KR0183368B1 - 페스트바이러스 뉴클레오티드 서열 및 폴리펩티드 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 미생물의 감염에 대하여 피검자, 특히 기금류를 보호하기 위한 방법에 관한 것으로서, 감염과 연관된 항원을 암호하는 뉴클레오티드 서열 및 종결 전달 뉴클레오티드 서열을 함께 사용하는 과정을 포함한다. 감염성 유기체에 내성을 나타내는 유전자 전달 동물을 생성하는 방법은 감염에 관련된 뉴클레오티드 서열을 동물의 게놈내로 삽입시키는 단계를 포함한다.
상기 방법은 호그 콜레라(스와인 피버)와 같은 페스트 바이러스 감염을 방어하는데 특히 유용하다. 본 발명은 왁찐을 생성하는데 유용하며 진단을 실시할 수 있는 뉴클레오티드 서열 및 그것의 벡터 구조물 및 폴리펩티드도 제공하는 것이다. 진단 방법은 감염된 동물과 왁찐 투여된 동물이 다르게 나타나도록 주어져야 한다.
Description
제1도는 브레스시아 균주의 돼지 콜레라 바이러스 RNA에 대한 DNA 사본의 완전한 뉴클레오티드 서열.
뉴클레오티드 361∼363에 의해 암호화된 메티오닌 잔기는 이 서열에서 뉴클레오티드 361∼12054로 전개되는 오픈 리딩 프레임의 첫 번째 아미노산이다.
밑줄친 부분은 토끼에 있어서 펩티드 항혈청(전술함)을 제조하기 위해 사용된 합성 펩티드(18 량체) 1 내지 3의 서열을 나타낸다.
화살표시(↑)는 아미노산 위치 691의 Leu, 위치 1031의 Phe, 위치 1063의 Leu 및 위치 1148의 Asp를 나타낸다(제4도 참고).
제2도는 펩티드 1 내지 3(참조: 제1도)에 대해 제조된 토끼 항혈청의 웨스턴 블로트 분석.
상기 블로트는 콘카나발린-A, 모노클로날 항체 8(Wensvoort(1989), 상기 참조); 펩티드 1 내지 3에 대한 항혈청(좌에서 우)을 사용하여 분석했다.
이중선 gp54와 gp51은 HCV 균주 브레스시아의 E1 당단백질 단편을 형성하며; gp31의 특성은 아직 규명되지 않았다.
제3도는 제한효소 AccI, EcoRI, EcoRV 및 NaeI에 대하여 제1도에 제시된 서열의 뉴클레오티드 1-4440의 지도. 제한 효소가 인지하는 인식 위치의 첫 번째 뉴클레오티드의 서열(제1도)의 위치를 표시하였다.
상기 서열에서 E1 제한 단편 M203(NaeI-EcoRI), M204(NaeI-AccI) 및 M205(NaeI-EcoRV)의 위치는 밑줄로 나타내었다. 이들 단편을 pHB델타2.4에 서브클로닝하였다(참조 : 제4도).
제4도는 HCV-E1과 pHB델타2.4의 재조합체의 구성.
pHB델타2.4의 제조는 Quint 등에의해 제시되었다[참조 : J. Gen. Virol. 68, 523-534(1987)]. 삼각형은 pHB델타2.4의 특정한 짧은 부분에서 약 2.05kb가 결실되었음을 나타내고 있다(Van Zijl, 공개됨). BamHI 위치는 B로 표시했다. gX의 서열은 Rea 등에 의해 제시되었으며[참조 : J. Virol. 54, 21-29(1985)], gp50의 서열은 Petrovskis 등에 의해 제시되었으며[참조 : J. Virol. 59, 216-223(1986)] 및 gp63의 서열도 Petrovskis 등에 의해서 제시되었다[참조 : J. Virol. 60, 185-193(1986)]. 재조합체는 pHB델타2.4로부터 제한 단편 BalI-NdeI의 결실에 의해 구성되었다. 상기 제한 단편은 gX[참조 : Rea 등, 전술함]의 암호화 부위(1380 뉴클레오티드) 대부분을 포함하였다. NdeI 부위는 클리나우 폴리머라제로 충전하고, 제3도에 나타낸 E1 서열 M203, M204 및 M205를 pHB델타2.4에 삽입했다.
모든 E1 서열은 5'단부에 GG로 시작되는 평활 말단(NaeI)을 보유하고 있다. 이 말단은 pHB델타2.4의 BalI 분해 이후 산출된 평활 말단에 직접 결찰시켰다. 5'단부에서의 융합은 모든 pHB델타2.4-E1 구성물의 결찰 부위에서 Gly 코돈을 산출하였다. 이 Gly의 하류에 위치한 Leu 코돈은 HCV 서열에서 아미노산 번호 691을 암호화하였다(참조 : 제1도).
특정한 올리고뉴클레오티드 링커를 사용하여 상기 구성물의 3'단부에 종결코돈을 삽입했다. 구성물 M203에서 종결 코돈의 바로 상류에 위치한 코돈은 HCV 서열(제1도)에서 아미노산 1031을 암호화한다. 구성물 M204 및 M205에 있어서, 상기 코돈들은 각각 아미노산 1063과 1148을 암호화한다(참조 : 제1도).
5'과 3'단부에 있는 E1 삽입물을 따라 측부에 배치된 gX 서열의 개시점은 화살표로 나타냇다. 상기 구성물의 3'단부에 있는 종결 코돈 및 gX 개시점까지의 서열은 사용된 올리고뉴클레오티드 링커로부터 유도한 것이다.
분자 클로닝 방법은 Maniatis 등(상기 참조, 1982)에 의해 기술된 바와 같이 수행하였다.
제5도는 중첩 서브게놈 PRV 단편의 슈도라비에스 재조합 바이러스(PRV)의 재생[참조 : Van Zijl 등, J.Virol. 62, 2191-2195(1988)].
pMZ66은 E1 단편 M203을 포함하고, pMZ65는 E1 단편 M204를 포함하며, pMZ63은 E1 단편 M205를 포함하였다.
