 15/35
1210 1220 1230 1240 1250 1260 1270 1280 1290 1300
ATCAACCTCA CATACCTCAG CAAAATCCCA CCCCCCATCC CCCCTCACTT CATTCCCCAC CCCTCTAAAT CACAAGCCCC CCACAATTCC CCTAATTCCT
O F O P iO p —< p p o p σι <
ΙΛ P Ί F δ
p o
OO
HU9300716A 1990-09-12 1991-09-11 Csirkeanémiavírus-DNS, klónozása és alkalmazásai HU220102B (hu)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
NL9002008A NL9002008A (nl) 1990-09-12 1990-09-12 Recombinant dna en rna en daarvan afgeleide produkten.

Publications (3)

Publication Number Publication Date
HU9300716D0 HU9300716D0 (en) 1993-06-28
HUT65974A HUT65974A (en) 1994-08-29
HU220102B true HU220102B (hu) 2001-10-28

Family

ID=19857669

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU9300716A HU220102B (hu) 1990-09-12 1991-09-11 Csirkeanémiavírus-DNS, klónozása és alkalmazásai

Country Status (21)

Country Link
US (6) US5491073A (hu)
EP (2) EP0905246A1 (hu)
JP (1) JP2846116B2 (hu)
AT (1) ATE188739T1 (hu)
AU (1) AU651999B2 (hu)
CA (1) CA2091181C (hu)
DE (1) DE69131903T2 (hu)
DK (1) DK0548234T3 (hu)
ES (1) ES2144399T3 (hu)
GR (1) GR3033173T3 (hu)
HR (1) HRP940668B1 (hu)
HU (1) HU220102B (hu)
IL (1) IL99435A (hu)
MX (1) MX9101042A (hu)
NL (1) NL9002008A (hu)
RU (1) RU2146292C1 (hu)
SI (1) SI9111508B (hu)
UA (1) UA48936C2 (hu)
WO (1) WO1992004446A1 (hu)
YU (1) YU49095B (hu)
ZA (1) ZA917065B (hu)

Families Citing this family (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20080234466A1 (en) * 1990-09-12 2008-09-25 Noteborn Mathieu H M Delivery method for the tumor-specific apoptosis-inducing activity of apoptin
US20020061296A1 (en) * 2000-09-08 2002-05-23 Noteborn Mathieu H.M. Delivery method for the tumor specific apoptosis inducing activity of apoptin
US6162461A (en) * 1990-09-12 2000-12-19 Leadd B.V. Chicken anemia virus mutants and vaccines and uses based on the viral proteins VP1, VP2 and VP3 or sequences of that virus coding therefor
US20030138443A1 (en) * 1993-03-08 2003-07-24 Noteborn Mathews H.M. Cloning of chicken anemia virus DNA
NL9301272A (nl) * 1993-07-20 1995-02-16 Aesculaap Bv Chicken Anemia Virus mutanten en vaccins en toepassingen gebaseerd op de virale eiwitten VP1, VP2 en VP3 of daarvoor coderende sequenties van dat virus.
ZA918426B (en) * 1990-10-31 1992-12-30 Akzo Nv Chicken anemia virus vaccine and diagnostic
EP0878546A1 (en) * 1997-04-15 1998-11-18 Leadd B.V. A gene delivery vehicle expressing the apoptosis-inducing proteins VP2 and/or apoptin
US5789567A (en) * 1994-07-06 1998-08-04 Cornell Research Foundation, Inc. Chicken infectious anemia virus vaccine
GB9414888D0 (en) * 1994-07-23 1994-09-14 Univ Belfast Method and composition
EP0832242A1 (en) * 1995-06-07 1998-04-01 Aesculaap B.V. Neutralizing conformational epitopes of chicken anemia virus
CA2231729A1 (en) * 1995-11-14 1997-05-22 William L. Ragland Efficient method of detecting an infectious agent in blood
BR9811163A (pt) 1997-08-12 2000-07-25 Leadd Bv Processos para determinar a capacidade de transformação de um possìvel agente transformador, a predisposição de uma célula em tornar-se uma célula de tumor e de um indivìduo a tipos hereditários de câncer, e uma mutação de gene apresentando atividade oncogênica e/ou transformadora em uma célula, uso de um ácido nucleico codificando apoptina ou um seu fragmento ou derivado funcional, e, kit de teste diagnóstico
US6287856B1 (en) * 1998-03-13 2001-09-11 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Vaccines against circovirus infections
JP2003510030A (ja) * 1999-09-02 2003-03-18 レアト ベー．フェー． アポプチン関連タンパク質
AU784723B2 (en) * 1999-12-10 2006-06-01 Leadd B.V. Apoptin-associating protein
US6593134B1 (en) 2000-03-10 2003-07-15 Cornell Research Foundation, Inc. Method of propagating chicken infectious anemia virus
HU230236B1 (hu) * 2000-07-10 2015-10-28 Uni-Charm Corporation Takarítóeszköz
EP1199363A1 (en) * 2000-10-20 2002-04-24 Leadd B.V. Phosphorylation modifications of apoptin
EP1436001A4 (en) * 2001-09-05 2006-01-11 Biomune VACCINE AGAINST INFECTIOUS CHICKEN ANEMIA VIRUS MANUFACTURED FROM A CELL LINE
US7566548B2 (en) * 2004-08-13 2009-07-28 University Of Massachusetts Methods for identifying therapeutic agents and for treating disease
CN102636646A (zh) * 2012-05-15 2012-08-15 扬州大学 快速检测禽白血病抗原的试纸条及其制备方法

