CH676247A5

CH676247A5 -

Info

Publication number: CH676247A5
Application number: CH3821/86A
Authority: CH
Inventors: Shiu-Lok Hu; Anthony F Purchio; Linda Madisen
Original assignee: Oncogen
Priority date: 1985-09-25
Filing date: 1986-09-24
Publication date: 1990-12-28
Also published as: ES2006941A6; WO1987002038A1; FI863848A0; SE9102976L; SE8604007L; FI863848A; GB2181435B; IE59314B1; CN86106632A; FR2587720B2; HUT42133A; DE3690508T1; NL8602422A; IT8667730A0; IE862525L; MY103182A; GB8622987D0; SE9102975L; DK455486A; SE9102974L

Description

La présente invention concerne un virus recombinant permettant la préparation de vaccins contre le syndrome immunodéficitaire acquis (SIDA), ainsi que les vaccins obtenus et, également, les divers intermédiaires servant à cette obtention et leurs procédés de préparation.

Ainsi, la présente invention concerne des virus qui expriment des peptides et protéines apparentés à des épitopes du virus associé à l'adénopathie [Lymphadenopathy Associated Virus (LAV)]/virus de la leucémie des cellules T humaines [Human T-Cell Leukemia Virus (HTLV-III)], l'agent étiologique du syndrome d'adénopathie [Lymphadenopathy Syndrome (LAS)] et du syndrome immunodéficitaire acquis (SIDA); [Acquired Immune Deficiency Syndrome (AIDS)]. Les virus de la présente invention qui expriment des peptides apparentés à LAV/HTLV-III induisant une réponse d'immuno-protection peuvent servir d'immunogènes dans des formulations de vaccins à base de virus pour le syndrome d'adénopathie (LAS) ou le SIDA ou dans des formulations de vaccins multivalents.

En fait, les virus infectieux de la présente invention, qui peuvent se multiplier dans un hôte sans provoquer de maladie, peuvent servir dans des formulations de vaccins à base de virus vivants qui procurent une stimulation immunogène prolongée et peuvent donner naissance à une forte immunité.

La présente invention comprend également des peptides et protéines apparentés à des épitopes de LAV/HTLV III, pouvant servir d'immunogènes dans des formulations de vaccins à sous-unité(s) pour LAS ou le SIDA, ou dans des formulations de vaccins multivalents, ou comme antigènes dans des dosages immunologiques pour le diagnostic de LAS ou du SIDA. Ces peptides et protéines peuvent être produits en utilisant des techniques mettant en oeuvre de l'ADN recombinant dans n'importe quel système vecteur-hôte, ou bien ils peuvent être synthétisés par des méthodes chimiques.

Donc, l'invention comprend aussi la construction de nouvelles séquences de ADN et de vecteurs comprenant de l'ADN de plasmide, et de l'ADN viral comme des virus infectant les êtres humains, des virus infectant les animaux, des virus infectant les insectes ou des bactériophages pouvant servir pour diriger l'expression de peptides et protéines apparentés à LVA/HTLV dans des cellules d'un hôte approprié à partir desquelles on peut purifier les peptides et protéines. Des méthodes chimiques pour la synthèse de peptides et protéines apparentés à LAV/HTLV III sont également décrites.

Dans une forme spécifique de mise en oeuvre comprise dans la présente invention, on a utilisé des virus de vaccine recombinants pour produire des protéines apparentées à l'enveloppe ou à la partie centrale (noyau) de LAV/HTLV III. Pour cela, on a inséré des séquences d'ADN d'enveloppe ou de gag codant pour les glycoprotéines de l'enveloppe ou les protéines de structure de noyau de LAV/HTLV III, respectivement, dans des vecteurs de vaccine capables de diriger l'expression des gènes de LAV/HTLV III dans un hôte approprié. On a trouvé que les protéines apparentées à l'enveloppe de LAV/HTLV III, produites par les virus de vaccine recombinants, sont antigéniques et immunogènes et capables de susciter chez des primates sub-humains une immunité à médiation humorale et cellulaire.

Les protéines apparentées à gag de LAV/HTLV III, produites par le virus de vaccine recombinant, sont des protéines immunoréactives qui contiennent les épitopes majeurs des authentiques protéines de noyau.

Les virus de vaccine recombinants, qui expriment les protéines apparentées à l'enveloppe de LAV/HTLV III, peuvent servir isolément ou de concert avec les recombinants de vaccine qui expriment d'autres protéines apparentées à LAV/HTLV III (comme les protéines de structure de noyau) dans des formulations de vaccins à base de virus. En variante, les protéines apparentées à LAV/HTLV III, produites par les virus recombinants, peuvent être purifiées ou chimiquement synthétisées, et utilisées à titre d'immunogènes dans des formulations de vaccins à sous-unité(s). Puisque la ou les glycoprotéines apparentées à LAV/HTLV III risquent d'être reconnues comme "étrangères" dans l'hôte animal, une réponse immunitaire à médiation humorale et/ou cellulaire va être déclenchée contre cette protéine ou cette combinaison de protéines.

Dans une formulation de vaccin préparée de manière appropriée, cela doit protéger l'hôte contre des infections subséquentes par LAV/HTLV III.

Dans une autre forme spécifique de réalisation de la présente invention, on a utilisé des bacculovirus recombinants (Autoqrapha Californica, virus de polyédrose nucléaire ou ANCPV) pour produire des protéines apparentées à l'enveloppe et au noyau de LAV/HTLV III. Pour cela, on a inséré des séquences de ADN d'enveloppe ou de gag, qui codent pour des protéines de structure d'enveloppe ou de noyau, respectivement, dans des vecteurs du type bacculovirus qui sont capables de diriger l'expression des gènes de LAV/HTLV III dans un hôte approprié. On a trouvé que les protéines de LAV/HTLV III, produites par les bacculovirus recombinants, sont antigéniques, d'après la mesure faite par radioimmunoprécipitation et ELISA.

La présente invention comprend également la production d'antigènes de LAV/HTLV III, qui ont une importance générale en médecine humaine. Cela comprend l'utilisation des peptides et protéines de la présente invention comme réactifs dans des dosages immunologiques comme les essais de dosage immunoenzymatique et ELISA (Enzyme linked immunosorbent assay) et les dosages radioimmunologiques qui sont utiles comme des outils diagnostiques pour la détection d'anticorps spécifiques de LAV/HTLV dans les échantillons de sang, les fluides corporels, les tissus, etc. En outre, ce réactif sera un outil intéressant pour élucider le mécanisme de la pathogénèse de LAV/HTLV III.

Le SIDA (Syndrome Immuno Déficitaire Acquis) est une maladie caractérisée par une déficience immunitaire grave due principalement à des troubles de la réponse immunitaire à médiation cellulaire du patient (M. Gottlieb et col., 1981, N. Engl. J. Med. 305:1425; J Masur et col., 1981, N. Engl. J. Med. 305:431).

Deux présentations cliniques de la maladie sont reconnues: (a) une phase de prodrome, appelée syndrome d'adénopathie [Lymphadenopathy Syndrome (LAS)], caractérisée par une adénopathie chronique, de la leucopénie et une diminution quantitative des cellules auxiliaires du sang périphérique (cellules OKT4), conduisant à une inversion du rapport normal entre les lymphocytes auxiliaires et les lymphocytes T suppresseurs (OKT4:OKT8),qui se déplace de 2 vers 0,1 ou moins à mesure que la maladie progresse; et (b) un état immunodéficitaire caractérisé par une diminution des cellules OKT4 et l'inversion du rapport normal OKT4:OKT8, la lymphopénie absolue, et des infections répétitives dues principalement à Pneumocystis carnii; cette dernière phase est finalement associée à la mort dans la majorité des cas.

Certains sous-groupes de patients présentent une incidence accrue de lymphome et de sarcome de Kaposi. Il n'existe actuellement pas de traitement ni de thérapie pour cette maladie.

Les données épidémiologiques ainsi que les renseignements concernant les types de patients qui ont contracté la maladie suggèrent qu'un agent infectieux transmis par contact intime pourrait être la cause de la maladie. Par la suite, trois groupes de chercheurs ont présenté de fortes preuves indiquant que l'agent provoquant le SIDA est un rétrovirus présentant un tropisme le dirigeant vers les lymphocytes T auxiliaires. Ces groupes sont:

(a) R.C. Gallo et ses collaborateurs au National Institute of Health ont pu isoler un rétrovirus cytopathe (HTLV III) sur des patients présentant le SIDA et du pré-SIDA (R.C. Gallo et col., 1984, Science 224:500; M. Popovic et col., 1984 (Science 224:497). Ils ont aussi décelé des anticorps contre HTLV III dans le sérum de patients atteints de SIDA.
(b) L.

Montagnier et ses collaborateurs ont isolé à l'Institut Pasteur un rétrovirus lymphotrope (LAV/HTLV III) sur un patient qui présentait une adénopathie cervicale et présentait aussi un risque de SIDA (Barre-Sinoussi, F. et col., 1983, Science 220:868). Ce groupe a pu aussi montrer l'existence d'anticorps contre LAV/HTLV III dans du sérum provenant de patients atteints de SIDA (V.S. Kalyansraman et col., 1984, Science 225:321). En outre, ils ont pu isoler LAV/HTLV III à partir des lymphocytes d'un patient qui avait développé du SIDA après avoir reçu du sang d'un donneur atteint de SIDA (P.M. Feorino et col., 1984, Science 225:69).
(c) J. Levy et ses collaborateurs ont isolé des rétrovirus infectieux (appelés rétrovirus associés au SIDA (AIDS-associated retrovirus, ou ARV) à partir des cellules mononucléaires périphériques de patients présentant le SIDA (J.A.

Levy et col., 1984, Science 225:840).

Ces trois virus ont tous été isolés indépendamment, mais ils appartiennent probablement tous au même sous-groupe des rétrovirus (J.A. Levy et col., 1984, Science 225:840) et ils seront collectivement appelés ici LAV/HTLV III.

La structure générale des rétrovirus est celle d'un noyau de ribonucléoprotéines entouré par une enveloppe contenant des lipides que le virus acquiert au cours du bourgeonnement cellulaire. Les glycoprotéines à codage viral sont enfouies au sein de l'enveloppe et font saillie vers l'extérieur. Elles déterminent les virus connus de l'hôte et réagissent avec des récepteurs spécifiques situés à la surface de cellules sensibles. On pense que des anticorps neutralisants se fixent sur les glycoprotéines de l'enveloppe et en bloquent l'interaction avec des récepteurs situés à la surface des cellules (pages 534-535 dans "The Molecular Biology of Tumor Viruses" (biologie moléculaire des virus de tumeur), publié par John Tooze, 1973, Cold Spring Harbor Laboratory; pages 226-277 et 236-237 dans "RNA Tumor Viruses" (virus de tumeur à ARN (acide ribonucléique), publié par R. Weiss, N. Teich, H.

Varmus et J. Coffin, 1982, Cold Spring Harbor Laboratory). Dans le cas spécifique de LAV/HTLV III, il existe des preuves selon lesquelles l'antigène T4, présent dans un sous-groupe de lymphocytes T, est le récepteur ou un composant du récepteur du virus (A.G. Dalgleish et col., 1984, Nature 312:763; D. Kltazmann et col., 1984, Nature 312:767).

Le génome de ARN de LAV/HTLV III est schématisé sur la figure 1. Trois gènes sont généralement reconnus: le gène gag code pour les protéines structurelles internes (protéines de noyau) du virus et définit les antigènes spécifiques du groupe de virus. Le gène pol code pour la transcriptase inverse associée au virion. Le gene env code pour les glycoprotéines virales. D'autres régions, marquées sor et 3 min -orf, désignent des zones du génome contenant des cadres à lecture libre; la fonction de ces régions n'est pas actuellement connue.

On utilise actuellement un certain nombre de méthodes pour la prévention et le traitement des infections virales. Elles comprennent des vaccins qui déclenchent une réponse immunitaire active, le traitement par des agents de chimiothérapie et le traitement par l'interféron.

Les voies traditionnelles de préparation des vaccins comprennent l'utilisation de virus inactivés ou atténués. L'inactivation des virus les rend inoffensifs comme agents biologiques, mais n'en détruit pas l'immunogénicité. L'injection de ces particules de virus "tués" à un hôte va alors déclencher une réponse immunitaire capable de neutraliser une infection future par un virus vivant. Cependant, un souci majeur concernant l'utilisation des vaccins tués (utilisant des virus inactivés) cancerne le risque de non-inactivation de la totalité des particules de virus. Même si l'inactivation est réalisée, puisque les virus tués ne se multiplient pas dans leur hôte, l'immunité obtenue est souvent de courte durée et il faut habituellement des immunisations supplémentaires. Finalement, le processus d'inactivation peut altérer les protéines virales et les rendre moins efficaces comme immunogènes.

L'atténuation désigne la production de souches de virus qui ont essentiellement perdu leur aptitude à provoquer des maladies. Une voie pour y parvenir consiste à soumettre le virus à des conditions inhabituelles de croissance et/ou a un passage fréquent en culture cellulaire. On choisit ensuite des mutants de virus qui ont perdu de la virulence mais sont encore capables de déclencher une réponse immunitaire. Les virus atténués constituent généralement de bons immunogènes, car ils se répliquent dans la cellule de l'hôte et déclenchent une immunité de longue durée. Cependant, on rencontre plusieurs problèmes lors de l'utilisation de vaccins vivants, dont le plus gênant est une atténuation insuffisante.

Au lieu des méthodes ci-dessus, on peut utiliser ce que l'on appelle les vaccins de sous-unités, ou sous-unités de vaccins. Cela implique une immunisation obtenue seulement à l'aide des protéines contenant le matériel immunologique concerné. Pour de nombreux virus à enveloppe, la glycoprotéine à codage viral contient les épitopes capables de déclencher la production d'anticorps neutralisants ; elles comprennent les glycoprotéines du virus La Crosse (F. Gonzalez-Scarano, R.E. Shope, C.E. Calisher et N. Nathanson, 1982, Virology 120:42.), le virus de la diarrhée néonatale du veau (S. Matsuno et S. Inouye, 1983, Infection and Immunity 39:155), le virus de l'encéphalomyélite équine du Vénézuela (J.H. Mathews et J.T. Roerhrig, 1982, J. Imm. 129:2763), le virus de Punta Toro (J.M. Dalrymple, C.J. Peters, J.F. Smith et M.K.

Gentry, 1981 dans "Replication of Negative Strand Viruses" (Replication de virus de brin négatif), D.H.L. Bishop et R.W. Compans, page 167, Elsevier, New-York), virus de la leucémie de souris (R.A. Steeves, M. Strand et J.T. August, 1974, J. Virol. 14:187) et "Mouse Mammary Tumor Virus" (virus de la tumeur des mamelles de souris) (R.J. Massey et G. Schochetman, 1981, Virology 115:20). Un avantage des vaccins de sous-unités est que le matériel viral non-intéressant est exclu.

Les vaccins sont souvent administrés en association avec divers adjuvants. Les adjuvants aident à atteindre un niveau plus durable et plus élevé d'immunité, en utilisant de plus faibles quantités d'antigènes en de plus faibles doses que si l'immunogène était administré seul. Le mécanisme de l'action des adjuvants est complexe et n'est pas entièrement compris. Cependant, il peut impliquer la stimulation de la phagocytose et d'autres activités du système réticuloendothélial aussi bien qu'un retard de libération et de dégradation de l'antigène. Des exemples d'adjuvants comprennent l'adjuvant de Freund (complet ou incomplet), l'adjuvant 65 (contenant de l'huile d'arachide, du monooléate de mannide et du monostéarate d'aluminium), le polyol "Pluronic L-121", "Avridine", et les gels minéraux comme de l'hydroxyde d'aluminium, du phosphate d'aluminium ou de l'alun.

L'adjuvant de Freund n'est plus utilisé dans la formulation des vaccins pour les êtres humains, car il contient de l'huile minérale non metabolisable et il constitue un agent carcinogène potentiel.

L'utilisation de la technologie de l'ADN recombinant pour la production de vaccins de sous-unités implique le clonage moléculaire et l'expression dans un vecteur approprié de l'information génétique virale codant pour les protéines pouvant déclencher une réponse neutralisante dans l'animal hôte. Tous les autres renseignements génétiques du virus sont exclus et seules les protéines necessaires pour établir une réponse neutralisante sont présentées à l'animal hôte. L'hôte n'est jamais exposé à la totalité du virus et il ne risque pas de devenir infecte.

Récemment, une approche a été décrite, qui est potentiellement utile pour la production de vaccins de sous-unités (M. Mackett, G.L. Smith et B. Moss, 1982, Proc. Nat'1. Acad. Sci. 79, 7415-7419; M. Mackett, G.L. Smith et B. Moss, 1984, J. Virol. 49, 857-864; D. Panicali et E. Paoletti, 1982, Proc. Nat'1. Acad. Sci. 79, 4927-4931). Cette approche implique l'utilisation du virus de la vaccine comme vecteur pour exprimer des gènes étrangers insérés dans son génome. Quand il est introduit dans des hôtes animaux, le virus de vaccine recombinant exprime le gène étranger inséré et déclenche ainsi une réponse immunitaire de l'hôte à de tels gènes. Puisque le virus virant de vaccine recombinant peut servir de vaccin, une telle approche combine l'avantage des vaccins de sous-unité(s) et des vaccins vivants.

Le virus de la vaccine contient un génome de ADN (acide désoxyribonucléique) linéaire à double brin comportant environ 167 kilopaires de bases et il se réplique au sein cytoplasme de cellules infectées. Ces virus contiennent un système complet d'enzymes de transcription (ce qui comprend les enzymes de coiffage, de méthylation et de polyadényla tion) au sein du noyau du virus, qui sont nécessaires pour l'infectivité du virus. Les séquences de régulation de transcription du virus de la vaccine (promoteurs) permettent l'amorçage de la transcription par l'ARN polymérase de vaccine, mais non pas par l'ARN polymérase des cellules de l'hôte.

L'expression de l'ADN étranger dans des virus de vaccine recombinants exige la ligation des promoteurs de vaccine sur des séquences de ADN codant pour des protéines du gène étranger. Des vecteurs de plasmide, appelés également vecteurs d'insertion, ont été construits pour insérer des gènes chimères dans des virus de vaccine.

Un type de vecteur d'insertion est composé: (a) d'un promoteur de virus de vaccine comprenant le site d'initiation de transcription; (b) de plusieurs sites de clonage par endonucléase de restriction unique, situés en aval du site de début de transcription pour l'insertion de fragments de ADN étrangers; (c) de ADN non essentiel de virus de vaccine (comme le gène TK) entourant les sites du promoteur et de clonage qui dirigent l'insertion du gène chimérique dans la région homologue non essentielle du génome de virus ; et (d) d'un marqueur d'origine bactérienne de réplication et de résistance à des antibiotiques pour la réplication et la sélection dans E.coli. Des exemples de tels vecteurs sont décrits par Mackett 2 (M. Mackett, J.L. Smith et B. Moss, 1984, J. Virol. 49, 857-864).

Des virus de vaccine recombinants sont produits par transfection de plasmides d'insertion de bactéries recombinantes, contenant le gène étranger, à des cellules-précédemment infectées par le virus de la vaccine. Une recombinaison homologue se produit au sein des cellules infectées et produit l'insertion du gène étranger dans le génome viral. Les cellules infectées peuvent être dépistées à l'aide de techniques immunologiques, d'hybridation sur plaque de ADN, ou de choix génétique de virus recombinants que l'on peut isoler par la suite. Ces recombinants de vaccine conservent leurs fonctions essentielles et leur infectivité et ils peu vent être construits de manière à comporter environ 35 kilobases de ADN étranger.

L'expression de gènes étrangers peut être décelée par des dosages enzymatiques ou immunlogiques (par exemple par immunoprécipitation, dosage radioimmunologique ou immunocoagulation). Les glycoprotéines naturelles de membrane produites par des cellules infectées par de la vaccine recombinante sont glycosylées et peuvent être transportées vers la surface des cellules. On peut obtenir des taux élevés d'expression en utilisant des promoteurs forts ou en obtenant par clonage des copies multiples d'un seul gène.

Récemment, on a décrit une approche qui est potentiellement utile pour la production de protéines recombinantes (Pennock et al., 1984, mol. cel. biol. 4:399, Smith et al. 1983, J. Virol. 46:584). Cette approche implique l'utilisation d'un vecteur de type baculovirus pour exprimer des génes étrangers insérés dans son génome. Après introduction dans une cellule d'un hôte approprié, le baculovirus recombinant exprime le gène étranger.

Le prototype de la famille des baculovirus est Auto-grapha californica, virus de polyédrose nucléaire (AcNPV). Le génome de AcNPV consiste en une espèce de ADN circulaire à double brin de 128 paires de kilobases, dont on a dressé la carte par rapport à plusieurs sites de restriction (G.E. Smith et M.D. Summers, 1978, Virology 89:517). Le virus se réplique dans le noyau de cellules d'insectes infectées. Deux formes de virus sont produites par suite de l'infection, par AcNPV de type sauvage, de cellules sensibles, des particules de virus à occlusion et sans occlusion. Des particules de virus à occlusion sont entourées par une protéine appelée polyèdre dont le codage est dû au gène de polyédrine (voir Virol. 131:561-565, 1983). Dans des cellules infectées, les particules virales à occlusion peuvent être facilement visualisées à l'aide d'un microscope optique.

L'expression de l'ADN étranger dans des baculovirus recombinants exige la ligation des promoteurs de baculovirus sur des protéines codant pour des séquences d'ADN du gène étranger. Des vecteurs du type plasmide, appelés aussi vecteurs d'insertion, ont été construits afin d'insérer des gènes chimères dans AcNPV.

Un type de vecteur d'insertion est composé de: (a) un promoteur de AcNPV comprenant le site d'initiation de transcription; (b) plusieurs sites de clonage d'endonucléase à restriction unique, situés en aval du site de début de transcription pour l'insertion de fragments d'ADN étrangers; (c) de l'ADN de AcNPV non essentiel (comme le gène de polyédrine) flanquant le promoteur et les sites de clonage qui dirigent l'insertion du gène chimère dans la région homologue non essentielle du génome de virus; et (d) une origine bactérienne de réplication et un marqueur de résistance aux antibiotiques pour la réplication et la sélection dans E. coli. Des exemples de tels vecteurs sont décrits par Miyamota et al. (1985, Mol. Cell. Biol. 5:2860).

On reproduit des baculovirus recombinants par cotransfection de cellules avec insertion bactérienne recombinante de plasmides contenant le gène, avec l'ADN de baculovirus. Une recombinaison homologue se produit au sein des cellules infectées et provoque l'insertion du gène etranger dans le génome viral. Une fois un gène étranger inséré dans le gène de polyédrine, les particules de virus à occlusion ne peuvent plus être produites et les plaques recombinantes résultantes peuvent être examinées visuellement pour y déceler l'absence des corps à occlusion. Les cellules infectées peuvent également être dépistées à l'aide de techniques immunologiques, d'une hybridation de plaques de ADN, ou d'une sélection génétique donnant des virus recombinants que l'on peut isoler par la suite. Ces baculovirus recombinants conservent leurs fonctions et infectivité essentielles.

L'expression des gènes étrangers peut être décelée par des dosages enzymatiques ou immunologiques (par exemple par immunoprécipitation, dosage radio-immunologique ou immunocoagulation). On peut obtenir des niveaux élevés d'expression en utilisant des promoteurs forts ou en clonant des copies multiples d'un gène unique.

On va décrire des virus qui dirigent l'expression de peptides ou protéines apparentés à des épitopes de LAV/ HTLV III. Les virus recombinants de la présente invention, qui expriment à des épitopes apparentés à LAV/HTLV III suscitant une réponse d'immunoprotection, peuvent être formulés sous forme de vaccins contenant des virus pour protéger les êtres humains contre l'infection due à LAV/HTLV III. Dans une forme particulière de mise en oeuvre de la présente invention, on peut préparer des formulations de vaccins a virus vivants, en utilisant des virus infectieux qui expriment de tels épitopes apparentés à LAV/HTLV III dans un hôte infecté, mais ne provoquent pas une telle maladie chez cet hôte.

L'invention comprend également des peptides ou protéines apparents aux épitopes de LAV/HTLV III. On peut formuler les peptides ou protéines qui suscitent une réponse d'immunoprotection, en des vaccins de sous-unités ou en des vaccins multivalents pour protéger les êtres humains contre une infection par LAV/HTLV III. En variante, on peut utiliser les peptides ou protéines de l'invention pour des essais et dosages diagnostiques de dépistage du SIDA ou de LAS.

On peut produire les peptides ou protéines de la présente invention dans n'importe quel système de vecteur d'expression dans des cellules d'hôtes et les isoler à partir de ce système; cela comprend, par exemple, des cultures de cellules animales ou d'insectes infectées par du virus recombinant approprié; des microorganismes comme des bactéries transfectées par des plasmides recombinants, des cosmides ou des phages; et de la levure transformée à l'aide de plasmides recombinants. La présente invention propose également des méthodes, des modes opératoires et des constructions de ADN servant l'expression de l'information génétique codant pour les épitopes de LAV/HTLV III. En variante, on peut effectuer la synthèse chimique des peptides et protéines de la présente invention.

Dans des formes spécifiques de mise en oeuvre de la présente invention, on insère dans des plasmides les séquences de gènes codant pour les glycoprotéines d'enve loppe ou les protéines de structure de noyau de LAV/HTLV III (c'est-à-dire les séquences de gène de env ou gag de LAV/HTLV III, respectivement), de manière qu'un promoteur de virus de vaccine antérieur soit placé en 5 min par rapport à la séquence méthionine d'amorçage (ATG) des séquences de gène LAV/HTLV III, ce qui donne la construction de gènes chimères flanqués ou entourés par des séquences de thymidine kinase (TK) de ADN de vaccine. Ces plasmides ont été transfectés dans des cellules qui ont été au préalable infectées par du virus de vaccine de type sauvage, en laissant ainsi le gène env ou gag chimère de LAV/HTLV III, flanqué par les séquences de TK, se recombiner dans le gène TK du virus de vaccine.

On laisse les cellules se lyser et l'on cultive les virus résultants sur des plaques de cellules de TK<->. On choisit les virus recombinants d'après leur aptitude à se fixer sur des cultures de ces cellules en plaques en présence de la 5-bromo-désoxyuridine ainsi que par hybridation ADN-ADN sur une sonde radiomarquée appropriée comprenant des séquences d'enveloppe de LAV/HTLV III ou de gag LAV/HTLV III. On a purifié des plaques positives pour l'hybridation, on en a provoqué l'expansion et l'on a soumis les virus recombinants résultants à des essais de détermination de leur aptitude à produire des glycoprotéines d'enveloppe de LAV/HTLV III ou des protéines de structure de noyau de LAV/HTLV III.

Les protéines apparentées à l'enveloppe de LAV/HTLV III, exprimées par les virus de vaccine recombinants se sont avérées être antigéniques et immunogènes, et capables de susciter chez des primates sub-humains une immunité a médiation aussi bien humorale que cellulaire. Les protéines apparentées à gag de LAV/HTLV III, exprimées par les virus de vaccine recombinants, ont été des protéines immuno-réactives qui contenaient les épitopes majeurs des protéines de noyaux authentiques.

Dans d'autres formes spécifiques de réalisation comprises dans la présente invention, on a inséré des séquences env ou gag de LAV/HTLV III dans un plasmide de façon qu'un promoteur de polyédrine de baculovirus soit placé en position 5 min par rapport à la séquence méthionine d'amorçage (ATG) du gène de LAV/HTLV III suivie par des séquences d'ADN de polyédrine à l'extrémité 3 min . On a ensuite co-transfecté ces plasmides dans des cellules avec de l'ADN de baculovirus de type sauvage, en laissant le gène chimère de LAV/HTLV III flanqué par des séquences additionnelles de AcNPV se recombiner dans le gène de polyédrine du baculovirus. On a laissé les cellules subir une lyse et l'on a cultivé les virus résultants sur des plaques.

Par examen visuel pour déceler le manque de corps à occlusion ou par hybridation de ADN-ADN sur des sondes radiomarquées env/HTLV III ou gag de LAV/HTLV III, on a effectué la sélection de virus recombinants. On a purifié des plaques recombinantes et l'on en a provoqué la propagation, et l'on a soumis les virus recombinants résultants à des dépistages de détermination de leur aptitude à produire des protéines apparentées à LAV/HTLV III par immunoprécipitation suivie d'une analyse sur des gels de SDS (dodécylsulfate de sodium)-polyacrylamide. On a soumis des lysats de cellules infectées à des essais de détermination de leur aptitude à déceler des anticorps de LAV/HTLV III dans du sérum par ELISA.