PRV 균주 NIA-3의 물리적 지도(참조 : 5a) 상에서 형질감염된 클론의 위치는 수직 막대(참조 : 5b)로 나타냈다.
a도는 NIA-3의 물리적 지도[참조 : Quint 등, J. Gen. Virol. 68, 523-534(1987)]. 상기 게놈은 역위된 반복부(□로 표시됨) 내의 특정한 짧은 부위와 특정한 긴 부위로 나누어질 수 있는 선형 이본쇄 DNA 분자로 구성되었다. BamHI, HindIII 및 KpnI의 위치를 나타냈다.
b도는 5개의 중첩 클론 시리즈
코즈미드 클론 c-179, c-1 및 c-443은 Van Zijl 등에 의해 기술되었다(상기참조). 클론 pMZ64는 클라즈미드 벡터내에 균주 783의 BglII B 단편[참조 : Moormann 등, Abstract 12th Int. Herpes Virus Workshop, p255(1987)]을 포함하였다. 균주 783(pMZ64)의 TK유전자는 19 염기쌍을 결실시키므로써 불활성화시켰다(Moormann 등, 상기 참조). pMZ64에서 이 결실 위치는 삼각형(△)으로 나타냈다. 클론 pMZ63/65 및 66의 구성은 제4도에 나타냈다. PRV-E1 재조합체의 재생은 Van Zijl 등에 의해 기술된 바와 같이 실시했다(상기 참조). 삽입된 E1 부위(제3도 및 제4도)에 따라 재조합체 PRV-E1 균주는 PRV-M203, PRV-M204 및 PRV-M205로 칭하였다.
PRV-M206의 구성은 균주 PRV-M203 내지 M205의 구성과 동일하게 실시하였으며; 따라서 균주 PRV-M206은 상기 균주들과 동일하나, HCV 특이성 E1 서열은 없다.
제6도는 세포 배양물 중에서의 E1 단백질의 형질발현.
E1-특이성 MAb의 혼합물에 의해 M203-, M204-, M205-, 및 M206-감염된 세포로된 상청액(배지)과 용해물의 면역침전물을 나타내는 SDS-폴리아크릴아미드 겔의 자동 방사선 사진. HCV-감염된 세포의 용해물로부터 침전된 야생형 E1(분자량 51 내지 54kD)을 동시에 실험했다. 31-kD 당단백질은 항상 E1과 함께 침전되었다.
본 발명은 감염, 구체적으로 페스티바이러스의 감염에 대한 예방 및 진단 방법에 관한 것이다.
돼지에게 나타나는 돼지 콜레라 바이러스(또는 스와인 피버 바이러스)와, 다른 2가지 바이러스, 소에게 나타나는 소 바이러스성 설사 바이러스(BVDV) 및 양에게 나타나는 국경병 바이러스(BDV)는 모두 같은 페스티바이러스 속(genus)에 속하는 것이며, 이 페스티바이러스 속은 토가비리대(Togaviridae)과에 속한다[참조 : Westaway 등, Intervirology, 24, 125-139, 1985]. 상기 바이러스는 (+) 스트랜드, 즉 감염성 RNA 게놈을 보유한다. 상기 3종의 바이러스는 구조 및 항원성이 서로 밀접하게 연관되어 있어, 일반적으로 상기 3종의 바이러스 중 하나에 대하여 생성된 항혈청은 나머지 2종의 바이러스와도 반응할 수 있다. BVDV 및 BDV는 서로 매우 유사하므로 실제로는 하나의 바이러스 형태로서 간주된다[참조 : Terpstra, in: Progress in Veterinary Microbiology and Immunology, R. Pandey 편집, 1권, pp. 175-198(1985)]. 상기 3종의 바이러스 각각은 자신의 주된 숙주를 갖고 있지만, BVDV 및 BDV는 다른 반추동물을 감염시킬 수 있으며 더불어 돼지도 감염시킬 수 있다. 상기 3종의 바이러스의 공통된 특성은 이들이 선천성 감염을 야기시킬 수 있다는 것이다[참조 : Van Oirschot, Veterinary Microbiology 9, 113-120(1983)]. BVDV에 속하는 한 균주의 완전한 뉴클레오티드 서열은 유럽 특허 출원 제208,672호에 기재되어 있으며, 돼지 콜레라 바이러스 및 BDV의 완전한 뉴클레오티드 서열은 아직 공지되지 않았다.
패스티바이러스 감염에 대한 예방 접종은 일반적으로 약독화된 생바이러스 균주를 이용하여 실시된다. 따라서, 돼지 콜레라에 대한 예방 접종은 돼지 콜레라 바이러스(HCV)의 특정 균주, 예를 들어, 소위 차이니즈(Chinese) 균주를 이용하여 수행하는 것이 일반적이다. 그러한 예방 접종이 돼지 콜레라에 대하여 일반적으로 충분한 예방을 제공하더라도, 백신 바이러스 균주가 증식되어 종종 문제를 일으킨다. 또, 차이니즈 균주 및 기타 백신 균주는 예방 접종후 수태한 돼지의 태반을 통과할 수 있으므로 태아가 백신 바이러스에 의해 감염될 수 있다. 결과적으로, 태아는 죽거나 생후에 장기간의 병을 앓을 수 있다[참조 : Overby 및 Eskildsen, CEC Report Hog Cholera/Classical 및 African Swine Fever EUR 5904, 420-429(1976)]. 차이니즈 백신 바이러스는 예방 접종후 15일까지는 편도선에서 발견되었으며[참조 : Terpstra, Tijdschrift voor Diergeneeskunde, 103, 678-684(1978)], 돼지에게는 좀 더 오랫동안 지속되었다. 이와 같이 예방 접종된 동물을 진단한다면 예방접종된 바이러스와 야생형 바이러스(field virus)를 구별하기가 곤란하며, 따라서 추가 진단 시험을 거쳐야만 구분할 수 있게 된다.
결론적으로, 차이니즈 균주 및 기타 HCV 백신 바이러스에 대하여 생성된 항체는 야생형 바이러스에 대하여 생성된 항체와 구별할 수 없다. 따라서, 돼지 집단에 있어서, 혈청학적 선별 방법을 통하여 돼지 콜레라에 대한 예방 접종과 동시에 HCV 야생 감염을 검출하는 것은 불가능하다.
소 및 양에 있어서도 BVDV 및 BDV 감염을 예방하기 위한 각각의 공지된 방법은 전술한 것에 상응하는 결점을 갖고 있다.
그러므로, 페스티바이러스 감염, 구체적으로 돼지 콜레라의 예방 및 진단에 사용될 수 있는 개량되고 더 간단한 방법이 요구되고 있다.
따라서, 본 발명자들은 독성 HCV 균주, 브레스시아(Brescia)의 완전한 RNA 뉴클레오티드 서열을 규명하였다.
또한, 감염 예방을 위한 기본 물질로서, 특히 감염성 유기체의 구조 단백질 중 특정 부분을 암호화하는 서열이 적합하다는 것을 확인하였다.
