JPH02502425A

JPH02502425A - ウイルス感染に対して耐性の遺伝子導入動物細胞

Info

Publication number: JPH02502425A
Application number: JP63503385A
Authority: JP
Inventors: ペトロフスキイズ，エリック・エイ; ポスト，レオナルド・イー
Original assignee: ジ・アップジョン・カンパニー
Priority date: 1987-03-09
Filing date: 1988-02-26
Publication date: 1990-08-09
Also published as: EP0354213A1; WO1988007080A2; WO1988007080A3; AU616211B2; AU2380088A

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】ウィルス感染に対して耐性の遺伝子導入動物細胞発明の分野本発明は遺伝子導入動物細胞に関する。さらに詳しくは、本発明はＤＮＡウィルス感染に対して耐性の遺伝子導入動物細胞、およびかかる細胞を産生ずる方法に関する。

発明の背景レトロウィルスは種々の腫瘍性疾患を特徴的に誘発するものであって、を椎動物種の間にかなり広範に分布している。それらは自身の、形態、ＲＮＡウィルスゲノムの構造、およびＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ（逆転写酵素）によって識別される（ディ・アール・ローイ・（Ｄ、Ｒ，Ｌｏｗｙ）、「形質転換および腫瘍形成ニレトロウィルス」、バイｏｏジー（’１１７　ｉｒｏｌｏｇｙ）、ビイ・エフ・フィールズらＣＢ、Ｎ。

Ｆｉｅｌｄｓ、　ｅｔ　ａｌ、）！、ラベン・プレス（Ｒａｖｅｎ　Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク（１９８５））。

レトロウィルスのライフサイクルはウィルスゲノムの宿主ゲノムへの組込み（プロウィルス）を含み、それはしばしばウィルス抗原の発現を導く。１のレトロウィルスでの細胞系の感染は同一のセログループ（Ｓ　ｅｒｏｇｒｏｕｐ）における他のウィルスによるひき続いての感染に干渉することが長い間知られている（ビイ・ケイ・フォークトおよびアール・イシザキ（Ｐ、に、　Ｖｏｇｔ　ａｎｄ　Ｒ，ｌ５ｈｉｚａｋｉ）、パイロロジー（Ｖ　ｉｒｏｌｏｇｙ）、３０．３６８〜７４頁（１９６６））。この効果はレトロウィルスの細胞への吸着の如き感染の初期過程への干渉によることが示されており、細胞侵入（エフ・ティ・ステックおよびエイチ・ルピン（Ｆ、Ｔ、　５ｔｅＣｋ　ａｎｄ　Ｈ，Ｒｕｂｉｎ）、パイロロジー（Ｖ　ｉｒｏｌｏｇｙ）、２９．６４２〜５３頁（１９６５））は通常、「干渉」と呼ばれている。

エイチ・エル・ロビンソンら（Ｈ，Ｌ、　Ｒｏｂｉｎｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ、）、ジャーナル・オブ・パイロロジー（Ｊ　、　Ｖｉｒｏｌ、）、４０，７４５〜５１頁（１９８１）は内因性レトロウィルスの同一セログループス糖タンパクの発現に帰因することを証明し几。ロビンソンらはウィルス糖タンパクの合成は外因性レトロウィルスによる侵入を示したことを指摘した。また、ロビンソンらは、ウィルス遺伝子産生物が発現されたニワトリにおいてレトロウィルスの複製を干渉が誘導したことを証明した。

レトロウィルスの干渉現象はニワトリにとって珍しいことではない。ミンク細胞フォーカス誘導ウィルスに対するＤＢＡ／２マウスの耐性はウィルス糖タンパクをコード付けするマウス遺伝子の発現による（ニス・ルスセッティら（Ｓ　、　Ｒｕ５ｃｅｔｔｉ　ｅｔ　ａｌ、）、ジャーナル・オブ・エクスベリメンタル・メディシン（Ｊ　、　ＥＸＰ、　Ｍｅｄ、）、１５４．９０７〜２０頁（１９８１））：アール・エイチ・バラシンら（Ｒ，Ｈ，Ｂａ５ｓｉｎ　ｅｔ　ａｌ、）、パイロロジー（Ｖ　ｉｒｏｌｏｇＦ）、１２３．１３９〜５１　頁（１９８２））。マウスをマウス白血病レトロウィルスに対して耐性とするＦｖ−４遺伝子もウィルス糖タンパクをコード付けする（ケイ・カイら（Ｋ、　Ｋａｉ　ｅｔ　ａｌ、）、パイ口口ジーまた、干渉に対する効果において同様な現象が植物において証明されている。ウィルスに罹る植物は同一ウィルスの穏和株でのあらかじめの感染によって耐性とされる。植物においては、該現象は「干渉作用（ｃｒｏｓｓ　ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ）Ｊとして知られている。干渉作用が生シルメカニズムは知られていないが、恐らくはそれはウィルスｃＤＮＡの宿主ゲノムへの挿入は含まない（ビイ・パルカイティスおよびエム・ザイトリン（Ｐ、　Ｐａ１ｕｋａｉｔｉｓ　ａｎｄ　Ｍ、　Ｚａｉｔｌｉｎ）、「植物ウィルスおよびウィロイドによって示される「干渉作用」現象を説明するするためのモデル」、４２０〜２９、プラント・マイクローブ・インターアクシタンズ（Ｐ　１ａｎｔ　Ｍｉｅｒｏｂｅ　Ｉ　ｎｔｅｒａｅｔｉｏｎｓ）、ティ・コスゲおよびイー・ダブリニー・ネスター（Ｔ、　Ｋｏｓｕｇｅ　ａｎｄＥ、Ｗ、　Ｎｅ５ｔｅｒ）ｌ、マクミラン・インコーホレイティラド（Ｍａｃｉｉｌｌａｎ　Ｉ　ｎｃ、）、（１９８４））。