On va maintenant brièvement décrire les figures annexées.

La figure 1 représente la structure de génome proviral integré de LAV/HTLV III. Les zones hachurées indiquent des régions de cadres à lecture ouverte. Les régions codant pour l'antigène spécifique du groupe, la transcriptase inverse et les protéines d'enveloppe sont désignées respectivement par gag (groupe-spécifique antigène), pol et env. Les cadres à lecture ouverte qui se chevauchent sont représentés par des zones à hachurage croisé. Les nombres désignent les nombres de paires de base en aval du site de coiffage (site de "cap"), où démarre la transcription virale. Les sites de restriction sont marqués comme suit: Bg, Bg1II; Ec, EcoRI; Hn, HindIII; kp, kpnI; Ss, SstI.

La figure 2 représente la séquence des nucléotides de la région spécifique de LAV/HTLV III (EcoRi à SstI) présentes dans le plasmide pRS-3 ADN; la totalité du gène d'enveloppe de LAV/HTLV III (nucléotide 5766 à 8349) est contenue dans l'insertion LAV/HTLV III. Les sites de restriction utilisés dans la construction de pv-envl, pv-env2 et pv-env5 sont indiqués. La totalité de la séquence des amino acides du gène de l'enveloppe, telle que déduite des données des sequences de nucléotides, est egalement indiquée.

La figure 3 est une représentation schématique de la construction de plasmides contenant une portion de la séquence codant pour des protéines d'enveloppe LAV/HTLV III, séquence insérée en aval d'un promoteur de virus de vaccine. La séquence codant pour l'enveloppe de LAV/HTLV III est représentée par la barre libre et le promoteur de vaccine par la barre ombrée ou hachurée. La sequence des nucléotides à la jonction de la région de promoteur de vaccine et de la séquence codant pour l'enveloppe LAV/HTLV III est indiquée à la partie inférieure de la figure. Les séquences soulignées indiquent les codons présumés d'amorçage et le cadre de lecture pour le gène chimérique. On notera que les troisième et quatrième amino-acides de la séquence translatée (Pro-Val) du pv-env2 recombinant correspondent aux aminoacides numéro 43 et 44 de la séquence de codage d'enveloppe de LAV/HTLV III.

La figure 4 est une rèpresentation schématique de la construction de plasmides contenant la totalité de la séquence de codage des protéines d'enveloppe de LAV/HTLV III insérée en aval d'un promoteur de virus de vaccine. Le promoteur de virus de vaccine est représenté par la barre hachurée ou ombrée. Le plasmide pv-env5 contenant la totalité de la région de codage d'enveloppe de LAV/HTLV III a été construit en deux étapes. Les portions 5 min et 3 min de la région de codage ont éte tout d'abord clonées séparément dans pGS20 pour former pv-env1 qui contient l'extrémité amino de codage du gène de l'enveloppe de LAV/HTLV III et pv-env2 qui contient l'extrémité carboxyle de codage du gène de l'enveloppe de LAV/HTLV III. Ces deux portions sont regroupées au site StuI comme représenté.

La figure 5 est une représentation schématique de la construction de plasmides contenant la séquence de codage des protéines d'envelopoe de LAV/HTLV III, sans la séquence transmembrane (ancrage), insérée en aval d'un promoteur de virus de vaccine. Le plasmide pv-env7 a été construit en deux étapes. La partie 5 min de pv-env 5 a été insérée dans p26 pour former un plasmide intermédiaire, pv-env5/26, qui a fourni une séquence de terminaison par translation dans le cadre (TAA) donnant un gène env tronqué. On a ensuite inséré la séquence env tronquée, terminée par TAA, dans pG20 afin de construire pv-env7 dans lequel le gène env tronqué est flanqué par des séquences le gène de TK de vaccine.

La figure 6 représente la construction et le choix du virus de vaccine recombinant. Les barres pleines représentent le gène de thymidine kinase (TK) du virus de la vaccine. Ce gène TK est aussi présent dans le plasmide pv-env5 ADN, mais dans le plasmide le gène TK est interrompu par le gène chimère consistant en le promoteur à 7,5K de la vaccine (barre hachurée) et par la région de codage d'enveloppe de LAV/HTLV III (barre ouverte). Après infection des cellules par la vaccine, le plasmide recombinant contenant le gène TK interrompu par le gène d'enveloppe de LAV/HTLV III est introduit dans les cellules infectées. Les recombinaisons qui se produisent dans les séquences TK entourant le gène chimique introduisent la séquence de gène d'enveloppe de LAV/HTLV III dans le génome de virus de la vaccine. Le virus recombinant résultant, contenant le gène d'enveloppe de LAV/HTLV III, est TK.

Les figures 7 représentent une caractérisation des structures de génome des virus de vaccine recombinants contenant le gène env d'un LAV/HTLV III. La figure 7A représente une analyse, à l'aide d'une enzyme de restriction, des recombinants de vaccine v-env5 et v-env5NY ainsi que leurs souches de vaccine parentale respectives (WR et v-NY, respectivement). Des fragments de ADN engendrés par des produits de digestion par l'enzyme de restriction HindIII ont été résolus par électrophorèse sur un gel d'agarose et colorés par du bromure d'éthidium afin de visualiser les bandes. La figure 7B représente le caillot du Sud (Southern) obtenu après transfert des fragments résolus par restriction sur de la nitrocellulose et hybridation sur une sonde à translation par étranglement, spécifique des séquences d'enveloppe LAV/HTLV III.

La figure 8A représente une analyse par immunocoagulation de Western ("ouest") des protéines produites par les recombinants de env-LAV/HTLV III de vaccine. Les protéines provenant des sources suivantes ont été résolues sur un gel de polyacrylamide gradient de 7 à 15% de SDS et électrotransférées sur du papier nitrocellulosique: protéines de virion de LAV/HTLV III (LAV/HTLV III); cellules infectées par du virus de vaccine de type sauvage ("WTvv"); ("Wild-type vaccinia virus"); cellules non infectées ("mock"); cellules infectées par des virus recombinants v-env2 (v-env2) ou v-env5 (v-env5). Des protéines immunoréatives à l'égard du sérum d'un patient atteint de SIDA ont été décelées par l'action d'une peroxydase conjugée à des anticorps de IgG anti-humaines. Les gènes LAV/env produits sont indiqués par gp150, gp110 et gp41.

Les étalons de poids moléculaire sont exprimés en kilodaltons (kd).

La figure 8B représente une analyse d'un immunocoagulat de Western de protéines produites par des recombinants de vaccine LAV-env dans deux types de cellules. Les protéines provenant de cellules BSC-40 ou de ceilules HeLa ont été résolues par électrophorèse sur gel de SDS-polyacrylamide (SDS-PAGE) et électrotransférées sur du papier nitrocellulosique, puis mises en réaction avec du sérum groupé provenant de personnes à sérum positif pour LAV/HTLV-III; les pistes 1 et 5 représentent les cellules infectées par "mock"; les pistes 2 et 6 représentent des cellules infectées par le virus de la vaccine de type sauvage; les pistes 3 et 7 représentent des cellules infectées par v-env5; et les pistes 4 et 8 représentent des cellules infectées par v-env2. On a décelé des protéines immunoréactives en utilisant de la protéine A marquée par <1><2><5>I.

Les produits de type gène de LAV-env sont indiqués par gp150, gp110 et gp41.

La figure 9A représente les résultats d'une analyse par radioimmunoprécipitation des protéines synthétisées dans des cellules infectées par le virus de la vaccine de type sauvage ("WTvv") ou par du virus de vaccine recombinant (v-env2 et v-env5). Les protéines ont été marquées par de la <3><5>S-méthionine de 10 à 12 heures après l'infection. On a fait réagir les protéines marquées présentes dans les lysats de cellules avec du sérum humain témoin (N) ou avec du serum de patient atteint de SIDA (I) et l'on a provoqué la précipitation des immun complexes par la protéine A de Staphylococcus aureus. Les protéines immunoprécipitées ont été résolues par électrophorèse sur un gel de polyacrylamide à 15% de SDS et détectées par fluorographie. Les poids moléculaires sont indiqués en kilodaltons (kd).

La figure 9B représente les résultats d'une analyse par radioimmunoprécipitation de protéines marquées par 3H-glucosamine produites par effet d'expression des recombinants de vaccine-LAV/HTLV III de l'invention. Les cellules Hela ont été soit "infectées" par des cellules non infectieuses ("mock"; noninfection) (pistes 1 et 5), soit infectées par des virus de vaccine de type sauvage (pistes 2 et 6), v-env5 (pistes 3 et 7) ou v-env2 (pistes 4 et 8) et marquées par de la <3>H-glucosamine. Les lysats de cellules ont été immunoprécipités avec du sérum humain normal (pistes 1-4) ou avec du sérum groupé provenant de personnes à sérum positif à l'égard de LAV/HTLV III (pistes 5-8) et de la protéine A. Les protéines immunoprécipitées ont été résolues par électrophorèse sur gel de SDS-polyacrylamide.

La figure 9C représente les résultats d'une analyse de radioimmunoprécipitation "par impulsions de chasse" des protéines d'enveloppe LAV/HTLV III produites par les recombinants de vaccine LAV/HTLV III. On a infecté des cellules HeLa avec du virus de vaccine de type sauvage, v-env5 ou v-env2 comme indiqué, marqué par <3><5>S-méthionine, et on a lavé avec un milieu de chasse. Aux intervalles suivants de temps, on a lavé les cellules, on les a lysées et immunoprécipitées avec du sérum groupé provenant de personnes à sérum positif à l'égard de LAV/HTLV III et l'on a résolu par SDS-PAGE (électrophorèse sur gel de polyacrylamide): 0 heure (pistes 1, 7, 13); une demi-heure (pistes 2, 8, 14); 1 heure (pistes 3, 9, 15); 2 heures (pistes 4, 10, 16) ; 6 heures (pistes 5, 11, 17) et 12 heures (pistes 6, 12, 18).

La piste M représente des marqueurs comprenant des étalons de poids moléculaire marqués par <1><4>C.

La figure 9D représente les résultats d'une analyse de radioimmunoprécipitation des protéines apparentées à l'enveloppe de LAV/HTLV III que l'on trouve dans les cellules et dans des milieux provenant de cellules infectées par les virus de vaccine-LAV/HTLV III recombinants de l'invention. Des cellules HeLa ont été soit "infectées" par des virus non infectés (c'est-à-dire non infectées; piste 1 "mock"), soit infectés par le virus de vaccine de type sauvage (piste 2) v-env5 (piste 3) ou v-env2 (piste 4) et marquées par <3><5>S-méthionine. Les cellules ont été séparées du milieu et lysées. Les lysats de cellules (culot) et le milieu supérieur surnageant ont été chacun immunoprécipités à l'aide de sérum groupe provenant de personnes à sérum positif à l'égard de LAV/HTLV III. Les protéines immunoprécipitées ont été résolues par électrophorèse sur gel; de polyacrylamide (SDS-PAGE).

La figure 9E représente le résultat d'une analyse par radioimmunoprécipitation des protéines apparentées à l'enveloppe de LAV/HTLV III dans des cellules et dans des milieux provenant de cellules infectées par des virus recombinants de vaccine-LAV/HTLVL III de l'invention. v-env5 recombinant contient la totalité de la séquence de codage de l'enveloppe de LAV/HTLV III, alors que v-env7 contient la séquence de codage d'enveloppe de LAV/HTLV III sauf la région de transmembrane (ancrage). Les cellules Hela ont été soit "infectées" par des virus non infectés (c'est-à-dire non infectés; piste 1 "mock"), soit infectées par le virus de vaccine de type sauvage (piste 2), v-env5 (piste 3) ou v-env2 (piste 4), et marquées par <3><5>S-méthionine. Les cellules ont été séparées du milieu et lysées.

Les lysats de cellules (culot) et le milieu (surnageant) ont été chacun immunoprécipités à l'aide de sérum groupé provenant de personnes à sérum positif à l'égard de LAV/HTLV III. Les protéines immunopré cipitées ont été résolues par électrophorèse sur gel de polyacrylamide (SDS-PAGE).

La figure 10 représente une analyse par immunocoagulation de Western d'échantillons de sérum provenant de souris immunisées par des virus recombinants de vaccine-LAV/HTLV III. Les souris avaient été immunisées avec du virus de vaccine recombinant v-env5 ou v-env2. Au bout de 8 semaines, on a fait réagir les échantillons de sérum avec des protéines de virion LAV/HTLV III qui avaient été résolues par électrophorèse sur SDS-PAGE (gel de polyacrylamide) et électrotransférées sur du papier nitrocellulosique. On a utilisé une immunoglobuline anti-souris de chèvre conjuguée à de la phosphatase alcaline pour déceler les protéines LAV/HTLV III qui ont été reconnues par les sérums de souris.

Les pistes a à e représentent les échantillons de sérum de 5 souris individuelles auxquelles on a inoculé v-env5, et les pistes f à k représentent des échantillons de sérum provenant de 5 souris individuelles auxquelles on a inoculé v-env2. Les sérums groupés provenant de personnes à résultat positif pour LAV/HTLV III (SIDA) et de souris non immunisées C57B16J (NMS) ont servi de témoins positif et négatif, respectivement. Les positions des glycoprotéines d'enveloppe LAV/HTLV III gp150, gp110 et gp43 sont indiquées.

La figure 11 est un histogramme représentant la séro-conversion de singes macaques vaccinés par du virus de vaccine recombinant, v-env5. On a inoculé a 4 singes macaques, par scarification de la peau, 2 x 10<8> unités de formation de plaque et à 4 singes 2 x 10<7> unités de formation de plaque de v-env-5. On a inoculé à 1 animal 2 x 10<7> unités de formation de plaque de recombinant témoin vaccine-herpès simplex gD (v-HSVgD1). Dix semaines après la première inoculation, on a administré à tous les animaux, sauf le numéro 81, une seconde inoculation de 2 x 10<8> unités de formation de plaque du même virus. On a collecté des échantillons de sérum avant inoculation (barres ouvertes); 4 semaines après la première inoculation (barres hachurées; et 4 semaines après la seconde inoculation (barres pleines).

On a vérifié et titré la séro -conversion par ELISA, en utilisant des virions purifiés de LAV/HTLV III comme antigène cible.

La figure 12 représente une analyse par immunocoagulation de Western, d'échantillons de sérum provenant de singes macaques immunisés par des virus recombinants de vaccine-LAV/HTLV III, v-env5, comme décrit pour la figure 11. On a collecté des échantillons de virus avant la première inoculation (piste pré) et au bout de 4 semaines après la seconde inoculation. On a dilué des parties aliquotes du sérum 50 fois et on l'a fait réagir avec de la protéine de virion de LAV/HTLV V qui a été résolue par chromatographie sur gel de polyacrylamide (SDS-PAGE) et immobilisée sur des filtres en nitrocellulose, par électrotransfert en utilisant un protocole qui permet la détection optimale des deux glycoproteines d'enveloppe, gp110 (figure 12A) et gp41 (figure 12B).

Les protéines de LAV/HTLV III reconnues par les sérums de macaques ont été décelées par de l'immunoglobuline anti-humaine de chèvre conjuguée à de la phosphatase alcaline. On a utilisé comme témoin positif des sérums regroupés provenant de personnes à sérum positif pour la recherche de LAV/HTLV III (SIDA). On a utilisé comme témoin des virions authentiques de LAV/HTLV III (SIDA).

La figure 13 représente une analyse par immunocoagulation de Western de ces échantillons de sérum provenant de chimpanzés immunisés par des virus recombinants de vaccine NY-LAV/HTLV III, v-env5NY. A deux chimpanzés, on a inoculé par voie intradermique 5 x 10<8> unités de formation de plaque de v-env5NY, cependant qu'on a inoculé à un animal la même dose de v-HSVgD1NY, un recombinant de vaccine-virus d'herpès simplex gD construit à partir de la même souche de vaccine parentale-NY. Tous les animaux ont reçu une seconde inoculation 8 semaines après la première inoculation. On a collecté des échantillons de sérum avant immunisation (piste 1), 8 semaines après l'immunisation primaire (piste 2) et 2 semaines après la seconde immunisation (piste 3).

On a dilué 50 fois des parties aliquotes de sérum et on les a fait réagir avec des protéines de virion de LAV/HTLV III qui ont été résolues par électrophorèse sur gel de polyacrylamide (SDS-PAGE) et immobilisées sur des filtres nitrocellulosiques par électro-transfert, en utilisant un protocole qui permet la meilleure détection possible de gp 41. Les protéines de LAV/HTLV III reconnues par les sérums de chimpanzés ont été décelées par de l'immunoglobuline anti-humaine de chèvre conjuguée à de la phosphatase alcaline. On a utilisé comme témoin positif des sérums groupés provenant de personnes dont le sérum était positif à la recherche de LAV/HTLV III (SIDA).

Les figures 14A à 14D représentent la séquence des nucléotides de la région spécifique de LAV/HTLV III (SstI à KpnI) présentes dans l'ADN de plasmide pKS-5; la totalité du gène gag LAV/HTLV III (nucléotides 340 à 1871) est contenue dans la partie insérée de LAV/HTLV III. Les sites de restriction utilisés pour la construction de pAc-gag1 sont indiqués. La totalité des séquences des amino-acides du gène gag, telle que déduite des renseignements concernant la séquence des nucléotides, est également indiquée.

La figure 15 est une représentation schematique de la construction du plasmide pAc-gag1 contenant la séquence de codage des protéines gag LAV/HTLV III insérée en aval d'un promoteur AcNPV. Le vecteur de clonage pAc610 contient des séquences de nucléotides correspondant au promoteur de gène de polyédrine et il comprend les séquences de tête en 5 min et les séquences de polyédrine en 3 min interrompues par des sites de clonage situés en aval du site de début de transcription. Les sites de clonage à la position -8 sont EcoRI, SstI, SmaI (XmaI), BamHI, XbaI et PstI. SalI, AccI et HincII ne sont pas uniques. Il n'y a présence de sites pour KnpI ou Bg1II.

La figure 16 représente schématiquement la construction et la sélection du recombinant AcNPV (Ac-gag1). La barre hachurée indique les séquences de promoteur de polyédrine et de tête en 5 min . Les barres pleines représentent le gène de polyédrine de baculovirus. Les parties de ce gène sont présentes dans le plasmide pAc-gag1 ADN, interrompues par la région de codage de LAV/HTLV III gag (barre ouverte). Des cellules sont co-transfectées avec de l'ADN de plasmide recom binant contenant des portions du gène de polyédrine interrompues par le gène LAV/HTLV III gag (pAc-gag1) avec de l'ADN de AcNPV de type sauvage. Des recombinaisons qui se produisent dans les séquences de polyédrine flanquant le gène chimère introduisent la séquence de gène LAV/HTLV III gag dans le génome de AcNPV.

La figure 17 représente une analyse de coagulation de Northern (Nord) de l'ARN extrait de cellules de Spodoptera frugiperda infectées par AcPNV de type sauvage et Ac-gag1, en utilisant des ondes spécifiques pour LAV/HTLV III gag.

La figure 18 représente le résultat d'une analyse par radioimmunoprécipitation des protéines exprimées dans des cellules infectées par du baculovirus Ac-gag1 recombinant. Les protéines ont eté marquées par la (<3><5>S) methionine, pendant 2 heures, à 24 heures (pistes 1, 2), 48 heures (pistes 3, 4) et 72 heures (pistes 5, 6) après l'infection. On a fait réagir les protéines marquées présentes dans les lysats de cellules avec du sérum humain témoin (pistes 1, 3, 5) ou avec le sérum d'un patient atteint de SIDA (pistes 2, 4, 6), et les immun-complexes ont été précipités par la protéine A de Staphylococcus aureus. Les protéines immunoprecipitées ont été résolues par électrophorèse sur un gel de polyacrylamide à 10% de SDS et détectées par fluorographie. Les poids moléculaires sont indiqués en kilodaltons.

La figure 19 représente les resultats d'une analyse de radio-immunoprécipitation "par impulsions de chasse" des protéines apparentées à LAV/HTLV III gag que l'on trouve dans des cellules infectées par l'AcNPV recombinant de l'invention. On a infecté des cellules de Spodoptera frugiperda (Sf9) avec Ac-gag1 et on les marquées par impulsions durant 5 minutes à 24 heures après l'infection. On a ensuite lavé les cellules avec un milieu complet et on les fait incuber avec du milieu complet durant 0 heure (pistes 1, 2), 2 heures (pistes 3, 4), 4 heures (pistes 5, 6) et 8 heures (pistes 7, 8). Aux moments indiqués, on a lavé les cellules, on les a lysées et immunoprécipitées avec du sérum groupé provenant de personnes séropositives pour LAV/HTLV III (pistes 2, 4, 6, 8) ou du sérum humain normal (pistes 1, 3, 5, 7).

Les protéines ont été résolues par électrophorèse sur gel de SDS-polyacrylamide.

La figure 20 représente schématiquement la construction de cinq plasmides, pv-gag1, pv-gag2, pv-gag3, pv-gag4 et pv-gag5 contenant le promoteur de virus de vaccine 7,5K fixé par ligature sur diverses longueurs du génome de LAV/ HTLV III contenant des séquences de codage de gag. Le vecteur de clonage pGS62 que l'on utilise dans ces constructions est identique à pGS20 (voir figure 3), sauf qu'il comporte un site unique EcoRI situé en aval du site unique SmaI de pGS20.

La figure 21 représente les résultats d'une analyse d'immunocoagulation de type Western (Ouest) des protéines exprimées dans des cellules infectées par des virus LAV/HTLV III de vaccine recombinants (v-gag1NY, v-gag2NY, v-gag3NY, v-gag4NY et v-gag5NY), le virus de vaccine de départ (v-NY) et des cellules "infectées" par des cellules non infectieuses ("MOCK"). Des échantillons de virions LAV/HTLV III purifiés ("LAV/HTLV III") ont été inclus comme témoins positifs. Des cellules BSC-40 confluentes ont été infectées à un indice de multiplicité d'infection de 10. On a laissé l'infection se poursuivre durant 12 heures, au bout desquelles on a récolté les cellules et on les a lysées. Les protéines cellulaires totales ont été résolues par électrophorèse sur gel de SDS-PAGE et immobilisées par électrotransfert sur de la nitrocellulose.

On a fait réagir les filtres avec (1) du sérum de patient atteint de SIDA (figure 21B) qui a été décelé à l'aide d'une immunoglobuline anti-humaine de chèvre conjuguée à de la phosphatase alcaline; (2) anticorps monoclonaux de souris qui définissent des protéines gag p25 et p18 (figures 21A et 21C), que l'on a ensuite décelées en utilisant de l'immunoglobuline anti-souris de chèvre conjuguée à de la phosphatase alcaline.

La figure 22 représente schématiquement la construction du plasmide pAc-env5 contenant la totalité de la séquence de codage d'enveloppe de LAV/HTLV III insérée en aval d'un promoteur de polyédrine AcNPV. Le vecteur de clonage pAc610 est décrit sur la figure 15 ci-dessus.

La figure 23 représente les résultats d'une analyse par radio-immunoprécipitation des protéines exprimées dans des cellules infectées par du baculovirus recombinant Ac-env5. Des cellules "infectées" par des virus non infectieux ("MOCK") et la souche de baculovirus de départ (AcNPV) sont incluses à titre de témoins. Les protéines exprimées par des cellules Sf9 infectées ont été marquées, 28 heures après l'infection, durant 2 heures par <3><5>S-méthionine. On a fait réagir les protéines marquées présentes dans les lysats de cellules avec du sérum de patient atteint de SIDA ou avec des anticorps monoclonaux de souris qui définissent gp110 ou gp41, et les immun-complexes ont été précipités à l'aide de la protéine A de Staphylococcus aureus. On a résolu, par électrophorèse sur gel de SDS-PAGE, et l'on a décéle par fluorographie les protéines immunoprécipitées.

On va maintenant présenter une description plus détaillée de l'invention.

L'invention a pour objet un virus recombinant selon la revendication 1.

La présente invention comprend aussi un procédé d'obtention de virus qui produisent les peptides et protéines apparentés à des épitopes de LAV/HTLV III. L'invention vise également des peptides et protéines apparentés à des épitopes de LAV/HTLV III, que l'on peut produire en utilisant des méthodes faisant appel à de l'ADN recombinant ou par synthèse chimique. Les virus ou peptides et protéines de la présente invention qui peuvent susciter une réponse de protection immunitaire peuvent servir d'immunogènes dans diverses formulations de vaccins, ce qui comprend des formulations de vaccins multilvalents, pour protéger contre une infection par LAV/HTLV III, qui est l'agent responsable de LAS (syndrome d'adénopathie) et du SIDA.

En variante, on peut utiliser comme antigènes les peptides ou protéines comprise dans l'invention, dans des essais ou dosages immunologiques diagnostiques pour la détection, chez un patient, d'anticorps spécifiques de LAV/HTLV III. Les peptides ou protéines que l'on utilise dans les essais ou dosages immunologiques compris dans l'invention doivent être antigéniques (c'est-à-dire capables de réagir avec des anticorps d'un patient concernant LAV/HTLV III), mais ils n'ont pas besoin d'être immunogènes (c'est-à-dire capables de susciter une réponse immunitaire). En outre, il n'est pas nécessaire que les antigènes utilisés dans l'essai ou dosage immunologique de diagnostic suscitent in vivo une réponse de protection immunitaire.

Selon une forme de mise en oevre comprise dans la présente invention, on utilise des techniques faisant appel à de l'ADN recombinant pour insérer des séquences de nucléotides codant des épitopes de LAV/HTLV III dans des vecteurs d'expression qui vont diriger l'expression de séquences de LAV/HTLV III dans des cellules d'hôtes appropriés. Ces systèmes vecteurs d'expression-cellules d'hôtes peuvent servir à produire in vitro des peptides et protéines apparentés à LAV/HTLV III et, dans ce cas, les gènes produits peuvent être purifiés à partir des cellules en culture. Les peptides ou protéines pouvant susciter une réponse de protection immunitaire et servir d'immunogène dans des formulations de vaccins à sous-unités.

En variante, on peut utiliser des peptides et protéines, immunogènes ou tout simplement antigéniques, de l'invention à titre d'antigènes dans des essais et dosages immunologiques conçus pour déceler des anticorps de patients spécifiques de LAV/HTLV III. Dans une autre approche pour la production des peptides et protéines de l'invention, les séquences des aminoacides de ces peptides et protéines peuvent être déduites des séquences des nucléotides de LAV/HTLV III contenues dans les recombinants qui expriment des peptides et protéines antigéniques et/ou immunogènes apparentés à LAV/HTLV III. Ces peptides et protéines peuvent ensuite faire l'objet de synthèses chimiques et servir dans des formulations de vaccins à sous unités synthétiques (s'ils sont immunogènes) ou à titre d'antigènes dans des essais ou dosages immunologiques pour diagnostics (s'ils sont antigéniques et/ou immunogènes).

Quand le vecteur d'expression est un virus qui dirige l'expression d'un immunogène relié à un épitope de LAV/HTLVIII capable de susciter une réponse de protection immunitaire, le virus lui-même peut être formulé à titre de vaccin. Des virus recombinants infectieux, qui ne déclenchent pas une maladie dans l'hôte, peuvent servir dans des préparations de vaccins à virus pour conférer une immunité importante. En variante, on peut préparer des vaccins contenant des virus inactivés, quand on utilise des virus "tués". En outre, on peut préparer des vaccins multivalents contenant des épitopes de LAV/HTLV III ainsi que ceux d'autres agents provoquant des maladies.

A seule fin de présenter une description claire, le procédé compris dans l'invention peut être divisé en les étapes suivantes: (a) isolement d'un gène, ou fragment de gène, codant des protéines de virus LAV/HTLV III; (b) insertion du gène, ou du fragment de gène, dans des vecteurs d'expression; (c) identification et croissance du vecteur d'expression recombinant dans un système hôte qui est capable d'assurer la réplication et l'expression du gène; (d) identification et purification du produit obtenu à l'aide du gène; (e) détermination du pouvoir immunitaire du produit, et (f) formulation d'un vaccin.