따라서, 본 발명은 상기 뉴클레오티드 서열, 구체적으로 상기 서열 중 감염을 예방하기에 적합한 상기 서열의 단편에 관한 것이다.
본 명세서에서는 페스티바이러스 감염, 구체적으로 돼지 콜레라와 관련하여 본 발명을 설명하고 있지만, 본 발명은 일반적인 감염보다 명확히 말하면 면역원성을 생성하는 감염에 대한 예방 및 진단도 포함하고 있다.
HCV의 뉴클레오티드 서열은 제1도에 도시하고 있다. 도시한 서열은 브레스시아 균주, 클론 제111호(CDI, Lelystad)의 서열이다. 돼지 콜레라 바이러스 균주는 혈청학적 상동성이 매우 높으며, 따라서 교차-중화 시험에 의하여 균주간 구별은 할 수 없으나, BVDV(소 바이러스성 설사 바이러스) 및 BDV(국경병 바이러스)와는 구별된다[참조 : Wensvoort 등, Vet. Microbiol., 20:291-306(1989); Thesis, University of Utrecht(1989), Ch 3]. 또한, 돼지 콜레라 균주는 엔벨로프 단백질 E1에 대한 일군의 모노클로날 항체에 의해 일정하게 인식된다. 이 모노클로날 항체군은 BVDV 또는 BDV 균주를 인식하지는 못한다[ 참조: Wensvoort 등, Vet. Microbiol., 21: 9-20(1989); Thesis Ch 4(1989)]. HCV 엔벨로프 단백질 E1에 존재하는 보존적 에피토프는 조사한 94개의 HCV 균주 모두에서 발견되었다[참조 : Wensvoort, Thesis 1989, pp 47 및 78]. 따라서, 제1도에 도시한 바와 약간 다른 서열을 보유하는 브레스시아 이외의 HCV 균주의 서열도 본질적으로 본 발명에 속한다. 이하 본 명세서에서, 숫자는 HCV 균주 브레스시아의 게놈에 관한 것이며; 다른 균주들에 있어서는 그 위치가 약간 변할 수도 있으나, 이러한 차이는 본 발명에 있어서 별로 중요하지 않다. 도시한 서열은 11,694 뉴클레오티드의 오픈 리딩 프레임을 포함하며 이 프레임의 양말단 중 어느 한 쪽에는 비암호화 부위가 존재한다. 이 비암호화 부위는 5'단부에 존재하는 경우에는 길이가 360개인 뉴클레오티드이며, 3'단부에서는 TGA 종결신호에서부터 시작하는 229개의 뉴클레오티드이다. 따라서, 오픈 리딩프레임은 (5') 361-12054(3')번이 된다. 뉴클레오티드 361로부터 3804의 부분은 구조 단백질을 암호화한다. 이러한 구조 단백질은 캡시드 단백질(약 361 내지 1162 사이에 위치한 부위에 의해 암호화 됨), 소위 E2라 부르는 엔벨로프 단백질(뉴클레오티드 1162 내지 2070에 의해 암호화 됨), E3라 부르는, 아직 자세히 규명되지 않은 단백질(뉴클레오티드 2071 내지 2430에 의해 암호화 됨) 및 E1이라 칭하는 엔벨로프 단백질(뉴클레오티드 2431 내지 3804에 의해 암호화 됨)을 포함한다. 따라서, E2 및 E1 이라 부르는 엔벨로프 단백질은 각각 그 위치가 제1도의 아미노산 서열에서 약 267 내지 570 및 691 내지 1148이다.
특히, E1은 페스티바이러스 감염을 예방할 수 있는 항체를 생성하는데 효과적인 것으로 나타난다. E1 서열의 면역우성 준부위는 691(Leu) 내지 1030 (Glu)의 부위내에 존재하는 한편, 약 1031(Phe) 내지 1148(Asp)의 소수성 부위는 예방 작용에 필수적인 E1 서열의 또 다른 준부위인 것의로 나타난다. 상기 소수성 부위는 상기 펩티드를 세포막에 고착시키는 3개의 경막 부위(transmembrane region : TMR)를 포함한다. 펩티드 내에 상기한 바와 같은 경막 부위가 하나 이상 존재하는 것은 페스티바이러스에 대한 높은 수준의 예방성을 얻는데 매우 중요하다. 하나의 TMR은 1031(Phe) 내지 1063(Leu) 사이에 위치하며 예방에 사용되는 서열내에 존재함이 바람직하다. 또한, E1의 한 부분에만 상응하며 경막 부위를 포함하는 폴리펩티드도 감염 예방에 적합하다.
감염 예방에 중요한 다른 서열은 약 1012(Tyr)에서 출발하여 1031(Phe)에서 종결되는, 극성으로 하전된 부위이다. E1에서와 마찬가지로, 상기 서열은 1031(Phe) 내지 1063(Leu)에 의해 암호화되는 경막 부위와 함께 예방에 이용하는 서열내에 존재하는 것이 가장 바람직하다. 1012(Tyr) 내지 1063(Leu)에 의해 암호화되는 서열은 소위 종결 전달 부위(stop transfer region)라 칭한다(조면 소포체의 막 내에 단백질을 고착시킨다). 종결 전달 서열은 20 내지 25 잔기의 소수성 영역(즉, TMR) 및 10 내지 15 잔기의 극성 부위(즉, Tyr 1012 내지 Phe 1031)로 구성된다[참조 : E. Perara 및 V.R. Lingappa, R.C. Das 및 P.W. Robbins 편집, pp 3-47, 아카데미 출판사, 뉴욕, (1988)]. 또, 상기 서열은 페스티바이러스 RNA에 의해 암호화되는 다른 항원(즉, E2, E3, p80) 또는 이종 항원[즉, 박테리아 독소, 코로나바이러스의 페플로머 항원(즉, TGE), 인플루엔자 바이러스(즉, 돼지 인플루엔자 바이러스 등)의 헤마글루티닌 등]과 결합하여 이러한 항원의 면역원성을 증가시킬 수 있다(발현 체계와 무관함). 또한, 극성 부위와 떨어져 있는 TMR, 또는 TMR로부터 떨어져 있는 극성 부위를 이용할 수도 있다. 또한 상기 TMR 및 극성 부위는 이종 극성 부위 및 TMR과 각각 병용할 수 있다. 종결 전달 부위를 이용하는 것은 페스티바이러스로부터 유래한 부위에 대해서만 제한 사용되는 것은 아니다. 즉, 페스티바이러스 항원 뿐만 아니라 다른 항원의 면역원성도, 항원을 암호화하는 서열이 이종 종결 전달 부위 또는 그것의 일부와 결합되는 경우 향상될 수 있다.