情報開示の記載ビイ・ビイ・アベルら（Ｐ、Ｐ、　Ａｂｅｌ　ｅｔ　ａｌ、）、サイエンス（Ｓ　ｃｉｅｎｅｅ）、２３２．７３８〜４３頁（１９８６）、はタバコ植物のゲノムにクローンされたタバコモザイクウィルス（ＴＭＶ）外又タンパク質遺伝子ｅＤＮＡの発現によってＴＭＶに対して耐性とされｒ；植物について言及している。外又タンパク質遺伝子遺伝子を発現した実生はひき続いてのＴＭＶでの感染に際し徴候を呈するのが遅れ、遺伝子導入植物のｌＯ〜６０パーセントが実験の持続間に徴候を呈さなかった。

ロビンソンら、前掲、は遺伝子導入ニワトリを産生する可能性についてのいくつかの一般的なレビュー記事に引用されている。これらのレビュー記事において、著者は、レトロウィルス誘導ウィルス糖タンパク遺伝子を発現するニワトリは病原性レトロウィルスに対して耐性となり得ると予想している。エル・ビイ・クリテンデンおよびディ・ダブりニー・ソールター（Ｌ、Ｂ、　Ｃｒ１ｔｔｅｎｄｅｎ　ａｎｄＤ、Ｗ、　５ａｌｔｅｒ）、「遺伝子挿入：現在の進行および長期にかけてのゴール」、アビアン・ディジージズ（Ａ　ｖｉａｎ　Ｄ　１ｓｅａｓｅｓ）、３０．４３〜４６頁（１９８５）、およびエル・ビイ・クリテンデンおよびディ・ダブりニー・ソールター（Ｌ、Ｂ、　Ｃｒ１ｔｔｅｎｄｅｎ　ａｎｄ　Ｄ、Ｗ。

Ｓ　ａｌｔｅｒ）、「家禽のウィルス病に対する耐性を改良するための遺伝子工学：家畜改良への応用についてのモデル」、カナディアン・ジャーナル・才ブ・アニマル・サイエンス（Ｃａｎ、　Ｊ、　Ａｎｉｔｎ、　Ｓｅｉ、）、６５．５５３〜６２頁（１９８５）、は一般に遺伝子をニワトリ生殖細胞系へ挿入してよい病気耐性の表現形を産生する展望について考察している。より詳しくは、彼らは、もし細胞膜で発現されたらニワトリ集団におけるＡＬＶの最も普通の亜群による感染に干渉するであろう亜群Ａ、％類白面白血症ウィルスＡｔ、ｖ」、レトロウィルス）のエンベロープ抗原についてコード付けするウィルス遺伝子を挿入する可能性を考察している。さらに彼らは、ロビンソンら、前掲、を引用して内因性レトロウィルス遺伝子、ｅｖ６、がかかる宿主遺伝子について天然に生じるモデルを表わすことを示唆している。ビイ・エム・ビッグズ（Ｐ　、　Ｍ　、　Ｂ　１ｇｇ５）、「感染性動物病およびその制御」、フィロゾフィカル・トランスアクションズ・オブ・ロイヤル・ソサイエティ・オブーロンドン（Ｐｈｉｌ、　Ｔｒａｎｓ、　Ｒ，Ｓｏｃ。

Ｌｏｎｄ、）Ｂ、　３１０．２５９〜７４頁（１９８５）、は自然界で起つている如くニワトリにおいてウィルス感染についてのレセプターを阻害するためのＡＬＶのｅｎｖ遺伝子の使用の考察をとりわけ含む動物感染を制御する各種手段に言及している。ジェイ・シイ・サンフォードおよびニス・エイ・ジョンストン（Ｊ、Ｃ，５ａｎｆｏｒｄ　ａｎｄ　Ｓ、Ａ。

Ｊ　ｏｈｎｓｔｏｎ）、「寄生体由来耐性の概念−寄生体自身のゲノムからの耐性遺伝子の誘導」、セオル・パイオル（Ｔｈｅｏｒ、　Ｂｉｏｌ）、１１３．３９５〜４０５頁（１９８５）は、適当な寄生体遺伝子をクローンし、恐らくはその発現を修飾し、それを宿主ゲノム中に形質転換することにより病原性起源の遺伝子を宿主中に導入することによって特定の寄生体に対して耐性の宿主を産生する一般概念について言及している。このアプローチの特別な例として、彼らはいかにしてバクテリオファージＱβ、ＲＮＡファージの遺伝子を用いてイー・コリ（Ｅ、　ｅｏｌｉ）をＱβ感染に対して耐性とすることができるかを理論的に考察している。また、１９８６年９月２５日公開のＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ　８６１００５１４（発明者はジョンストンおよびサンフォード、前掲）は寄生体（ウィルスを包含する）から遺伝子フラグメントを単離し、それがアンチセンス方向に転写される、または遺伝子フラグメントが寄生体の本質的活性を失活できる産生物を産生ずるよう発現される、または遺伝子フラグメントが寄生体の天然結合部位と競合する結合部位として働く宿主へ遺伝子フラグメントを挿入することを特徴とする宿生体の宿主に対し対寄生体耐性を付与する方法について言及している。この出願に記載されている唯一の具体的実施例は前記したＱβファージに関するものである。