Dans des formes spécifiques de mise en oeuvre comprise dans l'invention, on décrit la construction de virus de vaccine recombinants et de baculovirus contenant le gène d'enveloppe de LAV/HTLV III qui dirige l'expression de protéines immunologiquement liées aux protéines d'enveloppe de LAV/HTLV III dans des cellules en culture tissulaire infectées par les virus recombinants. Dans d'autres formes de réalisation comprises dans la présente invention, on décrit la construction de virus de vaccine recombinants et de baculovirus contenant le gène gag de LAV/HTLV III qui dirige l'expression de protéines immunologiquement apparentées aux protéines de structure de noyaux de LAV/HTLV III dans des cellules de culture de ces tissus infectées par les virus recombinants.

Cependant, les compositions et procédés que l'on décrit ici ne se limitent pas à la construction de virus recombinants exprimant des protéines apparentées à l'enveloppe ou à gag de LAV/HTLV III, et ils peuvent servir à construire des recombinants dans n'importe quel système de vecteurs d'expression pour la production de polypeptides apparentés à des antigènes de n'importe quel agent éthiliogique du SIDA.

Pour la clarté de l'exposé, la totalité du procédé sera étudiée en termes de gènes d'enveloppe et gag de LAV/HTLV III. La même technique, cependant, peut être appliquée de façon analogue pour construire des vecteurs d'expression recombinants et pour produire des polypeptides apparentés à n'importe laquelle des protéines de LAV/HTLV III ainsi que ceux de virus apparentés. De telles protéines comprennent, sans que ce soit limitatif, les produits des gènes de LAV/HTLV III, comme gag, pol et env et au moins quatre gènes supplémentaires appelés à ce jour: sor, tat, 3 min -orf et un gène diversement appelé art ou trs (voir Fisher et al, 1986, Science 233:655-659).

ISOLEMENT DE GENES, OU DE FRAGMENTS DE GENE, CODANT DES PROTEINES VIRALES LAV/HTLV III

L'isolement des gènes de LAV/HTLV III implique tout d'abord l'isolement de fragments de ADN contenant les séquences de gènes d'enveloppe. Comme précédemment expliqué, LAV/HTLV III possède un génome de ARN et, donc, on peut obtenir l'ADN correspondant qui code le gène LAV/HTLV III (a) en clonant par ADNc l'ARN isolé de virions purifiés de LAV/HTLV III, ou (b) en clonant par ADNc de l'ARN contenant du poly<SEP>A<SEP> que l'on obtient à partir de cellules infectées par LAV/HTLV III, ou (c) en clonant de l'ADN de génome purifié à partirde cellules infectées par LAV/HTLV III. Ci-après, on appellera l'ADN codant les gènes de LAV/HTLV III de "l'ADN de LAV/ HTLV III".

Afin d'engendrer des fragments de ADN de LAV/HTLVIII, on peut cliver l'ADN de LAV/HTLV III en des sites spécifiques, en utilisant diverses enzymes de restriction. En variante, on peut utiliser de l'ADN ase en présence de manganèse pour fragmenter l'ADN, ou bien l'on peut cisailler physiquement l'ADN, par exemple par traitement aux ultrasons. On peut ensuite séparer les fragments linéaires de ADN, selon leurs dimensions, par des techniques classiques, ce qui com prend, sans que ce soit limitatif, une électrophorèse sur gélose et gel de polyacrylamide et une chromatographie sur colonne.

On peut utiliser n'importe quelle enzyme de restriction ou n'importe quelle combinaison d'enzymes de restriction pour engendrer un ou des fragments de ADN de LAV/HTLV III contenant les séquences gag ou d'enveloppe, à la condition que les enzymes ne détruisent pas l'antigénicité du produit protéinique de gène. Par exemple, le site antigénique d'une protéine peut consister en environ 7 à environ 14 aminoacides. Ainsi, une protéine de la dimension du peptide précurseur d'enveloppe (environ 97 000 daltons) peut comporter de nombreux sites antigéniques séparés, peut-être des milliers en considérant les séquences en recouvrement, des considérations de structures secondaires et tertiaires et des possibilités de traitement comme l'acétylation, la glycosylation ou la phosphorylation.

Donc, de nombreuses séquences partielles de gènes polypeptidiques d'enveloppes risquent de coder pour un site antigénique. Par consequent, on peut utiliser de nombreuses combinaisons d'enzymes de restriction pour engendrer des fragments de ADN qui, quand ils sont insérés dans un vecteur approprié, sont capables de diriger la production de séquences d'aminoacides spécifiques d'enveloppe comprenant différents déterminants antigéniques.

Une fois les fragments d'ADN engendrés, on peut réaliser d'un certain nombre de façons une identification du fragment spécifique d'ADN contenant le gène d'enveloppe LAV/HTLV III. En premier lieu, il est possible de séquencer lesfragments d'ADN correspondant à la totalité du génome de LAV/HTLV III, puis d'identifier les fragments contenant la séquence de gènes protéiniques d'enveloppe ou de gène gag en se fondant sur une comparaison de la séquence des aminoacides prédite et de la séquence des aminoacides de la protéine d'enveloppe ou des protéines de noyau gag. En second lieu, une fois déter- minée la totalité de la séquence de génome, on peut ordonner de 5 min à 3 min les grands cadres à lecture ouverte.

Comme l'organisation de genome de tous les rétrovirus examinés jusqu'à présent est 5 min -gag-pol-env-3 min , le grand cadre à lecture ouverte le plus voisin de l'extrémité 3 min risque très probablement de coder pour le gène d'enveloppe, alors que le grand cadre à lecture ouverte le plus voisin de l'extrémité 5' risque très probablement de coder pour le gène gag. En troisième lieu, on peut effectuer une identification probable d'un gène spécifique par reconnaissance de l'homologie avec d'autres gènes de rétrovirus connus, par des analyses d'hybridation d'acides nucléiques ou des comparaisons de séquences si les séquences sont connues.

En variante, le fragment contenant le gene protéinique d'enveloppe peut être identifié par sélection de ARNm. Dans ce mode opératoire, on utilise les fragments de ADN LAV/HTLV III pour isoler, par hybridation, les ARNm complémentaires. Une analyse par immunoprécipitation des produits de translation in vitro des ARNm isolés identifie l'ARNm et donc, les fragments d'ADN LAV/HTLV III complémentaire qui contiennent les séquences des protéines d'enveloppe. Enfin, on peut choisir des ARNm spécifiques de protéines d'enveloppe par adsorption de polysomes isolés à partir de cellules infectées par LAV/HTLV III sur des anticorps immobilisés dirigés contre les protéines d'enveloppe ou de gag. On peut synthétiser une ADN d'enveloppe radiomarquée, ADNC (ADN complémentaire) en utilisant comme gabarit l'ARNm choisi (provenant des polysomes adsorbés).

L'ARNm radiomarqué ou l'ADNc radiomarqué peuvent alors servir de sonde pour identifier les fragments de ADN de LAV/HTLV III contenant des séquences de gènes d'enveloppe ou de gag. Au lieu d'isoler le gène d'enveloppe ou de gag, on peut, sans que cette liste soit limitative, effectuer la synthèse chimique de la séquence de gène elle-même (à la condition que la séquence soit connue) ou transformer ADNc en ARNm qui code le gène d'enveloppe ou gag.

Une fois identifié et isolé, le fragment d'ADN de LAV/HTLV III contenant les séquences intéressantes peut être tout d'abord inséré dans un vecteur de clonage, tel un secteur de clonage de plasmide, qui sert à transformer des cel lules hôtes appropriées afin de provoquer la réplication de l'ADN de manière à engendrer de nombreuses copies des séquences intéressantes de LAV/HTLV III. On peut y parvenir en provoquant la ligation du fragment de ADN de LAV/HTLV III dans un vecteur de clonage comportant des terminaisons cohésives complémentaires. Cependant, si les sites de restriction complémentaires servant à fragmenter l'ADN de LAV/HTLV III ne sont pas présents dans le vecteur de clonage, les extrémités des molécules de ADN risquent d'être modifiées.

De telles modifications comprennant la production d'extrémités émoussées par digestion des terminaisons de ADN a simple brin ou par garnissage des terminaisons à simple brin de manière que les extrémités puissent subir une ligation d'extrémité émoussée. En variante, on peut produire n'importe quel site voulu en fixant par ligation des séquences de nucléotides (agents de liaison) sur les terminaisons d'ADN; ces agents de liaison ligaturés peuvent comprendre des oligonucléotides spécifiques, synthétisés par voie chimique, et codant des séquences de reconnaissance de sites de restriction. Selon d'autres procédés, on peut modifier, par terminaison homopolymère, le vecteur clivé et le fragment de ADN de LAV/HTLV III.

La transformation de cellules hôtes par des molécules de ADN recombinants qui incorporent le gène isolé, par ADNc ou une sequence de ADN obtenue par synthèse, permet d'engendrer de multiples copies du gène. Ainsi, le gène peut être obtenu en grandes quantités par la croissance de transformants, l'isolement des molécules de ADN recombinant à partir des transformants et, quand cela est nécessaire, la récupération du gène inséré,à partir de l'ADN recombinant isolé.

Si le but ultime consiste à insérer le gène dans des vecteurs d'expression de virus, comme le virus de la vaccine ou l'adénovirus, la molécule de ADN recombinant qui incorpore le gène LAV/HTLV III peut être modifiée de manière que le gène soit entouré par des séquences de virus permettant la recombinaison génétique dans des cellules infectées par le virus, de sorte que le gène puisse être insére dans legénome viral.

La totalité du génome de LAV/HTLV III a été clonée et séquencée par Wain-Hobson et col. (S. Wain-Hobson et col., 1985, Cell 40:9). Un clone, appelé lambda Jl9, a contenu un fragment de ADN de 9,2 kilopaires de bases d'une séquence de génome de LAV insérée dans le site Hind III de lambda L 47.1.

Un sous-clone particulièrement utile de lambda J19, contenant le gène d'enveloppe LAV/HTLV III, est pRS-3 qui consiste en un fragment, à 3840 paires de bases EcoRI vers SstI, de la séquence de nucléotides de LAV/HTLV III insérée dans le site EcoRI et SstI de pUC18. L'ADN spécifique de LAV/HTLV III contenu dans pRS-3 se situe entre le site EcoRI placé au nucléotide 5289 et le site SstI placé au nucléotide 9129 sur le génome de LAV/HTLV III (S. Wain-Hobson et col., 1985, Cell 40:9); voir la figure 2 qui montre la séquence de nucléotides de LAV/HTLV III contenue dans pRS-3. Cependant, en raison de la dégénérescence des séquences codant pour les nucléotides, on peut utiliser dans la pratique de la présente invention, pour le clonage du gène d'enveloppe de LAV/HTLV III, d'autres séquences de ADN qui codent pratiquement la même séquence des aminoacides que celle présentée sur la figure 2.

Cela comprend, sans que cela soit limitatif, des séquences de nucléotides comprenant la totalité ou des parties de la séquence des nucléotides d'enveloppe représentées sur la figure 2, qui sont modifiées par remplacement de différents codons qui codent le même reste aminoacide ou un reste aminoacide fonctionnellement équivalent au sein de la séquence (par exemple un aminoacide de même polarité), en produisant un changement silencieux.

Des sous-clones particulièrement utiles de lambda J19 contenant le gène gag de LAV/HTLV III sont pKS-5 et pSS5. Le plasmide pKS5 consiste en un fragment de LAV/HTLV III comportant 3148 paires de base de SstI vers KpnI dans pUC18. L'ADN spécifique de LAV/HTLV III contenu dans pKS-5 va du site SstI situé sur le nucléotide 224 au site KpnI situé au nucléotide 3372 sur le génome LAV/HTLV III. Le plasmide pSS-5 consiste en un fragment de 5,1 kbp de SstI vers SalI de LAV/HTLV III dans pUC 18. L'ADN spécifique de LAV/HTLV III contenu dans pSS-5 provient du site SstI situé au nucléotide 224 jusqu'au site SalI situé au nucléotide 5331 sur le génome de LAV/HTLV III. (Wain-Hobson, S. et col., 1985, Cell 40:9), voir figure 14, qui décrit la séquence des nucléotides de LAV/HTLV III contenue dans pKS-5 et PSS-5.

Cependant, en raison de la dégénérescence des séquences de codage des nucléotides, on peut utiliser la pratique de la présente invention, pour le clonage du gène gag de LAV/HTLV III, d'autres séquences de ADN qui codent sensiblement la même séquence des aminoacides que celle représentée sur la figure 14. Cela comprend, sans que cela soit limitatif, des séquences de nucléotides comprenant la totalité ou des parties de la séquence des nucléotides gag représentée sur la figure 14, qui sont modifiés par substitution de codons différents qui codent le même reste aminoacide, ou un reste aminoacide fonctionnellement équivalent, dans la séquence (par exemple un amioacide de même polarité), en produisant ainsi un changement silencieux.

INSERTION DES SEQUENCES DE CODAGE DE PROTEINES DE LAV/HTLV III DANS DES VECTEURS D'EXPRESSION

On insère la séquence des nucléotides codant pour la protéine d'enveloppe de LAV/HTLV III, ou une partie de cette séquence, dans un vecteur d'expression approprié, c'est-à-dire un vecteur qui contient les éléments nécessaires pour la transcription et la translation de la séquence de codage de protéines insérées. On peut utiliser divers systèmes hôtes-vecteurs pour exprimer la séquence de codage des protéines. Cela comprend, sans que ce soit limitatif, des systèmes de cellules de mammifères infectées par des virus (par exemple le virus de la vaccine, de l'adénovirus, etc.); des systèmes de cellules d'insectes infectées par des virus (par exemple du baculovirus); des micro-organismes comme de la levure contenant des vecteurs ou bactéries de levure transformés par de l'ADN de bactériophage, de l'ADN de plasmide ou de l'ADN de cosmide.

Les éléments d'expression de ces vecteurs varient en force et spécificité. Selon le système hôte-vecteur que l'on utilise, on peut utiliser n'importe lequel d'un certain nombre d'éléments convenables de transcription et de translation. Par exemple, quand on effectue un clonage dans des systèmes de cellules de mammifères, on peut utiliser des promoteurs isolés à partir du génome des cellules de mammifères (par exemple un promoteur de type métallothioniène de souris) ou isolés à partir de virus dont la croissance s'effectue dans ces cellules (par exemple le promoteur 7,5K de virus de vaccine). On peut aussi utiliser des promoteurs produits par de l'ADN recombinant ou par des techniques synthétiques, pour assurer la transcription des séquences insérées.

Il faut aussi des signaux spécifiques d'amorçage pour une translation efficace des séquences insérées de codage de protéines. Ces signaux comprennent le codon d'amorçage ATG et les séquences adjacentes. Quand on insère dans les vecteurs d'expression appropriés la totalité du gène d'enveloppe ou gag de de LAV/HTLV III, y compris son propre codon d'amorçage et les séquences adjacentes, des signaux témoins supplémentaires pour la translation peuvent ne pas être nécessaires. Cependant, quand on insère une partie seulement de la séquence de codage d'enveloppe, ou gag, il faut fournir des signaux exogènes de commande de translation, ce qui comprend le codon d'amorçage ou initiation de traduction ATG.

Le codon d'amorçage ou initiation doit en outre être en phase avec le cadre de lecture des séquences de codage de protéines d'enveloppe pour garantir la translation de la totalité de la séquence insérée. Ces signaux exogènes de commande de translation et ces codons d'iniation ou amorçage de traduction peuvent avoir diverses origines, aussi bien naturelles que synthétiques.

On peut utiliser n'importe laquelle des méthodes antérieurement décrites pour l'insertion de fragments de ADN dans un vecteur pour construire des vecteurs d'expression contenant un gène chimère consistant en des signaux appropriés de commande de transcription/translation et les séquences de codage de protéines. Ces procédés peuvent comprendre des techniques utilisant de l'ADN recombinant "in vitro" et des techniques synthétiques et une recombinaison "in vivo" (recombinaison génétique).

Dans les formes particulières de réalisation décrites en détail dans les exemples de la présente invention, le virus de la vaccine et le baculovirus ont été choisis comme vecteurs d'expression. Cependant, l'invention ne se limite pas à l'utilisation du virus de la vaccine ou du baculovirus. Comme précédemment expliqué, les vecteurs d'expression utilisables comprennent, sans qu'on doive se limiter aux vecteurs suivants ou à leurs dérivés: des virus infectant les êtres humains ou les animaux comme le virus de la vaccine ou les adénovirus; les virus infectant les insectes comme des baculovirus; des vecteurs de type levure; des vecteurs de type bactériophage, et des vecteurs de type ADN de plasmide et de cosmide, pour n'en citer que quelques-uns.

Quand on utilise un adénovirus comme vecteur d'expression, le gène de LAV/HTLV III est fixé par ligation sur un complexe de commande de transcription/translation d'adénovirus, par exemple la dernière séquence de promoteur et les séquences tripartites de tête. Ce gène chimère est ensuite inséré dans le génome de l'adénovirus par recombinaison "in vitro" ou "in vivo". L'insertion dans une région non essentielle du génome de virus (par exemple la région E1 ou E3) va donner un virus recombinant qui est viable et capable d'exprimer, dans les hôtes infectés, la protéine apparentée à LAV/HTLV III. Actuellement, il existe deux souches d'adénovirus (types 4 et 7) approuvées et utilisées comme vaccins pour le personnel militaire. Elles constituent les premiers candidats à utiliser comme vecteurs pour exprimer des gènes de LAV/HTLV III.

En outre, on peut choisir une souche de cellules hôtes qui module l'expression des séquences insérées, ou modifie et traite le gène chimique produit de la façon spécifique voulue. On peut augmenter l'expression de certains promoteurs en présence de certains inducteurs (par exemple les ions zinc et cadmium pour des promoteurs de métallothionéine). Donc, on peut régler l'expression de la protéine de LAV/HTLV III obtenue par génie génétique. Cela est important si le produit protéinique du gène étranger cloné est mortel pour les cellules hôtes. En outre, des modifications (par exemple une glycosylation) et un traitement (par exemple un clivage) des produits protéiniques sont importants pour le fonctionnement de la protéine. Des cellules hôtes différentes ont des mécanismes caractéristiques et spécifiques de traitement posttranslation et de modification des protéines.

On peut choisir des lignées de cellules appropriées ou des systèmes d'hôtes appropriés pour garantir la modification et le traitement corrects de la protéine étrangère exprimée.

Dans deux formes particulières de réalisation décrites en détail dans les exemples compris dans la présente invention, on a fait la ligation des séquences codant l'enveloppe de LAV/HTLV III chimères, aussi bien dans leur forme complète que dans leurs portions, ou des séquences de codage gag de LAV/HTLV III sur le promoteur à 7,5K du virus de vaccine pour former des gènes chimères dans divers plasmides. On a entouré les gènes chimères de ces plasmides par des séquences supplémentaires du virus de la vaccine, homologues du gène TK de virus de la vaccine. La construction du gène chimère a impliqué l'utilisation de nucléotides, aussi bien naturels que synthétiques, codant des signaux de commande pour la transcription et la translation des séquences d'enveloppe de LAV/HTLV III ou les séquences gag de LAV/HTLV III.

On a ensuite introduit ces gènes chimères dans les vecteurs d'expression de virus de vaccine par recombinaison "in vivo" entre la région TK homologue présente sur le vecteur de plasmide et le génome de virus de vaccine. On a utilisé ces virus recombinants, contenant le gène chimère, comme vecteurs d'expression pour produire des protéines apparentées à l'enveloppe de LAV/HTLV III ou produire des protéines apparentées à gag de LAV/HTLV III.

Dans d'autres modes particuliers de réalisation détaillés dans les exemples compris dans la présente invention, on a effectué la ligation des séquences de codage d'enveloppe de LAV/HTLV III ou des séquences de codage de gag de LAV/HTLV III sur le promoteur de polyédrine du virus de polyédrose nucléaire Autoqrapha Californica (AcNPV) pour former des gènes chimères dans divers plasmides. Les gènes chimères dans ces plasmides ont été entourés par des séquences additionnelles de AcNPV. La construction des gènes chimères a impliqué l'utilisation de signaux de commande de codage des nucléotides naturels pour la transcription et la translation des séquences de gag ou enveloppe de LAV/HTLV III. On a ensuite introduit les gènes chimères dans les vecteurs d'expression de AcNPV, par recombinaison in vivo entre les ADN homologues présents sur le vecteur plasmide et le génome de AcNPV.

On a utilisé ces virus recombinants, contenant les gènes chimères, comme vecteurs d'expression pour produire des protéines apparentées à l'enveloppe de LAV/HTLV III ou des protéines apparentées à gag de LAV/HTLV III.

IDENTIFICATION DE VECTEURS D'EXPRESSION RECOMBINANTS CAPABLES DE REPLICATION ET D'EXPRESSION DU GENE INSERE

On peut identifier par trois approches générales les vecteurs d'expression contenant des séquences insérées de gènes étrangers: (a) hybridation ADN-ADN; (b) présence ou absence de fonctions de gène "marqueur", et (c) expression de séquences insérées. Dans la première approche, on peut déceler la présence d'un gène étranger, inséré dans un vecteur d'expression par hybridation ADN-ADN, en utilisant des sondes comprenant des séquences qui sont homologues du gène étranger inséré. Dans la seconde approche, on peut identifier et choisir le système vecteur recombinant/hôte en se fondant sur la présence ou l'absence de certaines fonctions de gènes "marqueurs" (par exemple de l'activité de thymidine kinase, la résistance à des antibiotiques, un phénotype de transformation, la formation d'un corps à occlusion dans du baculovirus) dûs à l'insertion des gènes étrangers dans le vecteur.

Par exemple, si l'on insère le gène LAV/HTLV III au sein de la séquence des gènes marqueurs du vecteur, on peut identifier les recombinants, contenant la séquence insérée de LAV/ HTLV III, par l'absence de la fonction de gène marqueur. Dans la troisième approche, on peut identifier des vecteurs d'expression recombinants en recherchant et/ou dosant le produit du gène étranger exprimé par le recombinant. De telles recherches ou dosages peuvent se fonder sur les propriétés physiques, immunologiques ou fonctionnelles du produit du gène.

Une fois une molécule particulière de ADN recombinant identifiée et isolée, on peut utiliser plusieurs procédés pour en provoquer la propagation, selon qu'un tel recombinant constitue ou non une unité à autoréplication (un réplicon). Une unité à autoréplication, par exemple des plasmides, des virus, des cellules, etc., peut se multiplier dans l'environnement cellulaire approprié et dans des conditions appropriées de croissance. Des recombinants manquant d'une unité d'autoréplication devront être intégrés à une molécule comportant une telle unité pour que la propagation puisse avoir lieu. Par exemple, certains vecteurs d'expression de plasmide doivent, lors de leur introduction dans une cellule hôte, être intégrés au chromosome cellulaire pour garantir la propagation et une expression stable du gène recombinant.

Une fois établis un système d'hôtes convenables et des conditions convenables de croissance, on peut provoquer la propagation des vecteurs d'expression recombinants et les préparer en quantité.

Dans des formes particulières de mise en oeuvre comprises dans l'invention décrites en détail dans les exemples, on a inséré des gènes chimères contenant la séquence codant l'enveloppe ou gag de LAV/HTLV III dans le gène TK du génome de virus de la vaccine, en transformant ainsi le virus en TK<->, c'est-à-dire en détruisant l'aptitude du virus à fabriquer de la thymidine kinase. On a choisi de tels recombinants d'après leur aptitude à croître dans des milieux contenant de la 5-bromo-désoxy-uridine, qui est un nucléoside analogue à celui mortel pour les cellules TK<+> mais non pas pour les cellules TK<->. On a en outre identifié des recombinants par hybridation ADN-ADN, en utilisant des sondes spécifiques de l'enveloppe de LAV/HTLV III ou des sondes spécifiques de gag de LAV/HTLV III.

On a isolé le virus recombinant TK<-> par purification sur plaque et l'on a préparé des stocks de réserve à partir de cellules de cultures tissulaires infectées.

Dans d'autres formes particulières de mise en oeuvre comprises dans l'invention, décrites en détail dans les exemples, on a inséré des gènes chimères contenant la séquence de codage enveloppe ou gag de LAV/HTLV III dans le gène de polyhédrine du génome de AcNPV, en transformant ainsi le virus en un phénotype de non-occlusion. On a choisi visuellement de tels recombinants d'après leur absence de particules de virus occlus. On a encore identifié les recombinants par analyse de coagulation de type Northern (Nord) en utilisant des sondes spécifiques d'enveloppe de LAV/HTLV III ou des sondes spécifiques de type gag de LAV/HTLV III. On a isolé les virus recombinants par purification de plaques et l'on a préparé des stocks de réserve à partir de cellules de cultures tissulaires infectées.

IDENTIFICATION ET PURIFICATION DU PRODUIT DU GENE EXPRIME

Une fois identifié un recombinant qui exprime le gène LAV/HTLV III, il convient d'analyser le produit du gène. On peut y parvenir par des analyses et dosages se fondant sur les propriétés physiques, immunologiques ou fonctionnelles du produit. Une analyse immunologique est particulièrement importante lorsque le but final consiste à utiliser les produits de gènes ou virus recombinants qui expriment de tels produits dans des formulations de vaccins et/ou à titre d'antigènes dans des dosages immunologiques pour diagnostics.

Divers antisérums sont disponibles pour analyser l'immunoréactivité du produit, ce qui comprend, sans que ce soit limitatif, du sérum provenant de patients atteints de LAS (syndrome d'adénopathie) ou de SIDA et des anti-sérums polyvalents dirigés contre le virus LAV/HTLV, la protéine d'enveloppe virale ou des protéines de noyau codées par le gène gag. Les molécules immunogènes comprennent des analogues produits dans des systèmes bactériens, ou des peptides synthétiques contenant des déterminants antigéniques de l'enve loppe de LAV/HTLV III ou des antigènes de noyau LAV/HTLV III. L'identification des peptides et protéines décrits dans la présente invention se fonde sur deux exigences. En premier lieu, la protéine apparentée à l'enveloppe de LAV/HTLV III doit être produite seulement dans des cellules infectées par du virus recombinant.

En second lieu, la protéine apparentée LAV/HTLV III doit être capable d'une réaction immunologique avec le sérum de patients atteints de SIDA ou avec divers anticorps dirigés contre les protéines d'enveloppe ou de noyau de LAV/HTLV III ou leurs analogues et dérivés.

La protéine doit être immunoréactive, qu'elle résulte de l'expression de la totalité de la séquence entière de gènes, d'une partie de séquence de gènes ou de deux ou plusieurs séquences de gènes qui sont liées par ligation pour diriger la production de protéines de fusion. Cette réactivité peut être mise en évidence par des techniques immunologiques classiques, comme une radio-immunoprécipitation, une compétition radio-immunologique ou des immunocaillots.

Une fois identifiée la protéine apparentée à LAV/HTLV III, on peut isolér et purifier cette protéine par des méthodes classiques comprenant la chromatographie (par exemple la chromatographie par échange d'ions, par affinité et dans une colonne de classement par dimensions), par centrifugation, par différence de solubilité, ou par n'importe quelle autre technique classique pour la purification de protéines.

En variante, une fois identifiée une protéine immuno-réactive apparentée à LAV/HTLV III et produite par un recombinant, on peut déduire la séquence des aminoacides de la protéine immunoréactive d'après la séquence des nucléotides du gène chimère contenu dans le recombinant. Par suite, la protéine peut être synthétisée par des méthodes chimiques classiques connues en pratique (voir, par exemple, M. Hunkapiller et col., 1984, Nature 310:105-111).

Dans des formes particulières de réalisation comprises dans de la présente invention, de tels peptides, qu'ils soient produits par des techniques utilisant de l'ADN recombinant ou par des méthodes de synthèse chimique, comprennent, sans que cette liste soit limitative, la totalité ou une partie des séquences des aminoacides essentiellement comme représenté sur la figure 2 ou sur la figure 14, ce qui comprend des séquences altérées dans lesquelles des restes d'aminoacides fonctionnellement équivalents remplacent des restes au sein de la séquence, ce qui crée une variation silencieuse. Par exemple, un ou plusieurs restes d'aminoacides de la séquence peuvent être remplacés par un autre aminoacide de polarité semblable, qui joue le rôle d'un équivalent fonctionnel, en donnant une altération silencieuse.

