JP2852395B2

JP2852395B2 - ネコ白血病ウイルスワクチン

Info

Publication number: JP2852395B2
Application number: JP5508416A
Authority: JP
Inventors: ウォードリー，リチャード・カルバート; トムセン，ダレル・レイ
Original assignee: FUARUMASHIA ANDO ATSUPUJON CO
Current assignee: FUARUMASHIA ANDO ATSUPUJON CO
Priority date: 1991-11-08
Filing date: 1992-10-08
Publication date: 1999-02-03
Anticipated expiration: 2014-02-03
Also published as: DE69232650T2; DE69232650D1; AU689355B2; EP1136562A2; AU4213496A; EP0611397A1; ATE219520T1; LV13060B; AU672372B2; CA2120137C; EP1136562A3; ES2177530T3; AU2892392A; CA2120137A1; DK0611397T3; KR100265393B1; WO1993009238A1; MX9206018A; JPH06510910A; EP0611397B1

Description

【発明の詳細な説明】発明の分野ネコ白血病ウィルスのgag、gp70およびgp85遺伝子を
発現する組換えバキュロウイルス、ワクチンおよびこれ
ら発現産物に基づく、ワクチン製造および使用方法を開
示する。また、粘膜／非経口組合せ接種方法も開示す
る。

発明の背景ネコ白血病ウイルスオンコルナウイルス科ネコ白血病ウイルス（FeLV）
は、レトロウイルス族のメンバーである。ネコにおい
て、FeLVは、リンパ腫、脊髄増殖性疾病、白血病、免疫
不全症候群、無形成貧血および神経学的疾患を引き起こ
しうる。該ウイルスは、高年のネコがほとんどのFeLV腫
瘍株に対してさえ抵抗性であるのに、新生または若年の
子ネコに高率で感染する。動物はFeLVに対しワクチン接
種しうる。例えば、FeLV感染に対するワクチンを製造す
る初期の試みは、種々のアジュバントを用いた、生また
は不活性化FL74ネコリンパ腫細胞の投与を含んでいた。
しかしながら、これらワクチンの効率は混乱し、これら
数々の試みは、持続性ウイルス血症または２次リンパ腫
および肉腫進展に対するネコの保護で成功しなかった。
今日、可溶性腫瘍細胞抗原ワクチンは商業的に入手で
き、他のISCOMに基づく実験的ワクチンおよびサブユニ
ットも報告されている。

FeLVゲノムは３つの遺伝子：ウイルス主要構成要素を
コードするgag遺伝子、外皮糖タンパク質をコードするe
nv遺伝子およびポリメラーゼタンパク質をコードするpo
l遺伝子をコードする。該gag遺伝子は、４つのサブユニ
ット:p15マトリックスタンパク質、機能不明のp12タン
パク質、p27キャプシドタンパク質およびp10ヌクレオキ
ャプシドタンパク質に加工される65kDポリプロテインと
して発現される。該pol遺伝子は３つのタンパク質：プ
ロテアーゼ、逆転写酵素およびインテグラーゼをコード
する。該遺伝子のプロテアーゼ部分による自己プロセッ
シング（autoprocessing）は、該pol領域の全３つのタ
ンパク質を生じる。加えて、該プロテアーゼは、gag前
駆体の加工を担っている。該pol遺伝子は、gag−pol融
合タンパク質として発現される。該エンベロープ遺伝子
は、85Kd糖タンパク質、gp85として発現され、これは、
さらにウイルス粒子の表面に見い出されるジスルフィド
結合し、膜会合した70kDおよび15kD（p15E）複合体に加
工される。この同じgag−プロテアーゼ領域を、ネコヘ
ルペスウイルス（FHV）ゲノムに挿入し、組換えFHV感染
細胞中で、gag遺伝子産物およびgag−プロテアーゼ融合
タンパク質の両方を生産することが示された。該プロテ
アーゼもまたgag（p65）の、４つのポリペプチド要素へ
の加工において活性であった。

バキュロウイルス発現系バキュロウイルスは、特定の昆虫に高い病原性を有す
るが、脊椎動物または植物には病原性がないウイルスの
大きな一群である。バキュロウイルス発現ベクター系
（BEVS）の出現により、ウイルス、糸状菌、細菌、植物
および動物由来の広範な遺伝子が、組換えバキュロウイ
ルスで発現されている。簡単には、BEVSは、バキュロウ
イルス調節エレメント制御下で遺伝子が発現されるよう
なバキュロウイルスゲノム位置に、異種遺伝子を挿入さ
せるため発現ベクターを用いる。該組換えバキュロウイ
ルスを培養昆虫細胞系に感染させ、そこで異種タンパク
質が発現される。いくつかのグループがこの系を用い、
２つの他のレトロウイルス、ヒト免疫不全ウイルスおよ
びトリ白血病ウイルスの表面糖タンパク質を発現させて
いる。該レトロウイルスgag遺伝子も発現され、感染昆
虫細胞中でウイルス様粒子に会合することが見い出され
たと報告されている。

ワクチン接種哺乳動物のワクチン接種は、ほとんど常に、皮下もし
くは筋肉内注射の使用を介して行われ、皮下が好ましい
経路である。小さなペット動物（イヌ、ネコ、その他）
の場合、いくつかのワクチンは、鼻腔内および／または
経口的にも投与される。これら、２つの異なった方法で
の宿主へのワクチン投与は、免疫系の応答が区分される
ため不利である。これは、粘膜表面の接種は異なった免
疫学的部位の刺激に適合するが、皮下投与が全身的な反
応だけを本当に刺激することを意味する。

本発明者らは、本明細書において、FeLVのgag、gp70
およびgp85遺伝子を発現するたげでなく、未熟なウイル
ス様粒子に会合し、それがgagおよびgp85ウイルスで同
時感染させた昆虫細胞の培地に放出される、組換えバキ
ュロウイルスの構築を記載する。加えて、本発明はこの
ようなウイルスおよびこれらの組換えウイルスに基づく
FeLVワクチンの製法を提供する。本発明は、また、哺乳
動物のワクチン接種方法を包含し、本発明者らは、驚く
べきことに、天然ウイルス宿主の粘膜および全身部位双
方へのワクチン投与により、持続性ウイルス血症に対
し、本質的に十分な保護が達成されうることを見い出し
た。

情報の開示ノートボーン，エム・エイチ・エム（Noteborn,M.H.
M.）ら、ジャーナル・オブ・ゼネラル・バイロロジー
（J.Gen.Virol.）、71:2641〜2648頁（1990）は、BEVS
を用いた昆虫細胞中におけるトリ白血病ウイルス表面糖
タンパク質の発現を報告している。この刊行物は、本発
明の組換えバキュロウイルスを示唆していない。

ウェルズ，ディー・イー（Wells,D.E.）およびコンパ
ンス，アール・ダブリュー（Compans,R.W.）、バイロロ
ジー（Virology）、176:575〜586頁（1990）、ヒュー，
エス−エル（Hu,S−Ｌ）ら、ジャーナル・オブ・バイロ
ロジー（J.Virol.）、61:3617〜3620頁（1987）および
ルッシェ，ジェイ・アール（Rusche,J.R.）ら、プロシ
ーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・
サイエンシーズ・オブ・ザ・ユーエスエイ（Proc.Natl.
Acad.Sci.U.S.A.）、84:6924〜6928頁（1987）は、BEVS
を用いた昆虫細胞中におけるヒト免疫不全症候群ウイル
ス（HIV）の表面糖タンパク質の発現を報告している。
これらの刊行物は、本発明のFeLV組換えバキュロウイル
スを示唆していない。

モリカワ，エス（Morikawa,S.）ら、バイロロジー（V
irology）、183:288〜297頁（1991）は、レンチウイル
スネコ免疫不全ウイルス（FIV）からのgag遺伝子の発現
におけるBEVSの使用を報告している。発現タンパク質
は、gag配列として同時感染した場合、感染した昆虫細
胞中でウイルス様粒子（VLP）に会合する。該pol配列の
封入は、粒子形成を停止させた。この刊行物は、本発明
のFeLV組換えバキュロウイルスについて示唆していな
い。

