JPH11507515A

JPH11507515A - 遺伝的に改変したネコ免疫不全症ウイルス、およびネコ免疫不全症ウイルス感染症に対する有効なワクチンとしてのその使用

Info

Publication number: JPH11507515A
Application number: JP9501172A
Authority: JP
Inventors: チャベス，ロイド・ジョージ・ジュニア; ワスモン，テリー; フアン，チェンリン
Original assignee: アメリカン・ホーム・プロダクツ・コーポレイション
Priority date: 1995-06-07
Filing date: 1996-06-03
Publication date: 1999-07-06
Also published as: EP0832265A1; ZA964679B; WO1996040953A1; CO4480038A1; AU6037296A; AU719034B2; NZ310055A; CA2223969A1; US6300118B1; BR9608716A

Abstract

(57)【要約】本発明は、ネコ免疫不全症ウイルス(ＦＩＶ)によって引き起こされる疾病を予防するためのワクチンとして有用な組換えアライグマポックスウイルス(ＲＲＰＶ)を提供する。本発明によるＲＲＰＶは、ＦＩＶｇａｇ蛋白質(ｇａｇ)，ＦＩＶエンベロープ蛋白質(ｅｎｖ)、ＦＩＶｅｎｖのアミノ酸１-７３５よりなるポリペプチド、または前記いずれかからの免疫原性フラグメントをコードするＤＮＡ配列を含む少なくとも１個の内部遺伝子を有する。前記の１または２以上のＦＩＶ-発現組換えアライグマポックスウイルスを含むワクチンは、医薬上許容される担体または希釈剤と医薬上許容されるアジュバントをも含み得る。本発明は、また、前記をワクチンをかかる治療を要するネコに投与することによって行う、ＦＩＶによって引き起こされる疾病を予防または軽減するための方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】遺伝的に改変したネコ免疫不全症ウイルス、およびネコ免疫不全症ウイルス感染症に対する有効なワクチンとしてのその使用発明の分野本発明は、遺伝的に改変したネコ免疫不全症ウイルス（ＦＩＶ）ビリオンを使用する、ＦＩＶによって引き起こされる疾病の予防および治療に関する。詳細には、ＲＮＡのビリオンへのパッキングを担う蛋白質をコードするｐ１０遺伝子の一部分を欠失させた。得られたビリオンを適当な宿主細胞系統で産生させ、これを用いて、ウイルスＲＮＡを含まない全死菌ビリオンを含むワクチンを生成する。発明の背景ネコ免疫不全症ウイルス(ＦＩＶ)感染症は、世界中の飼いネコにとって重要な健康問題である。そのヒト相当物においては、ＦＩＶの感染は免疫機能の進行的な破壊を引き起こす。感染の急性期においては、該ウイルスは、リンパ節疾患、発熱、および好中球減少症のごとき症状に関連する過渡的な疾患を引き起こす。つづいて、感染した動物は、免疫不全の臨床的発現が明らかとなる前に１-２年の無症候性期に入り、その後の平均生存期間は通常１年未満である。ＦＩＶは、一本鎖ポリアデニル化ＲＮＡゲノム、ｇａｇ遺伝子産物由来の内部構造蛋白質、およびｅｎｖ遺伝子産物由来の膜蛋白質を含有する脂質エンベロープを含む典型的なレトロウイルスである(Bendinelliら，Clin．Microbiol．Rev ．8:87，1995)。ｇａｇ遺伝子は約５０ｋＤａの一次産物に翻訳され、これは、ウイルスプロテアーゼによってマトリックス(ｐ１５)、キャプシド(ｐ２５)、およびヌクレオキャプシド(ｐ１０)蛋白質につづいて切断される。ＧＡＧポリ蛋白質の各切断産物の開始点および終結点は、オープンリーディングフレームの下側に図２に示す。ｅｎｖ遺伝子は、感染細胞において７５-８０ｋＤａ（非グリコシル化分子量）の一次翻訳産物を供し、その前駆体はＮ-結合グリコシル化のために１４５-１５０ｋＤａの見かけ分子量を有する。ｅｎｖ前駆体はゴルジ装置中でＳＵおよびＴＭ蛋白質（また、各々、ｇｐ９５およびｇｐ４０とも呼称されている）に切断される。上記で論じたごとく、ネコ免疫不全症ウイルス(ＦＩＶ)のｇａｇ遺伝子は前駆体ポリ蛋白質として最初に翻訳され、これが切断されて機能的に成熟したマトリックス蛋白質、キャプシド蛋白質、およびウイルスのコアを構成するヌクレオキャプシド蛋白質を供する(Elderら，J．Virol．67：1869-76，1993)。ｐｏｌ遺伝子はｇａｇ遺伝子と１１２ヌクレオチドで重複し、ｇａｇ遺伝子のものに対して -１の読み枠で存在する。したがって、該遺伝子は、リボソームフレームシフトによって生成するＧａｇ-Ｐｏｌ融合蛋白質として翻訳される。該重複領域には、ｇａｇ遺伝子の３'末端に位置するフレームシフトシグナル、ＧＧＧＡＡＡＣおよびＧＧＡＧＡＡＡＣが含まれる（Morikawaら，Virol．