HU220237B - Sertéskolera vírus nukleotidszekvencia, ezt tartalmazó pseudorabies vírusvektor és expressziós rendszer, az általa kódolt rekombináns polipeptid, eljárások ezek előállítására, valamint diagnosztikai kitek és vakcinák - Google Patents
Sertéskolera vírus nukleotidszekvencia, ezt tartalmazó pseudorabies vírusvektor és expressziós rendszer, az általa kódolt rekombináns polipeptid, eljárások ezek előállítására, valamint diagnosztikai kitek és vakcinák Download PDFInfo
- Publication number
- HU220237B HU220237B HU667/90A HU666790A HU220237B HU 220237 B HU220237 B HU 220237B HU 667/90 A HU667/90 A HU 667/90A HU 666790 A HU666790 A HU 666790A HU 220237 B HU220237 B HU 220237B
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- amino acid
- acid sequence
- virus
- hcv
- sequence
- Prior art date
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims description 38
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 title claims description 32
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 title claims description 31
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims description 30
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 title claims description 24
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title claims description 21
- 241000701093 Suid alphaherpesvirus 1 Species 0.000 title claims description 16
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 9
- 239000013598 vector Substances 0.000 title claims description 6
- 238000009007 Diagnostic Kit Methods 0.000 title claims description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims description 3
- 241000710777 Classical swine fever virus Species 0.000 title description 3
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 52
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 claims description 44
- 206010008631 Cholera Diseases 0.000 claims description 26
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 claims description 18
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 15
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 13
- 241000710778 Pestivirus Species 0.000 claims description 9
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 8
- 208000004571 Pestivirus Infections Diseases 0.000 claims description 7
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 claims description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 6
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 5
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 5
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 5
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 4
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 claims description 3
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 claims description 3
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 claims description 3
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 20
- 241000607479 Yersinia pestis Species 0.000 claims 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 claims 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 23
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 23
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 22
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 21
- 241000710780 Bovine viral diarrhea virus 1 Species 0.000 description 17
- 210000002435 tendon Anatomy 0.000 description 17
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 15
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 12
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 12
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 12
- 108700008783 Hepatitis C virus E1 Proteins 0.000 description 11
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 9
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 9
- 241001118702 Border disease virus Species 0.000 description 8
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 7
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 7
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 7
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 7
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 102100034349 Integrase Human genes 0.000 description 6
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 6
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 6
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 6
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 6
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 6
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 5
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 5
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 5
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 5
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 5
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 5
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 5
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 5
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 5
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 5
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 description 4
- 101710094648 Coat protein Proteins 0.000 description 4
- 102100021181 Golgi phosphoprotein 3 Human genes 0.000 description 4
- 101710125418 Major capsid protein Proteins 0.000 description 4
- 101710141454 Nucleoprotein Proteins 0.000 description 4
- 101710083689 Probable capsid protein Proteins 0.000 description 4
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 4
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 4
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 4
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 4
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 4
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 4
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 4
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 4
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 4
- PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N isoamylol Chemical compound CC(C)CCO PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 241000713826 Avian leukosis virus Species 0.000 description 3
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 3
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 3
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101710091045 Envelope protein Proteins 0.000 description 3
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 3
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 3
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 3
- 241000209035 Ilex Species 0.000 description 3
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 3
- 101710188315 Protein X Proteins 0.000 description 3
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 3
- 230000002788 anti-peptide Effects 0.000 description 3
- 241000902900 cellular organisms Species 0.000 description 3
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 3
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 3
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 3
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 3
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 3
- 208000025858 pestivirus infectious disease Diseases 0.000 description 3
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 3
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 3
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 101100129922 Caenorhabditis elegans pig-1 gene Proteins 0.000 description 2
- 108010062580 Concanavalin A Proteins 0.000 description 2
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 2
- 108010054576 Deoxyribonuclease EcoRI Proteins 0.000 description 2
- ROSDSFDQCJNGOL-UHFFFAOYSA-N Dimethylamine Chemical compound CNC ROSDSFDQCJNGOL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101100520057 Drosophila melanogaster Pig1 gene Proteins 0.000 description 2
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 2
- ULGZDMOVFRHVEP-RWJQBGPGSA-N Erythromycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](C)C(=O)O[C@@H]([C@@]([C@H](O)[C@@H](C)C(=O)[C@H](C)C[C@@](C)(O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@H](C[C@@H](C)O2)N(C)C)O)[C@H]1C)(C)O)CC)[C@H]1C[C@@](C)(OC)[C@@H](O)[C@H](C)O1 ULGZDMOVFRHVEP-RWJQBGPGSA-N 0.000 description 2
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010090054 Membrane Glycoproteins Proteins 0.000 description 2
- 102000012750 Membrane Glycoproteins Human genes 0.000 description 2
- 108091092724 Noncoding DNA Proteins 0.000 description 2
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 2
- 101710185720 Putative ethidium bromide resistance protein Proteins 0.000 description 2
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RJURFGZVJUQBHK-UHFFFAOYSA-N actinomycin D Natural products CC1OC(=O)C(C(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C(=O)C2CCCN2C(=O)C(C(C)C)NC(=O)C1NC(=O)C1=C(N)C(=O)C(C)=C2OC(C(C)=CC=C3C(=O)NC4C(=O)NC(C(N5CCCC5C(=O)N(C)CC(=O)N(C)C(C(C)C)C(=O)OC4C)=O)C(C)C)=C3N=C21 RJURFGZVJUQBHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 2
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 2
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 description 2
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 2
- -1 i.e. Proteins 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 2
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 2
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 2
- 208000009305 pseudorabies Diseases 0.000 description 2
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 2
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 2
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JMNQYAXOMXHZAP-ZETCQYMHSA-N (2s)-5-(diaminomethylideneamino)-2-(propylamino)pentanoic acid Chemical compound CCCN[C@H](C(O)=O)CCCNC(N)=N JMNQYAXOMXHZAP-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 1
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000007407 African swine fever Diseases 0.000 description 1
- 231100000699 Bacterial toxin Toxicity 0.000 description 1
- 108090000565 Capsid Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102100023321 Ceruloplasmin Human genes 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 208000001726 Classical Swine Fever Diseases 0.000 description 1
- 241000710774 Classical swine fever virus - Brescia Species 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N Cysteine Chemical compound SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108050009160 DNA polymerase 1 Proteins 0.000 description 1
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 1
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 1
- 108010092160 Dactinomycin Proteins 0.000 description 1
- FEWJPZIEWOKRBE-JCYAYHJZSA-N Dextrotartaric acid Chemical compound OC(=O)[C@H](O)[C@@H](O)C(O)=O FEWJPZIEWOKRBE-JCYAYHJZSA-N 0.000 description 1
- 101710201734 E3 protein Proteins 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 101000686824 Enterobacteria phage N4 Virion DNA-directed RNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 101001095863 Enterobacteria phage T4 RNA ligase 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000644628 Escherichia phage Mu Tail fiber assembly protein U Proteins 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- 101001052021 Haemophilus phage HP1 (strain HP1c1) Probable tail fiber protein Proteins 0.000 description 1
- 101710154606 Hemagglutinin Proteins 0.000 description 1
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical group C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 206010021882 Infections and infestations congenital Diseases 0.000 description 1
- 101710203526 Integrase Proteins 0.000 description 1
- 101710125507 Integrase/recombinase Proteins 0.000 description 1
- 241000984622 Leucodon Species 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 241000829100 Macaca mulatta polyomavirus 1 Species 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 101710127721 Membrane protein Proteins 0.000 description 1
- 229910003251 Na K Inorganic materials 0.000 description 1
- 101000986989 Naja kaouthia Acidic phospholipase A2 CM-II Proteins 0.000 description 1
- 101001114132 Naja sputatrix Neutral phospholipase A2 B Proteins 0.000 description 1
- 101001114133 Naja sputatrix Neutral phospholipase A2 muscarinic inhibitor Proteins 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 108010038807 Oligopeptides Proteins 0.000 description 1
- 102000015636 Oligopeptides Human genes 0.000 description 1
- 101710093908 Outer capsid protein VP4 Proteins 0.000 description 1
- 101710135467 Outer capsid protein sigma-1 Proteins 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 1
- 229920002584 Polyethylene Glycol 6000 Polymers 0.000 description 1
- 101710176177 Protein A56 Proteins 0.000 description 1
- 101000802260 Pseudomonas phage D3112 Anti-CRISPR protein 31 Proteins 0.000 description 1
- 239000013614 RNA sample Substances 0.000 description 1
- 241001428754 Rat leukemia virus Species 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000282849 Ruminantia Species 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 229910000831 Steel Inorganic materials 0.000 description 1
- 108091027544 Subgenomic mRNA Proteins 0.000 description 1
- 101150003725 TK gene Proteins 0.000 description 1
- 241000246358 Thymus Species 0.000 description 1
- 235000007303 Thymus vulgaris Nutrition 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 1
- 241001672648 Vieira Species 0.000 description 1
- 206010051511 Viral diarrhoea Diseases 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- RJURFGZVJUQBHK-IIXSONLDSA-N actinomycin D Chemical compound C[C@H]1OC(=O)[C@H](C(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C(=O)[C@@H]2CCCN2C(=O)[C@@H](C(C)C)NC(=O)[C@H]1NC(=O)C1=C(N)C(=O)C(C)=C2OC(C(C)=CC=C3C(=O)N[C@@H]4C(=O)N[C@@H](C(N5CCC[C@H]5C(=O)N(C)CC(=O)N(C)[C@@H](C(C)C)C(=O)O[C@@H]4C)=O)C(C)C)=C3N=C21 RJURFGZVJUQBHK-IIXSONLDSA-N 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 1
- 238000000211 autoradiogram Methods 0.000 description 1
- 239000000688 bacterial toxin Substances 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000001772 blood platelet Anatomy 0.000 description 1
- UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N bromophenol blue Chemical compound C1=C(Br)C(O)=C(Br)C=C1C1(C=2C=C(Br)C(O)=C(Br)C=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 description 1
- 108091092330 cytoplasmic RNA Proteins 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 1
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 1
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 1
- 229960000640 dactinomycin Drugs 0.000 description 1
- 229940009976 deoxycholate Drugs 0.000 description 1
- 229960003964 deoxycholic acid Drugs 0.000 description 1
- KXGVEGMKQFWNSR-LLQZFEROSA-N deoxycholic acid Chemical compound C([C@H]1CC2)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 KXGVEGMKQFWNSR-LLQZFEROSA-N 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 1
- 238000009585 enzyme analysis Methods 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229960003276 erythromycin Drugs 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000185 hemagglutinin Substances 0.000 description 1
- 108060003552 hemocyanin Proteins 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 239000012133 immunoprecipitate Substances 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 230000003189 isokinetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001926 lymphatic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 description 1
- KRZWEBVPFGCYMY-UHFFFAOYSA-M methylmercury(1+);hydroxide Chemical compound [OH-].[Hg+]C KRZWEBVPFGCYMY-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 238000004264 monolayer culture Methods 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 210000002741 palatine tonsil Anatomy 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- XYFCBTPGUUZFHI-UHFFFAOYSA-O phosphonium Chemical compound [PH4+] XYFCBTPGUUZFHI-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 210000002826 placenta Anatomy 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 229940093429 polyethylene glycol 6000 Drugs 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 210000000664 rectum Anatomy 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 1
- 239000012723 sample buffer Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- BXAPDQHYAQOAHO-UHFFFAOYSA-M sodium;dodecyl sulfate;phosphoric acid Chemical compound [Na+].OP(O)([O-])=O.CCCCCCCCCCCCOS(O)(=O)=O BXAPDQHYAQOAHO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 239000010959 steel Substances 0.000 description 1
- 239000004575 stone Substances 0.000 description 1
- 201000010740 swine influenza Diseases 0.000 description 1
- 229940095064 tartrate Drugs 0.000 description 1
- 239000001585 thymus vulgaris Substances 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 1
- UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N triphosphoric acid Chemical compound OP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 1
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2217/00—Genetically modified animals
- A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2267/00—Animals characterised by purpose
- A01K2267/02—Animal zootechnically ameliorated
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/24011—Flaviviridae
- C12N2770/24111—Flavivirus, e.g. yellow fever virus, dengue, JEV
- C12N2770/24122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Virology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
A találmány tárgya sertéskolera-vírus, előnyösen annak Brescia-törzse aminosavszekvenciájának egy részét kódoló nukleotidszekvencia, az azt tartalmazó pseudorabies vírusvektor és expressziós rendszer, az általa kódolt rekombináns polipeptid, eljárások ezek előállítására, valamint diagnosztikai kitek sertéskolera diagnosztizálására és vakcinák pestivírus-fertőzés megelőzésére és kezelésére.