これらの文献はどれも、発現に際し、細胞および動物にＤＮＡウィルスに対する耐性を付与する、ヘルペスウィルスの如きＤＮＡウィルスの糖タンパクをコード付けする遺伝子を宿主に挿入することに言及していない。前記したすべての引用文献は遺伝子を宿主ゲノムに挿入し、それによりそれらの通常のライフサイクル間にいくらかの耐性を付与するＲＮＡウィルスまたはレトロウィルスのみに関する現実の実施例を記載する。

発明の要約本発明は発現に際し類縁のＤ　Ｎ　Ａウィルスによる感染に対して動物細胞を耐性とするＤＮＡウィルス由来の遺伝子よりなることを特徴とする遺伝子導入動物細胞に関する。

さらに詳しくは、本発明は発現に際しヘルペスウィルスによる感染に対し遺伝子導入哺乳動物細胞を耐性とするヘルペスウィルス糖タンパク遺伝子よりなることを特徴とする遺伝子導入哺乳動物細胞に関する。

さらに詳しくは、本発明は発現に際しヘルペスウィルス、好ましくは仮性狂犬病（ｐｓｅｕｄｏｒａｂｉｅｓ）ウィルスによる感染に対し遺伝子導入哺乳動物細胞を耐性とするｇｐｓｏ仮性狂犬病ウィルス遺伝子よりなることを特徴とする遺伝子導入哺乳動物細胞に関する。

また、本発明はＤＮＡウィルス由来の糖タンパク遺伝子で動物細胞を形質転換することを特徴とする該動物細胞を該Ｄ　Ｎ　Ａウィルス感染に対して耐性とする方法に関する。

発明の詳細な説明低減化をいう。従って、「耐性」はウィルスに対する宿主による感染に対する完全なおよび部分的な免疫を包含する。

本明細書中にて用いる「遺伝子導入」は非類縁生物からの遺伝子を移入され、続いてそれを維持しかつ発現する細胞をいい（例えば、動物細胞におけるウィルス遺伝子の発現）、かかる遺伝子は細胞分裂に際し後代細胞により受は継がれる。

本明細書中にて用いる「類縁ＤＮＡウィルス」はそれより遺伝子導入動物細胞を産生ずるのに用いる遺伝子が由来するＤＮＡウィルスに類縁のウィルスをいう。

「類縁」は比較的近い進化系統関係を宵すること、例えばヘルペスウィルスを意味する。

本明細書中にて用いる「哺乳動物」および哺乳類はヒトを除くすべての哺乳動物を包含する。

ヘルペスウイルス糖タンパクは当業者によく知られ、例えば単純ヘルペスウイルス−１糖タンパクＤ（ＨＳＶ−１ｇＤ）、単純ヘルペスクー１’ルＸ−２１タンパクＤ（ＨＳＶ−２ｇＤ）および仮性狂犬病ウイルス糖タンパク５　０（ＰＲＶｇｐ５０）を包含する。これらの３種の糖タンパクは同種である。ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２双方における他の単純ヘルペスウイルス糖タンパクＢ；ｇＢ％ｇＣ，ｇＥ％ｇＧ。

ｇＨおよびＬ″Ｓ７を包含する。同種ＰＲＶタンパクは最初の４種については各々ｇｎ、ｇｍ．ｇＩおよびｇＸとして、ＵＳ７についてはｇｐ６３として公知である。また、糖タンパクは水痘、サイトメガロウィルス、感染性ウシ鼻気管炎ウィルス、およびマレック病ウィルスについて公知である。他のウィルスはウシ乳頭炎ウイルス、悪性カタルウィルス、感染性喉頭気管炎ウイルス、ウマヘルペス１ウイルス、およびネコヘルペスウィルスを包含する。

本発明は動物細胞を対ウィルス感染耐性とする方法に関する。

本発明者らは仮性狂犬病ウィルス（ＰＲＶ）ｇＰ５０糖タンパクの発現を直接に指示するＤＮＡを培養において細胞に導入した。ｇｐｓｏを発現する細胞はＰＲＶおよび単純ヘルペスウィルス（ＨＳＶ）による感染に対して耐性であることが見い出された。

イー・エイ・ペトロフスキイズら（Ｅ．Ａ．　Ｐｅｔｒｏｖｓｋｉｓ　ｅｔ　ａｌ．）〜「仮性狂犬病ウィルスｇｐ５０、Ｎ−結合糖鎖形成なしの糖タンパクについての遺伝子のＤＮＡ配列」、ジャーナル・オブ・パイ口口ジー（Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、）、５９．２１６〜２３頁（１９８６）、および（１９８６年８月２８日出願のＦ’ＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ　８６１０１７６１はチャイニーズハムスター卵巣細胞におけるｇｐ５０ヌクレオチド配列およびその発現を記載している。