186：389-97，1992）。ヌクレオキャプシド蛋白質またはｐ１０は小塩基性蛋白質であり、これはゲノムＲＮＡと関連していて、ウイルスＲＮＡのパッキングに必要なようである(Egb erinkら，J．Gen．Virol．，71：739-743，1990；Steinmanら，J．Gen．Virol．，71：701-06，1990)。該ｐ１０蛋白質は、配列Ｃ-Ｘ₂-Ｃ-Ｘ₄-Ｈ-Ｘ₄-Ｃ(ここにＸはいずれかのアミノ酸を表し、数字は残基の数を表す)の１４アミノ酸より各々なる２個のシステイン列(arrey)を含んでいる。他のレトロウイルスを用いた遺伝的研究によると、これらの２個のシステイン列がウイルスＲＮＡのパッキングに必須であることが示されている(Reinら，J．Virol．，68：6124-29，1994 ；Mericら，J．Virol．，62：3328-33；Gorelickら，Proc．Natl．Acad．Sci．U SA，85：8420-24，1988)。したがって、これらの２個のシステイン列の欠失は、理論的には、すべてのウイルス蛋白質を含むがウイルスゲノムＲＮＡは含まないＦＩＶウイルス粒子を生成するにちがいない。これらのＦＩＶウイルス粒子は非 -感染性であるにちがいなく、これらを用いてワクチン接種ネコに効率的な免疫防御を供し得る。ＦＩＶに対する大部分のワクチンは、防御免疫を誘導することができなかった。効果のないワクチンには、不活化全ウイルス、固定化感染細胞、組換えＣＡおよびＳＵ蛋白質、ならびに、ＳＵのＶ３領域に相当する合成ペプチドが含まれていた。幾つかのケースにおいては、実際、ワクチンが攻撃後に感染症を高めた。１つの系においては、パラホルムアルデヒド-固定したウイルスまたは感染細胞でのワクチン接種が防御免疫を生じたが(Yamamotoら，J．Virol．67：601，1993) 、他の者によるこのアプローチの適用は成功しなかった(Hosieら，Abstracts of the International Symposium on Feline Retrovirus Research，1993，p．50) 。かくして、ＦＩＶに対する有効な全死菌ビリオンワクチンに対して、当該技術分野において要望が存在する。発明の概要本発明は、ネコ免疫不全症ウイルス(ＦＩＶ)によって引き起こされるネコにおける疾病の予防または軽減に関する。疾病の予防または軽減とは、ＦＩＶ感染から生じる免疫系破壊を包含するいずれの病徴の改善をも意味するものと理解される。本発明は、ｇａｇ遺伝子の一部分、詳細にはｐ１０(ヌクレオキャプシド)コード領域、またはその一部分を有するゲノムが欠失したＦＩＶゲノムをコードするプラスミドを提供する。この欠失により、機能蛋白質または全ｐ１０蛋白質の産生が妨害され、ついで、このことによって、適当な宿主細胞へのこのプラスミドのトランスフェクションから生成したビリオンにＲＮＡがパッキングされるのが妨害され、ＲＮＡを含まないビリオンが生じる。かかるビリオンは「空(empty) 」ビリオンとして説明する。また、本発明は、該空ビリオンを生成するプラスミドで形質転換した宿主細胞、およびビリオンそれ自体をも包含する。もう１つの具体例において、本発明は、医薬上許容される担体または希釈剤および医薬上許容されるアジュバントと共に、１または２種以上の前記の空ビリオンを含むワクチンをも包含する。なおもう１つの態様において、本発明は、かかる治療を要するネコに前記のワクチンを投与することにより行う、ＦＩＶによって引き起こされる疾病を予防または軽減する方法を提供する。図面の簡単な説明図１は、ｐ１０欠失を有するＦＩＶを作製するクローニング戦略を示す図である。図２は、示す種々の蛋白質加水分解産物のコード配列の図と共に、ＦＩＶのｇａｇ遺伝子のＤＮＡ配列［配列番号５］を示している。本発明の好ましい具体例においては、二重下線のＤＮＡ配列が欠失している。図３は、一次オープンリーディングフレーム［配列番号６］および二次オープンリーディングフレーム［配列番号７］の両方を含むＦＩＶのｇａｇ遺伝子の翻訳産物の蛋白質配列を示している。本発明の好ましい具体例によっては、二重下線のアミノ酸はコードされていない。発明の詳細な説明本明細書において引用するすべての特許、特許出願、および参考文献は、出典明示して本明細書の一部とみなす。不一致の場合には、定義を含む本願明細書の開示は、調節されるであろう。本発明のワクチンは、ネコ免疫不全症ウイルス(ＦＩＶ)のｇａｇ蛋白質の一部分をコードするｐ１０遺伝子またはその一部分の欠失を運搬する組換えＦＩＶを作製することによって調製し得る。クローニングスキームを用いて３９コドンを除去した欠失ウイルスを作製し、該コドンには、野生型ウイルス-感染細胞において生じるｇａｇ遺伝子オープンリーディングフレームまたはｇａｇ-ｐｏｌフレームシフトのいずれをも破壊することなくｐ１０遺伝子内に２個のシステイン列が含まれる。