본 명세서에서 사용하는 폴리펩티드란 용어는 그들의 길이에 제한없이 올리고펩티드 및 폴리펩티드를 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 상기 폴리펩티드는 때로는 글리코실화할 수 있으며, 기타 몇 가지 방법으로 변형시킬 수도 있다.
그러므로, 본 발명의 예방 작용을 수행하는데 중요한 뉴클레오티드 서열은 엔벨로프 단백질 E1 및 그것의 일부를 암호화하는 부위이며, 이는 종결 전달 서열을 포함한다. 따라서, 본 발명의 서열은 뉴클레오티드 서열(5') 1-3804(번호는 제1도에 따라 지정함)의 적어도 한 부분을 함유하는 것이 바람직하다. 상기 서열 중에서 2431 내지 3804 부분, 특히 2431 내지 3549 부분을 함유하는 것이 더욱 바람직하다. 본 발명에 있어서, 진단용으로 바람직한 다른 서열은 1162 내지 2430 서열 중의 적어도 한 부분을 포함한다. 이 부분들은 HCV에서만 정확한 것이며, BVDV 및 BDV에 있어서 그 위치는 다소 차이가 있으며, 하지만 일반적인 배열은 동일하다. 따라서, 상응하는 엔벨로프 단백질 및 그것의 일부 서열도 예방 및 진단에 특히 유용하다.
페스티바이러스 감염에 대한 예방 작용을 수행할 수 있는 구조 단백질 및 그것에 완전히 또는 일부 상응하는 폴리펩티드의 중요성은, HCV의 구조 단백질, 특히 E1을 암호화하는 cDNA 서열을 포함하는 재조합 바이러스를 접종한 돼지가 E1에 대한 항체를 생성하고, HCV에 대한 중화 항체를 형성하며, 독성 돼지 콜레라 바이러스에 의한 감염을 예방한다는 사실로부터 확인된다.
제1도에서 제시한 서열로부터 유래한 서열 또는 페스티바이러스 E1, E2, E3 또는 그것의 일부를 암호화하는 유전자 서열도 페스티바이러스에 의한 감염에 내성을 갖는 돌연변이(transgenic) 동물을 생성하는데 이용할 수 있다. 세포내 면역화[참조 : Baltimore, Nature, 335, 395-396(1988)]라고 부르는 이러한 형태의 동물 면역화는 여러 가지 형태로 실시할 수 있는데, 즉 제1도에 제시한 서열(또는 다른 페스티바이러스 서열)로부터 유래한 서열은 페스티바이러스 게놈의 형질발현 또는 복제를 방해하는 (안티센스)RNA로서 형질발현되며; 페스티바이러스 당단백질(E1, E2 및 E3)을 암호화하는 서열은 돌연변이에 의해 생물학적으로 불활성화되며, 이와 같이 형질발현된 돌연변이 유전자 생성물은 감염된 세포 중에서 정상적인 생성물과 경쟁함으로써 생존성 바이러스의 생성을 중단시키며; 또한, E1과 가능하다면 E2 및 E3과 같은 표면 당단백질은 돌연변이 동물내에서 형질발현되어 페스티바이러스의 세포 수용체에 결합함으로써 페스티바이러스의 감염을 예방한다. 닭에서, 이와 같이 형질발현된 표면 당단백질[ALV(조류 백혈증 바이러스)의 아군 A의 gp85]은 조류 백혈증 바이러스(아군 A)에 의한 감염에 내성을 부여하는 것으로 확인되었다[참조 : D.W. Salter 및 L.B. Crittenden, Theoretical and Applied Genetics, 77, 457-461(1989)].
본 발명은 상기 제시한 서열중 하나가 삽입된 재조합 RNA 및 DNA에 관한 것이며, 이러한 형태의 재조합 폴리뉴클레오티드는, 예를 들면 재조합 바이러스의 형태이다. 이러한 목적으로 사용하기에 적합한 캐리어 바이러스로는 슈도라비에스바이러스(PRV); 백시니아 바이러스, 아데노바이러스, 바쿨로바이러스, SV40, 레트로바이러스, B형 간혐 바이러스 및 이들의 유도체와 같은 기타 바이러스를 들 수 있다. 또한, 상기 바이러스 중의 하나에 의해 안정하게 형질전환 될 수 있는 세포; 상기 바이러스가 에피솜으로서 또는 용균적으로 보제하는 세포; 및 적합한 벡터에 의해 안정하게 형질전환 되어 구조 단백질, 특히 E1 단백질 또는 그것의 일부, 즉 원핵세포 또는 진핵세포 시스템 내에서 재조합 DNA를 통하여 때로 얻어지는 모든 서브유니트를 형질발현시키는 세포도 이용할 수 있다. 이러한 재조합 시스템은 페스티바이러스 감염, 특히 HCV 감염에 대한 백신 제조에 특히 적합하다. 그러므로, 본 발명은 재조합 바이러스 또는 다른 형태로 전술한 뉴클레오티드 서열을 함유하는 백신에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 페스티바이러스 서열의 전장 cDNA 사본 및/또는 이의 (+) 스트랜드 전사체를 기초로 하여 형성된 모든 백신에 관한 것이다. 이러한 백신은, 예를 들어 구조 단백질, 특히 HCV 엔벨로프 단백질 E1의 보존된 에피토프를 암호화하는 서열에 돌연변이를 형성할 수도 있다[참조 : Wensvoort, Thesis, pp. 47 내지 78(1989)]. 상기 방법으로, 야생형 바이러스로 감염된 동물과 예방 접종된 동물(백신 균주를 사용함)의 혈청학적 구별을 가능하게 하는 백신 균주를 얻을 수 있다. 또한, cDNA 사본의 돌연변이는 독성 및 면역원성의 마커를 나타낼 수 있으며, 독성이 덜하며, 면역원성이 더 양호한 백신 균주를 유도할 수 있다.
또한, 본 발명은 전술한 바와 같이 항원으로서 표면 단백질에 완전히 또는 부분적으로 상응하는 폴리펩티드를 함유하는 백신을 추가로 포함한다.
상기 폴리펩티드에 의해 생성되는 항체는 페스티바이러스 감염의 진단에 이용할 수 있으며, 이 또한 본 발명에 포함된다.