これら文献をともにここに参照のために挙げる。

遺伝子導入動物細胞を産生ずる方法は当業者によく知られている（シイ・ボルマン（Ｃ−Ｇ　ｏｒｍａｎ）、「晴乳動物細胞への高効率遺伝子導入」、ディーｚヌ・エイ・クローニング（Ｄ　Ｎ　Ａ　Ｃｌｏｎｉｎｇ）、２巻、ア・プラクティカル・アプローチ（Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ）、ディ・エム・グローバー（Ｄ、Ｍ、　Ｇｌｏｖｅｒ）編、アイ・アール・エル・プレス（ＩＲＬ　Ｐ　ｒｅｓｓ）、オックスフォード（１９８５）をここに参照のために挙げる）。これは細胞系レベルのみならず全動物体についても当てはまる（ビイ・ホーガンら（Ｂ、　Ｈｏｇａｎ、　ｅｔ　ａｌ、）、「マウス胚の操作−実験マニュアル（Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ　ｔｈｅ　ＭｏｕｓｅＥａ＋ｂｒｙｏ− Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ）Ｊ、コールド・スプリング・ハーバ −・ラボラトリ−（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）（１９８６）；ティ・イー・ワーグナー（Ｔ、Ｅ、　Ｗａｇｎｅｒ）、カナディアン・ジャーナル・オブ・アニマル・サイエンス（Ｃａｎ、　Ｊ　、　Ａｎｉｍ。

Ｓ　ｅｉ、）、６５．５３９〜５２頁（１９８５）、これら２つを参照のために挙げる。

実施例１細胞およびウィルスＨｅＬａ細胞はジェイ・ロス（Ｊ、　ＲＯ８Ｓ）％ライスコンシン大学、マディソン、ウィスコンシン州から得た。ブタＭＵＰＫ−１細胞［スワニイー（Ｓ％ａｎｅｙ）、アメリカン・ジャーナル・オブ・ベテリナリイ”リサーチ（Ａｍ、　Ｊ、　Ｖｅｔ、　Ｒｅｓ、）、３７：１３１９〜１３２２コはエム・ウェイセン（Ｍ、　Ｗａｔｈｅｎ）、ジ・アブプジタン・カンパニー（Ｔｈｅ　ｔＪｐｊｏｈｎ　Ｃｏ、）、カラマズー（Ｋ　ａｌａｍａｚｏｏ）、ミシガン州から得た。

これらの細胞系は１０％子ウシつ児血清を含むダルベツコ修正イーグル培地で増殖させた。Ｇ−４１８硫酸塩（ジブコ（Ｇ　１ｂｅｏ））をネオマイシン耐性誘導体の増殖用に３００μｇ／ｍＱで加えた。チャる（ペトロフスキイズ；（（Ｐｅｔｒｏｖｓｋｉｓ％ｅｔ　ａｌ、）、前ｍ）ｅ　Ｐ　ＲＶを増殖させるためのベロ（Ｖｅｒｏ）ａ胞の使用は以前に記載されている。

リーら（Ｒｅａ、　ｅｔ　ａｌ、）、ジャーナル・オブ・パイロロジー（Ｊ。

Ｖｉｒｏｌ、）、５４：２１〜２９（１９８５）をここに参照のために挙げる。

ＰＲＶのライス（Ｒｉｃｅ）株はディ・ビイ・グスタフソン（Ｄ、Ｐ。

Ｇ　ｕｓｔａｆｓｏｎ）、プルデ４　（Ｐｕｒｄｕｅ）大学、ラフアイエツト（Ｌ　ａｆａｙｅｔｔｅ）、インディアナ州から得た。ＰＲＶのＨＲ株の単離は以前に記載されている（ベトロフスキイズ（（Ｐｅｔｒｏｖｓｋｉｓ、　ｅｔ　ａｌ、）、前掲）。

ＨｅＬａ細胞およびＨｅＬａ誘導体細胞の感染は、前記ベロ細胞の感染について記載されている如く、１％子ウつ飴児血清を含む培地１９９　（Ｇ　１ｂｃｏ））におけるものであった。ウィルスは感染フラスコを凍結し、解凍し、等容量の滅菌乳汁を加え、軽く超音波処理することによって得た。培地１９９中での希釈およびベロ細胞の単層上での希釈体の平板培養によってウィルスの力価を測定した。単純ヘルペスウィルス株Ｈ３Ｖ−１はＰＲＶについてと同様にベロ細胞中で増殖させた。ＢＳＶ−１のＦ子株はシカゴ大学のビイ・ロイラマン（Ｂ、　Ｒｏｉｚｓａｎ）により提供された。該Ｆτ株は３７°において増殖するのに適応するＨＳＶ−Ｉ　Ｆの誘導体（ＡＴＣＣＶＲ−７３３）すべてのＤＮＡ組換法はここに参照のために挙げる例えばマニアナイスら（Ｍａｎｉａｔｉｓ％ｅｔ　ａｌ、）、モレキュラー・クローニングーア・ラボラトリ−・マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ−ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ）、（１９８２）に記載されている標準法によって行った。ＰＲＶｇｐ５０遺伝子の単離、特性付けおよび発現は以前に記載されている（ＰＣＴ出願、ｐｃＴ／ＵＳ　８６１０１７６１、前掲、およびペトロフスキイズら（Ｐｅｔｒｏｖｓｋｉｓ、　ｅｔ　ａｌ、、前掲）、プラスミドＰＮＩＥ５０ＰＡを組立てるために、ｐＳ　Ｖ　２　ｄｈｆｒノ代りにプラスミドｐｓＶ２ｎｅｏ（ＡＴＣＣＮｏ、３７１４９）で置き換えた。