この２個のシステイン列を図２に強調するが、ここでシステイン列１はヌクレオチド１１２９〜１１７０を包含し、システイン列２はヌクレオチド１１８６〜１２２７を包含する。欠失している３９コドンおよびアミノ酸は図２および３において二重下線が引かれている。該欠失は、元のｐ１０オープンリーディングフレームを破壊しない。また、該欠失は、ｇａｇ-ｐｏｌフレームシフト開始サイトおよびフレームシフトシグナルを変化しない。したがって、理論的には、ヌクレオチド１２４２のｇａｇ-ｐｏｌフレームシフトの頻度は、ｇａｇ-ｐｏｌフレームシフト開始サイトに先行する３９コドンの欠失によって影響されない。図２は、下線を引いてｇａｇ-ｐｏｌフレームシフト開始サイトを示している。図２はｐ１０オープンリーディングフレームの下側のＰＯＬポリ蛋白質の５'末端を示しており、一方、図３はｐ１０のアミノ酸配列およびフレームシフトを起こしたＰＯＬ蛋白質を掲載している。ｐ１０欠失ワクチンの構築法を以下に概説する。プラスミド構築物を作製し、これはＰＣＲ-媒介突然変異導入を用いてｐ１０コード遺伝子配列の一部分を欠失している。該構築物は、ｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子に重複する１１２個のヌクレオチド(１２４３〜１３５３)のいずれも欠失せず、かつｐｏｌ転写に必要なフレームシフトシグナルも除去されていないように設計されている。構築したら、該プラスミドを哺乳動物細胞のごとき適当な宿主細胞にトランスフェクトし、その形質転換細胞を非感染性ウイルス産生についてスクリーニングする。非感染性 (恐らくは空である)ビリオンを産生することがはっきりとした細胞を用いて、高レベルのウイルス粒子を産生させて、これを細胞培養培地から単離する。この特別の構築物および方法は空ビリオン、すなわち、ＲＮＡを含有しないビリオンを産生させるのに有効であるが、当業者であれば、同一目的を達成する別のよく知られている方法を認識し得るであろう。例えば、該欠失は、全ｐ１０コード配列が除去されている必要はなく、該蛋白質の機能について十分な配列のみが除去されていればよい。このアプローチの１つの代表的な例は、２個のシステイン列のうちの１個のみの除去であろう。さらに、配列のフラグメントが除去されている必要はない。当該技術分野でよく知られている方法を用いたいずれかの遺伝的改変、すなわち、列内のシステインの部位特異的突然変異を用いて、空ビリオンをコードするＦＩＶゲノムを構築することができる。かくして、空ビリオンをコードするゲノムを生じる現在用いられている遺伝的改変のよく知られている変形は、本発明の範囲内に存在することが意図されている。単離ウイルスは、使用する時点まで、４℃にて濃縮後または(-５０℃もしくはそれ未満で)凍結して、あるいは凍結乾燥して保存することができる。ＮＺ-アミン、デキストロース、ゼラチンのごとき化合物、または凍結および凍結乾燥の間にウイルスを安定化させる他のものを添加してもよい。該ウイルスは市販の装備を用いて濃縮することができる。ワクチンを生成するためには、単離した粒子を化学処理して感染能を確実に欠乏させ、すなわち、不活化し、アジュバント(群) と混合することができる。典型的には、ワクチン処方中のウイルス濃度は、用量当たり最低１０^6.0ウイルス粒子であろうが、典型的には、用量当たり１０^6.0ないし１０^8.0ウイルス粒子の範囲内であろう。ワクチン接種時には、脱イオン水、セーライン、リン酸緩衝液セーラインなどのごとき生理学的に許容される担体で該ウイルスを(凍結している場合には)解凍するか、または(凍結乾燥している場合には)復元する。本発明のワクチンのさらなる任意成分は医薬上許容されるアジュバントである。適当なアジュバントの例としては、スクアランおよびスクアレン(または動物起源の他の油類)；Pluronic^R(L121)Saponinのごときブロックコポリマー；Tween^R-80 のごとき洗剤；Quil^RＡ、またはDrakeol^RもしくはMarcol^Rのごとき鉱油、または落花生油のごとき植物油;コリネバクテリウム・パルバム(corynebacterium parvu m)のごときコリネバクテリウム-由来アジュバント；プロピオニバクテリウム・アクネ(Propionibacterium acne)のごときプロピオニバクテリウム-由来アジュバント；Mycobacterium bovis(Bacillus CalmetteおよびGuerinn、またはＢＣＧ )；インターロイキン２およびインターロイキン１２のごときインターロイキン；インターロイキン１のごときモノカイン；腫瘍壊死因子；γ-インターフェロンのごときインターフェロン；サポニン-水酸化アルミニウムまたはＱuil^R-Ａ- 水酸化アルミニウムのごとき組合せ；リポソーム；イスコムアジュバント；結核菌細胞壁抽出物；ムラミルジペプチドまたは他の誘導体のごとき合成グリコペプチド；アビリジン；リピッドＡ；デキストランサルフェート；ＤＥＡＥ-デキストラン、またはリン酸アルミニウムを用いたＤＥＡＥ-デキストラン；Carbopol^R のごときカルボキシポリメチレン；無水マレイン酸エチレン(ＥＭＡ)；Neocryl^R A640(例えば、米国特許第5,047,238号)のごときアクリル酸コポリマー懸濁液；ワクシニアまたは動物のポックスウイルスの蛋白質；オルビウイルスのごときサブウイルス粒子アジュバント；コレラ毒；臭化ジメチルジオクレデシルアンモニウム；あるいはこれらの混合物が包含されるが、これらに限定されるものではない。