On peut choisir, parmi d'autres membres de la classe à laquelle l'aminoacide appartient, des éléments pour remplacer un aminoacide au sein de la séquence. Par exemple, les aminoacides non polaires (hydrophobes) comprennent l'alanine, la leucine, l'isoleucine, la valine, la proline, la phénylalanine, le tryptophanne et la méthionine. Les aminoacides neutres polaires comprennent la glycine, la sérine, la thréonine, la cystéine, la tyrosine, l'asparagine et la glutamine. Les aminoacides (basiques) à charge positive comprennent l'arginine, la lysine et l'histidine. Les aminoacides (acides) à charge négative comprennent l'acide aspartique et l'acide glutamique.

DETERMINATION DU POUVOIR IMMUNITAIRE DU PRODUIT RECOMBINANT

On peut déterminer le pouvoir immunitaire du produit apparenté à LAV/HTLV III en surveillant la réponse immunologique d'animaux d'essai après immunisation par injection de la protéine purifiée ou du peptide ou protéine de synthèse purifiée. Quand la protéine apparentée à LAV/HTLV III est exprimée par un virus recombinant infectieux, on peut utiliser le virus recombinant lui-même pour immuniser les animaux d'essai. Les animaux d'essai peuvent comprendre des souris, des lapins, des chimpanzés, et l'on peut éventuellement aussi faire appel à des êtres humains. Des méthodes d'introduction de l'immunogène peuvent comprendre la voie intradermique, intramusculaire, intrapéritonéale, intraveineuse, sous-cutanée, intranasale ou n'importe quelle autre voie classique d'immunisation.

La réponse immunologique des sujets d'essai peut être analysée par trois approches: (a) la réactivité de l'immun sérum résultant à l'égard d'antigènes viraux authentiques de LAV/HTLV III, selon des dosages ou essais effectués par des techniques connues, par exemple le dosage par immunosorption avec enzyme liée (ELISA), les immunocoagulats, des radio-immunoprécipitations, etc. (b) l'aptitude de l'immunsérum à neutraliser "in vitro" l'infectivité de LAV/HTLV III (M. Robert-Guroff, 1985, Nature 316:72-74) (pour détection de l'anticorps anti-enveloppe), et (c) une protection contre l'infection par LAV/HTLV III et/ou une atténuation des symptômes infectieux chez des animaux immunisés (D.P. Francis, 1984, Lancet 2:1276-1277; D.C. Gujdusek, 1985, Lancet 1:55-56).

FORMULATION D'UN VACCIN

Il s'agit de formuler un vaccin dans lequel l'immunogène est apparenté à un épitope de LAV/HTLV III ou qui contient un virus recombinant qui exprime un tel immunogène qui protège contre les infections à virus de LAV/HTLV III pour la prévention de l'adénopathie (LAS) ou du SIDA. En outre, on peut préparer des formulations de vaccins multivalents qui contiennent plus d'un déterminant immunogène apparenté à LAV/HTLV III. De tels vaccins comprennent, mais n'y sont pas limités, ceux contenant des épitopes apparentés à l'enveloppe de LAV/HTLV III formulés isolément ou en combinaison avec d'autres épitopes de LAV/HTLV III, comme les épitopes apparentés à gag. De tels vaccins multivalents, contenant à la fois des épitopes codés enveloppe et codés gag, peuvent être importants pour la prévention du développement du SIDA.

Des personnes ne présentant pas de symptômes semblent fabriquer des anticorps anti-gag plus souvent que des patients malades, alors que les deux groupes de patients fabriquent des anticorps dirigés contre des déterminants d'enveloppe (Science 1986, 233:419). Des études ont également montré que des patients atteints de SIDA fabriquent, aux stades précoces sans symptômes, des anticorps contre les protéines d'enveloppe et de noyau (gag). Lorsque la maladie progresse et que des symptômes apparaissent, les anticorps anti-gag sont réduits, cependant que les anticorps anti-enveloppe demeurent (Science, 1986, 233-282).

Ainsi, l'inclusion d'épitopes apparentés à gag dans des formulations de vaccins, dont la production est décrite à titre d'un aspect spécifique de réalisation de la présente invention, peut être importante pour l'immunoprophylaxie ou l'immunothérapie dans le cas d'une maladie apparentée a LAV/HTLV III.

On peut formuler des vaccins multivalents de manière qu'ils contiennent les produits de gène de LAV/HTLV III et/ou des virus recombinants exprimant les produits de gènes chimères. On peut aussi les utiliser en combinaison avec d'autres immunogènes pour la prévention du syndrome d'adénopathie (LAS) ou du SIDA et d'autres maladies. Des exemples de diverses formulations sont présentés ci-après.

FORMULATIONS DE VACCINS A VIRUS

On peut formuler un vaccin à virus recombinant vivant ou un vaccin à virus recombinant inactivé. Le choix dépend de la nature du virus recombinant que l'on utilise pour exprimer les épitopes apparentées à LAV/HTLV III. Quand le virus recombinant est infectieux pour l'hôte à immuniser mais ne suscite pas de maladie, un vaccin vivant est préférable parce qu'une multiplication chez l'hôte conduit à une stimulation prolongée d'un genre et d'une amplitude semblables à ce qui se produit dans des infections subcliniques naturelles et, donc, cela confère une forte immunité de longue durée. Lors de son introduction dans un animal hôte, le virus recombinant infectieux peut exprimer les protéines apparentées à LAV/HTLV III à partir de son gène chimère et stimuler ainsi une réponse immunologique contre des antigènes de LAV/HTLV III.

Quand une telle réponse immunologique constitue une protection à l'encontre d'une attaque ultérieure par LAV/HTLV III, le virus recombinant vivant peut servir lui-même de vaccin préventif contre une infection par le virus du SIDA. La production d'un tel virus recombinant à utiliser dans ces formulations peut impliquer des systèmes aussi bien "in vitro" (par exemple des cellules de culture tissulaires) qu'"in vivo" (par exemple un animal hôte naturel comme une vache). On peut adapter des méthodes classiques pour la préparation et la formulation de vaccins contre la variole à la formulation d'un vaccin à virus recombinant (par exemple, voir Vaccinia Viruses and Factors for Vaccine Antigens, publié sous la direction de G.U. Quinnan chez Elsevier, 1985, pages 109-116).

On peut préparer des vaccins multivalents à virus vivants, à partir d'un seul ou d'un petit nombre de virus recombinants infectieux qui expriment plusieurs épitopes apparentés à LAV/HTLV III/HTLV. Le vaccin peut inclure aussi des virus qui expriment des épitopes d'organismes provoquant d'autres maladies, en plus des épitopes de LAV/HTLV III. Par exemple, on peut traiter par génie génétique un virus de vaccine (qui peut recevoir environ 35 kp de base de ADN étranger) de manière qu'il contienne des séquences de codage d'épitopes de LAV/HTLV III apparentés à l'enveloppe et à gag. Le virus peut aussi coder d'autres épitopes en plus de ceux concernant LAV/HTLV III. Un tel virus recombinant lui-même peut servir d'immunogène dans un vaccin multivalent.

En variante, on peut formuler, dans un vaccin multivalent, un mélange de virus de vaccine ou d'autres virus, capables chacun de diriger l'expression d'un gène différent codant pour différents épitopes de LAV/HTLV III et/ou d'autres organismes capables de provoquer une maladie.

Que le virus recombinant soit ou non infectieux pour l'hôte à immuniser, on peut préparer une formulation de vaccin inactivé. Les vaccins inactivés sont "morts" en ce sens que leur infectivité a été détruite, habituellement par traitement du formaldéhyde. En principe, l'infectivité du virus est détruite sans affecter les protéines de la capside ou d'enveloppe qui portent le caractère immunogène du virus. Afin de préparer des vaccins inactivés, il faut faire croître en culture de grandes quantités de virus recombinant pour fournir la quantité nécessaire d'antigènes apparentés. On peut utiliser un mélange de virus inactivés qui expriment différents épitopes pour formuler des vaccins "multivalents".

Dans certains cas, cela peut être préférable à des formulations de vaccins vivants, en raison de difficultés potentielles dues à une interférence mutuelle de virus vivants administrés ensemble. Dans l'un ou l'autre cas, il convient de formuler le virus recombinant inactivé, ou le mélange de tels virus, avec un adjuvant convenable afin d'amplifier la réponse immunologique à leurs antigènes. Des adjuvants convenables comprennent, sans que cette liste soit limitative, des gels minéraux, par exemple de l'hydroxyde d'aluminium; des substances tensioactives comme de la lysolécithine, des polyols "Pluronic"; des polyanions; des peptides; des émulsions dans de l'huile et des adjuvants potentiellement utiles pour les êtres humains, comme le BCG (bacille de Calmette Guerin) et corynebacterium parvum.

On peut utiliser de nombreuses méthodes pour introduire les formulations de vaccins décrites ci-dessus; elles comprennent, sans que ce soit limitatif, les voies intradermique, intramusculaire, intrapéritonéale, intraveineuse, souscutanée et intranasale. Quand on utilise une formulation de vaccins à virus recombinants vivants, ce vaccin peut être introduit par la voie naturelle d'infection du virus de type sauvage apparenté que l'on a utilisé pour obtenir le virus recombinant dans la formulation du vaccin.

FORMULATION DE VACCINS A SOUS-UNITES

Au lieu de vaccins à base de virus, on peut utiliser la protéine apparentée à LAV/HTLV III elle-même comme immunogène dans des formulations de vaccins à sous-unités qui peuvent être multivalents. Comme précédemment expliqué, des vaccins à sous-unités comprennent seulement le matériel immunogène en cause, nécessaire pour immuniser un hôte. Donc, la ou les protéines apparentées LAV/HTLV III peut ou peuvent être purifiées à partir de recombinants qui expriment les épitopes de LAV/HTLV III.

De tels recombinants comprennent n'importe lesquelles des cellules cultivées infectées par le virus, des transformants bactériens, des transformants de levure ou des insectes infectés par des virus qui expriment les épitopes de LAV/HTLV III (on peut se reporter à ce qui a été dit ci-dessus à propos de l'insertion des séquences de codage de protéines, de l'identification des vecteurs recombinants d'expression, et à propos de l'identification et de la purification du produit de gène exprimé). Dans une autre forme de mise en oeuvre de la présente invention, les peptides ou protéines apparentés à LAV/HTLV III peuvent être obtenus par synthèse chimique.

Pour cela, on peut déduire la séquence des aminoacides d'un tel peptide ou d'une telle protéine à partir de la séquence des nucléotides du gène chimère qui en dirige l'expression (voir, par exemple, ce qui a été indiqué ci-dessus à propos de l'identification et de la purification du produit de gène exprimé).

Que les immunogènes soient purifiés à partir de recombinants ou obtenus par synthèse chimique, le produit final peut être ajusté à une concentration appropriée et formulé avec n'importe quel adjuvant convenable pour vaccin, puis emballé en vue de son utilisation. Des adjuvants convenables comprennent, sans que cette liste soit limitative, des gels minéraux, par exemple l'hydroxyde d'aluminium, les substances tensioactives comme la lysolécithine, des polyols "Pluronic"; des polyanions; des peptides; des émulsions dans de l'huile et des adjuvants potentiellement utiles pour les êtres humains, comme le BCG (Bacille de Calmette Guerin) et corynebactérium parvum. L'immunogène peut également être incorporé à des liposomes, ou conjugué à des polysaccharides et/ou à d'autres polymères pour servir dans une formulation de vaccin.

Quand le peptide ou la protéine apparenté à LAV/HTLV III est un haptène, c'est-à-dire une molécule qui est antigénique du fait qu'elle peut réagir sélectivement avec des anticorps reconnus, mais qui n'est pas antigénique du fait qu'elle ne peut déclencher une réponse immunitaire, l'haptène peut être lié par covalence à un support ou une molécule immunogène; par exemple, une grosse protéine comme dede HIND-3 introduit, dans Pv-env5 et du site de EcoRI empli dans le plasmide P26 a créé un codon d'arrêt en phase avec la séquence de codage pour l'enveloppe. Cette construction intermédiaire a été appelée Pv-env5/26.

On a utilisé l'ADN du plasmide pv-env5/26 pour transformer E.coli MC1000, l'amplifier et le purifier. On a ensuite soumis à digestion par BamHI et HpAI, et l'on a résolu sur un gel le gélose à 1% les fragments résultant. On a isolé le fragment de 2,1 kilopaires de base contenant la séquence de codage d'enveloppe de LAV/HTLV, et on l'a ensuite soumise à fixation par ligation sur du plasmide pGS 20 soumis au préalable à digestion avec BamHI et SmAI. Le plasmide Pv-env 7 résultant contient le promoteur de virus de vaccine à 7,5 K fixé par ligation sur une séquence spécifique de LAV/HTLV III à partir des 96 paires de bases en amont du codon d'amorçage d'enveloppe par rapport au site HIND 3 au numéro de nucléotide 6798 (figure 5).

Ce plasmide ne comporte donc pas la séquence présumée d'ancrage du gène d'enveloppe de LAV/HTLV III.

CONSTRUCTION ET CARACTERISATION DU VIRUS DE VACCINE RECOMBINANT CONTENANT LE GENE CHIMERE D'ENVELOPPE LAV/HTLV III

On a utilisé deux souches de départ de virus de vaccine pour la construction des virus recombinants: WR, la souche témoin de recherche, et v-NY, un dérivé de la souche provenant du "New-York City Board of Health" (Service de la Santé Publique de la Ville de New-York).

L'insertion des séquences de gènes chimères correspondant à l'enveloppe de LAV/HTLV III dans le génome du virus de la vaccine est obtenue par recombinaison "in vivo", rendue possible par le fait que les gènes chimériques sont entourés dans les plasmides pv-env2, pv-env5 et pv-env7 par des séquences du virus de la vaccine codant pour le gène de thymidine kinase (TK). L'introduction de ces plasmides dans des cellules infectées par le virus de la vaccine a permis une recombinaison entre la séquence TK du plasmide et la séquence homologue du génome de virus de la vaccine. L'insertion du gène chimère se produit par suite d'une double recombinaison dans les séquences d'entourage latéral. De tels recombinants comporteront le gène chimère inséré dans le gène TK de la vaccine et, donc, leur phénotype correspondra à TK<->.

On peut choisir ces recombinants TK<-> pour les faire croître dans un milieu auquel on a ajouté BUdR, qui est mortel pour les cellules TK<+> mais non pas pour les cellules TK<->. Le principe général de ce mode opératoire a été décrit (M. Mackett, G.L. Smith et B. Moss, 1984, J. Virol. 49, 857-864).

CONSTRUCTION DU VIRUS DE VACCINE RECOMBINANT CONTENANT LE GENE CHIMERE CORRESPONDANT A L'ENVELOPPE DE LAV/HTLV III

On a infecté une boîte de 100 mm de diamètre comportant 80% de cellules confluentes de rein de singe vert d'Afrique (souche BSC-40) avec du virus de la vaccine (souche WR) à une multiplicité d'infections de 0,05. Après 2 à 4 heures d'incubation à 37 DEG C, on a recouvert les cellules infectées par des coprécipités, à l'aide de phosphate de calcium, de l'ADN de plasmide pv-env2 ou pv-env5. On a préparé les précipités en ajoutant goutte à goutte 0,5 ml d'une solution de 2XADN-CaCl2 à 0,5 ml de solution 2XHeBS (la solution de 2XADN-CaCl2 contient 20 mu g de ADN de plasmide dans 0,5 ml de CaCl2 0,25M; 2XHeBS contient, par ml, 16 mg de NaCl, 0,74 mg de KCl, 0,25 mg de Na2HPO4 2H2O, 2 mg de dextrose, et 10 mg de HEPES, à un pH de 7,08). On a laissé se former à la température ambiante durant 30 minutes les coprécipités obtenus à l'aide de ADN-phosphate de calcium.

Quatre heures après les avoir recouvertes de précipité, on a lavé les cellules une fois avec 1XHeBs, on a fait incuber à 37 DEG C durant 3 minutes en présence de 2 ml de glycérol à 15% dans 1XHeBs, puis on a lavé une fois encore avec 10 ml de milieu de croissance (MEMD + 10% de sérum de foetus de veau + 100 unités/ml de pénicilline et 100 unités/ml de streptomycine). Deux jours plus tard, on a récolté les cellules infectées et on les a collectées par centrifugation (4 DEG C, 10 minutes à 2000 x g). On a préparé des stocks de virus en mettant ces cellules à nouveau en suspension dans 1 ml d'une solution saline tamponnée par des phosphates et additionnée de sérum albumine de bovin, puis l'on a effectué deux cycles de congélation et décongélation et trois traitements durant 15 secondes par des ultrasons.

On a choisi des recombinants en plaçant 0,1 ml de dilution à 10<-><3> des stocks de virus provenant des opérations ci-dessus sur des plaques circulaires dans des boîtes de 60 mm de cellules humaines confluentes 143 TK<->, surmontées de 5 ml/boîte de gélose Nobel à 1% (Difco, Détroit, Michigan) avec 5% de serum de veau, 25 mu g/ml de BUdR dans MEMD. Deux jours plus tard, on a coloré les cellules en plaçant 2 ml/boîte de milieu de gélose contenant les mêmes ingrédients que ci-dessus, plus 0,01% de rouge neutre.

On a prélevé les plaques individuelles un jour après coloration, on les a mises à nouveau en suspension dans 0,5 ml d'une solution saline physiologique tamponnée par des phosphates et additionnée de sérum albumine de bovin (PBSAM), et l'on a utilisé des parties aliquotes (0,25 ml) des suspensions de virus pour infecter des cellules confluentes 143 TK<-> placées dans des creux de 16 mm de diamètre sous un milieu sélectif (MEMD + 10% de sérum de foetus de veau + 100 unités/ml de streptomycine + 100 unités/ml de pénicilline + 25 mu g/ml de BUdR). On a collecté par centrifugation les cellules infectées et on les a remises en suspension dans 100 mu l de solution saline physiologique tamponnée par des phosphates (PBS) contenant 0,5 mg/ml de trypsine et 0,2 mg/ml de EDTA (acide éthylène diamine tétra acétique).

On a lysé les cellules par incubation à 37 DEG C durant 30 minutes, ce qui a éte suivi de 3 cycles de 20 secondes chacun de traitement aux ultrasons. On a collecté sur des filtres de nitrocellulose les lysats de cellules, en utilisant un manifold ou collecteur de filtration à plusieurs creux (Schleicher et Schuell, Arlington, MA). On a déterminé par hybridation ADN-ADN, comme décrit (M. Mackett, G.L. Smith et B. Moss, 1982; Proc. Nat'l. Acad. Sci. 79, 7415-7419), la présence des séquences de ADN spécifiques de l'enveloppe de LAV/HTLV III dans ces échantillons. On a utilisé comme sonde d'hybridation de l'ADN de plasmide pRS-3 marqué par <3><2>p, préparé par translation appropriée.

On a encore purifié deux fois sur plaque des recombinants qui avaient donné une hybridation positive pour cette sonde, sur des cellules 143 TK<-> dans des conditions sélectives (milieu contenant BUdR) et une fois sur des cellules BSC-40 dans des conditions non sélectives. Après confirmation finale par hybridation ADN-ADN, on a préparé des stocks de virus à partir des plaques trois fois purifiées sur des cellules de BSC-40 et on les a utilisés pour la caractérisation subséquente.

Une représentation schématique de la construction des virus recombinants est montrée sur la figure 6, sur laquelle la séquence de gène correspondant à l'enveloppe de LAV/HTLV III (env) située en aval du promoteur de vaccine 7,5 K (p->) est entourée au sein du génome de la vaccine par des séquences de ADN TK. Les stocks de virus provenant de la recombinaison entre le génome de virus de la vaccine et le plasmide pv-env5 ont été appelés v-env5, et ils contiennent la totalité du gène de l'enveloppe de LAV/HTLV III. Dans la forme particulière de mise en oeuvre décrite dans les exemples ici, v-env5 contient la totalité du gène d'enveloppe aussi bien que 96 paires de bases des séquences non translatées proches de 5 min et 223 paires de bases des séquences non translatées proches de 3 min .

Les stocks de virus provenant de pv-env2 ont été appelés v-env2 et ils contiennent la plupart du gène de l'enveloppe de LAV/HTLV III (c'est-à-dire le fragment KpnI), mais ils ne comportent pas la partie de la séquence codant pour les 42 premiers aminoacides de la protéine de l'enveloppe de LAV/HTLV III. Puisque la séquence de signal supposée de la protéine d'enveloppe de LAV/HTLV III est située au sein des 49 premiers aminoacides de la protéine, v-env2 devrait produire une protéine ne comportant pas la séquence de signal; donc, on devrait s'attendre à ce que la protéine apparentée à LAV/HTLV III produite par ce virus recombinant ne soit pas transportée vers la membrane. Au contraire, v-env5, qui contient la totalité de la séquence d'enveloppe de LAV/HTLV III doit produire une protéine qui est transportée vers la membrane.

Des stocks des virus provenant de pv-env7 sont appelés v-env7 et ils contiennent la terminaison azotée complète du gène correspondant à l'enveloppe de LAV/HTLV III, mais ne comportent pas la séquence en aval du site HIND III. Puisque la séquence présumée transmembrane (ancrage) est manquante dans cette construction, on pourrait s'attendre à ce que la protéine apparentée à LAV/HTLV III, produite par ce recombinant, soit secrétée dans le milieu de croissance. Cette propriété est avantageuse pour la purification de cette protéine en vue de son utilisation comme réactif diagnostique ou pour sa formulation comme vaccin à sous-unités.

FORMATION DE FRAGMENTS DE RESTRICTION DE RECOMBINANTS VACCINE-ENVELOPPE DE LAV/HTLV III

On a isolé, comme précédemment décrit (Esposito et al, 1981, J. Virol. Methods 2.2. 1975-180) l'ADN de souche de virus de vaccines de départ WR et v-NY, ainsi que leurs dérivés v-env5 et v-env5NY, respectivement. On les a soumis à digestion par l'enzyme de restriction HIND III et les fragments résultants ont été résolus sur un gel à 0,7% de gélose. l'ADN provenant de la souche de départ WR a présenté le modèle typique de fragment de restriction (figure 2A) comme précédement décrit (De Filippes, 1982, J. Virol. 43:136-149). Le modèle de fragment de restriction pour v-NY a été semblable, mais distinct de celui obtenu avec WR. Les différences les plus évidentes se sont situées dans la longueur des fragments b et c obtenus avec HIND III (fragments HIND III b et c), qui sont des fragments terminaux du génome du virus de la vaccine.

Les recombinants v-env5 et v-env5NY ne comportent pas de fragments HIND III J de leurs souches de départ ou parentales. On a observé à la place deux nouveaux fragments, ayant pour taille 5,4 Kbp (kilopaires de bases) et 3,2 Kbp. Cette observation concorde avec le résultat de la double recombinaison qui a inséré la séquence codant l'enveloppe de LAV/HTLV III dans le gène TK de vaccine, qui est situé sur le fragment HIND III J. Deux fragments ont été engendrés par l'insertion, en raison de la présence d'un site HIND III dans la séquence LAV/HTLV III. Ce résultat confirme aussi l'orientation du fragment inséré LAV/HTLV III par rapport au gène TK de virus de la vaccine.

ANALYSE PAR COAGULATION TYPE "SOUTHERN" (Sud) DE RECOMBINANTS VACCINE-ENVELOPPE LAV/HTLV III

L'identité de deux nouveaux fragments HIND III dans les produits de digestion de restriction de génomes viraux recombinants a été confirmée par analyse de coagulation de type Southern. Des fragments de ADN, résolus sur un gel de gélose comme celui présenté sur la figure 7A, ont été trans férés sur des filtres en nitrocellulose, et ont été hybridés sur une sonde obtenue par translation spécifique des séquences d'enveloppe de LAV/HTLV III. Comme représenté sur la figure 7B, l'hybridation a été décelée seulement dans les fragments de 5,4 et de 3,2 Kbp. Ce résultat confirme la structure du génome du virus recombinant telle que representée sur la figure 6.

EXPRESSION DES PROTEINES APPARENTEES A L'ENVELOPPE DE LAV/HTLV III DANS DES CELLULES DE CULTURE TISSULAIRE INFECTEES PAR DES VIRUS DE LA VACCINE RECOMBINANTS

On a montré que les virus de vaccine recombinants, portant les gènes chimères d'enveloppe de LAV/HTLV III, sont capables d'exprimer les protéines apparentées à l'enveloppe de LAV/HTLV III lors d'une infection de cellules dans une culture tissulaire. On a également trouvé que ces protéines sont immunoréactives avec du sérum provenant de patients atteints de SIDA.

IDENTIFICATION, A L'AIDE DE TECHNIQUES D'IMMUNOCOAGULATION, DE PROTEINES APPARENTEES A L'ENVELOPPE DE LAV/HTLV III, EXPRIMEES DANS DES CELLULES INFECTEES PAR DU VIRUS DE VACCINE RECOMBINANT

On a infecté une plaque de boîte circulaire de 100 mm de cellules confluentes BSC40, à un taux ou multiplicité d'infection de 10, par du virus de vaccine de type sauvage ou avec ses dérivés recombinants, v-env5 ou v-env2. On a laissé l'infection se poursuivre durant 12 heures, au bout desquelles on a récolté des cellules, on les a lavées une fois avec une solution saline physiologique tamponnée par des phosphates (PBS) et collectées par centrifugation. Les culots de cellules infectées ont été remis en suspension dans 1 ml de tampon d'échantillon de Laemmli (Laemmli, U.K. 1970, Nature 227:680) et on effectué une lyse par 4 minutes d'ébullition. On a résolu par électrophorèse, sur un gel de SDS-polyacrylamide à un gradient de 7 à 15%, la protéine cellulaire totale dans une partie aliquote (75 mu l) de lysat de cellules.

On a inclus comme témoin un échantillon de virion de LAV purifié et une partie aliquote de lysat de cellules "infectées" par un virus non pathogène (c'est-à-dire non infectées). On a fait passer par électrotransfert le contenu du gel sur une feuille de filtre nitrocellulosique. On a fait incuber le filtre tout d'abord dans 5 ml de PBS (solution saline physiologique tamponnée par des phosphates) plus 5% de poudre de lait dégraissé, durant 20 minutes à la température ambiante puis durant 2 heures à la température ambiante dans PBS + 5% de poudre de lait dégraissé + du sérum humain provenant de patients atteints de SIDA (dilution à 1:100 du sérum inactivé par chauffage). On a ensuite lavé le filtre cinq fois avec PBS + 0,05% de "Tween 20" (monolaurate de polyoxyéthylène sorbitane) et une fois avec PBS seul.

On a fait incuber durant 2 heures à la température ambiante le filtrat ainsi lavé avec 5 ml de PBS contenant 1% de sérum normal de chèvre (inactivé par chauffage) plus une dilution à 1/3000 de conjugué IgG (immunoglobuline G) anti-humaine de chèvre/peroxydase de raifort. On a lavé à nouveau le même filtre 5 fois avec PBS + 0,05% de "Tween 20", et une fois avec TBS (NaCl 0,5 M + 20 mM de Tris-HCl, pH 7,5). On a décelé le conjugué de peroxydase de raifort fixé sur le filtre en faisant réagir des réactifs de coloration, de type chloronaphtol, avec le filtre durant 10 minutes à la température ambiante à l'obscurité (le réactif de coloration de type chloronaphtol a été préparé en mélangeant des solutions A et B juste avant utilisation. Solution A: 20 ml de méthanol à 30% froid + 60 mg de 4-chloro-1-naphtol; solution B: 60 mu l de peroxyde d'hydrogène à 30% froid + 100 ml de TBS).

Les protéines fixées sur le filtre et qui ont réagi avec des anticorps du sérum de patient atteint de SIDA peuvent être décelées par le réactif de coloration, par la fixation sur les conjugués IgG anti-humaine de chèvre/peroxydase de raifort.

Les résultats de cette analyse, tels que représentés sur la figure 8A, ont indiqué que v-env5 de virus recombinant de vaccine a produit une famille de trois protéines qui ont été immunoréactives spécifiquement avec du sérum provenant d'un patient atteint de SIDA. Ces protéines avaient des mobilités en électrophorèse semblables à celles des glycoprotéines gp150, gp110 et gp41 du virus authentique LAV/HTLV III, que l'on pense codées par le gène d'enveloppe (W. Robey et col., 1985, Science 228:593-595). Ces protéines n'ont pas été produites dans des cellules infectées par du virus non infectieux ou dans des cellules infectées par du virus de vaccine de type sauvage.