ルオ，エル（Luo,L.）ら、バイロロジー（Virolog
y）、179:874〜880頁（1990）、ゲイセン，ディー（Ghe
ysen,D.）ら、セル（Cell）、59:103〜112頁（1989）、
オーバートン，エイチ・エイ（Overton,H.A.）ら、バイ
ロロジー（Virology）、170:107〜116頁（1989）、ヒュ
ー，エス−エル（Hu,S−Ｌ）ら、ジャーナル・オブ・バ
イロロジー（J.Virol.）、61:3617〜3620頁（1987）お
よびメディセン，エル（Madisen,L.）ら、バイロロジー
（Virology）、158:248〜250頁（1987）は、感染した昆
虫細胞におけるウイルス様粒子に会合したレンチウイル
スヒト免疫不全ウイルス（HIV）の発現を報告してい
る。該発現タンパク質は、gag配列として同時感染した
場合、感染昆虫細胞中でウイルス様粒子に会合する。し
かし、再度、pol配列の含有は、該VLPを停止させた。デ
ルチャンブル，エム（Delchambre,M.）ら、ディ・エン
ボ・ジャーナル（EMBO）、8:2653〜2660頁（1989）は、
感染した昆虫細胞におけるウイルス様粒子に会合したレ
ンチウイルスサル免疫不全ウイルス（SIV）gagタンパク
質の発現を報告している。該発現タンパク質は、gag配
列として同時感染した場合、感染昆虫細胞中でウイルス
様粒子に会合する。しかし、再度、pol配列の含有は該V
LPを停止させ、かくして、この刊行物は本発明のFeLV組
換えバキュロウイルスを示唆していない。

ラスムッセン，エル（Rasmussen,L.）ら、バイロロジ
ー（Virology）、178:435〜451頁（1990）は、感染した
昆虫細胞におけるウイルス様粒子に会合したレンチウイ
ルスウシ免疫不全ウイルス（BIV）gagタンパク質の発現
を報告している。該発現タンパク質は、gag配列と同時
感染した場合、感染昆虫細胞中でウイルス様粒子に会合
する。しかし、再度、pol配列の含有は、該VLPを停止さ
せ、かくして、この刊行物は本発明のFeLV組換えバキュ
ロウイルスを示唆していない。

キンマン，ティー・ジー（Kimman,T.G.）ら、「獣医
免疫学＆免疫病原学（Veterinary Immunology＆Immunop
athology）」、22:145〜160頁（1989）は、粘膜または
筋肉内経路を経て投与するウシ呼吸系シンシチウムウイ
ルスワクチンの効率について報告している。該報告は、
完全な保護を提供するための両部位への投与を示唆して
いない。

発明の概要本発明の第１の態様は、ネコ白血病ウイルス（FeLV）
糖タンパク質よりなる多剤（multiple−dose）投与型の
ワクチンを提供する。さらに詳しくは、本発明は、
（ａ）バキュロウイルスで発現した（以下、バキュロウ
イルス発現と称する）FeLV gp70、gp85および／またはg
agよりなる投与剤；および（ｂ）FeLV gp70、gp85およ
び／またはgagをコードするDNAを発現するように設計さ
れた組換えネコヘルペスウイルス（FHV）よりなる投与
剤からなる多剤投与型のFeLVワクチンを提供する。

また、本発明は、バキュロウイルス発現FeLV gp70、g
p85および／またはgagよりなる２種の投与剤からなる多
剤投与型のFeLVワクチンを提供する。

本発明の第２の態様は、（ａ）バキュロウイルス発現
FeLV gp70、gp85および／またはgagよりなる非経口投与
用の投与剤；および（ｂ）FeLV gp70、gp85および／ま
たはgagをコードするDNAを発現するように設計された組
換えFHVよりなる粘膜投与用の投与剤からなる多剤投与
型のFeLVワクチン接種キットを提供する。

また、本発明は、バキュロウイルス発現FeLV gp70、g
p85および／またはgagよりなる非経口投与用の２種の投
与剤からなる多剤投与型FeLVワクチン接種キットを提供
する。

本発明の第３の態様は、（ａ）バキュロウイルス発現
FeLV gp70、gp85および／またはgagタンパク質の投与剤
を用意し；（ｂ）FeLV gp70、gp85および／またはgag遺
伝子をコードするDNAを発現するように設計された組換
えFHVの投与剤を用意し；ついで（ｃ）そのバキュロウ
イルス発現FeLV gp70、gp85および／またはgag蛋白質の
投与剤および組換えFHVの投与剤をネコに投与すること
よりなる、該ネコにFeLVに対する免疫を付与する方法を
提供する。

図面の簡単な説明図１は、攻撃後０、１、３、５および７週間のネコか
ら採取した血清に対するp27アッセイの結果を示す（ワ
クチン実験Ｉ）。

図２は、ワクチン接種し攻撃したネコから採取した血
清に対するp27アッセイの結果を示す（ワクチン実験I
I）。

図３は、異なったベクターの組合せでワクチン接種し
たネコの血清からの攻撃後９週間におけるp27アッセイ
の結果を示す。各々の棒線は、一匹のネコからの値を示
す（ワクチン実験III）。陰の部分の値は、陰性とみな
した。

発明の詳細な説明いずれの免疫原性FeLVタンパク質も、本明細書記載の
方法および技術に従って、バキュロウイルスで発現しう
る。例えば、FeLVのgag、gp70およびgp85をコードする
遺伝子の部位および配列ならびに、それによりコードさ
れているタンパク質配列は公知であり、当該分野でよく
知られた技術に従って分離しうる。例えば、米国特許第
4,789,702号（FeLVgp70配列）；欧州特許第0247904号
（gp70タンパク質配列）、ジャーナル・オブ・バイロロ
ジー（J.Virol.）、62:722〜731頁（gp85）を参照され
たし。別法として、gag、gp70およびgp85について公表
されている配列および、当該分野でよく知られた技術に
従って本目的に設計された器具を用い、該遺伝子を化学
的に合成しうる。組換え技術を用い、FeLVgag、gp70お
よびgp85、またはその免疫原性部分をコードする遺伝子
をプラスミドに形質転換し、かくして、該遺伝子は便宜
には、好ましくは本発明のトランスファーベクター中に
て、かかる入手源から入手できる。プラスミドの例は、
pFeLVgag3（gag遺伝子をコード）、pTC2（gp85をコー
ド）（PUC−FeLVenvとしても公知）、ptGAΔAvaI、ptGA
ΔApaI、pt9:3−19（米国特許第4,701,416号で報告され
ているように、全gp70の抗原性部分をコードする）であ
り;pFeLVgag3およびpTC2は、本発明の具体例で好まし
い。

BEVSもまた、いくつかの場合において大量の異種タン
パク質を生産することが示されている、便利な組換え発
現系として当該分野でよく知られている。BEVSは、「組
換えDNA技術および応用（Recombinant DNA Technology
and Applications）」、シー・ホー，（C.Ho,）、エ
イ．プロコップ，（A.Prokop,）およびアール．バーペ
イ，（R.Bajpai,）編（1990）、マグロー・ヒル（MaGra
w−Hill）、ニュー・ヨーク（New York）およびラッコ
ウ・ブイ・エイ（Luckow,V.A.）＆サマーズ，エム・デ
ィー（Summers,M.D.）、バイオ／テクノロジー（Bio/Te
chnology）、6:47〜55頁（1988）中の、「バキュロウイ
ルスベクターを用いた昆虫細胞における異種遺伝子のク
ローニングおよび発現（Cloning and expression of he
terologous genes in insect cells with baculovirus
vectors）」に、ラッコウ，ブイ・エイ（Luckow,V.A.）
によって詳細に概説されており、出典明示して本明細書
の一部とみなす。本発明の組換えバキュロウイルス構築
のため、本発明者らは、後者の文献に詳細に記載されて
いる方法を用いる。

膨大な数のバキュロウイルス種が知られているが、BE
VSに用いる好ましいビリオンは、AcNPVまたはAcMNPVと
しても公知であるアウトグラファ・カリフォルニカ（Au
tographa californica）である。AcNPVは、30種を超え
る鱗翅目細胞に感染し、好ましい宿主は、スポドプテラ
・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）細胞系Sf9で
ある。