個々の遺伝的に改変したビリオンは、ワクチン接種用に共に混合することもできる。さらに、該ウイルスは、ネコ白血病ウイルス、ネコ汎白血球減少症ウイルス、ネコ鼻気管炎ウイルス、ネコカリチウイルス、ネコ伝染性腹膜炎ウイルス、ネコChlamydia psittaci、Microsporum canisまたは他のもののごとき、さらなる不活化または弱毒化したウイルス、細菌、または菌類と混合することができる。加えて、前記した生物からの抗原を組合せワクチンに取り込ませることもできる。この抗原は、天然資源からか、または組換え発現系から精製することができ、あるいはそれら由来の抗原または合成ペプチドの個々のサブユニットを含んでいてもよい。生成したワクチンは、皮下、筋肉内、経口、皮内、または鼻腔内の経路によってネコに投与することができる。注射の回数およびその時間的な間隔は変動し得る。１ないし３回のワクチン接種を１ないし３週間の間隔で投与するのが通常有効である。本発明のワクチンの効率は下記の方法によって評価する。最終ワクチン接種から約１カ月後に、ワクチン接種体および対照を、３-２０のネコＩＤ₅₀単位を、好ましくは５のネコＩＤ₅₀単位のＦＩＶを、好ましくはＮＣＳＵ-１単離株(ＡＣＴＴ寄託番号ＶＲ２３３３)で各々攻撃する。ａ）ウイルス血症およびｂ）ＣＤ４およびＣＤ８リンパ球の相対量を測定するために、攻撃直前および攻撃後一定の間隔で、全血液を動物から採取する。ウイルス血症は、血液から単核細胞を単離し、その細胞と非感染動物からの単核細胞とを共培養することによって測定する。培養７日後に、酵素結合イムノアッセイによってＦＩＶについて培養上清を試験する(後記の実施例３を参照されたし)。ワクチン接種体および対照の循環中のＣＤ８リンパ球に対するＣＤ４リンパ球の比を、免疫機能の測定値として採用する。典型的には、ＦＩＶ感染によって、約１.５-４の正常ＣＤ４：ＣＤ８比から約０.５-１の病理学的比への逆転が起こる。ＣＤ４およびＣＤ８リンパ球の力価は、特異的抗体を用いたフローサイトメトリーによって測定する(後記の実施例３を参照されたし)。免疫機能のもう１つの測定は、最終ワクチン接種６-１２ヶ月後にトキソアズマ・ゴンディ（Toxoplasma gondii）でワクチン接種体および対照を攻撃することである。通常、T．gondiiが誘導する病徴の重度は、非感染ネコに比してＦＩＶ-感染ネコにおいてかなり悪化する。T．gondii効果の重度は、眼排出物、鼻排出物、呼吸困難および発熱を計測することによって判断する。ＦＩＶ感染症のいずれかの症状を緩和することが望ましい臨床目的であることは理解されよう。これには、ＦＩＶ-誘導の症状を治療するために用いる薬物療法の用量の低下が含まれる。以下の実施例は、それらに限定されることなく、本発明を説明することを意図している。実施例１：ｐ１０欠失ＦＩＶ株の調製Ａ．親ＤＮＡの単離ＮＣＳＵ-１単離株の完全長プロウイルス配列を含有する精製λＤＮＡは、Wiz ard Lambda Preps DNA Purification System(Promega Corporation社製，Madiso n，WI)で調製し、これを欠失突然変異体を構築するための親ＤＮＡとして用いた。ＤＮＡの消化、接合、および他の分子的技術は、記載されているのと同様に行った(Sambrookら，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第２版，Cold Sp ring Harbor Laboratory，1989)。Ｂ．ＦＩＶ-レフト(Left)プラスミドの調製精製λＤＮＡをＳａｌＩで消化し、完全長ＦＩＶプロウイルス配列を含有する１１ｋｂのインサートＤＮＡを放出させた。該インサートＤＮＡは、BIO 101 In c．社製のGENECLEAN IIキットを用いたガラスビーズ法によって精製し、これを、ＦＩＶゲノムを一カ所でのみ切断するＮｃｏＩで消化して、フラグメントＡと命名する２.９ｋｂのＳａｌＩ-ＮｃｏＩフラグメント、およびフラグメントＢと命名する８.１ｋｂのＮｃｏＩ-ＳａｌＩフラグメントを生成した。フラグメントＡを前記のガラスビーズ法によって精製し、プラスミドベクターｐＧＥＭ５Ｚｆ(ｔ)(Promega Corp．社製，Madison，WI)にサブクローン化してプラスミドｐＦＩＶ-レフトを作製した。このプラスミドｐＦＩＶ-レフトは、ＬＴＲ、ｐ１５、ｐ２５およびｐ１０遺伝子を含むウイルスゲノムの左部分を含有している。