V-env recombinant, qui ne comporte pas les séquences voisines de 5 min codant pour la méthionine supposée d'initiation et les 42 premiers aminoacides des protéines d'enveloppe de LAV/HTLV III, a produit une protéine de dimensions restreintes, mais encore immunoréactive à l'égard d'un sérum de patient atteint de SIDA. On suppose que la translation de la séquence env dans v-env2 recombinant part du codon AUG transcrit à partir de la séquence correspondant à l'agent de liaison utilisé dans la construction de ce recombinant (voir ci-dessus la construction des vecteurs de plasmide contenant du virus de vaccine lié par ligation aux séquences du gène d'enveloppe de LAV/HTLV III codant en 3 min ).

Dans une seconde expérience, on a infecté par v-env5 et v-env2 deux lignées de cellules (BSC-40 et HeLa). On a soumis les protéines spécifiques de LAV, dans les lysats de cellules infectées, à des essais de dosage par immunocoagulation de type Western, comme décrit ci-après.

On a infecté des monocouches confluentes de cellules BSC-40 ou HeLa avec v-env5 ou v-env2 de virus recombinants à une multiplicité ou taux d'infection de 50 unités de formation de plaques par cellule. Douze heures après l'infection, on a lavé deux fois les cellules dans une solution saline tamponnée par des phosphates, on les a remises en suspension dans du tampon pour échantillon de Laemmli et l'on a fait bouillir durant 5 minutes. On a résolu, par électrophorèse sur gel de polyacrylamide comportant du dodécyl sulfate de sodium (SDS-PAGE) les protéines provenant de cellules infectées, on les a soumises à électrotransfert vers une membrane nitrocellulosique et on les a fait réagir avec du sérum groupé provenant de personnes à sérum positif dans la recherche de LAV/HTLV-III.

On a décelé à l'aide de la protéine A, qui a été marquée par 125 I (Amersham, MA) par la méthode à la chloramine T, les protéines immunoréactives. Sur la figure 8B, les pistes 1 et 5 contiennent des protéines provenant de cellules "infectées" par des virus non infectieux; les pistes 2 et 6 contiennent des protéines provenant de cellules infectées par du virus de vaccine de type sauvage; les pistes 3 et 7 des protéines provenant de cellules infectées par v-env-5 ; et les pistes 4 et 8 proviennent de cellules infectées par v-env2. On a utilisé comme témoin (LAV/HTLV III) des protéines de virion de LAV/HTLV III purifiées à l'aide d'un gradient de saccharose, et les positions des protéines d'enveloppe gp150, gp110 et gp41 étaient comme indiqué sur la figure. Les poids moléculaires ont été exprimés en kilodaltons (kd).

On a décelé dans les cellules infectées par v-env5 (figure 8B, pistes 3 et 7) trois protéines majeures capables d'une réaction immunologique ("immunoréactives") avec du sérum groupé provenant de personnes à sérum donnant une réponse positive ("séropositives"). On a estimé que les poids moléculaires de ces protéines étaient de 150 kd, 120 kd et 41kd, semblables à ceux des glycoprotéines d'enveloppe de LAV/HTLV III gp150, gp110 et gp41.

V-env2 de virus recombinant ne comportait pas la séquence supposée émettre un signal pour l'enveloppe de LAV/HTLV III, mais pouvait produire au moins trois polypeptides immunoréactifs ayant pour poids moléculaires 99 kd, 68 kd et 40 kd (figure 8B, pistes 4 et 8).

IDENTIFICATION, PAR DES TECHNIQUES D'IMMUNOPRECIPITATION, DE PROTEINES APPARENTEES A L'ENVELOPPE DE LAV/HTLV III ET EXPRIMEES DANS DES CELLULES INFECTEES PAR DU VIRUS DE VACCINE RECOMBINANT

Le dosage par immunoprécipitation, décrit ci-après, a montré que des cellules infectées par des virus de vaccine recombinants de la présente invention synthétisent des protéines spécifiquement immunoréactives avec du sérum provenant de patients atteints de SIDA.

On a infecté par du virus de vaccine de type sauvage, ou par ses recombinants v-env5 ou v-env2, à un taux ou mul tiplicité d'infection de 10, une boîte de 100 mm comportant des cellules confluentes BSC-40. Après l'écoulement d'un intervalle de temps de 9,5 heures après l'infection, on a remplacé le milieu de croissance par MEMD sans méthionine et sans complément de sérum. A 10 heures après l'infection, on a remplacé le milieu par 2 ml de MEMD sans méthionine contenant 100 mu Ci/ml de (<3><5>S) méthionine et on a laissé le marquage se poursuivre durant 2 heures à 37 DEG C. A la fin de la période de marquage, on a lavé les cellules une fois avec de la solution saline physiologique tamponnée par des phosphates (PBS) et on les a collectées par centrifugation.

On a remis en suspension les culots de cellules dans 1 ml de tampon de lyse: 1% de NP 40 (polyoxyéthylène (9) p-tertoctylphénol), 0,5% de désoxychlolate de sodium, NaCl 0,1M, tris-HCl 0,01M, pH 7,4, EDTA 1mM, et on a séparé le lysat par centrifugation durant 1 minute dans une microcentrifugeuse Eppendorf.

On a effectué une immunoprécipitation en ajoutant 5 microlitres de sérum humain inactivé par chauffage, provenant d'une population témoin ou de patients atteints de SIDA, a 100 mu l de lysat de cellules. Après 1 heure d'incubation à 4 DEG C, on a ajouté 60 mu l de cellules de Staphylococcus aureus activées (cellules "Pansorbin", Calbiochem-Behring Corp., LaJolla, CA) et on a laissé l'incubation se poursuivre durant 1 heure supplémentaire à 4 DEG C. On a collecté par centrifugation durant 30 secondes, dans une microcentrifugeuse Eppendorf à 4 DEG C, les complexes d'immunoprécipitation et on les a lavés une fois dans NaCl 1M + 0,1% de NP 40 + Tris-HCl 0,01 M, à pH 7,4, et deux fois du tampon RIPA (Tris-HCl 10 mM, pH 7,2, NaCl 0,15 M, 1% de désoxycholate de sodium, 1% de "Triton-X 100" (polyoxyéthylène (9-10) p-tert-octyl-phénol), 0,1% de laurylsulfate de sodium).

On a remis en suspension les immunoprécipités, lavés, dans 50 mu l d'un tampon pour échantillon de Laemmli, on a fait bouillir durant 1 minute et centrifugé durant 1 minute dans une microcentrifugeuse Eppendorf. On a analysé par électrophorèse sur des gels de polyacrylamide à 15% de SDS les protéines immuno précipitées présentes dans le liquide surnageant. Après l'électrophorèse, on a coloré les gels avec du colorant bleu de Coomassie, on les a traités par du salicylate de sodium (30 minutes à température ambiante dans du salicylate de sodium 1M) et on les a séchés pour fluorographie.

Les résultats de cette analyse, tels que représentés sur la figure 9A, ont indiqué que v-env5 recombinant a synthétisé une famille de protéines présentant une immunoréaction spécifique avec du sérum de patient atteint de SIDA. Ces protéines présentaient des poids moléculaires apparents de 160, 140, 120, 42 et 40 kilodaltons (kd), correspondant approximativement aux poids moléculaires apparents des glycoprotéines apparentées à l'enveloppe citées pour LAV/HTLV III (W.G. Robey et col., 1985, Science 228:593-595). Ces protéines n'étaient pas présentes dans des cellules "infectées" par des virus non infectieux ou dans des cellules infectées par du virus de vaccine de type sauvage et elles ne subissaient pas non plus d'immunoprécipitation par du sérum humain témoin.

Dans des cellules infectées par v-env2, une protéine tronquée, d'un poids moléculaire apparent de 95 kd, a été produite et reconnue par du sérum de patient atteint de SIDA. Cette forme tronquée de protéine apparentée à l'enveloppe de LAV/HTLV III part très probablement du codon AUG codé par la séquence d'agents de liaison située en 5 min près de la séquence insérée, correspondant à LAV/HTLV III dans ce recombinant.

MARQUAGE PAR <3>H-GLUCOSAMINE DE PROTEINES APPARENTEES A L'ENVELOPPE DE LAV/HTLV III PRODUITES PAR DES VIRUS RECOMBINANTS DE VACCINE CORRESPONDANT A LAV/HTLV III

Le dosage par radioimmunoprécipitation décrit ci-après a indiqué que les virus recombinants de vaccine, correspondant à LAV/HTLV III de la présente invention, ont produit des protéines d'enveloppe glycosylées.

On a soumis des cellules HeLa à une infection par des virus non infectieux (voir figure 9B, pistes 1 et 5) ou à une infection séparément par du virus de vaccine de type sauvage (pistes 1 et 6), du v-env5 recombinant (pistes 3 et 7) ou v-env2 (pistes 4 et 8), le tout à un taux d'infection de 50 unités de formation de plaques par cellule. On a ajouté au milieu de culture, entre 4 et 16 heures apres l'infection, de la glucosamine marquée par <3>H (0,25 mu Ci à 23 mCi/mg, Amersham). On a lavé les cellules deux fois avec une solution saline physiologique tamponnée par du phosphate et on les a lysées dans du tampon contenant NaCl 0,1M, tris-HCl 0,01M à pH 7,4 , EDTA 1mM, 1% de NP-40 (polyoxyéthylène (9) p-tert-octylphénol) et 0,5% de désoxycholate de sodium.

On a mélangé des parties aliquotes de lysat de cellules avec du sérum humain normal (pistes 1-4) ou du sérum groupe provenant de personnes à sérum positif pour LAV/HTLV III (pistes 5-8). Les protéines immunoréactives ont été précipitées par des cellules fixées de Staphyloccocus aureus portant de la protéine A, puis on a effectué une résolution par SDS-PAGE et une détection par fluorographie.

Les résultats du marquage par de la glucosamine comportant un radioisotope, tels que représentés sur la figure 9B, piste 7, indiquent que les protéines obtenues à l'aide du recombinant v-env5, comme les protéines d'enveloppe de LAV/HTLV III ont également été glycosylées. Des différences de configurations de glycosylation peuvent expliquer les légères variations observées dans les mobilités par électrophorèse de protéines fabriquées à l'aide de recombinants, en comparaison des glycoprotéines dues au virion de LAV.

Comme on pourrait s'y attendre pour des protéines ne comportant pas de peptide émetteur de signaux, on n'a pas observé de glycosylation liée à l'azote, avec <3>H-glucosamine, dans des cellules infectées par v-env2 (figure 9B, piste 8).

ANALYSE PAR IMMUNOPRECIPITATION, AVEC PULSIONS DE CHASSE, DE PROTEINES APPARENTEES A L'ENVELOPPE DE LAV/HTLV III PRODUITES PAR DES VIRUS RECOMBINANTS DE VACCINE LIEES A LAV/HTLV III

Il a été suggéré que gp150 de LAV/HTLV III constituait le précurseur dont proviennent une protéine extérieure gp110 et une protéine de transmembrane gp41. L'essai d'immunoprécipitation par "impulsions de chasse" décrit ci-après, indique que les protéines à 150 kd, 120 kd et 41 kd obtenues à l'aide du virus de vaccine recombinant correspondant à LAV/HTLV III ont une relation entre précurseur et produit semblable à celle suggérée pour gp150, gp110 et gp41 pour LAV/HTLV III authentique.

On a infecté des monocouches confluentes de cellules HeLa avec du virus de vaccine de type sauvage (voir figure 9C, pistes 1-6), v-env recombinant (pistes 7-12) ou v-env2 (pistes 13-18), le tout à une multiplicité d'infection de 50 unités de formation de plaques/cellule. Au bout de 10 heures et demie après infection, on a marqué les cellules avec <3><5>S-méthionine (plus de 800 Ci/mmoles, Amersham) à 100 mu Ci/ml durant 15 minutes. A la fin de la période de marquate, on a lavé les cellules une fois avec 2 ml de milieu de chasse préchauffé (milieu de Eagle modifié selon Dulbecco, MEMD, + 3 mg/ml de L-méthionine + 5% de sérum de veau + 100 unités/ml de penicilline + 100 mu g/ml de streptomycine) puis on a fourni à nouveau aux cellules 1 ml du même milieu avant de les faire revenir dans l'incubateur.

A divers moments par la suite, on a lavé les cellules et on les a lysées comme décrit précédemment ci-dessus (marquage par <3>H-glycosamine) et l'on a soumis les protéines provenant de lysats de cellules à immunoprécipitation avec du sérum groupé provenant de personnes dont le sérum présentait une réponse positive pour LAV/HTLV III. Les protéines immunoprécipitées ont été résolues par électrophorèse sur SDS-PAGE et décelées par fluorographie. La durée de chaque chasse a été comme suit: 0 heure (pistes 1, 7, 13); 1 demi-heure (pistes 3, 8, 14); 1 heure (pistes 3, 9, 15); 2 heures (pistes 4, 10, 16); 6 heures (pistes 5, 11, 17) et 12 heures (pistes 6, 12, 18).

Les résultats présentés sur la figure 9C, pistes 7-12, indiquent pour les protéines à 150 kd, 120 kd et 41 kd obtenues à l'aide du recombinant, la même relation précurseur-produit que pour gp150, gp110 et gp41 de LAV/HTLV III authentique. Le traitement de la protéine à 150 kd a semblé lent et inefficace dans les cellules HeLa, puisqu'au bout de 6 heures après le marquage par impulsions, moins de 50% de la radioactivité de la protéine à 150 kd étaient passés dans les protéines à 120 kd et 41 kd. Des résultats préliminaires indiquent que ce traitement est plus efficace dans certains types de globules de sang périphérique humain infecté par les mêmes virus recombinants.

Ces expériences ont également indiqué que la séquence env dans v-env2, qui ne comportait pas la séquence supposée émettre un signal pour déceler l'enveloppe de LAV, a été exprimée sous forme d'un précurseur à 87 kd non modifié (780 aminoacides), qui a donné par traitement un intermédiaire à 99 kd et a été clivé en les polypeptides à 68 kd et 40 kd (figure 9C, pistes 13-18).

PRESENCE D'UNE PROTEINE APPARENTEE A L'ENVELOPPE DE LAV/HTLV III DANS LE MILIEU DE CROISSANCE DE CELLULES INFECTEES PAR DES VIRUS DE VACCINE RECOMBINANTS-LAV/HTLV III

Le dosage par radioimmunoprécipitation décrit ci-après a montré que les protéines immunoréactives produites par le virus de vaccine recombinant de l'invention peuvent être exprimées et traitées de façon semblable à la glycoprotéine d'enveloppe de LAV/HTLV III authentique.

On a soumis des monocouches confluentes de cellules de HeLa à "infection" par du virus non infectieux (voir figure 9D, piste 1) ou séparément à infection par du virus de vaccine de type sauvage (piste 2), par v-env5 recombinant (piste 3) ou v-env2 recombinant (piste 4), le tout à une multiplicité ou taux d'infection de 20 unités de formation de plaque par cellule. On a marqué les cellules avec <3><5>S-méthionine (plus de 800 Ci/mmole, Amersham) à 100 mu Ci/ml 10 à 12 heures après l'infection. A la fin de la période de marquage, on a retiré le milieu et on l'a clarifié par centrifugation durant 2 minutes à 12 000 g avant de l'utiliser pour une immunoprécipitation avec du sérum groupé provenant de personnes à résultat positif pour LAV/HTLV III.

Les protéines provenant de cellules infectées ayant subi une immunoprécipitation par le même sérum sont présentées dans la partie marquée "culot" et les protéines provenant du milieu de croissance ou culture sont présentées dans la partie marquée "Supe" (milieu supérieur surnageant).

Comme on pouvait s'y attendre pour gp110 de LAV/ HTLV III, la protéine à 120 kd obtenue à l'aide du recombinant a également été décelée dans le milieu infecté (figure 9D, piste 3). Ces résultats ont montré que v-env5 de virus recombinant était capable d'exprimer le gène correspondant à l'enveloppe de LAV et de produire des protéines immunoréactives qui ont été traitées de façon semblable à des glycoprotéines d'enveloppe de LAV/HTLV III authentique.

Comme on pouvait s'y attendre pour des protéines ne comportant pas de peptides de signal, on n'a pas décelé de polypeptides liés à l'enveloppe de LAV/HTLV III dans le milieu de croissance de cellules infectées par v-env2 (figure 9D, piste 4).

Par ailleurs, les cellules infectées par v-env7 ont exprimé une protéine tronquée de 130 Kd. Cette protéine ne comporte pas les 217 aminoacides à carbone terminal contenant les séquences d'ancrage de la protéine d'enveloppe de LAV/HTLV III. Cette protéine tronquée (gp130) a été sécrétée dans le milieu de croissance bien plus efficacement que gp110 ou son précurseur gp150 (figure 9E). En même temps, gp130 n'est pas efficacement transformé en gp110, bien que le site de clivage soit encore présent sur la molécule tronquée.

POUVOIR IMMUNITAIRE DU VIRUS RECOMBINANT CORRESPONDANT A L'ENVELOPPE DE LAV

Il a été montré que les virus recombinants, portant le gène chimère correspondant à l'enveloppe de LAV/HTLV III, sont capables de déclencher une réponse par anticorps contre LAV/HTLV III dans deux souches de souris et une espèce de primate sub-humain.

IMMUNOGENICITE DES RECOMBINANTS DE VACCINE PORTANT LE GENE D'ENVELOPPE DE LAV/HTLV III CHEZ LES SOURIS

On a examiné le caractère immunogène de protéines exprimées par v-env5 et v-env2 de virus de la vaccine recombinants. Les expériences décrites ci-après indiquent l'aptitude de ces virus recombinants à déclencher une réponse immunologique pour toutes les glycoprotéines majeures de LAV/HTLV III.

A deux lignées de souris, l'une consanguine (C57B16J) et l'autre non consanguine (ICR), on a inoculé v-env2 ou v-env5 de virus recombinants. Tous les animaux étaient âgés de 5 à 7 semaines au moment de l'inoculation. On a utilisé quatre voies d'inoculation: coussinet de patte, scarification de queue, voies intranasale et intrapéritonéale. On a réalisé l'inoculation dans le coussinet de patte en injectant 25 mu l (5 x 10<6> unités de formation de plaque) de virus recombinant dans chacun des coussinets des pattes arrière. On a effectué la scarification de queue en grattant, à l'aide d'une aiguille à deux branches, la peau à la base de la queue et en appliquant sur la surface scarifiée 10 mu l (2 x 10<7> unités de formation de plaque) de virus recombinant.

On a réalisé une inoculation intranasale en plaçant 10 ml (2 x 10<7> unités de formation de plaque) de virus recombinant sur le nez des souris et en laissant la souris aspirer l'inoculum. On a effectué les injections intrapéritonéales en injectant 10 mu l (2 x 10<7> unités de formation de plaque) de virus recombinants dans la cavité péritonéale des souris. On a effectué la préparation des stocks et diluation de virus en opérant comme décrit ci-dessus à propos de cellules et virus.

On a collecté, à des intervalles de 2 semaines après l'inoculation des échantillons de sérum sur des souris individuelles et l'on a analysé ces échantillons aussi bien par un dosage d'immunosorption avec liaison d'enzyme ("ELISA"; enzyme linked immunosorbent assay) que par analyse de coagulat de type Western comme décrit ci-après.

CONVERSION DU SERUM (SEROCONVERSION), MONTREE PAR LE DOSAGE OU ESSAI ELISA, DE SOURIS IMMUNISEES PAR DES VIRUS RECOMBINANTS DE VACCINE A ENVELOPPE DE LAV/HTLV III

Les résultats des essais ELISA sur des échantillons de sérum de 6 semaines sont résumés au Tableau 1. Les séquences v-env2 et v-env5 de virus recombinants ont converti (transformé) à 100% et à 95% le sérum des souris C57B16J, respectivement. Pour les souris ICR, le taux de conversion de sérum a été de 44% pour v-env2 et de 100% pour v-env5.

On a obtenu une conversion totale de sérum ainsi que le titre moyen le plus élevé, à l'essai ELISA, chez des souris immu nisées par scarification de la queue.
<tb><TABLE> Columns=4
<tb>Title: Tableau I
<tb>Head Col 01 to 04 AL=L: Séroconversion de souris inoculées avec des virus recombinants portant le gène chimère de l'enveloppe de LAV/HTLV III
<tb>SubHead Col 01 AL=L>Virus recombinant:
<tb>SubHead Col 02 AL=L>Voie d'inoculation:
<tb>SubHead Col 03 to 04 AL=L:

Séroconversion de souris inoculées*
<tb>SubHead Col 03 AL=L>ICR:
<tb>SubHead Col 04 AL=L>C57B16J:
<tb> <SEP>v-env2 <SEP>coussinet de patte <SEP>1/3 <SEP>4/5
<tb> <SEP>scarification de queue <SEP>3/3 <SEP>4/5
<tb> <SEP>voie intranasale <SEP>0/3 <SEP>4/5
<tb> <SEP>voie intrapéritonéale <SEP>non effectuée <SEP>3/5
<tb> <SEP>v-env5 <SEP>coussinet de patte <SEP>4/4 <SEP>5/5
<tb> <SEP>scarification de queue <SEP>3/3 <SEP>5/5
<tb> <SEP>voie intranasale <SEP>3/3 <SEP>4/5
<tb> <SEP>voie intrapéritonéale <SEP>non effectuée <SEP>5/5
* La séroconversion, déterminée par l'essai ELISA comme décrit, est exprimée par le nombre de souris présentant de la séroconversion par rapport au nombre total de souris ayant subi une inoculation, pour chaque groupe.

On a obtenu comme suit les résultats des dosages ou essais ELISA: on a dilué des virions de LAV/HTLV III inactivés et purifiés, dans du tampon de carbonate (50 nM de carbonate de sodium, pH 9,6) et l'on a placé ces dilutions dans des plaques pour microtitrage comportant 96 creux ou puits (100 mu l/creux, contenant 0,2 mu g de LAV/HTLV III inactivé). On a laissé la liaison s'effectuer à 4 DEG C durant la nuit. On a aspiré la protéine non fixée et on a lavé avec 200 ml (par creux) de solution saline physiologique à tampon de phosphate + 5% de poudre de lait dégraissé puis avec 300 mu l (par creux) à 4% de saccharose. Après aspiration de l'excès de la solution de saccharose, on a laissé les plaques sécher à la température ambiante (1 heure).

Puis on a ajouté dans chaque creux 50 mu l de solution saline physiologique à tampon de phosphate contenant 2,5 mu l d'échantillon de sérum de souris, et on a laissé réagir à 37 DEG C durant 1 heure. A la fin de la période d'incubation, on a lavé cinq fois les creux avec de la solution saline physiologique comportant du tampon de phosphate (PBS) + 0,05% de "Tween 20" (monolaurate de polyoxyéthylène sorbitanne). On a ajouté dans chaque creux 50 mu l de conjugués immunoglobuline G anti-souris de chèvre/peroxydase de raifort (dilution à 1:5000 dans PBS (solution saline physiologique à tampon de phosphate) + 0,05% de "Tween-20", et on a laissé réagir à 37 DEG C durant 45 minutes. Après 5 lavages par PBS + 0,05% de "Tween 20", on a ajouté 100 mu l d'un substrat citrate-O-phénylènediamine-peroxyde.

On a préparé le substrat comme suit: on a dissous 0,294 g de citrate de sodium dihydraté + 0,537 g de cristal de phosphate de sodium dibasique dans 10 ml de H2O et l'on a ajusté à pH 5,0 avec HCl; on a ajouté juste avant emploi 2 mu l de H2O2 à 30% et 4 mg d'O-phénylène-diamine. On a fait incuber les plaques 30 minutes à l'obscurité à la température ambiante. On a arrêté la réaction en ajout 100 mu l d'acide sulfurique 1,3N dans chaque creux et l'on a mesuré le coefficient d'absorption optique du mélange réactionnel à 490 nm.

Les résultats présentés au tableau I sont exprimés sous forme des rapports du nombre total de souris séropositives au nombre total de souris ayant subi une inoculation. Les échantillons de sérum ont été collectés 6 semaines après inoculation et analysés par l'essai de dosage ELISA. On a utilisé comme témoin des échantillons de sérum provenant de 5 souris n'ayant pas subi d'inoculation. Les titres ELISA moyens pour le groupe témoin ont été de 0,021 +/- 0,005 et de 0,017 +/- 0,010 pour les souris ICR et C57B15J, respectivement. On a considéré comme positifs des échantillons de sérum provenant de souris ayant subi une inoculation d'immunisation qui ont présenté des titres ELISA supérieurs de plus de trois écarts-types aux titres du groupe témoin.

Pour montrer que des souris ayant reçu une inoculation de virus recombinants (souris "séroconverties") ont produit des anticorps contre des glycoprotéines authentiques d'enveloppe de LAV/HTLV III, on a analysé des échantillons de sérum provenant de souris ayant subi cette inoculation ("souris immunisées") par une technique d'immunocoagulation de type Western comme suit: on a "immunisé" des souris mâles agées de 5 à 7 semaines, consanguines (C57B16J, Jackson Laboratory) par scarification de la queue, ce qui a consisté à appliquer un inoculum de 10 mu l contenant 2 x 10<7> unités de formation de plaque de virus de vaccine recombinant à des abrasions engendrées par grattage à l'aide d'une aiguille à deux branches à la base de la queue. On a saigné les animaux à partir du sinus rétro-orbital 8 semaines après l'inoculation et l'on a conservé le sérum sous congélation jusqu'à utilisation.

On a fait réagir les parties aliquotes d'échantillons de sérum, diluées 50 fois dans une solution saline tamponnée par des phosphates + 0,2% de "NP-40" et 3% de poudre de lait non gras, avec des protéines de virion de LAV/HTLV III qui ont été résolues par électrophorèse sur polyacrylamide-SDS et immobilisées par électrotransfert sur des filtres de nitrocellulose. On a décelé par de l'immunoglobuline anti-souris de chèvre conjugée à des phosphatases alcalines les protéines de LAV/HTLV III reconnues par ces sérums.

Les résultats obtenus sur ces échantillons de sérum de 8 semaines provenant de souris C57B16J ayant subi une inoculation, par scarification de queue, de virus recombinants sont présentés sur la figure 10. Tous les animaux ayant subi une inoculation par des virus recombinants ont produit des anticorps qui ont réagi avec la glycoprotéine gp41 de l'enveloppe de LAV. Le sérum de certains des animaux ayant subi une inoculation de v-env5 (figure 10, piste a) a également reconnu gp50 et gp110, ce qui indique l'aptitude de ce virus recombinant à déclencher une réponse immunitaire à l'égard de toutes les glycoprotéines majeures de LAV/HTLV III.

CARACTERE IMMUNOGENE DE V-ENV5 RECOMBINANT DE VIRUS DE VIRUS DE VACCINE-LAV/HTLV III CHEZ DES PRIMATES SUB-HUMAINS

On a étudié le caractère immunogène de vaccine-V-env5 recombinant de LAV/HTLV III dans deux espèces de primates sub-humains: Macaca Fasciculariès et des chimpanzés. Les résultats décrits ci-après montrent que v-env5 est capable de susciter dans les deux espèces une immunité humorale et à médiation cellulaire.

Réponse humorale chez les singes macaques immunisés par v-env5

On a utilisé neuf macaques à longue queue (Macaca Fascicularis), allant de la jeunesse à l'âge adulte, pour étudier le caractère immunogène de v-env5 recombinant de virus de vaccine. On a soumis tous les animaux à des essais de dépistage préliminaire pour constater l'absence d'anticorps contre des virus de vaccine et contre LAV/HTLV III et l'absence de virus T-lymphotropes de singe ou de virus de SIDA de singe ou d'anticorps contre ces virus. A quatre des singes, on a inoculé 2 x 10<8> unités de formation de plaque de v-env5 et à quatre singes on a inoculé 2 x 10<7> unités de formation de plaque du même virus. A un animal, on a inoculé 2 x 10<7> unités de formation de plaque d'un virus de vaccine recombinant témoin (v-HSgD1 de virus recombinant de vaccineherpès simplex gD1). Tous les animaux ont été inoculés par scarification de la peau.