A sertéskolera-vírus (vagy sertéslázvírus) sertésekben, és két másik vírus, a marha vírusoshasmenés-vírusa (BVDV) marhában és az úgynevezett borderbetegség-vírus (bordér disease vírus, BDV) birkában mind ugyanabba a nemzetségbe tartoznak, a Togaviridae családba tartozó pestivírus nemzetségbe [Westaway és munkatársai, Intervirology, 24, 125-139 (1985)]; ezek a vírusok egy plusz (értelmes) szállal, azaz fertőző RNS-genommal bírnak. Szerkezetileg és antigén jelleg szempontjából a fenti három vírus egymással közeli rokon, a három közül bármelyik ellen irányuló antiszérum általában a másik kettőre is hat. A BVDV és a BDV olyan közeli rokonságban állnak egymással, hogy gyakorlatilag egy vírustípusnak tekinthetők [Tzerpstra; Progress in Veterinary Microbiology and Immunology, kiadó: R. Pandey, 1. kötet, 175-198. old., (1985)]. Bár mindhárom vírusnak megvan a maga elsődleges gazdaszervezete, a BVDV és a BDV megfertőzhet más kérődzőket is, és esetenként sertéseket is. A három vírus közös jellemzője, hogy kongenitális fertőzéseket okoznak [Van Oirschot, Veterinary Microbiology 9, 113—120 (1983)]. A BVDV egy szálának teljes nukleotidszekvenciája ismert, ez a 208 672 A számú európai szabadalmi leírásban szerepel, a sertéskolera-vírus és a BDV teljes nukleotidszekvenciája még nem ismert.
A pestivírus-fertőzések elleni vakcinálást általában élő, legyengített vírustörzsekkel végzik, így a sertéskolera elleni vakcinálást általában a sertéskolera-vírus (HCV) speciális törzseinek segítségével végzik, például az úgynevezett kínai törzset használják. Bár az ilyen vakcinálás általában kielégítő védelmet nyújt sertéskolerával szemben, a vakcinálásra szolgáló vírustörzsek szaporítása gyakran problémát jelent. Ezenkívül a kínai törzs és más vakcinálásra szolgáló törzsek áthatolhatnak vakcinálást követően a vemhes koca placentáján, és így a magzatok megfertőződhetnek a vakcináló vírussal. Ennek következtében a magzatok elpusztulhatnak, vagy születésük után hosszasan betegek lehetnek [Overby és Eskildsen, CEC Report Hog Cholera/Classical and African Swine Fever EUR 5904, 420-429 (1976)]. A kínai vakcinavírust a vakcinálást követően 15 napon át megtalálták a mandulákban [Terpstra, Tijdschrift voor Diergeneeskunde, 103, 678-684 (1978)], és a vírus a sertésben hosszabb időn át megmaradhat. Ez zavaró lehet vakcináit állatról készített diagnózis esetén, mert a vad („field”) vírustól való megkülönböztetés csak hosszas diagnosztikai vizsgálatok révén lehetséges.
A kínai törzs és más HCV vakcinavírusok elleni antitestek nem különböztethetők meg a vad vírus elleniektől. Ennek folytán egy sertésnépesség vakcinálása sertéskolera ellen, és ezzel egyidejűleg, ugyanebben a populációban a vad HCV-fertőzések kimutatása szerológiai felméréssel nem lehetséges.
A marhák és birkák BVDV- és BDV-fertőzésekkel szembeni ismert módszerekkel történő védelme hasonló hátrányokkal jár. Ezért szükséges egy jobb, egyszerűbb módszer a pestivírus-fertőzések elleni védelemre, és az ilyen fertőzések diagnosztizálására, különösen sertéskolera elleni védelemre, és ennek diagnosztizálására.
Megtaláltuk a virulens Brescia HCV-törzs teljes RNS-nukleotidszekvenciáját.
Azt találtuk továbbá, hogy egy fertőző organizmus struktúrfehérjéinek bizonyos részét kódoló szekvenciák különösen alkalmas alapanyagul szolgálnak a fertőzés elleni védelemre.
A találmány tárgyát képezik ezért ezek a nukleotidszekvenciák, különösen azok a részei, amelyek alkalmasak a fertőzés elleni védelemre.
A leírásban a találmányt pestivírus-fertőzések vonatkozásában világítjuk meg, különösen sertéskolera példáján mutatjuk be, de a találmány magában foglalja a fertőzések elleni védelmet és ezek diagnózisát, közelebbről az immunogén hatást általában.
A HCV nukleotidszekvenciáját az 1. ábrán mutatjuk be. A bemutatott szekvencia a 111 klónszámú Bresciatörzsre vonatkozik (CDI, Lelystad). Azt találtuk, hogy a sertéskolera-vírustörzsek nagy mértékű szerológiai homologitással bírnak, a sertéskoleratörzsek nem különböztethetők meg egymástól keresztsemlegesítéses vizsgálattal, de megkülönböztethetők a BVDV-tőI (sertés vírusos hasmenésének vírusa) és BDV-től (borderbetegség-vírus) [Wensvoort és munkatársai, Vet. Microbiol., 20: 291-306 (1989); Thesis. University of Utrecht (1989), 3. fejezet]. Azt találtuk, hogy a sertéskoleratörzseket az El burokfehéije ellen kifejlesztett monoklonális antitestek egy csoportja egyformán felismeri. A monoklonális antitesteknek ez a csoportja nem ismeri fel a BVDV- és a BDV-törzseket [Wensvoort és munkatársai, Vet. Microbiol., 21: 9-20 (1989); Thesis (1989), 4. fejezet]. Mind a 94 vizsgált HCV-törzsben a HCV-E1 burokfehéijén állandósult epitopokat találtak [Wensvoort, Thesis 1989, 47. és 78. oldal]. A Bresciatörzstől eltérő HCV-törzsek szekvenciái enyhe eltérést mutatnak az 1. ábrán bemutatott szekvenciától, de lényegében a találmány körébe tartoznak. A következőkben a számok a HCV-törzsek körébe tartozó Brescia törzs genomjára vonatkoznak, más törzsek esetén a pozíciók kissé különbözőek lehetnek, de ezek a különbségek a találmány szempontjából nem jelentősek. A szekvencia egy 11694 nukleotidból álló nyílt leolvasási keretet foglal magában, amelyet mindkét oldalon nem kódoló régió határol. Ez a nem kódoló régió az 5’-végen 360 nukleotid hosszúságú, míg a 3’-végen 229 nukleotid hoszúságú és egy TGA stop szignállal kezdődik. A nyílt leolvasási keret számozása ezért (5’)361-12054(3’). A 361-3804 nukleotidig tartó szekció kódolja a struktúrfehéqéket. Ezek közé tartozik egy kapszidfehéqe, amelyet mintegy a 361 és 1162 közötti régió kódol, egy burokfehérje, amelynek jele E2, ezt a szomszédos, 1163-2070 nukleotidok kódolják, egy E3 jelölésű fehérje, amelyet még részleteiben nem azonosítottak, ezt
HU 220 237 Β a 2071-2430 nukleotidok kódolják, és egy ugyancsak El jelölésű burokfehérje, amelyet a 2431-3804 nukleotidok kódolnak. Az E2 és El jelölésű burokfehéijék
1. ábra szerinti aminosavszekvenciában való helyzete mintegy 267-570 és 691-1148.
Az El különösen hatékonynak tűnik olyan antitestek termelésére, amelyek a pestivírus-fertőzésekkel szemben védelmet nyújtanak. Az El szekvencia immundomináns alszekciója feltehetőleg a 691. Leu, 1030. Glu közötti régióban van, míg a hidrofób régió, amely a mintegy 1031. Phe és 1148. Asp között található, az El szekvencia egy másik alszekciójának tűnik, amely a védőhatás szempontjából tűnik lényegesnek. Az utóbbi alszekció három transzmembrán régiót (TMR) tartalmaz, amelyek lehetővé teszik, hogy a peptid a sejtmembránhoz rögzítődjön. Azt találták, hogy a pestivírussal szembeni nagyfokú védőhatás eléréséhez igen fontos, hogy a pepiidben legalább egy ilyen transzmembrán régió legyen jelen. Egy TMR az 1031. Phe és 1063. Leu közötti egységekben található, és előnyösen a védelemre használt szekvenciában jelen van. A védelem céljára megfelelőek azok a polipeptidek is, amelyek csak egy El szekciónak felelnek meg, és amelyek egy transzmembrán régiót tartalmaznak.