バキュロウイルスに挿入すべき外来遺伝子では、バキ
ュロウイルスDNA側方にクローニング部位を含有するプ
ラスミドを用いる。該培養宿主細胞を、このプラスミド
および野生型バキュロウイルスのゲノムDNAで同時感染
させ、それにより組換えを起こして、異種遺伝子を担う
ウイルスゲノムを産生させる。同時感染を誘起させる方
法および条件は、当該分野でよく知られている。例は、
リン酸カルシウム共沈澱［グラハム，エフ・エル（Grah
am,F.L.）およびファン・デル・エプ，アー・ヨット（v
an der Eb,A.J.）、バイロロジー（Virology）、52:456
〜467頁（1973）］、プロタミン［ウィンヒュース，ユ
ー（Wienhues,U.）ら、ディーエヌエイ（DNA）、ニュー
ヨーク（NY）、6:81〜89頁（1987）］、リポペクチン
［バイオテクニックス（Biotechniques）、11:310〜312
頁］およびエレクトロポレイション［マン，エス・ジー
（Mann,S.G.）およびキング，エル・エイ（King,L.
A.）、ジャーナル・オブ・ジェネラル・バイロロジー
（J.Gen.Virol.）、70:3501〜3505頁（1989）］を包含
する。本発明者らは、下記に詳細に概説するリン酸カル
シウム法を用い、これは本発明の組換えバキュロウイル
スを生産する好ましいトランスフェクション方法であ
る。

典型的には、細胞外ウイルスの複製または生成に必須
でない、遺伝子である核多角体遺伝子への挿入は、該異
種遺伝子を標的とする。これは、一般に、核多角体プロ
モーターおよび該核多核体プロモーターDNAを挟む３′
および５′DNAの配列をコードするバキュロウイルスDNA
をプラスミド・トランスファー・ベクターに含有させる
ことにより達成される。次いで、外来遺伝子を、当該分
野で公知の組換えDNA手法を用いて、該プロモーターの
下流へと該トランスファー・ベクターに挿入する。広範
囲の適当なトランスファー・ベクターが公知であり、本
発明の具体例で用いるのに適当であろう。これらの中に
は、pACYMI、pEV55、pAC373、pACRP、pEVIV、pEV51およ
びpVL941があり；好ましいベクターは、pVL941である。
さらに、該gagおよびenv両遺伝子は、入手可能ないくつ
かの複数クローニングサイトベクターを用い、単一のウ
イルスに挿入しうる。適当な複数サイトベクターの例
は、p2XIVVI^-X3、pXIVVI^-、［ジーン（Gene）、100:131
〜137頁（1991）記載の］pSyn nWTVI^-、またはプロテイ
ン・エンジニアリング（Protein Engineering）、1:359
〜366頁（1987）記載のpACVC2を包含する。

本発明の組換えバキュロウイルスは、目視スクリーニ
ング、続いてのDNAドット・ブロット・ハイブリダイゼ
ーション、セル・アフィニティー技術、プラーク・ハイ
ブリダイゼーションまたは当該分野で公知の他の技術に
より同定しうる。本発明の組換えバキュロウイルスは、
同定および精製を容易とするために色素生産性および／
または酵素基質のためのタンパク質を包含しうる。好ま
しい方法は、野生型バキュロウイルスに特徴的な封入体
を欠くので組換え体を目視スクリーニングすることがあ
り；目視スクリーニングは当該分野でよく知られた技術
である。次いで、封入体−欠損表現体を拾い出し、DNA
ドット・ブロット・ハイブリダイゼーションのため96穴
プレートに置いた。このハイブリダイゼーション技術
は、組換えDNA技術の分野でよく知られており、特に説
明しない。精製し、最も強いハイブリダイゼーション・
シグナルに相当するいくつかのウイルスをさらに十分に
特徴付けするのが好ましい。

本発明の組換えバキュロウイルスは、数々の継続的培
養昆虫細胞系で増殖され、最も典型的には、アンティカ
ーサ・ゲムミタリス（Anticarsa gemmitalis）（マメイ
モムシ）、ボンビクス・モリ（Bombyx mori）（カイ
コ）、エスティグメネ・アクレア（Estigmene acrea）
（アメリカヒトリガの幼虫）、ヘリオトヒス・ビレスセ
ンス（Heliothis virescences）（タバコ芽食い毛ム
シ）、ロイカニア・セパラタ（Leucania separata）、
リマントリア・ディスパール（Lymantria dispar）（マ
イマイガ）、マラカソマ・ディスストリア（Malacasoma
disstria）（テンマクケムシ）、マメストラ・ブラシ
カエ（Mammestra brassicae）（アオムシ）、マンドゥ
カ・セクスタ（Manduca sexta）（タバコイモムシ）、
プルテラ・ジロステラ（Plutella zylostella）（コナ
ガ）、スポドプテラ・エクシグア（Spodoptera exigu
a）（マメアワヨトウ幼虫）およびスポドプテラ・リト
ルリス（Spodoptera littorlis）がある。本発明の組換
えバキュロウイルスの増殖のための好ましい昆虫細胞系
は、スポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugipe
rda）Sf−９である。

本発明の糖タンパク質またはその免疫原性断片を利用
して製造したワクチンは、固定した宿主細胞、宿主細胞
抽出物または、宿主細胞から部分的もしくは完全に精製
した、または化学合成により製造したFeLV糖タンパク質
からなりうる。本発明に従って製造したFeLV糖タンパク
質免疫原は、好ましくは完全なFeLVウイルスがないもの
である。かくして、本発明のワクチン免疫原は、望まし
いFeLVポリペプチドおよび／またはFeLV抗原性を示す他
のFeLVポリペプチドの実質上全体からなる。

免疫原は、よく知られた手法によりワクチン投与型に
製造されうる。該ワクチンは、次いで、非経口的または
粘膜的に投与されうる。筋肉内または皮下接種のごとき
非経口投与の場合、該免疫原は適切な担体と組合せるこ
とができる。例えば、それは、水酸化アルミニウム、リ
ン酸アルミニウム、硫酸カリウムアルミニウム（ミョウ
バン）、硫酸ベリリウム、シリカ、カオリン、炭素、油
中水型エマルジョン、水中油型エマルジョン、ムラミル
ジペプチド、細菌性エンドトキシン、リピドＸ、コリネ
バクテリウム・パルバム（Corynebacterium parvum）、
［プロピオニバクテリウム・アクネス（Propionibacter
ium acnes）］、ボルデテラ・ペルタスシス（Bordetell
a pertussis）、ポリリボヌクレオチド、アルギン酸ナ
トリウム、ラノリン・リソレシチン、ビタミンＡ、サポ
ニン、リポソーム、レバミゾール、DEAE−デキストラ
ン、ブロック共重合体または他の合成アジュバントを包
含する各種アジュバントまたは免疫調整剤を含むまたは
含まない水、生理食塩水または緩衝化ビヒクル中にて投
与されうる。かかるアジュバントは、例えば、メルク・
アジュバント65（Merck Adjuvant 65）、［メルク・ア
ンド・カンパニー・インコーポレーションズ、ラーウェ
イ・ニュージャージー州（Merck and Company,Inc.,Rah
way,N.J.）］等の種々の入手源から商業的に入手しう
る。もうひとつの適切なアジュバントは、フロイントの
不完全アジュバントである［ディフコ研究所、デトロイ
ト、ミシガン州（Difco Laboratories,Detroit,Michiga
n）］である。他のワクチンは、出典明示して本明細書
の一部とみなすディザード，アイ（Tizard,I）の「獣医
免疫学概説第２版（An Introduction to Veterinary
Immunology,2nd ed.（1982）」第４章に記載されている
ごとく当業者によく知られた方法により製造しうる。

非経口投与の場合、免疫原およびアジュバントの比率
は、両方が有効量にある限り、広い範囲で変化させう
る。例えば、水酸化アルミニウムは、該ワクチン混合物
（水酸化アルミニウムベース）の約0.5％の量で存在さ
せうる。１回投与量ベース当たり、免疫原の純度および
免疫原性に応じ、免疫原濃度は、１匹のネコ当たり約1.
0μｇ〜10mgの範囲としうる。好ましい免疫原濃度およ
び投与容量は、宿主の年齢および体重ならびにワクチン
接種分野の当業者に知られている他の要因に依存して変
化する。例えば、ネコでは、好ましい範囲は約10μｇ〜
1.0mg;適当な用量サイズは、約0.5〜5ml、好ましくは約
1.0mlである。従って、注射投与量は、例えば、0.5％水
酸化アルミニウムと混合した1.0mgの免疫原を含有する1
mlからなる。同等の投与形態もまた成体に達する前の哺
乳動物の非経口投与のために製造しうるが、投与量当た
りの免疫原の量はより小さく、例えば子ネコの場合、投
与量当たり約0.25〜1.0mlである。