On a collecté des échantillons de sérum et de sang héparinisé, avant inoculation, et au bout de 4, 6 et 8 semaines après inoculation. Dix semaines après la première inoculation, on a administré à tous les animaux une seconde inoculation de 2 x 10<8> unités de formation de plaque du même virus. Tous les animaux ont présenté une autocicatrisation des lésions de peau, typique des infections par le virus de la vaccine, et des indications physiologiques normales pendant tout le cours de l'expérimentation. La réponse humorale a été analysée par ELISA et par des essais de dosage de coagulation de type Western.

Pour une analyse "ELISA", on a dilué les échantillons de sérum de 50 fois dans PBS contenant 3% de poudre de lait non gras et 0,2% de NP-40 (polyoxyéthylène (9) p-tert-octylphénol), et on les a fait réagir avec des protéines de virion de LAV/HTLV III qui avaient été immobilisées sur des creux de plaques pour microtitrage. Le mode opératoire pour ELISA a été identique à celui décrit ci-dessus, sauf que le second anticorps utilisé a été de l'anticorps anti-humain de chèvre conjugué à de la péroxydase de raifort.

Les résultats obtenus, présentés sur la figure 11, montrent que, si deux animaux seulement ont présenté une séroconversion après inoculation primaire, tous les animaux ont présenté de la séroconversion après la seconde immunisation.

Pour déterminer quels anticorps ont été produits chez les animaux immunisés, on a analysé, par coagulation de type Western, des échantillons de sérum collectés au bout de 4 semaines après la seconde immunisation. On a utilisé deux protocoles pour la détection optimale des deux glycoprotéines d'enveloppe, gp41 et gp110. Pour une détection optimale de gp41, on a dilué le sérum 50 fois dans PPS + 3% de lait non pasteurisé et 0,2% de NP-40, et l'on a fait réagir durant 1 heure à la température ambiante avec de la protéine de virion de LAV/HTLV III purifiée et immobilisée sur un filtre nitrocellulosique.

On a lavé les filtres avec PBS (solution saline physiologique additionnée d'un tampon de phosphate) + 0,2% de NP-40, et l'on a fait réagir avec de l'anticorps d'immunoglobuline anti-humaine de chèvre conjuguée à de la phosphatase alcaline (Zymed, CA) à une dilution de 1:2000 dans du tampon PBS + 0,2% de NP-40. Pour la détection de la glycoprotéine gp110, on a dilué le sérum 50 fois dans PBS + 3% de lait non pasteurisé et l'on a fait réagir durant 1 heure à la température ambiante avec de la protéine de virion de LV/HTVL III purifiée et immobilisée sur un filtre en nitrocellulose. On a lavé les filtres dans PBS + 0,05% de "Tween-20" puis on a fait réagir avec de l'anticorps d'immunoglobuline anti-humaine de chèvre conjuguée à de la phosphatase alcaline (Zymed, CA) à une dilution de 1 à 2000 dans du tampon PBS.

Dans chaque mode opératoire, le lavage final après la seconde réaction avec l'anticorps a été réalisé dans du TRIS 0,1 M (pH 9,5) avec NaCl 0,1M et 5 mM de MgCl2. On a décelé l'anticorps lié à des antigènes sur le filtre en faisant réagir le filtre avec une solution contenant du Tris 0,1M (pH 9,5), du NaCl 0,1M, 5mM de MgCl2, 0,33 g/ml de phosphate de bromo-chloro-indolyle et 0,17 mg/ml de bleu de nitrotétrazolium. Après avoir fait réagir les filtres avec les chromogènes, on a rincé les filtres dans de l'eau, on les a séchés à l'air et photographiés.

Comme représenté sur la figure 12B, tous les animaux qui ont reçu deux inoculations ont montré une forte réaction d'anticorps à l'égard de gp41. En outre, quatre de ces animaux ont également produit des anticorps qui ont fortement réagi avec gp110. Dans leur ensemble, les résultats représentés sur la figure 12A montrent que v-env5 recombinant est capable de susciter, chez les singes macaques, la production d'anticorps spécifiques de l'enveloppe de LAV/HTLV III.

REPONSE IMMUNOLOGIQUE, A MEDIATION CELLULAIRE, CHEZ DES MACAQUES IMMUNISES PAR V-ENV5

On a isolé des lymphocytes de sang périphérique à partir de sang héparinisé de macaques, obtenu quatre semaines après une seconde immunisation intradermique par v-env5, ou un virus recombinant de vaccine témoin exprimant la glycoprotéine D de virus de herpès simplex (v-HSVgD1), par centrifugation sur appareil "Ficoll Hypaque". On a également isolé des lymphocytes de sang périphérique provenant du macaque 81, qui a été vacciné une fois seulement avec v-env5, et provenant de macaques non immunisés. Les lymphocytes de sang périphérique ont été mis en suspension dans du milieu "RMPI 1640" (Gibco, Grand Island, New-York, Etats-Unis d'Amérique) additionné de 10% de sérum humain normal inactivé par la chaleur et l'on a placé 1 x 10<5> lymphocytes de sang périphérique, dans un volume final de 0,1 ml du milieu, dans des creux de plaque comportant 96 creux à fond rond.

Dans chaque creux, on a introduit 0,1 ml de milieu contenant v-env5 inactivé par la lumière (ultraviolette) (1 x 10<6> unités de formation de plaque/ml avant inactivation par l'ultraviolet) ou LAV/HTLV III non rompu (1 mg/ml, environ 1 x 10<5> doses infectieuses moyennes obtenues par culture sur tissu), que l'on a purifié par deux cycles de centrifugation avec gradient de saccharose pour séparer les liquides surnageants de cellules CEM infectées par LAV/HTLV III, qui est une lignée de cellules de leucémie T négative de type HLADR.

Six jours après la stimulation, on a marqué chaque creux de lymphocytes de sang périphérique avec 1 mu Ci de 3H-TDR (3H-thydimine, New England Nuclear, Boston, MA, Etats-Unis d'Amérique) durant 6 heures, on a récolté les cellules, et l'on a déterminé les coups par minute (cpm) correspondant à 3H-TDR incorporé, comme étant la valeur moyenne obtenue pour quatre creux.

On a calculé l'indice de stimulation en divisant le nombre de coups par minute correspondant à 3H-TDR incorporé à des cellules stimulées, par le nombre de coups par minute correspondant à l'incorporation à des cellules non stimulées.
<tb><TABLE> Columns=7
<tb>Title: Tableau II
<tb>Head Col 01 to 07 AL=L: Réponse, par prolifération induite par LAV/HTLV III, de lymphocytes de sang périphérique prélevé sur des macaques, après immunisation par un virus recombinant de vaccine exprimant les glycoprotéines d'enveloppe de LAV/HTLV III
<tb>SubHead Col 01 AL=L>Macaque
n<o>:
<tb>SubHead Col 02 AL=L>Immunisation:
<tb>SubHead Col 03 AL=L>Néant,
cpm*:
<tb>SubHead Col 04 to 07 AL=L: Virus utilisé pour la stimulation des lymphocytes
<tb>SubHead Col 04 to 05 AL=L:

LAV/HTLV III
<tb>SubHead Col 06 to 07 AL=L: v-env5
<tb>SubHead Col 04 AL=L>cpm*:
<tb>SubHead Col 05 AL=L>IS**:
<tb>SubHead Col 06 AL=L>cpm*:
<tb>SubHead Col 07 AL=L>IS**:
<tb> <SEP>67 <SEP>v-env5 <SEP>1586 <SEP>7465 <SEP>4,7 <SEP>60 415 <SEP>38,1
<tb> <SEP>68 <SEP>v-env5 <SEP>2245 <SEP>9075 <SEP>4,0 <SEP>28 638 <SEP>12,8
<tb> <SEP>74 <SEP>v-env5 <SEP>1585 <SEP>4732 <SEP>3,0 <SEP>21 487 <SEP>13,6
<tb> <SEP>75 <SEP>v-env5 <SEP>581 <SEP>8645 <SEP>14,9 <SEP>37 847 <SEP>14,1
<tb> <SEP>76 <SEP>v-env5 <SEP>2479 <SEP>5987 <SEP>2,5 <SEP>36 657 <SEP>14,8
<tb> <SEP>80 <SEP>v-env5 <SEP>1077 <SEP>13 922 <SEP>12,9 <SEP>24 752 <SEP>23,0
<tb> <SEP>81 <SEP>v-env5 <SEP>965 <SEP>3985 <SEP>4,1 <SEP>40 572 <SEP>42,0
<tb> <SEP>82 <SEP>v-env5 <SEP>2581 <SEP>8580 <SEP>3,3 <SEP>46 847 <SEP>18,1
<tb> <SEP>73 <SEP>V-HSVgD1 <SEP>612 <SEP>553 <SEP>1,0- <SEP>56 217 <SEP>91,9
<tb> <SEP>26 <SEP>néant

<SEP>2911 <SEP>1822 <SEP>1,0- <SEP>2240 <SEP>1,0-
<tb> <SEP>27 <SEP>néant <SEP>1228 <SEP>1072 <SEP>1,0 <SEP>2532 <SEP>2,0
* cpm: coups par minute correspondant à <3>H-TdR Incorporé
** IS: indice de stimulation

Comme on le voit sur le tableau II, tous les macaques immunisés, y compris le numéro 81, qui ont reçu une seule inoculation de v-env5, ont produit des lymphocytes qui ont proliféré en réponse spécifique à la stimulation par LAV/HTLV III in vitro. Au contraire, les lymphocytes provenant de l'animal 73, qui a reçu de la vaccine-v-HSVgD1 recombinant de l'herpès simplex, n'a répondu qu'à la stimulation par le virus de la vaccine, mais non pas à celle par LAV/HTLV III. Des animaux témoins non immunisés n'ont pas produit de lymphocytes répondant à l'un ou l'autre antigène. En outre, la réponse pour des lymphocytes provenant de macaques immunisés par v-env-5 a été semblable en amplitude à celle obtenue pour le macaque 73, qui a été vaccine avec v-HSVgD1.

Ces résultats indiquent que l'expression du gène env de LAV/HTLV III par le virus recombinant n'a pas supprimé chez les singes macaques les réponses immunologiques, à médiation par des cellules T, in vitro ou in vivo.

Pour déterminer le sous-groupe de lymphocytes provenant de macaques immunisés qui a été stimulé par LAV/HTLV III, on a soumis les lymphocytes de sang périphérique stimulés à un examen par immunofluorescence en deux couleurs pour expression des récepteurs IL-2 qui sont présents sur des cellules T activées et sur des cellules B. Les antigènes CD4 et CD8 sont présents sur les cellules T et l'antigène CD20 (Bp35) est présent sur les cellules B. Les résultats présentés au tableau III montrent que presque tous les lymphocytes de sang périphérique stimulés par un virus, qui expriment des récepteurs IL-2, expriment aussi des antigènes CD4 ou CD8, alors que 1,5 à 2% seulement coexpriment l'antigène CD20 (Bp35).

Ce résultat indique que les lymphocytes stimulés sont des cellules T.
<tb><TABLE> Columns=6
<tb>Title: Tableau III
<tb>Head Col 01 to 06 AL=L: Expression de récepteurs IL-2 et d'antigènes CD4, CD8 ou CD20 (Bp35) sur des lymphocytes de sang périphérique obtenus sur des macaques vaccinés, après stimulation par LAV/HTLV III ou par un virus de vaccine recombinant exprimant les glycoprotéines d'enveloppe de LAV/HTLV III
<tb>SubHead Col 01 AL=L>Macaque
n<o>:
<tb>SubHead Col 02 AL=L>Lymphocytes* stimulés par:
<tb>SubHead Col 03 AL=L>% total de cellules IL-2R+:
<tb>SubHead Col 04 to 06 AL=L: % de cellules IL-2R+ coexprimant
<tb>SubHead Col 04 AL=L>CD4:
<tb>SubHead Col 05 AL=L>CD9:
<tb>SubHead Col 06 AL=L>CD20 (Bp35):

<tb> <SEP>74 <SEP>v-env5 <SEP>27,7 <SEP>48,6 <SEP>52,2 <SEP>2,0
<tb> <SEP>80 <SEP>v-env5 <SEP>25,6 <SEP>62,4 <SEP>40,0 <SEP>NT
<tb> <SEP>74 <SEP>LAV/HTLV III <SEP>14,7 <SEP>50,0 <SEP>59,0 <SEP>1,9
<tb> <SEP>80 <SEP>LAV/HTLV III <SEP>12,0 <SEP>58,0 <SEP>38,0 <SEP>1,5
<tb> <SEP>80 <SEP>pas de virus <SEP>0,3 <SEP>0,3- <SEP>0,3- <SEP>0,3-
* lymphocytes: lymphocytes de sang périphérique
** NT: pas d'essai

On a obtenu comme suit les résultats du tableau III. On a coloré les lymphocytes de sang périphérique simultanément avec de l'anticorps monoclonal 2A3 conjugué à de la phycoérythrine (Becton-Dickinson, Inc., Mountain View, CA, Etats-Unis d'Amérique), anticorps par rapport au récepteur d'interleucine-2 (IL-2R), et avec des anticorps monoclonaux IF5 conjugués à de la fluorescéine (Genetic Systems Corp., Seattle, WA, Etats-Unis d'Amérique) pour CD20, G10-1 (Genetic Systems Corp., Seattle, WA) pour CD8 ou T4a (Ortho Diagnostics, Raritan, N.J.) pour CD4. On a utilisé les anticorps à des concentrations de saturation, déterminées au préalable par des titrages sur des lymphocytes analysés par microfluorométrie en écoulement avec un classificateur FACS IV modifié (Becton-Dickinson, Mountain View, CA).

On a effectué une analyse quantitative en deux couleurs comme indiqué précédemment (Ledbetter, J.A. et al., 1984, Perspectives in Immunogenetics and Histocompatibility, 6, 119-129). On a réglé les portes de dispersion en avant et à angle droit de manière à inclure des lymphoblastes et un nombre important de petits lymphocytes. Les valeurs indiquées sont celles concernant le pourcentage total de cellules IL-2R+ et pour le pourcentage de cellules IL-2R+ coexprimant CD4, CD8, ou CD20 (Bp35).

Il est bien établi que des cellules T, après simulation par antigène, produisent des lymphokines comprenant IL-2, pouvant promouvoir une différenciation et/ou une proliferation des cellules T et B et pouvant activer des cellules ou globules lytiques naturels capables de lyser des cellules infectées par divers virus, ce qui comprend le virus du SIDA. On s'est donc demandé si les globules ou cellules T provenant de macaques vaccines produisent IL-2 après stimulation par LAV/HTLV III.

Pour répondre à cette question, on a conduit deux expériences. Pour l'expérience 1, on a isolé les lymphocytes de sang périphérique à partir de sang héparinisé de macaques quatre semaine après une seconde injection intradermique d'immunisation par v-env5 ou v-HSVgD1 construit avec la souche WR du virus de la vaccine. Pour l'expérience 2, on a isolé des lymphocytes de sang périphérique sur des macaques 4 semaines après une première injection intradermique d'immunisation par 2 x 10<5> unités de formation de plaques de v-env5, v-HSVgD1 ou d'un virus recombinant v-env5 construit avec la souche de virus de vaccin du "New York City Board of Health" (service de santé de la Ville de New-York) (v-env5NY).

On a mis les lymphocytes de sang périphérique en suspension dans du milieu RPMI 1640 additionné de 10% de sérum humain normal inactivé par la chaleur et l'on a placé 2 x 10<5> lymphocytes de sang périphérique dans des creux de plaque comportant 96 creux à fond rond. On a ensuite ajouté dans les creux v-env5 inactivé par la lumière ultraviolette (1 x 10<6> unités de formation de plaque/ml avant inactivation par la lumière ultraviolette) ou LAV/HTLV III purifié (1 mu g/ml). Deux jours après la stimulation, on a récolté les liquides surnageants sur des creux utilisés par paires et l'on a soumis à des essais de détermination de la capacité à entretenir une prolifération de cellules CTLL-2 dépendant de IL-2 (cellules fournies par le Dr S. Gillis, Immunex Corp. Seattle, WA, Etats-Unis d'Amérique), qui ont été lavées durant 24 heures, avant l'essai, pour les débarrasser IL-2.

Au cours des six dernières heures d'incubation avec le liquide surnageant, on a marqué les cellules avec <3>H-TdR, et l'on a déterminé la quantité de <3>H-TdR incorporée aux cellules. On a calculé les unités d'activité de IL-2 présent dans le liquide surnageant, comme décrit, à partir de courbes de référence obtenues par des essais de l'effet de IL-2 humain recombinant (fourni par le Dr Gillis) sur la prolifération de cellules CTLL-2.

Les résultats obtenus sont présentés au tableau IV.
<tb><TABLE> Columns=5
<tb>Title: Tableau IV
<tb>Head Col 01 to 05 AL=L: Production de IL-2 par les lymphocytes de sang périphérique provenant de macaques vaccinés, après stimulation par LAV/HTLV III ou par des virus de vaccine recombinants exprimant de la glycoprotéine d'enveloppe de virus de SIDA
<tb>Head Col 01 to 02 AL=L: Expérience 1:
<tb>Head Col 03 to 05 AL=L: IL-2 (unités/ml)
<tb>SubHead Col 01 AL=L>Macaque
n<o>:
<tb>SubHead Col 02 AL=L>Immunisation:
<tb>SubHead Col 03 to 05 AL=L:

Liquides surnageants de lymphocytes* stimulés par
<tb>SubHead Col 03 AL=L>pas de virus:
<tb>SubHead Col 04 AL=L>LAV/HTLV III:
<tb>SubHead Col 05 AL=L>v-env5:
<tb> <SEP>67 <SEP>v-env5 <SEP>0 <SEP>28,0 <SEP>96,0
<tb> <SEP>68 <SEP>v-env5 <SEP>0 <SEP>16,0 <SEP>124,0
<tb> <SEP>74 <SEP>v-env5 <SEP>0 <SEP>9,0 <SEP>52,0
<tb> <SEP>73 <SEP>v-HSVgD1 <SEP>0 <SEP>0 <SEP>108,0
<tb> <SEP>26 <SEP>néant <SEP>0 <SEP>0 <SEP>0
<tb>Head Col 01 to 05 AL=L: Expérience 2:
<tb> <SEP>03 <SEP>v-env5 <SEP>0 <SEP>14,4 <SEP>55,8
<tb> <SEP>05 <SEP>v-env5NY <SEP>0 <SEP>16,8 <SEP>33,3
<tb> <SEP>49 <SEP>v-env5NY <SEP>0 <SEP>7,1 <SEP>26,7
<tb> <SEP>52 <SEP>v-env5NY <SEP>0 <SEP>2,4 <SEP>27,6
<tb> <SEP>59 <SEP>v-HSVgD1 <SEP>0 <SEP>0 <SEP>27,6
<tb> <SEP>26 <SEP>néant <SEP>0 <SEP>0 <SEP>0
<tb> <SEP>27 <SEP>néant <SEP>0 <SEP>0 <SEP>0
<tb></TABLE>

Les résultats de l'expérience 1 du tableau IV montrent que les cellules surnageantes provenant de lymphocytes de sang périphérique stimulés par v-env5 ou par LAV/HTLV III obtenus sur des macaques immunisés deux fois par v-env5, contiennent IL-2, comme le montre leur aptitude à induire une prolifération de cellules CTLL-2, qui est une lignée de cellules dépendant de IL-2.

De même, comme montré dans l'experience 2 du tableau IV, on a décelé IL-2 dans ce qui surnage des lymphocytes de sang périphérique stimulés par LAV/HTLV III ou par v-env5 provenant du macaque 03, qui a été immunisé une fois avec v-env5, et provenant de l'ensemble des trois macaques qui ont été immunisés une fois par la souche de "vaccins" du même recombinant (v-env5NY, voir ci-dessus l'exposé sur la construction et la caractérisation du virus de vaccine recombinant contenant le gène d'enveloppe chimère de LAV/HTLV III). Au contraire, les lymphocytes de sang péripherique provenant des macaques 73 et 59, qui ont subi des inoculations d'immunisation par des virus recombinants de vaccine-HSV gD-1, ont produit IL-2 après stimulation par v-env5 seulement, et non pas après stimulation par LAV/HTLV III.

Les macaques 26 et 27, non immunisés, n'ont pas produit de IL-2 décelable après stimulation par LAV/HTLV III ou par le virus de vaccine recombinant. Puisque des cellules ou lymphocytes T, présentant de l'activité d'auxiliaires/inducteurs produisent IL-2 après stimulation antigénique, ces résultats montrent la présence des cellules ou globules T auxiliaires, qui reconnaissent LAV/HTLV III, chez des macaques immunisés par les virus recombinants.

En plus de leur rôle probable dans la différenciation des cellules ou lymphocytes B pour produire des anticorps contre des antigènes d'enveloppe LAV/HTLV III, les cellules ou lymphocytes T producteurs de IL-2 peuvent être impliqués dans la différenciation et/ou l'expansion de cellules effectrices, comme des lymphocytes T cytotoxiques ou des cellules lytiques naturelles qui peuvent tuer des cellules infectées par des virus.

REPONSES HUMORALES CHEZ LES CHIMPANZES IMMUNISES PAR V-ENV5NY

A deux chimpanzés d'age juvénile, on a inoculé par voie intradermique 5 x 10<8> unités de formation de plaque de v-env5NY, la souche de "vaccin" de v-env5. A un animal, on a inoculé par voie intradermique le même titre d'un recombinant de vaccine-herpès simplex gD, v-HSVgD1NY construit à partir de la même souche parentale de vaccine (v-NY) que v-env5NY. On a administré à tous les animaux une seconde inoculation de la même dose 8 semaines après la première immunisation. On a collecté deux fois par semaine les échantillons de sérum après immunisation et on les a soumis à des dosages, par ELISA et par coagulation de type Western, pour chercher des anticorps spécifiques de LAV/HTLV III.

Tous les animaux ont présenté une autocicatrisation des lésions de la peau, typique d'une infection par virus de la vaccine et ils ont eu des résultats physiologiques normaux pendant tout le cours de l'expérience.

Les méthodes pour un examen de type ELISA sur des sérums de chimpanzés ont été identiques à celui utilisé pour des sérums de macaques. Les résultats présentes au tableau V indiquent que les deux animaux d'expérience (124 et 149) ont subi une séro-conversion au bout de 8 semaines après première immunisation et que les taux d'anticorps ont continué à augmenter après la seconde injection d'immunisation.

L'animal témoin (134) est resté séronégatif.
<tb><TABLE> Columns=4
<tb>Title: Tableau V
<tb>Head Col 01 to 04 AL=L: Dosage ELISA d'échantillons de sérum provenant de chimpanzés immunisés par des virus de vaccine recombinants
<tb>SubHead Col 01 AL=L>Temps du prélèvement:
<tb>SubHead Col 02 to 04 AL=L:

Lecture ELISA pour des anticorps de sérum spécifiques de LAV/HTLV III
<tb>SubHead Col 02 AL=L>Chimpanzé n<o> 134 v-HSVgDINY:
<tb>SubHead Col 03 AL=L>Chimpanzé n<o> 124 v-env5NY:
<tb>SubHead Col 04 AL=L>Chimpanzé n<o> 149 v-env5NY:
<tb> <SEP>Avant saignée <SEP>0,084 +/- 0,015 <SEP>0,100 +/- 0,005 <SEP>0,123 +/- 0,025
<tb> <SEP>8 semaines après la première injection d'immunisation <SEP>0,085 +/- 0,010 <SEP>0,185 +/- 0,020 <SEP>0,403 +/- 0,027
<tb> <SEP>2 semaines après la seconde injection d'immunisation <SEP>0,075 +/- 0,012 <SEP>0,237 +/- 0,017 <SEP>0,523 +/- 0,073
<tb></TABLE>

Pour montrer que les anticorps spécifiques de LAV/HTLV III décelés chez les animaux immunisés étaient dirigés contre les glycoprotéines d'enveloppe, on a analysé les mêmes sérums par coagulation de type Western. Le mode opératoire utilisé a été optimisé pour la détection de l'anticorps gp41, et il a été identique à celui utilisé pour l'analyse des sérums de macaques. Les résultats présentés sur la figure 13 montrent que les anticorps spécifiques de LAV/HTLV III, fabriqués dans les deux animaux vaccinés, agissent bien entendu à l'encontre des glycoprotéines d'enveloppe, et que le taux au niveau de ces anticorps a augmenté aprés la seconde injection d'immunisation.

REPONSES IMMUNOLOGIQUES, A MEDIATION PAR LES CELLULES, CHEZ DES CHIMPANZES IMMUNISES PAR V-ENV5NY

On a utilisé des lymphocytes de sang périphérique, isolés à partir des mêmes animaux que ceux décrits ci-dessus, pour montrer les réponses immunologiques, à médiation cellulaire, chez ces animaux. On a isolé les lymphocytes de sang périphérique à partir de sang héparinisé, par centrifugation de type Ficoll-hypaque 4 semaines après l'inoculation intradermique initiale des virus de vaccine recombinant. On a ensemencé ces lymphocytes à raison de 1 x 10<5> cellules par creux dans des plaques de microtitrage comportant 96 creux, dans un milieu RPMI 1640 additionné de 10% de sérum humain normal inactivé par la chaleur et de pénicilline/streptomycine. On a ensuite ajouté dans les creux les glycoprotéines de LAV/HTLV III (5 mu g/ml) ou des glycoprotéines d'enveloppe de LAV/HTLV III (1 mu g/ml), isolées par chromatographie de lectine sur LAV/HTLV III purifié.

Six jours plus tard, on a déterminé, par comptage de scintillation en milieu liquide, H<3>-thymidine incorporée aux cellules.

Comme montré sur le tableau VI, les lymphocytes provenant des deux animaux (no<S> 124 et 149) immunisés par v-env5NY, ont prolifére en réponse à une stimulation par le virion LAV/HTLV III ou par des protéines d'enveloppe purifiées (env). Au contraire, l'animal 134, qui a reçu de la vaccine, herpès simplex recombinant v-HSgD1NY, n'a pas produit de lymphocytes reconnaissant LAV/HTLV III.
<tb><TABLE> Columns=5
<tb>Title: Tableau VI
<tb>Head Col 01 to 05 AL=L: Réponse immunologique, à médiation cellulaire, chez des chimpanzés vaccinés par des recombinants de vaccine
<tb>SubHead Col 01 AL=L>Chimpanzé
n<o>:
<tb>SubHead Col 02 AL=L>Immunisation:
<tb>SubHead Col 03 to 05 AL=L:

<3>H-thymidine incorporée dans des lymphocytes* stimulés par
<tb>SubHead Col 03 AL=L>pas d'antigène:
<tb>SubHead Col 04 AL=L>LAV/HTLV III:
<tb>SubHead Col 05 AL=L>env:
<tb> <SEP>124 <SEP>v-env5NY <SEP>2842 <SEP>37 132 <SEP>26 370
<tb> <SEP>149 <SEP>v-env5NY <SEP>375 <SEP>20 292 <SEP>27 115
<tb> <SEP>134 <SEP>v-HSVgD1NY <SEP>367 <SEP>1987 <SEP>367
<tb> <SEP>64 <SEP>néant <SEP>452 <SEP>567 <SEP>222
<tb> <SEP>72 <SEP>néant <SEP>737 <SEP>2417 <SEP>905
* lymphocytes de sang périphérique

Les lymphocytes de sang périphérique provenant de tous les chimpanzés ont présenté des titres élevés d'incorporation de <3>H-thymidine (38 870 à 109 790 cpm) après stimulation par de la phytohémagglutinine (PHA, 2 mu g/ml) et des taux élevés d'incorporation de <3>H-thymidine (42 172 à 12 067 cpm) après stimulation par des lymphocytes de sang périphérique humain xénogène, groupé, ayant subi une irradiation par des rayons X. Les lymphocytes de sang périphérique provenant de chimpanzés immunisés par v-env5 et aussi le chimpanzé immunisé par v-HSVgD1NY, ont montré de fortes réponses de prolifération à des virus de la vaccine, alors que des lymphocytes de sang périphérique provenant de chimpanzés non immunisés n'ont pas proliféré en réponse à une stimulation par du virus de la vaccine.

Dans l'ensemble, les résultats présentés aux tableaux I à VI et sur les figures 11 à 13 indiquent que (a) le virus de vaccine recombinant v-env5 et sa contrepartie dans la souche de vaccin, v-env5NY, ont été capables de susciter des réponses immunologiques à médiation humorale et cellulaire spécifiques de LAV/HTLV III dans deux espèces de primates sub-humains, les macaques et les chimpanzés, et (b) que les virus recombinants n'ont pas supprimé les réponses immunologiques à médiation par les cellules ou lymphocytes T, in vitro ou in vivo.