또한, 본 발명은 전술된 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 프로브(RNA 또는 DNA) 또는 항원 폴리펩티드 또는 항체를 사용하여 감염을 진단하는 방법 및 수단에 관한 것이며, 또한 이 수단을 필수 성분으로 함유하는 키트에 관한 것이다. 진단 목적으로는 상기 구조 부위 및 비-구조 부위내의 기타 서열 또한 중요하다.
본 발명에 의해 제공되는 특히 유용한 진단 방법에 의하면 본 발명에 따라 예방 접종된 동물과 감염된 동물, 특히 HCV로 감염된 동물간의 차이점을 혈청학적으로 구별하는 것이 가능해진다. 이러한 진단 방법에는 예방 항체를 생성하는 폴리펩티드 이외의 다른 제2의 폴리펩티드가 사용되어, 결국 감염된 동물의 혈청은 이 제2의 폴리펩티드에 대한 항체를 함유하는 반면, 예방 접종된 동물의 혈청은 상기 항체를 함유하지 않는 것으로 나타난다. 이러한 목적에 적합한 폴리펩티드는 E2 단백질 또는 그의 일부분이지만, 원칙적으로 페스티바이러스 게놈에 의해 암호화된 기타 폴리펩티드도 또한 적합하다.
이하 바이러스의 배양 방법, RNA의 분리 및 클로닝 방법, 그 서열의 결정 방법 및 펩티드와 항혈청의 제조방법을 설명한다.
[세포 및 바이러스]
SK-6 세포[참조 : Kasza 등, Research Vet. Sc. 13 46-51(1979)]를 5% 태내 송아지 혈청(FBS)을 함유한 이글의 기본 배지중에서 성장시켰다. FBS는 감마 방사선으로 조사시킨 후, 이 혈청을 함유한 배지중에서 태내 송아지 상피세포(FBE)가 지속적으로 성장하는지에 의해 BVDV의 존재 여부를 철저히 조사했다. BVDV 존재 여부는 상기 세포들을 감응성 면역페록시다제 단층 분석법(IPMA)으로 검측하여 시험하였다[참조 : Wensvoort 등, Vet. Microbiol. 12, 101-108(1986)]. 또한, FBS도 IPMA를 사용하여 표준 BVDV 저장액의 중화 지수를 측정함으로써 BVDV 항체에 대해 점검했다. 결과적으로, BVDV가 없고, BVDV 항체를 함유하고 있지 않거나, BVDV 항체 역가가 낮은 혈청만을 본 발명에 사용했다.
HCV 브레스시아 균주는 세포 병원성이 없는 것으로, 3배 종말점 희석법(threefold end point dilution)에 의해 생물학적으로 클로닝하였다. 3회의 증폭단계 후, 역가가 3.107TCID50/ml인 클로닝된 바이러스 저장액(Brescia, 클론 제111호)을 얻었다.
[HCV로부터 세포내 RNA의 분리]
175㎠병(눈클론)중의 SK-6 세포 단층을, 감염 다중도(MOI)가 10 TCID50/세포인 HCV를 이용하여 감염시켰다. 이를 37℃에서 1.5 시간 동안 배양한 후, 새로운 배지를 최종 부피가 40㎖가 되도록 첨가했다. 7 시간 후 액티노마이신 D를 최종 농도 1㎍/㎖로 첨가했다. 감염 24 시간 후, 세포를 빙냉한 PBS로 2회 세척했다. 세포를 빙냉한 용해 완충액[50 mM 트리스-HCI(pH 8.2), 0.14M NaCl, 2 mM MgCl2, 5 mM DTT, 0.5%(v/v) NP-40, 0.5% 나트륨 데옥시콜레이트 및 10 mM 바나딜 리보뉴클레오시드 복합체(뉴 잉글랜드 바이오랩스에서 시판)]중에 용해시켰다.
용해물을 원심분리(4℃, 5분, 4,000 rpm)하고, 상청액을 프로테이나제 K(250 ㎍/㎖, 최종농도)로 37℃에서 30분 동안 처리하고, 페놀, 클로로포름 및 이소아밀 알코올(49:49:2)로 2회 추출하고, 클로로포름 및 이소아밀 알콜(24:1)로 1회 추출했다. 에탄올로 침전시켜 세포내 RNA를 얻은 후, 5.7 M CsCl 쿠션을 이용해 정제하고, 50% 포름아미드를 함유하는 5 내지 29%(w/v)의 변성 등속도 수크로즈 구배를 통해 HCV-특이적 RNA를 농축시켰다. 이 수크로즈 구배물을 5℃에서 베크만 SW40 Ti 로타 중에서 16시간 동안 200,000×g로 원심분리했다[참조 : Moormann과 Hulst, Virus Res. 11, 281-291(1988)].
[HCV로부터 바이러스 RNA의 분리]
브레스시아 바이러스는 주로 Moormann과 Hulst(상기 참조)에 의해 기술된 방법으로 정제하였다. SK-6 세포의 융합성 단층을 0.5의 MOI로 감염시키고, 배지 200㎖ 중에서 37℃하에 48시간 동안 성장시켰다. 이어서, 세포들을 50㎖의 배지중에 현탁시키고, 2회 동결건조시켰다. 세포 현탁액이 투명하게 된 후, 상청액을 0.5 M NaCl과 10%(m/v) 폴리에틸렌글리콜 6000(BDH)상에 첨가했다. 바이러스는 4℃, 6000×g에서 20분 동안 원심분리하여 펠릿화하고, TNE(20 mM 트리스-HCI(pH 7.2), 150 mM NaCl,1mM EDTA)중에 용해시킨 후, 30 내지 50% 글리세롤/(0 내지 50%)Na-K 타르트레이트 구배를 통해 정제하였다. 구배 분획들의 역가를 측정하고 IPMA를 사용하여 바이러스 존재 여부를 결정하였다. 사용에 적합한 분획들을 합하고, 4℃, 150,000×g에서 4시간 동안 원심분리하여 바이러스를 펠릿화하였다. 진술한 바와 같이, 이 펠릿을 빙냉한 용해 완충액과 프로테이나제 K로 처리하여 바이러스 RNA를 추출했다. 바이러스 RNA는 에탄올로 침전시켜 회수했다.
[HCV RNA의 클로닝]
농축된 세포내 HCV RNA(HCV-특이성 RNA 약 1.5㎍)를 10분 동안 실온에서 10 mM 메틸머큐리 히드록사이드와 함께 배양했다. 변성된 RNA 시료를 총 100㎕ 부피 중에 함유된 50 mM 트리스-HCI(pH 7.8), 10 mM MgCl2, 70 mM KCl, 0.5 mM dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP, 0.6 ㎕ 송아지 흉선 올리고뉴클레오티드 프라이머 pd(N)6(파마시아) 및 300 유니트의 멀로니 쥐 백혈병 바이러스 역전사효소(베데스다 리서치 레보레이토리즈)와 함께 42℃에서 배양했다. 1시간 후에 20 mM EDTA를 첨가한 후, 이어서 이 반응 혼합물을 페놀/클로로포름으로 추출하고, 세파덱스 G50 컬럼을 통해 통과시킨 후, 에탄올로 침전시켰다.