A védelem szempontjából fontos másik szekvencia egy poláros töltött régió, amely mintegy az 1012 Tyrnél kezdődik, és az 1031 Phe-nál végződik. Legelőnyösebb, ha a védelemre szolgáló szekvenciában ez a szekvencia az 1031 Phe - 1063 Leu által kódolt transzmembrán régióval - amint az az El-nél előfordul - együtt van jelen. Az 1012 Tyr - 1063 Leu által kódolt szekvencia az úgynevezett stop transzfer régió (ez egy fehérjét rögzít a durva endoplazmatikus retikulum membránjába). A stop transzfer szekvenciák 20-25 egységből álló hidrofób domént tartalmaznak (azaz TMR), és egy 10-15 egységből álló poláros régiót (azaz 1012 Tyr 1031 Phe) [E. Perara és V. R. Lingappa,R. C. Das and P. W. Robbins, szerkesztők: Academic Press, New York, 1988, 3-47. oldal]. Ez a szekvencia kapcsolódhat egy másik, a pestivírus-RNS által kódolt antigénhez (azaz E2, E3, p80), vagy egy heterológ antigénhez (azaz bakteriális toxinhoz, korona vírus peplomer antigénjéhez, azaz TGE-hez, influenzavírus, azaz sertésinfluenza-vírus hemagglutininjéhez), ezáltal az ilyen antigén immunogén hatása megnő (függetlenül az expressziós rendszertől). Használható a poláros régió nélküli TMR vagy a TMR nélküli poláris régió is. A TMR és a poláris régió használhatók heterológ poláris régióval vagy TMRrel együtt is. A stop transzfer régió alkalmazása nem korlátozódik a pestivírusból származó ilyen régiókra. Továbbá, egy pestivírus-antigén immunogén hatása, de más antigéneké hasonlóan, növelhető, ha az antigént kódoló szekvenciát egy heterológ stop transzfer régióhoz vagy annak egy részéhez kapcsoljuk.
A polipeptidek kifejezésen oligopeptideket és polipeptideket értünk, ezek hossza nem korlátozott. A polipeptidek adott esetben glikoziláltak vagy más módon módosítottak is lehetnek.
A találmány szerinti védelem szempontjából fontos nukleotidszekvenciák ennek megfelelően azok, amelyek az El burokfehérjét vagy annak részeit kódolják, beleértve egy stop transzfer szekvenciát. A találmány szerinti szekvenciák ennek megfelelően az (5’) 1-3804 nukleotidszekvencia legalább egy részét tartalmazzák (a számozás az 1. ábra szerinti). Még előnyösebben a szekvencia a 2431-3804 szekvencia, különösen előnyösen a 2431-3549 szekvencia egy részét tartalmazza. Egy másik előnyös szekvencia, a találmány szerinti diagnosztikai eljárás szempontjából, az 1162-2430 szekvencia legalább egy részét tartalmazza. A fenti pozíciók HCV esetén érvényesek, BVDV és BDV esetén némileg eltérőek, de az általános elrendezés azonos, a burkolófehérjéknek és részeiknek (szekcióiknak) megfelelő szekvenciák ugyancsak rendkívül hasznosak védőhatás keltése és diagnosztika céljára.
A sturktúrfehérjék és az ezeknek teljesen vagy részlegesen megfelelő polipeptidek pestivírus-fertőzésekkel szembeni védőhatás tekintetében való fontossága nyilvánvaló abból a tényből, hogy a HCV struktúrfehérjéjét kódoló cDNS-szekvenciát, különösen az El-t tartalmazó rekombináns vírussal beoltott sertésekben HCV-t közömbösítő antitestek képződnek, és a sertések védetté válnak virulens sertéskolera-vírussal való fertőzéssel szemben.
Az 1. ábrán bemutatott szekvenciából származó szekvenciák vagy pestivírus El, E2, E3 vagy ezek részei kódolására szolgáló génszekvenciák ugyancsak használhatók transzgénes állatok (sejtjeik genomjában idegen DNS-szekvenciát tartalmazó állatok) létrehozására, amelyek pestivírus-fertőzéssel szemben rezisztensek. Az állatok immunizálásának ezt a formáját intracelluláris immunizálásnak nevezik [Baltimore, Natúré, 335, 395-396 (1988)], az ilyen immunizálásnak többféle formája lehetséges; az 1. ábrán bemutatott szekvenciából származó szekvencia (vagy bármely más pestivírus-szekvencia) expresszálható olyan (antiszenz) RNSként, amely a pestivírusgenom replikációjába és expressziójába beavatkozik; pestivírus-glikoproteineket (El, E2 és E3) kódoló szekvenciák tehetők biológiailag inaktívvá mutáció révén, és az ilyen expresszált, mutált géntermékek versenghetnek a fertőzött sejtben a normáltermékekkel, ezáltal az élő vírusok termelődését akadályozzák; kifejezhetők a transzgénes állatokban felületi glikoproteinek, például El és feltehetőleg E2 és E3 is, és ezek a pestivírus sejtreceptoraihoz kötődnek, ezáltal megakadályozzák azok fertőző hatását. Kimutatták [D. W. Salter és L. B. Crittenden, Theoretical and Applied Genetics, 77, 457-461 (1989)], hogy csirkékben egy ilyen expresszált felületi glikoprotein [az ALV (avian leukosis vírus) A alcsoportjának gp 85 glikoproteinje] viszi át a számyasleukózis-vírus (ALV, A alcsoport) rezisztenciát.
A találmány tárgyát képezi továbbá rekombináns RNS, és egy DNS, amely a fenti szekvenciát tartalmazza; egy ilyen típusú rekombináns polinukleotid, például rekombináns vírus formájú. Ennek megfelelő hordozóvírus például az Aujeszky-betegség vírusa (pseudorabies vírus, PRV), de más vírusok, például a vakciniavírus, az adenovírus, a baculovírus, az SV40, a retrovírus, a hepatitis B vírus és származékaik is alkalmazha3
HU 220 237 Β tők. Használhatók továbbá olyan sejtek, amelyek a fenti vírusok valamelyikével stabil transzformáción mentek át, olyan sejtek, amelyekben ezek a vírusok episzomálisan vagy lítikusan replikálódnak, és olyan sejtek, amelyek megfelelő vektorokkal stabil transzformáción mentek át, és a struktúrfehéijét, különösen az El fehérjét vagy annak egy részét fejezik ki, azaz adott esetben prokarióta vagy eukarióta rendszerekben rekombináns DNS révén nyert minden alegységet. Az ilyen rekombináns rendszerek különösen alkalmasak vakcina alapjaként pestivírus-fertózésekkel szemben, különösen HCV ellen. A találmány ezért olyan vakcinákra is vonatkozik, amelyek a nukleotidszekvenciát rekombináns vírusban vagy más formában tartalmazzák.
A találmány körébe tartozik minden olyan vakcina, amelyet egy pestivírus-szekvencia teljes hosszúságú cDNS-kópiája és/vagy plusz szálának transzkriptuma alapján fejlesztenek ki. Az ilyen vakcina kifejleszthető például a struktúrfehérje állandósult epitópját kódoló szekvencia mutációjával, különösen a HCV-El burokfehéijét kódoló szekvencia mutációjával [Wensvoort, Thesis 1989, 47-78. oldal]. Ily módon olyan vakcinatörzs nyerhető, amely lehetővé teszi (a vakcinatörzzsel) vakcináit állatok szerológiai megkülönböztetését a vad vírussal fertőzött állatoktól. A cDNS-kópia mutációja vonatkozhat virulencia és immunogenitás markerekre is, és kevésbé virulens, immunogénként hatásosabb vakcinatörzsekhez vezethet.
A találmány tárgyát képezik továbbá olyan vakcinák, amelyek olyan - az előzőekben leírt - polipeptideket tartalmaznak antigénként, amelyek teljesen vagy részben - megfelelnek a felületi proteineknek.
Ezekkel a polipeptidekkel kifejlesztett antitestek felhasználhatók pestivírus-fertőzések diagnosztizálására, és ugyancsak a találmány körébe tartoznak.
A találmány tárgyát képezik továbbá a fertőzés diagnosztizálására szolgáló eljárások és eszközök, amelyekben egy oligonukleotid- vagy polinukleotidpróbát (RNS vagy DNS) vagy egy antigén polipeptidet, vagy egy antitestet - az előzőekben leírtak szerint - alkalmazunk, valamint a találmány körébe tartoznak az ilyen eszközöket lényeges komponensként tartalmazó kitek is. Diagnosztikai célra fontosak a strukturális és nem strukturális régiókban lévő más szekvenciák is.
Különösen hasznos az a találmány szerinti diagnosztikai eljárás, amely lehetőséget nyújt a találmány szerint vakcináit állatnak egy fertőzött állattól való szerológiai megkülönböztetésére, különösen HCV esetén. Ebben az esetben olyan polipeptidet alkalmazunk, amely eltér a védő antitesteket kifejlesztőtől, a fertőzött állatok széruma ebben az esetben a második polipeptiddel szemben antitesteket fog tartalmazni, míg a vakcináit állatoké nem. Erre a célra alkalmas polipeptid az E2 protein vagy annak egy része, de más, a pestivírusgenom által kódolt polipeptidek lényegében ugyancsak megfelelőek.
A következőkben a vírusok tenyésztésére, izolálására, és RNS-klónozására szolgáló eljárásokat a peptidszekvencia meghatározását, peptidek és antiszérumok készítését ismertetjük.
Sejtek és vírusok
SK-6 sejteket [Kasza és munkatársai, Research Vet. Se. 13, 46-51 (1979)] szaporítunk 5% magzati borjúszérumot (FBS) tartalmazó Eagle-alaptápközegben. Az FBS-t gamma-sugárzással besugározzuk, ezt követően gondosan megvizsgáljuk BVDV-re nézve oly módon, hogy ilyen szérumot tartalmazó tápközegben hosszasan tenyésztünk magzati borjú-epiteliálissejteket (FBE). A sejteket BVDV-re szenzitív immunperoxidáz egyrétegű vizsgálattal (IPMA) vizsgáljuk [Wensvoort és munkatársai, Vet. Microbiol. 12, 101-108 (1986)]. Az FBS-t BVDV-antitestekre nézve is ellenőrizzük standard BVDV-törzsanyag szenzitív immunperoxidáz egyrétegű vizsgálatában a semlegesítési index mérésével. Csak olyan szérumokat alkalmazunk, amelyek BVDVmentesek, és amelyek nem tartalmaznak BVDV antitesteket vagy BVDV-antitesttiterük alacsony.
A HCV Brescia-törzs nem volt citopatogén, és biológiailag klónozott volt háromszoros végponthígítás révén. Három amplifikációs lépés után egy 3 107 TCID50/ml titerű klónozott vírustörzsanyagot (Brescia, klónszám: 111) nyerünk.
Intracelluláris RNS izolálása HCV-ből
175 cm2 felületű palackokban (Nunclon) lévő egyrétegű SK-6 sejttenyészetet többszörös fertőzéssel (multiplicity of infection, MOI) 10 TCID50/sejt titerű HCV-vel fertőzünk. A tenyészetet 37 °C hőmérsékleten 1,5 órán át inkubáljuk, majd 40 ml végtérfogatig friss tápközeget adunk hozzá. 7 óra múlva aktinomicin D-t adagolunk 1 pg/ml végkoncentrációra. 24 órával a fertőzést követően a sejteket jéghideg PBS-oldattal (foszfáttal pufferolt sóoldat) kétszer mossuk. A sejteket jéghideg lizálópufferben [50 mmol/1 trisz-HCl, pH=8,2, 0,14 mol/1 NaCl, 2 mmol/1 MgCl2, 5 mmol/1 DTT, 0,5 térfogat% NP-40, 0,5% Na-dezoxikolát és 10 mmol/1 vanadil-ribonukleozid-komplexek (New England Biolabs)] lizáljuk.
