NL8602422A - Recombinant-virus, antigeen peptide of eiwit, vaccin tegen verworven immuundeficientiesyndroom, vector voor recombinant-dna en eencelligen die deze vector bevatten. - Google Patents

Recombinant-virus, antigeen peptide of eiwit, vaccin tegen verworven immuundeficientiesyndroom, vector voor recombinant-dna en eencelligen die deze vector bevatten. Download PDF

Info

Publication number
NL8602422A
NL8602422A NL8602422A NL8602422A NL8602422A NL 8602422 A NL8602422 A NL 8602422A NL 8602422 A NL8602422 A NL 8602422A NL 8602422 A NL8602422 A NL 8602422A NL 8602422 A NL8602422 A NL 8602422A
Authority
NL
Netherlands
Prior art keywords
recombinant
virus
protein
peptide
lav
Prior art date
Application number
NL8602422A
Other languages
English (en)
Original Assignee
Oncogen
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Oncogen filed Critical Oncogen
Publication of NL8602422A publication Critical patent/NL8602422A/nl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10341—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/10343—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/14011—Baculoviridae
    • C12N2710/14111—Nucleopolyhedrovirus, e.g. autographa californica nucleopolyhedrovirus
    • C12N2710/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/24011—Poxviridae
    • C12N2710/24111—Orthopoxvirus, e.g. vaccinia virus, variola
    • C12N2710/24141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/24143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16111—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV env
    • C12N2740/16122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16111—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV env
    • C12N2740/16134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16211—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV gagpol
    • C12N2740/16222—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16211—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV gagpol
    • C12N2740/16234—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein

Description

-«-.i A. W? ·*"· - *·· * ~ — ·4 * τΛ· * -- > 4; ν;" "' ’ ^ ï r ·η ï ƒ ·.·*·,.
:.,.1 - .-, .- . -ϊ.-'ν .
* Recombinant-virus, antigeen pepti4e.-;-of eiwit., vaccin tegen f · .- · ;'Γ’ ' ’ verworven'”immuundeficiëntie-syndrQQmy· vector voor recombinant-· " - ,. / _ QNA en..ééncelligen. die- deza-veeter-foeva tten-i—:———-— i ' ; ΐ ,* a .·; .V.-* —-«-·- ----- «.«w.·- . :- * - * 1. Terrein---van de-uitvinding.· -? ·· - ' -' Deze^SitvSdiil^is' geHcht. op virussen tot uitdrukking komen-.-ifl-peptidenj5^^ei^itrten'-weike' VerMnf~zrj_n·' aan epitopen van het jaetL.iymphadenopathi&--geass©e-iee-:i?ée'-v±ru.s — ----- 5 (LAVj en/of menselijk T-celleukemie-virus (HTLV-III)^ denver- .... — i j oorzakers van het ij^hadenopathie-syndiroom (LAS) en_ het' ver-_____
worven irrmuundeficiêntie-syndroom. (AXDS9 . De virussen volgens i-l~ - — deze· uitvinding, welke tot-uitdrukking-ikomen ixi· »aan LAV/HTLV~III
* i · ’ * verwante peptiden die een beschermende 'immuunrespons veroorzaken, 10 kunnen dienen als immunogenen in vaccinformuleringen tegen LAS of AIDS of in polyvalente vaccinformuleringen. In feite kunnen de infectieuze virussen volgens deze uitvinding, welke zich in een gastheer vermenigvuldigen zonder daar ziekte te veroorzaken, toegepast worden in levende virus-vaccinformuleringen die een 15 lang aanhoudende stimulans kunnen zijn en tot een behoorlijke immuniteit kunnen leiden.
Deze uitvinding is ook gericht op peptiden en eiwitten die verwant zijn aan epitopen van LAV/HTLV lil welke als immunogenen kunnen dienen in vaccinformuleringen voor LAS 20 of AIDS die subeenheden bevatten, of in polyvalente vaccinformuleringen, of als antigenen bij diagnose-proeven op LAS of AIDS. Deze peptiden en eiwitten kunnen met recombinant-DNA-technieken in ieder vector-gastheer-systeem gemaakt worden of ze kunnen op chemische wijzen gesynthetiseerd worden. De uit-25 vinding is dan ook mede gericht op het opbouwen van nieuwe DNA-reeksen en vectoren, waaronder plasmide-DNA en virus-DNA, zoals menselijke virussen, dierlijke virussen, insect-virussen en baccerrcfagen, welke kunnen dienen rot de expressie van aan LAV of HTLV III verwante peptiden en eiwitten in geëigende gast-30 heercellen, uit welke de peptiden en eiwitten geïsoleerd kunnen §.öt:2.4 22 -*.·.-· ··» · * ^..Τ·"ΓΤ” · — · ·*· '· - - — .........
- 2 - Γ V -i, 7 # '# worden. Chemische methoden voor de synthese van aan LAV of HTLV III verwante peptiden en eiwitten worden hier ook beschreven.
Bij een bepaalde uitvoeringsvorm van deze uitvinding werden recombinant-koepokvirussen gebruikt om aan 5 buiten- of binnenkant van LAV/HTLV III verwante eiwitten te maken. Hiertoe werden DNA-reeksen die voor de glycoproteienen of de kernstructuureiwitten van LAV/HTLV III coderen in koepok-vectoren ingevoegd die in staat zijn de expressie van de LAV/HTLV
III-genen in een geschikte gastheer te richten. De door het 10 recombinant-koepokvirus gemaakte aan LAV/HTLV III omhulling verwante eiwitten bleken antigeen en immunogeen te zijn en in staat humoraal of door cellen beheerste immuniteit in lager dan de mens staande primaten uit te lokken. De door het recombinant-koepokvirus gemaakte en aan inwendige structuureiwitten van 15 LAV/HTLV III verwante eiwitten zijn immunoreactief en bevatten de voornaamste epitopen van de authentieke kerneiwitten.
De recombinant-koepokvirussen die de aan LAV/HTLV Ill-omhulling verwante eiwitten doen maken kunnen alleen in virus-vaccinformuleringen gebruikt worden of in combinatie met 20 koepok-recombinanten die in andere aan LAV/HTLV III verwante eiwitten tot expressie komen. Maar ook kunnen de door de recombi-nant-virussen gemaakte, aan LAV en HTLV III verwante eiwitten gezuiverd of chemisch gesynthetiseerd worden en als immunogenen in opgesplutste vaccinformuleringen dienen. Daar de aan LAV en 25 HTLV III verwante glycoproteinen in de hastheer als "vreemd" herkend zullen worden zal er een humorale en/of door cellen beheerste immuunrespons tegen dit eiwit gaan optreden. In een op de juiste wijze aangemaakte vaccinformalering zal dit de gastheer tegen latere infecties met LAV of HTLV III beschermen.
30 Bij een andere uitvoeringsvorm van de uit vinding worden recombinant-baculovirussen (kern-polyhedrose-virus van Autographa californica oftewel AcNPV) gebruikt om aan omhulling of kern van LAV/HTLV III verwante eiwitten te maken. Hiertoe worden de DNA-reeksen die voor omhulling- of kern-35 eiwitten coderen ingebouwd in baculovirus-vectoren die het tot expressie komen van de LAV/HTLV III-genen in een geëigende 8602422 Λ 1 « A.
% % / - 3 - gastheer kunnen richten. De door deze reeombinant-baculovirussen gemaakte eiwitten bleken in radioimmuun- en ELISA-tests anti-geen te zijn.
Deze uitvinding verschaft ook een werkwijze 5 voor de bereiding van LAV- en/of HTLV III-antigenen die van algemeen belang in de menselijke geneeskunde zijn. Dit omvat het gebruik van peptiden en eiwitten volgens deze uitvinding als reagentia in immuniteltsproeven, zoals de ELISA-test en in radio-immuunproeven, welke ook nuttig zijn als diagnostische hulpmid-10 delen bij het herkennen van LAV en/of HTLV III in bloedmonsters, lichaamsvloeistoffen, weefsels, enz. Bovendien zal dit reagens een waardevol hulpmiddel zijn bij het ophelderen van het mechanisme van de pathogenese van LAV en HTLV III.
2. Achtergrond van de uitvinding.
15 2.1. AIDS-virus.
Verworven immuundeficiëntie-syndroom (AIDS) is een ziekte die gekenmerkt wordt door het ontbreken van de immune afweer, voornamelijk door beschadiging'van de door cellen geregelde immuunrespons van de patiënt (M, Gottlieb c.s. en 20 J. Masur c.s. in N. Engl. J. Med. 305 (1981) resp. blz. 425 en 431). De ziekte kan zich klinisch op twee verschillende wijzen voordoen: (a) een prodoom-fase die het "Lymphadenopathie-syndroom" (LAS) genoemd wordt, gekenmerkt door chronische lymphadenopathie, leukopenie en een kwantitatieve afname van de 25 helpercellen in het perifere bloed (de 0KT4-cellen), wat tot een omslag in de verhouding tussen de normale perifere helpercellen tot onderdrukkende T-lymfocyten (OKT4:OKT8) leidt, welke bij het voortschrijden van de ziekte van 2 haar 0,1 of minder verloopt, en (b) een immunodeficiënte toestand gekenmerkt door 30 een afname van de 0KT4-cellen en een omkering van de normale verhouding ΟΚΤ4-ΟΚΓ8, een absolute lymfopenie en steeds terugkerende opportunistische infecties, voornamelijk door Pneumocystis carnii; deze laatste fase leidt in de meeste gevallen tot de dood. In sommige gevallen is er een verhoogd 35 optreden van lymfoom en Kaposi's sarcoom. Thans is er voor deze S 6 0 2 4 2 2 - 4 - t * Γΐ t' * ziekte geen genezing of therapie.
Epidemiologische gegevens en informatie betreffende het type patiënten dat de ziekte oploopt deed veronderstellen dat een door intiem contact overgebracht 5 infectieus agens de oorzaak van de ziekte zou. kunnen zijn.
Vervolgens hebben drie groepen sterke aanwijzingen verzameld dat de oorzaak van AIDS een retrovirus met een. tropisme voor helpende T-lymfocyten is. Deze groepen zijn: 10 (a) R.C. Gallo en medewerkers van het National Institute of Health waren in staat een cytopathogeen retrovirus (HTLV III) te isoleren uit patiënten met AIDS en een voorfase van AIDS (R.C. Gallo c.s. en M. Popovic c.s. in Science 224 (1984) resp. blz. 500 en 497). Ze 15 vonden ook antilichamen tegen HTLV III in het serum van patiënten met AIDS.
(b) L. Montagnier en medewerkers van het Instituut Pasteur isoleerden een T-ymfotroop retrovirus (LAV) uit een 20 patiënt met hersen-lymfadenopathie die risio van AIDS
liep (F. Barre-Sinoussi c.s. in Science 220 (1983) 868).
Deze groep slaagde er ook in antilichamen tegen LAV aan te tonen in serum van AIDS-patiënten (V.S. Kalyansraman c.s. in Science 225 (1984) 321). Bovendien konden ze 25 ook LAV isoleren uit de lymfocyten van een patiënt die AIDS opliep nadat hij bloed ontvangen had van een donor die AIDS bleek te hébben (P.M.- Feorino c.s.
30
.........A
8602422 I * - 5 - i t in Science 225 (1984) 69), (c) J. A. Levy en medewerkers isoleerden infectieuze retrovirus-sen ("met AIDS geassocieerd retrovirus" of "ARV" genoemd) uit de perifere éénkemige cellen van patiënten met AIDS 5 (J.A. Levy c.s. in Science 225 (1984) 840).
Hoewel alle drie virussen onafhankelijk van elkaar geïsoleerd werden behoren ze waarschijnlijk tot dezelfde retrovirus-subgroep (J. A. Levy c.s. in Science 225 (1984) 840), en ze zullen hierna aangeduid worden als "LAV/HTLV III".
10 De algemene structuur van retrovirussen is die van een ribonucleoproteïene-kem omgeven door een lipiden-omhulling die het virus weet te verwerven tijdens de knopvorming van de cel. De door het virus gecodeerde glycoprotelenen liggen in die omhulling en steken naar buiten uit. Zij bepalen het 15 gastheerspectrum van het virus en reageren met specifieke receptoren op het oppervlak van gevoelige cellen. Neutraliserende antilichamen worden geacht met de glycoprotelnen te binden en hun inwerking met receptoren op de celoppervlakken te blokkeren (blz. 534-535 in "The Molecular Biology of Tumor Viruses" 20 onder redactie van John Tooze, Cold Spring Harbor Laboratory (1973) en blz. 226-227 en 236-237 in "RNA Tumor Viruses" onder redactie van R. Weiss, N. Teich, H. Varmus en J. Coffin,
Cold Spring Harbor Laboratory, 1982). In het specifieke geval van LAV/HTLV III zijn er aanwijzingen dat het T4-antigeen, dat op 25 een ondergroep van T-lymfocyten aanwezig is, de receptor of een bestanddeel van de receptor voor het virus is (A.G. Dalgleish c.s. en D. Klatzmann c.s. in Nature 312 (1984) resp. blz. 763 en 767).
Het HNA-genoom van LAV/HTLV III is in figuur 30 1 schematisch weergegeven. Drie genen vallen er in het algemeen te onderkennen: het gag-gen codeert voor de inwendige structuur-eiwitten (kemeiwitten) van het virus en definieert de voor deze groep van virussen specifieke antigenen. Het pol-gen codeert voor het omkeer-transcriptase dat bij dit virus hoort. Het 35 env-gen codeert voor de glycoprotelenen van het virus. Andere gebieden, aangeduid als sor en 31-orf, zijn gedeelten van het 3002422 ‘ r f - 6 - genoom die open af te lezen zijn; de functie van deze gebieden is tegenwoordig niet bekend.
2·.^·. Vacc,ins_. Er tegenwoordig eeji aantal methoden in gebruik voor het voorkomen en behandelen van virus-infecties.
5 Daaronder vallen vaccins die een actieve immuun-respons oproepen, en het behandelen met chemotherapeutica en behandelen met interferon .
De traditionele wijzen van vaccinbereiding omvatten het gebruik van. geïnactiveerde of verzwakte virussen.
10 Het inactiveren van het virus maakt het als biologisch agens ongevaarlijk maar vernietigt zijn immunogeniteit niet. Injectie van deze "afgedode" virusdeeltjes in een gastheer zal dan een Immuun-respons oproepen die een latere infectie met een levend cirus kan. neutraliseren. Maar een belangrijk punt van zorg bij 15 het gebruik van zulke vaccins (met geïnactiveerd virus) is de kans dat niet alle virusdeeltjes afgedood zijn. Zelfs als dat bereikt is duurt de verkregen immuniteit vaak maar kort, daar gedode virussen zich in hun gastheer niet vermenigvuldigen, en zijn meestal aanvullende immuniseringen nodig. Tenslotte kan 20 het inactiveren de virus-eiwitten veranderen waardoor ze als immunogenen minder doeltreffend worden.
"Afzwakken" noemt men de vorming van virusstammen die in wezen hun vermogen mensen ziek te maken verloren hebben. Een manier om dat te bereiken is het virus te onderwerpen 25 aan ongewone groeiomstandigheden en/of veelvuldig passeren van celkweken. Virus-mutanten worden dan uitgezocht die hun virulentie verloren hebben maar toch in staat zijn een immuun-respons op te wekken. De verzwakte virussen zijn in het algemeen goede immunogenen daar zij zich in de gastheercel inderdaad vermenig-30 vuldigen en een langdurende immuniteit oproepen. Maar er zijn verschillende problemen met het gebruik van levende vaccins, en de meest klemmende daarvan is een onvoldoende afzwakking.
Een alternatief op de genoemde methoden is het gebruik van opgesplitste vaccins. Dat betekent dat men alleen 35 immuniseert met die eiwitten die het relevante immunogene materiaal bevatten. Voor vele ingekapselde virussen bevat het door 3602422 ï" wupMUe·”’··· - 7 - % f het virus gecodeerde glycoprotexene die epitopen die het neutraliseren van antilichamen kunnen uitlokken; daartoe behoren de glyco-proteinen van het La Crosse Virus (F. Gonzalez-Scarano, R.E. Shope, C.E. Calisher en N. Nathanson in Virology 120 5 (1982) 42), het virus van de diarrhee bij pasgeboren kalveren (S. Matsuno en S. Inouye in Infection and Immunity 39 (1983) 155), Venezolaanse Paarden-encefalomyelitis-Virus (J. H. Mathews en J.T. Roehrig in J. Imm. 129 (1982) 2763, het Punta Toro-
Virus (J.M. Dalrymple, C.J. Peters, J.F. Smith en M.K. Gentry in 10 "Replication of Negative Strand Viruses" onder redactie van D.H.L. Bishop en R.W. Compans (Elsevier, New York, 1981) blz.
167), muizenleukemie-virus (R.A. Steeves, M. Strand en J.T.
August in J. Virol. _14_ (1974) 187) en muizenborstkankervirus (R.J. Massey en G. Schochetman in Virology 115 (1981) 20). Een 15 voordeel van opgesplitste vaccins is dat het irrelevante virusmateriaal er niet in voorkomt.
Vaccins worden veelal in combinatie met diverse adjuvanten toegediend. De adjuvanten dragen er toe bij een hogere en langer aanhoudende mate van immuniteit met kleinere 20 doses of met minder doses antigeen te bereiken dan als het immunogeen alleen toegediend zou zijn. Het werkingsmechanisme van het adjuvans is ingewikkeld en wordt niet helemaal doorzien.
Maar het houdt het stimuleren van phagocytose en andere werkingen van het reticuloendotheliale systeem in, alsmede een ver-25 traagde afgifte en/of afbraak van het antigeen. Voorbeelden van antigenen zijn het adjuvans van Freund (compleet of incompleet), Adjuvans 65 (met slaolie, mannide-monoöleaat en aluminium-monostearaat), het polyol "Pluronic L-121", Avridine en anorganische gelen zoals aluminiumhydroxyde-, aluminiumfosfaat- of 30 aluin-gel. Freund's adjuvans wordt niet langer in vaccinformu- leringen voor mensen toegepast omdat het een niet te metabolise- ren minerale olie bevat en kanker zou kunnen verwekken.
2.2.1. Recombinant-DNA-technieken en koepokvirus.
-üeL iiügycaBën. van 'recoM>in‘aftr-DNA-technieken 35 voor de bereiding van opgesplitste vaccins omvat het moleculair klonen en het in een geëigende vector tot uitdrukking laten komen van de genetische virus-informatie die voor die eiwitten 8802422 “ 8 ' % vs codeert die in de gastheer een neutraliserende respons kunnen oproepen. Alle andere genetische informatie van het virus wordt uitgesloten en alleen die eiwitten die voor het instellen van een neutraliserende respons nodig zijn worden aan de gastheer 5 aangeboden. De gastheer krijgt nooit te maken met het hele virus en loopt geen risico geïnfecteerd te worden.
Kortgeleden is er een aanpak beschreven die een goede kans maakt nuttig te zijn bij de bereiding van opgesplitste vaccins (M. Mackett, G.L. Smith en B. Moss in Proc. 10 Natl. Acad. Sci. 79 (1982) 7415-7419 en in J. Virol. 48 (1984) 857-864, D. Panicali en E. Paoletti in Proc. Natl. Acad. Sci.
79 (1982) 4927-31). Deze aanpak omvat het gebruik van koepokvirus als vector voor de expressie van vreemde in zijn genoom ingevoegde genen. Brengt men dit recombinant-koepokvirus in een 15 /-'gastheerdier dan brengt het het ingevoegde vreemde gen tot expressie en lokt daardoor een immuun-respons tegen dergelijke genen in de gastheer op. Daar levend recombinant-koepokvirus als vaccin gebruikt kan worden combineert deze aanpak de voordelen van zowel opgesplitste als van levende vaccins.
20 Koepokvirus bevat een onvertakt dubbel- strengig DNA-genoom met ongeveer 187.000 baseparen en het verdubbelt zich in het cytoplasma van geïnfecteerde cellen. Deze virussen hebben binnen hun kern een compleet enzymsysteem voor de transcriptie (waaronder enzymen voor het afsluiten, het 25 . methyleren en het polyadenyleren) dat voor de infectiviteit van het virus nodig is. DNA-reeksen die de transcriptie binnen het koepokvirus regelen (promotors) laten het inzetten van de transcriptie door koepok-RNA-polymerase toe maar niet door het RNA-polymerase van de gastheercel.
30 Expressie van vreemd DNA in recombinant- koepokvirussen vereist het aanhechten van koepok-promotors aan de DNA-reeksen van het vreemde gen die voor eiwit coderen. Plasmide-vectoren, ook wel ,,invoegvectoren,' genoemd, zijn opgebouwd om chimaere genen in koepokvirus in te brengen. Een type 35 invoegvector bestaat uit (a) een koepokvirus-promotor met een beginplaats voor de transcriptie, (b) meerdere "unieke1' klonings- 8602422 * * s % -¾ - 9 -- plaatsen voor het restrictie-endonuclease die benedenstrooms van de beginplaats voor de transcriptie liggen, waarmee het invoegen van vreemde DNA-fragmenten mogelijk wordt, (c) niet-essentieel koepokvirus-DNA (zoals het TK-gen) dat naast de promotor en de 5 kloningsplaatsen ligt, welke het invoegen van het chimaere gen in het homologe, niet-essentiële deel van het virus-genoom veroorzaakt, en (d) een bacteriële bron van verdubbeling en anti-bioticum-bestendigheid als merkpunten voor verdubbeling en selectie in E.coli. Voorbeelden van zulke vectoren zijn door .
10 MacKett beschreven (M. Mackett, G.L. Smith en B. Moss in J. Virol. 49 (1984) 857-864).
Recombinaifc-koepokvirussen ontstaan door overbrengen van bacteriële recombinant-plasmiden voor invoegen die het vreemde gen bevatten in cellen die vooraf met koepokvirus 15 geïnfecteerd waren. Homologe recombinatie vindt binnen de ge-infecteerde cellen plaats en leidt tot het invoegen van het vreemde gen in het virus-genoom. De geïnfecteerde cellen kunnen uitgezocht worden met immunologische technieken, DNA-plak-hybri-disering of genetische selectie op recombinant-virussen, welke 20 daarna geïsoleerd kunnen worden. Deze koepok-recombinanten behouden hun wezenlijke functies en hun infectiviteit en men kan er voor zorgen dat ze ongeveer 35.000 baseparen aan vreemd DNA bevatten.
Het tot expressie komen van vreemde genen kan 25 men vaststellen met enzym- of immunologische proeven (bijvoorbeeld door iimnunoprecipitatie, radioimmunoassay of met immune stippen). De ook van nature voorkomende membraan-glycoprotelenen die de met recombinant-koepokvirus geïnfecteerde cellen maken worden geglycosyleerd en kunnen naar het oppervlak van de cel 30 verplaatst worden. Hoge maten van expressie kunnen verkregen worden door sterkte promotoren te gebruiken of door meervoudige afschriften van één enkel gen te klonen.
2.2.2. Recombinant-DNA-technieken en baculovirus.
Kortgeleden is een benadering beschreven die 35 bijzonder nuttig is voor de bereiding van recombinant-eiwitten (Pennock c.s. in Mol. Cell. Biol. (1984) 399; Smith c.s. in 3 ?0 2 42 2 - 10 - 1 r ^ t- ?* J. Virol £6 (1983) 584) . Deze benadering omvat het gebruik van een baculovirus-vector voor het tot uitdrukking brengen van vreemde genen die in zijn genoom ingebouwd zijn. Bij opname in een geëigende gastheercel brengt het recombinant-baculovirus het 5 vreemde gen tot uitdrukking.
Het prototype van de baculovirus-familie is het kernpolyhydrose-virus van Autographa californica (AcNPV) . Het genoom van AcNPV bestaat uit een dubbelstrengig soort DNA van 128.000 base-paren waarvan de verschillende restrictieplaatsen 10 in kaart gebracht zijn (G.E. Smith en M.D. Summers in Virology 89 (1978) 517) : Het virus vermenigvuldigt zich in de kern van de geïnfecteerde insectencellen. Als gevolg van infectie met AcNPV van het wilde type ontstaan twee vormen van virussen: ingesloten en niet-ingesloten virusdeeltjes. De ingeslotën virusdeeltjes 15 worden omgeven door een eiwit dat veelhoekig genoemd wordt en dat gecodeerd wordt door het polyhedrine-gen (zie Virol. 131 (1983) 561-565). De ingesloten virus-deeltjes kan men in de geïnfecteerde cellen gemakkelijk met een gewone microscoop zien.
Expressie van vreemd DNA in recombinant-20 baculovirussen vergt het binden van baculovirus-promotoren voor het coderen van DNA-reeksen van het vreemde gen. Plasmide-vectoren, ook wel "inbouwvectoren" genoemd, zijn in elkaar gezet om de chimère genen in het AcNPV in te bouwen. Een type inbouwvector bestaat uit: (a) een AcNPV-promotor die de beginplaats van het 25 aflezen omvat, (b) diverse unieke restrictieplaatsen benedenstrooms van het beginpunt van het aflezen, opdat later vreemde DNA-fragmenten ingebouwd kunnen worden, (c) niet-essentieel AcNPV-DNA (zoals het polyhydrine-gen) naast de promotor en de kloningsplaatsen die het inbouwen van het chimere gen in het 30 homologe niet-essentiële gebied van het virus-genoom richten, en (d) een bacteriële aanzet voor vermenigvuldiging en antibio-ticumbestendigheid als merk voor vermenigvuldiging en selectie in Ξ. coli. Voorbeelden van zulke vectoren zijn beschreven door Miyamota c.s. in Mol. Cell. Biol. 5_ (1985) 2860.
35 Recombinant-baculovirussen worden gevormd door gezamenlijke overdracht in cellen van bacteriële plasmiden 8602422
% I
- u - die het in te bouwen gen bevatten en baculovirus-DNA. Homologe recombinatie vindt binnen de geïnfecteerde cellen plaats en leidt tot het inbouwen van het vreemde gen in het virus-genoom. Als een vreemd gen eenmaal in het polyhedrine-gen ingevoegd is 5 kunnen ingesloten virusdeeltjes niet langer gevormd worden en kunnen de ontstane recomb inant-plaques op het oog uitgezocht worden op het ontbreken van insluitingslichaampjes. De geïnfecteerde cellen kunnen ook met immunologische technieken uitgezocht worden, door DNA-plaque-hybridisering of door genetische selec-10 tie op recombinant-virussen die vervolgens geïsoleerd kunnen worden. Deze baculovirus-recombinanten behouden him wezenlijke functies en hun infectiviteit.
Expressie van een vreemd gen kan enzymatisch of met immunologische proeven vastgesteld worden (bijvoorbeeld 15 door het vormen van neerslagen, met radioimmunoassay-proeven of door immunologisch overstippen). Hoge maten van expressie kan men verkrijgen door sterke promotoren te gébruiken of door meervoudige kopieën van één enkel gen te klonen.
3. Samenvatting van de uitvinding.
20 Virussen die tot uitdrukking komen in aan de epitopen van LAV/HTLV III verwante peptiden of eiwitten zijn beschreven. De recombinant-virussen volgens deze uitvinding, die in aan LAV/HTLV XXX verwante epitopen tot uitdrukking komen kunnen geformuleerd worden tot virusvaccins voor het beschermen 25 van mensen tegen infectie met LAV/HTLV III. Bij een bepaalde uitvoeringsvorm van deze uitvinding wordt levend virus tot vaccins geformuleerd onder toepassing van infectieuze virussen die in een geïnfecteerde gastheer tot dergelijke, aan LAV/HTLV XII verwante epitopen tot uitdrukking komen maar in de gastheer geen ziekte 30 veroorzaken.
De uitvinding betreft ook peptiden en eiwitten die aan de epitopen van LAV/HTLV III verwant zijn. Die een beschermende immuunrespons uitlokken kunnen tot opgesplitste vaccins of tot polyvalente vaccins geformuleerd worden voor het 35 beschermen van mensen tegen infectie met LAV/HTLV III. Maar ook kunnen de peptiden en eiwitten volgens de uitvinding gebruikt 8602422 - 12 - * l _ ë ï worden voor diagnose-proeven op AIDS en LAS. De peptiden of eiwitten volgens de uitvinding kunnen met ieder gastheer/vector-systeem gevormd en daaruit geïsoleerd worden; hieronder vallen bijvoorbeeld celkweken van dierlijk of insecten-weefsel dat met 5 het geëigende recombinantvirus geïnfecteerd is, microörganismen zoals bacteriën.waarin de recombinant-plasmiden, cosmiden of fa-gen overgebracht zijn, en gisten die met recombinant-plasmiden omgebouwd zijn. Deze uitvinding betreft ook werkwijzen en DNA-constructies ten gebruike bij het tot expressie komen van gene-10 tische informatie die voor de epitopen van LAV/HTLV III codeert. Maar ook kunnen de peptiden en eiwitten volgens deze uitvinding chemisch gesynthetiseerd worden.
Bij bepaalde uitvoeringsvormen van deze uitvinding (nog in de voorbeelden te detailleren) worden DNA-15 reeksen die voor de omhullende glycoprotelnen of voor de kern-structuur-eiwitten van LAV/HTLV III coderen in plasmiden ingebouwd zodat een vroege koepokvirus-promotor op de 5'-plaats van het initiërende methionine-trio(ATG) van het LAV/HTLV III-gen geplaatst wordt, wat tot het opbouwen van chimaera genen leidt 20 die door koepok-DNA-reeksen voor thymidine-kinase (TK) geflankeerd worden. Deze plasmiden werden overgébracht in cellen die vooraf met koepokvirus van het wilde type geïnfecteerd waren, waardoor het chimaere LAV/HTLV III-gen met daarnaast het TK-DNA gerecombineerd kon worden met het TK-gen van het koepokvirus.
25 Men liet de cellen lyseren en de onstane virussen werden op TK cellen geplaqued. Recombinantvirussen werden uitgezocht op him vermogen tot plaquevorming op deze cellen in aanwezigheid van 5-broom-deoxyuridine en ook door DNA/DNA-hybridisering met een geëigend radioactief merk met DNA-reeksen voor LAV/HTLV III-30 omhulling of voor LAV/HTLV III-structuureiwitten. Voor hybri-disering positieve: plaques werden gezuiverd en uitgezet en de ontstane recombinantvirussen werden beproefd op hun vermogen de bedoelde omhullings- of kemstructuur-eiwitten te vormen. De door het recombinant-koepokvirus veroorzaakte aan LAV/HTLV III-35 omhulling verwante eiwitten bleken antigeen en immunogeen te zijn en in staat in onder de mens staande primaten zowel humoraal f302422 « * - 13 -
ι I
als door cellen beheerste immuniteit op te roepen. De door het recombinant-koepokvirus veroorzaakte aan LAV/HTLV III-kemstruc-tuur verwante eiwitten bleken immunoreactieve eiwitten te zijn die de voornaamste epitopen van authentieke kemeiwitten bevat-5 ten.
Bij andere specifieke uitvoeringsvormen van deze uitvinding werden DNA-reeksen van LAV/HTLV III in een plas-mide ingebouwd zodat een baculovirus-polyhedrine-promotor op de 5’-plaats ten opzichte van het initiërende methionine-trio (ATG) 10 van het LAV/HTLV Ill-gen geplaatst werd, gevolgd door poly- hedrine-DNA-reeksen aan het 3'-einde. Deze plasmiden werden toen samen met baculovirus-DNA van het wilde type in cellen overgebracht waardoor het chimaere LAV/HTLV Ill-gen met daarnaast aanvullende AcNFV-reeksen in het polyhedrine-gen van het baculo-15 virus gerecombineerd werd. Men liet de cellen lyseren en de ontstane virussen werden geplaqued. Recombinant-virus werd op het oog uitgezocht op het ontbreken van insluitingslichaampjes of door DNA/DNA-hybridisering met radioactief gemerkte monsters LAV/HTLV Ill-gen. Recombinant-plaques werden gezuiverd en uitge-20 zet en de ontstane recombinant-virussen werden door immunologische neerslagproefjes uitgezocht op hun vermogen aan LAV/HTLV III verwante eiwitten te vormen, gevolgd door analyse op poly-acrylamide-gelen met NaDS. Lysaten van geïnfecteerde cellen werden uitgezocht op hun geschiktheid in de ELISA-test er in serum 25 antilichamen tegen LAV/HTLV III mee te vinden.
4. Beschrijving van de tekeningen.
Figuur 1 is een totale weergave van de provirus-genoom-structuur van LAV/HTLV III. Gearceerde gebieden geven de open af te lezen stukken aan. Dergelijke gebieden code-30 ren voor het groepsspecifieke antigeen, het terugtranscriptase en de omhullingseiwitten, en zijn respectievelijk aangeduid als gag, pol en env. Overlappende stukjes zijn door gekruiste arcering aangegeven. De cijfers geven de nummering der base-paren vanaf de beginplaats aan waar het aflezen van het virus-DNA begint.
35 Restrictieplaatsen zijn als volgt aangegeven: Bg - BglII, Ec = EcoRI, Hn = HindlII, Kp = Kpnl en Ss = Sstl.
8602422 i 3 - 14 -
Figuur 2 geeft de nucleotiden-volgorde van het voor LAV/HTLV III specifieke gebied (EcoRI t/m SstI) in het DNA van plasmide pRS-3; het gehele gen voor de LAV/HTLV III-omhulling (nucleotiden 5766 t/m 8349) zit binnen het invoegsel 5 LAV/HTLV lil. Restrictieplaatsen die bij het opbouwen van pv-envl, pv-env2 en pv-env5 gebruikt worden, zijn aangegeven. De gehele aminozuurvolgorde die uit deze gegevens van nucleotiden volgorde af te leiden is is ook aangegeven.
Figuur 3 is een schematische weergave van 10 het in elkaar zetten van plasmiden die een deel van de DNA- reeks bevatten, welke voor het LAV/HTLV III-omhullingseiwit coderen, benedenstrooms van een koepokvirus-promotor. De voor de omhulling coderende reeks is weergegeven door .de open staaf en de koepokvirus-promotor door het geschaduwde blok. De reeks 15 nucleotiden bij het aanknooppunt van het gebied van de koepokvirus-promotor en het stuk dat voor de LAV/HTLV in-omhulling codeert is onderaan de tekening aangegeven. De onderlijnde trio's geven het veronderstelde beginpunt voor aflezen en het directe vervolg daarop aan. Merk op dat het. derde en vierde aminozuur van 20 het recombinant-pv-env2 overeenkomen met aminozuren no.'s 43 en 44 van de LAV/HTLV III-omhulling.
Figuur 4 is een schematische weergave van het in elkaar zetten van plasmiden die benedenstrooms van een koepokvirus-promotor de hele reeks voor het LAV/HTLV III-omhul-25 lingseiwit bevatten. De koepokvirus-promotor wordt door het geschaduwde blok aangegeven. Plasmide pv-env5 dat de gehele reeks bevat voor de LAV/HTLV III-omhulling werd in twee stappen opgebouwd. De 5'- en 3'-gedeelten van het coderende gedeelte werden eerst afzonderlijk in pGS20 gekloond waardoor enerzijds pv-envl 30 ontstond dat het gedeelte van het LAV/HTLV III-gen voor het amino-einde bevatte en anderzijds pv-env2 ontstond dat het LAV/HTLV III-gedeelte voor het carboxyl-einde bevatte. Deze twee gedeelten werden, zoals aangegeven, op de 3tul-plaats aan elkaar gezet.
Figuur 5 is een schematische weergave van 35 het in elkaar zetten van plasmiden die benedenstrooms van een koepokvirus-promotor het DNA bevatten dat voor de LAV/HTLV III- 3602422 « » - 15 - £ % omhulling codeert, maar zonder de transmembraan- of verankerings-reeks. Plasmide pv-env7 werd in twee stappen in elkaar gezet. Het 5’-gedeelte van pv-env5 werd in p26 ingebouwd zodat een tussen-plasmide, pv-env5/26, ontstond, dat in zich het trio TAA bevat 5 dat het aflezen doet beëindigen, zodat een afgeknot env-gen het resultaat is. Deze afgeknotte DNA-reeks die op TAA eindigde, werd toen in pG2Q ingebouwd zodat pv-env7 ontstond waarin het afgeknotte env-gen naast de koepok-DNA-reeksen voor TK stond.
Figuur 6 geeft het in elkaar zetten en 10 selecteren van reccanbinant-koepokvirussen weer. Dikgetekend is het koepokvirus-gen voor thymidinekinase (TK) . Dit TK-gen is ook in het DNA van pv-env5 aanwezig, maar in het plasmide wordt het TK-gen onderbroken door het chimaere gen dat uit de koepokvirus-promotor van 7,5K (gearceerde staaf) en het voor de LAV/HTLV III-15 omhulling coderende gebied bestaat. Nadat de cellen met koepok-virus geïnfecteerd waren werd het recombinant-plasmide, met het TK-gen dat door het LAV/HTLV III-omhullingsgen onderbroken was, in de geïnfecteerde cellen ingevoerd. Recombinaties die in TK-reeksen aan weerszijden van het chimaere gen optreden zorgen er 20 voor dat de DNA-reeks voor LAV/HTLV III-omhulling in het koepok-virus-genoom kwamen. Het recombinant-virus met het gen voor de LAV/HTLV III-omhulling dat hiervan het resultaat is is TK .
Figuur 7 is een weergave van de genoom-structuren van recombinant-koepokvirussen die het gen voor LAV/ 25 HTLV III-omhulling bevatten. Figuur 7A geeft een restrictie-enzym-analyse van koepokvirus-recombinanten v-env5 en v-env5NY, alsmede van de respectievelijke moederstammen daarvan (resp. WR en NY).
. Door het restrictie-enzym Hind III veroorzaakte DNA-fragmenten werden door elektroforese over een agarose-gel uit elkaar gehaald, 30 welk gel met ethidiumbromide gekleurd werd om de banden zichtbaar te maken. Figuur 7B is een zuidelijk vlekkenpatroon, verkregen na het op nitrocellulose overbrengen van de uit elkaar gehaalde restrictiefragmenten en het hybridiseren met een nick-vertaald monster dat specifiek voor DNA-reeksen voor LAV/HTLV ïll-omhul-35 ling is.
Figuur 8A stelt een westelijk vlekkenpatroon 8602422 ϊ ί - 16 - voor van eiwitten waarin de recombinanten uit koepokvirus en LAV/HTLV III tot uitdrukking gekomen zijn. Eiwitten van de volgende herkomsten werden met een 7-15 % gradiënt van NaDS op polyacrylamide-gel uit elkaar gehaald en elektrisch op nitro-5 cellulose-papier overgebracht: LAV/HTLV Ill-virus (LAV/HTLV III); met koepokvirus van het wilde type geïnfecteerde cellen (Wtw), niet geïnfecteerde cellen (blanco) , met recombinant-virus sen v-env2 en v-env5 geïnfecteerde cellen (resp. v-env2 en v-env5).
Met serum uit AIDS-patiënten immunoreactieve eiwitten werden 10 aangetoond met behulp van peroxydase dat 'aan antilichamen tegen menselijk IgG gekoppeld was. De produkten van het LAV/HTLV III-env-gen zijn aangeduid als gpl50, gpllQ en gp41. De molecuul-gewichten zij n. uitgedrukt in kilodaltons.
Figuur 8B geeft een westelijk vlekken-15 patroon van de eiwitten waarin de recombinanten van koepokvirus met LAV/HTLV Ill-env in twee celtypen tot uitdrukking gekomen zijn. Eiwitten die of van BSC-40- of van HeLa-cellen afkomstig waren werden door elektroforese over NaDS-polyacryl-amide-gel uit elkaar gehaald en elektrisch op nitrocellulose-20 papier overgebracht waar aè tot reactie gebracht werden met een serum-combinatie uit voor LAV/HTLV III seropositieve mensen; banen 1 en 5 zijn voor niet echt geïnfecteerde cellen, banen 2 en 6 voor cellen die met koepokvirus van het wilde type geïnfecteerd waren, banen 3 en 7 voor cellen die met v-env5 en 25 banen 4 en 8 voor cellen die met v-env2 geïnfecteerd waren. Immuno- 125
reactieve eiwitten, werden aangetoond met eiwit A dat met J
gemerkt was. De produkten van het LAV/HTLV III-env-gen zijn aangeduid als gpl50, gpllO en gp41.
Figuur 9A geeft de resultaten van een radio- 30 immunoprecipitatieanalyse van de eiwitten gevormd in cellen die of met koepokvirus van het wilde type (WTw) of met recombinant- koepokvirus (v-env2 of v-env5) geïnfecteerd waren. De eiwitten 35 werden 10-12 uur na infectie met S-methionine gemerkt. Gemerkte eiwitten in de cel-lysaten liet men of met blanco menselijk 35 serum (N) of . met serum van een AIDS-patiënt (I) reageren en de immuuncomplexen werden met eiwit A van Staphylococcus aureus neer- 8602422 - 17 - 1 » t '7 geslagen. De neergeslagen eiwitten werden door elektroforese over een polyacrylamide-gel met 15 % NaDS uit elkaar gehaald en door fluorografie gevonden. De molecuulgewichten zijn in kilodaltons opgegeven.
5 Figuur 9B geeft de resultaten van een radio- immunoprecipitatieanalyse van met ^H-glucosamine gemerkte eiwitten die gevormd waren door de koepokvirus-L&v/HTLV ill-recombinan-ten volgens deze uitvinding. HeLa-cellen werden of niet echt geïnfecteerd (banen 1 en 5), of met koepokvirus van het wilde 10 type (banen 2 en 5), met v-env5 (banen 3 en 7) of met v-env2 (banen 4 en 8), en met ^H-glucosamine gemerkt. Cel-lysaten werden of neergeslagen met normaal menselijk serum (banen 1-4) of met een serum-combinatie uit voor LAV/HTLV III seropositieve patiënten (banen 5-8) en eiwit A. De aldus neergeslagen eiwitten 15 werden op de eerder aangegeven wijze door elektroforese uit elkaar gehaald.
Figuur 9C geeft de resultaten van een ,,polsslag"-radioimmunoprecipitatieanalyse van eiwitten van de LAV/HTLV III-omhulling waarin de koepokvirus-LAV/HTLV III-recom- m 20 binanten tot expressie gekomen waren. HeLa-cellen werden geïnfecteerd met koepokvirus van het wilde type, met v-env5 of 35 v-env2, zoals aangegeven, met S-methionine gemerkt en met medium uitgewassen. Op de volgende tijdstippen werden de cellen gewassen, gelyseerd en immunologisch neergeslagen met serum uit 25 een combinatie van voor LAV/HTLV III seropositieve mensen, en daarna door elektroforese uit elkaar gehaald: 0 uur (banen 1,7, 13), 0,5 uur (banen 2, 8 en 14),.1 uur (banen 3, 9 en 15), 2 uur (banen 4, 10 en 16), 6 uur (banen 5, 11 en 17) en 12 uur 14 (banen 6, 12 en 18). Baan M was voor de met C gemerkte molecuul-30 gewicht-standaarden.
Figuur 9D geeft de resultaten van een radio-immunoprecipitatieanalyse van de aan LAV/HTLV III-omhulling verwante eiwitten gevonden in cellen en media die met de recombinant-virussen volgens de uitvinding geïnfecteerd waren. HeLa-cellen 35 werden of niet echt geïnfecteerd (baan 1) of met koepokvirus van het wilde type (baan 2), met v-env5 (baan 3) of met v-env2 (baan if), 8602422 35 - 18 - 4 i ί -¾ en met S-methionine gemerkt. De cellen werden uit het medium afgescheiden en gelyseerd. De cel-lysaten (het sediment) en het medium (de bovenstaande vloeistof) ondergingen beide immunopreci-pitatie met serum uit een combinatie van voor LAV/HTLV III sero-5 positieve mensen. De aldus neergeslagen eiwitten werden door elektroforese uit elkaar gehaald.
Figuur 9E geeft de resultaten van een radio-immunoprecipitatieanalyse van aan LAV/HTLV III-omhulling verwante eiwitten in cellen, die met de recombinant-virussen volgens 10 de uitvinding geïnfecteerd waren en van de daarbij horende media. Recombinant v-env5 omvat de hele reeks voor het coderen van de LAV/HTLV III-omhulling,· terwijl v-env7 deze reeks heeft maar zonder het transmembraan- of verankeringsgebied. HeLa-cellen werden of niet echt geïnfecteerd (baan 1) of met koepokvirus van 15 het wilde type (baan 2), met v-env5 (baan 3) of met v-env7 35 (baan 4) en met S-methionine gemerkt. De cellen werden van het medium gescheiden en gelyseerd. De cel-lysaten (het sediment) en de bovenstaande vloeistof ondergingen beide immunoprecipita-tie met serum uit een combinatie van voor LAV/HTLV III sero-20 positieve mensen. De aldus neergeslagen eiwitten werden door elektroforese uit elkaar gehaald.
Figuur 10 geeft een westelijke vlekken-analyse van serum-monsters uit muizen die met koepok-LAV/HTLV III-recombinantvirussen geïmmuniseerd waren. Muizen werden met 25 recombinant-koepokvirus v-env5 of v-env2 geïmmuniseerd. Na 8 weken liet men serummonsters reageren met LAV/HTLV III-virus-eiwitten die door elektroforese over polyacrylamide-gel uit elkaar gehaald en elektrisch op nitrocellulose-papier overgebracht waren.. Een geiten-immunoglobuline tegen de muis dat met alkalisch fos-30 fatase gekoppeld was werd gebruikt om die LAV/HTLV m-eiwitten te vinden die door het muizenserum herkend werden. Banen a t/m e en f t/m k zijn alle voor monsters uit afzonderlijke muizen, de eerste groep beent, met v-env5 en de tweede groep met v-env2.
Als positieve en negatieve blanco's werden combinaties van serum 35 . gebruikt uit voor LAV/HTLV III seropositieve mensen (AIDS) en uit niet geïmmuniseerde muizen C57B16J (NMS). De plaatsen van de 850 2 422 - 19-- ' % 'j eiwitten van de LAV/HTLV III-omhulling zijn met gpl5Q, gpUO en gp41 aangegeven.
Figuur 11 is een histogram dat de veranderingen in het serum van rhesus-apen weergeeft welke met het recom- 5 binant-koepokvirus v-env5 gevaccineerd waren. Vier aapjes werden 8 door krassen in de huid geïnfecteerd met 2 x 10 pfu en vier met 7 7 2 x 10 pfu aan v-env5, en ter vergelijking één dier met 2 x 10 pfu aan gD-recombinant van koepokvirus met herpes simplex (v-HSVgDl). Tien weken na de eerste beënting kregen alle dieren, 3 10 uitgezonderd no. 81, een tweede beënting met 2 x 10 pfu van hetzelfde virus. Serum-monsters werden vóór het beënten (open staven), 4 weken na het eerste beënten (gearceerde staven) en 4 weken na de tweede beënting (volle staven). De verandering van het serum werd bepaald met de ELISA-test met behulp van gezuiverd 15 LAV/HTLV Ill-virus als doelantigeen.