DIMINUTION DE LA NEUROTOXICITE DE RECOMBINANTS CONSTRUITS AVEC LA SOUCHE V-NY DU VIRUS DE LA VACCINE

On a injecté dans le cerveau de groupes de cinq souris (souche ICR) des parties aliquotes de virus, contenant 5 x 10<7> unités de formation de plaques dans 25 à 50 mu l. On a coté le rapporté le rapport de mortalité 10 jours après inoculation.
<tb><TABLE> Columns=2
<tb>Title: Tableau VII
<tb>Head Col 01 to 02 AL=L: Mortalité de souris ayant subi une inoculation intracérébrale par des recombinants de la vaccine
<tb>SubHead Col 01 AL=L>Inoculation:
<tb>SubHead Col 02 AL=L>Animaux morts/
animaux traités par injection:
<tb> <SEP>v-NY <SEP>0/5
<tb> <SEP>v-env5NY <SEP>0/5
<tb> <SEP>n-env2NY <SEP>0/5
<tb> <SEP>v-env7NY <SEP>0/5
<tb> <SEP>vaccin antivariolique (Wyeth) <SEP>3/5
<tb> <SEP>v-env5 <SEP>5/5
<tb> <SEP>v-env2 <SEP>5/5
<tb> <SEP>v-env7 <SEP>5/5
<tb> <SEP>solution saline <SEP>0/5
<tb></TABLE>

Les résultats présentés au tableau VII indiquent que le virus de la vaccine provenant d'une culture tissulaire, purifié sur plaque (souche v-NY) et ses dérives v-env5NY, v-env2NY et v-env7NY, ont une neurotoxicité réduite en comparaison de la souche WR et de ses dérivés. Puisque la souche du "New York City Board of Health" (service de santé de la ville de New-York) a servi de vaccin anti-variolique, des recombinants basés sur cette souche devraient mieux convenir pour le développement d'un vaccin pour usage humain.

EXEMPLE 2: RECOMBINANTS GAG DE BACULOVIRUS

Dans l'exemple suivant, on a construit divers vecteurs de plasmides contenant des gènes chimères comprenant des séquences de codage de gag LAV/HTLV III situées en aval par rapport aux séquences de commande de transcription de AcNPV.

On a inséré ces gènes chimères, contenant le promoteur de polyédrine AcNPV et la séquence de codage gag de LAV/HTLV III, dans le génome de AcNPV, par recombinaison in vivo. De tels virus recombinants ont été identifiés et purifiés, et on a préparé des stocks de virus à partir de cellules de cultures tissulaires infectées. On a montré que des protéines immunoréactives, apparentées à gag de LAV/HTLV III, sont produites in vitro par le recombinant AcNPV. On a montré que les cellules infectées par des virus recombinants présentent une immunofluorescence positive. Enfin, des lysats de cellules infectées par AcNPV recombinant ont été positifs dans le dosage ELISA quand des essais ont eté effectués avec du sérum provenant de patients atteints de SIDA.

Une description détaillée de chaque étape de cette forme de réalisation de l'invention est présentée ci-après.

MODES OPERATOIRES GENERAUX

Cellules et virus

On a obtenu des cellules de Spodoptera frugiperda,clone Sf9, à l'American Type Culture Collection (ATCC n<o> CRL 1711) et l'on en a effectué la propagation dans du milieu Antheraea de Grace (Gibco, KC Biologicals) contenant 3,3 g/l d'un hydrolysat de levure (de Difco) et 3,3 g/l d'un hydrolysat de lactalbumine (Difco), 10% de sérum de foetus de bovin et 0,06 g/l de pénicilline ainsi que 0,1 g/l de streptomycine (milieu TNM-FH). On a cultivé les cellules à 28 DEG C. On a obtenu le virus de polyhédrose nucléaire Autographa californica du Dr Lois Miller (Department of Genetics and Entomology, University de Géorgie, Athènes, GA 30602, Etats-Unis d'Amérique) et l'on a purifié ce virus par plaque sur des cellules Sf9 contenant 1% de gélose et 0,8 x TNM-FH. Les dilutions de stocks de virus ont été réalisées dans TNM-FH.

PREPARATION, RESTRICTION ET MODIFICATIONS DE ADN

Les enzymes de restriction ont été achetées au Bethesda Research Laboratories Inc., et les conditions pour les digestions de restriction ont été celles suggérées par le fournisseur. On a utilisé le fragment de Kenow de l'ADN polymérisage de E. coli à 200 unités/ml dans du Tris-HCl 50 mM (pH 7,4), 6 mM de MgCl2, 10 mM 2-mercaptoéthanol à 37 DEG C durant 30 minutes.

On a préparé de l'ADN viral pour transfection à partir de stocks de virus non occlus (VNO) de virus de type sauvage, en utilisant le mode opératoire suivant de Miller, L.K; Miller D.W. et Safer, P.: on a obtenu un culot de centrifugation des particules de VNO pour les séparer du liquide surnageant à travers un coussin de 25% de saccharose, 5 mM de NaCl et 10 mM de EDTA, par centrifugation à 90 000 g durant 1 heure à 5 DEG C. On a enlevé le liquide surnageant et l'on a remis en suspension le culot de virus dans 0,5 ml de tampon de lyse (10 mM de Tris, pH 7,6, 10 mM de EDTA, 0,25% de SDS). Après remise en suspension du culot des virus, on a ajouté de la protéinase K jusqu'à une concentration finale de 500 ug/ml et l'on a fait incuber durant la nuit (environ 16 heures) à 37 DEG C avec agitation occasionnelle.

On a extrait l'ADN avec un égal volume de phénol:chloroforme:alcool isoamylique (25:24:1). On a ensuite précipité l'ADN à -20 DEG C par l'addition d'1/10 de volume d'acétate de sodium 3M à pH 5 et de 2 volumes d'éthanol froid. Après obention d'un culot de centrifugation, on a lavé l'ADN avec de l'éthanol à 70%, on l'a séché et remis en suspension dans TE (10 mM de Tris, 1 mM de EDTA, pH 7,5) avant de l'utiliser pour une transfection ou par analyse par enzyme de restriction.

On a préparé de l'ADN de plasmide en utilisant le mode opératoire de Summers, M.D. et Smith, G.E. comme suit: On a inoculé une seule colonie de cellules bactériennes, provenant d'une plaque fraîchement préparée, à 1 ml de bouillon Luria (BL) additionné d'un antibiotique approprié. Après incubation à 37 DEG C durant 12 à 18 heures, on a transféré le ml de culture dans 200 ml de bouillon Luria plus des antibiotiques dans un ballon de 500 à 1000 ml, et l'on a fait incuber dans un incubateur à secousses (37 DEG C) durant la nuit (12 à 18 heures). On a transféré les cultures, de 200 ml chacune, dans des bouteilles pour centrifugeuses, et l'on a centrifugé à 2500 t/min durant 10 minutes.

Après enlèvement du liquide surnageant, on a remis en suspension chaque culot de cellules dans 30 ml de tampon STET (8% de saccharose, 0,5% de Triton X-100, 50 mM de EDTA (pH 8,0), 10 mM de Tris-Cl, pH 8,0) à la température ambiante et l'on a transféré dans un ballon de 125 ml. Puis l'on a ajouté dans chaque ballon 3 ml de 10 mg/ml de lysozyme (préparé frais dans du tampon STET), et l'on a fait tourbillonner chaque ballon pour mélanger, puis l'on a fait incuber durant 5 minutes environ à la température ambiante. On a ensuite fait doucement tourbillonner chaque ballon (environ 1 fois toutes les 5 secondes) directement au-dessus d'une flamme jusqu'à ce que les cellules commencent à coaguler et à virer au blanc.

Au moment où des bulles se sont formées, on a transféré les ballons dans un bain d'eau bouillante durant 45 secondes, après quoi on a refroidi les ballons dans un bain d'eau glacée durant 2 minutes ou davantage. On a versé lentement les mélanges visqueux dans des tubes de centrifugeuses à fond rond, de 50 ml, et l'on a centrifugé durant 15 minutes à 16000 t/min en utilisant un rotor SW 28 (Beckman, CA) dans une centrifugeuse pour préparation. On a soigneusement versé le liquide surnageant de chaque tube dans un tube de centrifugeuse en polypropylène, à jeter après usage, et auquel on a ajouté un volume d'isopropanol ou deux volumes d'éthanol, et l'on a précipité l'ADN à -80 DEG C durant 20 minutes (ou -20 DEG C durant 2 heures ou davantage), et l'on a centrifugé à 2500 g durant 15 minutes ou davantage.

Après enlèvement de l'alcool, on a ajouté 2,5 ml de tampon pour extraction (par litre: 12,1 g de Tris, 33,6 g de Na2EDTA, 2H2O, 14,9 g de KCl, pH 7,5) au culot, que l'on a ensuite fait tourbillonner pour détacher le lysat du fond du tube. On a ajouté 100 mu l de 10 mg/ml de RNase A (dissous dans 0,1X TE et prétraité par 10 minutes d'ébullition) et l'on a fait incuber durant 30 minutes à 37 DEG C. On a ajouté dans chaque tube environ 200 mu g de protéinase K et l'on a ensuite fait incuber à 40-50 DEG C durant 30 minutes environ, au bout desquelles on a ajouté 250 mu l de "Sarkosyl" à 10% et l'on a poursuivi l'incubation durant 3 heures au moins. Afin de préparer des gradients de CsCl, on a ajouté dans chaque tube 80 mu l de 10 mg/ml de bromure d'éthidium par ml de solution de ADN.

Puis l'on a ajouté dans chaque tube 1,04 g de CsCl par ml de solution de ADN et l'on a fait doucement tourbillonner pour dissoudre. Après transfert dans des tubes "Quick Seal"<(R)>, on a centrifugé les gradients jusqu'à équilibre à 55 000 t/min durant 16 heures dans un rotor à angle fixe 70.1 Ti, ce qui a donné deux bandes visiblement bien séparées de ADN dans lesquelles la bande supérieure comprend l'ADN linéaire et entaillé alors que la bande inférieure comprend de l'ADN circulaire fermé par covalence. La bande inférieure (ADN circulaire fermé par covalence) a été collectée et versée dans un tube de centrifugeuse de 15 ml, en polypropylène, dans lequel on a ajouté de l'eau pour porter dans chaque tube le volume à environ 6 ml. On a extrait de l'ADN le bromure d'éthidium, en utilisant un volume égal d'alcool isoamylique, et l'on a enlevé et jeté la phase rose (supérieure).

On a répété l'extraction jusqu'à ce que la phase supérieure soit incolore, et que la phase inférieure (ADN) soit limpide et incolore. Il doit rester dans chaque tube environ 5 ml de solution de ADN (sinon, on ajoute de l'eau jusqu'à un volume final de 5 ml) auquel on a ajoute 2 volumes d'éthanol absolu. On a précipité l'ADN à -20 DEG C durant la nuit ou à -80 DEG C durant 10 minutes, et l'on a formé un culot par centrifugation à 2500 g durant 20 minutes. Après enlèvement de la totalité de l'alcool, on a ajouté à chaque culot 500 mu l de 0,1X TE, et l'on a mis le culot à nouveau en suspension à 65 DEG C durant 10 minutes au moins. On peut conserver l'ADN à 4 DEG C.

On a aussi préparé de l'ADN de plasmide comme décrit dans Maniatis et al., 1982, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory (page 8696). L'ADN-ligase a été achetée chez New England Biolabs, et on l'a utilisée à 10 000 unités//HTLV III gag dans le génome du virus de la vaccine, par recombinaison in vivo. On a identifié et purifié de tels virus recombinants, et l'on a préparé des stocks de virus à partir de cellules obtenues par culture sur tissu infecté. On a montré que des protéines immunoréactives apparentées à LAV/HTLV III gag, sont produites in vitro par les virus de vaccine recombinants. Une description détaillée de chaque étape dans cette forme de réalisation de l'invention est présentée ci-après.

Les modes opératoires généraux utilisés pour cette forme de réalisation ont été décrits ci-dessus à propos des recombinants d'enveloppe de vaccine.

Construction de plasmides vecteurs contenant un promoteur de virus de vaccine, relié par ligation aux séquences de codage du gène LAV/HTLV III gag

On a construit cinq plasmides vecteurs qui contenaient le promoteur 7,5K de virus de vaccine relié par ligation à diverses longueurs du génome de LAV/HTLV III contenant des séquences de codage de gag. La source des séquences de codage de LAV/HTLV III gag a été deux sous-clones apparentés de lambda J19 (Wain-Hobson et al, Cell 40: 1985), pKS- et pSS-5. Le plasmide pKS-5 contient un fragment de 3148 paires de base allant de SStI à KpnI (nucléotide n<o> 224 à n<o> 3372) de l'ADN de LAV/HTLV III inséré aux sites correspondants de pUC18. Le plasmide pSS-5 contient un fragment de 5107 paires de base de SstI à Sa1I (nucléotide no 224 à 5221) de l'ADN de LAV/HTLV III inséré aux sites correspondants de pUC18. On a inséré diverses longueurs de séquences de codage de gag, provenant de pKS-5 ou de pSS-5, dans le plasmide pGS62, qui est identique à PGS20 (Mackett et al., 1984, J.

Virol. 49:857-864), sauf qu'il comporte un unique site EcoRI situé en aval de l'unique site SmaI (voir figure 20). Les séquences spécifiques de LAV/HTLV III, insérées dans pGS62, commencent toutes avec un site ThaI (FnuDII) situé à 76 paires de base en amont du codon d'amorçage du gène gag. Les plasmides pv-gag1, pv-gag2, pv-gag3, pv-gag4 et pv-gag5 contiennent des séquences spécifiques de LAV/HTLV III allant de ce site ThaI jusqu'aux sites EcoRI (à 4194), KpnI (à 3372), EcoRv (à 2523), BclI (à 1975) ou BglII (à 1642), respectivement. La description de la construction de chaque plasmide, effectuée ci-après, est facilitée quand on se réfère à la figure 20.

Construction de pv-gag1: on a fait digérer jusqu'à achèvement 5 mu g de l'ADN de plasmide pSS-5 par des enzymes de restriction ThaI EcoRI. Les fragments résultants ont été résolus sur un gel à 1% de gélose LMP. On a isolé un fragment de 3,9 kbp, contenant les séquences de codage de LAV/HTLV III gag et on l'a fixé par ligation sur de l'ADN de pGS62 précédemment soumis à digestion avec SmaI et EcoRI. On a utilisé le mélange de ligation pour transformer E. coli HB101 et l'on a choisi des clones capables de résister à l'ampicilline. On a soumis des plasmides provenant de colonies individuelles à des essais pour déterminer la présence du fragment inséré de 3,9 kilopaires de base (kbp), par analyse de restriction et par la régénération du site EcoRI à la jonction de ligation.

La construction résultante contient la totalité de la séquence de codage des gènes gag et de protéase (prt), et une majeure partie du cadre de lecture ouverte pol, jusqu'au site EcoRI au nucléotide 4194.

Construction de pv-gag2: on a fait digérer 5 mu g du plasmide pKS-5, jusqu'à achèvement, avec des enzymes de restriction ThaI et SmaI. Le site SmaI de pKS-5 est situé près du site KpnI, qui est la jonction entre la séquence insérée en provenance de LAV/HTLV III et les sites de clonage multiples du plasmide pUC18. On a résolu les fragments résultants sur un gel à 1% de gélose LMP, et l'on a isolé un fragment de 3,2 kbp contenant des séquences correspondant à LAV/HTLV III gag, et l'on a effectué la ligation sur de l'ADN de pGS 62, soumis au préalable à digestion par SmaI et traité par CIAP. On a utilisé le mélange de ligation pour transformer E. coli HB101 et l'on a choisi des clones capables de résister à l'ampicilline.

On a soumis des plasmides, provenant de colonies individuelles, à des essais de présence du fragment comportant 3,1 kilopaires de bases, et l'on a déterminé par analyse par restriction l'orientation de l'insertion. La construction résultante pv-gag2, contient la totalité du gène gag, le gène prt et une partie du cadre de lecture ouvert pol jusqu'au site KpnI au nucléotide 3372.

La construction de pv-gag3 a été semblable à celle de pv-gag2, sauf que l'on a utilisé un fragment de 2,3 kbp, engendré par des digestions par ThaI et EcoRV de pKS-5, pour l'insertion au site SmaI de pGS62. La construction finale, pv-gag3, contient la totalité des gènes gag et prt et une petite partie de pol fusionnée sur la partie 3 min du gène TK de virus de vaccine.

Construction de pv-gag4: on a soumis à digestion, jusqu'à achèvement, par SStI et BclI 5 ug de ADN de plasmide pSS-5. On a purifié le fragment résultant, contenant la séquence correspondant à LAV/HTLV III gag. On a relié par ligation ce fragment à un plasmide vecteur pIC19R (Marsh et al., 1984, gène 32:481-485) préalablement découpé avec SstI et BamHI pour construire un plasmide intermédiaire. L'insertion de la séquence gag au site BamHI de pIC19R aboutit la juxtaposition du site BclI dans la séquence LAV/HTLV III sur le site EcoRI dans ce vecteur de clonage à sites multiples. La digestion de cette construction intermédiaire par les enzymes de restriction ThaI et ECoRI a engendré un fragment de 1,72 kilopaires de bases (kbp) que l'on a pu faci lement insérer dans le plasmide pGS62 aux sites SmaI et EcoRI.

La construction finale, pv-gag4, contient la totalité du gène LAV/HTLV III gag et une partie du gène prt fusionnée sur la partie 3 min du gène TK de virus de vaccine.

La construction du plasmide pv-gag5 a utilisé la même stratégie en deux étapes que pour pv-gag4. On a fait digérer 5 mu g de pSS-5 avec des enzymes de restriction SstI et Bg1II. On a isolé un fragment de 1,42 kbp, contenant la séquence correspondant à LAV/HTLV III gag, et l'on a purifié ce fragment sur un gel à 1% de gélose LMP et on l'a inséré dans le plasmide pIC19R aux sites SstI et BglII. Une ligation de la séquence gag au site BglII sur son site correspondant dans pIC19R permet (a) la formation d'un codon d'arrêt en phase avec le cadre de lecture ouverte gag, et (b) la juxtaposition du site Bg1II sur le site adjacent EcoRI sur le plasmide à sites multiples de clonage. Cette construction intermédiaire a été ensuite soumise à digestion avec ThaI et EcoRI.

On a purifié un fragment, de 1,39 kilopaires de bases contenant les séquences correspondant à LAV/HTLV III gag, et l'on a fixé par ligation ce fragment, aux sites SmaI et EcoRI, sur le plasmide pGS62. Le plasmide résultant, pv-gag5, contient la plupart, mais non pas la totalité, de la séquence de codage de gag (jusqu'au site Bg1II) fixée par ligation sur une séquence d'arrêt de translation dans le cadre.

Construction des virus de vaccine recombinants contenant des gènes chimères LAV/HTLV III gag

L'insertion de gènes chimères LAV/HTLV III gag provenant de plasmides vecteurs pv-gag1, pv-gag2, pv-gag3, pv-gag4 et pv-gag5, dans le génome du virus de vaccine, a été realisée par le même protocole que celui utilisé pour la construction de v-env5 et v-env2 (voir ci-dessus). Dans les exemples qui suivent, tous les virus recombinants ont été construits à l'aide de la souche, purifiée par plaques, provenant du "New York City Board of Health" (service de la santé de la ville de New York) (v-NY, voir ci-dessus). On a choisi des recombinants TK<-> et on les a purifiés sur plaque trois fois avant d'effectuer l'expansion en des stocks de virus que l'on a utilisés pour des caractérisations subséquentes.

Les virus recombinants provenant de pv-gag1, pv-gag2, pv-gag3, pv-gag4 et pv-gag5 ont été appelés v-gag1NY, v-gag2NY, v-gag3NY, v-gag4NY et v-gag5NY, respectivement.

Expression de protéines apparentées à LAV/HTLV III GAG dans des cellules de culture sur tissu infectées par des virus de vaccine recombinants

Les virus de vaccine recombinants, porteurs du gène chimère LAV/HTLV III gag, décrits ci-dessus, sont capables d'exprimer des protéines apparentées à LAV/HTLV III gag, quand on les introduit par infection dans des cellules de culture de tissu. Certains de ces recombinants ont été capables de faire passer la protéine correspondant à gag précurseur, p55, à l'état des protéines matures p25 et p18. On a constaté que ces protéines sont immunoréactives avec du sérum de patients atteints de SIDA et/ou avec des anticorps monoclonaux contre des protéines gag p25 ou p18.

On a infecté, à un taux d'infection de 10, des cellules BSC-40 confluentes, dans une boîte de 60 mm, par du virus de vaccine de type parental (v-NY) ou par ses dérivés recombinants, v-gag1NY, v-gag2NY, v-gag3NY, v-gag4NY ou v-gag5NY. On a laissé l'infection se poursuivre durant 12 heures, au bout desquelles on a récolté les cellules, on les a lavées une fois avec de la solution saline tamponnée par des phosphates et on les a collectées par centrifugation. On a remis les culots de centrifugation de cellules infectées en suspension dans 0,3 ml d'un tampon pour échantillons de Laemmli et l'on a effectué la lyse par 4 minutes d'ébullition. On a résolu la totalité de la protéine cellulaire dans 20 mu l de lysat de cellules par électrophorèse sur un gel à 15% de polyacrylamide-SDS.

On a inclus, à titre de témoins, un échantillon de virion purifié LAV/HTLV III et une partie aliquote d'un lysat de cellules infectées par des éléments non infectieux ("mock").

On a transféré par électrophorèse le contenu du gel sur une feuille d'un filtre en nitrocellulose. On a tout d'abord fait réagir le filtre avec du sérum de patients atteints de SIDA, ou avec une combinaison d'anticorps monoclonaux contre les protéines gag p25 et p18. Après des lavages poussés, on a ensuite fait réagir le filtre avec des anticorps d'immunoglobuline anti-humaine de chèvre conjugués sur de la phosphatase alcaline (à conjugaison AP) dans les cas où l'on a utilisé du sérum de patient, ou avec des anticorps d'immunoglobuline anti-souris de chèvre à conjugaison AP, dans les cas où l'on a utilisé des anticorps monoclonaux de souris. Les conditions pour les premières et secondes réactions avec les anticorps ainsi que pour les lavages ont été comme décrit ci-dessus à propos de l'identification des protéines apparentées dans l'enveloppe de LAV/HTLV III.

Le lavage final après la seconde réaction des anticorps a été effectué dans du Tris 0,1M (pH 9,5) avec 0,1 M NaCl et 5 mM de MgCl2. On a décelé de l'anticorps lié à des antigènes sur le filtre en faisant réagir le filtre avec une solution contenant 0,1 M de Tris (pH 9,5), 0,1 M de NaCl, 5 mM de MgCl2, 0,33 mg/ml de phosphate de bromo-chloro-indolyle, et 0,17 mg/ml de bleu de nitrotétrazolium. Après réaction des filtres avec les chromogènes, on a lavé les filtres à l'eau, on les a séchés à l'air et photographiés.

Les résultats de cette analyse sont présentés sur la figure 21. Les recombinants v-gag1NY et v-gag2NY contiennent la totalité des gènes gag et prt. Ces recombinants expriment une famille de protéines apparentées à LAV/HTLV III qui ont co-migré avec les protéines majeures gag de LAV/HTLV III, p55, p40, p25 et p18. Ces protéines ont été immunoréactives aussi bien avec du sérum de patients atteints de SIDA (figure 21B) qu'avec des anticorps monoclonaux de souris contre p25 et p18 (figure 21A). Le recombinant v-gag3NY contient les gènes gag et prt, mais son cadre de lecture ouverte pol est relié par ligation en phase avec la partie terminale carboxy du gène TK de vaccine. V-gag3NY a été capable aussi d'exprimer le produit primaire de gène gag, p55.

Cependant, le traitement de p55 semble avoir été moins efficace que dans le cas de v-gag1NY et v-gag2NY, puisqu'il y a eu beaucoup moins de p25 et de p18, par rapport à p55, dans des lysats de cellules infectés par v-gag3NY. Le recombinant v-gag4NY contient la totalité du gène gag, mais seulement une partie du gène prt. Il a synthétisé une protéine apparentée à LAV/HTLV III semblable en dimensions à p55. Le recombinant v-gag5NY contient une partie seulement du gène gag et a exprimé une protéine tronquée de 43 kD (figure 21C). Bien que v-gag4NY et v-gag5NY ne semblent pas avoir traité efficacement leurs protéines apparentées à gag primaire, leurs produits ont été immunoréactifs à l'égard d'anticorps monoclonaux contre p25 et p18.

En somme, malgré les différences de capacité de traitement, les cinq recombinants ont tous été capables d'exprimer des protéines immunoréactives qui contenaient les épitopes majeurs des protéines de noyau de LAV/HTLV III.

EXEMPLE: RECOMBINANTS D'ENVELOPPE DE BACULOVIRUS

Dans l'exemple suivant, on a construit un plasmide vecteur contenant un gène chimère comprenant les séquences de codage d'enveloppe de LAV/HTLV III logées en aval par rapport aux séquences de commande de transcription de AcNPV. Le gène chimère a contenu le promoteur de polyédrine AcNPV et la séquence de codage de LAV/HTLV III env a été insérée, par recombinaison in vivo, dans le génome de AcNPV. Le virus recombinant a été identifié et purifié, et l'on a préparé des stocks de virus à partir de cellules surnageantes infectées. Il a été montré que de la protéine immunoréactive apparentée à LAV/HTLV III env est produite in vitro par le baculovirus recombinant. Une description détaillée de chaque étape de cette forme de réalisation de l'invention est présentée ci-après.

Les modes opératoires généraux utilisés pour cette forme de réalisation sont tels que décrits ci-dessus pour les recombinants de baculovirus.

Construction de plasmides vecteurs contenant le promoteur AcNPV relié par ligation aux séquences codantes du gène LAV/HTLV III env

On a purifié la séquence codante (ou de codage) du gène LAV/HTLV III env à partir de pv-env5 (voir ci-dessus, dans la partie concernant la construction et la caractérisation du virus de vaccine recombinant contenant le gène chimère d'enveloppe de LAV/HTLV III), que l'on a utilisé pour la construction du virus de vaccine recombinant v-env5, dont on a montré qu'il exprime des protéines apparentées à env. La région de codage env dans pv-env, ainsi que les séquences non translatées de 96 paires de bases voisines de 5 min et de 223 paires de bases voisines de 3 min , a été entourée aux deux extrémités par des sites BamHI. Une digestion partielle de ce plasmide, qui a également contenu un site interne BamHI) à l'aide de l'enzyme de restriction BamHI a engendré un fragment de 2,9 kbp ne contenant que des séquences spécifiques de LAV/HTLV III.

On a résolu ce fragment (environ 0,5 ug) et on l'a purifié à partir d'un gel à 1% de gélose LMP, et on en a effectué la ligation sur 0,5 mu g du plasmide vecteur pAc610, qui avait été au préalable linéarisé à l'aide de BamHI et traité par CIAP. On a utilisé le mélange de ligation pour transformer la souche MC1000 de E coli et l'on a choisi les colonies résistantes à l'ampicilline. On a soumis l'ADN de plasmide de transformants individuels à des essais de détermination de la présence des séquences correspondant à LAV/HTLV III env (c'est-à-dire la formation, par digestion par BamHI, des fragments de 2,3 Kbp et de 0,54 Kbp) et pour déterminer l'orientation de la partie insérée. Le plasmide comportant la séquence correspondant à LAV/HTLV III env, insérée dans l'orientation correcte, a été purifié et appelé pAc-env5.

Sa structure est représentée sur la figure 22.