A lizátumokat 4 °C hőmérsékleten, 4000 fordulat/perc sebességgel 5 percig centrifugáljuk, a felülúszót 250 pg/ml végkoncentrációjú proteináz K-val 37 °C hőmérsékleten 35 percig kezeljük, majd fenol, kloroform és izoamil-alkohol 49:49:2 arányú elegyével kétszer, ezután kloroform és izoamil-alkohol 24:1 arányú elegyével egyszer extraháljuk. Az intracelluláris RNS-t etanollal csapjuk ki, 5,7 mol/l-es CsCl alkalmazásával tisztítjuk, és a HCV-fajlagos RNS-ben gazdagítjuk egy denaturáló, izokinetikus szacharózgradiensben, amelynek koncentrációja 5-29 tömeg/térfogat%, és 50% formamidot tartalmaz. A szacharózgradienst 200 000 g mellett 16 órán át centrifugáljuk Beckmann SW40 Ti rotorban, 5 °C hőmérsékleten [Moormann és Hulst, Vírus Rés. 11, 281-291 (1988)].
Vírus-RNS izolálása HCV-ből
Brescia-vírust tisztítunk lényegében a Moorman és Hulst által leírt módon (lásd fent). Összefolyó, egyrétegű SK-6 sejttenyészetet befertőzünk 0,5 MOI értékű HCV-sal, és 200 ml tápközegben 37 °C hőmérsékleten 48 órán át tenyésztjük. A sejteket ezután 50 ml tápközegben szuszpendáljuk, és kétszer fagyasztva szárítjuk. A sejtszuszpenziót szüljük, majd a felülúszót nátrium4
HU 220 237 Β kloriddal 0,5 mol/l-esre, és polietilénglikol-6000-rel (BDH) 10 tömeg/térfogat%-ra állítjuk be. A vírust 6000xg mellett 4 °C hőmérsékleten 20 percig végzett centrifúgálással kiülepítjük, majd TNE-ben (20 mmol/1 trisz-HCl, pH=7,2, 150 mmol/1 NaCl, 1 mmol/1 EDTA) oldjuk, és 30-50% glicerin/0-50% Na-K tartarát gradiensen tisztítjuk. A gradiens frakcióit titráljuk, IPM-vizsgálattal megállapítjuk, hogy van-e jelen vírus. A megfelelő frakciókat egyesítjük, a vírusokat 4 órán át 150 000 χ g mellett 4 °C hőmérsékleten végzett centrifúgálással kiülepítjük. A vírus-RNS-t a csapadékból jéghideg lizálópufferrel, és proteináz K-val extraháljuk a csapadékból az előzőekben leírt módon. A vírus-RNS-t etanollal való kicsapással nyerjük ki.
HCV-RNS klónozása
Dúsított intracelluláris HCV-RNS-t (mintegy 1,5 pg HCV-fajlagos RNS) 10 mmol/liter metil-higany-hidroxiddal inkubálunk 10 percig szobahőmérsékleten. A denaturált RNS-mintát 42 °C hőmérsékleten 50 mmol/l-es trisz-HCl, pH=7,8, 10 mmol/1 MgCl2, 70 mmol/1 KC1, 0,5 mmol/1 dATP, dCTP, dGTP és dTTP, 0,6 pg borjú timus oligonukleotid primerek pd(N)6 (Pharmacia) és 300 egység Moloney-patkányleukémia-vírus reverz transzkriptáz (Bethesda Research Laboratories) jelenlétében, 100 pl össztérfogatban inkubáljuk. 1 óra elteltével az elegyhez 20 mmol/1 EDTA-t adunk, a reakcióelegyet ezután fenol és kloroform elegyével extraháljuk, majd Sephadex G50 oszlopon átengedjük, és etanollal kicsapjuk.
A második cDNS-szál szintézisére DNS-polizmeráz 1-t (Boehringer) és RN-áz H-t (Pharmacia) alkalmazunk [Gübler és Hoffman, Gene, 25, 263-269 (1983)].
A kétszálú cDNS-t T4 DNS polimerázzal (Pharmacia) inkubáljuk olyan reakcióelegyben, amely 0,05 mmol/1 dezoxinukleotid-trifoszfátot tartalmaz és EcoRI metilázzal (New England Biolabs) metiláljuk, EcoRI linkereket (New England Biolabs) adunk a cDNS tompa végéhez T4 DNS-ligázzal (Pharmacia). EcoRI-gyel (New England Biolabs) végzett emésztést követően a cDNS-t 0,8%-os agarózgélen szeparáljuk. Az 1 és 4 kb közötti fragmenseket elektroeluáljuk, a pUC 19 EcoRI helyre ligáljuk, és E. coli JM 83 törzs transzformálására használjuk [Vieira és Messing, Gene 19, 259-269 (1982)], amint azt Hanahan ismerteti [J. Mól. Bioi. 166, 577-580 (1983)]. A telepeket 32P-jelzett egyszálú cDNS-próbával hibridizáljuk. A próbát semleges agarózgélen ffakcionált (Moormann és Hulst, lásd fent) HCV-RNS-ről fordítottan átírjuk (reverz transzkripció). Felhasználás előtt az egyszálú DNS-próbát látszatfertőzött SK-6 sejtekből származó citoplazma-RNS-sel inkubáljuk.
A HCV-cDNS-klónok közötti rokonságot restrikciós enzimes elemzéssel és az emésztett DNS Southemblotjainak [Southern, J. Mól. Bioi. 89, 503-517 (1975)] nick-transzlációs cDNS-próbákkal való hibridizálásával (Maniatis és munkatársai, „Molecular Cloning, A Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor Láb., Cold Spring Harbor, N. Y. 1982) határozzuk meg.
Az előzőekben leírt cDNS-könyvtárból izolált klónok a HCV-RNS 90%-át teszik ki. Azonban az RNSszekvencia 5’-végének és 3’-végének klónozása nem történt meg.
A 3’-vég cDNS-klónjának nyerésére 20 pg vírusRNS-t in vitro poliadenilálunk E. coli poliA-polimerázzal (Pharmacia) 300 pl olyan reakcióelegyben, amely 50 mmol/1 trisz-HCl koncentrációjú, pH-ja 7,8, további összetevői 2,5 mmol/1 MnCl2, 10 mmol/1 MgCl2, 250 mmol/1 NaCl, 5 mmol/1 DTT, 800 Mg/ml BSA, 180 egység RNasin (Promega Biotec), 0,2 mmol/1 ATP, 4 pCi 3H-ATP és 2 egység polimeráz. A reagáltatást 37 °C hőmérsékleten 90 percig végezzük, majd fenolos extrahálással állítjuk le (lásd fent). A poliA-val adenilált RNS-t etanollal nyerjük ki, és az első cDNS-szál szintézisét oligodT-vel (12-18) (Pharmacia) indítjuk meg. Az 5’-vég cDNS-klónjainak nyerésére az 1. ábra 308-347 nukleotidszekvenciájával komplementer szintetikus oligonukleotidot szintetizálunk, és ezt használjuk cDNS első szála szintézisének megindítására vírus-RNS-templáton.
A cDNS első és második szálának az 5’- és 3’-vég felől való szintézisénél alkalmazott körülmények az előzőekben megadottak.
Kettősszálú cDNS-t inkubálunk T4 polimerázzal (lásd az előzőekben), 0,8%-os agarózgélen frakcionáljuk, és pGEM-4 kék (Promega Biotec) Smal helyére ligáljuk. A ligáit DNS-t E. coli oH5-a transzformálására alkalmazzuk (Hanahan, in DNA Cloning I. kötet; A Practical Approach, 6. fejezet, 109-135. oldal, 1985).
cDNS-klónok szekvenálása
A szekvenciaanalízis nagy részét a megfelelő restrikciós fragmenteknek M13mp 18-ba és mp 19-be való szubklónozása után végezzük [Yanisch-Perron és munkatársai, Gene 33, 103-119, (1985)]. A szekvencia megmaradó szekcióját a plazmidklónok kettősszálú DNS-ének direkt szekvenciameghatározásával határozzuk meg T7 polimerázalapú szekvenciakit (Pharmacia) alkalmazásával. Az univerzális, 15 nukleotid hosszúságú Ml 3 primeren (Boehringer) kívül szekvenálást végzünk egy ciklon DNS-szintetizátoron (New Brunswick Scientific) készített oligonukleotid primer alkalmazásával is. A szubklónozott, HCV-fajlagos restrikciós fragmentek nukleotidszekvenciáját a didezoxi-láncterminációs eljárással [Sanger és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 54-63, 54-67 (1977)] határozzuk meg Klenow DNS polimeráz (Pharmacia) vagy reverz transzkriptáz (Life Sciences) alkalmazásával [Sanger és munkatársai, lásd fent; Smith, DNA Sequence Analysis by Prímed Synthesis in „Methods in Enzymology” 65. kötet, 560-580. oldal, Academic Press, New York és a-35S-dAT (Amersham)].
A szekvenálási reakciók elemzését 8 mol/liter karbamidot tartalmazó 6%-os akrilamidgélen végezzük. Az adatokat M24 komputerrel (Olivetti) elemezzük egy PCGene szekvenciaanalízis-program (Genofit, Genf, Svájc) alkalmazásával, és egy Macintosh SE komputerrel (Apple) DNS „Strider” [Marck, Nucl. Acids Rés. 16,1829-1836 (1988)] alkalmazásával.
Szintetikus peptidek készítése és antipeptidszérum készítése nyálban
Peptideket szintetizálunk ismert módon szilárd fázisban BOP- [benzotriazol-l-il-oxi-trisz(dimetil-ami5
HU 220 237 Β no)-foszfónium-hexafluoro-foszfát] reagens alkalmazásával [Foumier és munkatársai, Int. J. Peptide Protein Rés. 31,86-97(1988)].
A peptidek ellen antiszérumot nyulak immunizálásával készítünk, amit komplett Freund-féle adjuvánsban lévő keyhole lympet haemocyaninnal (KLH) (KLH: peptid= 1:1) konjugált 1 mg peptiddel végzünk. A nyulakat az immunizálást követően 70 nap múlva kivéreztetjük.