Figuur 12 geeft een westelijke vlekken-analyse van serummonsters uit de rhesus-apen die op de voor figuur 11 beschreven wijze met recombinant-virus v-env5 geïmmuniseerd waren. Serum-monsters werden opgevangen vóór de eerste 20 beënting (banen "pre") en 4 weken na de tweede beënting. Deelmens ter s van het serum werden 50-voudig verdund en tot reactie gebracht met LAV/HTLV III-viruseiwit dat door gelelektroforese uit elkaar gehaald en op nitrocellulose-filters vastgelegd was, waarbij het protocol gericht was op een optimaal herkennen van 25 de twee omhullingsglycoprotelnen gpllO (figuur 12A) en gp41 (figuur 12B). Door de apensera herkende LAV/HTLV ni-eiwitten werden gelokaliseerd met een geiten-immunoglobuline dat tegen menselijke serum gericht en met alkalisch fosfatase gekoppeld was. Als positieve blanco dienden sera uit een combinatie van mensen 30 die voor LAV/HTLV III seropositief waren (AIDS). Authentiek LAV/ HTLV Ill-virus (AIDS) diende als blanco.
Figuur 13 geeft een westelijke vlekken-analyse van serum-monsters uit chimpansees die met v-env5NY geïmmuniseerd waren. Twee chimpansees werden intradermaal met 5 x 8 35 10 pfu aan v-env5 NY beent terwijl één dier dezelfde dosis aan v-HSVgDlNY kreeg, een gD-recombinant van koepok met herpes 8602422 £ i - 20 - simplex die uit dezelfde koepok-moederstam opgebouwd was. Alle dieren kregen 8 weken na de eerste beënting een tweede ent. Serum-monsters werden opgevangen voor het immuniseren (baan 1), 8 weken na de eerste immunisering (baan 2) en 2 weken na de twee-5 de immunisering (baan 3) . Deelmonsters van het serum werden 50-voudig verdund en tot reactie gebracht met LAV/HTLV III-virus-eiwitten die door elektroforese uit elkaar gehaald en elektrisch op nitrocellulose-filters overgebracht en daardoor vastgelegd waren, waarbij een protocol gebruikt werd dat optimaal op het vin-10 den van gp41 gericht was. Door de chimpansee-sera herkende LAV/ HTLV III-eiwitten werden gelokaliseerd met geiten-immunoglabuline dat tegen mensen serum gericht en met alkalifosfatase gekoppeld was. Combinaties van sera uit mensen die voor LAV/HTLV III seropositief waren (AIDS) diende als positieve blanco.
15 Figuur 14 geeft de nucleotiden-volgorde van het voor LAV/HTLV lil specifieke gebied (SstI t/m KpnX) in het DNA van plasmide pKS-5; het gehele gag-gen (nucleotiden no.'s 340 t/m 1835) zitten in het invoegsel. Restrictieplaatsen die bij het in elkaar zetten van pAc-gagl gebruikt werden zijn aan-20 gegeven. Ook is aangegeven de gehele aminozuur-volgorde die uit deze nucleotiden-volgorde af te leiden is.
Figuur 15 is een schematische weergave van het in elkaar zetten van het plasmide pAc-gagl dat de gehele DNA-reeks bevat nodig voor het coderen van het LAV/HTLV Ill-eiwit 25 benedenstrooms van een AcNPV-promotor. De kloningsvector pAc610 omvat nucleotide-reeksen die met de promotor van het poly-hedrine-gen overeenkomt, waaronder voorafgaande 5’-reeksen en 31-polyhedrine-reeksen onderbroken door kloningsplaatsen benedenstrooms van het beginpunt voor het aflezen. Kloningsplaatsen op 30 de 8-plaats zijn: EcoRI, SstI, Smal (Xmal), BamHI, Xbal en
Pstl. Sail, AccI en Hind II zijn niet uniek. Voor Kpnl en BglII zijn er geen plaatsen.
Figuur 16 geeft schematisch het in elkaar zetten en uitzoeken van recombinant AcNPV weer (Ac-gagl). Het 35 gearceerde blok geeft de polyhedrine-promotor en de voorafgaande 5'-reeks aan. Volgetekende blokken geven het polyhedrine-gen van 8602422 t - 21 - * ΐΐ het baculovirus aan. Delen van dit gen zijn in het DNA van plas- mide pAc-gagl aanwezig, onderbroken door een gebied dat voor LAV/ HTLV III-gag codeert (open staaf). Cellen worden tegelijkertijd getransfecteerd met het DNA dat gedeelten van het polyhedrine- 5 gen bevat, onderbroken door het LAV/HTLV III-gag-gen (pAc-gagl) en met AcNPV-DNA van het wilde type. Recombinaties die optreden in de polyhedrine-reeksen naast het chimaere gen brengen de informatie voor LAV/HTLV III-gag binnen het AcNPV-genoom.
Figuur 17 geeft een noordelijke vlekken- 10 analyse van het SNA uit Spodoptera frugiperda-cellen die met wild AcPNV en met Ac-gagl geïnfecteerd waren, waarbij voor LAV/ HTLV III-gag specifieke monstername toegepast werd.
Figuur 18 geeft de resultaten van een radio- immunoprecipitatieanalyse van eiwitten waarin het recombinant- 15 baculovirus Ac-gagl tot expressie gekomen was. Eiwitten werden 24 uur (banen 1 en 2), 48 uur (banen 3 en 4) en 72 uur (banen 35 5 en 6} na de infectie gedurende 2 uur met S-methionine gemerkt. De gemerkte eiwitten in de cel-lysaten liet men bf met blanco menselijk serum (banen. 1, 3 en 5) 'of met serum uit een 20 AIDS-patiënt (banen 2, 4 en 6) reageren, en de immuun-complexen werden neergeslagen met eiwit A van Staphylococcus aureus. De aldus neergeslagen eiwitten werden door elektroforese over een polyacrylamide-gel met 10 % NaDS uit elkaar gehaald en door fluorografie gelokaliseerd. De molecuulgewichten staan in kilo-25 daltons.
Figuur 19 geeft de resultaten van een ,,polsslag"-radioimmunoprecipitatieanalyse van de aan LAV/HTLV III-gag verwante eiwitten gevonden in cellen die met het recombinant-AcNPV van de uitvinding geïnfecteerd waren. Spodoptera frugiperda-30 cellen werden met Ac-gagl geïnfecteerd en 24 uur daarna gedurende 5 minuten gemerkt. De cellen werden dan met volledig medium gewassen en gedurende 0 uur (banen 1 en 2), 2 uur (banen 3 en 4), 4 uur (banen 5 en 6) en 8 uur (banen 7 κι 8) met compleet medium gelncubeerd. Na die tijden werden de cellen gewassen, gelyseerd 35 en tot reactie gebracht met normaal menselijk serum (banen 1, 3,
5 en 7) of met serum uit een combinatie van voor LAV/HTLV III
§602422 « * - 22 - £ i positieve mensen (banen 2, 4, 6 en 8). De· eiwitten werden door elektroforese uit elkaar gehaald.
Figuur 20 geeft schematisch het in elkaar zetten van vijf plasmiden aan, pv-gagl, pv-gag2, pv-gag3, pv-gag4 5 en pv-gag5, welke de promotor van 7,.5 Kb uit koepokvirus bevat, gekoppeld aan diverse lengten van het LAV/HTLV Ill-genoom met voor gag coderende reeksen. De bij dit in elkaar zetten gebruikte kloningsvector pGS62 is identiek met pGS20 (zie figuur 3), behalve dat het benedenstrooms van de unieke Smal-plaats van 10 pGS20 ook een unieke EcoRl-plaats heeft.
Figuur 21 geeft de resultaten van een westelijke immunovlekkenanalyse van eiwitten gevormd in cellen die geïnfecteerd waren met de recombinant-virussen v-gaglNY, v-gag2NY, v-gag3NY, v-gag4NY en v-gag5NY, de moederstam van het 15 koepokvirus v-NY of helemaal niet (blanco). Monsters van het. gezuiverde virus LAV/HTLV III dienden als positieve blanco. Samenvloeiende cellen BSC-40 werden tot een moi 10 geïnfecteerd, en 12 uur daarna werden de cellen geoogst en gelyseerd. De totale celeiwitten werden door elêktroforese uit elkaar gehaald en 20 daarna elektrisch overgebracht en aldus vastgelegd op nitrocellulose. Men liet de filters of met het serum van een AIDS-patiënt reageren (figuur 21B) of met monoklonale antilichamen uit de muis die voor gag-eiwitten p25 en pl8 specifiek waren (figuren 2lA en 21C), waarbij geiten-immunoglobuline tegen mense-25 lijk serum dat met alkalisch fosfatase gekoppeld was voor het lokaliseren diende.
Figuur 22 geeft schematisch het in elkaar zetten weer van het plasmide pAc-env5 dat de gehele reeks voor het coderen van de LAV/HTLV· III-omhulling benedenstrooms van een 30 AcNPV-polyhedrine-promotor bevat. De kloningsvector pAcSIO is hierboven bij figuur 15 reeds besproken.
Figuur 23 geeft de resultaten van een radio-immunoprecipitatieanalyse van de eiwitten gevormd in cellen die met het recombinant-baculovirus Ac-env5 geïnfecteerd waren. In 35 feite niet geïnfecteerde cellen (blanco) en de moederstam baculo-virus (AcNEV) werden als blanco's meegenomen. De door de geïnfec- 8602422 * 5 - 23 - I * teerde Spodoptera frugiperda-cellen gevormde eiwitten werden 35 28 uur na de infectie gedurende 2 uur met S-methionine gemerkt. Men liet de gemerkte eiwitten van de cel-lysaten of reageren met het serum van een AIDS-patiënt of met monoklonale antilichamen 5 uit de muis die voor gpllO en gp41 specifiek zijn, en de immuun-complexen werden met eiwit A van Staphylococcus aureus neergeslagen. De aldus neergeslagen eiwitten werden door chromatogra-fie over een polyacrylamide-gel uit elkaar gehaald en door fluoro-grafie geïdealiseerd.
10 5. Gedetailleerde beschrijving van de uitvinding.
Deze uitvinding betreft virussen die aan de epitopen van LAV/HTLV III verwante peptiden en eiwitten maken.
De uitvinding betreft ook deze peptiden en eiwitten, welke bereid kunnen worden met recombinant-DNA-methoden en door chemische 15 synthese. De virussen of peptiden en eiwitten van deze uitvinding, die een beschermende immuunrespons kunnen uitlokken, kunnen als immunogenen in diverse vaccin-formuleringen. gebruikt worden, waaronder polyvalente vaccin-formuleringen, om tegen infectie met LAV/HTLV III (de oorzaak van LAS en AIDS) te beschermen. Maar 20 ook kunnen de peptiden en eiwitten volgens de uitvinding bij de diagnose gebruikt worden als antigenen voor het herkennen van voor LAV/HTLV III specifieke antilichamen. De eiwitten of peptiden die bij de immunoassay1 s volgens deze uitvinding gebruikt worden moeten antigeen zijn (dus reageren met de antilichamen 25 van de patiënt tegen LAV/HTLV III) maar ze hoeven niet immuno- geen te zijn (d.i. een immuunrespons uitlokken). Bovendien hoeven de antigenen die bij de diagnose- immunoassay gebruikt worden in vivo geen immuunrespons op te wekken.
Bij een uitvoeringsvorm van deze uitvinding 30 worden DNA-technieken gébruikt om nucleotide-reeksen die voor LAV(HTLV III-epitopen coderen in expressievectoren in te bouwen die deze LAV/HTLV III-reeksen in geëigende gastheercellen brengen. Deze systemen van expressievector en gastheercel kunnen gebruikt worden om in vitro aan LAV/HTLV III verwante peptiden en eiwitten 35 te maken, in welk geval de gen-produkten uit de gekweekte cellen gezuiverd kunnen worden. De peptiden of eiwitten die een bescher- 8602422 f
i -I
- 24 - mende immuunrespons kunnen opwekken kunnen in opgesplitste vaccin-formuleringen als immunogenen dienen. Maar ook kunnen immunogene of slechts antigene peptiden en eiwitten volgens de uitvinding als antigenen gebruikt worden in immunoassay's bedoeld om in 5 patiënten voor LAV/HTLV III specifieke antilichamen te vinden.
Bij een alternatieve benadering voor de bereiding van de peptiden en eiwitten volgens de uitvinding kan de aminozuur-volgorde van deze peptiden en eiwitten afgeleid worden uit de nucleotiden-volgorde in de recombinanten die in antigene en/of immunogene, 10 aan LAV/HTLV III verwante peptiden en eiwitten tot expressie komen. Deze peptiden en eiwitten kunnen dan chemisch gesynthetiseerd. en (indien immunogeen) in synthetische opgesplitste vaccin-formuleringen of (indien antigeen en/of immunogeen) als antigenen in diagnose-immunoassay's, gebruikt worden.
15 Als de expressievector een virus is dat de expressie van een immunogeen richt dat aan een epitoop van LAV/HTLV III verwant is en een beschermende immuunrespons kan uitlokken dan kan de virus zelf als vaccin geformuleerd worden.
*
Infectieuze recombinant-virussen die in de gastheer geen ziekte 20 veroorzaken kunnen in levende vaccin-formuleringen benut worden om een aanzienlijke immuniteit te verwerven. Maar ook kunnen vaccins van geïnactiveerde virus bereid worden. Bovendien kunnen polyvalente vaccins met twee of meer epitopen van LAV/HTLV III of met één epitoop gebruikt worden evenals die van andere 25 ziekteverwekkers.
Uitsluitend ten behoeve van de beschrijving kan men de werkwijze volgens de uitvinding in de volgende stappen opdelen: (a). het isoleren van een gen of gen-fragment dat voor de eiwitten van het virus LAV/HTLV III codeert, (b) het 30 inbouwen van het gen of gen-fragment in een expressievector, (c) het identificeren en uitkweken van de recombinant-expressie-vector in een gastheer waarin het gen tot expressie kan komen, (d) het identificeren en zuiveren van het gen-produkt, (e) het bepalen van het immunogene vermogen van het produkt en (f) het 35 formuleren van een vaccin.
Afzonderlijk zullen nu beschreven worden het 8602422 # ·· - 25 - in elkaar zetten van recomhinant-koepokvirussen en -baculovirus-sen die het omhullingsgen van LAV/HTLV III bevatten dat in weef-selkweekcellen welke door het recombinantvirus geïnfecteerd zijn tot expressie komen in eiwitten die immunologisch aan de omhul-5 lingseiwitten van LAV/HTLV III verwant zijn. In een ander gedeelte wordt de opbouw beschreven van recombinant-koepokvirussen en -baculovirussen die het gag-gen van LAV/HTLV III bevatten die in weefselkweekcellen welke met het recombinantvirus geïnfecteerd zijn tot expressie komen in eiwitten die immunologisch verwant 10 zijn aan de kemstructuur-eiwitten van LAV/HTLV III. Maar de hier beschreven preparaten en werkwijzen zijn niet beperkt tot het opbouwen van deze aan LAV/HTLV III-omhulling of kernstructuur verwante eiwitten en men kan er in elke expressievee tor recombinanten mee opbouwen voor de bereiding van polypeptiden die 15 aan antigenen of andere oorzaken van AIDS verwant zijn.
Om de bespreking helder te houden zal deze gaan in termen van de LAV/HTLV ill-omhullings- en gag-genen. Dezelfde technieken kunnen echter op een analoge wijze toegepast worden voor het opbouwen van recombinant-expressievectoren en 20 voor het bereiden van polypeptiden die aan enig eiwit van LAV/ HTLV III verwant zijn of aan daarop gelijkende virussen. Tot deze eiwitten behoren de gen-produkten van LAV/HTLV III zoals gag, pol en env en ten minste vier aanvullende genen die tot nog toe "sor", "tat", 'S'-orf'1 en (afwisselend) "art" of "trs" genoemd 25 zijn (zie Pisher c.s. in Science 233 (1986) 655-659).
5.1. Het isoleren van genen of gen-fragmenten die voor eiwitten van LAV/HTLV III coderen.
Het isoleren van de genen van LAV/HTLV III brengt eerst het isoleren van DNA-fragmenten met zich mee die 30 de gewenste DNA-reeksen voor omhulling of kernstructuur bevatten. Zoals eerder uitgelegd heeft LAV/HTLV III een RNA-genoom, en het overeenkomstige DNA dat voor LAV/HTLV III codeert kan dus verkregen worden of a) door het uit gezuiverd LAV/HTLV III ge-isoleerde RNA met cDNA te klonen, of b) door het RNA dat uit met 35 LAV/HTLV III geïnfecteerde cellen verkregen is met cDNA te klonen of c) door genoom-DNA uit met LAV/HTLV III geïnfecteerde cellen 8602422 ί -* - 26 - te klonen. Hierna wordt voor LAV/HTLV III-genen coderend DNA aangeduid als "LAV/HTLV III-DNA".
Om LAV/HTLV III-DNA fragmenten te doen ontstaan moet LAV/HTLV III-DNA met behulp van diverse restrictie-5 enzymen op bepaalde plaatsen gesplitst worden- Maar ook kan men DNase in aanwezigheid van mangaan gebruiken om het DNA in stukken te knippen, of het DNA kan. fysisch in stukken geslagen worden, bijvoorbeeld door ultrasone trillingen. De onvertakte DNA-fragmen-ten kunnen dan met standaardtechnieken (waaronder, maar niet 10 uitsluitend, elektroforese over agarose of polyacrylamide-gel en kolomchromatografie) op grootte geklassificeerd worden.
Ieder restrictie-enzym of combinatie van restrictie-enzymen kan gebruikt worden om LAV/HTLV III-DNA-frag-menten met de gewenste reeksen te doen ontstaan, mits deze 15 enzymen de antigeniteit van het gen-produkt niet vernietigen. Bijvoorbeeld kan de antigene plaats van een eiwit uit 7 tot 14 aminozuren bestaan. Zo kan een eiwit van de grootte van de om-hullingsvoorloper (ongeveer 97.000 dalton) vele afzonderlijke antigene plaatsen hebben, misschien wel duizenden als men de over-20 lappende reeksen, de secundaire en tertiaire structuren en nabewerkingen zoals acetylering, glycosylering en fosforylering mee rekent. Daarom moeten er wel vele gedeeltelijke omhullings-DNA-reeksen voor antigene plaatsen coderen. Derhalve kunnen vele restrictie-enzym-combinaties gebruikt worden om DNA-fragmenten 25 te verkrijgen die bij inbouwen in een geëigende vector in staat zijn bepaalde aminozuur-reeksen met uiteenlopende antigene determinanten te doen ontstaan.
Als de DNA-fragmenten eenmaal gevormd zijn kan het identificeren van de specifieke DNA-fragmenten met het 30 gewenste LAV/HTLV III-gen op verschillende wijze gebeuren. In de eerste plaats is het mogelijk de DNA-fragmenten die met het gehele LAV/HTLV Ill-genoom overeenkomen op volgorde te zetten en dan het fragment te identificeren dat het omhullings-gen of de kernstructuur-gen bevat, op basis van een vergelijking van de voor-35 spelde aminozuur-volgorde met de aminozuur-volgorde van het om-hullings- of kemstructuur-eiwit. In de tweede plaats kunnen de 8602422 X ï - 27 - grote open. af te lezen stukken van 51 naar 3 * opgesteld worden. Daar de genoom-organisatie van alle tot nog toe onderzochte retrovirussen die van 5'-gag-pol-env-3r is zal het grote open af te lezen stuk dat het dichtst bij het 3'-einde ligt waar-5 schijnlijk voor de omhulling coderen terwijl het grote, open af te lezen stuk het dichtste bij het 5'-einde waarschijnlijk het gag-gen omvatten. In de derde plaats kan een waarschijnlijke identificatie van een bepaald gen gerealiseerd worden door. herkennen van de.homologie met andere bekende retrovirus-genen, 10 hetzij door nucleinezuur-hybridiseringsanalysis hetzij door vergelijken van de volgorden ais die bekend zijn.
Maar ook kan het fragment dat het omhul-lings- of het gag-gen omvat door uitkiezen van het mRNA geïdentificeerd worden. Bij die procedure worden de'LAV/HTLV III-DNA-15 fragmenten gebruikt om door hybridisering complementair mRNA te isoleren. Iramunoprecipitatieanalyse van de afleesprodukten in vitro identificeert het mRNA en daarmee de complementaire LAV/HTLV iII-DNA-fragmenten die de reeksen voor omhulling of kernstructuur bevatten. Tenslotte kan specifiek mRNA uitgezocht 20 worden door adsorptie van polysomen die uit met LAV/HTLV III
geïnfecteerde cellen geïsoleerd zijn aan geïmmobiliseerde anti-lichamen tegen omhullings- of kemstructuur-eiwitten. Een radioactief gemerkt cDNA (complementair DNA) voor omhullingseiwit kan opgebouwd worden met behulp van het gekozen mRNA (uit de ge-25 adsorbeerde polysomen) als matrix. Het radioactief gemerkte mRNA of cDNA kan dan gébruikt worden als hulpmiddel bij het identificeren van DNA-fragmenten uit LAV/HTLV III die de codering voor omhulling of kernstructuur bevatten. Andere mogelijkheden (niet uitputtend) zijn het chemisch synthetiseren van de DNA-reeks 30 zelf (mits de volgorde bekend is) en het maken van cDNA voor het mRNA dat voor omhulling of kernstructuur codeert.
Als het eenmaal geïdentificeerd en geïsoleerd is kan het DNA-fragment uit LAV/HTLV m met de van belang zijnde codering eerst ingebouwd worden in een 35 kloningsvector zoals een plasmide, dat gebruikt wordt om geëigende gastheercellen om te bouwen zodat ze DNA gaan vermenigvuldigen 8602422 t ft - 28 - -i * en er vele LAV/HTLV III-reeksen van belang ontstaan. Dit kan bereikt worden door het DNA-fragment uit LAV/HTLV UI te koppelen aan een kloningsvector die aanvullende kleverige uiteinden heeft. Maar als de complementaire restrictieplaatsen voor het opdelen van 5 het LAV/HTLV III-DNA niet in de kloningsvector aanwezig zijn kunnen de uiteinden van de DNA-moleculen gemodificeerd worden. Tot die modificatie behoren het maken van "stompe" uiteinden door het afknabbelen van enkelstrengige DNA-uiteinden of door het opvullen van de enkelstrengige uiteinden zodat die "stomp"worden.
10 Maar ook kan elke gewenste plaats gevormd worden door nucleotide-reeksen (koppelaars) aan de DNA-uiteinden te verbinden/ deze aangehechte koppelaars kunnen specifiek chemisch gesynthetiseerde oligonucleotiden omvatten die voor de reeksen coderen die als restrictieplaatsen herkend kunnen worden. Volgens nog andere 15 methoden kan de opgesplitste vector of het LAV/HTLV III-DNA-fragment door homopolymeer "aanbreien" gemodificeerd worden.
Transformeren van gastheercellen met recom-binant-DNA dat het geïsoleerde gen omvat, met cDNA of met een gesynthetiseerde DNA-reeks maakt het ontstaan van meerdere kopieën 20 van het gen mogelijk. Aldus kan het gen in grote hoeveelheden verkregen worden door transformanten te kweken, het recombinant-DNA uit de transformanten te- isoleren en, indien nodig, het ingevoegde gen uit het geïsoleerde recombinant-DNA op te zoeken.
Als het uiteindelijke doel is het gen in 25 virus-expressie-vectoren zoals koepokvirus of adenovirus in te bouwen kan het recombinant-DNA dat het LAV/HTLV III-gen omvat gemodificeerd worden zodat het gen geflankeerd wordt door stukken virus die de genetische recombinatie in met cellen geïnfecteerd virus mogelijk maken zodat het gen in het virus-genoom ingebouwd 30 kan worden.
Het gehele LAV/HTLV III-genoom is gekloond en op volgorde gesteld door S. Wain-Hobson c.s. in Cell 40_ (1985) 9. Een kloon, aangeduid als lambda J19, bevatte een DNA-fragment van 9200 base-paren van een LAV/HTLV Ill-genoomreeks die op de 35 Hind ΙΙΙ-plaats van lambda L 47,1 ingevoegd was.
Een bijzonder nuttige subkloon van lambda 8602422 % -29-.
f > J19 met het omhullingsgen van LAV/HTLV III is pRS-3 bestaande uit 3840 base-paren tussen EcoRI en Sstl van de nucleotiden-reeks uit LAV/HTLV III, dat op de EcoRI- en Sstl-plaatsen van pUCl8 ingevoegd is- Het in pRS-3 aanwezige voor LAV/HTLV III 5 specifieke DNA ligt tussen de EcoRI-plaats bij nucleotide no.
5289 en de Sstl-plaats bij nucleotide no- 9129 van het LAV/HTLV ΙΙΙ-genoom (S. Wain-Hobson c.s- in Cell 40. (1985) 9),. zie figuur 2 dat de in pRS-3 aanwezige nucleotidenreeks van LAV/HTLV III afbeeldt. Echter kunnen, door het degenereren van de nucleo-10 tide-codering, andere DNA-volgorden die in wezen dezelfde amino-zuur-volgorde veroorzaken (zoals in figuur 2 aangegeven) in de praktijk van deze uitvinding gebruikt worden voor het klonen van het omhullingsgen van LAV/HTLV III. Hieronder vallen (niet uitputtend) nucleotide-volgorden die de hele nucleotiden-reeks van 15 figuur 2 of gedeelten daarvan omvatten, veranderd door vervanging van codons door andere die hetzelfde of een functioneel gelijkwaardig aminozuur binnen die reeks bepalen (bijvoorbeeld een aminozuur met dezelfde polariteit), wat een "stille" verandering geeft.
20 Bijzonder nuttige subklonen van lambda J19 met het LAV/HTLV III-gag-gen.zijn pKs-5 en pSS-5, Het plasmide pKS-5 is een LAV/HTLV Ill-fragment van 3148 base-paren tussen Sstl en Kpnl in pUCl8. Het in pKS-5 aanwezige, voor LAV/HTLV III specifieke DNA ligt tussen de plaats Sstl bij nucleotide no.
25 224 en de kPnl-plaats bij nucleotide no. 3372 van het LAV/HTLV
ΙΙΙ-genoom. Het plasmide pSS-5 is een LAV/HTLV Ill-fragment van 5100 base-paren in pUC 18. Het voor LAV/HTLV III specifieke DNA ligt in pSS-5 tussen de Sstl-plaats bij nucleotide no. 224 en de Sall-plaats bij nucleotide no. 5331 van het LAV/HTLV III-30 genoom (nogmaals S. Wain-Hdbson, loc. cit.) zie figuur 14 dat de in pKS-5 en PSS-5 aanwezige LAV/HTLV Iïl-nucleotïde-reeks afbeeldt. Maar door het degenereren van de nucleotide-codering kunnen andere DNA-reeksen die in wezen voor dezelfde, in figuur 14 aangegeven, aminozuur—volgorde coderen in de praktijk van de uitvinding toege- 8602422 * t - 30 - past worden voor het klonen van het gag-gen van LAV/HTLV III. Hieronder vallen (niet uitputtend) de nucleotide-reeksen die de gehele nucleotiden-reeks van figuur 14 of gedeelten daarvan omvatten die veranderd zijn door één of meer codonen te vervangen door 5 andere die voor het zelfde of een functioneel gelijkwaardig aminozuur binnen die reeks coderen (bijvoorbeeld voor een aminozuur van dezelfde polariteit) wat een "stille" verandering geeft.
5.2'. Inbouwen van het DNA in de expressievectoren.
De nucleotidenreeks die voor een LAV/HTLV 10 III-eiwit zoals een omhulling/ een kernstructuur of een deel daarvan, codeert wordt in een geëigende expressievector ingebouwd, d.i. een vector die de noodzakelijke elementen voor overschrijven en vertalen van het ingebouwde stuk DNA bevat. Een verscheidenheid van gastheer/vectorsystemen kan gebruikt worden om 15 dat DNA tot expressie te brengen. Hieronder vallen (niet uitputtend) met virus (bijv. koepokvirusadenovirus, enz.) geïnfecteerde celsystemen van zoogdieren, met virussen (bijv. baculovirus) geïnfecteerde celsystemen uit insecten, microörganismen zoals gist met gistvectoren, en bacteriën die met bacteriofaag-DNA, 20 plasmide-DNA of cosmide-DNA omgebouwd zijn. De expressie-elemen- ten van deze vectoren variëren in sterkte en specificiteit. Afhankelijk van het toegepaste gastheer/vectorsysteem kan elk van een verscheidenheid van geschikte overschrijf- en vertalingselementen gebruikt worden. Bijvoorbeeld kunnen bij het klonen in zoogdier-25 celsystemen uit de genomen van zoogdiercellen geïsoleerde promotoren gebruikt worden (bijv. de metallothionien-promotor van de muis) of uit virussen die in deze cellen groeien (bijv. de 7,5 K-promotor van koepokvirus). Met recombinant-DNA of met synthetische technieken verkregen promotoren kunnen ook gebruikt 30 worden voor het aflezen van de ingevoègde reeksen.
Bepaalde beginsignalen zijn ook nodig voor een doeltreffend aflezen van de ingebouwde coderingsreeksen. Deze signalen omvatten het codon ATG en aanvullende reeksen waarmee het aflezen begint. In gevallen dat het gehele gen voor LAV/HTLV 35 Ill-omhulling of kernstructuur met eigen startcodon en aanvullende reeksen in een geëigende expressievector ingebouwd wordt 8602422 i s -31.- heeft men geen aanvullende regelsignalen nodig. Maar in die gevallen dat slechts een deel van de voor omhulling of gag coderende reeks ingevoegd wordt moet men van buitenaf voor regelsignalen zorgen, waaronder het begincodon ATG. Het startsignaal moet ver-5 der in fase met de af te lezen reeks zijn opdat aflezen van het gehele invoegsel verzekerd is. Deze regelsignalen van buitenaf kunnen van diverse herkomst zijn, zowel natuurlijk als synthetisch.
Elke eerder beschreven methode voor het in-10 bouwen van DNA-fragmenten in een vector kan toegepast worden voor het opbouwen van expressievectoren met een chimare gen dat de geëigende begin- en regelsignalen en de juiste coderingsreeks bevat. Tot die methoden behoren in vitro recombinant-technieken en synthetische technieken.
15 In de uitvoeringsvormen die in de voorbeelden van deze uitvinding beschreven zijn werden koepokvirus als expressievectoren gekozen. Maar de uitvinding is niet tot deze twee virussen beperkt. Zoals eerder uitgelegd behoren de volgende tot de bruikbare expressievectoren (geen uitputtende opsomming)? 20 menselijke en dierlijke virussen zoals koepok- en adenovirussen, insect-virussen zoals baculovirussen, gist-vectoren, bacteriofagen en plasmide- en cosmide-DNA, om er maar enkele te noemen.
In gevallen dat een adenovirus als expressie-vector gebruikt wordt wordt het LAV/HTLV III-gen aan een adeno-25 virus-complex ter regeling van overschrijven en aflezen gekoppeld, d.i. aan de promotor-reeksen en het inleidende signaal. Dit chi-maere gen wordt dan door recombineren in vitro of in vivo in het adenovirus-genoom ingebouwd. Inbouwen in een niet-essentieel deel van het virus-genoom (bijv. in gebied El of E3) leidt tot 30 een recombinant-virus dat levensvatbaar en tot expressie in de geïnfecteerde gastheer in staat is. Thans zijn er twee stammen adenovirus (typen 4 en 7) die als vaccins voor militairen goedgekeurd en in gebruik zijn. Dit zijn de eerste kandidaten voor gebruik als vectoren voor het tot expressie brengen van LAV/HTLV 35 III-genen.
Bovendien kan een gastheerstam gekozen worden 8602422 * « - 32 - die de expressie van de ingebouwde informatie moduleert of verandert en het' chimaere gen-produkt op een bepaalde wijze bewerkt. Van bepaalde promotoren kan de expressie versterkt worden door bepaalde uitlokkers (bijv. zink- en cadmiurn-ionen bij metallo-5 thionien-promotoren) . De expressie van genetisch ingebouwd LAV/ HTLV III laat zich dus regelen. Dit is belangrijk als het produkt van het gekloonde vreemde gen voor de gastheercellen dodelijk is. Verder zijn modificaties (bijv. glycosylering) en bewerking (bijv. splitsing) van de eiwitprodukten belangrijk voor de functie 10 van dat eiwit. Verschillende gastheercellen hebben na het aflezen kenmerkende en specifieke mechanismen voor het bewerken en modificeren der eiwitten. Geëigende cellijnen van gastheersysternen kunnen gekozen worden om van een juiste modificatie en bewerking van het vreemde eiwit te verzekeren.
15 In twee bepaalde uitvoeringsvormen die in de voorbeelden van deze uitvinding gedetailleerd zullen worden werden beide coderingsreeksen voor LA V/HTLV III-omhulling, zowel de complete vorm als gedeelten daarvan als reeksen voor LAV/HTLV III-kernstructuur aan de 7,5 K-promotor van koepokvirus gekoppeld tot 20 chimaere genen in diverse plasmiden. De chimaere genen waren in deze plasmiden geflankeerd door aanvullende koepokvirus-reeksen die met het TK-gen van het koepokvirus homoloog zijn. De constructie van de chimaere genen omvatte het gebruik van zowel natuurlijke als synthetische nucleotiden die controlesignalen voor over-25 schrijven en aflezen van informatie voor LAV/HTLV III-omhulling of -kernstructuur bevatten. Deze chimaere genen werden dan door in vivo recombinatie van het homologe TK-gebied op de plasmide-vector en het koepokvirus-genoom in de koepokvirus-expressievec-toren ingebouwd. Deze recombinant-virussen met hun chimaere genen 30 werden als expressieveetoren gebruikt om aan LAV/HTLV III-omhul-ling of -kernstructuur verwante eiwitten, te doen ontstaan.
Bij andere bepaalde uitvoeringsvormen die nog in de voorbeelden gedetailleerd zullen worden werden coderingsreeksen voor LAV/HTLV III-omhulling of -kernstructuur ge-35 koppeld aan de polyhedrine-promotor van het kempolyhedrose-virus van Autographa califo.rnica (AcNPV) waardoor in diverse plasmiden 8602422 * s - 33 - % > chimaere genen ontstonden, De chimaere genen werden in deze plasmiden geflankeerd door aanvullende AcNPV-reeksen. Het opbouwen van de chimaere genen omvatte het gebruik van natuurlijke nucleotiden die coderen voor controlesignalen voor overschrijven 5 en aflëzen van de LAV/BTLV Ill-reeksen voor gag of env. De chimaere genen werden toen door in vivo recombinatie van homoloog DNA van de plasmide-vector en het AcNPV-genoom in AcNPV-expressie-vectoren ingebouwd. Deze recombinant-virussen met hun chimaere genen werden als expressievectoren gebruikt voor het doen ontstaan 10 van aan LAV/HTLV IIX-omhulling of kernstructuur verwante eiwitten.
5.3. Identificeren van recombinant-expressievectoren die tot vermenigvuldiging en expressie van het ingebouwde gen in staat zijn.
Expressievectoren met vreemde gen-invoegsels 15 kunnen in het algemeen op drie verschillende wijzen geïdentificeerd worden: (a) door DNA-DNA-hybridisering, (b) door aanwezigheid of afwezigheid van bepaalde gen-functies, en (c) door expressie van de ingebouwde reeksen. Bij de eerste benadering kan de aanwezigheid van een vreemd gen in de expressievector door 20 DNA-DNA-hybridisering vastgesteld worden aan monsters die reeksen omvatten welke homoloog met het vreemde, ingebouwde gen zijn.
Bij de tweede benadering kan het systeem van recombinaxitvector en gastheer geïdentificeerd en uitgezócht worden op de aanwezigheid of afwezigheid van bepaalde merk-functies die door het 25 vreemde gen in de vector veroorzaakt worden (bijv. het optreden van thymidine-kinase, bestendigheid tegen antibiotica, omvorming van het fenotype, het optreden van insluitlichaampjes in baculovirus, enz.). Als bijvoorbeeld het LAV/HTLV III-gen binnen het merk-gebied van de vector ingebouwd wordt kunnen recom-30 binanten met dit LAV/HTLV Hl-invoegsel herkend worden aan de afwezigheid van deze merk-functie. Bij de derde benadering kunnen recombinant-expressievectoren geïdentificeerd worden door het expressieprodukt van dat vreemde gen te bepalen. Dergelijke bepalingen kunnen zich richten op de fysische, immunologische 35 of functionele eigenschappen van het gen-produkt.
Als een bepaald recombinant-DNA eenmaal ge- #602422 £ t - 34 - identificeerd en geïsoleerd is kunnen verschillende methoden gebruikt worden om het te vermenigvuldigen, er van afhankelijk of zo'n . recombinant een zelf vermenigvuldigende eenheid (een replicon) is of niet. Een eenheid die zichzelf vermenigvuldigt, bijv. een 5 plasmide, een virus, een cel, enz., kan zichzelf in de geëigende omgeving onder de goede omstandigheden vermenigvuldigen. Recombinanten die zo'n zelfvermenigvuldiging missen moeten in een structuur met zo'n eenheid ingebouwd worden om zich te kunnen vermeerderen. Bijvoorbeeld moeten bepaalde plasmide-expressievectoren bij in-10 bouwen in een gastheercel in hêt chromosoon van die cel ingebouwd worden om tot vermenigvuldiging en stabiele expressie van het recombinant-gen te komen. Als een geschikt gastheersysteem en goede kweekomstandigheden eenmaal vastgesteld zijn kunnen recom-binant-expressievectoren tot de gewenste hoeveelheden vermenigvul-15 digd en bereid worden.
Bij bepaalde uitvoeringsvormen van de uitvinding die in de voorbeelden gedetailleerd zullen worden werden chimaere genen met de informatie voor omhulling of kernstructuur van LAV/HTLV III in het TK-gen van het koepokvirus-genoom inge-20 bouwd, waardoor het virus TK werd, d.w.z. het vermogen van het virus thymidine-kinase te maken ging verloren. Dergelijke recombinanten werden uitgezocht op hun vermogen in media met 5-broom- __ψ deoxyuridine te groeien, een nucleoside-analogon dat voor TK -cellen dodelijk is maar niet voor TK -cellen. Recombinanten wer-25 den verder geïdentificeerd door DNA-DNA-hybridisering met voor . omhulling of kernstructuur van LAV/HTLV III specifieke herkenningspunten. TK -recombinant-virus werd via plaques geïsoleerd en gezuiverd. en uit geïnfecteerde weefselkweekcellen werden voorraden aangelegd.
30 Bij andere, in de voorbeelden toe te lichten bepaalde uitvoeringsvormen van de uitvinding werden chimaere genen die de informatie voor omhulling of kernstructuur van LAV/HTLV III bevatten in het polyhedrine-gen van het AcNPV-genoom ingebouwd, waarbij dat virus in een fenotype zonder insluitingslichaampjes 35 veranderd werd. Dergelijke recombinanten werden op het oog uitgezócht op de afwezigheid van ingesloten virusdeeltjes. Verder wer- 8602422 % -ï - 35 - den recombinanten geïdentificeerd door een noordelijke vlekken-analyse met voor omhulling of kernstructuur van LAV/HTLV III specifieke herkenningspunten. Recombinant-virus werd dan via plaques geïsoleerd en gezuiverd en uit geïnfecteerde weefsel-5 kweekcellen werden voorraden aangelegd.
5.4. Identificatie en zuivering van het gen-produkt.
Als een recombinant dat het LAV/HTLV III-gen tot expressie brengt eenmaal geïdentificeerd is moet het gen-produkt geanalyseerd worden. Dit kan gebeuren door bepalingen 10 op basis van fysische, immunologische of functionele eigenschappen van het produkt. Immunologische analyse is vooral van belang als het gébruik van de gen-produkten of van de recombinant-virussen die in zulke produkten tot expressie komen in vaccin-formuleringen en/of als antigenen in diagnose-immunoassay's het uiteindelijke 15 doel is.
Een verscheidenheid van antisera is beschikbaar voor het onderzoek van de immunoreactiviteit van het produkt, waaronder (geen uitputtende opsomming) het van LAS- of AIDS-patiinten afkomstige serum en polyvalente antisera tegen het 20 LAV/HTLV Ill-virus, het omhullende eiwit daarvan of de kern- eiwitten daarvan. Tot de immunogene stoffen behoren in bacterie-systemen gevormde analoga en synthetische peptiden die antigene determinanten voor de LAV/HTLV III-omhulling of -kernstructuur bevatten. Het identificeren van de peptiden en eiwitten dat hier 25 beschreven wordt berust op twee eisen. Ten eerste moet het aan LAV/HTLV III verwante eiwit alleen in met recombinant-virus geïnfecteerde cellen gevormd worden. Ten tweede moet het aan LAV/ HTLV III verwante eiwitten immunoreactief met het serum van AIDS-patiênten zijn of met een verscheidenheid van antilichamen tegen 30 de eiwitten van LAV/HTLV III-omhulling of -kernstructuur, of de analoga en derivaten daarvan.
Het eiwit moet immunoreactief zijn, of het nu het resultaat van de expressie van de gehele gen-informatie, van een deel van die informatie of van twee of meer gen-reeksen 35 is die gekoppeld zijn om tot de bereiding van versmeltingseiwit-ten te komen. Deze reactiviteit kan met standaard immunologische 66 0 2 ^ 2 2
£ I
- 36 - technieken aangetoond worden, zoals radioimmunoprecipitatie, radio immune concurrentie, en Immunovlekkenanalysis.
Als het aan LAV/HTLV III verwante eiwit eenmaal geïdentificeerd is kan het met standaard methoden gelso-5 leerd en gezuiverd, worden, waaronder chromatografie (over ionenwisselaars, over naar grootte sorterende kolommen of door affini-teitschromatografie), door centrifugeren, door verschillen in oplosbaarheid, of met iedere andere standaardtechniek voor het zuiveren van eiwitten.
10 ’ Als een immunoreactief, aan LAV/HTLV III
verwant, door een recombinant gevormd eiwit eenmaal geïdentificeerd is kan de aminozuur-volgorde van het immunoreactieve eiwit uit de nucleotiden-volgorde van het chimaere gen in de recombinant afgeleid worden. Als resultaat kan het eiwit dan gesynthe-15 tiseerd worden met. in de techniek bekende chemische standaardmethoden (zie bijv. M. Hunkapiller c.s. in. Nature 310 (1984) 105-111).
Tot deze uitvinding behoren dergelijke peptiden, of zij nu met recombinant-DNA-technieken of door chemische 20 synthese verkregen zijn, zoals afgeheeld in figuren 2 en 14, en ook gewijzigde reeksen met "stille" veranderingen waarbij sommige aminozuren door gelijkwaardige vervangen zijn. Aminozuren van dezelfde klassen kunnen onderling vervangen worden. Bijvoorbeeld zijn alanine, valine, leucine, isoleucine, proline, fenyl-25 alanine, tryptofaan en methionine,alle neutrale aminozuren met hydrofobe zijketens. Glycine, serine, threonine, cysteine, tyrosine, asparagine en glutamine zijn neutrale aminozuren met polaire zijketens. Basische aminozuren (met positieve lading) zijn arginine, lysine en histidine; zure aminozuren met negatieve 30 lading zijn asparaginezuur en glutaminezuur.
5.5. Bepaling van het immunogene vermogen van het recombinant-produkt.
Het immunogene vermogen van het aan LAV/ HTLV III verwante produkt kan bepaald worden door de immuunrespons 35 van proefdieren na immunisering met het gezuiverde eiwit of het synthetische peptide of eiwit te bepalen. In gevallen waar het 8602422 % ί - 37 - aan LAV/HTLV III verwante eiwit het produkt is van een infecti-eus recombinant-virus kan dit virus zelf gebruikt worden om de proefdieren te immuniseren. Proefdieren kunnen muizen, konijnen, chimpansees en eventueel zelfs mensen zijn. Het immunogeen kan 5 oraal, intradermaal, intramusculair, intraperitoneaal,. intraveneus, sübcutaan, intranasaal of op elke standaardwijze voor immunisering toegediend worden. De immuunrespons van de proefdieren kan met drie verschillende benaderingen bepaald worden: (a) de reactiviteit van het ontstane immune serum voor authen-10 tieke LAV/HTLV III-antigenen, met bekende technieken te bepalen (enzym-gekoppelde immunosorptie-proef (ELISA), immunovlekken-analyse, radioimmunoprecipitatie, enz.), (b) het vermogen van het immune serum in vitro LAV/HTLV III te neutraliseren (M. Robert-Guroff, Nature 316 (1985) 72-74), en (c) bescherming van de ge-15 immuniseerde dieren tegen infectie door LAV/HTLV III en/of verzwakking van de symptomen (D.P. Francis in Lancet 2_ (1984) 1276-1277; D.C. Gujdusej, Lancet _1 (1985) 55-56) .
5.6. Formulering van een vaccin.
Het is de bedoeling een vaccin te formule-20 ren waarin het immunogeen verwant is- aan een epitoop van LAV/ HTLV III en dat een recombinant-virus bevat dat een immunogeen doet ontstaan dat een beschermende respons uitlokt tegen infecties met LAV/HTLV III ter bescherming tegen LAS en AIDS. Verder kunnen polyvalente vaccin-formuleringen met meer dan één immunogene, 25 aan LAV/HTLV III verwante determinant aangemaakt worden. Tot zulke vaccins behoren die met epitopen verwant aan de LAV(HTLV III-omhulling, alleen of in combinatie met andere LAV/HTLV III-epitopen zoals die die aan de kernstructuur verwant zijn. Dergelijke polyvalente vaccins kunnen van belang zijn voor het voor-30 komen en het ontwikkelen van AIDS. Personen die vrij van symptomen zijn schijnen vaker antilichamen tegen kernstructuur-eiwitten aan te maken dan zieke patiënten, terwijl beide groepen antilichamen tegen omhullingsdeterminanten aanmaken (Science 233 (1986) 419). Bij studie is ook gebleken dat AIDS-patiënten in hun vroege, 35 symptoomvrije stadium nog antilichamen maken, zowel tegen de omhulling als tegen de structuureiwitten. Naarmate de ziekte voort- 8302422 * τ- - 38 - schrijdt en de symptomen verschijnen lopen de antilichamen tegen de kernstructuren terug terwijl die tegen de omhulling blijven (Science 233 (1986) 282). Dus kan het opnemen van aan gag verwante epitopen in vaccinformuleringen, waarvan de bereiding een 5 aspect van deze uitvinding vormt, van belang zijn voor de immuno-profylaxe en voor de immunotherapie van door LAV/HTLV III veroorzaakte ziekte.