プラスミドｐＮＩＥ５０ＰＡは各々の他の点においてプラスミドＰＤＩＥ５０ＰＡと同一である（ベトロフスキイズら（Ｐ　ｅｔｒｏｖｓｋｉｓ。

ｅｔ　ａｌ、）、前掲）。

トランスフェクシタンサケ精子担体ＤＮＡでのリン酸カルシウム共沈法によってプラスミドｐＮＩＥ５０ＰＡをＨｅＬａ細胞およびＭ　ＶＰＫ細胞に導入した（グラハムおよびファン・デル・ニブ（Ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｅｂ）、パイロロジー（Ｖ　ｉｒｏｌｏｇｙ）、５２．４５６〜６７頁）。）　ランス７　ｓ　り）　Ｌｔ＝細胞を、ｌＯ％子ウシつ児血清および３００μｓ／ｍｆｆＧ　−４１８５！酸塩を含むダルベツコ修正イーグル培地で選択した。以前に記載されている如くにプラスミドｐＮＩＥ５０ＴＰＡをＨｅＬａ細胞およびＭＶＰＫ細胞に導入した（出願ＰＣＴ／ＵＳ　８６１０１７６１およびベトロフスキイズら（Ｐｅｔｒｏｖｓｋｉｓ、　ｅｔ　ａｌ、）、前掲）。

抗体および蛋白分析ｇｐｓｏと反応する単クローン抗体３Ａ−４の単離は以前に記載されている（ペトロフスキイズら（Ｐｅｔｒｏｖｓｋｉｓ、　ｅｔ　ａｌ、）、前掲：１９８６年１２月１９日出願の特許出願Ｐ　ＣＴ／ＵＳ　８６１０２８０９）。

ｇｐ５０と反応する多クローン抗血清はｇｐ５０遺伝子を発現するワクシニアウィルス組換体でＣＦ−１マウスを免疫することによって単離した（出ＩＪＰｃＴ／ＵＳ８６１０１７６１）。以前に記載されている如くにトランスフェクトされたＨｅＬａおよびＣＨＯＥＢ胞抽出物を３Ａ−４で免疫沈殿を行った（ベトロフスキイズら（Ｐ　ｅｔｒｏｖｓｋｉｓｓｅｔ　ａｌ、前掲）ｅ　ｇｌ）ｓ　Ｏを発現する細胞を選択するために対ｇｐ５０多クローン抗血清を用いるウェスタンプロット法（トウビンら（Ｔｏ＊ｂｉｎ　ｅｔ　ａｌ、）、プロシーディングズ・才ブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、）ＬＪＳＡ。

７６．４３５０〜５４頁（１９７９））によって、トランスフェクトされたＭ　Ｖ　Ｐ　Ｋ細胞抽出物を調べ１こ。

前記の如くしてｇｐ５０を発現するいくつかのＨｅＬａ細胞系を産生じた。かく産生じたｌの細胞系、ｇＩ）５　ｏ　ＨｅＬａ　−９をいくつかのＰＲＶ株およびＨＳＶ　Ｆ＋によって感染した。第１表に示す如く、得られたウィルスの力価は、ＰＲＶで感染したｇｐ５０ＨｅＬａ−９において１〜２桁小さく、ＨＳＶ　Ｆ＋で感染したｇｐ５０　ＨｅＬａ　−９細胞において少なくとも４桁小さい。

第１表ヘルペスウィルスでの感染に対するｇｐ５０ＨｅＬａ−９細胞系の耐性ウィルス　　　　Ｍ　０１　　　　　細胞　　　　　　　力価８ＰＲＶライス　　０．１　　　ｇｐ５０ＨｅＬａ−９５，Ｏｘｌ　Ｏ’ＨｅＬａ　　　　　４．５Ｘ１０＠ＰＲＶＨＲＯ，１ｇｐ５０ＨｅＬａ−９２，６Ｘ１０’ＨｅＬａ　　　　　１．３ｘｌＯ’ ＨＳＶ　Ｆ＋　　　　０．１　　ｇｐ５０ＨｅＬａ−９≦１０’ＨｅＬａ　　　　　２．４Ｘ１０” ＰＲＶ　ライス　０．０１　ｇＰ５０ＨｅＬａ−９１，２ｘｌＯ’ＨｅＬａ　　　　　ｓ、ｏｘｔｏ’ ＰＲＶ　ＨＲＯ，０１ｇｐ５０ＨｅＬａ−９≦１０４ＨｅＬａ　　　　　２．５Ｘ１０＠ＨＳＶ　Ｆ＋　　　０．０１　ｇｐ５０ＨｅＬａ−９≦１０’”ＰＦＵ／ｍｆｆ第２表は非形質転換ＨｅＬａ細胞および非ウィルス性ポリペプチド、ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）を発現するＨｅＬａ細胞と比較してＨＳＶおよびＰＲＶによる感染に対するｇｐｓｏを発現する他のＨｅＬａ細胞系の耐性経過を示す。