粘膜投与の場合、免疫原は、適当な担体、例えば水、
生理食塩水または緩衝化ビヒクルと組合わせることがで
きる。加えて、種々の当該分野で公知の免疫調整剤が、
特別に粘膜の免疫応答を高めるため添加されうる。かか
る剤は、コレラ毒またはその部分、DEAE−デキストラ
ン、インターロイキン（例えばIL−５）、イー・コリ
（E.coli）のLTトキシン、シガトキシンおよびグラム陰
性生物からの他のトキシンを包含する。ひとたび処方化
されると、かかるワクチンは、本目的に適した器具、例
えば小さな鼻用カニューレによる滴下を用い、エアロゾ
ール化等によっていずれの粘膜表面、典型的かつ最も簡
便には、鼻孔および／または中咽頭に導入されうる。粘
膜投与のための免疫原濃度ならびに用量サイズは、非経
口投与に用いたものと同様である。

ワクチン接種は、２投与量法により行うことができ
る。好ましくは、該２投与量法は、上記概略のような粘
膜へ投与される第１投与量、続いての非経口投与される
第２投与量からなる。本発明のこの態様に従い、第２投
与量は、最初の粘膜接種後しばらく経ってから投与され
る。最初の粘膜接種と、２回目の後の通時の非経口接種
との間で経過すべき時間間隔は、宿主の年齢、体重、健
康状態等、それに対して保護が必要とされるウイルス、
各ワクチンの免疫原性等に依存する。普通の条件下では
該粘膜投与は、免疫原が免疫系へ接近させるため、複製
剤、すなわち生組換えウイルスまたは細菌よりなること
はよく理解される。加えて、２回目の非経口接種は、複
製もしくは非複製剤のどちらか一方からなりうる。しか
しながら、このプロトコルは、例えば、抗原のマイクロ
フェアのカプセル化によって、非複製抗原が粘膜免疫系
に送達されうるような、抗原送達の唯一の方法ではな
い。これらおよび他の要因は、当該分野でよく知られて
おり、体重の測定およびこれらの要因すべての相対的重
要性は、当該者のルーチン的考慮の範囲内のものであ
る。本発明のこの二重手法は、区分された免疫原性反応
を示す、すなわち、粘膜部位を経て宿主への侵入を獲得
するが、全身的にも複製するウイルスに対して最も効果
的であり、ヒトを含む全ての哺乳動物で用いるのに適す
る。このような区分された応答を示すウイルス生物の例
は、（ヒトにおいて）インフルエンザおよびヘルペス感
染を引き起こすウイルス；（ウシにおける）感染性鼻腔
気管炎およびウイルス性下痢；（ネコにおける）全白血
球減少症、白血病、鼻腔気管炎およびカリチウイルス；
（ブタ）シュードラビエス（Pseudorabies）、パルボウ
イルスおよび脳心筋炎ウイルス；（イヌ）ジステンパ
ー、感染肝炎およびパルボウイルスを包含する。細菌生
物の例は、ヒトにおけるスタフィロコッカス（Staphylo
coccus）感染、ウシにおけるパステレラ・マルトシダ
（Pasteurella multocida）、ピイ・ヘモリティカ（P.h
emolytica）およびヘモフィラス・ソムナス（Hemophilu
s somnus）、ブタにおけるアクチノバチラス・プレロニ
ューモニア（Actinobacillus pleuropneumonia）、ピイ
・マルトシダ（P.multocida）およびブタ、イヌの双方
におけるボルデテラ・ブロンコセプティカ（Bordetella
bronchoseptica）を包含する。また本発明の二重手法
は、粘膜部位または非経口部位のどちらか一方で優先的
に複製する生物、例えば、ウシにおける呼吸系シンチウ
ムおよびパラインフルエンザ−３ウイルス、およびネコ
における免疫不全症ウイルスに対しても有効であると考
えられる。これらのウイルスに対するワクチンは、標的
動物において各ワクチンに適する用量および濃度を用い
て投与され、このことは当該分野で公知である。現在入
取可能なワクチンは、本発明の二重投与法による投与に
適するように再処方化される必要があり得る。

本発明のこの二重投与法は、２種類のワクチン成分を
それらの適当な部位に同時に投与することによっても達
成しうる。両サイトへの正確な同時刻での投与は当業者
に、あり得ないと認識されており、かくして、同時投与
の時間間隔は、例えば、２回目の投薬のために宿主が用
意され、投与のために第２用量が用意され、第１用量の
投与後の弱った徴候が宿主に観察される等のように経験
されうる遅れを包含する。かくして、本発明の同時投与
法に従う場合、例えばネコには、鼻孔内および／または
経口投与する適当なワクチン処方の適量及び適当なワク
チンでの同時筋肉内ワクチン接種を摂取させる。

本発明の二重手法によりワクチンを投与する場合、該
ワクチンには、同一または異なるベクター中に製造また
は供した、あるいは同一または異なるビヒクル中に処分
した同一の免疫原性成分を含有させることができる。た
った今記載した同時二重投与は、両方の免疫原性区画へ
の刺激を提供し、かくして、２回目の、後の適時の投薬
の必要を減じると考えられる。

本発明のFeLVワクチンでのワクチン接種は、伝統的方
法によっても達成しうる。典型的には、第１用量を非経
口部位、または稀にいくつかのワクチンの場合には、粘
膜部位に投与される。１回目接種部位の選択は、治療す
べき動物ならびに、該部位へのワクチンの利用性および
適合性に依存する。適当な期間により、要すれば第２用
量を投与する。伝統的には、第１のものと同一部位に第
２用量を投与する。すなわち、第１のものが粘膜投与で
あれば第２のものも粘膜投与である。いかなる部位が初
投与に適するかという決定、第２用量の必要性および第
２用量までの時間間隔、投与すべき用量等は、全て、哺
乳動物のワクチン接種技術分野の当業者に知られかつ理
解されている要因である。

例えば、ネコにワクチン接種する場合、第１用量は、
６〜10週齢に投与できる。次いで、ワクチンの第２用量
は、第１用量から数週間後、例えば約２〜４週間後に投
与すべきである。別法として、ワクチンは、単一の1m1
用量として、例えば約６〜10週齢にて投与できる。しか
しながら、二重投与法は、最も効果的なネコの免疫とし
て好ましいと考えられる。年一回の再ワクチン化が推奨
される。成体には、いずれの時期に再ワクチン接種して
もよい。ワクチン接種していない成体から産まれた子ネ
コは、生後約３〜10日、再度生後４〜６月、その毎年ワ
クチン接種できる。

本発明のFeLVワクチンならびに公知ワクチンは、伝統
的技術に従って投与するかまたは本発明の二重方法に従
って投与する場合、多価ワクチンを製造するため、他の
疾病用の他のワクチンと組合わせることができる。加え
て、本発明のワクチンならびに公知ワクチンは、伝統的
技術に従って投与するかまたは本発明の二重投与法に従
って投与する場合、他の薬剤、例えば抗生物質と組み合
わせることもできる。

「ウイルス様粒子」とは、バキュロウイルス感染昆虫
細胞によって生産される粒子で、（クロマトグラフィー
での）密度およびサイズ、形状および（EM分析での）環
構造が、未熟FeLV粒子に類似している。