Ｃ．ｐ１０配列の欠失ｐ１０遺伝子内の２個のシステイン列の欠失は、製造業者指示書(Boehringer Mannheim，USA社製，Indianapolis，IN)に従って高精度ＰｗｏＤＮＡポリメラーゼを用いたＰＣＲ-媒介突然変異によって促進した。プラスミドｐＦＩＶ-レフトを、ＰＣＲ反応の初期テンプレートとして用いた。ＳＰ６プライマーおよびプライマーＡを用いて、ヌクレオチド１１２４で終結する配列を有する２.２-ｋｂのフラグメントＣを増幅した。ＳＰ６プライマー：５’-TTAGGTGACACTATAGAATACTCAA-３’［配列番号１］は、ＳａｌＩサイトの上流のベクター配列にアニーリングする。プライマーＡ：５’-GGTCCTGATCCTTTTGATTGCACTA-３’［配列番号２］は、ヌクレオチド１１００〜１１２４のＦＩＶ配列にアニーリングする。プライマーＢおよびＴ７プライマーを用いて、ヌクレオチド１２４２で開始する０.６-ｋｂのフラグメントＤを増幅した。プライマー：５’-AAAGAATTCGGGAAACTGGAAGGCGG-３’［配列番号３］は、ヌクレオチド１２４２〜１２６７のｇａｇｐ１０遺伝子内中にアニーリングする。プライマーＴ７：５’-TAATACGACTCACTATAGGGCGAATTG-３’［配列番号４］は、ＮｃｏＩサイトから下流のベクター配列にアニーリングする。各ＧＡＧ-特異的プライマーの位置を図２中に強調する。フラグメントＣおよびフラグメントＤを前記と同様にして精製し、接合し、その接合産物をテンプレートとして用い、ＳＰ６プライマーおよびＴ７プライマーを用いて２.８-ｋｂフラグメントを増幅した。生成した２.８-ｋｂフラグメントを前記と同様にして精製し、ＳａｌＩおよびＮｃｏｌで消化してフラグメントＥを生成した。フラグメントＥは、２個のシステイン列にわたるセグメントの配列が欠失している、すなわち、ヌクレオチド１１２５〜１２４１にわたる配列が除去されている以外は、フラグメントＡと同一である(図１を参照されたし)。Ｄ．ＦＩＶδｐ１０プラスミドの構築生成したフラグメントＥおよびフラグメントＢは前記と同様にして精製した。ついで、フラグメントＥおよびフラグメントＢを合し、ジーンターゲティングベクターｐＭＣ１neo PolyA(Stratagene社製，LaJolla，CA；Thomas，K．R．およびCapecchi，M．R．，Cell，51：503-21，1987)のＳａｌＩサイトにクローン化し、プラスミドｐＦＩＶδｐ１０を生成した。プラスミドｐＦＩＶδｐ１０は、ジーンターゲティングベクター上のネオマイシン抵抗性遺伝子に加えて、ｐ１０遺伝子内に内部欠失を有する全ＦＩＶゲノムを含有する。Ｅ．ビリオンの作製安定な形質転換体は、プラスミドｐＦＩＶδｐ１０をＶｅｒｏ細胞(ＡＴＣＣＣＣＬ８１)、Crandellネコ腎細胞(ＡＴＣＣＣＣＬ９４)またはＡＨ９２７ネコ胚繊維芽細胞(Overbaughら，Virol．188：558-569，1992)にトランスフェクトさせ、製造業者指示書(Life Technologies，Inc．社製，Gaithersburg，MD)に従ってLIPOFECtamine^R試薬およびＧ４１８(ゲンチシン)とカチオン性リポソーム-媒介トランスフェクションを用いてＧ４１８によって選抜することによって得た。Ｇ４１８-抵抗性細胞の培養物を、ａ）ウイルス粒子-関連逆転写酵素活性をアッセイし；ｂ）記載されているのと同様に相補性プラークアッセイ(Reinら，J．Vi rol．29：494-500，1979)を行って、ウイルス粒子が感染の単一サイクルを開始し得るか否かを判断し；ｃ）主要コア蛋白質ｐ２５に対する抗血清(IDEXX,USA 社製，Portland，ME)をもちいてウエスタンブロッティングを行ってウイルス蛋白質の一体化を検査し；ついでｃ）電子顕微鏡によってウイルス粒子を直接観察する、ことによってウイルス粒子の産生について試験した。安定にトランスフェクトされた細胞から放出されたウイルス粒子は、ａ）ＲＴ -ＰＣＲおよびＤＮＡＰＣＲによってウイルスＲＮＡおよびＤＮＡの不存在、およびｂ）標準的な確認感染能アッセイによって感染能の不存在について検査しなければならない。実施例２：全死菌空ＦＩＶワクチンの調製非感染性のウイルス粒子を産生する安定にトランスフェクトした細胞は、バイオリアクター中の微担体上でか、またはローラーボトル中で増殖させた。電子顕微鏡および／またはネコ免疫不全症ウイルス抗原試験キット(IDEXX,USA社製，Po rtland，ME)によって測定してウイルス粒子が高レベルに達した時に、１回または複数回で培養流体を採取した。ウイルス粒子は、当該技術分野でよく知られた標準的プロトコールに従って、ホルマリンまたは二元エチレンイミンで処理することによって不活化した。不活化後に、そのウイルス粒子を、１０,０００〜１００,０００ダルトンの分子量を排除する中空繊維法で１０〜５０倍濃縮した。