第２表感染に対するｇｐ５０発現Ｈ発現ＨｅＬａ細胞性経過８感染後の日数細胞　　　　　　　　　　２　　　　　３　　　　　４実験；：１−ＨＳＶ　　Ｆ＋で（７）感染（ＭＯＩ＝０．００１）ＨｅＬａ　　　　　　　６．７Ｘ１０ ’　　１．５ｘｌＯ’　　１．ｌＸ１０’ｂＧＨＨｅＬａ　　　　１．８ｘｌＯ＠　２．ｌＸ１０’　　１．８ｘｌＯ’ｇｐ５０ＨｅＬａ−≦１０３　　　≦１０’　　　　≦１０”ｇｐ５０ＨｅＬａ−≦１０３　　　≦１０”　　　　≦１０”実験３２−ＰＲＶ　　ＨＲでの感染（ＭＯＩ　＝０．００１）ＨｅＬａ　　　　　　　　４．８Ｘ１０’　　４．６ｘｌＯ’　　３．ｌＸ１０’ｂＧＨＨｅＬａ　　　　２．９ｘｌＯ”　　４．１ｘｌＯ’　　９．３ＸＩＯ’ｇｐ５０ＨｅＬａ−≦ｌＯ≦１０　　　　　≦１０ｇｐ５０ＨｅＬａ−≦１０　　　　　≦ １０　　　　　≦１０”ＰＦｔＪ／ｍｆｆｂｂＧＨＨｅＬａ細胞はプラスミドｐＳ　Ｖ　２　ｎｅｏにクローンされたヒトサイトメガロウィルス即時型プロモータ（１９８５年７月２６日出願の米国特許出願７５８５１７号）によって発現されるウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）ゲノムＤＮＡを含有する。

これらの結果は、親ＨｅＬａ系またはｇｐ５０以外の蛋白（例えば、ｂＧＨ）を産生ずるように形質転換され？＝ＨｅＬａ系いずれと比較しても、ｇｐ５０を発現するＨｅＬａ細胞系が耐性であることを示す。

遺伝子導入ブタ細胞が同様にヘルペス感染に対して耐性であることを証明するために、前記の如くにブタＭＶＰＫ−１細胞をｇｐ５０についての遺伝子で形質転換した。細胞系ＭＶＰＫ−２はｇｐ５０を産生する。細胞系ＭＶＰＫ−４はｐＮＩＥ５０ＰＡでのトランスフェクションに上ってＧ４１８耐性であるが、ｇｐ５０を産生しない。

ＭＶＰＫ−７はｇｐ５０を産生ずるが、ＭＶＰＫ−２よりも低レベルにおいてである。ＭＶＰＫ−ｔＰＡはｇｐ５０よりもむしろ組織プラスミノーゲンアクチベータを産生じ、やはりＧ４１８耐性である形質転換ＭＶＰＫ細胞系である。第３表より理解される如く、多量のｇｐ５０を産生するＭ　Ｖ　Ｐ　Ｋ　−２細胞はヘルペスウィルスによるひき続いての感染に対して最も耐性である。

第３表ｇｐ５０発現Ｍ　Ｖ　Ｐ　Ｋ細胞系の感染に対する耐性経過８感染後の時間／ＭＯＩ＝０．Ｏ１細胞　　　　　１８．５　　２７．５　　　４５　　　　６０Ｍ５’ＰＫ−２３，ｌＸ１０Ｓ２．３Ｘ１０’　　　１．２Ｘ１０’　　　１．０Ｘ１０”ＭＶＰＫ−４１，６ｘ　１０’　　　１．３Ｘ　１０’　　　２．５Ｘ　１０”　　　３．６Ｘ　１０’’ｔｌＶＰＫ−７１，７Ｘ１０＠２．０ｘｌＯ’　　３．７Ｘ１０”　　　７．５ｘｌＯ＠ＭＶＰＫ−ｔＰ人　　　１．６Ｘ１０＠２．３Ｘ１０’　　２．０Ｘ１０＠７．４Ｘ１０”ＰＲＶでの感染後の時間／ＭＯ！　＝０．００１ＭＶＰＫ−２１，２ｘｌＯ” ＭＶＰＫ−４１，２Ｘ１０” ＭｖＰＫ−７２，２ｘｌ　Ｏ” ＭＶＰＫ−ｔＰＡ　　　　　　　　１．８　ｘ　１０’ＰＲＶでの感染後ノ時間／ＭＯＩ＝０．１ＭＶＰＫ−２２，６ｘｔ　Ｏ＠ＭＶＰＫ−４７，Ｏｘｌ　Ｏ” ＭＶＰＫ−７６，３ｘｌ　Ｏ＠ＭＶＰＫ−ｔＰＡ　　　　　　　３．８ｘｌ　Ｏ”ＨＳＶでの５染後の時間／ＭＯＩ＝０．０１？司ＶＰＫ−２８，５Ｘ１０” ＭＶＰＫ−４１，Ｏｘｌ　Ｏ’ ＭＶＰＫ−７８，２Ｘ１０’ ＭＶＰＫ−ｔＰＡ　　　　　　　　　　１．３　Ｘ　１０’ワクシニアウイルスでの感染後の時間／ＭＯＩ＝０．０１ＭＶＰＫ−２２，６ｘｌＯ” λ４ＶＰＫ−４４，ＯＸｌ　０’ ＭＶＰＫ　−７６，Ｏｘ　１０’ ｇｐ５０遺伝子が発現されるならば、トランスフェクション、マイクロインジェクション、プロトプラスト融合等によるｇｐｓｏ遺伝子の細胞への導入はその細胞をＰＲＶ感染に対して耐性とする。前記で明らかにした如く、耐性は、ｇｐ５０産生細胞系をＰＲＶで感染し、次いで標準的なウィルス力価法によりウィルスの複製を測定することによって証明される。ｇＤ−１およびｇＤ−２の如き蛋白をコード付けする他の遺伝子を同様に用いることができる。