本発明を実施するのに使用したほとんどの組換えDNA
方法は、標準的な操作であり、当業者によく知られ、例
えば、ジェイ、ミラー，（J.Miller,）、「分子遺伝学
実験（Experiments in Molecular Genetics）」、コー
ルド・スプリング・ハーバー研究所、コールド・スプリ
ング・ハーバー、ニュー・ヨーク（Cold Spring Harbor
Laboratory,Cold Spring Hrbor,N.Y.（1972）、ディー
・エイ、モリソン（D.A.Morrison）、「凍結によるコン
ピテント細菌細胞の形質転換および保存（Transformati
on and Preservation of Competent Bacteiral Cells b
y Freezing）」、メソッズ・イン・エンザイモロジー
（Methods Enzymol.）、68、326〜331頁（1979）、ジェ
イ、サンブルック（J.Sambrook）ら、「モレキュラー・
クローニング、ア・ラボラトリー・マニュアル（Molecu
lar Cloning,A Laboratory Manual）」、コールド・ス
プリング・ハーバー・プレス（Cold Spring Harbor Pre
ss）（1989）、ジェイ、パーバル（J.Perbal）、「モレ
キュラー・クローニングへの実践的案内（A Practical
Guide to Molecular Cloning）」、ジョン・ウィレイ＆
サンズ（John Wiley ＆ Sons）（1984）、およびエム
・ディー、サマーズ（M.D.Summers）およびジー・イ
ー、スミス（G.E.Smith）、アグリカルチュラル・エク
スペリメンタル・ブレチン（Agricultural Experimenta
l Bulletin）、第1555号（1987）に詳細に記載されてお
り、出典明示してすべて本明細書の一部とみなす。注記
する場合を除き、全ての制限酵素、化学物質および材料
またはそれらの同等物は、商業的販売者から容易に入手
できる。エンドヌクレアーゼ制限は、製造業者の勧告に
従った。

さらなる詳述なしで、当業者なら、前記の説明を用い
本発明を十分に実施できると考えられる。以下の詳細な
実施例では、本発明の種々の組換えをバキュロウイルス
の構築方法、および／または種々の本発明工程の実施方
法を記載し、単に例示的なものであって、これまでの開
示を断じて限定するものと解釈されるべきでない。当業
者ならば、反応物ならびに反応の条件および技術に関す
る方法から、適当な変法を直ちに理解するであろう。

実験材料および実験方法細胞、ウイルスおよびプラスミドバキュロウイルス親株、アウトグラフィカ・カリフォ
ミカ（Autographica califomica）核多角体病ウイルス
（AcNPV）、E2株はマックス・サマーズ（Max Summers）
（テキサスＡ＆Ｍ大学）から得た。スポドプテラ・フル
ギペルダ（Spodoptera frugiperda）細胞系Sf−９は、
アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（CRL1
711）から得た。プラスミドpFeLVgag3、pTC2およびpCG1
13、ならびに細胞系FeLV−A/FGAは、セータス（Cetus）
社から得た。該細胞、ウイルス親株および組換えウイル
スはテキサス・アグリカルチュラル・エクスペリメンタ
ル・ブレチン（Texas Agricultural Experimantal Bull
etin）、第1555号（1989）に詳細に記載されている方法
により増殖させる。

プラスミドpVL941は、ラッコウ，ブイ・イー（Laucko
w,V.E.）およびエム・ディー、サマーズ（M.D.Summer
s,）、バイロロジー（Virology）、170:31〜39頁（198
9）に記載されている。

FeLV−A/FGAは、FeLVサブグループＡに属し、恒久的
にクランデル（Crandell）ネコ腎臓（CRFK）細胞系感染
し、ジャーナル・オブ・バイロロジー（J.Virol.）、6
4:4930〜4938頁（1990）に記載されている。FeLV−A/FG
A細胞は、10％ウシ胎児血清（FCS）を補足したダルベッ
コの修飾イーグル培地（DMEM）で増殖させた。

CT600細胞およびGp50モノクローナル抗体（MAB）は、
カリフォルニア大学・デービス分校のエヌ、ペダーセン
（N.Pedersen）博士から寄贈された。

AcNPV−gp50は、シュードラビエス（pseudorabies）
ウイルスからのエンベロープタンパク質gp50を発現する
組換えバキュロウイルスであり、ジャーナル・オブ・セ
リュラー・バイオケミストリー（J.Cell.Biochem.）、4
3:67〜79頁（1990）記載のプロトコルに従って合成す
る。

FeLVのgagおよびgp85を発現するFHV組換え体は、セー
タス（Cetus）社のジェイ、ヌンベルグ（J.Nunberg）か
ら入手、発現はジャーナル・オブ・バイロロジー（J.Vi
rol.）、64:4930〜4938頁（1990）に記載されている。

FeLV全ウイルスは、テイレン（Theilen）ら、ネイチ
ャー（Nature）、222:589〜590頁（1969）に記載されて
いるごとく、FL74細胞系で生産する。gp70は、ワクチン
（Vaccine）、7:142〜146頁（1989）に記載されている
ごとく精製したFL74細胞からのウイルスを用いて調製す
る。

動物全ての実験で、特別な病原体−フリーのネコを用
いる。動物は、個別のカゴまたは６〜８匹のネコの檻の
どちらか一方の収容施設で飼育する。動物には、自由に
キャット・フードおよび水を摂取させた。

ウイルスに感染した細胞に特異性なポリペプチドの標識
³⁵S−メチオニン（50μCI/ml）での標識は、通常濃度
のメチオニンの1/10を含有する10％FCSをグレース培地
に添加した中で行う。³H−グルコサミン（50μCi/ml）
標識は、10％FCSを添加したグレース培地中で行う。両
標識培地から、酵母分解物およびラクトアルブミン加水
分解物は省略する。細胞を５〜10プラーク形成単位（pf
u/細胞）の感染の多重度（MOI）で感染し、感染後24〜4
8時間で標識した。メチオニン標識細胞および培地を収
穫し、ジャーナル・オブ・バイロロジー（J.Virol.）、
60:216〜223頁（1986）に記載されているごとくに免疫
沈降のため処理する。グルコサミン標識細胞および培地
を、直接SDS−PAGE解離緩衝液に採取する。

ショ糖勾配分析 100ml回転フラスコ中で増殖するSf−
９細胞（１×10⁶細胞/ml）を、単一感染培養物では、各
々のウイルスの10pfu/細胞MOIにて、あるいは多重感染
培養物では、5pfu/細胞にて、組換えバキュロウイルスA
cNPV−gag、AcNPV−gp85、AcNPV−gp70または対照ウイ
ルスAcNPV−gp50で感染させる。感染させた細胞培養物
は、感染後64時間に採取する。FeLVは、該細胞が密集す
ると、持続性感染FeLV−A/FGA細胞上清から採取する。
細胞および細胞夾雑物は、低速遠心分離により除去す
る。その上清を次いで、100,000×ｇで１時間遠心分離
する。高速回転からのペレットをリン酸緩衝化生理食塩
水（PBS）に再懸濁し、20〜60％ショ糖勾配に重ね、SW4
1ローター中、100,000×ｇで16時間遠心分離する。勾配
は、頂点から分画する。各画分（0.5ml）は、ショ糖濃
度およびタンパク質含有量［BCAタンパク質アッセイキ
ット、ピアス・ケミカル（Pierce Chemcal）社］につき
分析する。各画分の個々のタンパク質を検知するため、
ウェスタン・ブロットを用いる。いくつかの画分のウイ
ルス粒子の存在は、電子顕微鏡により直接観察する。

ウエスタン・ブロット分析ウエスタン・ブロット分析
のため、勾配の各画分からの等分を、ラエムリ（Laemml
i）の方法［ネイチャー（Nature）、227:680〜685頁（1
970）］を用いて、11％のN,N−ジアリルタータージアミ
ド（DATD）−架橋ポリアクリルアミドゲルで分離する。
電気泳動に続いて、タンパク質を、タウビン，エッチ
（Towbin,H.）ら、プロシーディングズ・オブ・ナショ
ナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・オブ・ザ・ユ
ーエスエイ（Proc.Natl.Acad.Sci.USA）、76:4350〜435
4頁（1979）の手法に従って、0.22μｍニトロセルロー
スに電気ブロットする。ニトロセルロース上の占有され
ていない部位を、0.1％のトゥイーン20を含有するPBSお
よび0.1％のBrij−58を含有するpH7.4のトリス−セリン
中で連続してインキュベートし、ブロックする。ブロッ
ト膜を一次抗体とインキュベートし、ヒンク，ダブリュ
ー・エフ（Hink,W.F.）ら、バイオテクノロジー・プロ
グレス（Biotechnology Progress）、7:9〜14頁（199
1）に記載されているごとく着色展開を行う。gagおよび
gp70を検知するため、ルッツ，エッチ（Lutz,H.）ら、
アメリカン・ジャーナル・オブ・ベテリナリー・リサー
チ（Am.J.Vet.Res）、44:2054〜2059頁（1983）、ルッ
ツ，エッチ（Lutz,H）ら、（Vet.Immunol.Immunopatho
l.）、2:425〜440頁（1981）およびグラント，シー・ジ
ェイ（Grant,C.J.）ら、ジャーナル・オブ・イムノロジ
ー（J.Immunol.）、131:3042〜3048頁（1983）に記載さ
れているごとくモノクローナル抗体を用いる。