Polyvalente vaccins kunnen geformuleerd worden zodat ze de genprodukten van LAV/HTLV III en/of van recombi-10 nant-virussen met chimaere genen bevatten. Deze kunnen ook in combinatie met andere immunogenen gebruikt worden voor het voorkomen van LAS en AIDS en andere ziekten. Voorbeelden van diverse formuleringen zullen nu gegeven worden.
5.6.1. Virusvaccin-formuleringen.
15 Vaccins kunnen zowel geformuleerd worden tegen levende als tegen geïnactiveerde recombinant-virussen.
De keuze is afhankelijk van de aard van het gebruikte recombinant-virus. Als deze voor de te immuniseren gastheer infectieus is maar geen ziekte veroorzaakt heeft een levend vaccin de voorkeur 20 omdat vermenigvuldiging in de gastheer tot een langer aanhoudende stimulans leidt, van een zelfde soort en een zelfde omvang als bij natuurlijke subklinische infecties, waarmee een langer aanhoudende immuniteit verkregen wordt. Het infectieuze recombinantvirus kan bij komst in een gastheerdier tot expressie komen in 25 aan LAV/HTLV III verwante eiwitten waardoor een immuunrespons tegen de LAV/HTLV III-antigenen gestimuleerd wordt. In het geval dat zo'n immuunrespons bescherming geeft tegen een latere uitdaging door LAV/HTLV III kan het recombinantvirus zelf als beschermend vaccin tegen· AIDS-infectie dienen. Bereiding van zo'n 30 recombinantvirus voor deze formuleringen kan zowel in vitro (met weefselkweken) als in vivo (met natuurlijke gastheren) gebeuren. Koepokvirus-recombinanten zijn in dit opzicht bijzonder nuttig. Gebruikelijke methoden voor het bereiden en formuleren van water-pokken-vaccins kunnen aangepast worden aan de formulering van 35 levende recombinantvirus-vaccins (zie bijvoorbeeld "Vaccinia Viruses and Factors for Vaccine Antigens", red. G.V. Quinnan 8602422 £ 1? - 39 - (Elsevier, 1985) biz. 109-116).
Polyvalente vaccins tegen levende virussen kunnen bereid worden uit één of enkele infectieuzé recombinant-virussen die meerdere aan LAV/HTLV III verwante epitopen tot 5 expressie laten komen. Het vaccin kan ook virussen bevatten waarmee epitopen tot expressie komen van organismen die andere ziekten veroorzaken. Bijvoorbeeld kan men een koepokvirus (dat ongeveer 35.000 base-paren aan vreemd DNA kan herbergen) zo geknutseld worden dat het informatie bevat voor zowel de omhulling 10 als voor de kernstructuren van LAV/HTLV III. Het virus kan ook voor andere epitopen dan die van LAV/HTLV III coderen. Een dergelijk recombinantvirus kan zelf als immunogeen in een polyvalent vaccin dienen. Maar ook kan een mengsel van koepok- en andere virussen, waarvan elk tot expressie van een ander gen voor uit-15 lopende epitopen van LAV/HTLV III en andere ziekte veroorzakende organismen in staat is, in een polyvalent vaccin geformuleerd worden.
Of het recombinantvirus nu infectieus voor de te immuniseren gastheer is of niet, de vaccin-formulering kan 20 geïnactiveerd zijn. Geïnactiveerde vaccins zijn "dood" in die zin dat hun infectiviteit vernietigd is, gewoonlijk door behandeling met formaldehyd. In het ideale geval is de infectiviteit van het virus vernietigd zonder invloed op de omhullingseiwitten die de immunogeniteit van het virus veroorzaken. Om een gelnac-25 tiveerd vaccin te bereiden moet men grote hoeveelheden recombinantvirus kweken om voldoende van de relevante antigenen te verkrijgen. Een mengsel van geïnactiveerde virussen die uiteenlopende epitopen tot expressie brengen kan gebruikt worden voor het formuleren van polyvalente vaccins. In sommige gevallen kan 30 dat de voorkeur hebben boven levende vaccin-formuleringen wegens de mogelijkheden van onderlinge storing der levende virussen.
In beide gevallen moet het geïnactiveerde recombinantvirus of mengsel van virussen met geschikte hulpstoffen geformuleerd worden om de immunogene respons op hun antigenen te versterken.
35 Tot de geschikte hulpstoffen behoren (niet uitputtend) anorganische gelen zoals aluminiumhydroxyde, oppervlakactieve stoffen 8502422
Jt 3- - 40 - zoals lysolecithine, de pluronic-polyolen, polyanionen, peptiden, olie-emulsies en mogelijk nuttige menselijke adjuvanten zoals BCG (bacille Calmette-Guerin) en Corynebacterium parvum.
Vele methoden kunnen gebruikt worden om de 5 hierboven beschreven vaccin-formuleringen toe te dienen; daartoe behoren orale, intradermale, intramusculaire, intraperitoneale, intraveneuze, subcutane en intranasale toedieningen. Als een levend vaccin gebruikt wordt kan het op de natuurlijke wijze van infectie toegediend worden, net als het virus van het wilde type 10 dat voor het bereiden van het recombinantvirus gebruikt was.
5.6.2. Opgesplitste vaccin-formuleringen.
Als alternatief voor virus-vaccins kan het aan LAV/HTLV III verwante eiwit zelf als immunogeen dienen in opgesplitste vaccin-formuleringen, welke polyvalent kunnen zijn.
15 Zoals eerder uitgelegd bestaan opgesplitste vaccins alleen uit het relevante immunogene materiaal dat nodig is om een gastheer te Immuniseren. De aan LAV/HTLV III verwante eiwitten kunnen dan ook gezuiverd worden uit de recombinanten waarmee de LAV/HTLV % III-epitopen tot expressie komen. Tot die recombinanten behoren 20 alle eerder beschreven celkweken met virus-infectie, bacteriële transformanten, gist-transformanten en door virussen geïnfecteerde insecten die de LAV/HTLV III-epitopen tot expressie doen komen (zie afdelingen 5.2, 5.3.en 5.4). Bij een andere uitvoeringsvorm van deze uitvinding kunnen de aan LAV/HTLV III verwante peptiden 25 en eiwitten chemisch gesynthetiseerd worden. Hiertoe kan de amino-zuur-volgorde van zo'n peptide of eiwit afgeleid worden uit de nucleotiden-volgorde van het chimaere gen dat daarin tot uitdrukking komt (zie afdeling 5.4).
Of de immunogenen uit recombinanten geïsoleerd 30 of chemisch gesynthetiseerd worden, het eindprodukt kan op een
geëigende concentratie gebracht en met alle bekende vaccin-hulp-stoffen geformuleerd en dan verpakt worden. Tot de geschikte adjuvanten behoren (geen uitputtende opsomming): anorganische gelen zoals aluminiumhydroxyde, oppervlak-actieve stoffen zoals lyso-35 lecithine, de pluronic-polyolen, polyanionen, peptiden, olie-emulsies en mogelijk nuttige menselijke adjuvanten, zoals BCG
8602422 X * - 41 - } (bacille Calmette-Guerin) en Corynebacterium parvum. Hetimmuno-geen kan ook in liposomen opgenomen worden of aan suikers en/of andere polymeren gekoppeld worden om in vaccin-formuleringen te kunnen dienen.
5 In het geval dat het aan LAV/HTLV III ver wante peptide of eiwitten een hapteen is, d.i. een molecuul dat antigeen is doordat het selectief met daarop ingestelde antilicha-men kan reageren, maar niet immunogeen doordat het geen immuun-respons kan uitlokken, kan het hapteen covalent aan een drager of 10 immunogeenmolecuul gebonden worden, bijvoorbeeld aan een groot eiwit zoals serumalbumine; dit maakt het aangekoppelde hapteen immunogeen. De combinatie hapteen-drager kan als vaccin geformuleerd worden.
5.6.3. Passieve -immuniteit en anti-idiotypische antilichamen.
15 In plaats van actief immuniseren met virus of opgesplitste vaccins kan het mogelijk zijn een gastheer kortdurende bescherming te verlenen door het toedienen van vooraf gevormde antilichamen tegen één of meer epitopen van LAV/HTLV III. De hierboven beschreven vaccin-formuleringen kunnen gebruikt wor-20 den om in passieve immunotherapie te gebruiken antilichamen te
bereiden. Menselijk immunoglobuline heeft bij humane therapie de voorkeur omdat een heteroloog immunoglobuline een immunrespons tegen zijn vreemde immunogene componenten zal uitlokken. Een dergelijke passieve immunisering kan in een noodgeval toegepast 25 worden voor de directe bescherming van niet geïmmuniseerde personen die aan speciaal risico blootstaan, bijvoorbeeld zij die met AIDS-patiënten in contact komen, bijvoorbeeld in hospitalen en andere instellingen voor gezondheidszorg. Maar ook kunnen deze antilichamen gebruikt worden voor de vorming van anti-idiotypische 30 antilichamen, welke op hun beurt als antigeen kunnen dienen voor het stimuleren van een imrauunrespons tegen epitopen van LAV/HTLV
III.
5.7. Immunoassay * s.
De aan LAV/HTLV III verwante peptiden en 35 eiwitten volgens de uitvinding kunnen gebruikt worden als anti-genen bij immunoassay’s voor het aantonen van antilichamen tegen 8602422 £ f· - 42 - LAV/HTLV III in diverse menselijke weefsels en lichaamsvloeistoffen, alsmede in bloed van bloedbanken en hospitalen. Hiertoe kunnen de antigenen volgens de uitvinding gebruikt worden in ieder eerder bekend immunoassay-systeem, waaronder (geen uitputtende 5 opsomming) de concurrerende en niet-concurrerende proefsystemen met technieken zoals radioimmunoassay, ELISA (aan enzym gekoppelde immunosorptie-proef), "sandwich"-immunoassay, precipitine-reacties, geldiffusie-precipitine-reacties, immunodiffusie-proeven, agglutineringsproeven, complement-fixeringsproeven, 10 immunoradiometrische proeven, fluorescentie-immunoassay's, immunoassay's met eiwit A en immunoelektroforese-proeven, om er maar enkele te noemen.
De immunoassay's volgens deze uitvinding kunnen gebruikt worden om bloed van bloedbanken en van patiënten 15 uit te zoeken op blootstelling aan LAV/HTLV III en om het verloop van LAS of AIDS bij behandelde patiënten te volgen. Ieder peptide of eiwit dat aan een antigeen van LAV/HTLV III verwant is kan bij de immunoassay volgens deze uitvinding dienen. Tot die k antigenen.behoren (geen uitputtende opsomming) de peptiden en 20 eiwitten die verwant zijn aan de gen-produkten van env, gag, pol en de vier aanvullende genen die tot nog toe genoemd zijn: sor, tat, 3'-orf en art (of trs). Bij een bijzondere uitvoeringsvorm van deze uitvinding kan een panel van antigenen bij een immunoassay dienen om patiënten op een profiel van antilichamen 25 tegen verschillende epitopen van LAV/HTLV III uit te zoeken.
Bij een andere uitvoeringsvorm van de uitvinding kan men patiënten die met een vaccin-formulering volgens deze uitvinding gevaccineerd zijn volgen op het dan volgende blootstaan aan LAV/HTLV lil. In zulke gevallen is het bij de immunoassay gebruikte antigeen 30 bij voorkeur een peptide of eiwit dat niet een immunogeen van het voor het vaccineren van de patiënt gébruikte vaccin was, want zulke gevaccineerde mensen zullen seropositief voor het gebruikte epi-toop zijn en dus een positieve uitslag geven ongeacht ze aan het virus blootgestaan hebben of niet. Als een patiënt bijvoorbeeld 35 gevaccineerd was met een aan de LAV/HTLV III-omhulling verwante epitoop volgens deze uitvinding moet die patiënt op infectie met S 6 0 2 4 2 2 i > - 43 - LAV/HELV III beoordeeld worden met een ander aan LAV/HTLV III verwant eiwit om de aanwezigheid van voor LAV/HTLV III specifieke antilichamen te vinden. Een patiënt die met een aan de omhulling verwant epitoop gevaccineerd is kan onderzocht worden op voor 5 LAV/HTLV Ill-kernstructuur specifieke antilichamen of op andere antigenen van LAV/EPLV III, waaronder die tegen sor en 3'-orf e.d.
Bij een andere uitvoeringsvorm kunnen de aan LAV/HTLV III verwante peptiden en eiwitten volgens de uit-10 vinding in concurrerende immunosassay1s gebruikt worden voor het aantonen en meten van door LAV/3TLV III gecodeerde eiwitten in het bloed of serum van die patiënt.
6. Voorbeeld: Koepokvirus-omhulling-recombinanten
In de nu komende voorbeelden werden diverse 15 plasmidevectoren in elkaar gezet die chimaere genen bevatten waaronder reeksen die voor de LAV/HTLV Ill-omhulling coderen benedenstrooms van het startsignaal van een koepokvirus.
Deze chimaere genen met de koepokvirus-promotor en de voor LAV/HTLV Ill-omhulling coderende informatie 20 werden door recombinatie in vivo in het genoom van koepokvirus ingebouwd. Het recombinantvirus werd geïdentificeerd en gezuiverd en uit geïnfecteerde weefselkweken werden voorraden aangelegd.
In vitro werd aangetoond dat immunoreactieve, aan LAV/HTLV III-omhulling verwante eiwitten door deze recomb inant-koepokvirussen 25 gemaakt worden. Deze recombinanten werden in proefdieren getest op hun vermogen neutraliserende of beschermende immuunresponsen op te roepen en op hun nut als vaccin tegen AIDS. Een gedetailleerde beschrijving van elke stap van deze uitvoeringsvorm komt nu.
6.1. Algemene procedure.
30 6.1.1. Cellen en virussen.
Niercellen van de Afrikaanse groene aap (stam BSC-40, een continue lijn afkomstig van de cellen BSC-1, ATCC no. CCL26) werden verkregen van R. Condit (Associate Professor, Afd. Biochemie van de Staat-Universiteit van New York, 35 Buffalo, N.Y.) en werden voortgekweekt in het door Dulbecco gemodificeerde medium van Eagle (DMEM, Gibco, Grand Island, N.Y.) 8602422 * ï - 44 - aangevuld met 10 % foetaal runderserum en 100 eenheden per ml aan penicilline en streptomycine. Menselijke 143 TK -cellen (J.S.Rhim c.s., Inti. J. Cancer _15 (1975) 23-29 werden verkregen van M. Botchan (Professor, Afd. Moleculaire Biologie, üniversiteit van 5 California, Berkley, Calif.) en werden voortgekweekt in het bovengenoemde medium waaraan 25 ^im/ml 5-broomdeoxyuridine (BUdR) toegevoegd was.
Diploïde menselijke cellen (MRC-5) werden van de American Type Culture Collection ATCC No. CCL171) verkre-10 gen en in hetzelfde medium als voor BSC-40 voortgekweekt.
Koepokvirus (stam WR, ATCC No. VR-119) werd van R. Condit verkregen en werd gekweekt in BSC-40 cellen in DMEM met 5 % kalverserum dat vrij van gamma-globulins was en waaraan 100 eenheden per ml penicilline en streptomycine toegevoegd 15 waren. TK -recombinanten werden op 143 TK -cellen in hetzelfde medium met 25 jig/wl. BUdR uitgezócht en via plaques gezuiverd in dezelfde cellijn in DMEM met 1 % Noble-agar (Difco, Detroit,
Mich.) met 5 % kalverserum vrij van gamma-glcbuline, 100 E7ml penicilline, 100 E/ml streptomycine en 25 jpg/ml BUdR. Verdun-20 ningen van de virus-suspensies werden gemaakt in met fosfaat gebufferde zout-oplossing (PBS met per liter 8 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,5 g NaE^FO^ en 0,2 9 ^HPO^) waaraan 1 mM MgCl2 en 0,01 % runder-serum-albumine (RSAm) toegevoegd waren.
De koepokvirus-stam van de New York City 25 Board of Health werd uit een handelspreparaat van waterpok- vaccin (Dryvax® partij no. 321501G) van de Wyeth Laboratories (Marietta, Pa.) gezuiverd. Waterpokken-vaccin werd met RSAm verdund (zie hierna) en driemaal na elkaar via plaques op BSC-40-cellen gezuiverd. Een voorraad (hierna als "v-NY" aangeduid) van dit 30 via plaques gezuiverde isolaat op BSC-40 cellen werd aangehouden voor het in elkaar zetten van recombinant-virussen. Voorraden van recombinant-virussen die van v-NY afgeleid waren werden in MRT-5000 cellen voortgekweekt.
6.1.2. Bereiding, restrictie en modificatie van het DNA.
35 Tenzij anders aangegeven zijn alle hierna toegepaste procedures door Maniatis c.s. beschreven in "Molecular 8602422 i. i - 45 -
Cloning" van het Cold Spring Harbor Laboratory (1982): Bereiding van plasmide-DNA (biz. 86-96), restrictievertering van het DNA (biz. 98-106) en zuivering van de restrictiefragmenten uit laag-smeltende agar-gelen (biz. 157-161 en 170), reactie-omstandigheden 5 voor het Klenow-fragment van het DNA-polymerase uit E. coli (biz. 107-114), van het alkalische fosfatase uit kalverdarmen (biz. 133-134) en het ligase (biz. 146), bereiding van nick-vertaalde proeven (biz. 109-112) en werkwijze voor de DNA-DNA-hybridisering (in biz. 324-325).
10 6.2. Opbouw van plasmide-vectoren die koepokvirus-promotor ge koppeld aan de reeksen voor LAV/HTLV III-omhulling bevatten.
De nu komende onderafdelingen beschrijven het in elkaar zetten van diverse plasmidevectoren die informatie bevatten welke de LAV/HTLV III-omhulling codeert, voorafgegaan door 15 regelsignalen uit het koepokvirus; dit bastaard-DNA wordt door TK-DNA geflankeerd. Deze recombinant-plasmide-vectoren werden later gebruikt om de reeksen die de LAV/HTLV Ill-omhulling coderen door recombinatie in vivo in het genoom van het koepokvirus in te bouwen.
20 In de nog komende onderafdelingen werden de DNA-reeksen voor de LAV/HTLV Ill-omhulling uit pRS-3 gezuiverd, dat is een subkloon van lambda J19 (S. Wain-Hobson c.s., Cell 40_ (1985) 9) en in plasmide pGS20 ingebouwd (M. Mackett, G.L. Smith en B. Moss, J. Virol. 49 (1984) 857-864) en benedenstrooms van 25 de koepok-7,5K-promotor van pGS20 ingebouwd om pv-envl, pv-env2, pv-env5 en pv-env7 in elkaar te zetten. Bij al die constructies werd het bastaard-gen (d.i. de koepok-promotor gekoppeld aan de voor LAV/HTLV III specifieke reeks nucleotiden) geflankeerd door koepok-TK-DNA-reeksen.
30 Zoals reeds uitgelegd bestaat pRS-3 uit een fragment van het LAV/HTLV III-DNA van 3840 base-paren in lambda J19 gekloond tussen de plaatsen EcoRI en SstI van pucl8. Het werd verkregen door het Sstl-restrictiefragment van J19 op de Sstl-plaats van pDCl8 te klonen zodat pBT-1 ontstond dat dan met EcoRI 35 verteerd en opnieuw gekoppeld werd. Dit DNA werd gebruikt om E.coli en plasmide pRS-3 te transformeren, en het werd geïsoleerd.
8602422 L· * - 46 -
Het voor LAV/HTLV XII specifieke DNA in pRS-3 zit tussen de EcoRI-plaats van nucleotide no. 5289 en de SstI-plaats van nucleotide no. 9129 van het LAV/HTLV Ill-genoom (S. Wain-Hobson c.s., loc. cit.), zie figuur 2.
5 6.2.1. Opbouw van plasmide-vectoren die koepokvirus-promotor gekoppeld aan het 31-gedeelte van het LAV/HTLV Ill-gen bevatten.______ 5 microgram DNA van het plasmide pRS-3 werd volledig uitverteerd met restrictie-enzym Kpnl en de ontsta-10 ne fragmenten werden door elektroforese over een 1 % agarosegel uit elkaar gehaald. Een fragment van 2680 base-paren werd geïsoleerd en gezuiverd. Dit fragment bevatte voor LAV/HTLV III specifiek DNA met de nucleotide no.'s 5889 t/m 8572, waaronder het gedeelte (5889 t/m 8349) dat voor het C-uiteinde van het 15 LAV/HTLV III-omhullingseiwit codeert.
Van dit fragment werd 1 microgram gemengd met 0,5 jj.g pGS20-DNA dat vooraf met restrictie-enzym BamHI onvertakt gemaakt was. Koppeling van deze twee fragmenten gebeurde in 24 uur bij 4°C in aanwezigheid van oligodeoxynucleotide-koppelaars, m 20 zijnde 0,6 ^ig 51-GATCCACCATGGTAC-31-OH en 0,3 jig 51-CATGGTG-3’-OH. Deze koppelaars dienden (a) om de met Kpnl verkregen kleverige uiteinden van het uit pRS-3-DNA verkregen fragment van 2680 base-paren in voor BamHI kleverige uiteinden om te zetten, welke complementair zijn aan de met BamHI te verkrijgen kleverige uit-25 einden van het opengesplitste pGS-20 DNA en (b) om een beginplaats (ATG) voor het aflezen in het juiste kader te krijgen, zowel juist voor het LAV/HTLV III-omhullingsgen als voor de reeksen nucleotiden die voor het overschrijven en voor het vertalen van het mRNA nodig zijn. Het koppelingsmengsel werd gebruikt 30 om stam MC1000· van E.coli te transformeren. Plasmide-DNA uit voor ampicilline bestendige transformanten werd beproefd op de oriëntatie van het invoegsel en op het regenereren van BamHI,
Ncol- en Kpnl-plekken op de koppelingsplaatsen. Dit bevestigde de structuur van het gewenste plasmide, pv-env 2, dat in figuur 3 35 afgebeeld is, met benedenstrooms van de 7,5K koepokvirus-promotor het gedeelte van het LAV/HTLV III-omhullingsgen dat met nucleo- 8602422 E » - 47 - tiden no.'s 5889 t/m 8572 overeenkomt (zoals afgeheeld in figuur 2}. De DNA-reeks voor de LAV/HTLV III-omhulling stond in het af-leeskader op de juiste plaats ten opzichte van het beginsig-naal MG.
5 6.2.2. Ophouw van plasmide-vectoren die koepokvirus-promotor gekoppeld aan de 51-coderingsreeksen van het LAV/HTLV III-omhullingsgen bevatten.
5 microgram plasmide-DNA van pRS-3 werd volledig verteerd met het restrictie-enzym Avail en de aldus ver-10 kregen fragmenten werden door elektroforese over een 1 % agarose-gel uit elkaar gehaald. Een fragment van 820 base-paren werd geïsoleerd en gezuiverd. Dit fragment bevatte de voor LAV/HTLV III specifieke volgorde van nucleotiden no.'s 5671 t/m 6490 (zoals afgebeeld in figuur 2). Dit omvat het stuk (nucleotiden no.'s 15 5766 t/m 6490) dat voor het N-uiteinde van het öwhullingseiwit codeert en 95 base-paren van het niet te vertalen 5'-uiteinde van LAV/HTLV III. Dit fragment werd behandeld met het Klenow-fragment van E.coli-DNA-polymerase in aanwezigheid van overmaat deoxy-ribonucleatidetrifosfaten. Het fragment,dat nu stompe uiteinden 20 had,werd gekoppeld aan 0,5 jiq pGS20-DNA dat eerst metSmal onver takt gemaakt en met alkalisch fosfatase uit kalverdarmen behandeld was. De koppeling gebeurde in 16 uur bij 12°C. Het koppe-lingsmengsel werd gebruikt om stam MC1000 van E.coli te transformeren. Plasmide-DNA uit voor ampicilline bestendige transforman-25 ten werd beproefd op de oriëntatie van het LAV/HTLV Il-invoegsel ten opzichte van DNA dat het overschrijven van koepokvirus-DNA regelt. Dit bevestigde de structuur van het gewenste plasmide, pv-envl, dat in figuur 4 afgebeeld is, met benedenstrooms van de 7,5K-promotor het gedeelte van het LAV/HTLV Ill-omhullingsgen 30 dat met no.'s 5671 t/m 6490 overeenkomt (zoals afgebeeld in figuur 2) en dat zijn eigen startsignaal ATG bevatte.
6.2.3. Opbouw van plasmide-vectoren die koepokvirus-reeksen gekoppeld aan het hele LAV/HTLV Ill-omhullingsgen bevatten.
2 microgram plasmide-DNA uit pv-envl werd 35 volledig verteerd met restrictie-enzymen Stul, Pvul en Xhol. De ontstane fragmenten werden uit elkaar gehaald door elektroforese 8602422 * t - 48 - ΐ ΐ over een 1 % agarose-gel. Splitsing van pv-envl met Stul en Pvul leidde tot twee fragmenten van 4000 base-paren, één met het 5'-uiteinde van LAV/HTLV III en in het andere het stuk pGS20;
Xhol splitst het fragment van 4000 base-paren dat pGS20 bevat 5 tot kleinere fragmenten,, waardoor de identificatie van dit fragment van 4000 paren (met daarin het regelsignaal voor het overschrijven) en van het 5'-deel van het LAV/HTLV III-omhullings-gen mogelijk wordt. Dit fragment werd geïsoleerd, gezuiverd en gekoppeld aan een fragment van 6500 base-paren verkregen door 10 verteren van pv-env2 met‘Stul en Pvul. Twee koppelingsmengsels werden gebruikt om stam MC100Q van E.coli te transformeren. Tegen ampicilline bestendige transformanten werden geselecteerd. Plasmide-DNA uit afzonderlijke transformanten werden beproefd op het ontstaan van restrictieplaatsen voor Stul en Pvul' en op de aanwezig-15 heid van de moederfragmenten van 4000 en 6500 base-paren. Het gewenste plasmide, pv-env5, dat in figuur 4 afgebeeld is, bevat benedenstrooms van het koepokvirus-regelsignaal het gehele om-hullingsgen van LAV/HTLV III, overeenkomende met nucleotiden no.'s 5766 t/m 8349, zoals afgebeeld in figuur 2.
20 6.2.4. Opbouw van plasmide-vectoren die koepokvirus-promotor gekoppeld aan het LAV/HTLV Ill-omhullingsgen zonder ver-ankeringsstuk bevatten.
10 pg DNA uit het plasmide pv-env5 werd volledig verteerd met Hind III en de ontstane fragmenten werden 25 door elektroforese over een 1 % agarose-gel uit elkaar gehaald.
Het fragment van 3000 base-paren dat de 7,5K-koepokvirus-promotor en de 51 -promotor van het voor LAV/HTLV III coderende gen bevatten werd gezuiverd en dan met het Klenow-enzym behandeld om de kleverige uiteinden aan te vullen. Dit fragment werd toen gekop-30 peld aan de kloningsvector p26 met meerdere restrictieplaatsen, die vooraf met EcoRI verteerd en achtereenvolgens met Klenow-enzym en met alkalisch fosfatase uit kalverdarmen behandeld was. Koppeling van het afgestompte Hind ΙΙΙ-einde van pv-env5 en het afgestompte EcoRI-einde van plasmide p26 leidde tot een stop-codon 35 dat in fase was met de codering voor de omhulling. Dit tussenpro-dukt werd aangeduid als pv-env5/26.
8302422 * a, 1 - 49 -
Plasmide-DNA van pv-env5/26 werd na versterking en zuivering gebruikt om E.coli MC1000 te transformeren. Dat werd toen verteerd met BamHI en Hpal en de ontstane fragmenten werden door elektroforese over 1 % agarose uit elkaar gehaald.
5 Het fragment van 2100 base-paren met de reeks die voor de LAV/ HTLV XII-omhulling codeert, werd geïsoleerd en gekoppeld aan plasmide pGS20 dat vooraf met BamHI en Smal behandeld was. Het ontstane plasmide pv-env7 bevatte de 7,5k koepokvirus-promotor gekoppeld aan de voor LAV/HTLV III specifieke reeks, beginnende 10 96 base-paren bovenstrooms van het startcodon tot aan de HindlII- plaats bij nucleotide no. 7698 (zie figuur 5). Dit plasmide mist dus de veronderstelde verankeringsreeks van het gen voor de LAV/ HTLV III-omhulling.
6.3. Opbouw en karakterisering van recombinant-koepokvirus dat 15 het chimaere LAV/HTLV III-omhullingsgen bevat.
Twee moederstammen koepokvirus werden gebruikt voor de opbouw van recombinant-virussen: WR, de standaard researchstam en v-NY, een derivaat van de stam van de New York City Board of Health (zie 6.1.1.).
o 20 Inbouw van de chimaere LAV/HTLV III-omhul- lingsreeksen in het koepokvirus-genoom werd door recombinatie in vivo bereikt, mogelijk door het feit dat de chimaere genen in plasmiden pv-env2, pv-env5 en pv-env7 geflankeerd worden door DNA uit het koepokvirus dat voor thymidinekinase codeert. Invoe-25 ren van deze plasmiden in met koepokvirus geïnfecteerde cellen maakte recombinatie van de TK-informatie op het plasmide met de homologe reeksen in het koepokvirus-genoom mogelijk. Invoegen van het chimaere gen gebeurt als gevolg van dubbele recombinaties in de flankerende reeksen. Dergelijke recombinanten zullen het 30 chimaere gen binnen het koepokvirus-gen voor TK hebben, en dus fenotypisch TK zijn. Deze TK -recombinanten kunnen geselecteerd worden op groei in medium waaraan BudR toegevoegd is, dat voor TK+-cellen dodelijk is, maar niet voor TK~-cellen. Het algemene principe van deze procedure is door M.Mackett, G.L. Smith en 35 B. Moss beschreven in J. Virol. 4£ (1984) 857-864.
8602422 t t , i J- - 50 - 6.3.1. Opbouw van recorobinant-koepokvirus dat het chimaere gen voor de LAV/HELV III-omhulling bevat.
Een Petrischaal van 100 mm met voor 80 % samenvloeiende niercellen uit de Afrikaanse groene aap (stam 5 BSC-40) werd met koepokvirus (stam WR) geïnfecteerd tot een ge middeld infectiegetal van 0,05. Na 2 tot 4 uur incuberen op 37°C werden de geïnfecteerde cellen afgedekt van gezamenlijk met calciumfosfaat neergeslagen DNA van plasmide pv-env2 of pv-env5.
Deze neerslagen waren aangemaakt door 0,5 ml 2 x DNA-CaCl2-oplos-10 sing bij 0,5 ml 2 X HeBS-oplossing te druppelen (2 x DNA-CaC^-oplossing· bevat 20 jig plasmide-DNA in 0,5 ml 0,25 M CaC^; 2 X HeBS bevat per ml 16 mg NaCl, 0,74 mg KCl, 0,25 mg Na2HPC>4.2h20, 2 mg glucose en 10 mg Hepes met een pH van 7,08) . Voor het ont—' staan van de DNA-calciumfosfaat-neerslagen nam'men 30 minuten bij 15 kamertemperatuur. 4 uur na het afdekken der neerslagen werden de cellen eenmaal met lXHeBs gewassen, 3 minuten bij 37°C met 2 ml 15 % glycerol in IXHeBS geïncubeerd, nog eens met IxiHeBS uitgewassen en dan met 10 ml kweekmedium (DMEM + 10 % foetaal kalverserum plus 100 eenheden per ml penicilline en streptomycine).
Λ 20 Twee dagen later werden de geïnfecteerde cellen geoogst en door centrifugeren geconcentreerd (10 minuten op 2000 g bij 4°C). Virus-voorraden werden aangemaakt door deze cellen weer in 1 ml PBSAM te suspenderen, gevolgd door twee cycli vriezen en opdooien en driemaal 15 seconden ultrasoon trillen.
25 Recombinanten werden eruit gezocht door 0,1 ml van een 1000-voudige verdunning van die virus-voorraad in Petrischalen van 60 mm uit te platen op vervloeiende menselijke 143 TK -cellen die per schaal afgedekt waren met 5 ml 1 % Noble-agar met daarin 5 % kalverserum en 25 jig/ταΐ BüdR in DMEM. Twee 30 dagen na het uitplaten werden de cellen gekleurd door in elke plaat 2 ml van hetzelfde agar-mengsel met nog 0,01 % neutraalrood te schenken. Afzonderlijke plaques werden er 1 dag na dit kleuren uitgepikt en in 0,5 ml PBSAM gesuspendeerd, en met aliquoten van 0,25 ml van deze virus-suspensie werden vervloeiende 143 TK-cellen 35 in putjes van 16 mm doorsnede onder een selectief medium (DMEM + 10 % foetaal kalverserum + 100 E/ml streptomycine en penicilline + 8602422 * τ t - 51 - a. y 25 ^ig/ml BUdR) geïnfecteerd. Geïnfecteerde cellen werden door centrifugeren verzameld en weer gesuspendeerd in 100 jiL PBS met 0,5 mg/ml trypsine en 0,2 mg/ml EDTA. Be cellen werden gelyseerd door 30 minuten incuberen op 37°c, gevolgd door driemaal 20 secon-5 den ultrasoon stuktrillen. Cel-lysaten werden met behulp van een meervoudige filteropzet (van Schleicher & Schuell) op nitrocellulose-filters verzameld. De aanwezigheid van voor LAV/HTLV III-omhulling specifieke DNA in deze monsters werd door DNA-DNA-hybri-disering nagegaan, zoals beschreven door M. Mackett, G.L. Smith 10 en B. Moss in Proc, Natl. Acad. Sci. 79, 7415-7419, (1982). Als 32 proefstof voor de hybridisering diende met P gemerkt DNA uit plasmide pRS-3, dat door nick-vertaling verkregen was. Recombinanten die bij deze proef een positieve hybridisering lieten zien werden daarna tweemaal onder selectieve omstandigheden via plaques 15 op 143 TK -cellen gezuiverd (medium met BUdR) en eenmaal onder niet-selectieve omstandigheden op BSC-40-cellen. Na een uiteindelijke bevestiging door DNA-DNA-hybridisering werden van deze driemaal over plaques gezuiverde virussen voorraden aangelegd en werden ze verder gekarakteriseerd.
20 Een schematische weergave van de opbouw van de recombinant-virussen vindt men in figuur 6, waarin de genetische reeks voor de LAV/HTLV Ill-omhulling (env) benedenstrooms van de 7,5K koepokvirus-promotor (p —> ) staat, geflankeerd door de DNA-reeksen voor TK binnen het koepok-genoom. Virussen afge-25 leid van de recombinatie van koepokvirus-genoom met plasmide pv-env5 werden aangeduid als "v-env5" en bevatten het gehele gen voor de LAV/HTLV Ill-omhulling. Bij de uitvoeringsvorm die in deze voorbeelden beschreven is bevat v-env5 hét gehele omhuilingsgen en ook nog 96 base-paren aan het 5’-uiteinde en 223 base-paren 30 aan het 3'-uiteinde, die niet vertaald worden. Van pv-env2 afgeleide virussen kregen de aanduiding ,,v-env2" en bevatten het grootste deel van het gen voor de LAV/HTLV Ill-omhulling (te weten het KpnI-fragment), maar missen dat deel van de informatie die voor ie eerste 42 aminozuren van het omnullingseiwit codeert. Daar de 35 signaalreeks voor het LAV/HTLV III-omhullingseiwit verondersteld wordt binnen de eerste 49 aminozuren van het eiwit te zitten zou 1602422 <· 1 - 52 -
£ A
v-env2 een eiwit moeten maken dat deze signaalreeks mist, en men mag dus verwachten dat het door dit recombinant-virus gemaakte, aan LAV/HTLV III verwante eiwit niet naar het membraan getransporteerd wordt. Daarentegen moet v-env5, dat de volledige reeks 5 voor de LAV/HTLV III-omhulling bevat, een eiwit maken dat wel naar het membraan gaat. Van pv-env7 afgeleide virussen kregen de aanduiding "v-env7" en bevatten het volledig N-uiteinde van het gen voor de LAV/HTLV III-omhulling, maar missen het gedeelte benedenstrooms van de HindlII-plaats. Daar aan. deze constructie de 10 veronderstelde verankeringsreeks ontbreekt mag men verwachten dat het door deze recombinant, aan LAV/HTLV III gemaakte eiwit in het kweekmedium uitgescheiden zal worden. Die eigenschap is voordelig voor de zuivering van dit eiwit voor gebruik als diagnose-rea-gens of voor zijn formulering tot een opgesplitst vaccin.
15 6.3.2. Restrictiepatronen van koepok-LAV/HTLV III-omhulling- recombinanten- DNA uit de· moeder-koepokstammen WR en v-NY, en ook hun derivaten v-env5 en n-env5NY, werden geïsoleerd zoals eerder door Sposito c.s. beschreven in J. Virol. Methods _2, 20 (1981) 175-180. Ze werden met restrictie-enzym HindlII verteerd en de ontstane fragmenten werden door elektroforese over een 0,7 % agarose-gel uit elkaar gehaald. DNA uit de moederstam WR toonde het typerende restrictiepatroon (figuur 2A), zoals eerder beschreven door DeFilippes in J, Virol. 43 (1982) 136-149. Het 25 restrictiepatroon van v-NY leek op maar was te onderscheiden van dat van WR. De meest opvallende verschillen waren de lengte van de B- en C-fragmenten bij behandeling met HindlII, welke eind-fragmenten van het koepokvirus-genoom zijn. Recombinanten v-env5 en v-env5NY hebben niet het HindlII J-fragment van hun moeder-30 stammen. In plaats daarvan ziet men twee nieuwe fragmenten van 5400 en 3200 base-paren. Deze waarneming is in overeenstemming met de aanname dat er een dubbele recombinatie was waarmee de voor LAV/HTLV III coderende reeks in het koepokvirus-TK-gen ingevoegd *erd, dat op het HindlII J-fragment ligt. Twee fragmenten ont-35 stonden bij deze invoeging door de aanwezigheid van een HindlII-plaats binnen de LAV/HTLV III-reeks. Dit resultaat bevestigt ook
Sano k79
0 v 4- =4 -L.L
- 53 - L Λ de oriëntatie van de LAV/HTLV III-invoeging ten opzichte van het koepokvirus-TK-gen.
6.3.3. Zuidelijke vlekkenanalyse van recombinanten van koepok-virus met LAV/HTLV III.
5 De identiteit van de twee nieuwe HindlII
fragmenten van de verteringsanalyses der recombinant-virus-genomen werd bevestigd door een zuidelijke vlekkenanalyse. DNA-fragmenten die (net zoals afgebeeld in figuur 7a) op een agarose-gel geïsoleerd waren werden op nitrocellulose-filters overge-10 bracht en werden gehybridiseerd met een nick-vertaalde proef die voor LAV/HTLV III-omhulling specifieke reeksen had. Zoals in figuur 7B aangegeven vond men de hybridisering alleen in de fragmenten van 5400 en 3200 base-paren. Dat bevestigt de gencom-structuur van het recombinant-virus als weergegeven in figuur 6. 15 6.4. Vorming van aan LAV/HTLV III-omhulling verwante eiwitten in weefselkweekcellen die met recombinant-koepokvirus geïnfecteerd werden.
De recombinant-koepokvirussen met de chi-maere genen voor LAV/HTLV III-omhulling bleken in staat de aan 20 LAV/HTLV III-omhulling verwante eiwitten te maken als de cellen in weefselkweek geïnfecteerd werden. Deze eiwitten bleken ook immunoreactief te zijn met serum uit AIDS-patiënten.
6.4.1. Identlficering door immunovlekken-analyse van aan LAV/ HTLV III-omhulling verwante eiwitten in met recombinant-25 koepokvirus geïnfecteerde cellen.
Een 100 mm schaal met vervloeiende BSC-40-cellen werd tot een gemiddelde infectie-index van 10 geïnfecteerd met koepokvirus van het wilde type of met zijn recombinant-deri-vaten v-env5 of v-env2. Men liet de infectie 12 uur lopen, waar-30 na de cellen geoogst, eenmaal met PBS gewassen en door centrifugeren verzameld werden. Sedimenten van geïnfecteerde cellen werden weer gesuspendeerd in 1 ml monsterbuffer van Laemmli (U.K.
Laemmli in Nature 227 (1970) 680) waarna ze 4 minuten door koken gelyseerd werden. Het totale cel-eiwit van een 75 ^il-aliquoot 35 van het cel-lysaat werd uit elkaar gehaald door elektroforese over een polyacrylamide-gel met een NaDS-gradiënt van 7-15 %. Een 8602422 1 » - 54 - monster gezuiverd LAV/HTLV Ill-virus en een aliquoot van een lysaat van niet echt geïnfecteerde cellen dienden als blanco's. De inhoud van het gel werd elektrisch op een vel nitrocellulose-filter overgebracht. Het filter werd eerst 30 minuten bij kamertemperatuur 5 geïncubeerd met 5 ml PBS + 5 % vetvrije droge melk en daarna 2 uur bij kamertemperatuur in PBS + 5 % vetvrije droge melk + menselijk serum uit AIDS-patiënten (1:100 verdunning van het door verhitting geïnactiveerde serum). Het filter werd toen 5 maal met PBS + 0,05 % Tween 20 en daarna met alleen PBS uitgewassen.
10 Het gewassen filter werd 2 uur bij kamertemperatuur geïncubeerd met 5 ml PBS dat 1 % door verhitting geïnactiveerd, normaal geitenserum bevatte en een 1:3000 verdunning van een koppelingsprodukt van geiten-globuline tegen de mens met peroxydase uit de rammenas. Het zelfde filter werd daarna 5 maal gewassen met PBS + 0,05 % 15 Tween 20 en eenmaal met PBS (0,5 M NaCl. + 20 mM Tris.HCl, pH = 7,5). Het aangekoppelde peroxydase werd gevonden door het filter 10 minuten bij kamertemperatuur in het donker met chloornaftol-reagens te kleuren (dit reagens wordt gemaakt door vlak voor gebruik oplossingen A en B met elkaar te mengen. Oplossing A: 20 ml 20 koud 30 % methanol + 60 mg 4-chloornaftol-1; oplossing B: 60 ^il koud 30 % waterstofperoxyde + 100 ml TBS). Aan het filter gebonden eiwitten die met antilichamen in het serum van een AIDS-patiënt reageren moeten aldus te vinden zijn doordat ze met het peroxydase-conjugaat reageren.
25 De uitkomsten van deze analyse, weergegeven in figuur 8A, laten zien dat de koepokvirus-recombinant v-env5 een groep van drie eiwitten maakt die specifiek met het serum van AIDS-patiënten reageren. Deze eiwitten hadden elektroforetische beweeglijkheden overeenkomende met LAV/HTLV III-glycoproteïnen 30 gpl50, gpllO en gp41, waarvan men gelooft dat ze door het omhul-lingsgen gecodeerd worden (W.G. Robey c.s. in Science 228 (1985) 593-5). Deze eiwitten werden niet gevormd in onecht geïnfecteerde cellen of cellen die met koepokvirus van het wilde type geïnfecteerd waren. Recombinant v-env2, dat het' 5'-uiteinde mist 35 dat voor het beginsignaal methionine en de eerste 42 aminozuren van het omhullingseiwit van LAV/HTLV III codeert, maakte een eiwit 8602422 Λ - 55 - van kleinere grootte dat echter met het AIDS-serum nog immuno-reactief was. Vermoedelijk begint de vertaling van de env-reeks in de recombinant v-env2 bij het codon AUG dat overgeschreven werd van het verknopade stukje dat bij de opbouw van deze recombinant 5 gebruikt werd (zie afdeling 6.2.1.).
Bij een tweede experiment werden twee cellijnen (BSC-40 en HeLa) met v-env5 en v-env2 geïnfecteerd. De voor LAV/HTLV III specifieke eiwitten in lysaten van de geïnfecteerde cellen werden op de hierna beschreven wijze met een weste-10 lijke vlekkenanalyse bepaald.
Samenvloeiende monolagen van BSC-40- of HeLa-cellen werden met recombinant-virus v-env5 of v-env2 geïnfecteerd met een gemiddelde infectie-index van 50 plaque vormende eenheden per cel. 12 uur na de infectie werden de cellen tweemaal 15 met met fosfaat gebufferde zout-oplossing gewassen, in de monster-buffer van Laemmli gesuspendeerd en 5 minuten»gekookt. Eiwitten uit de geïnfecteerde cellen werden uit elkaar gehaald door elektro-forese over polyacrylamide-gel met natriumdodecylsulfaat en elektrisch op nitrocellulose-membranen overgebracht, waarop men ze 20 liet reageren met een serumcombinatie uit voor LAV/HTLV III seropositieve mensen. Immunoreactieve eiwitten werden gevonden met 125 eiwit A, dat met J (van de firma Amersham) of met de chloör-amine-T-methode gemerkt was. In figuur 8B zijn banen 1 en 5 voor eiwitten uit onecht geïnfecteerde cellen, banen 2 en 6 voor cellen 25 die met wild koepokvirus geïnfecteerd waren, banen 3 en 7 voor met v-env5 geïnfecteerde cellen en banen 4 en 8 voor met v-env2 geïnfecteerde cellen. Over een saccharose-gradiënt gezuiverde LAV/HTLV III-eiwitten dienden als blanco (LAV/HTLV III) en de plaatsen van de omhullingseiwitten gpl50, gpllO en gp41 zijn er 30 aangegeven. De molecuulgewichten zijn hierin kilodaltons opgegeven.
In hoofdzaak werden er drie met serum uit positief reagerende patiënten immunoreactieve eiwitten in de met v-env5 geïnfecteerde cellen gevonden. De molecuulgewichten van deze aiwittan werden geschat op 130, 120 an 41 kD, overeenkomstig lie 35 van de omhullingseiwitten gpl50, gpllO en gp4i van LAV/HTLV III.