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB2042888B (en) 1979-03-05 1983-09-28 Teijin Ltd Preparation for administration to the mucosa of the oral or nasal cavity
JPS6034925B2 (ja) 1979-07-31 1985-08-12 帝人株式会社 持続性鼻腔用製剤およびその製造法
JPS6032714A (ja) 1983-08-01 1985-02-19 Teijin Ltd 鼻腔粘膜に適用するための安定化された粉末状薬学的組成物
EP0188040B1 (en) 1985-01-11 1991-08-14 Abbott Laboratories Limited Slow release solid preparation
US4683195A (en) * 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US5059587A (en) 1987-08-03 1991-10-22 Toyo Jozo Company, Ltd. Physiologically active peptide composition for nasal administration
GB8723846D0 (en) 1987-10-10 1987-11-11 Danbiosyst Ltd Bioadhesive microsphere drug delivery system
US5079005A (en) 1988-06-17 1992-01-07 Gupta Kashmiri L Time release protein
WO1990002802A2 (en) * 1988-09-13 1990-03-22 Institute For Animal Health Limited Viral nucleotide sequences
GB2237510B (en) 1989-11-04 1993-09-15 Danbiosyst Uk Small particle drug compositions for nasal administration
US5271961A (en) 1989-11-06 1993-12-21 Alkermes Controlled Therapeutics, Inc. Method for producing protein microspheres
ZA918426B (en) 1990-10-31 1992-12-30 Akzo Nv Chicken anemia virus vaccine and diagnostic

Also Published As

Publication number Publication date
AU651999B2 (en) 1994-08-11
GR3033173T3 (en) 2000-08-31
IL99435A0 (en) 1992-08-18
ATE188739T1 (de) 2000-01-15
NL9002008A (nl) 1992-04-01
EP0548234B1 (en) 2000-01-12
IL99435A (en) 2006-10-31
US20020103336A1 (en) 2002-08-01
MX9101042A (es) 1992-08-10
US6509446B2 (en) 2003-01-21
US6238669B1 (en) 2001-05-29
EP0548234A1 (en) 1993-06-30
EP0905246A1 (en) 1999-03-31
DE69131903D1 (de) 2000-02-17
ES2144399T3 (es) 2000-06-16
US5958424A (en) 1999-09-28
JP2846116B2 (ja) 1999-01-13
US5491073A (en) 1996-02-13
WO1992004446A1 (en) 1992-03-19
UA48936C2 (uk) 2002-09-16
DK0548234T3 (da) 2000-06-19
HU9300716D0 (en) 1993-06-28
SI9111508B (en) 2001-12-31
SI9111508A (sl) 1998-10-31
ZA917065B (en) 1992-05-27
HRP940668B1 (en) 2000-10-31
HRP940668A2 (en) 1997-12-31
US6319693B1 (en) 2001-11-20
YU150891A (sh) 1995-10-24
RU2146292C1 (ru) 2000-03-10
JPH06504195A (ja) 1994-05-19
CA2091181C (en) 2006-02-21
YU49095B (sh) 2003-12-31
US5932476A (en) 1999-08-03
CA2091181A1 (en) 1992-03-13
DE69131903T2 (de) 2000-07-20
AU8658091A (en) 1992-03-30
HUT65974A (en) 1994-08-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Noteborn et al. Characterization of cloned chicken anemia virus DNA that contains all elements for the infectious replication cycle
HU220102B (hu) Csirkeanémiavírus-DNS, klónozása és alkalmazásai
TWI221774B (en) Porcine circovirus and parvovirus vaccine
Kato et al. Gene organization of chicken anemia virus
US5069901A (en) Preparation of a recombinant subunit vaccine against pseudorabies infection
Noteborn et al. Detection of chicken anaemia virus by DNA hybridization and polymerase chain reaction
JPH05292976A (ja) マレック病ウイルスワクチン
Liu et al. Molecular characterisation of very virulent infectious bursal disease viruses in Taiwan
AU2002315560B2 (en) Attenuated circovirus
Spackman et al. Comparison of a putative second serotype of chicken infectious anemia virus with a prototypical isolate II. Antigenic and physicochemical characteristics
Scott et al. Characterisation of a chicken anaemia virus variant population that resists neutralisation with a group-specific monoclonal antibody
KR0183368B1 (ko) 페스트바이러스 뉴클레오티드 서열 및 폴리펩티드
US20060073160A1 (en) Cloning of chicken anemia virus DNA
US6593134B1 (en) Method of propagating chicken infectious anemia virus
WO1996003507A1 (en) Method of isolating attenuated virus and vaccine thereof
JPH06141853A (ja) 組換え鶏伝染性喉頭気管炎ウイルス及びその製法
Kafle Pandey viruses that have the potential to alter the pathogenicity of wild type Marek’s disease virus. Masters (Research) thesis, James Cook University.

Legal Events

Date Code Title Description
DGB9 Succession in title of applicant

Owner name: LEADD B. V., NL

MM4A Lapse of definitive patent protection due to non-payment of fees