EM分析該ショ糖勾配からのピーク画分は、0.05％ウシ
血清アルブミン（BSA）溶液を含有する２％のリンタン
グステン酸（PTA）溶液100μｌと当該画分50μｌを混合
することによりEM用に調製する。該混合物を一滴、炭素
フォルムバル（carbon−formvar）コートしたグリッド
［テッド・ペラ社、レディング、カリフォルニア（Ted
Pella Inc.,Redding,California）］に移す。該サンプ
ルは、30秒間吸着させ、過剰の流体は、グリッド端をフ
ィルター紙に触れさせることにより除く。グリッドJEOL
1200透過型電子顕微鏡にて60KVで観察する。

ワクチンとして用いられる抗原の調製回転フラスコ中
のスポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperd
a）（Sf−９）細胞を、細胞密度１×10⁶細胞/ml、５プ
ラーク形成能（pfu）／細胞の感染の多重度で感染させ
る。該細胞は、以下の組換えウイルス:AcNPVgp85または
AcNPVgp70のどちらか一方で感染させるか、またはAcNPV
gp85およびAcNPVgagで同時感染させる。各培養物を感染
70時間後に採集する。gp85またはgp70で感染した細胞
は、ワクチンとしてテストする。感染細胞を低速遠心分
離により培養培地から分離し、使用するまで凍結保存す
る。Gag/gp85粒子は、100,000×ｇ、１時間の遠心分離
により100mlの感染細胞上清から精製する。この操作か
らのペレットを5mlPBSに再懸濁し、ワクチンとして調剤
する前に凍結保存する。

FeLVgp70、gp85またはgagのいずれかを発現するFHV組
換え体は、CRFK細胞で増殖させ、感染３日後に採集す
る。細胞夾雑物を除くため浄化した後、上清液体は力価
を測定し、使用する前に−70℃で保存する。ワクチン
は、10⁵〜10⁷pfu/mlを含有するよう調剤する。

ラボラトリー・アッセイネコのp27レベルは商業的に
入手可能なキット［シンバイオティクス社、サンディエ
ゴ、カリフォルニア州（Synbiotics,San Diego,CA）］
を用いて測定する。p27、FeLVグループ−特異性抗原
は、持続性−感染動物の血液中に見い出され、従ってウ
イルス血症のテストに使用できる。本発明者らの研究室
の標準化法は、公知の陽性および陰性の血清の関係内で
は、O.D.値が0.25以上で、ウイルス血症陽性であること
が示される。

FeLV特異性抗体は、精製gp70および精製全ウイルスに
対する２回のエライザ法で測定する。gp70は、FL74細胞
から粉砕したウイルス［テイレン（Theilen）ら、ネイ
チャー（Nature）、222:569〜570頁（1969）］およびgp
70モノクローナル抗体を用いたアフィニティー・クロマ
トグラフィーにより調製する。カラム溶出液は濃縮し、
２μｇタンパク質/mlのエライザ法プレートをコートす
るため用いる。４℃で18時間インキュベートした後、0.
05％トゥイーン20を含有するPBS（PBST）中の1:10希釈
ネコ血清を添加する前に、プレートをリン酸緩衝液生理
食塩水（PBS）で洗浄する。次いで、適当に希釈したホ
ースラデッシュ・ペルオキシダーゼ標識抗−ネコ・イム
ノグロブリン［カーケガード・アンド・ペリー社、ゲイ
サースバーグ、マリーランド、米国（Kirkegaard and P
erry,Gaithersburg MD USA）］を室温にて45分間、プレ
ートと反応させる。さらなる洗浄工程の後、基質および
クロモゲンを添加し、エライザリーダーでプレートを読
む前に発色させる。各プレートは、適当な陽性および陰
性対照を含む。血清は二連にてテストし、少なくとも処
理前のレベルの２倍OD値が増加していると、陽性と記録
する。全ウイルスアッセイのためのウイルスは、FL74細
胞から、アミコン・フィルター（Amion filter）濾過お
よび勾配遠心分離［ワクチン（Vaccine）、7:142〜146
頁（1989）］によって調製する。材料は−20℃で保存
し、使用のための適当な希釈率を求めるため、既知の陽
性および陰性血清で力価測定する。アッセイは、gp70抗
体測定に記載したのと同様に行う。

実施例１ FeLVgag、gp85およびgp70の発現 gag遺伝子のバキュロウイルス発現ベクターへのクロー
ニングプラスミドpFeLVgag3からエンドヌクレアーゼ
消化により、2.2kBのXbaI−EcoRI断片を除去する。この
断片は、FeLVgag遺伝子ならびにpol遺伝子のプロテアー
ゼ部分（ヌクレオチド517−2786）［ジャーナル・オブ
・バイロロジー（J.Virol.）、62:722〜731頁（198
8）］についての暗号領域を含有する。この断片の末端
は、クレノー酵素を用い修復し、BamHIリンカーを添加
する。次いで、該断片を、予めBamHI消化したプラスミ
ドpVL941に連結する。得られたプラスミドをpVLgagとす
る。

g,85エンベロープタンパク質のバキュロウイルス発現ベ
クターへのクローニング gp85遺伝子は、PstI酵素での
消化によってプラスミドpTC2から除去する。2kB断片を
単離し、T4DNAポリメラーゼでの処理、続いてのBamHIリ
ンカーの添加によって修飾する。このBamHI断片を、予
めBamHIで消化したプラスミドpVL941のBamHI部位に結
ぶ。得られたプラスミドをpVLgp85とする。

gp70エンベロープタンパク質のバキュロ発現ベクターへ
のクローニング env遺伝子のgp70部分は、３つのイン
フレーム終止コドンを含む合成オリゴヌクレオチドを用
いたgp85遺伝子先端切除により生成する。このオリゴヌ
クレオチドを、ヌクレオチド7298のAluI部位［ジャーナ
ル・オブ・バイロロジー（J.Virol.）、62:722〜731頁
（1988）］でgp85暗号配列に連結し、p15Eタンパク質を
コードする配列を除去する。この修飾遺伝子を、pVL941
（チャートC.1）のBamHI部位に連結してプラスミドpVL7
0を得る。

バキュロウイルス形質添加プラスミドpVLgag、pVL85
およびpVL70を、標準的なバキュロウイルス発現ベクタ
ー技術［テキサス・アグリカルチュラル・ブレチン（Te
xas Agricultural Bulletin）、第1555号（1987）］を
用い、野生型AcNPVで同時感染させる。組換えバキュロ
ウイルス、AcNPV−gag、AcNPV−gp85およびAcNPV−gp70
は、各々、（−）対（＋）封入体プラークの目視スクリ
ーニングによって選抜し、gag、gp85およびgp70タンパ
ク質の発現は、上記のごとく、gagまたはgp70に対する
モノクローナル抗体を用い、感染Sf−９細胞からの³⁵S
−メチオン標識タンパク質の免疫沈降により確認する。