Az antipeptidszérum analízise Western-blot alkalmazásával
A HCV Brescia El burok fehéqéjének tisztítását immunaffinitásos eljárással végezzük, nátrium-dodecilszulfátot tartalmazó poliakrilamid-gélen frakcionált elektroforézist végzünk, majd a mintát nitrocellulóz papírra visszük (biot) Wensvoort által leírt módon (thesis: Epitopes on Sructural Proteins of Swine Fever (Hog chlorea) Vírus. University of Utrecht, 71-85. oldal). A biotokat 30 percig 37 °C hőmérsékletű, 0,85 mol/1 nátriumkloridot, 0,05% Tween 80-t és 5% lószérumot tartalmazó foszfáttal pufferolt sóoldatban („blotting puffer”) áztatjuk, majd 60 percig 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk a blotting pufferral 1:10 arányban meghígított antipeptidszérummal. 0,05% Tween 80-t tartalmazó foszfáttal pufferolt sóoldattal négyszer mossuk, majd a kötött nyúl-immunoglobulinokat egy második inkubálással mutatjuk ki, amelyet 60 percig végzünk 37 °C hőmérsékleten nyúl-IgG és -IgM elleni HRPO-konjugátummal. A biotokat ezután az előzőekben leírt módon mossuk, és Wensvoort által leírt módon szubsztrátoldattal inkubáljuk (lásd fent). Pozitív kontrollként El biotokat konkanavalin-A-val és monoklonális antitest-HRPO 8 konjugátummal (Wensvoort, lásd fent) színezünk.
El kifejezése sejttenyészetben
3xl06 SK-6 sejtből álló egyrétegű tenyészetet HCV, M203, M204, M205 és M206-tal (lásd alább) fertőzünk 10-es fertőzési gyakorisággal (MOI). A sejteket a befertőzést követően 6-18 óra múlva 35S-nel jelöljük oly módon, hogy 2 ml, glutaminnal, antibiotikumokkal, 5% dializált magzati borjúszérummal és milliliterenként 100 pCi [35S]ciszteinnel kiegészített, ciszteinmentes Eagle-féle alaptápközegben inkubáljuk. A befertőzést követően 18 óra múlva a sejteket és a felülúszót egymástól elkülönítve összegyűjtjük. A sejteket 1 ml PBS-TDS-ben (1 térfogat% Triton X-100, 0,5 tömeg/térfogat% nátrium-dezoxikolát, 0,1 tömeg/térfogat% nátrium-dodecilszulfát foszfáttal pufferolt sóoldatban) lizáljuk. A lizátumot ultrahanggal kezeljük, és 10 percig 80 000 g mellett centrifugáljuk. A felülúszót 2 órán át 80 000 g mellett centrifugáljuk. A lizátum 0,01 μΐ-es mintáit vagy a felülúszó 200 μΐ-es mintáit 16 órán át 4 °C hőmérsékleten inkubáljuk 2 μΐ 1:1:1 arányú El-fajlagos MAb 3,6 és 8 elegy alkalmazásával [Wensvoort, J. Gén. Virol. 70, 2865 (1989)]. Ezeket az elegyeket 2 órán át 4 °C hőmérsékleten 1 mg protein A sepharose-zal inkubáljuk, majd 1 percig 1000 g mellett centrifugáljuk. A kicsapódott fehérjéket foszfáttal pufferolt sóoldat-TDS eleggyel négyszer mossuk, majd mintapufferben (600 mmol/1 trisz-HCl, pH=6,8, 2% nátrium-dodecilszulfát, 10% glicerin, 5% 2-merkaptoetanol, 0,01% brómfenolkék) inkubáljuk, és elektroforézissel nátrium-dodecilszulfátot tartalmazó 10%-os poliakrilamid-gélen analizáljuk.
A következőkben az ábrákat ismertetjük.
1. ábra
Brescia-törzs sertéskolera-vírus RNS-ének DNS-kópiájának teljes nukleotidszekvenciája.
A 361 nukleotid és 12054 nukleotid közötti nyílt leolvasási keret első aminosava a 361-363 nukleotidok által kódolt metioninegység.
Az aláhúzott részek az 1-3. szintetikus peptidszekvenciákat jelölik (18-mer-ek), amelyek nyúlban peptidantiszérum készítésére alkalmasak (lásd fent).
A függőleges helyzetű nyilak az aminosavak sorrendjében 691. helyzetű Leu-t, 1031. helyzetű Phe-t, 1063. helyzetű Leu-t és 1148. helyzetű Asp-t mutatják (lásd a 4. ábrán is).
2. ábra
Az 1-3. peptidek (lásd az 1. ábrán) ellen készített nyúlantiszérumok Westem-blot analízise
A biotok elemzését (balról jobbra) konkanavalin-A, monoklonális antitest 8, (Wensvoort, 1989, lásd fent), és az 1-3. peptidek elleni antiszérumok alkalmazásával végezzük.
A gp54-51 dublett képezi a HCV Brescia-törzs El glikoprotein frakcióját, a gp31 természete még nem ismert.
3. ábra
Az 1. ábrán bemutatott szekvencia 1-4440 nukleotidjainak térképe Acél, EcoRI, EcoRV és Nael restrikciós enzimekkel. A restrikciós enzim felismerési helyének első nukleotidjának a szekvenciában (1. ábrán) való helyzetét megjelöltük.
Az M203 (Nael-EcoRI), M204 (Nael-AccI) és M205 (Nael-EcoRV) El restrikciós ffagmenteknek ebben a szekvenciában való helyzetét aláhúzással jelöltük. Ezeket a fragmenteket pHBdelta-2,4-ben szubklónoztuk (lásd a 4. ábrán).
4. ábra
Rekombináns létrehozása HCV-El és pHBdelta2,4 között pHBdelta-2,4 konstrukcióját Quint és munkatársai írták le [J. Gén. Virol. 68, 523-534 (1987)]. A háromszög egy mintegy 2,05 kb deléciót jelöl a pHBdelta-2,4 egyetlen rövid régiójában (Van Zijl, közlés alatt). A BamHI helyek jelölése „B”. A gX szekvenciákat Reá és munkatársai [J. Virol. 54, 21-29 (1985)], a gp50 szekvenciákat Petrovskis és munkatársai, [J. Virol. 59, 216-223 (1986)], és a gp63 szekvenciákat Petrovskis és munkatársai, [J. Virol. 60, 185-193 (1986)] írták le. A rekombinánsok létrehozása a Ball-Ndel restrikciós fragmentnek a pHBdelta-2,4-ből való deléciójaval történt. Az említett restrikciós fragment a gX kódoló régiójának (1380 nukleotid) nagy részét tartalmazza (Reá és munkatársai, lásd fent). Az Ndel helyet Klenow-polimerázzal töltjük ki, és a pHBdelta-2,4-be a 3. ábrán bemutatott M203, M204 és M205 El szekvenciákat inzertálunk.
Minden El szekvencia 5’-vége egy GG-vel kezdődő tompa véggel (Nael) bír. Ezt a véget közvetlenül ligáljuk a pHBdelta-2,4 Ball emésztés után kapott tompa végével. Az 5’-végek fúziója minden pHBdelta-2,46
HU 220 237 Β
El konstrukció ligálási helyén Gly kodon létrejöttéhez vezet. Az ettől a Gly kodontól a 3’-vég felé eső Leu kodon a HCV-szekvencia (lásd az 1. ábrán) 691. aminosavját kódolja.
A 3’-végen specifikus oligonukleotid linkerek alkalmazásával stopkodonokat építünk be a konstrukcióba. Az M203 konstrukcióban a stopkodontól közvetlenül az 5’-vég felé eső kodon a HCV-szekvencia (lásd az 1. ábrán) 1031 számú aminosavját kódolja. Az M204 és M205 konstrukciókban ezek a kodonok az 1063 és 1148 jelű aminosavakat (lásd az 1. ábrán) kódolják.
A gX szekvenciák kezdőpontjai az El inzertek mentén az 5’- és 3’-végeken nyíllal jelöltek. A stopkodonok és a konstrukció 3’-végén a gX kezdőpontjáig tartó szekvenciák az alkalmazott oligonukleotid linkerekből származnak.
A molekulák klónozási eljárását a Maniatis és munkatársai (1982, lásd fent) által leírt eljárással végezzük.
5. ábra
Aujeszky-betegség (Pseudorabies PRV) rekombináns vírus regenerálása átlapoló szubgenom PRV ffagmentekból [Van Zijl és munkatársai, J. Virol. 62, 2191-2195 (1988)].
A pMZ66 M203 El ffagmentet, a pMZ65 M204 El fragmentet és a pMZ63 M205 El fragmentet tartalmaz.
A transzfektált kiónok helyzetét a NIA-3 PRV törzs fizikai térképén (lásd az 5a. ábrán) függőleges vonalakkal jelöljük (lásd az 5b. ábrán).
a) : NIA-3 fizikai térkép [Quint és munkatársai, J. Gén. Virol. 68, 523-534 (1987)]. A genom egy lineáris kettősszálú DNS-molekulát tartalmaz, amely invertált ismétlődéseken (nyílt téglalappal jelölve) belül felosztható egy egyedi rövid régióra és egy egyedi hosszú régióra. Az ábrán láthatók a BamHI, HindlII és KpnI helyek.
b) : öt átlapoló klón sorozata
A c-179, a c-l és a c-443 kozmidklónokat Van Zijl és munkatársai (lásd fent) írták le. A pMZ64 klón a 783 törzs Bglil fragmentjét [Moormann és munkatársai, Abstract 12th Int. Herpes Vírus Workshop, 255. oldal (1987)] plazmidvektorban tartalmazza. A 783 törzsben (pMZ64) lévő Tk gén 19 bázispár deléciója révén inaktivált (Moormann és munkatársai, lásd fent). A deléció helyét a pMZ64-ben háromszög jelöli. A pMZ63/65 és 66 kiónok konstrukciója a 4. ábránál van leírva. A PRV-E1 rekombináns regenerálását Van Zijl és munkatársai (lásd fent) által leírt módon végezzük. A beültetett El szakasznak megfelelően (3. és 4. ábra) a rekombináns PRV-E1 törzsek jelölése:
PRV-M203, PRV-M204 és PRV-M205.
A PRV-M206 konstrukciója azonos a PRV-M203, M204 és M205 törzsekével, a PRV-M206 törzs konstrukciója azonos az előbbi törzsekével, de hiányzik belőle a HCV-fajlagos El szekvencia.
6. ábra
El fehérje kifejezése sejttenyészetben
A nátrium-dodecilszulfátos poliakrilamid-gélről készült autoradiogramon láthatók az M203-, M204-, M205- és M206-fertőzött sejtek felülúszóinak (tápközeg) és lizátumainak El-fajlagos MAb-kel való elegyének immunprecipitátumai. Párhuzamosan bemutatunk
HCV-fertőzött sejtek lizátumából kicsapott vad típusú El-t is (molekulatömeg: 51-54 kD). Az El feltétjével együtt mindig lecsapódik egy 31 kD-os glükoprotein is.
Az alábbiakban példát mutatunk be.