実施例２本実施例においては、ｇｐ５０の発現に際し、ＰＲＶｌｔ’を染に対して耐性の遺伝子導入動物の産生を記載する。

プラスミドＩ）ＭＫはマウスメタロチオネイン−Ｉ　（ＭＴ　−１）プロモータを含有しくセル（Ｃｅｌｌ）、２７．２２３〜３１頁（１９８１））、リチャード・パルミテール（Ｒ１ｃｈａｒｄ　Ｐ　ａｌｍｉｔｅｒ）博士、ワシントン大学、シアトル、ワシントン州、から入手できる。ｐＭＫをＥｃｏＲＩで切断し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端とし、ＢｇｌＩＩリンカ−を該末端に結び、次いで組立体をＢｇｌ　ＩＩで消化する。ＢｇｌＩ［消化で産生されたほぼ２ｋｂのより小さな片はメタロチオネインプロモータを含有し、アガロースゲル電気泳動によって単離する。

プラスミドｐＤ５０（国際出願Ｎｏ、ＰＣＴ／’ＵＳ　８６１０１７６１をここに参照のために挙げる）をＢａ＋ｎＨＩで切断し、かく生成した末端を細菌アルカリ性ホスファターゼを用いて脱リン酸化してフラグメント１を得る。次いで、前記からのＭＴ−１プロモータ含有フラグメントに結んでプラスミドｐＭＴ５０を得る。

プラスミドｐＭ’ｒｓｏをＥｃｏＲＩで切断してフラグメント２を得る。フラグメント２を細菌アルカリ性ホスファターゼで脱リン酸化し、出願Ｎｏ、ＰＣＴ／ＵＳ　８６１０１７６１に記載されている如くに産生じたフラグメント１２と混合してウシ成長ホルモンポリアゾニレ−ジョンシグナルを加える。得られたプラスミドをｐＭＴ５０ＰＡと呼ぶ。

ｐＭＴ５０を産生ずる好ましい別法は以下のとおりであるニブラスミドｐＤＩＥ５０ＰＡ（ベトロフスキイズら（Ｐｅｔｒｏｖｓｋｉｓ、　ｅｔ　ａｔ、、前掲）におけるＢａｍＨ１部位を破壊するために、それをＢａａ）（Ｉで切断し、ＤＮＡポリメラーゼＩ（クレノー）で平滑末端とし、再びを３片を結んで組立てる。ｐＵｃ１９（シイ・ヤニイツシューベロンら（Ｃ，Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ％ｅｔ　ａｌ、）、ジーン（Ｇｅｎｅ）、３３．１０３〜１９頁（１９８５））をＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで切断し、アガロースゲル電気泳動によって２　、７　ｋｂフラグメントを単離することによってフラグメント１、ベクター、を得る。フラグメント２、ｇｐｓｏ遺伝子の上流片はｐＤ５０をＢａ鵬Ｈ１およびＳａｌ　Ｉで切断し、アガロースゲル電気泳動によって０　、５　ｋｂフラグメントを単離することによって得る。フラグメント３、ウシ成長ホルモンポリアデニレーシθンシグナルに結合したｇｐｓｏ遺伝子の下流片はＰＤＩＥ５０ＦＡＸをＳａｌ　ＩおよびＥｅｏＲｌで切断し、１　、１　ｋｂフラグメントを単離することによって得る。フラグメント１，２および３を結んでプラスミドｐＴＪｃ５０ＰＡを得る。

プラスミドｐＭＫをＥｃｏＲＩで切断し、ＤＮＡポリメラーゼｌ（クレノー）で平滑末端とし、ＨｉｎｄＩ［ｉリンカ−を該末端に結び、次いで組立体をＨｉｎｄＩ［［およびＢｇｌ　Ｉｆで消化する。メタロチオネインプロモータを含有するほぼ２０ｋｂのフラグメントをアガロースゲル電気泳動によって単離する。

プラスミドｐＵｃ５０ＰＡをＢａａＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断し、アガロースゲル電気泳動によって３　、５　ｋｂフラグメントを単離する。