DNA 폴리머라제 I(뵈링거)와 RNase H(파마시아)를 사용하여 제2의 cDNA 가닥을 합성했다[참조 : Gubler와 Hoffman, Gene 25, 263-269(1983)].
이와 같이 얻어진 이본쇄 cDNA를 0.05mM 데옥시뉴클레오티드-트리포스페이트를 함유하는 반응 혼합물 중에서 T4 DNA 폴리머라제(파마시아)와 함께 배양하고, EcoRI 메틸라제(뉴 잉글랜드 바이오랩스)로 메틸화시키고, T4 DNA 리가제(파마시아)를 이용하여 cDNA의 평활 말단에 EcoRI 링커(뉴 잉글랜드 바이오랩스)를 연결시켰다. EcoRI(뉴 잉글랜드 바이오랩스)으로 분해 후, cDNA를 0.8% 아가로즈겔상에서 분리했다. 1kb 내지 4kb의 단편들을 전기용출시키고, pUC19의 EcoRI 위치내에 결찰시킨 후, 이를 이용하여 문헌[참조 : Hanahan, J. Mol. Biol., 166, 577-580(1983)]에 기술된 바와 같이 이.콜리 균주 JM 83을 형질전환시켰다[참조 : Vieira와 Messing, Gene 19, 259-269(1982)]. 콜로니 필터를32P-표지된-일본쇄 cDNA 프로브와 하이브리드화시켰다. 이 프로브는 중성 아가로즈 겔(Morrmann과 Hulst, 상기 참조) 상에서 분획화된 HCV RNA로부터 역전사시킨 것이다. 이 일본쇄 DNA 프로브는 사용전에 위장 감염된(mock-infected) SK-6 세포로부터 얻어진 세포질 RNA와 함께 항온 처리하였다.
HCV-cDNA 클론들간의 관계는 제한 효소 분석법 및 분해된 DNA의 서던블로트[참조 : Southern, J. Mol. Biol., 89, 503-517(1975)]와 니크-해독된 cDNA 프로브의 하이브리드화에 의해 결정하였다[참조 : Maniatis 등, Molecular cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, N.Y.(1982)].
상기 cDNA 라이브러리로부터 분리된 클론들은 HCV RNA의 90%를 나타냈다. 그러나 5'단부와 3'단부의 RNA 서열은 클로닝되지 않았다.
3'단부의 cDNA 클론을 얻기 위해, 바이러스 RNA 20㎍을 50 mM 트리스-HCl(pH 7.8), 2.5 mM MnCl2, 10 mM MgCl2, 250 mM NaCl, 5 mM DTT, 800 ㎍/㎖ BSA, 180 유니트의 RNasin(프로메가 바이오테크), 0.2 mM ATP, 4 μCi3H-ATP 및 2 유니트의 폴리머라제를 함유하는 반응혼합물 300㎕ 중에서 이.콜리 폴리A-폴리머라제(파마시아)를 사용하여 시험관 내에서 폴리아데닐화시켰다. 이 반응은 37℃에서 90 분간 지속시킨 후, 페놀로 추출함으로써 종료시켰다(상기 참고). 폴리A로 아데닐화된 RNA는 에탄올로 희수한 뒤, 올리고-dT(12-18)(파마시아)을 사용해 제1 cDA 가닥의 합성을 개시하였다. 5'단부의 cDNA 클론을 수득하기 위해, 뉴클레오티드 서열 308-347(제1도)에 대해 상보적인 합성 올리고뉴클레오티드를 합성하고, 이를 이용하여 주형 바이러스 RNA 상에서 제1 cDNA 가닥의 합성을 개시하였다.
5'과 3'단부로부터 얻은 cDNA의 제1 및 제2 가닥을 합성하기 위한 조건은 전술한 바와 같다.
이본쇄 cDNA를 T4 폴리머라제와 함께 항온 처리하고(상기 참조), 0.8% 아가로즈겔 상에서 분획화한 후, pGEM-4 블루(프로메가 바이오테크)의 SmaI 위치내로 결찰시켰다. 결찰된 DNA를 이용하여, 이.콜리 OH5-α[참조 : Hanahan에 의해 DNA Cloning Vol. I; A Practical Approach. Chapter 6, pp 109-135(1985)]를 형질전환시켰다.
[cDNA 클론의 서열결정]
서열 분석은 적합한 제한 단편들을 M13mp18 및 mp19[참조 : Yanisch-Perron 등, Gene 33, 103-119(1985)]내로 서브클로닝한 후, 광범위하게 실시했다. 서열의 나머지 부분은 T7 폴리머라제(파마시아)를 기본으로 하는 서열결정용 키트를 사용하여 플라스미드 클론들의 이본쇄 DNA를 직접 서열 분석함으로써 결정했다. 15 뉴클레오티드 길이의 보편적인 M13 프라이머(뵈링거) 외에도, 사이클론 DNA 합성기(뉴 브런스위크 사이언티픽) 상에서 제조된 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 서열결정하였다. 서브클로닝된 HCV-특이성 제한 단편들의 뉴클레오티드 서열은 클리나우 DNA 폴리머라제(파마시아) 또는 역전사효소(라이프 사이언스) 및 α-35S-dATP(아메르샴)를 이용하는 디데옥시 쇄 종결법[참조 : Sanger 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 54-63, 54-67(1977)]을 이용하여 결정하였다[Sanger 등, 상기 참조; Smith, Method in Enzymology, Vol 65, pp. 560-580, Academic Press, New York에 기술된 프라이밍된 합성에 의한 DNA 서열분석].
서열결정 반응은 8M 우레아를 함유하는 6% 아크릴아미드겔 상에서 분석했다. 데이터는 PCG에 서열 분석 프로그램(스위스연방, 제네바, 제노피트)을 사용한 올리베티의 M24 컴퓨터 및 DNA 스트라이더[참조 : Marck, Nucl. Acids Res. 16, 1829-1836(1988)]를 이용하는 애플의 매퀸토시 SE 컴퓨터를 이용하여 분석했다.