ワクチンを調製するためには、ウイルス粒子を含有する該濃縮流体を免疫原的刺激アジュバント、例えば、無水マレイン酸エチレン(ＥＭＡ)３１、ネオクリル、ＭＶＰエマルシゲン、鉱油、またはアジュバントＡ、あるいは幾つかの免疫原的刺激アジュバントの組合せと混合する。アジュバントＡは、ポリオキシプロピレン-ポリオキシエチレン(ＰＯＰ−ＰＯＥ)ブロックコポリマー、好ましくはPluro nic^RL121(例えば、米国特許第４，７７２，４６６号)のごときブロックコポリマー、および代謝性油類、例えば、不飽和ターピン炭化水素、好ましくはスクワラン(２,６,１０,１５,１９,２３-ヘキサメチルテトラコサミン)またはスクワレンのごとき有機成分を含むアジュバントである。このアジュバント混合物中においては、ブロックコポリマー、有機油類、および界面活性剤が、各々、約１０〜約４０ｍｌ／ｌ、約２０〜約８０ｍｌ／ｌ、および約１.５〜約６.５ｍｌ／ｌの範囲の量で存在し得る。ストックアジュバントの好ましい具体例において、該有機成分は約４０ｍｌ／ｌの量で存在するスクワランで、該界面活性剤は約３.２ｍｌ／ｌの量で存在するポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート(Tween^R-80)で、該ＰＯＰ-ＰＯＥブロックコポリマーは約２０ｍｌ／ｌの量で存在するPluronic^RL121である。Pluronic^RL121は１５−４０℃にて液体のコポリマーで、ポリオキシプロピレン(ＰＯＰ)成分が３２５０〜４０００の分子量を有し、ポリオキシエチレン(ＰＯＥ)成分が合計分子の約１０ -２０％、好ましくは１０％を構成する。他の適当なアジュバントの例には、スクワランおよびスクワレン(または動物起源の他の油類);Pluronic^R(L121)Saponinのごときブロックコポリマー；Tween^R -80のごとき洗剤；Quil^RＡ、またはDrakeol^RもしくはMarcol^Rのごとき鉱油、または落花生油のごとき植物油；コリネバクテリウム・パルバム(corynebacterium parvum)のごときコリネバクレリウム-由来アジュバント；プロピオニバクテリウム・アクネ(Propionibacterium acne)のごときプロピオニバクテリウム-由来アジュバント；Mycobacterium bovis(Bacillus CalmetteおよびGuerinn、またはＢＣＧ）；インターロイキン２およびインターロイキン１２のごときインターロイキン；インターロイキン１のごときモノカイン；腫瘍壊死因子；γ-インターフェロンのごときインターフェロン；サポニン-水酸化アルミニウムまたはQuil^R- Ａ-水酸化アルミニウムのごとき組合せ；リポソーム；イスコムアジュバント；結核菌細胞壁抽出物；ムラミルジペプチドまたは他の誘導体のごとき合成グリコペプチド；アビリジン；リピッドＡ；デキストランサルフェート；ＤＥＡＥ-デキストラン、またはリン酸アルミニウムを用いたＤＥＡＥ-デキストラン；Carbo pol^Rのごときカルボキシポリメチレン；ＥＭＡ；Neocryl^R A640(例えば、米国特許第5,047,238号)のごときアクリル酸コポリマー懸濁液；ワクシニアまたは動物のポックスウイルスの蛋白質；オルビウイルスのごときサブウイルス粒子アジュバント；コレラ毒；臭化ジメチルジオクレデシルアンモニウム；あるいはこれらの混合物が包含されるが、これらに限定されるものではない。また、該組成物は、非イオン性の洗剤または界面活性剤、好ましくはTween^R洗剤のごときポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート、最も好ましくはTween^R-80、すなわちポリオキシエチレン(２０)ソルビタンモノオレエートも含まれ得る。典型的には、１ｍｌ用量には、電子顕微鏡またはネコ免疫不全症ウイルス抗原試験キット(IDEXX,USA社製，Portland，ME)によって測定して少なくとも１０⁶個のウイルス粒子が含まれる。実施例３：全死菌空ＦＩＶワクチンの効率の試験Ａ．ワクチン接種８週齢またはそれを超えるネコに、前記のごとき調製したワクチンを皮下または筋肉内注射した。各ネコは、２-４週間隔で２回のワクチン接種を受けた。ワクチン接種２ないし６週後に、ワクチン接種ネコおよび非ワクチン接種ネコを、５ネコＩＤ₅₀のネコ免疫不全症ウイルス(ＮＣＳＵ-１単離株(ＡＴＣＣＶＲ２３３３)および数種の他の単離株)を注射することによって攻撃した。ワクチン接種に対する抗体応答を、ＦＩＶエンベロープ蛋白質の免疫優勢領域(Ｖ３)内の中和ペプチドをもちいたＥＬＩＳＡ(Lombardiら，J．Virol．67：4742-49，1993)によって測定した。攻撃後のウイルス複製をａ）ＲＴ-ＰＣＲおよびＤＮＡＰＣＲを用いてＦＩＶＲＮＡまたは／＋プロウイルスＤＮＡのレベルを測定し；および／またはｂ）感染性ウイルス粒子の存在について共培養することによって隔週にモニターした。