Recombinantvirus v-env2 mist de veronder- 8602422 * * - 56 - stelde signaalreeks voor de LAV/HTLV III-omhulling, maar was took in staat ten minste drie immunoreactieve polypeptiden met mole-cuulgewichten van 99, 68 en 40 kD te vormen.
6.4.2. Identificatie van aan LAV/HTIV III-omhulling verwante ei-5 witten met immunologische technieken.
De hierna te beschrijven immunoprecipitatie-bepaling liet zien dat met de recombinant-koepokvirussen volgens deze uitvinding geïnfecteerde cellen eiwitten maken die specifiek reageren met het serum van AIDS-patiënten.
10 Een 100 mm Petrischaal met vervloeiende BSC-40-cellen werd tot een gemiddelde infectie-index van 10 geïnfecteerd met wild koepokvirus of met zijn recombinant v-env5 of v-env2, en 9,5 uur daarna werd het kweekmedium vervangen door DMEM zonder methionine en zonder serum-aanvullingen. Op 10 uur 15 na de infectie werd dat medium vervangen door 2 ml methionine- 35 vrij DMEM waaraan 100 ^iCi/ml S-methionine toegevoegd was, en dit merken liet men 2 uur bij 37°C verlopen. Na afloop daarvan werden de cellen eenmaal met PBS uitgewassen en door centrifugeren verzameld. De sedimenten werden weer in 1 ml lysis-buffer gesus-20 pendeerd: 1 % NP-40 (gepolyoxyethyleerd p-tert-octylfenol), 0,5 % natriumdeoxycholaat, 0,1 M NaCl, 0,01 M Tris.HCl (pH = 7,4) en 1 mM EDTA) en het lysaat werd na 1 minuut door centrifugeren in een Eppendorf-microcentrifuge geklaard.
De immunoprecipitatie gebeurde door aan 25 100 jxl cel-lysaat 5 ^il door verhitting geïnactiveerd menselijk serum toe te voegen, hetzij uit een blanco groep hetzij uit AIDS-patiënten. Na 1 uur incuberen op 4°C werd 60 ƒ11 geactiveerde Staphylococcus aureus-cellen (Pansorbine-cellen van de Calbiochem-Behring Corp. te LaJolla, CA) toegevoegd en liet men de incubatie 30 nog een uur bij 4°C verlopen. De immuunnerslagen werden door 30 seconden centrifugeren op 4°C in een Eppendorf-microcentrifuge verzameld en eenmaal met 1 M NaCl +0,1 % NP-40 10,01 M Tris.HCl (pH =7,4) gewassen en tweemaal met RIPA-buffer (10 mM Tris.HCl (pH = 7,2), 0,15 M NaCl, 1 % natriumdeoxychoiaat, 1 % 35 Triton X 100 en 0,1 % natriumlaurylsulfaat). De uitgewassen neerslagen werden weer gesuspendeerd in 50 ^il monsterbuffer van 8602422 s. i - 57 -
Laemmli, 1 minuut gekookt en 1 minuut in de Eppendorf-micro-centrifuge gecentrifugeerd- De aldus neergeslagen eiwitten die nu in de bovenstaande vloeistof zaten werden geanalyseerd door elektroforese over polyacrylamide-gel met 15 % NaDS. Na elektro-5 forese werd het gel met Koomassie-blauw gekleurd, 30 minuten bij kamertemperatuur met 1 M natriumsalicylaat behandeld en voor fluorografie gedroogd.
De in figuur 9A aangegeven uitkomsten van deze analyse laten zien dat de recombinant v-env5 een groep met 10 AIDS-serumimmunoreactieve eiwitten doet ontstaan. Deze hadden schijnbare molecuulgewichten van 160, 140, 120, 42 en 40 kilodal-ton wat ongeveer overeenkomt met de schijnbare molecuulgewichten van de aan de omhulling van LAV/HTLV verwante glycoproteïnen (zie W.G. Robey c.s. in Science 228 (1985) 593-5). Deze eiwitten 15 waren niet aanwezig in onecht geïnfecteerde cellen of cellen die met wild koepokvirus geïnfecteerd waren, en ook niet in blanco menselijk serum dat de immunoprecipitatie ondergaan had. In met v-env2 geïnfecteerde cellen werd een bekort eiwit met een schijnbaar molecuulgewicht van 95 kD gevormd en door het serum van AIDS-20 patiënten herkend. Dit bekorte, aan LAV/HTLV III-omhulling verwante eiwit begint waarschijnlijk met het codon AUG in de koppel-reeks bij het 5'-einde van het LAV/HTLV Ill-invoegsel van deze recombinant.
6.4.3. Merken van de aan LAV/HTLV III-omhulling verwante eiwitten 3 25 met H-glucosamine.
De hierna te beschrijven radioimmuno-precipi-tatieproef laat zien dat de koepok-LAV/HTLV Ill-recombinant-virussen volgens deze uitvinding gelycosyleerde omhullingseiwitten vormen.
30 HeLa-cellen werden of onecht geïnfecteerd (in figuur 9B banen 1 en 5), of met wild koepokvirus (banen 2 en 6), recombinant v-env5 (banen 3 en 7) of met v-env2 (banen 4 en 8), alle tot een gemiddelde infectiviteitindex van 50 eenheden per cel. Gedurende 4 tot 16 uur na de infectie werd aan elk kweekmedium 3 35 0,25 ^iCi H-glucosamine van 23 mCi/mg (firma Amersham) toegevoegd.
De cellen werden tweemaal uitgewassen met met fosfaat gebufferde 860 2 422' i ι - 58 - zout-oplossing en gelyseerd met een buffer die 0,1 M NaCl, 0,01 M Tris.HCl (pH = 7,4), 1 mM EDTA, 1 % NP-40 (gepolyoxyethyleerd p-tert-octylfenol) en 0,5 % natriumdeoxycholaat bevatte. Aliquoten van de cel-lysaten werden of gemengd met normaal menselijk serum, 5 (banen 1 t/m 4) of met een serum-combinatie van voor LAV/HTLV III seropositieve mensen (banen 5 t/m 8). De immunoreactieve eiwitten werden neergeslagen door vastgelegde cellen van Staphylococcus aureus die eiwit A bevatten, door chromatografie over polyacryl-amide-gel uit elkaar gehaald, en met fluorografie gevonden.
10 De uitkomsten van dit radioactief merken met glucosamine, weergegeven in figuur 9B laten zien dat de door de recombinant v-env5 gemaakte eiwitten, net als die van de omhulling van LAV/HTLV III, geglycosyleerd zijn (baan 7 van figuur 9B) . Verschillen in de glycosyleringspatronen kunnen verantwoordelijk zijn 15 voor de kleine variaties die in de elektroforese-snelheden van de door recombinanten gemaakte eiwitten te zien zijn, vergeleken met de glycoprotelnen van het virus LAV/HTLV III.
Zoals te verwachten van een eiwit zender start signaal,, werd in de met v-env2 geïnfecteerde cellen geen 3 20 glycosylering met Η-glucosamine gevonden (baan 8 van figuur 9B).
6.4.4. Polsslag-immunoprecipitatie-analyse van aan LAV/HTLV III-omhulling verwante eiwitten.
De veronderstelling is wel gemaakt dat gpl50 van het LAV/HTLV III-eiwit de voorloper van het omhullingseiwit 25 gpl10 en van het transmembraanproteïn gp4i is. De hierna te beschrijven· "polsslag-analyse" laat zien dat door koepokvirus-LAV/HTLV III-recombinant gemaakte eiwitten van 150 kD, 120 kD en 41 kD een zelfde voorloper/produkt-verband hebben als voor gpl50, gpl10 en gp41 van authentiek LAV/HTLV III verondersteld 30 wordt.
Samenvloeiende monolagen van HeLa-cellen werden geïnfecteerd of met koepokvirus van het wilde type (in figuur 9C banen 1 t/m 6), met recombinant v-env5 (banen 7 t/m 12) ’ of met v-env2 i,banen 13 t/m 18), alle tot een gemiddelde infectie- 35 index van 50 eenheden per cel, en 10i uur na de infectie werden 35 de cellen gedurende 15 minuten met 100 jxCx/xdL S-methionine (met 8602422 fir * - 59 - meer dan 800 Ci/mmol, firma Amersham) gemerkt. Na afloop werden de cellen eenmaal uitgewassen met 2 ml vooraf opgewarmd,volgens Dulbecco gemodificeerd medium van Eagle met 3 mg/ml L-methionine + 5 % kalverserum + 100 eenheden/ml penicilline en 100 jig/mL 5 streptomycine, en opnieuw in 1 ml van dat zelfde medium gebracht voordat ze naar de kweekkast teruggingen. Na verschillende tijden werden de cellen gewassen en gelyseerd zoals eerder beschreven in afdeling 6.4.3. en de eiwitten van de cellysaten liet men reageren met een serumcombinatie van voor LAV/HTLV III seropositieve 10 mensen. De aldus neergeslagen eiwitten werden door elektroforese uit elkaar gehaald en met fluorografie gevonden. De monsters werden genomen na: 0 uur (banen 1, 7 en 13), een è uur (banen 2, 8 en 14), 1 uur (banen 3, 9 en 15), 2 uur (banen 4, 10 en 16), 6 uur (banen 5, 11 en 17) en 12 uur (banen 6,12 en 18). De uit-15 komsten staan in figuur 9C. Uit banen 7 t/m 12 bleek bij de door de recombinant gemaakte eiwitten van 150 kD, 120 kD en 41 kD hetzelfde verband als bij authentiek LAV/HTLV III tussen gpl50, gpllO en gp41. De verwerking van het eiwit van 150 kD schijnt in HeLa-cellen langzaam en inefficiënt te gebeuren, daar 6 uur na de 20 stoot radioactiviteit slechts 50 % daarvan uit het 150 kD-eiwit in die van 120 kD en 41 kD overgegaan was. Voorlopige resultaten laten zien dat dit bewerken efficiënter verloopt in bepaalde typen van menselijke bloedcellen die met het zelfde recombinant-virus geïnfecteerd zijn. Deze uitkomsten laten ook zien dat de 25 omhullingsreeks in v-env2, waaraan het beweerde signaal voor het aflezen van LAV/HTLV III-omhulling ontbreekt, ongemodificeerd tot expressie kwam in een voorloper van 87 kD (780 aminozuren), waaruit een tussenprodukt van 99 kD ontstond, dat in polypeptiden van 68 kD en 40 kD gesplitst werd (in figuur 9C banen 13 t/m 18).
30 6.4.5. Aanwezigheid van aan LAV/HTLV III-omhulling verwant eiwit in het kweekmedium dat met recombinant-virus geïnfecteerd was.
De hierna te beschrijven radioimmuno-precipitatieproef liet zien dat de immunoreactieve eiwitten op een zeifde wijze en volgens een zelfde patroon door de recombinanten 35 volgens de uitvinding gevormd worden als door authentiek LAV/ ETLV III.
8602422 ί ί - 60 -
Samenvloeiende lagen HeLa-cellen werden of onecht geïnfecteerd (in figuur 9D baan 1), of met koepok-virus van het wilde type (baan 2), met recombinant v-env5 (baan 3) of met v-env2 (baan 4), alle tot een gemiddelde infectiviteits- 5 index van 20 eenheden per cel. De cellen werden 10 tot 12 uur na 35 de infectie met 100 ^iCi/ml aan S-methionine (sterker dan 800 Ci/mmol, firma Amersham) gemerkt. Daarna werd het medium verwijderd en door 2 minuten centrifugeren op 12.000 g geklaard en daarna liet men het reageren met een serumcombinatie uit voor 10 LAV/HTLV III seropositieve patiënten. Eiwitten uit de geïnfecteerde cellen (sediment) reageerden op dezelfde wijze als die uit de bovenstaande vloeistof (medium).
Zoals men zal verwachten voor gpllO van LAV/HTLV III werd het door de recombinant gemaakte eiwit van 15 120 kD ook in het geïnfecteerde medium gevonden (baan3 van figuur 9D). Dit laat zien dat de recombinant v-env5 het gen van LAV/HTLV III tot expressie kan laten komen en dat de imrnuno-actieve eiwitten op een zelfde patroon ontstonden als in de omhulling seiwitt en van authentiek lav/helv lil.
20 Zoals men ook mocht verwachten van eiwitten zonder signaalpeptiden werd in het met v-env2 geïnfecteerde kweek-medium geen aan LAV/HTLV Ill-omhulling verwant polypeptide gevonden (baan 4 in figuur 9D).
Aan de andere kant maakten met v-env7 ge-25 infecteerde cellen een afgeknot eiwit van 130 kD. Dit eiwit mist 217 aminozuren aan het C-uiteinde, waaronder het verankerings-deél van het LAV/BTLV III omhullingseiwit. Dit bekorte eiwit (gpl30) ging voor een veel groter deel in het kweekmedium over dan gpllO of zijn voorloper gpl50 (figuur 9E). Tegelijkertijd 30 gaat gpl30 niet doeltreffend in gpllO over, ook al is de split-singsplaats in het bekorte molecuul nog steeds aanwezig.
6.5. Immunogeen vermogen van de recombinant van koepokvirus met LV/HTLV III.
Aangetoond werd dat de recombinant-virus-35 sen met het chimaere LAV/HTLV Ill-omhullingsgen-eiwit in twee stammen muizen en één soort primaat antilichamen kunnen doen ont- . .........
8602422 - 61 - -V * staan.
6.5.1. De immunogeniteit in muizen.
De immunogeniteit van eiwitten gemaakt door de recombinant-virussen v-env5 en v-env2 werd nagegaan. De hierna 5 geschetste proeven laten het vermogen van deze recombinant-virussen zien een immuunrespons op te wekken tegen alle belangrijke glycoproteïnen van LAV/HTLV III.
Muizen van twee stammen, de ene inteelt (CS7B16J) en de andere uitteelt (ICR) werden met recombinant-virus-10 sen v-env2 en v-env5 beent. Alle dieren waren ten tijde van de beënting 5-7 weken oud. Er werden vier beentingswegen bewandeld:
Via de voedsel, door een kerf in de staart, intranasaal en intra-peritoneaal. Beënten via de voetzool gebeurde door 25 yil (met 5 x 10^ eenheden) reccmbinant-virus in elk van beide achtervoet-15 zolen te injiceren. Bij de tweede methode werd de huid bij de staartbasis met een tweehandige naald ruw gemaakt en werd op het 7 geraspte oppervlak 10 ul (met 2 x 10 eenheden) recombinant-virus 7 opgebracht. Intranasale beënting gebeurde door 10 jX (met 2 x 10 eenheden) aan recombinant-virus in de neuzen der muizen te plaatsen 20 en de muizen dat te laten opsnuiven. Intraperitoneale beënting gebeurde door 10 ^il (met 2 x 107 eenheden) recombinant-virus in de buikholte der muizen te injiceren. Alle virus-voorraden en -verdunningen werden aangemaakt zoals in afdeling 6.1.1. beschreven is. Serummonsters uit afzonderlijke muizen werden om de twee 25 weken na het beënten genomen en zowel met een aan enzym gekoppelde immunosorptie-proef (ELISA) als met een hierna te beschrijven westelijke vlekken-'analyse onderzocht.
6.5.1.1. Immunologisch onderzoek van muizen met de ELISA-proef.
De uitkomsten van ELISA-proeven met na 6 weken 30 genomen serummonsters zijn in tabel I samengevat. Recombinanten v-env2 en v-env5 maakten respectievelijk 100 % en 95 % der c57b16J muizen seropositief. Bij ICR-muizen was dat 44 % voor v-env2 en 100 % voor v-env5. Een totale reactie en tevens de hoogste ELISA-titer werd verkregen bij muizen die via kerven in de 35 staart beent waren.
8602422 4. i, - 62 -
Tabel I
Seropositieve reactie in met recombinant-virus beënte muizen
Recombinant- Beëntings- Positieve sera in 5 virus route_ beënte muizen* ICR C57B16J' v-env2 In de voetzool 3/3 4/5
Kerf in de staart 3/3 4/5
Intranasaal 0/3 4/5 10 Intraperitoneaal niet gedaan 3/5 v-env5 In de voetzool 4/4 5/5
Kerf in de staart 3/3 5/5
Intranasaal 3/3 4/5
Intraperitoneaal niet gedaan 5/5 15 * Positieve reacties/totaal aantal
De ELISA-proef werd als volgt uitgevoerd: Gezuiverd en geïnactiveerd LAV/HTLV III werd met carbonaat-buffer (50 mM natriumcarbonaat met pH = 9,6) verdund en over microtiter-20 platen met 96 putjes verdeeld (in elk putje 100 jl± met 0,2 ^g geïnactiveerd LAV/HTLV III) . Met liet het binden overnacht bij 4°C plaats vinden. Niet gebonden eiwit werd afgezogen en het residu werd uitgewassen met in elk putje 200 jil PBS + 5 % vetvrije droge melk en dan met 300 ƒ11 4 % saccharose-oplossing. Nadat de 25 overmaat saccharose-oplossing afgezogen was liet men de platen 1 uur op kamertemperatuur drogen. Nu werd in elk putje 50 ƒ:1 PBS met 2,5 ^il monster muizenserum gebracht en dat liet men 1 uur op 37°C reageren. Daarna werden de putjes vijfmaal met PBS + 0,05 % Tween-20 uitgewassen. In elk putje werd nu 50 ƒ11 conjugaat van 30 geiten-serum tegen de muis met peroxydase uit de rammenas gebracht (1:5000 in PBS +0,05 % Tween-20). Na 45 minuten reactie op 37°C werd weer met PBS + 0,05 % Tween-20 gewassen en werd het reactiemengsel van peroxyde en substraat toegevoegd. Dat mengsel werd als volgt aangemaakt: 0,294 g natriumcitraat en 0,537 g 35 Na2HP04 werden in 10 ml water opgelost en met HCl werd de pH op 5,0 gebracht; vlak voor gebruik werden 2 ƒ11 30 % H202 en 4 mg O-fenyleendiamine toegevoegd. De platen werden 30 minuten in het 8602422 jfc „* - 63 - donker bij kamertemperatuur geïncubeerd. De reactie werd gestopt door in ieder putje 100 jil 1,3 N zwavelzuur te brengen en de extinctie van het reactiemengsel bij 490 nM werd gemeten.
In tabel I staan de aantallen seropositieve 5 muizen en de totale aantallen muizen. De serummonsterswerden 6 weken na de beënting genomen en met ELISA gemeten. Als blanco’s dienden serummonsters van vijf niet beënte muizen. De gemiddelde ELISA-titers van de blanco groepen waren 0,021 ± 0,005 voor ICR-en 0,017 ± 0,010 voor C57Bl6J-muizen. Als positief golden die 10 ELISA-titers die meer dan driemaal de standaarddeviatie boven de blanco groep lagen.
6.5.1.2. Immunologisch onderzoek van muizen door westelijke vlek-kenanalyse
Om te laten zien dat met de recombinant-15 virussen beënte muizen antilichamen tegen authentieke LAV/HTLV
III-omhullingseiwitten maken werden serummonsters van geïmmuniseerde muizen als volgt met de westelijke vlekkenanalyse onderzocht: 5 tot 7 weken oude, mannelijke, ingeteelde muizen (C57B16J van Jackson Laboratory) werden via kerven in de staart geïmmuniseerd, 7 20 waarbij 2 x 10 eenheden aan recombinant-koepókvirus gebracht werd op staartbasis die eerst met een tweetandige naald geraspt was. 8 weken na de beënting liet men de dieren via de retro-orbitale bocht leegbloeden en de sera werden bevroren gehouden totdat ze onderzocht werden, Aliquoten van de serummonsters wer-25 den 1:50 verdund met fosfaat-gebufferde zout-oplossing met 0,2 % NP-40 en 3 % vet vrije droge melk, en dat liet men reageren met eiwitten van het LAV/HTLV Ill-virus die door elektroforese over polyacrylamide-gel uit elkaar gehaald en daarna door elektrische overdracht op nitrocellulose-filters vastgelegd waren. De door 30 deze sera als LAV/HTLV III-eiwitten herkende stoffen werden gevonden met een conjugaat van alkalisch fosfatase met geiten-immunoglobuline tegen de muis.
De uitkomsten met C57Bl6J-muizen die via kerven in de staart oeënt en 3 weken daarna bemonsterd werden 35 staan in figuur 10. Alle met recombinant-virussen geïmmuniseerde dieren maken antilichamen die met het LAV/HTLV III-omhullings- 8602422 i i * » ' - 64 - eiwit gp41 reageren. Sera van sommige met v-env5 geïmmuniseerde dieren (baan a van figuur 10) herkenden ook gplSO en gpllO, wat het vermogen van dit recombinantvirus aantoont een immuunrespons tegen alle belangrijke glycoproteïnen van LAV/HTLV III uit te 5 lokken.
6.5.2. Immunogeniteit van koepokvirus-LAV/HTLV III-recombinant v-env5 in andere primaten dan de mens.
Immunogeniteit van de recombinant v-env5 werd in twee soorten primaten onderzocht: Macaca fascicularis 10 en champansees. De in de volgende onderafdelingen beschreven resultaten laten zien dat v-env5 in staat is in beide soorten zowel humorale ais aan cellen toe te schrijven immuniteit kan opwekken.
6.5.2.1. De humorale respons van met v-env5 geïmmuniseerde makaken.
15 Negen langstaartmakaken (Macaca fascicularis), van jeugdig tot volwassen, werden gebruikt voor een studie van de immunogeniteit van de koepokvirus-LAV/HTLV III-recombinant v-env5. Alle dieren werden vooraf onderzocht op de afwezigheid van antilichamen tegen koepokvirus of tegen LAV/HTLV III, en op 20 de afwezigheid van apen-T-lymfotrope of AIDS-virussen en op anti- 8 lichamen daartegen. Vier apen werden met 2 x 10 eenheden aan 7 v-env5 beënt en vier met 2 x 10 eenheden daarvan. Als blanco 7 kreeg één dier 2 x 10 van een vergelijkbare recombinant-virus (v-HSgDl van koepok met herpes simplex gDl). Alle dieren werden 25 beënt via kerven in de staart. Op 4, 6 en 8 weken na het beënten werden monsters serum en gepariniseerd bloed verzameld. 10 weken na de. eerste beënting kregen alle dieren een tweede ent van 8 2 x 10 eenheden van hetzelfde virus. Alle dieren vertoonden uit zichzelf genezende huidaandoeningen die typerend voor koepok-30 infecties zijn en tijdens de gehele proef waren er normale fysiologische indicatoren. De humorale respons werd met ELISA en met een westelijke vlekken analyse onderzocht.
Voor de ELISA-proeven werden de serummonsters 50-voudig verdund met PBS dat 3 % vetvrije droge melk en 0,2 % 35 NP-40 (gepolyoxyethyleerd p-tert-octylfenol) bevatte, en dat liet men reageren met LAV/HTLV III-eiwitten die in microtiter-putjes 8802422 - 65 - vastgelegd waren. Voor ELISA was de procedure dezelfde als beschreven in afdeling 6.5.1.1., behalve dat het tweede antilichaam een conjugaat van rammenas-peroxydase met geiten-antilichaam tegen de mens was.
5 De in figuur 11 afgeheelde resultaten laten zien dat, hoewel slechts twee dieren na de eerste beënting seropositief waren, alle dieren het na de tweede beënting werden.
Om na te gaan welke antilichamen in de geïmmuniseerde dieren gevormd waren ondergingen vier weken na de tweede 10 immunisering opgevangen serummonsters een westelijke vlekken- analyse. Er waren twee protocollen om de twee omhullingseiwitten gp41 en gpllO optimaal te kunnen aantonen. Voor het optimaal aantonen van gp41 werd serum 50-voudig verdund met PBS dat 3 % niet-gepasteuriseerde melk en 0,2 % NP-4Q bevatte en liet men het 1 uur 15 bij kamertemperatuur reageren met gezuiverd LAV/HTLV Ill-eiwit dat op een nitrocellulose-filter vastgelegd was. De filters werden uitgewassen met PBS + 0,2 % NP-40 en daarna liet men ze reageren met conjugaten van alkalisch fosfatase met geiten-immuno-globuline tegen de mens (Zymed, CA) bij een verdunning van 1:2000 20 in PBS-buffer met 0,2 % NP-40. Voor het aantonen van gpllO werd het serum 50-voudig verdund met PBS + 3 % niet gepasteuriseerde melk en liet men het 1 uur reageren met tezuiverd en op een nitrocellulose-filter vastgelegd LV-HTLV Ill-eiwit. De filters werden gewassen met PBS met 0,05 % Tween-20 waarna men ze liet reageren 25 met een conjugaat van alkalisch fosfatase met geiten-immunoglobu-line tegen de mens bij een verdunning van 1:2000 in PBS-buffer.
In beide gevallen gebeurde het laatste uitwassen, na de tweede reactie met. antilichaam, met 0,1 M Tris (p3 = 9,5) dat 0,1 M NaCl en 5 mM MgCl2 bevatte. Op het filter aan het antigeen gebonden anti-30 lichaam werd gevonden door het filter te laten reageren met een oplossing van 0,1 M Tris (pH = 9,5), 0,1 M NaCl, 5 mM MgC^/ 0,33 mg/ml broomchloorindolylfosfaat en 0,17 mg/ml nitroblauw-tetrazolium. Nadat de filters met het chromogeen gereageerd hadden werden ze net water argespoeld,aan ie lucht gedroogd an ge-35 fotografeerd.
Zoals in figuur 12B te zien is vertoonden al- 3(30 2 422 - 66 -
4 I
ï ï le dieren die beide enten ontvingen een sterke antilichaamreactie op gp41. Bovendien maakten vier van deze dieren ook antilichamen die sterk met gpllO reageerden. Tezamen laten de in figuur 12A getoonde resultaten zien dat recombinant v-env5 in staat is de 5 vorming van voor LAV/HTLV Ill-omhulling specifieke antilichamen in makaken op te wekken.
6.5.2.2. Door cellen verzorgde immuunrespons in met v-env5 geïmmuniseerde makaken.
Lymfocyten van het perifere bloed werden ge-10 isoleerd uit het gehepariniseerde bloed van makaken 4 weken nadat die een tweede intradermale immunisering met v-env5 of met een vergelijkingsrecombinant (v-HSVgdl, een recombinant van koepok-virus met herpes simplex) ontvangen hadden, en wel door Ficoll-hypaque-centrifugeren. Deze lymfocyten werden ook geïsoleerd 15 uit aap no. 81 die slechts eenmaal met v-env5 gevaccineerd was, en uit niet-geïmmuniseerde makaken. Deze lymfocyten werden gesuspendeerd in het medium RPMI 1640 (van Gibco te Grand Island, N.Y.) waaraan 10 % door verhitting geïnactiveerd normaal menselijk serum toegevoegd was, en in elk putje van een rondbodem-20 microtiter-plaat werd 0,1 ml medium met 1 x 10^ aan lymfocyten
gebracht. Verder kreeg elk putje 0,1 ml medium met door UV
g geïnactiveerd v-env5 (voor de inactivering 1 x 10 eenheden per ml) of niet-opgebroken LAV/HTLV III (1 mg/ml met ongeveer 1 x 10 aan TCID^q) dat door tweemaal centrifugeren in een saacharose-25 gradiënt uit de bovenstaande-vloeistof van met LAV/HTLV III geïnfecteerde CEM-cellen verkregen was, d.i. een voor HLA-DR negatieve leukemie T-cellijn. Zes dagen na deze stimulering werd elk putje met lymfocyten gedurende 6 uur gemerkt met 1 ^iCi aan ^H-thymidine (van New England Nuclear te Boston, MA) . Na deze 3 30 6 uur werden de cellen geoogst en werd het ingebouwde H als gemiddelde van 4 putjes bepaald. De stimuleringsindex werd be- 3 rekend door het in gestimuleerde cellen ingebouwde H te delen door dat van de niet gestimuleerde cellen.
35 8602422 • » $ -i
- 67 -Tabel II
^H-thymidine-opname in al dan niet gestimuleerde lymfocyten_' 5 Voor de stimulering gebruikt virus
Aap Gelmm. Geen LAV/HTLV III v-env5_ no. met cpm* cpm* SI** cpm* SI** 67 v-env5 1586 7465 4,7 60.415 38,1 10 68 v-env5 2245 9075 4,0 28.638 12,8 74 v-env5 1585 4732 3,0 21.487 13,6 75 v-env5 581 8645 14,9 37.847 14,1 76 v-env5 2479 5987 2,5 36.657 14,8 80 v-env5 1077 13.922 12,9 24.752 23,0 15 81 v-env5 965 3985 4,1 40.572 42,0 82 v-env5 2581 8580 3,3 46.847 18,1 73 V-HSVgDl 612 553 1,0- 56.217 91,9 26 geen 2911 1822 1,0- 2240 1,0- 27 geen 1228 1072 1,0- 2532 2,0- 20 3 * t/min aan H ** stimuleringsindex.
Zoals men in tabel II kan zien maakten alle 25 geïmmuniseerde makaken, waaronder no. 81 die slechts éénmaal met v-env5 beënt werd, lymfocyten die in specifieke respons op in vitro stimulering met LAV/HTLV III sterk vermeerderden. Daarentegen reageerde aap no. 73, die de vergelijkingsrecombinant v-HSVgDl ontving, alleen op de stimulering met koepokvirus maar niet op 30 LAV/HTLV III. Blanco dieren die niet geïmmuniseerd werden maakten lymfocyten die op geen enkel antigeen reageerden. Verder was de lymfocyten-respons bij met v-env5 geïmmuniseerde makaken in grootte vergelijkbaar met die van aap no. 73 die met v-HSVgDl gevaccineerd was. Deze resultaten laten zien dat de expressie van 35 het gen voor de LAV/HTLV Ill-omhulling in het recombinant-virus in deze apen de immuunrespons via τ-cellen in vitro of in vivo niet onderdrukte.
8602422 i i - 68 -
Om na te gaan welke groep lymfocyten in de geïmmuniseerde makaken door LAV/HTLV III gestimuleerd werd werden de gestimuleerde lymfocyten met twee kleuren-immunofluorescen-tie onderzocht op de expressie van IL-2-receptoren die op geac-5 tiveerde T-cellen en B-cellen zitten. CD4- en CD8-antigenen zitten op T-cellen en CD20-antigeen (Bp35) zit op de B-cellen. De in tabel III getoonde resultaten laten zien dat bijna al de door virus gestimuleerde lymfocyten die IL-2-receptoren tot expressie brengen dat ook met de antigenen CD4 en CD8 doen, terwijl slechts 10 1,5 tot 2 % tevens het antigeen CD20 (Bp35) mede tot expressie brengt. Dit laat zien dat de gestimuleerde lymfocyten de T-cellen zijn.
Tabel III
Expressie van IL-2 receptoren en antigenen CD4, 15 CD8 of CD20 (Bp35) in lymfocyten van gevaccineerde makaken_
Aap Lymfocyten Totaal % IL-2R+ cellen, die tot no. gestimuleerd % IL-2R+ expressie brengen:_ _ met_ cellen CD4 CD9 CD2Q(Bp35) 20 74 v-env5 27,7 48,6 52,2 2,0 80 v-env5 25,6 62,4 40 niet bepaald 74 LAV/HTLV lil 14,7 50,0 59,0 1,9 80 LAV/HTLV III 12,0 58,0 38,0 1,5 80 niets 0,3 0,3- 0,3- 0,3- 25
De uitkomsten van tabel III waren als volgt verkregen: Lymfocyten van perifeer bloed werden tegelijkertijd gekleurd met aan phycoerythrine gekoppelde monoklonale antilicha-men 2A3 (van Becton-Dickinson, Ine. te Mountain View, CA) tegen 30 de interleukine-2-receptor (IL-2R) en met aan fluoresceïne gekoppelde monoklonale antilichamen 1F5 tegen CD20 en tegen G10-1 (van Genetic Systems Corp. te Seattle, WA) en tegen CD8 of T4 (van cl
Ortho Diagnostics te Raritan, N.J.) of tegen CD4. De antilichamen werden ingezet in verzadigingsconcentraties, die vooraf be-35 paald waren door stromingsmicrofluorometrie met een gemodificeerde FACS IV -Sortering (van Becton-Dickinson te Mountain View, CA). Kwantitatieve tweekleuren-analyse werd uitgevoerd zoals eerder 3602422 » * - 69 - in detail beschreven is door J.A. Ledbetter c.s. in "Perspectives in Immunogenetics and Histocompatibility" 6_ (1984) 119-129. De poorten voor doorgaande en recht afgebogen stralen werden zodanig ingesteld dat lymfoblasten en een belangrijk deel van de kleine 5 lymfocyten meegeteld werden. De getoonde cijfers zijn die voor het totale percentage cellen dat IL-2R+ was en voor de percentages IL-2R+ cellen die CD4, CD8 of CD20 (Bp35) mede tot uitdrukking brachten.
Het ligt goed vast dat T-cellen na antigene 10 stimulering lymfokinen waaronder IL-2 maken, welke differentiëring en/of vermeerdering van T- en B-cellen bevorderen en natuurlijke afweercellen kunnen activeren die in staat zijn met uiteenlopende virussen (waaronder dat van AIDS) tot lysis te brengen. De vraag was dus of T-cellen van gevaccineerde makaken na stimulering met 15 LAV/HTLV III wel IL-2 maken.
Hiertoe werden twee proeven uitgevoerd. Voor proef no. 1 werden lymfocyten geïsoleerd uit gehepariniseerd bloed van makaken 4 weken na een tweede intradermale immunisering met v-env5 of v-HSVgDl (dat van de WR-stam van het koepokvirus 20 afgeleid was). Voor proef no. 2 werden de lymfocyten geïsoleerd uit makaken 4 weken na een eerste intradermale immunisering met 2 x 105 eenheden aan v-env5, v-HSVgDl of een v-env5-recombinant afgeleid uit de stam v-env5NY van de New York City Board of Health.
De lymfocyten werden gesuspendeerd in het medium RPMI 1640 dat 25 met 10 % normaal, door verhitting geïnactiveerd menselijk serum aangevuld was, en in elk putje van een rondbodem-microtiter-
plaat werden 2 x IQ'* lymfocyten gebracht. Daarna werd door OV
6 geïnactiveerd v~env5 (1 x 10 eenheden per ml voor de inactive-ring) of gezuiverd LAV/HTLV III (1 jiq/ml) in de putjes gebracht.
30 Twee dagen na dit stimuleren werden de bovenstaande vloeistoffen uit de putjes genomen en getest op hun vermogen voor de vermeerdering van van IL-2 afhankelijke cellen CTLL-2 (van Dr. S.Gillis van de Immunex Corp. te Seattle, WA), die 24 uur voor de proef vrij van IL—2 gewassen waren, te zorgen. Tijdens de laatste 6 uur 3 35 incuberen met deze vloeistof werden de cellen met H-TdR gemerkt 3 en de in de cellen opgenomen hoeveelheid H-TdR werd bepaald.
4602422 i * -, t -70-
Het aantal eenheden IL-2-activiteit in de bovenstaande vloeistof werd berekend uit ijklijnen verkregen door het effect van menselijk recombinant-lL-2 (ook van Dr. Gillis) op de vermeerdering van cellen CTLL-2 na te gaan- De uitkomsten staan in tabel IV.
5 Tabel IV
IL-2 vorming door lymfocyten uit ge-vaccineerde makaken na stimulering met recombinant-koepokvirus
Kerste proef: _IL-2 (eenheden(ml)
Aap Geimm- Bovenstaande vloeistoffen gestimuleerd met 10 no. met niets LAV/HTLV III v-env5 67 v-env5 0 28,0 96,0 68 v-env5 0 16,0 124,0 74 v-env5 0 9,0 52,0 73 v-HSVgDl 0 0 108,0 15 26 niets 0 0 0
Tweede proef: 03 v-env5 0 14,4 55,8 05 v-envSNY 0 16,8 33,3 20 49 v-env5NY 0 7,1 26,7 52 v-env5NY 0 2,4 27,6 59 v-HSVgDl 0 0 27,6 26 niets 00 0 27 niets 00 0 25
De uitkomsten van de eerste proef van tabel IV laten zien dat de bovenstaande vloeistoffen van met v-env5 of met LAV/HTLV III gestimuleerde lymfocyten, verkregen uit makaken die tweemaal met v-env5 geïmmuniseerd waren, IL-2 bevatten, wat 30 blijkt uit hun vermogen de vermeerdering van CTLL-2-cellen (een van IL-2 afhankelijke cellijn) te ondersteunen. Evenzo werd, zoals in de tweede proef van tabel IV bleek, IL-2 aangetoond in de bovenstaande vloeistoffen van lymfocyten uit aap no. 03 die éénmaal met v-env5 geïmmuniseerd was en in alle drie de apen die 35 éénmaal met de "vaccin-stam" van dezelfde recombinant (v-env5NY, zie afdeling 6.3.) geïmmuniseerd was. Daarentegen maakten de lym- 8602422 ? Λ -71-: focyten uit apen no.’s 73 en 59, die met de koepok-HSV gD-1-recombinant geïmmuniseerd waren, alleen IL-2 na stimulering met v-env5 en niet na stimulering met LAV/HTLV lil. In nlet-geïmmuniseerde apen no.'s 26 en 27 was IL-2 noch na stimuleren met LAV/HTLV lil 5 noch met de koepok-recombinant aantoonbaar. Daar in hoofdzaak T-cellen met hulp- en inductiewerking na antigene. stimuléring IL-2 vormen tonen deze uitkomsten de aanwezigheid van helpende T-cellen aan, welke in met de recombinant-virussen geïmmuniseerde apen het LAV/HTLV lil herkennen. Naast hun waarschijnlijke rol 10 in de differentiatie van B-cellen,waardoor die antilichamen tegen de LAV/HTLV III-omhulling gaan vormen, zijn deze IL-2 makende T-cellen misschien betrokken bij de differentiatie en/of expansie van effector-cellen, zoals de cytotoxische T-lymfocyten of de natuurlijke opruimers die met virus geïnfecteerde cellen kunnen 15 doden.
6.5.2.3. Humorale respons in met v-env5NY geïmmuniseerde cham-pansees.
Twee jeudige chimpansees werden intradermaal 8 beent met 5 x 10 eenheden aan v-env5NY, de "vaccin-stam" van 20 v-env5. Een dier werd intradermaal beent met dezelfde dosis van een koepok-herpes simplex-recombinant, het v-HSVgDINY dat uit dezelfde moederstam als v-env5NY opgebouwd was, namelijk uit v-NY. Alle dieren kregen 8 weken na de eerste ent een tweede be-enting met dezelfde dosis. Na de immunisering werden om de twee 25 weken serummonsters genomen die op voor LAV/HTLV III specifieke antilichamen onderzocht werden met ELISA en de westelijke vlekken-analyse. Alle dieren vertoonden uit zichzelf genezende, voor koepokken typerende huidschade en vertonen tijdens de hele proef de normale fysiologische indicaties.
30 De uitvoering van deze bepalingen gebeurde net als met de makakensera. De in tabel V getoonde resultaten laten zien dat beide proefdieren (124 en 149) 8 weken na de eerste immunisering ander serum hadden en dat de antilichaam-gehalten na de 'weede immunisering bleven stijgen. Het blanco dier (134) 35 bleek seronegatief.
360 2 /22 * \ - 72 - i >'
Tabel V
ELISA met serummonsters van met koepok-recombinant geïmmuniseerde chimpansees._ 5 voor LAV/BTLV III specifieke antilichamen ELISA-uitkomst bij
Monster- Chimp No. 134 Chimp No. 124 Chimp No. 149
name v-HSVgDINY v-env5NY v-env5NY
10 Vooraf 0,084 ± 0,015 0,100 ± 0,005 0,123 ± 0,025 8 weken na 0,085 ± 0,010 0,185 ± 0,020 0,403 ± 0,027 de le immunisering 2 weken na 0,075 ± 0,012 0,237 ± 0,017 0,523 ± 0,073 15 de 2 immunisering
Om aan te tonen dat de in de geïmmuniseerde dieren aangetoonde voor LAV/BTLV lil specifieke antilichamen tegen 20 de glycoproteïnen van de omhulling gericht waren werden dezelfde sera ook met westelijke vlekkenanalyse onderzocht. Deze methode werd geoptimaliseerd voor het herkennen van het antilichaam gp41, en was gelijk aan die voor het onderzoek van de makakensera. De, in figuur 13 afgebeelde uitkomsten laten zien dat de in beide 25 gevaccineerde dieren gemaakte, voor LAV/HTLV III specifieke antilichamen inderdaad tegen de omhullingseiwitten zijn, en dat de gehalten aan deze antilichamen na de tweede immunisering hoger waren.
6.5.2.4. Immuunresponsen via de cellen in met v-env5NY gelmmuni-30 seerde chimpansees.
Lymfocyten geïsoleerd uit het perifere bloed van de bij 6.5.2.3. beschreven dieren werden gebruikt om de imrauun-responsen via cellen in deze dieren aan te tonen. De lymfocyten werden uit het gehepariniseerde bloed geïsoleerd door Ficoll-hypaque-35 centrifugeren 4 weken na de eerste intradermale beënting met de recombinant-virussen. De lymfocyten werden in doses van 1 x 10“* cellen per putje over microtiterplaten verdeeld, in het medium RPMI 1640 dat met 10 % normaal en door verhitting geïnactiveerd 8602422 .
£ * - 73 - menselijk serum en met penicilline en streptomycine aangevuld was. Daaima werd niet-opgebroken LAV/HTLV III (5 ^ig/ml) of door lentil-lectine-chromatografie uit gezuiverd LAV/HTLV III geïsoleerde omhullingseiwitten (1 jig/mL) in de putjes gebracht. Zes 5 dagen later werd het in de cellen ingebouwde ^H-thymidine door vloeistofscintillatietellen bepaald.
Zoals in tabel VI opgegeven vermeerderden in beide met v-env5NY geïmmuniseerde dieren (124 en 149) de lymfo-cyten zich in reactie op stimulering door LAV/HTLV III-virussen of 10 gezuiverde omhullingseiwitten. Daarentegen maakte dier 134, dat de recombinant v-HSgDlNï gekregen had, geen lymfocyten die LAV/HTLV III herkenden.
Tabel VI
Immuunrespons via cellen in het koepok-recombinanten 15 gevaccineerde chimpansees. __ 3
In lymfocyten ingebouwd H-thymi-dine na stimulering met
Chimpansee Immunis. met geen LAV/HTLV m env no._ _ antigeen _. __ 20 124 v-env5NY 2482 37.132 26.370 149 v^envSNY 375 20.292 27.115 134 v-HSVgDlNY . 367 1.987 367 64 niets 452 .567 222 72 niets 737 -2.417 905 25
De lymfocyten uit alle chimpansees vertoonden na stimulering met 2 ^ig/ml fytohemagglutinine een hoge mate van ^H-thymidine-inbouw (38.870 tot 109.790 t/m) en ook (42.172 tot 12.067 t/m) na stimulering met gecombineerde, met röntgen bestraal-30 de, xenogene menselijke lymfocyten. De lymfocyten uit met v-env5 geïmmuniseerde en ook die uit met v-HSVgDlNY geïmmuniseerde chimpansees reageerden op koepokvirus met sterke vermeerdering, terwijl de lymfocyten uit niet-geïmmuniseerde chimpansees dat helemaal niet deden.
35 Tezamen genomen tonen de resultaten van tabellen I t/m VI en figuren 11 t/m 13 dat (a) het recombinant- 8602422 A 1 - 74 - koepokvirus v-env5 en zijn tegenhanger in het vaccin, v-env5NY, in staat zijn in twee lager dan de mens gestelde soorten primaten humorale en door cellen geleverde, tegen LAV/HTLV ΙΠspecifieke immuunr e spons en op te wekken en (b) dat de recombinant-virussen 5 de immuunresponsen via T-cellen in vitro of in vivo niet onderdrukken.
6.6. Verlaagde neurotoxiciteit van met de stam v-NY opgebouwde koepok-recombinanten.
7
Porties virus met 5 x 10 eenheden in 25-50 10 jüwerden intracerebraal gelnjiceerd in groepen van vijf muizen (van de stam ICR). De sterfte werd 10 dagen later opgenomen.
Tabel VII
Sterfte van intracerebraal met koepok- recombinanten beënte muizen..______ 15 Beent met Dood/behandeld v-NY 0/5 v-env5NY 0/5 v-env2NY 0/5 v-env7NY 0/5 20
Waterpokkenvaccin (Wyeth) 3/5 v-env5 5/5 v-env2 5/5 25 v-env7 5/5
Zout-oplossing 0/5
De in tabel VII getoonde resultaten laten 30 zien dat het via plaques gezuiverde, uit weefselkweken afkomstige koepokvirus (stam v-NY) en zijn derivaten v-env5NY, v-env2NY en v-env7NY, lagere neurotoxiciteit hebben dan de WR-stam en de derivaten daarvan. Daar de stam van de New York City Board of Health als waterpokkenvaccin gebruikt wordt moeren recombinanten op basis 35 van deze stam beter geschikt zijn voor het ontwikkelen van een vaccin voor menselijk gebruik.
8602422 x :* - 75 - 7. Voorbeeld: Baculovirus-gag-recombinanfcen.
In de volgende voorbeelden werden diverse plasmidevectoren opgebouwd met chimaere genen die benedenstrooms van het regelende startsignaal van AcNPV DNA-reeksen bevatten 5 die voor de LAV/HTLV III-kemstructuren coderen.
Deze chimaere genen met de AcNPV-polyhedrine-promotor en de voor LAV/HTLV III-gag coderende reeks werden door recombinatie in vivo in het genoom van AcNPV ingebouwd. Dergelijke recombinant-virussen werden geïdentificeerd en gezuiverd/ en uit 10 de geïnfecteerde weefselkweekcellen werden virus-voorraden aangelegd. Aangetoond werd dat immunoreactieve, aan LAV/HTLV III-kern-structuren verwante eiwitten in vitro door het recombinant AcNPV gemaakt worden. Met recombinant-virussen geïnfecteerde cellen bleken positieve immunofluorescentie te vertonen. Tenslotte waren 15 lysaten van met recombinant-AcNPV geïnfecteerde cellen positief in de ELISA-proef tegen serum uit AIDS-patiénten. Een gedetailleerde beschrijving van elke stap van deze uitvoeringsvorm van de uitvinding komt in de nu volgende onderafdelingen.
7.1. Algemene procedures.
20 7.1.1. Cellen en virussen.
Cellen van Sodoptera frugiperda, kloon Sf9, werden van de American Type Cultre Collection verkregen (ATCC No.
CRL 1711} en werden voortgekweekt in het Antheraea-medium van Grace (Gibco, KC Biologicals) met 3,3 g/1 gist-autolysaat en 25 3,3 g/1 lactalbumine-hydrolysaat (beide van Difco), 10 % foetaal runderserum en 0,06 g/1 penicilline en 0,1 g/1 streptomycine.
(Dit medium wordt verder aangeduid als "TNM-FH"). De cellen werden bij 28°C gekweekt.
Kempolyhedrose-virus van Autographa 30 califomica werd verkregen van Dr. Louis Miller (afdeling van
Insecten-Genetica van de üniversiteit van Georgia, Athens, GA 30602) en werd gezuiverd via plaques op Sf9-cellen met 1 % agarose en 0,8x TNM-FH. Verdunningen van deze virus-voorraad werden gemaakt in TNM-FH.
35 7.1.2. Bereiding, restrictie en modificatie van het DNA.
Restrictie-enzymen werden gekocht bij de 3802422 ------ -- '« J· - 76 -
Bethesda Research Laboratories, Ine. en de omstandigheden voor restrictieverteringen waren zoals door de fabrikant voorgesteld. Het Klenow-fragment van het DNA-polymerase uit E .coli werd in een sterkte van 200 eenheden per ml gedurende 30 minuten bij 37°C 5 toegepast in 50 mM Tris.HCl (pH = 7,4) , 6 mM in MgC^ en 10 mM
2-mercaptoethanol.
Virus-DNA voor overbrengen werd met de methode van L.K. Miller, D.W. Miller en P. Safer bereid uit een voorraad van het wilde virus zonder insluitingslichaampjes: de 10 virus-suspensie werd 1 uur bij 5°C op 90.000 g gecentrifugeerd door een "kussen" van 25 % saccharose, 5 mM NaCl en 10 mM EDTA.