Az alábbi vizsgálatot annak meghatározására végeztük el, hogy képeznek-e az Aujeszky-betegség vírusa és sertéskolera-vírus ellen antitesteket, illetve képződnek-e HCV-El-fajlagos antitestek sertések vakcinálásakor, ha a vakcinálásra a három PRV-konstrukciót, az -M203, -M204 és -M205, vagy a PRV-M206 konstrukciót alkalmazzuk.
Vizsgáltuk továbbá, hogy ha a sertéseket a PRVM203, -M204 és -M205 konstrukciók valamelyikével vakcináljuk, védelmet nyújt-e ez ezeknek a sertéseknek virulens sertéskolera-vírussal való fertőzéssel szemben.
A vizsgálati állatokat négy csoportra (A-D) osztjuk, a vizsgálatba 10 hetes SPF sertéseket vonunk be, amelyekben sem HCV, sem BVDV elleni antitest nincs. Minden vizsgálati csoport négy sertésből áll.
A 0. napon az A csoport négy sertését intramuszkulárisan 107’3 egység (PFU) PRV-M203-mal (lásd a 4. ábrán) vakcináljuk, a B csoport tagjait 107-3 plakkképző egység (PFU) PRV-M204, a C csoportba tartozókat 107·3 egység (PFU) PRV-M205, míg a D csoportba tartozókat 107·3 egység (PFU) PRV-M206 alkalmazásával vakcináljuk.
A vakcinálást a 28. napon megismételjük. A 42. napon minden sertést intranazálisan 100 LD50 dózisban virulens HCV Brescia-törzs 456 610 [Terpstra és Wensvoort, Vet. Microbiol. 16, 123-128. old. (1988)] alkalmazásával megfertőzzük.
A -3., 28., 42. és 63. napokon vérszérummintákat veszünk. A szérumokat szérumneutralizációs vizsgálatban (SNT-PRV) vizsgáljuk [De Leeuw és munkatársai, Vet. Quarterly 4, 49-56 (1982)], hogy meghatározzuk a PRV elleni neutralizáló antitesteket. A szérumokat a neutralizáló peroxidázzal kapcsolt (NPL) vizsgálatban vizsgáljuk [Terpstra és munkatársai, Vet. Microbiol. 9, 113-120 (1984)], hogy meghatározzuk a HCV elleni neutralizáló antitesteket. A szérumokat tovább vizsgáljuk komplex kicsapó, gátló (trapping, blocking) ELISA vizsgálatban (CTB) [Wensvoort és munkatársai, Vet. Microbiol. 17, 129-140 (1988)], hogy meghatározzuk a HCV-El-fajlagos antitesteket.
EDTA-s vérmintákat veszünk a 42., 45., 47., 49., 52., 56. és 63. napokon. Megszámláljuk az eritrocitákat, a trombocitákat és a leukocitákat ezekben a mintákban. Továbbá, a leukocitákat izoláljuk ezekből a mintákból, és a leukocitafrakciók HCV-titerét a PK-15 sejtek frakcióinak log-hígításainak titrálásával meghatározzuk. Ezt követően a sejteket 4 napig 5% szén-dioxidot tartalmazó légtérben 37 °C hőmérsékleten tenyésztjük, majd a vírus jelenlétét meghatározzuk IPM vizsgálatban HCV Brescia-törzs ellen ható monoklonális antitestekkel [Wensvoort és munkatársai, Vet. Microbiol. 12, 101-108(1986)].
A sertések hőmérsékletét végbélben naponta mérjük, és naponta vizsgáljuk a sertéseket, hogy mutatják-e valamilyen betegség tünetét. Eredményeinket az 1., 2. és 3. táblázatokba foglaltuk.
HU 220 237 Β
1. táblázat
Az A-D csoportok antitestválaszai. A szérumokat a -3., 28., 42. és 63. napon vettük, és párhuzamos mintákkal SNT-PRV, NPL és CTB vizsgálatokat végeztünk. Az SNT-PRV és NPL vizsgálatoknál a titereket a 100-300 TCID50 vírus replikációját meggátló hígítás reciprokának logaritmusában fejeztük ki.
A CTB vizsgálatnál a titereket mint egy standard negatív szignál százalékos gátlását fejeztük ki [Wensvoort és munkatársai, Vet. Microbiol. 17, 129-140 (1988)].
| A vizsgálat napja | SNT-PRV | NPLA | CTB | |||||||||
| -3. | 28. | 42. | 63. | -3. | 28. | 42. | 63. | -3. | 28. | 42. | 63. | |
| A csoport (M203)* # § | ||||||||||||
| 1. sertés | - | 1,4 | 4,2 | 5,7 | - | - | 1,4 | 3,7 | 8 | 5 | 62 | 90 |
| 2. sertés | - | 1,4 | 4,2 | 3,9 | - | - | - | 2,7 | 8 | 0 | 30 | 89 |
| 3. sertés | - | 1,4 | 3,9 | 3,2 | - | - | 2,4 | 4,3 | 3 | 0 | 87 | 92 |
| 4. sertés | - | 1,8 | 4,5 | 4,8 | - | - | 1,5 | 4,2 | 13 | 0 | 48 | 91 |
| B csoport (M204) | ||||||||||||
| 5. sertés | - | 1,4 | 5,9 | 4,2 | - | 1,3 | 3,1 | 4,5 | 6 | 36 | 94 | 90 |
| 6. sertés | - | 2,0 | 4,8 | 4,8 | - | 1,5 | 3,3 | 5,0 | 2 | 35 | 92 | 90 |
| 7. sertés | - | 1,5 | 4,2 | 3,0 | - | 1,7 | 3,3 | 5,0 | 5 | 42 | 94 | 91 |
| 8. sertés | - | 1,5 | 4,5 | 2,7 | - | 1,9 | 3,4 | 5,0 | 0 | 43 | 91 | 93 |
| C csoport (M205) | ||||||||||||
| 9. sertés | - | 1,8 | 4,2 | 4,2 | - | 1,1 | 3,1 | 3,1 | 2 | 11 | 86 | 86 |
| 10. sertés | - | 1,5 | 4,8 | 3,3 | - | 1,6 | 3,4 | 5,0 | 5 | 23 | 89 | 92 |
| 11. sertés | - | 1,8 | 4,1 | 3,9 | - | 1,3 | 3,7 | 3,4 | 1 | 16 | 94 | 89 |
| 12. sertés | - | 1,4 | 3,0 | 2,7 | - | 1,3 | 3,4 | 5,0 | 4 | 21 | 94 | 91 |
| D csoport (M206) | ||||||||||||
| 13. sertés | - | 2,1 | 4,2 | d | - | - | - | d | 7 | 0 | 0 | d |
| 14. sertés | - | 2,3 | 3,9 | d | - | - | - | d | 6 | 0 | 0 | d |
| 15. sertés | - | 2,1 | 4,2 | d | - | - | - | d | 4 | 15 | 0 | d |
| 16. sertés | - | 2,3 | 4,4 | d | - | - | - | d | 0 | 8 | 0 | d |
* az SNT-PRV vizsgálatban a <0,3 értékeket negatívnak tekintjük.
# az NPL vizsgálatban a <0,8 értékeket negatívnak tekintjük.
§ a CTB vizsgálatban a <30% gátlást negatívnak tekintjük, míg a >50% gátlást pozitívnak tekintjük, d=elpusztult.
2. táblázat
Sertéskoleravírus-titer az A-D csoportokba tartozó sertések leukocitafrakciójában, a sertések befertőzését követő 42. napon, a fertőzés virulens sertéskolera-vírus Brescia 456610 törzssel 100 LD50 mértékben történt.
| Nap | 45. | 47. | 49. | 52. | 56. | 63. |
| A csoport (M203) * | ||||||
| 1. sertés | < | 0,72 | 0,88 | < | < | < |
| 2. sertés | < | 0,72 | 4,05 | < | 0,72 | < |
| 3. sertés | < | < | < | < | < | < |
| 4. sertés | < | 0,72 | < | < | < | < |
HU 220 237 Β
2. táblázat (folytatás)
| Nap | 45. | 47. | 49. | 52. | 56. | 63. |
| B csoport (M204) | ||||||
| 5. sertés | < | < | < | < | < | < |
| 6. sertés | < | < | 0,72 | < | < | < |
| 7. sertés | < | < | < | < | < | < |
| 8. sertés | < | < | < | < | < | < |
| C csoport (M205) | ||||||
| 9. sertés | < | < | < | < | < | < |
| 10. sertés | < | < | < | < | < | < |
| 11. sertés | < | < | < | < | < | < |
| 12. sertés | < | < | < | < | < | < |
| D csoport (M206) | ||||||
| 13. sertés | < | 2,55 | 5,55 | 4,38 | 5,05 | - |
| 14. sertés | < | 2,05 | 5,05 | 5,38 | 5,82 | - |
| 15. sertés | < | 3,28 | 6,05 | 4,55 | d | - |
| 16. sertés | < | 2,38 | 5,72 | 4,72 | 5,55 | - |
* < = vírust nem detektáltunk, a titcrckct log-TCID50-értékben fejezzük ki. d = elpusztult; a 13., 14. és 16. sertéseket „szélső esetben” az 56. napon leöltük. - = nem használható.
HU 220 237 B
3. táblázat
A táblázatban az A, B, C és D csoportokba tartozó, a 42. napon 100 LD50 virulens sertéskolera-vírussal, (Brescia 456 610 törzs) fertőzött sertések átlagos klinikai adatait ismertetjük.