１．ウイルス血症の検出ａ．ＦＩＶプロウイルスＤＮＡのＰＣＲ検出単核細胞は、Percoll^R(Pharmacia Biotech社製，Piscataway，NJ)勾配を用いて全血液から単離した。５×１０⁵細胞を溶解し、その溶解物の１／１０をＦＩＶのｇａｇ遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチドプライマー(TL．Wasmoenら，Ve t．Immun．Immunopath．，35：83-93，1992)または相当物と共にポリメラーゼ鎖反応に用いた。ＦＩＶ増幅ＤＮＡはアガロースゲル電気泳動およびエチジウムブロマイド染色によってか、または酵素結合オリゴヌクレオチドアッセイによって検出した。ｂ．ＦＩＶの組織培養単離ＦＩＶの培養単離は、以前に記載されているのと同様にして行った(Wasmoenら，Vet.Immuno.Immunopath．,35:83-93，1992)。単核細胞は、Percoll^TM(Pharmac ia Biotech社製，Piscataway，NJ)勾配を用いて全血液から単離した。ＦＩＶ-攻撃ネコからの５×１０⁵細胞を、非感染ネコから単離した１×１０⁶の単核細胞と培養した。培養物には７日毎にＲＰＭＩ培地を補充し、その上清を、ＦＩＶｐ２５抗原を検出する酵素結合イムノソルベントアッセイ(ＥＬＩＳＡ)(Petcheck ELISA，IDEXX社製，Portland，ME)によってＦＩＶの存在について試験した。別法として、血漿を感染ウイルスの供給源として用いることもできる。２．リンパ球サブセット白血球は、Histopaque^TM(Sigma Chemical Campany社製，St．Louis，MO)、およびＣＤ４に特異的な抗体(モノクローナル抗体CAT30A)、ＣＤ８に特異的な抗体 (モノクローナル抗体FLSM3.357)、平盤Ｔリンパ球に特異的な抗体(モノクローナル抗体FLSM1.572)またはＢリンパ球に特異的な抗体(抗−ネコＩｇＧ)で細胞を染色し、つづいてＦＡＣＳ分析することによって定量したリンパ球サブセットを用いて全血液から単離した。これらのモノクローナル抗体は他にも記載されており (M．B．Tompkinsら，Vet．Immunol．Immunopath．，26:305-317，1990)、フローサイトメトリー法は以前に記載されているものと同一であった(R．V．Englishら，J．Infect．Dis．170：543-552，1994)。ＣＤ４：ＣＤ８比を算出した。Ｂ．Toxoplasma gondii攻撃ＦＩＶで攻撃した８〜１２週間後に、ネコに10,000〜50,000タキゾイトのToxo plasma gondiiを注射した。１０％グリセリン中で凍結したT.gondiiのＭＥ49株のタキゾイト、または卵母細胞をSwissマウス(Charles Rivers Laboratories社製)に腹膜内注射し、発表されている手法に(Davidsonら，Am．J．Pathol．， 143：1486，1993)に従ってマウスに順次経過させた。マウスの腹水から採取したタキゾイトは、赤血球計数盤を用いて計数した。ネコを塩酸ケタミンを用いて麻酔し、予め手術で単離しておいたその右総頚動脈に50,000の新鮮なタキゾイトを注射した。この用量でToxoplasmaを注射すると、通常、ＦＩＶ-感染し、ワクチン接種しなかったネコの５０％にのぼる数が死亡した。Toxoplasma攻撃後に、T. gondii注射前の３日間および注射後の４８日まで、眼排出物、鼻排出物、呼吸困難、発熱、鬱病、および体重低下を包含する臨床的疾病の徴候についてネコを毎週モニターした。 T．gondii攻撃後の臨床的徴候は以下のとおり計数した：前記のごとく調製したワクチンは、Toxoplasma感染による臨床的徴候および死亡の発現を顕著に低下するであろうと期待される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩ //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｒ 1:92） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＥＥ，ＦＩ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ワスモン，テリーアメリカ合衆国50501アイオワ州フォート・ドッジ、トゥエンティフィフス・アベニュー・ノース1113番 (72)発明者フアン，チェンリンアメリカ合衆国50501アイオワ州フォート・ドッジ、ノース・サーティファースト・ストリート1454番アパートメント・ナンバー３

Claims