De bovenstaande vloeistof werd verwijderd en het virus-sediment werd gesuspendeerd in 0,5 ml lysis-buffer (10 mM Tris (pH = 7,6), 10 mM EDTA en 0,25 % NaDS). Daarna werd proteinase K toegevoegd 15 tot een eindconcentratie van 500 ^ig/ml en dat mengsel werd overnacht (ongeveer 16 uur) bij 37°C geïncubeerd onder zo nu en dan omschudden. Het DNA werd met een gelijk volume fenol/chloroform/ isoamylalkohol 25:24:1 geëxtraheerd. Het DNA werd bij -20°C neergeslagen door toevoegen van 1/10 volume 3M natriumacetaat (pH =
20 5) en 2 volumina koud ethanol. Na afcentrifugeren werd het DNA
met 70 % ethanol uitgewassen en gedroogd. Voor gebruik voor transfectie en restrictieanalyse werd het gesuspendeerd in 10 mM Tris met 1 mM EDTA (pH = 7,5).
Plasmide-DNA werd als volgt met de maxiprep-25 procedure van M.D. Summers en G.E. Smith bereid: Een ml Luria-bouillon (LB) met daarin het geëigende antibioticum werd beent met één enkele bacteriekolonie die van een vers gekweekte plaat af genomen werd. Na 12 tot 18 uur incubatie op 37 °C werd die kweek van 1 ml overgebracht in 200 ml LB met antibioticum in een 30 kolf van 500 tot 1000 ml, en overnacht (12-18 uur) in een schud-kast geïncubeerd. Die kweekvloeistoffen werden dan 10 minuten op 2500 rpm gecentrifugeerd. Na verwijderen van de bovenstaande vloeistof werd elk sediment bij kamertemperatuur in 30 ml STET-buffer gesuspendeerd (8 % saccharose, 0,5 % Triton X-100, 50 mM 35 EDTA en 10 mM Tris.HCl, pH = 8,0). Nu werd 3 ml lysozym-oplos-sing van 10 mg/ral (vers aangemaakt in STET-buffer) in elke kolf 1602422 Λ * - 77 - gebracht, die goed omgeschud en 5 minuten bij kamertemperatuur gelncubeerd werd. Elke kolf (van 125 ml) werd dan direct boven een vlam zachtjes omgeschud (eenmaal per 5 seconden) totdat de cellen begonnen te coaguleren en het geheel wit werd. Op het moment 5 dat er belletjes ontstonden werden de kolven 45 seconden in kokend water gehouden, waarna ze 2 minuten of langer in ijswater afgekoeld werden. De viskeuze mengsels werden langzaam in rondbodem-centrifugebuizen van 50 ml geschonken en in een preparatieve centrifuge 15 minuten op 16.000 rpm gecentrifugeerd. De bovenstaan-10 de vloeistof van elke buis werd zorgvuldig in een 50 ml wegwerp-centrifugebuis van polypropeen geschonken waaraan 1 vol.dl iso-propanol en 2 volumina ethanol werden toegevoegd, en het DNA sloeg in 20 minuten bij -80°C (of in 2 uur of langer bij -20°C) neer en werd gedurende 15 minuten of langer op 25.000 g afgecen-15 trifugeerd. Na verwijderen van de alkohol werd 2,5 ml extractie-buffer (per liter 12,1 g Tris, 33,6 g Na£ EDTA.2^0 én 14,9 g KCl, pH = 7,5) aan het sediment toegevoegd dat goed opgewerveld werd. Nu werd 100 ^il van 10 mg/ml RNase A toegevoegd (opgelost in 0,1 X TE en voorbehandeld door 10 minuten koken) en dat meng- 20 sel werd 30 minuten op 37°C gelncubeerd. Aan elke buis werd ongeveer 200 ^ig proteinase K toegevoegd en dat werd ongeveer 30 minuten op 40-50°C gelncubeerd, waarna 250 jil 10 % Sarkosyl toegevoegd en de incubatie nog 3 uur of langer voortgezet werd.
Om CsCl-gradiënten aan te maken werd per ml DNA-oplossing 25 80 ^il van 10 mg/ml ethidiumbromide toegevoegd . Nu werd 1,04 g CsCl per ml DNA-oplossing toegevoegd en elke buis werd voorzichtig opgewerveld. Na overbrengen in Quick-Seal buizen werden de gradiënten in 16 uur op 55.000 rpm tot evenwicht gecentrifugeerd in een 70,1 Ti rotor met vaste hoek, wat tot twee goed gescheiden, zichtbare DNA-banden leidde, waarvan de bovenste band onvertakt en nick-DNA bevat en de lagere band covalent gesloten» kringvormig DNA. De onderste band (het covalent gesloten, kringvormige DNA) werd opgevangen en in een 15 ml centrifuge-buis van polypropeen gebracht, waarna elke buis met -water tot ^ ongeveer 6 ml aangevuld werd. Het ethidiumbromide werd met eenzelfde volume isoamylalkohol uit het DNA geëxtraheerd, en de 830 2 4 22
i' T
- 78 - rose bovenfase werd weggedaan.. De extractie werd herhaald totdat de bovenfase kleurloos was en de onderste fase (met het DNA) helder en kleurloos. Er moet ongeveer 5 ml DNA-oplossing in elke buis óver zijn (zo niet dan werd water tot een eindvolume van 5 5 ml toegevoegd) en hierbij bracht men 2 volumina absolute ethanol.
Het DNA sloeg in 10 minuten bij -80 °C of overnacht bij -20°C neer en werd in 20 minuten op 2500 g af gecentrifugeerd. Na verwijderen van al het alkohol werd elk sediment opgewerveld in 0,1 X TE waarvoor menlO minuten of meer bij 65°C nam. Het DNA kan bij 4°C 10 bewaard worden.
Plasmide-DNA werd ook bereid zoals beschreven door Maniatis c.s. in "Molecular Cloning" (Cold Spring Harbor Laboratory, 1982, biz. 8696). Het DNA-ligase werd van de New England Biolabs gekocht en werd gébruikt in een sterkte van 10.000 15 eenheden per ml in 50 mM Tris.HCl (pH * 7,8), 10 mM MgC^/ 20 mM DTT en 1 mM ATP. De analyse van het DNA over agarose-gel gebeurde zoals beschreven door Maniatis c.s. (Loc. cit.).
7,2. Opbouw van plasmidevectoren die de AcNPV-promotor gekoppeld aan DNA van het LAV/HTLV IXI-gag-gen bevatten (pAc-gagl).
20 De volgende onderafdelingen beschrijven het opbouwen van plasmidevectoren die reeksen van het LAV/HTLV III-gag-gen bevatten, voorafgegaan door AcNPV-reeksen die het afschrijven regelen en gevolgd door polyhedrine-DNA. Deze recombi-nant-plasmide-vectoren werden later gebruikt om voor LAV/HTLV III-25 gag coderende reeksen door recombinatie in vivo in het genoom van baculovirus in te bouwen.
In de komende onderafdelingen werd het voor LAV/HTLV III coderende DNA (figuur 14) gezuiverd uit pKS-5, een subkloon van lambda J19 (S. Wain-Hobson c.s. in Cell 40 (1985) 9) 30 en in plasmide Ac610 ingebouwd, benedenstrooms van de in pAcölO aanwezige baculovirus-polyhedrine-promotor, wat dan pAc-gagl geeft (figuur 15). In deze constructie wordt de voor LAV/HTLV III specifieke reeks nucleotiden voorafgegaan door de polyhedrine-promotor, wat een chimaer gen geeft, gevolgd door een poiyhydrine-35 gen.
Zoals eerder uitgelegd bestaat pKS-5 uit 9802422 4:. .¾ - 79 - 3148 base-paren (het DNA-fragment van LAV/HTLV III van SstI tot Kpnl) op plaats püCl8 in lambda J19. Het werd verkregen door het Sstl-restrictiefragment van J19 op de Sstl-plaats van püCl8 te klonen, wat ρΒΤ-ί gaf, dat met Kpnl verteerd en opnieuw gekoppeld 5 werd. Dit DNA werd gebruikt om E.coli en plasmide te transformeren en het werd geïsoleerd. Het voor LAV/HTLV lil specifieke DNA in pKS-5 loopt van de Sstl-plaats (nucleotide no. 224) tot de Kpnl-plaats (nucleotide no. 3372) van het LAV/HTLV III- genoom (S. Wain-Hobson, loc. cit., zie ook fig. 14). ν'
IQ Van het pKS-5 werd 10 microgram met HindlII
verteerd en SstI en de ontstane fragmenten werden uit elkaar gehaald door • elektroforese over een 1 % agarose-gel. Het fragment van 1818 base-paren (ongeveer 0,20 ^g) werd uit het gel gesneden. Dit fragment bevatte de voor LAV/HTLV III specifieke reeks nucleotiden 15 van no.'s 224 t/m 2042, zoals afgeheeld in figuur 14. Het omvat dus het gehele gag-gen.
Van pAcölO werd 5 microgram volledig uitverteerd met Smal en SstI en dan op een 1 % agarose-gel gefractio-neerd; de DNA-band (ongeveer 0,4 ^g) werd uit het gel gesneden 20 (fig- 15).
Beide stukjes gel werden 10 minuten op 65°C gesmolten en 3 ƒ11 van het voor LAV/HTLV III specifieke fragment van 1818 base-paren (verkregen met HindlII en SstI) werd gekoppeld aan 1 ƒ11 pAcölO (met Smal en SstI verkregen) in een totaal volume 25 van 40 ƒ11. Het incuberen gebeurde 16 uur bij 23°C (kamertemperatuur) . Het koppelmengsel werd toen 10 minuten op 65°C verhit, en gebruikt om stam HB101 van E.coli te transformeren. Plasmide-DNA uit voor ampicilline resistente transformanten werd getest op de aanwezigheid van het LAV/HTLV III-invoegsel. De structuur 30 van dit plasmide pAc-gagl staat in fig. 15.
7.3. Opbouw van recombinant-baculovlrus dat het chimaere LAV/ BTLV III-gag-gen bevat (Ac-gagl).
AcNPV werd via plaques gezuiverd en voort-gekweekc op 3f9-ceiien. DNA van ‘’wild" AcNPV werd geïsoleerd en 35 via pAc-gagl gezuiverd, zoals eerder beschreven (afdeling 7.1.2.).
Inbouw van het chimaere LAV/HTLV III in het 860 2 42 2
4 C
- 80 -
AcNPV-genoora gebeurde door reconbinatie in vivo, die mogelijk werd door^dat de gag-reeksen in pAc-gagl geflankeerd zijn door AcNPV-reeksen. Gezamenlijke transfectie van pAc-gagl-plasmide van DNA van "wild" AcNPV maakte recombinatie van de polyhedrine-5 reeksen op het plasmide met de homologe reeksen van het AcNPV-genoom mogelijk- Invoegen van het chimaere gen trad op als gevolg van dubbele recombinaties in de flankerende gedeelten. Dergelijke recombinanten hebben het chimaere gen ingevoegd in het AcNPV-polyhedrine-gen en zijn dus niet tot de vorming van in-10 sluitingslichaampjes in staat. De plaques van recombinant kunnen op het oog uitgezocht worden op het ontbreken van ingesloten virusdeeltjes.
1 microgram AcNPV-DNA, 5 microgram pAc-gagl en 15 microgram kal ver thymus-DNA werden gemengd en met ethanol 15 neergeslagen. Het neerslag werd met 70 % ethanol uitgewassen en aan de lucht gedroogd onder een weefselkweekkap, en dan opnieuw gesuspendeerd in 437 ^il water. CaC^ werd toegevoegd tot 0,25 M (63 ^il 2 M CaCl2 bij 437 ƒ11 water met DNA) . Onder doorborrelen van lucht door 500 ul 2kHEBS werd de DNA-oplossing druppelsgewijs.
20 toegevoegd (1 druppel per 4 seconden). 2>iHEBS bevat per ml 16 mg NaCl, 2 mg G-glucose, 0,75 ml KCl, 0,5 mg Na2HPC>4.12^0 en 9,5 mg pH = 7,1. Het mengsel werd 30 minuten bij kamertemperatuur ge- incubeerd en dan uitgegoten in een Petrischaal van 60 mm die 6 3 x 10 Sf9-cellen in 2 ml insectenmedium van Grace bevatte, met 25 10 % foetaal runde-r serum en antibiotica, maar zonder gist-auto-lysaat of lactalbumine-hydrolysaat. De DNA-oplossing werd druppelsgewijs aan de cellen toegevoegd en de schaal werd 4 uur bij 28°C gelncubeerd. De schaal werd uitgespoeld met 4 ml medium van
Grace met runderserum en antibiotica, en na toevoegen van dimethyl-30 sulfoxyde tot 20 % werd het nog 90 seconden gelncubeerd.
De schaal werd driemaal met compleet medium uitgespoeld en dan bij 28°C gelncubeerd met 4 ml compleet medium.
Na 5 dagen werden de bovenstaande vloeistoffen verzameld en door 5 minuten op 1000 g geklaard. Deze virus-opiossing werd op Sf9-^ cellen getitreerd en de plaques zonder insluitingslichaampjes werden op het oog geïdentificeerd. Deze werden er uit genomen en 8602422 « - 81 - nog tweemaal via plaques op Sf9-cellen voortgekweekt. Die gezuiverde virus-oplossingen werden voor verdere karakterisering aangehouden. Een schematische weergave van het ophouwen van de recombinant staat in figuur 16.
5 7.4. Expressie van LAV/HTLV III-gag in met recombinant-baculo- virussen geïnfecteerde weefselkweekcellen.
Het recombinant-AcNPV met het chimaere LAV/ HTLV XII-gag-gen bleek in staat te zijn bij infectie van weefsel-kweekcellen het LAV/HTLV in-gag-DNA tot expressie te brengen.
10 De gevormde eiwitten bleken immunoreactief met serum uit AIDS-patiênten.
7.4.1. Identificatie van voor LAV/HTLV III-gag specifiek RNA in met Ac-gagl geïnfecteerde cellen.
Tien Petrischalen van 100 mm met Sf9-cellen 7
15 (ongeveer 10 cellen per schaal) werden geïnfecteerd met AcNPV
van het wilde type of met zijn recombinant Ac-gagl, tot een gemiddelde infectiegraad van 4. Na 24 uur werden de cellen geoogst en tweemaal uitgewassen met 0,15 M NaCl + 0,01 M Tris.HCl (pH = 7,2). Polyadenyl-RNA werd geïsoleerd zoals beschreven door A.F. Purchio 20 en G.C. Fareed in J. Virol 29 (1979) 763-9. Het RNA werd gefrac-tioneerd over een 1 % agarose-formaldehyd-gel (H. Lehrach c.s. in Biochemistry _16 (1977) 4743-4251), op een nylon filter (Hybond) overgebracht en met UV bestraald. Voor de hybridisering werd het filter 16 uur bij 42°C in contact gehouden met DNA van pKS-5 dat 32 25 met P gemerkt was, en wel in 0,9 M NaCl met 50 mM Na^HPO^ (pH = 7,0), 5 mM EDTA, 0,1 % NaDS, 4 X Denhardts, 0,4 mg/ml tRNA, 0,25 mg/ml kalverthymus-DNA en 50 % formamide. De filters werden viermaal met 0,1 % NaDS uitgewassen, 30 minuten in 0,25 X SSC van 65°C gehouden en onder toepassing van "Lightening Plus" 30 versterkingsfilter werd er röntgenfilm "Cronex 4" mee belicht.
Figuur 17 laat zien dat de voornaamste band met 2200 base-paren wel in met recombinant-AcNPV geïnfecteerde cellen gevonden wordt, maar niet in de cellen die met het wilde type geïnfecteerd waren. 7.4.2. Identificatie, van aan LAV/HTLV III-gag verwante siwxtten 35 in met recombinant-baculovirus geïnfecteerde cellen, met immunoprecipitatie-technieken.
HO 2 422 t ·ί - 82 -
De hierna te beschrijven immunoprecipitatie-proef laat zien dat met recombinant-baculovirus volgens deze uitvinding geïnfecteerde cellen eiwitten maken die specifiek immunoreactief zijn met serum uit AIDS-patiënten.
5 Sf9-cellen werden uitgezaaid op schalen van 60 mm (5 x 10^ cellen per schaal) en geïnfecteerd met AcNPV van het wilde type in Ac-gagl. Op 24, 48 en 72 uur na de infectie werden de media vervangen door methionine-vrij medium en werden de cellen nog 30 minuten bij 28 °C geïncubeerd. Op dat moment 10 werden de media vervangen door methionine-vrij medium dat l'OO 35 uCi/ml aan S-methionine bevatte, en voor het inbouwen van dit merk nam men 2 uur bij 28 °C.
Na afloop daarvan werden de cellen tweemaal gewassen met 0,01 M Tris.HCl met 0,15 M NaCl (pH =7,2) en door 15 centrifugeren verzameld. Van elke schaal werd het sediment gesuspendeerd 'in 1 ml lysis-buffer: 1 % NP-40 (gepolyoxyethyleerd p-tert-octylfenol), 0,5 % natriumdeoxycholaat, 0,1 M NaCl, 0,01 M Tris.HCl en 1 mM EDTA (pH = 7,4) , en het lysaat werd geklaard door 30 minuten centrifugeren op 100.000 g.
20 Immunoprecipitatie gebeurde door 4 ƒ11 door verhitting geïnactiveerd menselijk serum (hetzij van een blanco groep hetzij van AIDS-patiënten) aan 500 ml cel-lysaat toe te voegen. Na een i uur incuberen op 4°C werd 80 ƒ11 geactiveerde Staphylococcus aureus-cellèn ("Pansorbine-cellen" van de 25 Calbiochem-Behring Corp. te La Jolla, CA) toegevoegd en incubeer-de men nog een £ uur op 4°C. De neerslagen werden door 5 minuten centrifugeren op 5000 rpm bij 4°C verzameld en eenmaal uitgewassen met 1 M NaCl + 0,1 % NP-40 + 0,01 M Tris.HCl (pH = 7,4) en viermaal met RIPA-buffer (10 mM Tris.HCl met 0,15 M NaCl, 1 % 30 natriumdioxycholaat, 1 % natriumlaurylsulfaat en 1 % Triton X-100, pH =7,2). De gewassen neerslagen werden gesuspendeerd in 80 ƒ11 monsterbuffer van Laemmli, 1 minuut gekookt en 5 minuten op 5000 rpm gecentrifugeerd. De neergeslagen eiwitten die nu in de bovenstaande vloeistof zaten werden geanalyseerd door elektrofo-35 rese over polyacrylamide-gelen met 10 % NaDS. Na de elektroforese werden de gelen met Koomassie-blauw gekleurd, met natriumsalicylaat 8602422 % * - 83 - behandeld (30 minuten bij kamertemperatuur in 1 M natrium-salicylaat) en voor fluorografie gedroogd.
Het is wel gesuggereerd dat rijpe gag-eiwit-ten (24.000 dalton p24, 16.000 dalton pl6 en 14.000 dalton pl4) 5 afkomstig zijn van een grotere voorloper van 55.000 dalton.
Figuur 14 laat zien dat eiwitten met molecuulgewichten van 67.000, 55.000, 40.000, 34.000, 32.000 en 24.000 dalton specifiek door het serum van AIDS-patiënten neergeslagen worden.
Om na te gaan of er een voorlqper/produkt-10 verband tussen de in figuur 18 afgeheelde immunoreactieve eiwitten bestaan werd een "polsslag-proefM uitgevoerd. Sf-9-cellen werden op de hierboven beschreven wijze geïnfecteerd en 24 uur daarna werden ze gedurende 5 minuten met 35S methionine gemerkt; de cellen werden toen met compleet medium uitgewassen en voor 15 2, 4 of 8 uur met compleet medium gelncubeerd. Op die tijdstippen werden de cellen geoogst en immunogeen neergeslagen. Deze neerslagen werden op de hierboven beschreven wijze door elektroforese over polyacrylamide-gel met 10 % NaDS gefractioneerd. Figuur 19 toopt een fluorogram van dat experiment. De gegevens doen ver-20 onderstellen dat p67, p55, p40, p34 en p32 na 5 minuten het merk opgenomen hebben maar na 8 uur neemt in p67 en p55 het merk af en neemt dat in p34 toe. De hoeveelheid radioactief merk in p40 blijft betrekkelijk constant.
7.4.3. Identificatie van aan LAV(HTLV III-gag verwante eiwitten 25 met ELISA.
7
Tien schalen van 100 mm met in elk 10 Sf-9- cellen werden met Ac-gagl geïnfecteerd en 24 uur later werden de cellen geoogst, tweemaal met 0,01 M Tris.HCl + 0,15 M NaCl (pH = 7,2} gewassen, en driemaal bevroren en ontdooid. De cellen werden 30 opengebroken door ze 5 minuten onder ijskoeling in 2 ml PBS met 0,5 % NP-40 te houden. Het lysaat werd 10 minuten op 1000 g gecentrifugeerd en de bovenstaande vloeistof werd weggedaan. Nu werd 4 ml carbonaat-buffer (50 mM Na^CO^, pH = 9,6) en het mengsel werd 20 minuten in een Eppendorf-centrifuge gedraaid. De boven-35 staande vloeistoffen werden er uit genomen en op de in tabel VIII aangegeven wijze met carbonaat-buffer verdund. Deze lysaten werden %602422 - 84 - gebruikt om overnacht bij 4°C de putjes van microtiter-platen te bekleden (50 ƒ11 per putje). Nu werd 300 ƒ.1 blokkeringsreagens (5 % vetvrije melkpoeder, 0,01 % thimerosol en 0,01 % antischuim A in 10 X PBS) in ieder putje gebracht en werd er 45 minuten op 5 kamertemperatuur geincubeerd. Het blokkeringsreagens werd weggezogen en 50 ^il 1:100 verdund menselijk serum in blokkeringsreagens werd in elk putje gebracht. Maar eerst was dat verdunde serum (van AIDS-patiënten of van normale mensen) 45 minuten op 37°C geincubeerd.
10 Nadat men 1 uur op 37°C had laten reageren werden de putjes driemaal uitgewassen met NaCl + Tween-20, en in elk daarvan werd 100 ƒ11 conjugaat van rammenas-peroxydase met geiten-globuline tegen de mens (1:100 verdund in 0,01 % thimerosol) gebracht. Nadat men 1 uur op 37°C had laten reageren werden de 15 platen gewassen en werd in elk putje 100 ƒ11 gebufferd substraat met chromogeen gebracht (het gebufferde substraat bestond uit waterstofperoxide, citroenzuur en fosfaat-buffer en het chromogeen was tetramethylbenzidine in dimethylsulfoxyde). De platen werden 30 minuten op kamertemperatuur geincubeerd. De reactie werd ge-20 stopt door in elk putje 100 ƒ11 3 N zwavelzuur te brengen. De extinctie van het reactiemengsel werd bij 450 nm gemeten, alsmede een vergelijkingsextinctie bij 630 nm. De uitkomsten staan in tabel VIII. TRI, Y-l, CF22C en CF9 zijn sera van AIDS-patiënten, 2, 16, 21 en 48 zijn sera van gewone mensen.
25 8602422 3. -* - 85 -
Tabel VIII
Extincties bij de ELlSA-proef
Ac-gag 1
Lysaat-verdunning 5 Proef
Antiserum 1:50 1:100 1:200 1:400 1:800 1:1000 AIDS: TRI 2,619 2,471 2,235 2,076 1,786 1,499 2,504 2,479 2,216 2,119 1,877 1,500 10 Y-l 2,502 2,354 2,046 1,564 1,298 1,014 2,305 2,306 2,006 1,595 1,282 1,078 CF22C 2,486 2,317 1,924 1,393 1,009 0,811 2,319 2,241 1,838 1,331 1,068 0,848 CF9 2,303 2,110 1,339 0,855 0,636 0,512 15 2,209 2,012 1,305 0,850 0,659 0,455
Normaal: 2 0,221 0,204 0,312 0,199 0,228 0,222 0,229 0,187 0,176 0,227 0,208 0,210 16 0,176 0,175 0,217 0,131 0,144 0,129 20 0,165 0,135 0,139 0,210 0,175 0,147 21 "0,193 0,190 0,216 0,189 0,237 0,165 0,205 0,176 0,170 0,199 0,197 0,224 48 0,200 0,185 0,217 0,177 0,190 0,134 0,249 0,169 0,163 0,175 0,173 0,143 25
Tezamen genomen tonen de in figuren 17 t/m 19 en tabel VIII gegeven uitkomsten aan dat de hier beschreven recom-binant-baculovirussen in staat zijn (a) het ingevoegde LAV/HTLV III-gag-gen tot expressie te brengen, (b) de gen-produkten te 30 modificeren of te bewerken en (c) antigene eiwitten te maken die specifiek immunoreactief met het serum van AIDS-patiënten zijn.
8. Voorbeeld: Koepokvirus-gag-recombinanten
In het volgende voorbeeld werden plasmiden in elkaar gezet die chimaere genen bevatten met benedenstrooms 35 van het controlegebied voor het afschrijven LAV/HTLV Ill-gag- reeksen. Het chimaere gen met de 7,5K koepokvirus-promotor en de LAV/HTLV III-gag-reeks werd door recombinatie in vivo in het genoom van koepokvirus ingebouwd. Dergelijke recombinant-virussen werden geïdentificeerd en gezuiverd en virus-voorraden werden uit de ge- $602422 4 i - 86 - infecteerde weefselkweekcellen aangemaakt. Aangetoond werd dat immunoreactieve, aan LAV/HTLV III-gag verwante eiwitten in vitro door de recombinant-koepokvirussen gemaakt werden. Een gedetailleerde beschrijving van alle stappen van deze uitvoeringsvorm 5 van de uitvinding komt in de nu volgende onderafdelingen. De technieken waren in het algemeen net zoals die van afdeling 6.1.
8.1. In elkaar zetten van plasmiden die een koepokvirus-promotor gekoppeld aan informatie van het LAV/HTLV III-gag-gen bevatten.
10 Er werden vijf plasmideh in elkaar gezet die de 7,5K koepokvirus-promotor bevatten, gekoppeld aan diverse stukken van het LAV/HTLV-III genoom, alle met reeksen die voor gag coderen. De herkomst van deze voor LAV/HTLV III-gag coderende reeksen was twee verwante subklonen van lambda J19 (Wain-Hobson 15 c.s., in Cell 40, (1985) 9), pKS-5 en pSS-5. Plasmide pKS-5 bevat een fragment van 3148 baseparen van het LAV/HTLV III-DNA tussen de plaatsen SstI en Kpnl (nucleotiden no.'s 224 t/m 3372) ingevoegd op de overeenkomstige plaatsen van pUCl8. Plasmide pSS-5 bevat een fragment van 5107 base-paren van het LAV/HTLV III-DNA tussen 20 plaatsen SstI en Sail (nucleotiden no.'s 224 t/m 5221) ingevoegd op de overeenkomstige plaatsen van het pUCl8. Diverse van pKS-5 of pSS-5 afgeleide, voor gag coderende stukken werden in plasmide pGS62 ingevoegd, dat identiek is aan PGS20 (zie Mackett c.s. in J. Virol. _49_ (1984) 857-864) behalve dat het benedenstrooms 25 van de unieke Smal-plaats een unieke EcoRI-plaats heeft, (zie figuur 2θ). De in pGS62 ingevoegde, voor LAV/HTLV III specifieke reeksen beginnen met een plaats Thai (FnuDII)-plaats (nucleotide no. 257) 76 base-paren bovenstrooms van het startsignaal van het gag-gen. Plasmiden pv-gagl, pv-gag2, pv-gag3, pv-gag4 en pv-gag5 30 bevatten voor LAV/HTLV III specifieke reeksen vanaf deze Thal-plaats tot aan EcoRI (no. 4194), tot Kpnl (no. 3372) tot EcoRV (no. 2523), tot Bell (no. 1975) of BglII (no. 1642). De constructie van al deze plasmiden is beter te begrijpen door op figuur 20 te letten.
35 Opbouwe van pv-gagl: Met restrictie-enzymen
Thai en EcoRI werd 5 ^ig DNA van het plasmide pSS-5 volledig uit- 8802422
i. J
- 87 - verteerd. De ontstane fragmenten werden door elektroforêse over een 1 % agarose-gel gefractioneerd. Een fragment van 3900 base-paren met de voor LAV/HTLV IXI-gag coderende reeksen werd geïsoleerd en gekoppeld aan pGS62-DNA dat vooraf met Smal en EcoRI 5 verteerd was. Het koppelingsmengsel werd gebruikt om HB101 van . E.coli te transformeren en voor ampicilline bestendige klonen werden er uit gezocht. Plasmiden van afzonderlijke koloniën werden door restrictie-analyse en door het regenereren van de EcoRI-plaats.op de koppelingsplek onderzocht op de aanwezigheid van het 10 invoegsel van 3900 base-paren. Het resultaat bevatte de hele gag-reeks en de protease-genen, alsmede een belangrijk deel van het open af te lezen gebied "pol", totaan de EcoRI-plaats (nucleotide no. 4194) .
Opbouw van pv-gag2: Met restrictie-enzymen 15 Thai en Smal werd S yiq plasmide pKS-5 volledig uitverteerd. De
Smal-plaats van pKS-5 ligt naast de Kpnl-plaats, welke het koppe-lingspunt van de van LAV/HTLV III afkomstige reeks en de meervoudige kloningsplaatsen van het plasmide püCl8 is. De ontstane * fragmenten werden door elektroforese uit elkaar gehaald en een m 20 fragment van 3200 base-paren met de LAV/HTLV III-gag-reeksen werd geïsoleerd en gekoppeld aan DNA van pGS62 dat vooraf met Smal verteerd en met alkalisch fasfatase uit kalverdarmen behandeld was. Het koppelingsmengsel werd gebruikt om stam HB1Q1 van E.coli te transformeren en de tegen ampicilline bestendige klonen werden 25 geselecteerd. Plasmiden van afzonderlijke koloniën werden op de aanwezigheid van het fragment van 3100 base-paren getest en door restrictieanalyse werd de oriëntatie van het invoegsel bepaald.
Het resultaat, pv-gag2, bevatte het gehele gag-gen, het protease-gen en een deel van het open af te lezen gebied "pol" tot aan de 30 lipnl-plaats (nucleotide no. 3372).
Opbouw van pv-gag3 ging net als die van pv-gag2, behalve dat op de Smal-plaats van pGS62 een door vertering van pKS-5 met Thai en EcoRV gegenereerd fragment van 2300 base-paren ingevoegd werd. Het uiteindelijke bouwsel, pv-gag3, 35 bevat het gag-gen en het protease-gen helemaal en een klein deel van "pol", gekoppeld aan het 3'-deel van het koepokvirus.
8602422 i t - 88 -
Opbouw van pv-gag4: met SstI en Bell werd 5 ^ig DNA van plasmide pSS-5 volledig verteerd. Het daarbij ontstane fragment dat de LAV/HTLV Ill-gag-reeks bevatte werd gezuiverd. Dit fragment werd gekoppeld aan plasmide pICl9R (Marsh c.s.
5 in Gene 32 (1984) 481-5) dat vooraf met SstI en BamHI tot een plasmide-tussenprodukt verknipt was. Inbouwen van de gag-informa-tie op de BamHI-plaats van pICl9R leidt tot plaatsing van de Bell-plaats van de LAV/HTLV III-reeks op de EcoRI-plaats van de kloningsvector met meerdere restrictieplaatsen. Vertering van 10 dit tussenprodukt met restrictie-enzymen Thai en EcoRi gaf een fragment van 1720 base-paren dat gemakkelijk op de Smal- en EcoRi-plaatsen van plasmide pGS62 ingebouwd kon worden. De uiteindelijke constructie, pv-gag4, bevat het gehele LAV/HTLV 111-gag-gen en een deel van het protease-gen aan het 3'-deel van het 15 TK-gen van het koepokvirus.
Bij het opbouwen van het plasmide pv-gag5 werd dezelfde tweestapsstrategie gebruikt als voor pv-gag4. Met restrictie-enzymen SstI en BglII werd 5 microgram pSS-5 verteerd. Een fragment van 1420 base-paren met de LAV/HTLV Ill-gag-reeks 20 werd geïsoleerd en over een 1 % agarose-gel gezuiverd, en dan op de SstI en BglII-plaatsen van plasmide plCl9R ingevoegd. Koppeling van de gag-reeks op de BglII-plaats met de overeenkomstige plaats pICl9R maakt (a ) het genereren van een stopcodon in fase met het open af te lezen deel van gag mogelijk, en (b) de plaatsing van 25 de BglII-plaats naast de EcoRi-plaats op dit plasmide. Dit tussenprodukt werd toen met Thai en EcoRi verteerd. Een fragment van 1390 base-paren met de LAV/HTLV Ill-gag-reeksen werd gezuiverd en op de Smal en EcoRi-plaatsen aan plasmide pGS62 gekoppeld. Het ontstane plasmide, pv-gag5, bevat het meeste maar niet alles van 30 de informatie voor de gag (tot aan de Bglll-plaats toe) gekoppeld in een open af te lezen stopreeks.
8.2. Opbouw van recombinant-koepokvirussen met chimaere LAV/ HTLV III-gag-genen.
Het inbouwen van de chimaere LAV/HTLV II-35 gag-genen vanuit de plasmiden pv-gagl, pv-gag2, pv-gag3, pv-gag4 en pv-gag5 in het koepokvirus-genoom werd gerealiseerd met het- 3602422 % Λ - 89 - zelfde protocol als voor het opbouwen van v-env5 en v-env2 (zie afdeling 6.3.). In de nu komende voorbeelden werden alle recombi-nant-virussen opgebouwd vanuit de via plaques gezuiverde stam van de New York City Board of Health (v-NY, zie afdeling 6.1.1).
5 TK -recombinanten werden uitgekozen en driemaal via plaques gezuiverd voordat ze tot virus-voorraden vermenigvuldigd werden, welke voor de daarna komende karakteriseringen dienden. Van pv-gagl, pv-gag2, pv-gag3, pv-gag4 en pv-gag5 afgeleide recombinant-virussen kregen respectievelijk de aanduidingen v-gaglNY, v-gag2NY, 10 v-gag3NY, v-gag4NY en v-gag5NY.
8.3. Expressie van LAV/HTLV III-gag in met recombinant-koepokvirus geïnfecteerde weefselkweekcellen.
De hierboven beschreven recombinant-koepok-virussen met het chimaere LAV/HTLV iil-gag-gen waren in staat bij 15 infectie van weefselkweekcellen aan LAV/HTLV III-gag-verwante eiwitten te vormen. Sommige van deze recombinanten waren in staat het eiwit p55 (een voorloper van het gag-eiwit) tot "rijpe" eiwitten p25 en pl8 te verwerken. Deze eiwitten bleken immunoreac-tief met serum uit AIDS-patiënten en/of monoklonale antilichamen 20 tegen de gag-eiwitten p25 of pl8.
Samenvloeiende BSC-40-cellen werden op Petrischalen van 60 mm tot een gemiddelde entindex van 10 geïnfecteerd met de moederstam van het koepokvirus (v-NY) of met de re-combinant-derivaten daarvan v-gaglNY, v-gag2NY, v-gag3NY, 25 v-gag4NY of v-gag5NY. Men liet de infectie 12 uur verlopen, waarna de cellen geoogst, eenmaal met PBS gewassen en door centrifugeren verzameld werden. De cel-sedimenten werden weer gesuspendeerd in 0,3 ml monsterbuffer van Laemmli en gelyseerd door ze 4 minuten te koken. Het totale celeiwit in een 20 ^il-portie van het 30 cel-lysaat werd door elektroforese over een polyacrylamide-gel met 15 % NaDS gefractioneerd. Een monster van het gezuiverde LAV/HTLV III-virus en een aliquoot van het lysaat van onecht geïnfecteerde cellen dienden als blanco's.
De inhoud van het gel werd elektrisch op een 35 nitrocellulose-filter overgebracht. Men liet het filter eerst reageren met serum van AIDS-patiënten of met een combinatie van monoklonale antilichamen tegen de gag-eiwitten p25 en pl8. Na uit- S 6 0 2 42 2 i f - 90 - voerig uitwassen liet men het filter vervolgens reageren met aan alkalisch fosfatase gekoppeld geiten-immunoglobuline tegen de mens (in de gevallen dat serum van patiënten gebruikt werd) of met aan alkalisch fosfatase gekoppeld geiten-immunoglobuline 5 tegen de muis (in de gevallen dat monoklonale antilichamen uit de muis gebruikt werden). De omstandigheden voor de eerste en tweede antilichaam-reacties en bij het uitwassen waren als beschreven in afdeling 6.4.1. Het uiteindelijke uitwassen na de tweede reactie met antilichamen gebeurde met 0,1 M Tris + 0,1 M 10 NaCl + 5 iM MgC^ (pH = 9,5) . Aan de antigenen op het filter gebonden antilichamen werden gevonden door het filter te laten reageren met een oplossing die 0,1 M Tris, 0,1 M NaCl, 5 mM MgC^, 0,33 mg/ml broomchloorindolylfosfaat en 0,17 mg/ml nitroblauw-tetra-zolium (pH = 9,5) bevatte. Nadat de filters met de chromogenen 15 gereageerd hadden werden ze met water gespoeld, aan de lucht gedroogd en gefotografeerd.
De uitkomsten van dit onderzoek staan in figuur 21. Recombinanten v-gaglNY en v-gag2NY omvatten de genen voor de kerneiwitten en protease helemaal. Deze recombinanten 20 maakten een groep van aan LAV/HTLV III verwante eiwitten die bij elektroforese met p55, p40, p25 en pl8 (de voornaamste kem-eiwitten van LAV/HTLV III) mee ligpen. Deze eiwitten waren immuno-reactief met zowel het serum van AIDS-patiënten (figuur 21B) als tegen monoklonale antilichamen van de muis tegen p25 en pl8 25 (figuur 21a). Recombinant v-gag3NY bevat zowel de genen voor kern-eiwit als voor protease, maar zijn open af te lezen gedeelte "pol" zit in fase gebonden aan het deel van het koepokvirus-TK-gen voor het carboxyl-uiteinde. V~gag3NY was ook in staat het primaire produkt van het gag-gen, p55, te maken. Maar het verwer-30 ken van p55 scheen minder efficient te gebeuren dan van v-gaglNY en v-gag2NY, daar er in de lysaten van met v-gag3NY geïnfecteerde cellen veel minder p25 en p 18 zat. Recombinant v-gag4NY bevat het gehele gag-gen, maar slechts een gedeelte van het protease-gen. Het maakte, een aan .LAV/HTLV lil verwant eiwit dat in grootte 35 vergelijkbaar was met p55. Recombinant v-gag5NY had slechts een deel van het gag-gen en maakte een beknot eiwit van 43.000 dalton (figuur 21C) . Hoewel zowel v-gag4NY als v-gag5NY een primaire aan 8802422 # - - 91 - &. * gag verwante eiwitten efficient schijnen te verwerken waren hun produkten immunoreactief voor monoklonale antilichamen tegen p25 en p!8. Samengevat: ondanks de verschillen in vermogens tot verwerken waren alle vijf recombinanten in staat immunoreactieve 5 eiwitten te maken die de voornaamste epitopen van de aan LAV/HTLV III-kernen verwante eiwitten bevatten.
9. Voorbeeld: Baculovirus-omhullingsrecombinanten.
In het volgende voorbeeld werd een plasmide opgebouwd dat een chimaer gen bevat dat benedenstrooms van het 10 afschrijfstartsignaal van AcNPV de voor LAV/HTLV III-omhulling coderende reeksen bevat. Het chimaere gen bevatte de AcNPV-polyhedri-ne-promotor en de voor LAV/HTLV III-omhulling coderende reeks, en dat werd door recombinatie in vivo ingebouwd in het genoom van AcNPV. Recombinant-virus werd geïdentificeerd en gezuiverd 15 en uit de bovenstaande vloeistoffen van geïnfecteerde cellen werden virus-voorraden aangemaakt. Immunoreactief, aan LAV/HTLV HI-omhulling verwant eiwit bleek in vitro door het recombinant-baculovirus gemaakt te worden. Een gedetailleerde beschrijving van alle stappen van deze uitvoeringsvorm van de uitvinding komt 20 hierna. De algemene proceduresvoor deze uitvoeringsvorm waren als beschreven in afdeling 7.1.
9.1. Opbouw van plasmiden met AcNPV-promotor aan de reeksen voor de LAV/HTLV III-omhulling.
Voor LAV/HTLV III-omhulling coderende reeksen 25 werden gezuiverd uit pv-env5 (zie afdeling 5.3), dat gebruikt werd voor het opbouwen van recombinant-koepokvirus v-env5, dat de aan omhulling verwante eiwitten bleek te maken. Het voor de omhulling coderende gebied van pv-env5 werd, samen met 96 base-paren aan het 5'-uiteinde en 223 base-paren aan het 3'-uiteinde 30 (welke onvertaald bleven), aan beide kanten geflankeerd door BamHI-plaatsen. Gedeeltelijke vertering van dit plasmide (dat ook een interne BamHI-plaats had) met restrictie-enzym BamHI gaf een fragment van 2900 base-paren dat alleen voor LAV/HTLV III specifieke reeksen bevatte. Dit fragment (ongeveer 0,5 jxg) werd 35 geïsoleerd en gezuiverd door elektroforese over een 1 % agarose-gel, en het werd gekoppeld aan 0,5 ^ig plasmide pAc610 dat vooraf 3602422 « - 92 - * $ met BamHI onvertakt gemaakt en met alkalisch protease uit kalver-darmen behandeld was. Het koppelingsmengsel werd gebruikt om stam MC1000 van E.coli om te bouwen, en tegen ampicilline bestendige koloniën werden eruit gehaald. Het plasmide-DNA van afzonderlijke 5 transformanten werd beproefd op de aanwezigheid van voor LAV/ HTLV III-omhulling coderende reeksen (d.i. de aanwezigheid van fragmenten van 2300 en 540 base-paren bij vertering met BamHI) en op de oriëntatie van het invoegsel. Plasmide met de informatie voor LAV/HTLV III-omhulling met de juiste oriëntatie werd ge— 10 zuiverd en kreeg de aanduiding "pAc-env5". Zijn structuur is in figuur 22 afgeheeld.
9.2. Opbouw van recombinant-baculovirus met chimaer gen voor LAV/HTLV III-omhulling.
Inbouwen van het chimaere gen voor LAV/ 15 HTLV III-omhulling in het AcNPV-genoom gebeurde door recombinatie in vivo, zoals toegelicht in afdeling 7.3. Ombouwen van DNA uit AcNPV (1 mg), pAc-env5 (5 mg) of uit kalverthymus (15 mg) in Sf9-cellen gebeurde zoals in die zelfde afdeling beschreven. Na 5 dagen incuberen op 28°C met 4 ml compleet medium werden de boven-20 staande vloeistoffen genomen en door 10 minuten afdraaien op 1000 g geklaard. De virus-voorraad werd op Sf9-cellen getitreerd en het recombinant-virus werd eerst als volgt door plaque-hybridi-sering (volgens M.D. Summers en G.E. Smith) geïdentificeerd: SF9-cellen werden in serumvrij TNM-FH-medium 25 op kweekplaten van 60 x 15 mm uitgezaaid tot een dichtheid van 6 2,5 x 10 cellen per plaat. Nadat de cellen aangehecht hadden werden de media verwijderd en werd op elke plaat 1 ml verdunde virus-ent gebracht. Na afloop van 1 uupincuberen op 27°C werd alle vloeistof verwijderd en werd vanaf de rand op elke plaat 4 ml laag smel-30 tende agar gegoten. Nadat die gestold was werden de platen 4-6 dagen onder vochtige omgeving geïncubeerd, of totdat de plaques goed gevormd waren. Men liet de platen drogen door ze gedurende een nacht of langer in een omgeving zonder vocht te laten. Toen ze droog genoeg waren werden de agarose-dekiagen verwijderd en 35 werd op elke plaat met overblijvende cellen een droog nitrocellulose-filter geplaatst. Bovenop dat filter werd een filtreerpapier van 8602422 * · - 93 - ï 4 47 mm doorsnede (Whatman 3 MM) geplaatst dat aan oplossing A verzadigd was (0,05 M Tris.HCl + 0,15 M NaCl, pH = 7,4) . Na dit opzuigen werd het nitrocellulose-filter voorzichtig verwijderd en met de cellen-kant naar boven geplaatst op een Whatman-filter 5 dat aan oplossing B verzadigd was (0,5 N NaOH +1,5 M NaCl)- Na 2-3 minuten werd het nitrocellulose-filter op papieren doekjes aan de lucht gedroogd en overgebracht op een Whatman-filter dat aan oplossing C verzadigd was (1,0 M Tris.HCl + 1,5 M Nacl, pH = 7,4). Na 2-3 minuten werd het nitrocellulose-filter op papieren 10 doekjes aan de lucht gedroogd en uitgewassen door voorzichtig onderdompelen in een Petrischaal met oplossing D (0,3 M NaCl + 0,03 M natriumcitraat). Het werd dan verwijderd en op papieren doekjes gedroogd, en 2 uur onder vacuum op 80°C gebakken. Het 32 filter werd nu gehybridiseerd met pRS-3 dat met P gemerkt was.
15 Recombinant-virussen werden eruit gepikt én weer op Sf9-cellen getitreerd. Plaques zonder insluitingslichaampjes werden er op het oog uitgezocht. Deze .hierna'nog 3 malen via plaques gezuiver-denwerden gebruikt voor het aanmaken van virus-oplossingen voor hierna komend'onderzoek.
20 9.3. Vorming van aan LAV/HTLV Ill-omhulling verwante eiwitten in met recombinant-baculovirus Ac-env5 geïnfecteerde weefsel-kweekcellen.
De recombinant AcNPV met het chimaere gen voor de LAV/HTLV Ill-omhulling bleek in staat te zijn bij infec-25 tie van cellen in weefselkweken deze eiwitten te doen ontstaan.
Ze bleken immunoreactief met het serum van AIDS-patiênten en ook met monoklonale antilichamen die de LAV/HTLV III-omhullings-eiwitten gpllO en gp41 definiëren.
Op schalen van 100 mm uitgezaaide Sf9-cel- 7 30 len (1 x 10 ) werden tot een gemiddelde entindex van 5 geïnfecteerd met AcNPV van het wilde type of met zijn recombinant Ac-env5, en 28 uur na die infectie werd het medium vervangen door methionine-vrij medium zonder aanvullingen. Na 30 minuten werd dat medium vervangen door 2 ml van het zelfde methionine- 35 35 vrije medium waaraan 100 jxC±/ml aan S-methionine toegevoegd
was. Na 2 uur merken bij 28°C werden de cellen tweemaal met PBS
8802*22 Α- ï1 % * - 94 - gewassen en weer gesuspendeerd in 1 ml lysis-buffer, zoals in afdeling 6.4,2 beschreven. Immunoprecipitatie gebeurde ook zoals beschreven in afdeling 6.4.2, zowel met serum van AIDS-patiënten als met monoklonale muizenserum tegen gpllO en gp41.
5 De uitkomsten van dit onderzoek, afgebeeld in figuur 23, laten zien dat het recombinant-virus Ac-env5 voornamelijk één aan LAV/HTLV III-omhulling verwant eiwit van 150 kD maakte. Omdat het samen metioov koepokvirus-recombinant v-env5 gesynthetiseerd gpl50 liep en met serum van AIDS-patiënten en 10 met monoklonale antilichamen tegen gpllO en gp41 immunoreactief was was dit eiwit de geglycosyleerde voorloper van het omhullings-eiwit gpl50. Het verwerken van dit molecuul ging kennelijk niet efficient, daar na 2 uur radioactief merken geen gpllO of gp41 te vinden was. Maar daar de voornaamste epitopen van gpllO en 15 gp41 beide in deze voorloper aanwezig zijn is dit eiwit potentieel waardevol, zowel als diagnose-reagens als als immunogeen.
10. Beschikbaarheid van microörganismen.
De volgende stammen van E.coli met de te noemen plasmiden zijn gedeponeerd bij de Agricultural Research 20 Culture Collection (NRRL) te Peoria, ID, en hebben daar de volgende nummers gekregen: E.coli Stam _ Plasmide Registratienummer
Kl 2, MC1000 pv-envl NRRL B-18003
Ki 2, MCI000 pv-env2 NRRL B-18004 25 K12, MCI 000 pv-env5 NRRL B-18005 K12, MC1000 pv-env7 NRRL B-18110 K12, HB101 pv-gagl NRRL B-18111 K12, HB101 pAc-gagl NRRL B-18105 K12, NP1829 pAc-env5 NRRL B-18109 30 De volgende recombinant-virussen zijn bij de American Type Culture Collection te Rockville, MD, gedeponeerd en hebben daar de volgende nummers gekregen: 8602422 % 5 * - 95 -
Recombinant-virus Registratienummer v-env2 ATCC VR 2114 v-env5 ATCC VR 2113 v-env7 ATCC VR 2148 5 v-env5NY ATCC VR 2149 v-gaglNY ATCC VR 2150
Ac-gagl ATCC VR 2147
Ac-env5 ATCC VR 2151
De strekking van deze uitvinding wordt niet 10 beperkt door de gedeponeerde bacteriën en virussen daar die slechts individuele belichamingen van een aspect van de uitvinding vormen en alle functionele equivalenten daarvan ook binnen het kader van de uitvinding vallen. Dit zal voor de vakman duidelijk zijn.
Men zal ook begrijpen dat alle voor nucleoti-20 den opgegeven afmetingen in aantallen base-paren slechts bij benadering gelden en alleen voor een beter begrip genoemd waren.
25 S S ö 2 4 2 2