| SO <n | 38,8 | CM ©* | 0,3 | 400 | in m | Os_ 00* | ©* | Os* cn | ©* | V? | CM ©* | 1 ί 353 | Os »—» | 00* | Os ©* | 38,9 | ©* | Γγ | ©* | 397 | 00 m | 00* | 0,5 | ||||
| © | CM | CM | © | © | CM | ||||||||||||||||||||||
| 1/Ί | Os | © | Os | © | Os | © | |||||||||||||||||||||
| cn | cn | cn | |||||||||||||||||||||||||
| 00 | CM | 00 | © | CM | |||||||||||||||||||||||
| 00 | © | oo | © | Os | © | ||||||||||||||||||||||
| cn | cn | cn | |||||||||||||||||||||||||
| Os | © | © | © | ||||||||||||||||||||||||
| l/S | 00 | © | Os | © | Os | © | |||||||||||||||||||||
| cn | cn | cn | |||||||||||||||||||||||||
| 00 | CM | in | cn | •n | © | CM | 00 | CM | © | © | © | cn | CM | so | |||||||||||||
| m | 00 | © | in | © | 00 | Os | os | © | in | © | oo | <n | OO | CM | Os | © | •n | © | cn | cn | so | © | |||||
| cn | os | cn | Tf | CM | cn | «η | so | ||||||||||||||||||||
| CM | cn | cn | |||||||||||||||||||||||||
| 00 | n· | CM | os | CM | |||||||||||||||||||||||
| 00 | © | Os | © | 00 | © | ||||||||||||||||||||||
| cn | cn | cn | |||||||||||||||||||||||||
| sO | © | SO | cn | CM | |||||||||||||||||||||||
| Os | © | © | © | os | © | ||||||||||||||||||||||
| cn | cn | ||||||||||||||||||||||||||
| s© | © | CM | cn | SO | © | CM | 00 | ’t | CM | cn | CM | CM | |||||||||||||||
| M· | OS | © | in | © | Tf | SO | © | Os | © | •n | © | m | CM | 00 | CM | Os | © | in | © | r- | © | r-~ | |||||
| m | SO | 00 | cn | SO | cn | <n | cn | ||||||||||||||||||||
| CM | cn | cn | |||||||||||||||||||||||||
| r- | 00 | CM | m | m | |||||||||||||||||||||||
| Os | © | Os | © | Os | © | ||||||||||||||||||||||
| m | cn | cn | |||||||||||||||||||||||||
| Os | SO | CM | Os | © | CM | cn | cn | cn | © | •n | |||||||||||||||||
| M- | © | © | Tf | © | OO | Tj- | SO | Os | © | in | © | oo | «η | r- | Os | © | in | © | r- | 00 | Os | ||||||
| cn | in | cn | 00 | CM | cn | © | cn | ||||||||||||||||||||
| CM | CM | cn | |||||||||||||||||||||||||
| vn | Os | CM | CM | Os | |||||||||||||||||||||||
| © | © | OS | © | 00* | © | ||||||||||||||||||||||
| cn | cn | ||||||||||||||||||||||||||
| n Tf | 00 | CM | cn | SO | ’T’ | cn | cn | Os | © | CM^ | CM | cn | SO | Os | |||||||||||||
| OS | © | SO | © | cn | os | <n | Os | © | SO | © | in | Os | SO | Os | © | s© | © | r- | r- | SO | © | ||||||
| cn | SO | SO | cn | Tf | tJ- | cn | oo | 00 | |||||||||||||||||||
| CM | cn | CM | |||||||||||||||||||||||||
| 3 | CM | 00 | CM | in | CM | ||||||||||||||||||||||
| Os | © | 00 | © | 00 | © | ||||||||||||||||||||||
| cn | m | m | |||||||||||||||||||||||||
| cn 'φ | © | Os | CM | oo | CM | ||||||||||||||||||||||
| Os | © | 00 | © | 00 | © | ||||||||||||||||||||||
| cn | cn | cn | |||||||||||||||||||||||||
| CM TT | Γ | 1 | CM | CM | 00 | 00 | CM | © | cn | cn | cn | 00 | r—· | r- | cn | SO | cn | ||||||||||
| 00* | © | SO | © | 00 | •n | © | ©* | 00 | © | SO | © | so | 00 | © | © | 00 | © | «η | © | τ—1 | 00 | Os | © | ||||
| cn | Tt | i-M | cn | tI- | cn | —H | cn | CM | |||||||||||||||||||
| m | cn | cn | |||||||||||||||||||||||||
| © | © | Os | |||||||||||||||||||||||||
| nT | Os | © | Os | ©* | 00* | © | |||||||||||||||||||||
| cn | cn | cn | |||||||||||||||||||||||||
| cn | 'φ | >n | |||||||||||||||||||||||||
| © | © | © | |||||||||||||||||||||||||
| CM | CM | CM | |||||||||||||||||||||||||
| 2 | 2 | 2 | |||||||||||||||||||||||||
| §· | t; | * | % | 1 | r | 4fc | 1 | r | 1 | ||||||||||||||||||
| z | o | ε | f-í | cCn | X-S | /‘“‘s | o | ε | £ | © | ε | z“· | u | GCW | -““s | ||||||||||||
| u. | to | > | > | u | > | 3 | > | o- | *o | > | > | U | > | 3 | > | CL | kO | > | •E | > | u | > | 3 | > | |||
| o | -3 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | o | -C | 0 | 0 | js | 0 | 0 | 0 | o | J3 | 0 | 0 | J2 | 0 | 0 | 0 | |||||
| VJ | Ό | ü | Ό | Ό | Ό | ίΛ o | Ό | Ό | Ό | Ό | (Λ | Ό | o | Ό | *-* | Ό | Ό | ||||||||||
| < | -< | ví | <3 | cn | c3 | cn | -«3 | cn | m | -< | ΚΛ | -c3 | n | <3 | VJ | *ΐ3 | VJ | -< | (Λ | »«3 | VJ | ‘c5 | 1Λ | -cS | (Λ |
HU 220 237 B
3. táblázat (folytatás)
| 56. | D csoport (M206) | 50 00 m | © | (N rn | 05 o | Tt | Tt Tt | CN on | |
| iri | 40,0 | 0,6 | |||||||
| Tt <Z5 | 40,5 | Γ; ©* | |||||||
| 53. | 40,8 | 0,2 | |||||||
| ri •Λ | 1—* i-M Tt | 0,3 | Tt rn | 0,6 | © | © ÍN | ÍN Tt | 50 | |
| V) | 41,4 | ÍN © | |||||||
| 50. | Tt | 0,4 | |||||||
| 49. 1 | 41,5 | 0,3 | 0,2 | 05 ÍN | OO 50 | rn rn | 0,6 | ||
| 00 τΤ | 41,3 | Tt | |||||||
| Tt | 41,2 | 0,3 | Tt Tt | 0,3 | 240 | r- 50 | 5,0 | ÍN ÍN | |
| 46. | 40,9 | 0,2 | |||||||
| V» Tt | 40,8 | 0,3 | 0‘9 | ÍN © | 265 | r* | 05 Tt | ©, | |
| 44. 1 | 39,4 | Tt © | |||||||
| ΓΟ Tt | 39,0 | ÍN © | |||||||
| 42. | 38,9 | 0.2 | Tt te? | o | 332 | <N | oo | 2 | |
| 39,0 | ΐ‘0 .1 | ||||||||
| Nap | Átl. hőm. | (s. dev.) | átl. eritr.# | (s. dev.) | átl. thr. | (s. dev.) | átl. leuk.- | (s. dev.) |
T3 bű — o
L- .tS o — s s bo >e5 «β N “ iZ 'rt tí ü Ό O 'rt — N S 3 N ti ¢/5 υ rt O .tí x> » ε
* ű o a < •s» -a ε ε >2 X ε
£ .2 * 3fc «Z>
A három konstrukció, a PRV-M203, M204 és
M205 valamelyikével vakcináit sertések semlegesítő antitesteket fejlesztenek ki PRV és HCV ellen, valamint HCV-El-fajlagos antitesteket termelnek.
A PRV-M206-tal vakcináit sertésekben semlegesítő antitestek fejlődnek ki PRV-sal szemben, de nem jönnek létre HCV-vel szemben semlegesítő antitestek, sem pedig HCV-El-fajlagos antitestek (1. táblázat). A PRV-M206 és a három PRV-HCV konstrukció kö10 zött az egyetlen közös genetikai információ az a genomszekvencia, amely a HCV-El-t vagy egy HCV-E1 szekciót kódol: ez azt jelenti, hogy a HCV-E1 elleni sertésszérum semlegesíteni képes a HCV-t.
A PRV-M203-mal vakcináit sertések részben védet15 tek virulens HCV-fertőzésekkel szemben. A PRV - HCV M204 vagy M205 konstrukciókkal vakcináit sertések teljesen védettek virulens HCV-fertőzésekkel szemben.
A PRV-M206-tal vakcináit sertések nem védettek virulens HCV-fertőzéssel szemben (2. és 3. táblázat).
Ezért a sertések virulens sertéskoleravírus-fertőzéssel szemben olyan vakcinával vakcinálhatók, amely HCV-El vagy annak egy részére vonatkozó genetikai információt tartalmaz, vagy olyan vakcinával való vakcinálással, amelyben a HCV-E1 vagy a HCV-E1 egy része genetikai produktuma használatos egyetlen olyan polipeptidként, amellyel szemben egy HCV-sal szembeni antitestválasz jön létre, vagy a vakcinálás végezhető olyan polipeptidekkel, amelyek hasonló módon származnak olyan genetikai információból, amely a HCV-El-t vagy annak egy részét kódolják.
Claims (15)
- SZABADALMI IGÉNYPONTOK35 1. Sertéskolera-vírus Brescia-törzse aminosavszekvenciájának egy részét kódoló nukleotidszekvencia, azzal jellemezve, hogy az 1. ábrán megadott aminosavszekvencia 1-1148., 1-267., 268-570., 571-690., 691-1148., 691-1030., 1012-1031., 1012-1063.,40 1031-1048. vagy 1031-1063. rész-aminosavszekvenciái vagy azok legalább 95%-os homológiát mutató mutáns változatai közül egyet vagy többet tartalmazó szekvenciarészt kódol.
- 2. Pesti vírus genomjának egy részét tartalmazó nuk45 leotidszekvencia, azzal jellemezve, hogy az 1. ábrán bemutatott 268-570., 691-1148., 691-1030. vagy 1031-1063. aminosavszekvenciáknak megfelelő aminosavszekvenciát, vagy annak legalább 95%-os homológiát mutató mutáns változatát tartalmazó polipep50 tidet kódol, a 689-1067. HCV-aminosavszekvenciának megfelelő aminosavszekvencia kivételével.
- 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti nukleotidszekvenciát tartalmazó rekombináns polinukleotid.
- 4. A 3. igénypont szerinti rekombináns polinuk55 leotid, azzal jellemezve, hogy pseudorabies vírusvektor hordozza.
- 5. A 4. igénypont szerint meghatározott rekombináns vektor, azzal jellemezve, hogy működőképes tk-, gl- gX- és llk-géntermékek expressziójában hiányos a60 pseudorabies vírusvektor.HU 220 237 Β
- 6. Expressziós rendszer, azzal jellemezve, hogy 3-5. igénypontok bármelyike szerint meghatározott rekombináns polinukleotidot tartalmaz, és alkalmas a nukleotidszekvencia expresszáltatására.
- 7. Sertéskolera-vírus Brescia-törzse aminosavszekvenciájának egy részét tartalmazó rekombináns polipeptid, azzal jellemezve, hogy az 1. ábrán megadott aminosavszekvencia 1-1148., 1-267., 268-570., 571-690., 691-1148., 691-1030., 1012-1031., 1012-1063., 1031-1048. vagy 1031-1063. rész-aminosavszekvenciái vagy azok legalább 95%-os homológiát mutató mutáns változatai közül egyet tartalmazó részt tartalmaz, és adott esetben glikozilált.
- 8. Sertéskolera-vírus aminosavszekvenciájának egy részét tartalmazó rekombináns polipeptid, azzal jellemezve, hogy az 1. ábrán bemutatott 268-570., 691-1148., 691-1030. vagy 1031-1063. aminosavszekvenciáknak vagy azok legalább 95%-os homológiát mutató mutáns változatának megfelelő részt tartalmaz, a 689-1067. HCV-aminosavszekvenciának megfelelő aminosavszekvencia kivételével, és adott esetben glikozilált.