【特許請求の範囲】１．ネコ免疫不全症ウイルス(ＦＩＶ)のエンベロープ蛋白質またはそれからの免疫原性フラグメントをコードするＤＮＡ配列を含む少なくとも１個の内部遺伝子(internal gene)を有する組換えアライグマポックスウイルス。２．該内部遺伝子が、図３記載のアミノ酸配列を有するＦＩＶエンベロープ蛋白質またはそれからの免疫原性フラグメントをコードする請求項１記載の組換えアライグマポックスウイルス。３．該内部遺伝子が、ＦＩＶエンベロープ蛋白質のアミノ酸１-７３５をコードする請求項２記載の組換えアライグマポックスウイルス。４．ネコ免疫不全症ウイルス(ＦＩＶ)のエンベロープ蛋白質またはそれからの免疫原性フラグメントをコードするＤＮＡ配列を含む少なくとも１個の内部遺伝子を有する組換えアライグマポックスウイルス、および医薬上許容される担体または希釈剤を含んでなるワクチン。５．さらに、医薬上許容されるアジュバントを含んでなる請求項４記載のワクチン。６．該内部遺伝子が、図３記載のアミノ酸配列を有するＦＩＶエンベロープ蛋白質またはそれからの免疫原性フラグメントをコードする請求項６記載のワクチン。７．該内部遺伝子が、ＦＩＶエンベロープ蛋白質のアミノ酸１-７３５をコードする請求項４記載のワクチン。８．さらに、ネコ白血病ウイルス、ネコ汎白血球減少症ウイルス、ネコ鼻気管炎ウイルス、ネコカリチウイルス、ネコ伝染性腹膜炎ウイルス、ネコヘルペスウイルス、ネコ腸コロナウイルス、およびそれらの混合物よりなる群から選択されるウイルス由来の免疫原を含んでなる請求項４記載のワクチン。９．さらに、不活化または弱毒化したネコChlamydia psittaci、Microsporum canis、またはそれらの混合物を含んでなる請求項４記載のワクチン。１０．ネコ免疫不全症ウイルス(ＦＩＶ)のｇａｇ蛋白質またはそれからの免疫原性フラグメントをコードするＤＮＡ配列を含む少なくとも１個の内部遺伝子を有する組換えアライグマポックスウイルス。１１．該内部遺伝子が、図５記載のアミノ酸配列を有するＦＩＶｇａｇ蛋白質またはそれからの免疫原性フラグメントをコードする請求項１０記載の組換えアライグマポックスウイルス。１２．ネコ免疫不全症ウイルス(ＦＩＶ)のｇａｇ蛋白質またはそれからの免疫原性フラグメントをコードするＤＮＡ配列を含む少なくとも１個の内部遺伝子を有する組換えアライグマポックスウイルス、および医薬上許容される担体または希釈剤を含んでなるワクチン。１３．さらに、医薬上許容されるアジュバントを含んでなる請求項１２記載のワクチン。１４．該内部遺伝子が、図５記載のアミノ酸配列を有するＦＩＶｇａｇ蛋白質またはそれからの免疫原性フラグメントをコードする請求項１２記載のワクチン。１５．さらに、ネコ白血病ウイルス、ネコ汎白血球減少症ウイルス、ネコ鼻気管炎ウイルス、ネコカリチウイルス、ネコ伝染性腹膜炎ウイルス、ネコヘルペスウイルス、ネコ腸コロナウイルス、およびそれらの混合物よりなる群から選択されるウイルス由来の免疫原を含んでなる請求項１２記載のワクチン。１６．さらに、不活化または弱毒化したネコChlamydia psittaci、Microsporu m canis、またはそれらの混合物を含んでなる請求項１２記載のワクチン。１７．ネコ免疫不全症ウイルス(ＦＩＶ)のｇａｇ、エンベロープ蛋白質、およびそれらからの免疫原性フラグメントよりなる群から選択されるメンバーをコードするＤＮＡ配列を含む少なくとも１個の内部遺伝子を有する第一組換えアライグマポックスウイルス；ネコ免疫不全症ウイルス(ＦＩＶ)のｇａｇ、エンベロープ蛋白質、およびそれらからの免疫原性フラグメントよりなる群から選択されるメンバーをコードするＤＮＡ配列を含む少なくとも１個の内部遺伝子を有する第二組換えアライグマポックスウイルス；および医薬上許容される担体および希釈剤を含んでなるワクチン。１８．さらに、医薬上許容されるアジュバントを含んでなる請求項１７記載のワクチン。１９．ネコ免疫不全症ウイルス(ＦＩＶ)のエンベロープ蛋白質またはそれからの免疫原性フラグメントをコードするＤＮＡ配列を含む少なくとも１個の内部遺伝子を有する組換えアライグマポックスウイルスを含むワクチンを、かかる治療を要するネコに投与することを特徴とする、ネコ免疫不全症ウイルス(ＦＩＶ)によって引き起こされた疾病を予防または軽減するための方法。２０．該内部遺伝子が、図３記載のアミノ酸配列を有するＦＩＶエンベロープ蛋白質またはそれからの免疫原性フラグメントをコードする請求項１９記載の方法。２１．ネコ免疫不全症ウイルス(ＦＩＶ)のｇａｇ蛋白質またはそれからの免疫原性フラグメントをコードするＤＮＡ配列を含む少なくとも１個の内部遺伝子を有する組換えアライグマポックスウイルスを含むワクチンをかかる治療を要するネコに投与することを特徴とする、ネコ免疫不全症ウイルス(ＦＩＶ)によって引き起こされた疾病を予防または軽減するための方法。２２．該内部遺伝子が、図５記載のアミノ酸配列を有するＦＩＶｇａｇ蛋白質またはそれからの免疫原性フラグメントをコードする請求項２１記載の方法。