Claims (5)

1. Recombinant-virus waarvan het genoom een nucleotiden-reeks omvat die voor een epitoop van LAV/HTLV III 5 codeert, of een antigeen gedeelte daarvan bevat dat onder de controle van een tweede nucleotiden-reeks is die de gen-expressie regelt zodat een peptide' of eiwit dat aan het epitoop van LAV/HTLV III verwant is in een met het virus geïnfecteerde gastheer gevormd wordt.
2. Recombinant-virus volgens conclusie 1 waarvan de nucleotidenreeks die voor het epitoop van LAV/HTLV III codeert het gen voor de omhulling van LAV/HTLV III of gedeelte daarvan omvat en voor een antigeen peptide of eiwit codeert.
3. Recombinant-virus volgens conclusie 2, 15 waarvan de nucleotidenreeks voor het omhullingsgen de in figuur 2 afgebeelde reeks nucleotiden met no.'s 5767 t/m 8449 omvat, of een gedeelte daarvan dat voor een antigeen peptide of eiwit codeert .
4. Recombinant-virus volgens conclusie 1 20 dat in een geïnfecteerde gastheer tot expressie komt in een peptide of eiwit dat verwant is aan een omhullingsepitoop van LAV/HTLV III of antigeen gedeelte daarvan.
5. Recombinant-virus volgens conclusie 4, waarvan de omhullingsepitoop een peptide of eiwit omvat met een 25 aminozuur-volgorde in hoofdzaak zoals afgeheeld in figuur 2, van aminozuren no.'s 1 t/m 861, of met een antigeen gedeelte daarvan.
6. Recombinant-virus volgens een der voorafgaande conclusies dat een omhuld virus omvat.
7. Recombinant-virus volgens conclusie 6 30 dat een koepokvirus omvat.
8. Recombinant-koepokvirus v-env5 dat bij de ATCC gedeponeerd is en het toegangsnummer VR 2113 heeft, of mutant, recombinant of genetisch geknutseld derivaat daarvan.
9. Recombinant-koepokvirus v-env2 dat bij 35 de ATCC gedeponeerd is en het toegangsnummer VR 2114 heeft, of mutant, recombinant of genetisch geknutseld derivaat daarvan. 1602422 S -·* -5»-
10. Recombinant-koepokvirus v-env7 dat bij de ATCC gedeponeerd is en het toegangsnummer VR 2148 heeft, of mutant, recombinant of genetisch geknutseld derivaat daarvan.
11. Recombinant-koepokvirus v-env5NY dat 5 bij de ATCC gedeponeerd is en het toegangsnummer VR 2149 heeft, of mutant, recombinant of genetisch geknutseld derivaat daarvan.
12. Recombinant-virus volgens een der conclusies 1 t/m 5 dat een baculovirus omvat.
13. Recombinant-virus volgens conclusie 12 10 dat een kernpolyhedrose-virus omvat.
14. Recombinant-baculovirus Ac-env5 dat bij de ATCC gedeponeerd is en het toegangsnummer VR 2151 heeft, of mutant, recombinant of genetisch geknutseld derivaat daarvan.
15. Recombinant-virus volgens een der 15 conclusies 1 t/m 5 dat een "bloot" virus omvat.
16. Recombinant-virus volgens conclusie 15 wat een adenovirus omvat.
17. Recombinant-virus volgens een der conclusies 1 t/m 5 dat een bacteriofaag omvat. m
18. Recombinant-virus volgens conclusie 1 waarvan de nucleotidenreeks die voor het epitoop van LAV/HTLV III codeert, het gag-gen van LAV/HTLV III omvat of een deel daarvan dat voor een antigeen peptide of eiwit codeert.
19. Recombinant-virus volgens conclusie 18 25 waarvan de gag-gen-nucleotidenreeks de reeks nucleotiden omvat die in figuur 14 afgebeeld is met nucleotiden no1s 340 t/m 1835, of een deel daarvan dat voor een antigeen peptide of eiwit codeert.
20. Recombinant-virus volgens conclusie 1 30 dat in een geïnfecteerde gastheer een peptide of eiwit doet ontstaan dat verwant is aan een epitoop van een kerneiwit van LAV/ BTLV III, of met een antigeen gedeelte daarvan.
21. Recombinant-virus volgens conclusie 20 waarvan het epitoop een peptide of eiwit is men een aminozuur- 35 volgorde zoals afgebeeld in figuur 14 met aminozuren no*s 1 t/m 500, of antigeengedeelte daarvan. 9602422 < l -f -
22. Recombinant-virus volgens een der conclusies 18 t/m 21 dat een omhuld virus omvat.
23. Recombinant-virus volgens conclusie 22 dat een koepokvirus omvat.
24. Recombinant-koepokvirus v-gaglNY dat bij de ATCC gedeponeerd is en het toegangsnummer VR 2150 heeft, of mutant, recombinant of genetisch geknutseld derivaat daarvan.
25. Recombinant-virus volgens een der conclusies 18 t/m 21 dat een baculovirus omvat.
26. Baculovirus volgens conclusie 25 dat een kernpolyhedrose-virus omvat,
27. Recombinant-baculovirus Ac-gagl dat bij de ATCC gedeponeerd is en het toegangsnummer VR 2147 heeft, of mutant, recombinant of genetisch geknutseld derivaat daarvan.
28. Recombinant-virus volgens een der con clusies 18 t/m 21 dat een "bloot" virus omvat.
29. Recombinant-virus volgens conclusie 28 dat een adenovirus omvat.
30. Recombinant-virus volgens een der conclu- 20 sies 18 t/m 21 dat een bacteriofaag omvat.
31. In hoofdzaak zuiver antigeen peptide of eiwit dat_aan een epitoop van LAV/HTLV III verwant is.
32. Peptide of eiwit volgens conclusie 31 waarvan het epitoop een orahullingsglycoprotelne van LAV/HTLV III 25 omvat.
33. Peptide of eiwit volgens conclusie 32 met een aminozuur-volgorde in hoofdzaak zoals weergegeven in figuur 2 met aminozuren no.’s 1 t/m 861, of antigeengedeelte daarvan.
34. Peptide of eiwit volgens conclusies 32 of 33 dat gezuiverd werd uit gekweekte cellen met een nucleotiden-reeks die voor het peptide of eiwit codeert en onder controle staat van een tweede nucleotidenreeks zodat het peptide of eiwit door de gekweekte cellen gevormd wordt.
35. Peptide of eiwit volgens conclusie 34 gevormd in gekweekte cellen die microörganismen zijn. 8602422 X * '5 3 -
36. Peptide of eiwit volgens conclusie 35 waarvan het microörganisme een bacterie is.
37. Peptide of eiwit volgens conclusie 35 waarvan het microörganisme een gist is.
38. Peptide of eiwit volgens conclusie 34 waarvan de gekweekte cellen een dierlijke cellijn vormen.
39. Peptide of eiwit volgens conclusie 38, gevormd door dierlijke cellen die geïnfecteerd zijn met recombi-nant-koepokvirus v-env5 dat bij de ATCC onder no. VR 2113 gedepo- 10 neerd is, of met een mutant, recombinant of genetisch geknutseld derivaat daarvan.
40. Peptide of eiwit volgens conclusie 38 gevormd door dierlijke cellen die geïnfecteerd zijn met recombi-nant-koepokvirus v-env2 dat bij de ATCC onder no. VR 2114 gede- 15 poneerd is, of met een mutant, recombinant of genetisch geknutseld derivaat daarvan.
41. Peptide of eiwit volgens conclusie 38 gevormd door dierlijke cellen die geïnfecteerd zijn met recombi-nant-koepokvirus v-env7 dat bij de ATCC onder no. VR 2148 gedepo- 20 neerd is, of met een mutant, recombinant of genetisch geknutseld derivaat daarvan.
42. Peptide of eiwit volgens conclusie 38 gevormd door dierlijke cellen die geïnfecteerd zijn met recombi-nant-koepokvirus v-env5NY dat bij de ATCC onder no. VR 2149 ge- 25 deponeerd is, of met een mutant, recombinant of genetisch geknutseld derivaat daarvan.
43. Peptide of eiwit volgens conclusie 34 waarvan de gekweèkte cellen een insectencellijn vormen.
44. Peptide of eiwit volgens conclusie 43 30 gevormd door insectencellen die geïnfecteerd zijn met recombinant-baculovirus Ac-env5, dat bij de ATCC onder no. VR 2151 gedeponeerd is, of met een mutant, recombinant of genetisch geknutseld derivaat daarvan.
45. Pepuide of aiwit volgens conclusie 31 35 waarvan de epitoop een kern eiwit-epitoop van LAV/HTLV III omvat.
46. Peptide of eiwit volgens conclusie 45 3602422 * ·£ -160- met een aminozuur-volgorde in hoofdzaak zoals weergegeven in figuur 14, met aminozuren no.' s 1 t/m 500, of antigeen gedeelte daarvan.
47. Peptide of eiwit volgens conclusie 45 5 of 46 geïsoleerd uit gekweekte cellen met een nucleotidenreeks voor dat peptide of eiwit dat onder controle van een tweede nucleotidenreeks staat dat de gen-expressie regelt zodat dat peptide of eiwit door de gekweekte cellen gevormd wordt.
48. Peptide of eiwit volgens conclusie 47 10 waarvan de gekweekte cellen microörganismen zijn.
49. Peptide of eiwit volgens conclusie 48 waarvan het microörganisme een bacterie is.
50. Peptide of eiwit volgens conclusie 48 waarvan het microörganisme een gist is.
51. Peptide of eiwit volgens conclusie 47 waarvan de gekweekte cellen een dierlijke cellijn vormen.
52. Peptide of eiwit vólgens conclusie 51 gevormd door dierlijke cellen die geïnfecteerd zijn met recombinant -koepokvirus v-gaglNY dat bij de ATCC onder no. VR 2150 ge- 20 deponeerd is, of met een mutant, recombinant of genetisch geknutseld derivaat daarvan.
53. Peptide of eiwit volgens conclusie 47 waarvan de gekweekte cellen een insectencellijn vormen.
54. Peptide of eiwit volgens conclusie 53 25 gevormd door insectencellen die geïnfecteerd zijn met recombinant-baculovirus Ac-gag1 dat bij de ATCC onder no. VR 2147 gedeponeerd is, of met een mutant, recombinant of genetisch geknutseld derivaat daarvan.
55. Peptide of eiwit volgens een der conclu-30 sies 31, 32, 33, 45 of 46, dat chemisch gesynthetiseerd werd.
56. Levende vaccinformulering dat een virus volgens een der conclusies 1 t/m 5 bevat, welk virus infectieus is zonder in de te vaccineren gastheer een ziekte te veroorzaken.
57. Levende vaccinformulering volgens conclu-35 sie 56 waarvan het virus een omhuld virus is.
58. Levende vaccinformulering volgens conclu- 1802422 * » *. * -ιβι- sie 57 waarvan het virus een koepokvirus is.
59. Levende vaccin-formulering dat een infectieuze dosis koepokvirus v-env5 van conclusie 8 bevat.
60. Levende vaccin-formulering dat een 5 infectieuze dosis koepokvirus v-env2 van conclusie 9 bevat.
61. Levende vaccin-formulering dat een infectieuze dosis van koepokvirus v-env7 van conclusie 10 bevat.
62. Levende vaccin-formulering dat een infectieuze dosis van koepokvirus v-env5NY van conclusie 11 bevat.
63. Levende vaccin-formulering volgens conclusie 56 dat een "bloot" virus bevat. 64« Levende vaccin-formulering volgens conclusie 63 waarvan het "blote” virus een adenovirus is.
65. Polyvalente vaccin-formulering dat 15 levend recombinant-virus volgens een der conclusies 2 t/m 5 en een recombinant-virus volgens een der conclusies 18 t/m 21 bevat, welke beide infectieus zijn zonder in de te vaccineren gastheer ziekten te veroorzaken.
66. Polyvalent vaccin volgens conclusie 65 20 waarvan beide recombinant-virussen omhulde virussen zijn.
67. Polyvalent vaccin volgens conclusie 66 waarvan beide virussen koepokvirussen zijn.
68. Polyvalente vaccinformulering dat een infectieuze dosis bevat van 25 (a) het koepokvirus v-env5 van conclusie 8, v-env2 van conclusie 9, v-env7 van conclusie 10 of v-env5NY van conclusie 11, en (b) het koepokvirus v-gaglNY van conclusie 24.
69. Vaccinformulering van geïnactiveerd virus dat een werkzame dosis bevat van het virus volgens een der 30 conclusies 1 t/m 5, in niet-infectieuze toestand gemengd met een farmaceutische drager.
70. Vaccinformulering van geïnactiveerd virus dat een werkzame dosis van een omhuld virus volgens conclusie 6 bevat in niet-infextieuze toestand gemengd met een farmaceu- 35 tische drager. 8602422 -¾ ; *' ft -(ff 2.-
71. Vaccinformulering van geïnactiveerd virus dat een werkzame dosis van het koepokvirus van conclusie 7 bevat in niet-infectieuze toestand gemengd met een farmaceutische drager.
72. Vaccinformulering van geïnactiveerd virus dat een werkzame dosis van het koepokvirus v-env5 van conclusie 8 bevat in niet-infectieuze toestand gemengd met een farmaceutische drager.
73. Vaccinformulering van geïnactiveerd 10 virus dat een werkzame dosis van het koepokvirus v-env2 van conclusie 9 bevat in niet-infectieuze toestand gemengd met een farmaceutische drager.
74. Vaccinformulering van geïnactiveerd virus dat een werkzame dosis bevat van bet koepokvirus v-env7 15 van conclusie 10, in niet-infectieuze toestand gemengd met een farmaceutische drager.
75. Vaccinformulering van geïnactiveerd virus dat een werkzame dosis van het koepokvirus v-env5NY van conclusie 11 bevat, in niet-infectieuze toestand gemengd met een 20 farmaceutische drager.
76. Polyvalente vaccinformulering van geïnactiveerd virus dat een werkzame dosis bevat van (a) het recombinant-virus volgens een der conclusies 2 t/m 5, dat tot expressie komt in een epitoop dat aan de omhulling van
25 LAV/HTLV III verwant'is en (b) het recombinant-virus volgens een der conclusies 18 t/m 21 dat tot expressie komt in een epitoop dat aan de kern van LAV/ HTLV III verwant is, waarbij beide recombinant-virussen in niet-infectieuze toestand met een farmaceutische drager gemengd zijn.
77. Polyvalente virus formulering volgens conclusie 76 waarvan beide recombinant-virussen omhulde virussen zijn.
78. Polyvalente vaccinformulering volgens conclusie 77 waarvan beide omhulde virussen koepokvirussen zijn.
79. Polyvalente vaccinformulering van ge ïnactiveerde virus dat een werkzame dosis bevat van 8802422 i ' C± * -l esia} het koepokvirus v-env5 van conclusie 8, v-env2 van conclusie 9, v-env7 van conclusie 10 of v-env5NY van conclusie 11, en (b) het koepokvirus v-gaglNY van conclusie 24.
80. Opgesplitste vaccinformulering waarvan 5 het immunogeen een werkzame dosis is van het peptide of eiwit volgens conclusie 32 of 33, gemengd met een farmaceutische drager.
81. Opgesplitste vaccinformulering waarvan het immunogeen een werkzame dosis van het peptide of eiwit volgens conclusie 34 is, gemengd met een farmaceutische drager.
82. Opgesplitste vaccinformulering waarvan het immunogeen een werkzame dosis van het peptide of eiwit volgens conclusie 35 is, gemengd met een farmaceutische drager.
83. Opgesplitste vaccinformulering waarvan het immunogeen een werkzame dosis van het peptide of eiwit vol- 15 gens conclusie 36 is, gemengd met een farmaceutische drager.
84. Opgesplitste vaccinformulering waarvan het immunogeen een werkzame dosis van het peptide of eiwit volgens conclusie 37 is, gemengd met een farmaceutische drager.
85. Opgesplitste vaccinformulering waar- 20 van het immunogeen een werkzame dosis van het peptide of eiwit volgens conclusie 38 is, gemengd met een farmaceutische drager.
86. Opgesplitste vaccinformulering waarvan het immunogeen een werkzame dosis van het peptide of eiwit volgens conclusie 39 is, gemengd met een farmaceutische drager.
87. Opgesplitste vaccinformulering waarvan het immunogeen een werkzame dosis van het peptide of eiwit volgens conclusie 40 is, gemengd met een farmaceutische drager.
88. Opgesplitste vaccinformulering waarvan het immunogeen een werkzame dosis van het peptide of eiwit volgens 30 conclusie 41 is, gemengd met een farmaceutische drager.
89. Opgesplitste vaccinformulering waarvan het immunogeen een werkzame dosis van het peptide of eiwit volgens conclusie 42 is, gemengd met een farmaceutische drager.
90. Opgesplitste vaccinformulering waarvan 35 het immunogeen een werkzame dosis van het peptide of eiwit volgens conclusie 43 is, gemengd met een farmaceutische drager. §802422 ^ t» -L f -ΙΘΗ-
91. Opgesplitste vaccinformulering waarvan het immunogeen een werkzame dosis van het peptide of eiwit volgens conclusie 44 is, gemengd met een farmaceutische drager.
92. Polyvalente opgesplitste vaccinformulering 5 die een werkzame dosis bevat van (a) een eerste peptide of eiwit volgens conclusie 32 of 33, en (b) een tweede peptide of eiwit volgens conclusie 45 of 46, gemengd met een farmaceutische drager.
93. Polyvalente opgesplitste vaccinformu-10 lering die een werkzame dosis bevat van (a) een eerste peptide of eiwit volgens conclusie 32 of 33, en (b) een tweede peptide of eiwit volgens conclusie 47, gemengd met een farmaceutische drager.
94. Polyvalente opgesplitste vaccinformu-15 lering die een werkzame dosis bevat van (a) een eerste peptidebf eiwit volgens conclusie 32 of 33, en (b) een tweede peptide of eiwit volgens conclusie 48, gemengd met een farmaceutische drager.
95. Polyvalente opgesplitste vaccinformu-20 lering die een wërkzame dosis bevat van (a) een eerste peptide of eiwit volgens conclusie 32 of 33, en (b) een tweede, peptide of eiwit volgens conclusie 49, gemengd met een farmaceutische drager.
96. Polyvalente opgesplitste vaccinformu-25 lering die een werkzame dosis bevat van (a) een eerste peptide of eiwit volgens conclusie 32 of 33, en (b) een tweede peptide of eiwit volgens conclusie 50, gemengd met een farmaceutische drager.
97. Polyvalente opgesplitste vaccinformu-30 lering die een werkzame dosis bevat van (a) een eerste peptide of eiwit volgens conclusie 32 of 33, en (b) een tweede peptide of eiwit volgens conclusie 51, gemengd met een farmaceutische drager.
98. Polyva:ente opgesplitste vaccinformu-35 lering die een werkzame dosis bevat van (a) een eerste peptide of eiwit volgens conclusie 32 of 33, en 3602422 $ < - IQS'- (b) een tweede peptide of eiwit volgens conclusie 52, gemengd met een farmaceutische drager.
99. Polyvalente opgesplitste vaccinformu-lering die een werkzame dosis bevat van 5 (a) een eerste peptide of eiwit volgens conclusie 32 of 33, en (b) een tweede peptide of eiwit volgens conclusie 53, gemengd met een farmaceutische drager.
100. Polyvalente opgesplitste vaccinformu-lering die een werkzame dosis bevat van 10 (a) een eerste peptide of eiwit volgens conclusie 32 of 33, en (b) een tweede peptide of eiwit volgens conclusie 54, gemengd met een farmaceutische drager.
101. Recombinant-DNA-vector die pv-envl omvat.
102. Eencellig organisme dat de recombinant- DNA-vector van conclusie 101 bevat.
103. Bacterie die de recombinant-DNA-vector van conclusie 101 bevat.
104. Bacterie volgens conclusie 103 die de 20 bij de NRRL onder toegangsnummer B-18003 gedeponeerde stam van Escherichia coli is, of een mutant, recombinant of genetisch geknutseld derivaat daarvan.
105. Recombinant-DNA-vector die pv-env2 omvat. 25 106. Eéncellig organisme dat de recombinant- DNA-vector van conclusie 105 bevat.
107. Bacterie die de recombinant-DNA-vector van conclusie .105 bevat.
108. Bacterie volgens conclusie 107 die de 30 bij de NRRL onder toegangsnummer B-18004 gedeponeerde stam van Escherichia coli is, of een mutant, recombinant of genetisch geknutseld derivaat daarvan.
109. Recombinant-DNA-vector die pv-envS omvat. 35 110. Eéncellig organisme dat de recombinant- DNA-vector van conclusie 109 bevat. 8602422 « π *v» < £ - I sk ill. Bacterie die de recombinant-DNA-vector van conclusie 109 bevat.
112. Bacterie volgens conclusie 111 die de bij de NRRL onder toegangsnummer B-18005 gedeponeerde stam van
5 Escherichia coli is, of een mutant, recombinant of genetisch geknutseld derivaat daarvan.
113. Recombinant-DNA-vector die pv-env7 omvat.
114. Eéncellig organisme dat de recombinant-10 DNA-vector van conclusie 113 bevat.
115. Bacterie die de recombinant-DNA-vector van conclusie 113 bevat.
116. Bacterie volgens conclusie 115 die de bij de NRRL onder toegangsnummer B-18110 gedeponeerde stam van
15 Escherichia coli is, of een mutant, recombinant of genetisch geknutseld derivaat daarvan.
117. Recombinant-DNA-vector die pv-gagl omvat.
118. Eéncellig organisme dat de recombinant-20 DNA-vector van conclusie 117 bevat.
119. Bacterie die de recombinant-DNA-vector van conclusie 117 bevat.
120. Bacterie volgens conclusie 119 die de bij de NRRL onder toegangsnummer B-18111 gedeponeerde stam van
25 Escherichia coli is, of een mutant, recombinant of genetisch geknutseld derivaat daarvan.
121. Recombinant-DNA-vector die pAc-gagl omvat.
122. Eéncellig organisme dat de recombinant-30 DNA-vector van conclusie 121 bevat.
123. Bacterie die de recombinant-DNA-vector van conclusie 121 bevat.
124. Bacterie volgens conclusie 123 die de bij de NRRL onder toegangsnummer 3-18105 gedeponeerde stam van
35 Escherichia coli is, of een mutant, recombinant of genetisch geknutseld derivaat daarvan. 1602422 > i * IT 'V -;τ
125. Recombinant-DNA-vector die pAc-env5 omvat.
126. Eencellig organisme dat de recombinant-DNA-vector van conclusie 125 bevat.
127. Bacterie die de recombinant-DNA-vector van conclusie 125 bevat.
128. Bacterie volgens conclusie 127 die de bij de NRRL onder toegangsnummer B-18109 gedeponeerde stam van Escherichia coli is, of een mutant, recombinant of genetisch 10 geknutseld derivaat daarvan. 15 -8S02422 * c Verbetering van errata in de beschrijving behorende bij de octrooiaanvrage no. 86,02422 Ned. voorgesteld door aanvrager dd. 24 november 1986. _________________________________________ Vervang "nick-vertaald monster dat" in regels 33-34 van blz. 15 en "nick-vertaalde proef die". in regel 10 van blz. 53 beide door "monster dat lus-verplaatsing ondergaan had en"
5 Verbeter in regels 10 en 23 van blz. 79 "Hind III" tot "Hinc II". * JKr/JvdB 8602422
NL8602422A 1985-09-25 1986-09-25 Recombinant-virus, antigeen peptide of eiwit, vaccin tegen verworven immuundeficientiesyndroom, vector voor recombinant-dna en eencelligen die deze vector bevatten. NL8602422A (nl)