[합성 펩티드 제조 및 토끼에서 항펩티드 혈청의 제조]
고체상 및 BOP[벤조트리아졸-1-일옥시-트리스(디메틸아미노)포스포늄 헥사플루오로포스페이트] 시약을 이용하여 공지된 방법으로 펩티드를 합성했다[참조 : Fournier 등, Int. J. Peptide Protein Res. 31, 86-97(1988)].
펩티드에 대한 항혈청은 프로인트 완전 보조제 중에 함유된 키홀 삿갓조개헤모시아닌(KLH) 결합된 펩티드(KLH : 펩티드 = 1 : 1) 1mg을 이용하여 토끼를 면역화함으로써 제조했다. 토끼는 면역화 70일후 체혈했다.
[웨스턴 블로트를 이용하는 항펩티드 혈청의 분석]
HCV 브레스시아의 엔벨로프 단백질 E1은 면역친화성을 이용해 정제하고, 나트륨 도데실설페이트/폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 분획화한 뒤, Wensvoort[참조 논문 : Epitopes on Structural Proteins of Swine Feber(Hog Cholera) Virus. University of Utrecht, pp 71-85]에 의해 설명된 바와 같이 니트로셀롤로오즈 페이퍼(블로트)로 전이시켰다. 이 블로트를 PBS + 0.85M NaCl + 0.05% 트윈 80 및 5% 말 혈청(블로팅 완충액) 내에서 37℃하에 30분 동안 침지한 후, 블로팅 완충액으로 1:10으로 희석한 항펩티드 혈청과 37℃에서 60분 동안 항온처리하였다. PBS + 0.05% 트윈 80으로 4회 세척한 후 결합된 토끼 면역글로불린은 토끼 IgG와 IgM에 대해 유도된 HRPO 접합체와 함께 37℃에서 60분 동안 2차 항온처리에 의해 검출했다. 그후, 상기 블로트를 상기한 바와 같이 세척하고, 상기 Wensvoort(상기 참조)에 의해 설명된 방법대로 기질 용액과 함께 항온처리했다. 양성 대조용으로, E1 블로트를 콘카나발린-A 및 모노클로날 항체-HRPO 접합체 8(Wensvoort, 상기 참조)로 염색했다.
[세포 배양물 중에서 E1의 형질발현]
3×106개의 SK-6 세포 단층을 다중감염도 10으로 HCV, M203, M204, M205 또는 M206을 이용해 감염시켰다. 세포들은 감염 6시간 후부터 18시간까지 글루타민, 항생제, 5% 투석된 태내 송아지 혈청 및 100 μCi의 [35S] 시스테인/㎖가 보충된 시스테인이 없는 이글 기본 배지 2㎖ 중에서 항온처리함으로써35S로 표지했다. 감염후 18 시간째에 세포와 상청액을 따로 수거했다. 세포들은 1㎖의 PBS-TDS[인산염 완충 처리된 염수중의 1%(v/v) 트리톤 X-100, 0.5%(w/v)Na-데옥시콜레이트, 0.1%(w/v) Na-도데실-설페이트]중에 용해시켰다. 용해물은 초음파 처리하고, 80,000g에서 10분 동안 원심분리하여 투명하게 하였다. 상청액은 80,000g에서 2시간 동안 원심분리하여 투명하게 하였다. 용해물 샘플 100㎕ 또는 상청액 샘플 200㎕를 E1-특이성 MAb 3, MAb 6 및 MAb 8[참조 : Wensvoort, J. Gen. Virol. 70, 2865(1989)]의 1:1:1 혼합물 2㎕와 함께 4℃에서 16시간 동안 항온처리했다. 그후, 이 혼합물은 단백질 A 세파로즈 1㎎과 함께 4℃에서 2시간 동안 항온처리하고, 1000g에서 1분 동안 원심분리했다. 침전된 단백질은 PBS-TDS로 4회 세척하고, 샘플 완충액[60 mM 트리스-HCI(pH 6.8), 2% Na-도데실 설페이트, 10% 글리세롤, 5% 2-머캅토에탄올, 0.01% 브로모페놀 블루]중에서 5분 동안 100℃에서 배양하고, 10% SDS-폴리아크릴아미드 겔상에서 전기 영동으로 분석했다.
하기 실험은 3개의 PRV 구성물 M203, M204 및 M205 중 하나 또는 PRV 구성물 M206을 예방 접종한 돼지를 대상으로 한 테스트 결과로서, 슈도라비에스 바이러스와 돼지 코렐라 바이러스에 대한 중화 항체를 형성하고 HCV-E1 특이성 항체를 형성하는지 여부를 결정하기 위해 수행했다.
또한, 상기 3개의 구성물 PRV-M203, PRV-M204 및 PRV-M205 중 하나를 사용하는 돼지의 예방 접종이 돼지 콜레라 카이러스에 의한 독성 감염에 대해 이들 돼지의 보호 여부를 결정했다.
사용된 테스트 동물은 HCV와 BVDV에 대한 항체가 없는 10주된 SPF 돼지로 구성된 4개의 그룹(A-D)이었다. 각 테스트 그룹은 4마리의 돼지를 포함하였다.
0일째, A그룹의 돼지 4마리에게는 107.3PFU의 PRV-M203을 근육내로 예방 접종하였으며(참조 : 제4도), B 그룹에서는 107.3PFU의 PRV-M204를, C 그룹에게는 107.3PFU의 PRV-M205를, D그룹에게는 107.3PFU의 PRV-M206을 예방 접종했다.
상기 예방 접종은 28일째 반복했으며, 42일째에는 4개 그룹의 모든 돼지를 독성 HCV 브레스시아 균주 456610의 100 LD50투여량으로 비강내 감염시켰다[참조 : Terpstra 및 Wensvoort, Vet. Microbiol. 16, 123-128(1988)].
혈청 혈액 샘플을 -3, 28, 42 및 63일에 채혈했다. 이 혈청에 대해 혈청 중화 테스트(SNT-PRV)[참조 : De Leeuw 등, Vet. Quarterly 4, 49-56(1982)]를 수행하여 PRV에 대한 중화 항체를 검출했다. 상기 혈청에 대해 중화 퍼옥시다제-결합 분석(NPLA)[참조 : Terpstra 등, Vet. Microbiol. 9, 113-120(1984)]을 수행하여 HCV에 대한 중화 항체를 검출했다. 상기 혈청을 복합체 트래핑 차단 ELISA(CTB)[참조: Wensvoort 등, Vet. Microbiol. 17, 129-140(1988)]로 추가 조사하여 HCV-E1-특이성 항체를 검출했다.