前記からのＭＴ−１プロモータフラグメントをこのフラグメントに結んでプラスミドｐＭＴ５０ＰＡを得る。

ホーガンら（Ｈｏｇａｎ、　ｅｔ　ａｌ、）、前掲、によって記載されている如くマイクロインジェクションによりプラスミドｐＭＴ５０ＰＡをマウス胚に入れる。ＭＴ−１プロモータは多くの異なる組織において発現され、かつその組織は異なる動物において特異的に変化するので（バルミテールおよびプリンスター（Ｐａｌｍｉｔｅｒ　ａｎｄ　Ｂｒ１ｎｓｔｅｒ）、アニ・レブ・ジェネト（Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、　Ｇｅｎｅｔ、）、２０．４６５〜９９頁（１９８６）によって総括されている）、組織がＰＲＶ耐性を特異的に生じるものを見い出すための遺伝子導入子孫をスクリーニングする必要がある。

同様の組立体を他のプロモータで作成することができる。例えば、異なる組織分布を得るためにヒトメタロチオネインプロモータを用いることができる（ネイチ＋　　（Ｎ　ａｔｕｒｅ）、３２５．４１２〜１６（１９８７）。

ハンマーら（Ｈａｍｍｅｒ、　ｅｔ　ａｌ、）、ネイチ＋−（Ｎａｔｕｒｅ）、３１５．６８０〜８３頁（１９８５）によって記載されている如く、ブタを包含する遺伝子尋人家畜動物を産生ずるために同様のマイクロインジェクション技術を用いることができる。

□、−−−＝　　ＰＣ？！’ＪＳ　　２Ｂ１００４９１国際調査報告

Claims

【特許請求の範囲】

１．その遺伝子が発現に際して動物細胞を類縁のＤＮＡウイルスによる感染に対して耐性とするＤＮＡウイルス由来の遺伝子よりなることを特徴とする遺伝子導入動物細胞。
２．該動物細胞が、発現に際して遺伝子導入哺乳動物細胞をヘルペスウイルスによる感染に対して耐性とするヘルペスウイルス糖タンパク遺伝子よりなる遺伝子導入哺乳動物細胞である請求の範囲第１項記載の遺伝子導入動物細胞。
３．該糖タンパクがＨＳＶ−ｌｇＤ、ＨＳＶ−２ｇＤおよびＰＲＶｇｐ５０よりなる群から選択される請求の範囲第２項記載の遺伝子導入動物細胞。
４．ｇｐ５０仮性狂犬病ウイルス遺伝子よりなる請求の範囲第２項記載の遺伝子導入哺乳動物細胞。
５．細胞がそれに対し耐性なヘルペスウイルスが仮性狂犬病ウイルスである請求の範囲第４項記載の遺伝子導入哺乳動物細胞。
６．その遺伝子が動物細胞による発現に際して該動物細胞をＤＮＡウイルスによる感染に対して耐性とするＤＮＡウイルス由来の遺伝子で該細胞を形質転換することを特徴とする動物細胞をＤＮＡウイルス感染に対して耐性とする方法。
７．該ウイルスがヘルペスウイルスであって、該動物細胞を該ヘルペスウイルス由来の糖タンパク遺伝子で形質転換する請求の範囲第６項記載の方法。
８．該ヘルペスウイルスが仮性狂犬病ウイルスであって、該糖タンパクがｇｐ５０である請求の範囲第７項記載の方法。
９．その遺伝子が発現に際して動物を類縁ＤＮＡウイルスによる感染に対して耐性とするＤＮＡウイルス由来の遺伝子よりなることを特徴とする遺伝子導入非ヒト動物。
１０．該動物が、その遺伝子が発現に際して遺伝子導入哺乳動物をヘルペスウイルスによる感染に対して耐性とするヘルペスウイルス糖タンパク遺伝子よりなる遺伝子導入哺乳動物である請求の範囲第９項記載の遺伝子導入非ヒト動物。
１１．該糖タンパクがＨＳＶ−１ｇＤ、ＨＳＶ−２ｇＤ、ＰＲＶｇＰ５０よりなる群から選択される請求の範囲第１０項記載の遺伝子導入動物。
１２．発現に際して遺伝子導入哺乳動物をヘルペスウイルスによる感染に対して耐性とするｇＰ５０仮性狂犬病ウイルス遺伝子よりなる請求の範囲第１０項記載の遺伝子導入哺乳動物。
１３．それに対して細胞が耐性であるヘルペスウイルスが仮性狂犬病ウイルスである請求の範囲第１２項記載の遺伝子導入哺乳動物。
１４．その遺伝子が動物による発現に際して該動物を感染に対して耐性とするＤＮＡウイルス由来の遺伝子で該動物を形質転換することを特徴とする動物をＤＮＡウイルス感染に対して耐性とする方法。
１５．該ウイルスがヘルペスウイルスであって、該動物を該ヘルペスウイルス由来の糖タンパク遺伝子で形質転換する請求の範囲第１４項記載の方法。
１６．該ヘルペスウイルスが仮性狂犬病ウイルスであって、該糖タンパクがｇｐ５０である請求の範囲第１５項記載の方法。