Applications Claiming Priority (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US77990985A 1985-09-25 1985-09-25
US77990985 1985-09-25
US84298486A 1986-03-27 1986-03-27
US84298486 1986-03-27
US90521786A 1986-09-09 1986-09-09
US90521786 1986-09-09

Publications (1)

Publication Number Publication Date
NL8602422A true NL8602422A (nl) 1987-04-16

Family

ID=27419757

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
NL8602422A NL8602422A (nl) 1985-09-25 1986-09-25 Recombinant-virus, antigeen peptide of eiwit, vaccin tegen verworven immuundeficientiesyndroom, vector voor recombinant-dna en eencelligen die deze vector bevatten.

Country Status (22)

Country Link
CN (1) CN1020752C (nl)
AT (1) ATA256786A (nl)
CH (1) CH676247A5 (nl)
DE (1) DE3690508T1 (nl)
DK (1) DK455486A (nl)
ES (2) ES2002490A6 (nl)
FI (1) FI863848A (nl)
FR (1) FR2587720A2 (nl)
GB (1) GB2181435B (nl)
GR (1) GR862412B (nl)
HU (1) HU205780B (nl)
IE (1) IE59314B1 (nl)
IL (1) IL80073A (nl)
IT (1) IT1195829B (nl)
MY (1) MY103182A (nl)
NL (1) NL8602422A (nl)
NO (1) NO863803L (nl)
NZ (1) NZ217645A (nl)
PT (1) PT83434B (nl)
SE (4) SE8604007L (nl)
WO (1) WO1987002038A1 (nl)
YU (1) YU46753B (nl)

Families Citing this family (39)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1986006099A1 (en) * 1985-04-08 1986-10-23 Genetic Systems Corporation EXPRESSION AND DIAGNOSTIC USE OF gag ENCODED PEPTIDES WHICH ARE IMMUNOLOGICALLY REACTIVE WITH ANTIBODIES TO LAV
US4734362A (en) * 1986-02-03 1988-03-29 Cambridge Bioscience Corporation Process for purifying recombinant proteins, and products thereof
US4925784A (en) * 1986-04-04 1990-05-15 Hoffmann-La Roche Inc. Expression and purification of an HTLV-III gag/env gene protein
US4983387A (en) * 1986-05-19 1991-01-08 Viral Technologies Inc. HIV related peptides, immunogenic antigens, and use therefor as subunit vaccine for AIDS virus
ATE107861T1 (de) * 1986-09-19 1994-07-15 Oncogen Verwendung von aktivierten t-lymphozyten zur vorbereitung einer pharmazeutischen zusammensetzung zur behandlung von aids.
IL84154A0 (en) * 1986-10-16 1988-03-31 Microgenesys Inc Polypeptides derived from the envelope gene of human immunodeficiency virus in recombinant baculovirus infected insect cells and vaccines against acquired immune deficiency syndrome containing the same
JPS63258575A (ja) * 1986-12-15 1988-10-26 レプリゲン　コーポレーション 昆虫細胞中でつくられる組換えｈｉｖエンベロープタンパク
FR2610632B1 (fr) * 1987-02-11 1990-12-21 Pasteur Institut Peptides caracteristiques des retrovirus d'immunodeficience humaine (virus hiv) leurs applications au diagnostic des infections dues a certains de ces virus et, le cas echeant, a la vaccination contre le sida
ES2104556T3 (es) * 1987-01-16 1997-10-16 Pasteur Institut Peptidos que tienen propiedades inmunologicas de hiv-2.
US5681713A (en) * 1987-05-08 1997-10-28 Smithkline Beecham Corporation Expression of heterologous proteins in Drosophila cells
GB8714802D0 (en) * 1987-06-24 1987-07-29 Proteus Biotech Ltd Synthetic polypeptides
DE10399032I1 (de) * 1987-08-28 2004-01-29 Health Research Inc Rekombinante Viren.
FR2620030B1 (fr) * 1987-09-07 1990-03-23 Transgene Sa Vecteur d'expression des proteines du virus hiv-2, un agent causal du sida, culture cellulaire infectee ou transformee par ce vecteur, proteines obtenues, vaccin et anticorps obtenus
IL89118A0 (en) * 1988-02-03 1989-08-15 Microgenesys Inc Vaccine containing polypeptides derived from the envelope gene of human immunodeficiency virus type 1
US5763160A (en) * 1988-02-12 1998-06-09 United Biomedical, Inc. Synthetic peptides and process of using same for the detection of antibodies to human immunodeficiency virus (HIV) gp120 envelope protein, diagnosis of AIDS and pre-AIDS conditions and as vaccines
DE68917520T2 (de) * 1988-05-06 1995-01-05 Ferropas Ag Verfahren und Systeme zur Herstellung von HIV-Antigenen.
US5043262A (en) * 1988-05-12 1991-08-27 Dana Farber Cancer Institute Protein, sequences containing the VPU gene therefore, vectors, methods of preparation and use
AP129A (en) * 1988-06-03 1991-04-17 Smithkline Biologicals S A Expression of retrovirus gag protein eukaryotic cells
US5631154A (en) * 1988-06-10 1997-05-20 Therion Biologics, Incorporated Self assembled, defective, non-self-propagating lentivirus particles
AU3775789A (en) * 1988-06-10 1990-01-05 Applied Biotechnology, Inc. A method of evaluating recombinant vaccines against immunodeficiency virus
US5614404A (en) * 1988-06-10 1997-03-25 Theriod Biologics, Incorporated Self-assembled, defective, non-self-propagating lentivirus particles
US5747324A (en) * 1988-06-10 1998-05-05 Therion Biologics Corporation Self-assembled, defective, non-self-propagating lentivirus particles
US5665577A (en) * 1989-02-06 1997-09-09 Dana-Farber Cancer Institute Vectors containing HIV packaging sequences, packaging defective HIV vectors, and uses thereof
WO1990012880A1 (en) * 1989-04-18 1990-11-01 Applied Biotechnology, Inc. Generation of hybrid genes and proteins by virus-mediated recombination
WO1990015141A2 (en) * 1989-06-01 1990-12-13 Applied Biotechnology, Inc. Self-assembled, defective, non-self-propagating viral particles
GB8923123D0 (en) 1989-10-13 1989-11-29 Connaught Lab A vaccine for human immunodeficiency virus
US5981276A (en) * 1990-06-20 1999-11-09 Dana-Farber Cancer Institute Vectors containing HIV packaging sequences, packaging defective HIV vectors, and uses thereof
US5840312A (en) * 1991-05-02 1998-11-24 Institut Pasteur Recombinant Bacillus anthracis strains unable to produce the lethal factor protein or edema factor protein
FR2676068B1 (fr) * 1991-05-02 1994-11-04 Pasteur Institut Souches recombinantes immunogenes de b. anthracis - compositions immunogenes les contenant.
DE69232650T2 (de) * 1991-11-08 2002-11-28 Upjohn Co Vakzine gegen katzenleukämievirus
DE4405810A1 (de) 1994-02-23 1995-08-24 Behringwerke Ag Von einem Retrovirus aus der HIV-Gruppe abgeleitete Peptide und deren Verwendung
WO1996024378A2 (en) * 1995-02-10 1996-08-15 Worcester Foundation For Biomedical Research, Inc. Delivery of exogenous compounds
US6013506A (en) * 1995-06-05 2000-01-11 Wardley; Richard C. Feline leukemia virus vaccines
ATE188783T1 (de) * 1995-09-06 2000-01-15 Schablonentechnik Kufstein Ag Verfahren zum herstellen einer siebdruckschablone
US5741492A (en) * 1996-01-23 1998-04-21 St. Jude Children's Research Hospital Preparation and use of viral vectors for mixed envelope protein vaccines against human immunodeficiency viruses
US6723558B1 (en) 1996-01-23 2004-04-20 St. Jude Children's Research Hospital Preparation and use of viral vectors for mixed envelope protein vaccines against human immunodeficiency viruses
US20060165606A1 (en) 1997-09-29 2006-07-27 Nektar Therapeutics Pulmonary delivery particles comprising water insoluble or crystalline active agents
US7871598B1 (en) 2000-05-10 2011-01-18 Novartis Ag Stable metal ion-lipid powdered pharmaceutical compositions for drug delivery and methods of use
WO2003053411A1 (en) 2001-12-19 2003-07-03 Nektar Therapeutics Pulmonary delivery of aminoglycosides

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ATE78293T1 (de) * 1983-05-27 1992-08-15 Texas A & M Univ Sys Verfahren zur herstellung eines rekombinanten baculovirus-expressionsvektors.
US4662514A (en) * 1983-11-01 1987-05-05 Charleswater Products, Inc. Electrically conductive polymeric tubes for static sensitive electronic devices
IL76082A (en) * 1984-08-22 1991-07-18 Us Health Molecular clones of the genome of htlv-iii and a process for the preparation thereof
US9328391B1 (en) * 1984-08-22 2016-05-03 The United States Of America As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Cloning and expression of HIV-1 DNA
GB8501473D0 (en) * 1985-01-21 1985-02-20 Pasteur Institut Cloned dna sequences
KR930000189B1 (ko) * 1984-10-18 1993-01-11 앵스뛰띠 빠스뙤르 임파선증과 후천성 면역 결핍증 바이러스의 항원을 제조하는 방법 및 이 항원에 대한 항체의 생산 방법
CA1341482C (en) * 1984-10-31 2005-05-10 Paul A. Luciw Process for preparing fragments of aids-associated retroviruses
ATE138100T1 (de) * 1984-12-24 1996-06-15 Genentech Inc Fusionen von aids-verwandten polypeptiden
US4774175A (en) * 1985-03-01 1988-09-27 Centocor, Inc. Immunochemical methods for the detection of antibody against HTLV-III
DK171119B1 (da) * 1985-04-19 1996-06-17 Hoffmann La Roche AIDS-viruskappeprotein, ekspressionsvektor bærende viruskappeproteinet, transformanter transformeret med ekspressionsvektoren, fremgangsmåde til fremstilling af viruskappeproteinet, fremgangsmåde til detektion af AIDS-antistoffer, fremgangsmåde til bestemmelse af AIDS-virus, vaccine mod AIDS, antistoffer mod viruskappeproteinet samt anvendelse af dette til fremstilling af en vaccine og til testnin
FR2586427B1 (fr) * 1985-08-20 1988-12-09 Pasteur Institut Sequences de nucleotides et de polypeptides issus du virus visna et leur application a des essais de diagnostic et a la production de compositions immunogenes

Also Published As

Publication number Publication date
HUT42133A (en) 1987-06-29
GB8622987D0 (en) 1986-10-29
SE9102975D0 (sv) 1991-10-14
GB2181435B (en) 1990-01-10
PT83434B (pt) 1988-07-29
IE59314B1 (en) 1994-02-09
MY103182A (en) 1993-05-29
GB2181435A (en) 1987-04-23
IT8667730A0 (it) 1986-09-24
IT1195829B (it) 1988-10-27
GR862412B (en) 1987-01-23
NO863803L (no) 1987-03-26
SE9102974L (sv) 1993-04-15
SE8604007D0 (sv) 1986-09-23
SE9102976L (sv) 1993-04-15
DK455486D0 (da) 1986-09-24
NO863803D0 (no) 1986-09-24
ATA256786A (de) 1995-05-15
SE9102975L (sv) 1993-04-15
SE9102974D0 (sv) 1991-10-14
WO1987002038A1 (en) 1987-04-09
FI863848A0 (fi) 1986-09-24
SE8604007L (sv) 1987-03-26
FR2587720B2 (nl) 1995-02-10
PT83434A (en) 1986-10-01
CH676247A5 (nl) 1990-12-28
YU46753B (sh) 1994-05-10
IL80073A (en) 1995-01-24
FR2587720A2 (fr) 1987-03-27
FI863848A (fi) 1987-03-26
CN1020752C (zh) 1993-05-19
ES2002490A6 (es) 1988-08-16
DE3690508T1 (nl) 1988-06-23
YU165486A (en) 1989-08-31
NZ217645A (en) 1991-11-26
HU205780B (en) 1992-06-29
DK455486A (da) 1987-03-26
ES2006941A6 (es) 1989-05-16
IL80073A0 (en) 1986-12-31
CN86106632A (zh) 1987-05-13
SE9102976D0 (sv) 1991-10-14
IE862525L (en) 1987-03-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
NL8602422A (nl) Recombinant-virus, antigeen peptide of eiwit, vaccin tegen verworven immuundeficientiesyndroom, vector voor recombinant-dna en eencelligen die deze vector bevatten.
KR101971808B1 (ko) 인간 면역 결핍 바이러스 감염에 대한 방어 면역을 유도하기 위한 방법 및 조성물
Hu et al. Expression of AIDS virus envelope gene in recombinant vaccinia viruses
US5614404A (en) Self-assembled, defective, non-self-propagating lentivirus particles
CZ375296A3 (en) Polynucleotide and vaccine containing thereof
US20100291037A1 (en) Immunogenicity using a combination of dna and vaccinia virus vector vaccines
US5747324A (en) Self-assembled, defective, non-self-propagating lentivirus particles
WO1991019803A1 (en) Self assembled, defective, nonself-propagating viral particles
Ahmad et al. Reduced virus load in rhesus macaques immunized with recombinant gp160 and challenged with simian immunodeficiency virus
IE921875A1 (en) Vaccine and treatment method for human immunodeficiency¹virus
JP2000506727A (ja) 組換え生ネコ免疫不全ウイルスおよびプロウイルスｄｎａワクチン
FI114318B (fi) Menetelmä rekombinanttiadenovirusrokotteiden valmistamiseksi
CA2033175C (en) Self-assembled, defective, non-self-propagating viral particles
KR20120093941A (ko) 인간에서 ｈｉｖ에 대한 광범위한 ｔ-세포 반응의 생성
VAN EENDENBURG et al. Cell-mediated immune proliferative responses to HIV-1 of chimpanzees vaccinated with different vaccinia recombinant viruses
JP3164351B2 (ja) 疾患モデルおよびワクチンに使用するプロトタイプＦｅＬＶの分離体
JPS6368075A (ja) 後天性免疫不全症候群に関するワクチンおよび免疫検定法
AU6612800A (en) Immunotherapy in hiv infected persons using vaccines after multi-drug treatment
AU608205B2 (en) Vaccines against acquired immune deficiency syndrome
US6290963B1 (en) Anti-HIV compositions containing native and recombinant peptides
US20060094006A1 (en) Immunotherapy regimens in hiv-infected patients
JP2002513381A (ja) ＨＴＬＶ―Ｉ感染およびＨＴＬＶ―ＩＩ感染を予防するためのｅｎｖ―糖タンパク質ワクチン
FR2593519A1 (fr) Vaccin contre le syndrome immunodeficitaire acquis et intermediaires pour la preparation de ce vaccin
Vafai Varicella-Zoster Virus Subunit Vaccine
WO1998022596A1 (fr) VIRUS VACCINAL RECOMBINE, PROCEDE POUR PREPARER UNE STRUCTURE PARTICULAIRE DE PROTEINES Gag A L&#39;AIDE DE CELUI-CI, PARTICULE AINSI PREPAREE ET SON UTILISATION

Legal Events

Date Code Title Description
BT A notification was added to the application dossier and made available to the public
BA A request for search or an international-type search has been filed
BB A search report has been drawn up
BC A request for examination has been filed
BV The patent application has lapsed