Construction du baculovirus recombinant contenant le gène chimère LAV/HTLV III env

On réalise l'insertion du gène chimère LAV/HTLV III env dans le génome de AcNPV par recombinaison in vivo, comme expliqué ci-dessus (construction du baculovirus recombinant contenant le gène chimère LAV/HTLV III gag). L'introduction par transfection de 1 mg d'ADN de AcNPV, 5 mg d'ADN de pAc- env5 et 15 mg d'ADN de thymus de veau dans les cellules Sf9 a été réalisée comme décrit dans les mêmes paragraphes précités. Après 5 jours d'incubation à 28 DEG C avec 4 ml de milieu complet, on a collecté les parties surnageantes et on les a clarifiées par centrifugation à 1000 g durant 10 minutes. On a titré le stock de virus sur les cellules Sf9, et l'on a d'abord identifié, par l'essai d'hybridation de plaque de M.D. Summers et G.E. Smith, comme suit, le virus recombinant:

On a ensemencé des cellules Sf9 sur des plaques de culture de 60 x 15 mm à une densité de 2,5 x 10<6> cellules par plaque dans un milieu TNM-FH sans sérum. Après fixation des cellules, on a enlevé le milieu et l'on a ajouté à chaque plaque 1 ml d'un inoculum de virus dilué. Au bout d'1 heure d'incubation à 27 DEG C, on a enlevé la totalité de l'inoculum de chaque plaque et l'on a lentement ajouté au bord de chaque plaque 4 ml d'une couche supérieure de gélose LMP. Une fois la couche supérieure solidifiée, on a fait incuber les plaques dans un environnement humide durant 4 à 6 jours, ou jusqu'à bonne formation des colonies ou plaques de cellules. On a ensuite laissé sécher les plaques de gélose durant la nuit ou plus longtemps, en les abandonnant dans un environnement non humidifié.

Quand elles ont été suffisamment sèches, on a enlevé les couches supérieures de gélose et l'on a placé un filtre en nitrocellulose sèche par-dessus les cellules demeurant dans la plaque de culture. On a saturé avec une solution A (0,05 M de Tris-HCl, pH 7,4 et 0,15 M de NaCl) un cercle de 47 mm de papier 3 MM Whatman et l'on a placé ce papier par-dessus-le filtre en nitrocellulose dans la plaque de culture. Après absorption, on a soigneusement enlevé le filtre en nitrocellulose et on l'a placé (le côté des cellules par-dessus) sur un papier filtre Whatman saturé d'une solution B (0,5N de NaOH, 1,5 M de NaCl). Après 2 à 3 minutes, on a séché à l'air le filtre en nitro-cellulose sur des serviettes en papier et on l'a transféré sur un papier filtre Whatman saturé d'une solution C (1,0 M de Tris-HCl, pH 7,4; 1,5 M de NaCl).

Au bout de 2 à 3 minutes, on a séché à l'air sur des serviettes en papier le filtre en nitrocellulose, et on l'a lavé par immersion ménagée dans une boîte de Pétri emplie d'une solution D (0,3 M en NaCl, 0,03 M de citrate de sodium). On a ensuite enlevé le filtre et on l'a séché sur des serviettes en papier, et on l'a chauffé à 80 DEG C durant 2 heures sous vide. On a fixé par hybridation le filtre sur pRS-3 marqué par <3><2>p, comme sonde. On a prélevé des virus recombinants et on les a titrés à nouveau sur des cellules Sf9. On a identifié, par examen visuel, des plaques de cellules sans occlusion. On les a purifiées trois fois encore et on les a utilisées pour préparer des stocks de virus pour des études subséquentes.

Expression de protéines apparentées à LAV/HTLV III env dans des cellules de culture tissulaire infectées par du baculovirus recombinant Ac-env5

Il a été montré que AcNPV recombinant, portant le gène chimère LAV/HTLV III env, est capable d'exprimer les protéines apparentées à LAV/HTLV III env, par infection de cellules dans une culture sur tissu. On a trouvé que ces protéines sont immunoréactives avec du sérum provenant de patients atteints de SIDA ainsi qu'avec des anticorps monoclonaux qui définissent des glycoprotéines gp110 et gp41 apparentées à l'enveloppe de LAV/HTLV III.

On a infecté des cellules Sf9 (1 x 10<7>) ensemencées sur une boîte de 100 mm, avec AcNPV de type sauvage, ou son recombinant Ac-env5, à un indice d'infection de 5. 28 heures après l'infection, on a remplacé le milieu par du milieu sans méthionine ne comportant pas de sérums supplémentaires, et l'on a fait incuber durant 30 minutes. Après cette période, on a remplacé le milieu par 2 ml d'un milieu sans méthionine contenant 100 mu Ci/ml de [<3><5>S] méthionine, et on a laissé le marquage se poursuivre durant 2 heures à 28 DEG C.

A la fin de la période de marquage, on a lavé les cellules deux fois avec une solution saline tamponnée par du phosphate et on les a remises en suspension dans 1 ml de tampon de lyse, comme décrit ci-dessus à propos de l'identification de protéines apparentées à l'enveloppe de LAV/HTLV III, exprimées dans des cellules infectées par du virus de vaccine recombinant, en utilisant des techniques d'immunoprécipitation). On a effectué l'immunoprécipitation comme décrit dans les paragraphes précités, en utilisant du sérum de patients atteints de SIDA aussi bien que des anticorps monoclonaux de souris contre gp110 ou gp41.

Les résultats de cette analyse, tels que présentés sur la figure 23, indiquent que le virus recombinant Ac-env5 a synthétisé surtout une protéine de 150 kD, apparentée à l'enveloppe de LAV/HTLV III. Puisqu'elle comigre avec gp150 synthétisée par le recombinant de vaccine v-env5 et qu'elle a été immunoréactive avec du sérum de patient atteint de SIDA ainsi qu'avec des anticorps monoclonaux contre gp110 et gp41, cette protéine représente le précurseur glycosylé de la protéine d'enveloppe gp150. Le traitement de transformation de cette molécule n'a pas été efficace, puisque l'on n'a pas décelé de gp110 ni gp41 au cours de la période des 2 heures de marquage. Cependant, puisque les épitopes majeurs de gp110 et gp41 sont présents sur le précurseur, cette protéine est potentiellement intéressante aussi bien comme réactif pour diagnostic que comme immunogène.

DEPOT DE MICRO-ORGANISMES

Les souches suivantes de E. coli, portant les plasmides énumérés, ont été déposées au service appelé "Agricultural Research Culture Collection (NRRL)", 1815 North University Street, Peoria, Illinois 61 604, (Etats-Unis d'Amérique) et ont reçu les numéros suivants d'inscription:
<tb><TABLE> Columns=5
<tb>Head Col 01 AL=L: E. coli
<tb>Head Col 02 AL=L: Souche
<tb>Head Col 03 AL=L: Plasmide
<tb>Head Col 04 AL=L: No d'inscription
<tb>Head Col 05 AL=L:

Date de dépôt
<tb> <SEP>K12 <SEP>MC1000 <SEP>pv-env1 <SEP>NRRL B-18003 <SEP>19. 09. 85
<tb> <SEP>K12 <SEP>MC1000 <SEP>pv-env2 <SEP>NRRL b-18004 <SEP>19. 09. 85
<tb> <SEP>K12 <SEP>MC1000 <SEP>pv-env5 <SEP>NRRL B-18005 <SEP>19. 09. 85
<tb> <SEP>K12 <SEP>MC1000 <SEP>pv-env7 <SEP>NRRL B-18110 <SEP>05. 09. 86
<tb> <SEP>K12 <SEP>HB101 <SEP>pv-gag1 <SEP>NRRL B-18111 <SEP>05. 09. 86
<tb> <SEP>K12 <SEP>HB101 <SEP>pAc-gag1 <SEP>NRRL B-18105 <SEP>29. 08. 86
<tb> <SEP>K12 <SEP>NF1829 <SEP>pAc-env5 <SEP>NRRL B-18109 <SEP>05. 09. 86
<tb></TABLE>

Les virus recombinants suivants ont été déposés à l'American Type Culture Collection, 12 301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20 852, Etats-Unis d'Amérique, et ont reçu les numéros de dépôt
<tb><TABLE> Columns=3
<tb>Head Col 01 AL=L: Virus recombinant
<tb>Head Col 02 AL=L: Numéro de dépôt
<tb>Head Col 03 AL=L: Date de dépôt
<tb> <SEP>v-env2 <SEP>ATCC VR 2114 <SEP>20. 09. 85
<tb> <SEP>v-env5 <SEP>ATCC VR 2213 <SEP>20. 09. 85
<tb> <SEP>v-env7 <SEP>ATCC VR 2148 <SEP>05. 09. 86
<tb> <SEP>v-env5NY <SEP>ATCC VR 2149 <SEP>05. 09. 86
<tb> <SEP>v-gag1NY <SEP>ATCC VR 2150 <SEP>05. 09. 86
<tb> <SEP>Ac-gag1 <SEP>ATCC VR 2147 <SEP>29. 08. 86
<tb> <SEP>Ac-env5 <SEP>ATCC VR 2151 <SEP>05. 09. 86
<tb></TABLE>

On ne doit pas considérer que le cadre de la présente invention se limite seulement aux micro-organismes et virus déposés, puisque ce qui est déposé constitue une simple illustration d'un aspect de l'invention et que tous les micro-organismes ou virus fonctionnellement équivalents entrent dans le cadre de la présente invention. Il va de soi que, sans sortir du cadre de l'invention, de nombreuses modifications peuvent être apportées aux virus recombinants, à leurs génomes chimères et protéines ou peptides et aux formulations de vaccins, décrits et représentés.

Il va également de soi que toutes les dimensions données pour les paires de bases des nucléotides constituent des renseignements approximatifs fournis à titre surtout descriptif.

Claims

1. Virus recombinant, caractérisé en ce que son génome comprend une séquence de nucléotides codant pour un épitope de l'enveloppe ou du gène gag de virus LAV/HTLV III, ou pour une portion antigénique de l'épitope d'enveloppe ou de gag, dans laquelle la séquence de nucléotides codant pour le gène de l'enveloppe comprend la séquence telle que représentée sur la Figure 2, du nucléotide No 5767 au nucléotide No 8549 ou toute portion de cette séquence codant pour un peptide ou une protéine antigénique, ou dans laquelle la séquence de nucléotides du gène gag comprend la séquence telle que représentée sur la Figure 14, du nucléotide No 340 au nucléotide No 1835 ou toute portion de cette séquence codant pour un peptide ou une protéine antigénique,

ladite séquence de nucléotides étant sous le contrôle d'une seconde séquence de nucléotides qui règle l'expression du gène de manière qu'un peptide, ou une protéine apparenté(e) à l'épitope de LAV/HTLV III soit exprimé(e) dans un hôte infecté par le virus.

2. Virus recombinant selon la revendication 1, caractérisé en ce que le peptide ou la protéine exprimé(e) dans l'hôte infecté est apparenté(e) à un épitope d'enveloppe de LAV/HTLV III, ou toute portion antigénique de ce virus ou du peptide ou protéine d'expression.

3. Virus recombinant selon la revendication 2, caractérisé en ce que l'épitope d'enveloppe comprend un peptide ou une protéine ayant une séquence d'aminoacides telle que représentée sur la Figure 2 du reste aminoacide No 1 au reste 861, ou toute portion antigénique de cette séquence.

4.

Virus recombinant selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'il comprend un virus comportant une enveloppe.

5. Virus recombinant selon la revendication 4, caractérisé en ce qu'il est ou comprend un virus de vaccine.

6. Virus de vaccine recombinant v-env5 selon la revendication 1, tel que le virus ATCC VR 2113 ou un mutant.

7. Virus de vaccine recombinant v-env2 selon la revendication 1, tel que le virus ATCC VR 2114 ou un mutant.

8. Virus de vaccine recombinant v-env7 selon la revendication 1, tel que le virus ATCC VR 2148 ou un mutant.

9. Virus de vaccine recombinant v-env5NY selon la revendication 1, tel que le virus ATCC VR 2149 ou un mutant.

10. Virus recombinant selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'il est ou comprend un baculovirus.

11.

Virus recombinant selon la revendication 10, caractérisé en ce qu'il est ou comprend un virus de polyédrose nucléaire.

12. Baculovirus recombinant Ac-env5 selon la revendication 10, tel que le virus ATCC VR 2151 ou un mutant.

13. Virus recombinant selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'il est ou comprend un virus nu.

14. Virus recombinant selon la revendication 13, caractérisé en ce qu'il est ou comprend un adénovirus.

15. Virus recombinant selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'il est ou comprend un bactériophage.

16. Virus recombinant selon la revendication 1, caractérisé en ce que le peptide ou la protéine exprimé(e) dans l'hôte infecté est apparenté(e) à un épitope de protéine de noyau de LAV/HTLV III ou à toute portion antigénique de cet épitope.

17.

Virus recombinant selon la revendication 16, caractérisé en ce que l'épitope comprend un peptide ou une protéine ayant une séquence d'amioacides telle que représenté sur la Figure 14 du reste d'amioacides n<o> 1 à 500, ou toute portion antigénique de cette séquence.

18. Virus recombinant selon l'une des revendications 16 et 17, caractérisé en ce qu'il est ou comprend un virus à enveloppe.

19. Virus recombinant selon la revendication 18, caractérisé en ce qu'il est ou comprend un virus de vaccine.

20. Virus de vaccine recombinant v-gag1NY selon la revendication 19, tel que le virus ATCC VR-2150 ou un mutant.

21. Virus recombinant selon l'une des revendications 16 et 17, caractérisé en ce qu'il est ou comprend un baculovirus.

22. Baculovirus selon la revendication 21, caractérisé en ce qu'il est ou comprend un virus de polyhédrose nucléaire.

23.

Baculovirus recombinant Ac-gag1 selon la revendication 22, tel que le virus ATCC VR-2147 ou un mutant.

24. Virus recombinant selon l'une des revendications 16 et 17, caractérisé en ce qu'il est ou comprend un virus nu.

25. Virus recombinant selon la revendication 24, caractérisé en ce qu'il est ou comprend un adénovirus.

26. Virus recombinant selon l'une des revendications 16 et 17, caractérisé en ce qu'il est ou comprend un bactériophage.

27. Procédé pour la préparation d'un peptide ou d'une protéine antigénique apparenté(e) à un épitope de virus LAV/HTLV III caractérisé par la mise en oeuvre, dans un hôte approprié, du virus recombinant selon la revendication 1.

28. Procédé selon la revendication 27, caractérisé en ce que l'épitope comprend une glycoprotéine d'enveloppe de LAV/HTLV III.

29.

Procédé selon la revendication 28, caractérisé en ce que l'épitope a une séquence d'aminoacides telle que décrite sur la figure 2, du reste aminoacide No 1 au reste 861, ou toute portion antigénique de cette séquence.

30. Procédé selon l'une des revendications 27 à 29, caractérisé en ce qu'on purifie le peptide ou la protéine obtenu(e) de l'hôte approprié cultivé.

31. Procédé selon la revendication 27, caractérisé en ce que l'hôte approprié cultivé est ou comprend un microorganisme.

32. Procédé selon la revendication 31, caractérisé en ce que le microorganisme est ou comprend une bactérie.

33. Procédé selon la revendication 31, caractérisé en ce que le microorganisme est ou comprend une levure.

34. Procédé selon la revendication 27, caractérisé en ce que l'hôte approprié cultivé est ou comprend une lignée de cellules animales.

35.

Procédé selon la revendication 34, caractérisé en ce que le peptide ou la protéine est produit(e) par des cellules animales infectées par le virus de vaccine recombinant v-env5, tel que le virus ATCC VR 2113 ou un mutant.

36. Procédé selon la revendication 34, caractérisé en ce que le peptide ou la protéine est produit(e) par des cellules infectées par le virus de vaccine recombinant v-env2, tel que le virus ATCC VR 2114 ou un mutant.

37. Procédé selon la revendicaion 34, caractérisé en ce que le peptide ou la protéine est produit(e) par des cellules animales infectées par le virus de vaccine recombinant v-env7, le que le virus ATCC VR 2148 ou un mutant.

38.

Procédé selon la revendication 34, caractérisé en ce que le peptide ou la protéine est produite par des cellules animales infectées par le virus de vaccine recombinant v-env5NY, tel que le virus ATCC VR 2149 ou un mutant.

39. Procédé selon la revendication 27, caractérisé en ce que l'hôte approprié cultivé est ou comprend une lignée de cellules d'insectes.

40. Procédé selon la revendication 39, caractérisé en ce que le peptide ou la protéine est produit(e) par des cellules d'insectes infectées par le baculovirus recombinant Ac-env5, tel que le baculovirus ATCC VR 2151 ou un mutant.

41. Procédé selon la revendication 27, caractérisé en ce que l'épitope comprend un épitope de protéine de noyau.

42.

Procédé selon la revendication 41, caractérisé en ce que l'épitope a une séquence d'aminoacides telle que représenté sur la figure 14 à partir du reste d'aminoacide numéro 1 à 500 ou toute portion antigénique de cette séquence.

43. Procédé selon la revendication 41 ou 42, caractérisé en ce que'on purifie le peotide ou la protéine obtenu(e) de l'hôte approprié cultivé.

44. Procédé selon la revendication 43, caractérisé en ce que l'hôte approprié cultivé est ou comprend un microorganisme.

45. Procédé selon la revendication 44, caractérisé en ce que le microorganisme est ou comprend une bactérie.

46. Procédé selon la revendication 44, caractérisé en ce que le microorganisme est ou comprend une levure.

47. Procédé selon la revendication 43, caractérisé en ce que l'hôte approprié cultivé est ou comprend une lignée de cellules animales.

48.

Procédé selon la revendication 47, caractérisé en ce que le peptide ou la protéine est produit(e) par des cellules animales infectées par le virus de vaccine recombinant v-gag1NY, tel que le virus ATCC VR 2150 ou un mutant.

49. Procédé selon la revendication 43, caractérisé en ce que l'hôte approprié est ou comprend une lignée de cellules d'insectes.

50. Procédé selon la revendication 49, caractérisé en ce que le peptide ou la protéine est produit par des cellules d'insectes infectées par le baculovirus recombinant Ac-gag1, tel que le baculovirus ATCC VR 2147 ou un mutant.

51. Peptide ou protéine tel qu'obtenu(e) au moyen du procédé selon l'une des revendications 27 à 50.

52.

Procédé pour la préparation d'un peptide ou d'une protéine antigénique apparenté(e) à un épitope de virus LAV/HTLV III, caractérisé en ce que l'on détermine la séquence des aminoacides du peptide ou de la protéine obtenu(e) au moyen de procédé selon l'une des revendications 27 à 50 d'après la séquence des nucléotides du gène chimère contenu dans le virus recombinant et que l'on synthétise le peptide ou la protéine par voie chimique.

53. Peptide ou protéine tel qu'obtenu(e) au moyen du procédé selon la revendication 52.

54. Formulation de vaccin à virus vivant, caractérisé en ce qu'elle comprend un virus recombinant selon l'une des revendications 1 à 3, ce virus étant infectieux sans provoquer de maladie pour l'hôte à vacciner.

55. Formulation de vaccin à virus vivant selon la revendication 54, caractérisée en ce que le virus est ou comprend un virus à enveloppe.

56.

Formulation de vaccin à virus vivant selon la revendication 55, caractérisée en ce que le virus à enveloppe est ou comprend un virus de vaccine.

57. Formulation de vaccin à virus vivant selon la revendication 54, caractérisée en ce qu'elle comprend une dose infectieuse du virus de vaccine v-env5 selon la revendication 6.

58. Formulation de vaccin à virus vivant selon la revendication 54 caractérisée en ce qu'elle comprend une dose infectieuse du virus de vaccine v-env2 de la revendication 7.

59. Formulation de vaccin à virus vivant selon la revendication 54, caractérisée en ce qu'elle comprend une dose infectieuse du virus de vaccine v-env7 selon la revendication 8.

60. Formulation de vaccin à virus vivant selon la revendication 54, caractérisée en ce qu'elle comprend une dose infectieuse du virus de vaccine v-env5NY selon la revendication 9.

61.

Formulation de vaccin à virus vivant selon la revendication 54, caractérisée en ce que le virus est ou comprend un virus nu.

62. Formulation de vaccin à virus vivant selon la revendication 61, caractérisée en ce que le virus nu est ou comprend un adénovirus.

63. Procédé de préparation de formulation de vaccin à virus vivant selon la revendication 54 à partir d'un virus recombinant selon l'une des revendications 1 à 3.

64. Formulation de vaccin multivalent à virus vivants, caractérisée en ce qu'elle comprend un virus recombinant selon l'une des revendications 2 ou 3 et un virus recombinant selon la revendication 16 ou 17, les deux virus recombinants étant infectieux sans provoquer de maladie pour l'hôte à vacciner.

65. Formulation de vaccin multivalent selon la revendication 64, caractérisée en ce que chaque virus recombinant comprend un virus à enveloppe.

66.

Formulation de vaccin multivalent à virus vivant selon la revendication 64, caractérisée en ce que chaque virus à enveloppe est ou comprend un virus de vaccine.

67. Formulation de vaccin multivalent selon la revendication 64, caractérisée en ce qu'elle comprend une dose infectieuse de: (a) du virus de vaccine v-env5 selon la revendication 6, v-env2 selon la revendication 7, v-env7 selon la revendication 8 ou v-env5NY selon la revendication 9; et (b) du virus de vaccine v-gag1NY selon la revendication 20.

68. Procédé de préparation de formulation de vaccin mutivalent à virus vivants selon la revendication 64 à partir d'un virus recombinant selon l'une des revendications 2 ou 3 et d'un virus recombinant selon la revendication 16 ou 17.

69.

Formulation de vaccin à virus inactivé, caractérisée en ce qu'elle comprend une dose efficace du virus recombinant selon l'une des revendications 1 à 3, à un état non infectieux, en mélange avec un excipient pharmaceutique.

70. Formulation de vaccin à virus inactivé selon la revendication 69, caractérisée en ce qu'elle comprend une dose efficace du virus recombinant à enveloppe selon la revendication 4, à un état non infectieux, en mélange avec un excipient pharmaceutique.

71. Formulation de vaccin à virus inactivé selon la revendication 69, caractérisée en ce qu'elle comprend une dose efficace du virus de la vaccine de la revendication 5, à un état non infectieux, en mélange avec un excipient pharmaceutique.

72.

Formulation de vaccin à virus inactivé selon la revendication 69, caractérisée en ce qu'elle comprend une dose efficace du virus de vaccine v-env5 selon la revendication 6, à un état non infectieux, en mélange avec un excipient pharmaceutique.

73. Formulation de vaccin à virus inactivé selon la revendication 69, caractérisée en ce qu'elle comprend une dose efficace du virus de vaccine v-env2 selon la revendication 7 à un état non infectieux, en mélange avec un excipient pharmaceutique.

74. Formulation de vaccin à virus inactivé selon la revendication 69, caractérisée en ce qu'elle comprend une dose efficace du virrus de vaccine v-env7 selon la revendication 8, à un état non infectieux, en mélange avec un excipient pharmaceutique.

75.

Formulation de vaccin à virus inactivé selon la revendication 69, caractérisée en ce qu'elle comprend une dose efficace du virus de vaccine v-env5NY selon la revendication 9, à un état non infectieux, en mélange avec un excipient pharmaceutique.

76. Formulation de vaccin multivalent à virus inactivé, caractérisée en ce qu'elle comprend une dose efficace: (a) du virus recombinant selon l'une des revendications 2 ou 3, qui exprime l'épitope apparenté à l'enveloppe de LAV/HTLV III; et (b) du virus recombinant selon la revendication 16 ou 17, qui exprime l'épitope, apparenté au noyau de LAV/HTLV III, chaque virus recombinant étant à un état non infectieux, en mélange avec un excipient pharmaceutique.

77. Formulation de vaccin multivalent à virus inactivés selon la revendication 76, caractérisée en ce que chaque virus recombinant est ou comprend un virus à enveloppe.

78.

Formulation de vaccin multivalent à virus inactivés selon la revendication 77, caractérisée en ce que chaque virus à enveloppe est ou comprend un virus de vaccine.

79. Formulation de vaccin multivalent à virus inactivés selon la revendication 76, caractérisée en ce qu'elle comprend une dose efficace de: (a) du virus de vaccine v-env5 de la revendication 6, v-env2 de la revendication 7, ou v-env7 de la revendication 8, ou v-env5NY de la revendiaction 9; et (b) du virus de vaccine v-gag1NY de la revendication 20.

80. Formulation de vaccin à sous-unités, caractérisée en ce que l'immunogène comprend une dose efficace du peptide ou de la protéine selon la revendication 51, en mélange avec un excipient pharmaceutique.

81.

Formulation de vaccin multivalent à sous-unités, caractérisée en ce qu'elle comprend une dose efficace de: (a) un premier peptide ou une première protéine selon la revendication 51; et (b) un second peptide ou une seconde protéine selon la revendication 51, en mélange avec un excipient pharmaceutique.

82. Vecteur de ADN recombinant pour la production d'un virus recombinant selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend pv-env1 NRRL B-18 003.

83. Organisme unicellulaire, caractérisé en ce qu'il comprend le vecteur de ADN recombinant selon la revendication 82.

84. Organisme selon la revendication 83 sous forme de bactérie, caractérisé en ce qu'il comprend le vecteur de ADN recombinant selon la revendication 82.

85. Organisme selon la revendication 84, caractérisé en ce qu'il comprend Escherichia coli NRRL B-18 003 ou un mutant.

86.

Vecteur de ADN recombinant pour la production d'un virus recombinant selon la revendication 7, caractérisé en ce qu'il comprend pv-env2 NRRL B-18 004.

87. Organisme unicellulaire caractérisé en ce qu'il comprend le vecteur de ADN recombinant selon la revendication 86.

88. Organisme selon la revendication 87 sous forme de bactérie, caractérisé en ce qu'il comprend le vecteur de ADN recombinant selon la revendication 86.

89. Organisme selon la revendication 88, caractérisé en ce qu'il comprend Escherichia coli NRRL B-18 004 ou un mutant.

90. Vecteur de ADN recombinant pour la production d'un virus recombinant selon la revendication 6, caractérisé en cequ'il comprend pv-env5 NRRL B-18 005.

91. Organisme unicellulaire caractérisé en ce qu'il comprend le vecteur de ADN recombinant selon la revendication 90.

92.

Organisme selon la revendication 91 sous forme de bactérie, caractérisé en ce qu'il comprend le vecteur de ADN recombinant selon la revendication 90.

93. Organisme selon la revendication 92, caractérisé en ce qu'il comprend Escherichia coli NRRL B-18 005 ou un mutant.

94. Vecteur de ADN recombinant pour la production du virus recombinant selon la revendication 8, caractérisé en ce qu' il comprend pv-env7 NRRL B-18 110.

95. Organisme unicellulaire, caractérisé en ce qu'il comprend le vecteur de ADN recombinant selon la revendication 94.

96. Organisme selon la revendication 95 sous forme de bactérie, caractérisé en ce qu'il comprend le vecteur de ADN recombinant selon la revendication 94.

97. Organisme selon la revendication 96, caractérisé en ce qu'il comprend Escherichia coli NRRL B-18 110 ou un mutant.

98.

Vecteur de ADN recombinant pour la production du virus recombinant selon la revendication 20, caractérisé en ce qu' il comprend pv-gag1NY NRRL B-18 111.

99. Organisme unicellulaire, caractérisé en ce qu'il comprend le vecteur de ADN recombinant selon la revendication 98.

100. Organisme selon la revendication 99 sous forme de bactérie, caractérisé en ce qu'il comprend le vecteur selon la revendication 98.

101. Organisme selon la revendication 100, caractérisé en ce qu'il comprend Escherichia coli NRRL B-18 111 ou un mutant.

102. Vecteur de ADN recombinant pour la production du virus recombinant selon la revendication 23, caractérisé en ce qu' il comprend pAc-gag1 NRRL B-18 105.

103. Organisme unicellulaire caractérisé en ce qu'il comprend le vecteur de ADN recombinant selon la revendication 102.

104.

Organisme selon la revendication 103 sous forme de bactérie, caractérisé en ce qu'il comprend le vecteur de ADN recombinant selon la revendication 102.

105. Organisme selon la revendication 104, caractérisé en ce qu'il comprend Escherichia coli NRRL B-18 105 ou un mutant.

106. Vecteur de ADN recombinant pour la production du virus recombinant selon la revendication 12, caractérisé en ce qu'il comprend pAc-env5 NRRL B-18 109.

107. Organisme unicellulaire, caractérisé en ce qu'il comprend le vecteur de ADN recombinant selon la revendication 106.

108. Organisme selon la revendication 107, sous forme de bactérie, caractérisé en ce qu'il comprend le vecteur de ADN recombinant selon la revendication 106.

109. Organisme selon la revendication 108, caractérisé en ce qu'il comprend Escherichia coli NRRL B-18 109 ou un mutant.