- 9. Eljárás sertéskolera-vírus Brescia-törzse aminosavszekvenciája egy részét tartalmazó rekombináns polipeptid előállítására, azzal jellemezve, hogy az 1. ábrán megadott 1-1148., 1-267., 268-570., 571-690., 691-1148., 691-1030., 1012-1031., 1012-1063., 1031-1048. vagy 1031-1063. aminosavszekvenciák vagy azok legalább 95%-os homológiát mutató mutáns változatai közül egyet vagy többet tartalmazó aminosavszekvenciát expresszáltatunk, az expresszálandó aminosavszekvenciát kódoló DNS alkalmazásával.
- 10. Eljárás sertéskolera-vírus aminosavszekvenciájának egy részét tartalmazó rekombináns polipeptid előállítására, azzal jellemezve, hogy az 1. ábrán bemutatott 268-570., 691-1148., 691-1030. vagy 1031-1063. aminosavszekvenciáknak vagy azok legalább 95%-os homológiát mutató mutáns változatainak megfelelő részt tartalmazó aminosavszekvenciát expresszáltatunk, a 689-1067. HCV-aminosavszekvenciának megfelelő aminosavszekvencia kivételével, az expresszálandó aminosavszekvenciát kódoló DNS alkalmazásával.
- 11. Vakcina pestivírus-fertőzés elleni védelemre, azzal jellemezve, hogy az 1. vagy 2. igénypont szerinti nukleotidszekvenciát tartalmaz.
- 12. Vakcina pestivírus-fertőzés elleni védelemre, azzal jellemezve, hogy a 7. vagy 8. igénypont szerinti,vagy a 9. vagy 10. igénypont szerint előállított polipeptidet tartalmaz.
- 13. A 11. igénypont szerinti vakcina pestivírus-fertőzés elleni védelemre, azzal jellemezve, hogy a vakcinatörzs és a vad vírustörzs közötti szerológiai különbségtételt lehetővé tévő, szerkezeti fehéijét kódoló szekvenciában található mutációt tartalmazó pestivírus-vakcinatörzs teljes hosszúságú cDNS-kópiából vagy annak pozitívszál-átiratából nyert genomi RNS-ét alkotó nukleotidszekvenciát tartalmaz.
- 14. Diagnosztikai kit, azzal jellemezve, hogy legalább egy, a 7. vagy 8. igénypont szerinti, vagy a 9. vagy 10. igénypont szerint előállított polipeptidet tartalmaz.
- 15. A 14. igénypont szerinti diagnosztikai kit, sertéskolera diagnosztizálására, azzal jellemezve, hogy az 1. ábra szerinti 268-570. aminosavszekvenciának megfelelő aminosavszekvenciát tartalmazó polipeptidet tartalmaz.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| NL8901651A NL8901651A (nl) | 1989-06-29 | 1989-06-29 | Vaccin tegen pestivirusinfecties, zoals varkenspest; daarvoor bruikbare nucleotidesequenties en polypeptiden. |
| PCT/NL1990/000092 WO1991000352A1 (en) | 1989-06-29 | 1990-06-29 | Pestivirus nucleotide sequences and polypeptides |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HU906667D0 HU906667D0 (en) | 1992-06-29 |
| HUT63194A HUT63194A (en) | 1993-07-28 |
| HU220237B true HU220237B (hu) | 2001-11-28 |
Family
ID=19854928
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU667/90A HU220237B (hu) | 1989-06-29 | 1990-06-29 | Sertéskolera vírus nukleotidszekvencia, ezt tartalmazó pseudorabies vírusvektor és expressziós rendszer, az általa kódolt rekombináns polipeptid, eljárások ezek előállítására, valamint diagnosztikai kitek és vakcinák |
Country Status (11)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0479866B2 (hu) |
| JP (1) | JP3262273B2 (hu) |
| KR (1) | KR0183368B1 (hu) |
| AT (1) | ATE191504T1 (hu) |
| AU (1) | AU5955190A (hu) |
| DE (1) | DE69033503T3 (hu) |
| ES (1) | ES2146574T5 (hu) |
| HU (1) | HU220237B (hu) |
| NL (1) | NL8901651A (hu) |
| RO (1) | RO114347B1 (hu) |
| WO (1) | WO1991000352A1 (hu) |
Families Citing this family (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5811103A (en) * | 1989-03-19 | 1998-09-22 | Akzo Nobel N.V. | Hog cholera virus vaccine and diagnostic |
| ZA901719B (en) * | 1989-03-19 | 1991-01-30 | Akzo Nv | Hog cholera virus vaccine and diagnostics |
| US5935582A (en) * | 1990-03-16 | 1999-08-10 | Akzo Nobel, N.V. | Hog cholera virus vaccine and diagnostic |
| US5731167A (en) * | 1992-01-17 | 1998-03-24 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Autotaxin: motility stimulating protein useful in cancer diagnosis and therapy |
| WO1995035380A1 (en) | 1994-06-17 | 1995-12-28 | Instituut Voor Dierhouderij En Diergezondheid | Nucleotide sequences of pestivirus strains, polypeptides encoded by these sequences and use thereof for diagnosis and prevention of pestivirus infections |
| FR2751224B1 (fr) * | 1996-07-19 | 1998-11-20 | Rhone Merieux | Formule de vaccin polynucleotidique contre les pathologies respiratoires et de reproduction des porcs |
| US8063195B2 (en) * | 2009-05-22 | 2011-11-22 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture | Mutations in a toll-like receptor motif in the NS4B of classical swine fever virus strain brescia influences virulence in swine |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3687769T2 (de) * | 1985-07-08 | 1993-09-02 | Chiron Corp | Vakzine und diagnostika, die vom bovine-diarrhea-virus stammen. |
| IE870507L (en) * | 1986-03-07 | 1987-09-07 | Biothechnological Res Partners | Bovine virus diarrhea and hog cholera vaccines |
| JPH02502425A (ja) * | 1987-03-09 | 1990-08-09 | ジ・アップジョン・カンパニー | ウイルス感染に対して耐性の遺伝子導入動物細胞 |
| ZA901719B (en) * | 1989-03-19 | 1991-01-30 | Akzo Nv | Hog cholera virus vaccine and diagnostics |
-
1989
- 1989-06-29 NL NL8901651A patent/NL8901651A/nl not_active Application Discontinuation
-
1990
- 1990-06-29 WO PCT/NL1990/000092 patent/WO1991000352A1/en active IP Right Grant
- 1990-06-29 AU AU59551/90A patent/AU5955190A/en not_active Abandoned
- 1990-06-29 AT AT90910520T patent/ATE191504T1/de not_active IP Right Cessation
- 1990-06-29 DE DE69033503T patent/DE69033503T3/de not_active Expired - Lifetime
- 1990-06-29 ES ES90910520T patent/ES2146574T5/es not_active Expired - Lifetime
- 1990-06-29 HU HU667/90A patent/HU220237B/hu unknown
- 1990-06-29 JP JP51005790A patent/JP3262273B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1990-06-29 RO RO149030A patent/RO114347B1/ro unknown
- 1990-06-29 EP EP90910520A patent/EP0479866B2/en not_active Expired - Lifetime
-
1992
- 1992-10-06 KR KR1019910702003A patent/KR0183368B1/ko not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ATE191504T1 (de) | 2000-04-15 |
| KR0183368B1 (ko) | 1999-04-01 |
| DE69033503D1 (de) | 2000-05-11 |
| WO1991000352A1 (en) | 1991-01-10 |
| KR920702720A (ko) | 1992-10-06 |
| HUT63194A (en) | 1993-07-28 |
| DE69033503T3 (de) | 2006-07-27 |
| ES2146574T3 (es) | 2000-08-16 |
| EP0479866B2 (en) | 2005-05-25 |
| JP3262273B2 (ja) | 2002-03-04 |
| JPH04506453A (ja) | 1992-11-12 |
| HU906667D0 (en) | 1992-06-29 |
| EP0479866A1 (en) | 1992-04-15 |
| EP0479866B1 (en) | 2000-04-05 |
| RO114347B1 (ro) | 1999-03-30 |
| DE69033503T2 (de) | 2000-08-24 |
| NL8901651A (nl) | 1991-01-16 |
| AU5955190A (en) | 1991-01-17 |
| ES2146574T5 (es) | 2005-10-16 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR950000887B1 (ko) | 프로제니터 비루스 왁찐 조성물, 이의 제조방법, 및 이를 사용하여 비루스에 감염된 동물과 왁찐 주사를 맞은 동물을 구별하기 위한 방법 | |
| US5202430A (en) | Transmissible gastroenteritis virus genes | |
| KR20070028547A (ko) | 바이러스에 감염되고 백신접종된 생물의 동정 | |
| CN106456741B (zh) | 包含e2蛋白tav表位中的取代的重组经典猪瘟病毒(csfv) | |
| JP3846808B2 (ja) | ペスチウイルス株のヌクレオチド配列、それらの配列によりコードされるポリペプチド、ならびにペスチウイルス感染の診断および予防のためのそれらの使用 | |
| Rümenapf et al. | Molecular characterization of hog cholera virus | |
| HUT55243A (en) | Process for producing recombinant subunite vaccine against pseudolyssa | |
| Seif et al. | Finer mapping of neutralizing epitope (s) on the C-terminal of Japanese encephalitis virus E-protein expressed in recombinant Escherichia coli system | |
| US5651972A (en) | Use of recombinant swine poxvirus as a live vaccine vector | |
| US7521058B2 (en) | Non-spreading pestivirus | |
| CN109999191B (zh) | 一种鸡毒支原体新型基因工程亚单位疫苗 | |
| JPH05292976A (ja) | マレック病ウイルスワクチン | |
| HU220237B (hu) | Sertéskolera vírus nukleotidszekvencia, ezt tartalmazó pseudorabies vírusvektor és expressziós rendszer, az általa kódolt rekombináns polipeptid, eljárások ezek előállítására, valamint diagnosztikai kitek és vakcinák | |
| Castillo-Olivares et al. | Generation of a candidate live marker vaccine for equine arteritis virus by deletion of the major virus neutralization domain | |
| JP3262787B2 (ja) | 豚コレラウイルスワクチン | |
| US6468538B1 (en) | Recombinant proteins for the fusion of the porcine reproductive and respiratory syndrome virus and its use in diagnosis | |
| HUE029385T2 (hu) | Marker vakcina klasszikus sertéspestishez | |
| TWI393778B (zh) | Recombinant swine fever virus E2 glycoprotein, its single source antibody and its application in diagnostic reagents and subunit vaccines (2) | |
| HUT54306A (en) | Process for producing proteins, vaccines and nucleic acids | |
| EP1438969A1 (en) | Arterivirus marker vaccine |