かくして、組換えウイルスAcNPV−gagは、gag産物の
みならず、pol遺伝子のプロテアーゼ部分をコードするD
NAを含有する。この構築体は、昆虫細胞中でgag終止シ
グナルが抑制された場合、FeLV感染哺乳動物細胞中のよ
うに、p65gag前駆体または78kDのgag−プロテアーゼ融
合タンパク質の発現を可能にする。この同一gag−プロ
テアーゼ部分は、コール，ジー・イー（Cole,G.E.）
ら、ジャーナル・オブ・バイロロジー（J.Virol.）、6
4:4930〜4938頁（1990）により、ネコヘルペスウイルス
（FHV）ゲノムに挿入されている。この組換えウイルス
は、感染細胞中で、gag遺伝子産物およびgag−プロテア
ーゼ融合タンパク質を双に生産することが示される。該
プロテアーゼは、また、組換えFHV感染細胞中でgag p65
を４つのポリペプチド構成部分へ加工するのに活性を有
することも示される。加えて、２つの形態のエンベロー
プ遺伝子、すなわちgp85糖タンパク質をコードする全長
遺伝子（組換えウイルスAcNPV−gp85）および該遺伝子
のgp70部分のみをコードする遺伝子（組換えウイルスAc
NPV−gp70）をバキュロウイルスに挿入する。該gp70遺
伝子産物は、gp85糖タンパク質のp15E部分を欠き、感染
細胞の培地に分泌されるはずである。該gp85遺伝子は、
67kDのバックボーンのタンパク質をコードする一方、該
gp70遺伝子は、45kDのバックボーンのタンパク質をコー
ドしうる。

FeLV gp70およびgp85の発現 ³⁵S−メチオニン標識感染
細胞ポリペプチドの免疫沈降は、AcNPV−gp85およびAcN
PV−gp70感染細胞において、gp85およびgp70の２つの型
が合成され、細胞中に停まることを示す。エンドＨ処理
は、AcNPV−gp85感染細胞中の74kD種およびAcNPV−gp70
感染細胞中の53kD種を、さらに低分子量型の各々の60kD
および41kDへ分子量を減少させる。さらに高分子量型の
gp85およびgp70だけは、グリコサミン標識を取り込む。
感染細胞の培地中に少量のgp85およびgp70見い出され
る。

FeLVgag発現および粒子会合 AcNPV−gag感染Sf−９細
胞の細胞外液体を、ウイルス様粒子の存在につき、ショ
糖勾配分析により検査する。AcNPV−gagおよびAcNPV−g
p50感染細胞の高速ペレットの上清を分画する。AcNPV−
gp50は、シュードラビエス（Pseudorabies）・ウイルス
（PRV）からのgp50糖タンパク質遺伝子を生成する組換
えウイルスで、対照として供する。AcNPV−gagおよびAc
NPV−gp50は、共に同一画分に主要タンパク質ピークを
有する。これらの画分のEM分析は、それらがバキュロウ
イルス粒子を含有することを示す。該昆虫細胞は、未熟
FeLV粒子に、サイズ（100nm）、形状および環状構造に
おいて類似した粒子を生産する。バキュロウイルスによ
り生産された物質中には、未熟粒子だけが認められた
が、その一方、FeLV−A/FGA上清調製物中には、成熟お
よび未熟粒子が共に見い出された。ウエスタン・ブロッ
ト分析は、gag発現の結果、ウイルス様粒子が形成され
ることを示す（データは示さず）。

AcNPV−gag感染細胞上清を勾配分画およびウエスタン
・ブロットにより分析したとき、本発明者らは、いくつ
かの免疫反応性ポリペプチドが存在することを見い出し
た（データは示さず）。これは、gag−pol遺伝子産物
（ポリプロテイン）は加工されて、生物的に活性となる
ことを示唆する。

FeLV−A/FGA細胞系により生産された勾配分画FeLV粒
子のウエスタン・ブロットは、いずれの天然gp85および
gag遺伝子産物が、感染昆虫細胞上清に用いたのと同一
の条件下で分画した場合に似ているかについて情報を提
供する。エンベロープタンパク質に対する抗体は、分子
量80kDの単一バンドと反応した。p27に対する抗体は、
これらの同一画分の27kDポリペプチドと反応した。大き
な割合のgp70が、勾配の頂点近くに残っており、これは
精製中にウイルス粒子から脱離したgp70であると、ゼリ
クマン，アイ（Zelikman,I.）ら、バイオテクノロジカ
ル・アプライ・イン・バイオケミストリー（Biotechno
l.Appl.Biochem.）、11:209〜216頁（1989）により報告
されている。

AcNPV−gagおよびAcNPV−gp85同時感染細胞からの勾
配のイムノブロット分析は、FeLVについては、丁度gp70
であるように、gp85が見い出されることを明らかにす
る。少量が，勾配の頂点に認められたが、ウイルス粒子
で観察されたものにはほとんど比例しない。AcNPV−gp8
5単独で感染させた細胞の上清を同様に分析した場合、
勾配中に免疫反応性のバンドは認められない。

gp85のgagとの相互作用の特異性を証明するため、細
胞をAcNPV−gagおよびAcNPV−gp70で同時感染させた。g
p70は、糖タンパク質のp15E部分を除去することによ
り、分泌されるよう設計されているが、感染細胞からほ
とんど分泌されない。もし表面糖タンパク質の取り込み
がランダムであるか、または分子の15kD部分が、gagの
認識シグナルとして作用しなければ、gag粒子と同一の
密度にgp70免疫反応性ポリペプチドを見い出すと予測す
るであろう。gp70反応性は、勾配頂点でのみ起きる。ウ
イルス粒子に相当する密度では、gp70反応性は認められ
ない（データは示さず）。

本発明者らは、また、AcNPV−gagおよびAcNPV−gp50
で細胞を同時感染させた。gp50は、PRV表面および感染
細胞表面に見い出される糖タンパク質である［ベン−ポ
ラット，ティー（Ben−Porat,T.）およびカプラン，エ
イ・エス（Kaplan,A.S.）、バイロロジー（Virolog
y）、41:265〜273頁（1970）］。gp50を検知するため、
gp50を生成する組換えワクシニアウイルスでウサギをワ
クチン接種することにより生産したポリクローナル抗体
を用いる［ジャーナル・オブ・バイロロジー（J.Viro
l.）、61:3977〜3982頁（1987）］。再度、gag粒子の密
度でgp50は見い出されず（データは示さず）、これはgp
85の粒子への取り込みは特異的であることを示唆する。

gp85env遺伝子のgp70部分の発現については、３つの
インフレーム終止コドンを有するオリゴヌクレオチドを
設計する。このオリゴヌクレオチドを、ヌクレオチド72
98のAluI部位でgp85暗号配列に連結し［ドナヒュー，ピ
ー・アール（Donahue,P.R.）ら、ジャーナル・オブ・バ
イロロジー（J.Virol.）、62:722〜731頁（1988）参
照］、p15Eタンパク質の暗号配列を除去し、その結果、
先端が除去された（truncated）gp70タンパク質が得ら
れる。ネコ白血病ウイルスへの挿入については、このgp
70遺伝子を、HCMV IEプロモーターおよびBGHポリＡシグ
ナル間にてFHVΔtkベクターpCG113に挿入してプラスミ
ドp113−70Bを得る。これを、FHV UT88からのDNAととも
に、クランデル（Crandell）ネコ腎臓（CRFK）細胞に同
時感染させる。組換えウイルスを、ニュンベルグ，ジェ
イ・エッチ（Nunberg,J.H.）ら、プロシーディングズ・
オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・オ
ブ・ザ・ユーエスエイ（Proc.Natl.Acad.Sci.USA）、8
1:3675〜3679頁（1984）の標準的技術に従い単離する。
gp70タンパク質の発現は、gp70に対するモノクローナル
抗体を用いた感染細胞からの³⁵S−メチオニン標識タン
パク質のウエスタン・ブロットおよび免疫沈降により確
認する（データは示さず）。

実施例２粘膜／非経口の組合せワクチン接種ワクチン実験Ｉ２群のネコを、本実験で用いる。第１
群（ｎ＝６）を、各々、1.3×10⁵pfuおよび10⁷pfuを含
有する1.0mlのFHVΔtkgp85で２回、鼻腔内／経口接種す
る（０日および21日目）。これは、小さな鼻のカニュー
レを付けたシリンジを用いて行う。動物を穏やかに拘束
し、各々の鼻に約0.25mlを滴下し、中咽頭の背後に向け
て0.5mlを入れる。第２群（ｎ＝６）を、０日目に８×1
0⁶のAcNPVgp85感染Sf−９細胞で、21および33日目に10⁷
のAcNPVgp85感染Sf−９細胞で筋肉内注射する。動物
を、密集したCT600細胞からの上清液1mlで０、２、４お
よび７日目に鼻腔内／口腔内に攻撃する。５日目にネコ
を、デポーメドロール［（Depo−Medrol）、ジ・アップ
ジョン・カンパニー、カラマズ−、ミシガン州（The Up
john Company,Lalamazoo,MI）］で、5mg/kg体重を用い
免疫抑制する。攻撃０日目は、最初のワクチン接種後40
日である。６匹のワクチン未接種ネコを、対照として供
するため、同時に攻撃する。