EDTA 혈액 샘플은 42, 45, 47, 49, 52, 56 및 63일에 채혈했다. 혈액 샘플중의 적혈구, 혈소판 및 백혈구의 수를 계수하였다. 또한 백혈구를 혈액 샘플에서 분리하고 백혈구 분획의 HCV 역가를 PK-15 세포중의 분획을 대수-희석으로 적정함으로써 결정했다. 그후 이 세포를 37℃, 5% CO2에서 4일 동안 배양한 후, 바이러스의 존재는 HCV 브레스시아 균주에 대하여 생성된 모노클로날 항체를 사용하는 IMPA로 결정했다[참조 : Wensvoort 등, Vet, Microbiol. 12, 101-108(1986)]
상기 모든 돼지의 직장 온도는 매일 측정했으며, 모든 돼지는 질병 징후 진전에 대하여 매일 조사했다.
* =0.3, SNT-PRV에서 이 수치는 음성반응으로 간주됨.
#=0.8, NPLA에서 이 수치는 음성반응으로 간주됨.
@=CTB에서 30의 저해율은 음성반응으로 간주되고 50의 저해율은 양성반응으로 간주됨.
d=죽음.
* = 바이러스가 검출되지 않음; 역가는 log TCID50으로 표시함.
D = 죽음; 돼지 13, 14 및 16는 56일에 과다증으로 죽음.
- = 적용안됨.
* 평균온도 = 오전 10시경의 직장 온도(℃).
# 평균적혈구 = 적혈구의 평균 수(×1012)/ℓ.
@ 평균 혈소판 = 혈소판의 평균 수(×109)/ℓ.
- 평균백혈규 = 백혈구의 평균 수(×109)/ℓ.
[결론]
3개의 구성물 PRV-M203, M204 및 M205 중 하나를 예방 접종한 돼지는 PRV와 HCV에 대한 중화 항체 및 HCV-E1 특이성 항체를 생성했다. PRV-M206으로 예방 접종한 돼지는 PRV에 대한 중화 항체를 생성했지만 HCV에 대한 중화 항체 또는 HCV-E1 특이성 항체는 생성하지 못했다(표 1). PRV-M206과 비교하여, 상기 3개의 PRV-HCV 구성물에 포함된 유일한 추가 유전정보는 HCV-E1 또는 HCV-E1의 부분을 암호화하는 게놈 서열이다 : 이것은 HCV-E1에 대하여 유도되는 돼지 혈청이 HCV를 중화시킬 수 있음을 의미한다.
PRV-M203으로 예방 접종된 돼지는 독성 HCV 감염에 대하여 부분적으로 예방된다. PRV-HCV 구성물 M204 또는 M205로 예방접종된 돼지는 독성 HCV 감염에 대하여 완전히 예방되었다.
PRV-M206으로 예방 접종된 돼지는 독성 HCV 감염에 대하여 예방되지 못했다(표 2와 표 3). 따라서, 돼지는 HCV-E1 또는 HCV-E1의 일부분에 대한 유전 정보를 함유하는 백신을 예방 접종하거나, HCV-E1 또는 HCV-E1의 일부분의 유전자 생성물이 HCVDP 대한 항체 반응을 일으키는 유일한 폴리펩티드로서 사용되는 백신을 접종하거나, 또는 HCV-E1 또는 HCV-E1의 일부분을 암호화하는 유전 정보로부터 몇몇 방식으로 유도되는 폴리펩티드를 예방 접종함으로써 독성의 돼지 콜레라 바이러스 감염으로부터 예방될 수 있다.
Claims (17)
- 제1도에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열 267∼690과 691∼1148 또는 항 페스티바이러스 항체를 유발시킬 수 있는 이들의 항원성 단편을 함유하는 돼지 콜레라 폴리펩티드 암호성 뉴클레오티드 서열.
- 제1항에 있어서, 상기 아미노산 서열 중에서 267∼570과 691∼1030 또는 항페스티바이러스 항체를 유발시킬 수 있는 이들의 항원성 단편을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열.
- 제1항에 기재된 뉴클레오티드 서열을 함유하는 재조합 폴리뉴클레오티드.
- 제3항에 있어서, 상기 서열이 슈도라비에스 바이러스 벡터내에 함유되어 있는 재조합 폴리뉴클레오티드.
- 제1항의 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되며, 선택적으로 글리코실화되는 폴리펩티드.
- 제2항의 뉴클리오티드 서열에 의해 암호화되며, 선택적으로 글리코실화되는 폴리펩티드.
- 제5항의 폴리펩티드에 대하여 생성된 항체.
- 제1항의 유전 정보를 함유하는, 페스티바이러스 감염의 예방용 백신.
- 제5항의 폴리펩티드를 함유하는, 페스티바이러스 감염의 예방용 백신.
- 페스티바이러스 뉴클레오티드 서열의 전장 cDNA 사본 또는 그것의 (+) 스트랜드 전사체로부터 형성되고 제1도에 기재된 뉴클레오티드 서열 361∼3804에 해당하는 영역에 존재하는 보존성 에피토프를 변화시키는 돌연변이를 포함하는 것이 특징인, 게놈성 RNA를 가진 페스티바이러스 균주를 포함하는 페스티바이러스 감염의 예방용 백신.
- 제6항의 폴리펩티드를 함유하는 페스티바이러스 감염의 예방용 백신.
- 제1항의 서열로부터 유래한 올리고뉴클레오티드를 함유하는 올리고뉴클레오티드 프로브.
- 제1항의 서열로부터 유래된 올리고뉴클레오티드 프로브를 하나 이상 함유하는 페스티바이러스 감염의 진단용 키트.
- 페스티바이러스의 뉴클레오티드 서열 또는 이 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되는 폴리펩티드를 사용한 예방 접종으로 페스티바이러스에 대한 감염 예방된 동물과 페스티바이러스에 감염된 동물을 혈청학적으로 구별하기 위한 진단용 키트로서, 이 키트가 전술한 동물을 예방하는데 사용되는 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되는 폴리펩티드와는 상이하며, 제6항의 폴리펩티드를 하나 이상 함유하는 진단용 키트.
- 제9항의 항체를 하나 이상 함유하는 진단용 키트.
- 제1항에 있어서, 아미노산 서열 691∼1063 또는 항페스티바이러스 항체를 유발시킬 수 있는 이것의 항원성 단편을 암호하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열.
- 제1항에 있어서, 아미노산 서열 267∼570 또는 항페스티바이러스 항체를 유발시킬 수 있는 이것의 항원성 단편을 암호하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열.
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