ワクチン実験II 単一群の動物（ｎ＝17）をこの実験で
用い、それらを、２×10⁵pfuを含有する1.0mlのFHVΔtk
gp70で鼻腔内／口腔内に接種する。27日後、全動物を、
同一調製物で再ワクチン接種する。２度目のワクチン接
種後39日に、ネコには、AcNPVgp70で感染した2.5×10⁷
のSf−９細胞を筋肉内注射を介して摂取させる。この接
種の後64日に、ネコを２つのサブグループに分割する。
第１サブグループ（ｎ＝10）を、免疫抑制し、実験１に
記載されているごとく攻撃する。第２サブグループ（ｎ
＝７）を、８匹の持続性FeLV感染ネコおよび６匹のワク
チン未接種陰性対照とともに檻に入れる。

ワクチン実験III ７群の動物を、本実験で用いる。第
１群（ｎ＝８）では、ネコには、バキュロウイルスAcNP
Vgp70感染Sf−９細胞の筋肉内接種を２回、29日間隔で
受ける。第２群（ｎ＝８）では、動物は、Sf−９細胞の
２回の接種を摂取させる。１回目はAcNPVgp70およびgp8
5/gag粒子から成り、一方２回目はgp85/gag粒子単独か
ら成る。第３群（ｎ＝８）では、ネコを初めに1ml中に
２×10⁵pfuを含有するFHVΔtkgp85で、鼻腔内／口腔内
に接種し、29日後にAcNPVgp85感染Sf−９細胞で筋肉内
に接種する。第４群のネコ（ｎ＝８）を、初めにFHVΔt
kgp85およびFHVΔtkgagで鼻腔内／口腔内に同時接種す
る。各接種は、２×10⁵pfuを含有するものであった。29
日後、動物には、感染昆虫細胞の高速遠心分離後に採集
した上清からのgag/gp85粒子の筋肉内接種を摂取させ
る。第５群（ｎ＝６）では、ネコには、２回の２×10⁵p
fuのFHVΔtkgp70の鼻腔内接種を29日離し摂取させる。
最後の群（ｎ＝８）では、動物を初めに２×10⁵pfuを含
有するFHVΔtkgp70の1ml用量で、鼻腔内／口腔内に接種
する。29日後、動物をAcNPVgp70で筋肉内接種する。最
後のワクチン接種の44日後、各群から全ネコを、実験１
に記載したごとく免疫抑制／接種する。８匹の、競合さ
せた、非ワクチン接種動物は、対照として作用するよう
に同様に攻撃する。

ワクチン接種実験の結果ワクチン実験Ｉ（ここでは、
ネコはFHVΔtkgp85またはAcNPVgp85のどちらか一方を接
種する）では、全ての動物は、ワクチン接種の有害な徴
候を示さなかった。攻撃後、動物から採血し、ウイルス
血症の測定としてp27レベルをアッセイする。図１は、
攻撃前および攻撃後３、５および７週の採血からの結果
を示す。６匹の対照ネコ（図1A）中、５匹は持続性ウイ
ルス血症になっており、１匹は決して感染しなかった。
FHVΔtkgp85（図1B）およびAcNPVgp85（図1C）の両ワク
チン群において、６匹の動物中４匹がウイルス血症にな
った。感染した動物中のウイルス血症レベルは、対照と
異ならない。FHVΔtkgp85でワクチン接種したネコは、g
p70または全FeLVに対し応答を示さない一方、AcNPVgp85
でワクチン接種したネコ６匹中４匹は、全FeLVのエライ
ザ法にて応答し、６匹中１匹が精製gp70に反応したこと
をエライザ法は示している。

ワクチン実験IIは、１）p15Eサブユニット除去により
効率を改善するか否か、２）粘膜および非経口的起爆剤
の組合せは、ワクチン保護効果を高めうるか否か、およ
び３）天然攻撃系は、免疫性検知の機会を増加させるか
否かをテストするため設計する。

組合せワクチン法は、動物および多数のネコにおいて
有害な徴候を全く引き起こさず、17匹中７匹が、別々に
組換えウイルスを与える以前の応答に比べ、gp70に対す
る応答を示した。大多数の、すなわち17匹中16匹もが、
全ウイルスアッセイで応答した。注射攻撃が４匹中３匹
の対照に感染を成立させた一方、ワクチン接種動物10匹
中わずか３匹が７週目にp27陽性であったにすぎない
（図2Aおよび1B）。接触攻撃は、６匹の対照中わずか２
匹に感染を成立させたにすぎない一方、ワクチン接種動
物６匹中わずか１匹が、非常に低いp27レベルを攻撃後
７週目に示したにすぎない。

これらの結果は、gp70の粘膜／非経口組合せ接種が、
注射／免疫抑制攻撃系においてさえ、攻撃に対する保護
を提供しうることを示す。他方、接触／攻撃系の対照の
低感染率は、ワクチン／接触攻撃群からの結果の解釈を
困難にする。ワクチン／感染攻撃群に認められた保護
は、二重接種法に起因するか、またはp15Eがgp70サブユ
ニットの使用に対し免疫抑制的だとすればそれによるか
もしれない。この点をさらに証明し、免疫におけるgag
タンパク質の重要性をテストするため、さらに一連のネ
コを多数の異なったワクチン法を用いワクチン接種す
る。接触攻撃を用いた対照において確立される貧感染
率、および免疫抑制にもかかわらず該ワクチンの明らか
な成功のため、最後の実験での全ネコを、感染／免疫抑
制モデルを用いて攻撃する。

攻撃後９週目における６種のワクチン法についてのp2
7値（ワクチン実験III）を図３に示す。いずれかのベク
ター単独中のgp70で処理した動物は、ワクチン実験Ｉで
gp85につき認められたのと同様に、低い保護レベルを示
した。gp70での粘膜および非経口免疫についての二重接
種は、50％の保護を提供し、攻撃後９週目になおウイル
ス血症であるこの群のネコは、低いp27レベルを有する
ようであった。gp85の二重接種は、gp70を用いるのに比
べ、保護レベルを改善し、再度p27レベルを低下させ
た。これは、p85の単一部位接種に比べ、gp70二重部位
接種に認められる予め高められた保護が、p15Eの可能な
免疫抑制効果よりむしろ、２部位における免疫学的刺激
によることを示す。gag/gp85粒子の一部としてgagタン
パク質を含ませると、非経口投与のみを用いたという事
実に拘わらず、再度ワクチン効率が改善された。gp85お
よびgagを共に用い、粘膜および非経口両部位をワクチ
ン接種すると、攻撃後９週目に100％保護が達成され
る。８匹のネコのこの群において３匹の動物が、２〜４
週間の間の一過性のウイルス血症を示したが、一方５匹
の動物は全くウイルス血症にならなかった。

gp70アッセイを用いた抗体スコアは、少数のみが陽性
のようであることを示している（データは示さず）一
方、FHVΔtkgp70単独でワクチン接種したネコを除き、
全ての動物が、全ウイルスアッセイを用い、ワクチン接
種後の血清変換を示した。

ワクチン接種キット本明細書に記載するごとく、投与用ワクチンを含有す
るキットおよびワクチンの二重粘膜／非経口投与の指示
は、ワクチン供給の安全およびコスト的有効手段として
作成しうる。該ワクチン接種キットは、単一または多数
使用のバイアル、アンプルまたは他の適当な容器を含有
する。粘膜投与には、ワクチン製剤は、前記容器中に入
れるか、またはエアロゾール化形態とすることができ
る。非経口使用には、宿主哺乳動物に適する有効量を含
有する一回用量のシリンジは、投与方法において、簡便
性および迅速性を提供する。別法として、該キットで
は、多目的バイアルまたは他の適当な容器に粘膜および
非経口ワクチンを含有させることができ、また即使用可
として供給することもでき、あるいは使用前にさらにい
くらか調製したり混合すること必要とする場合もある。
仕様書には、投与すべき含有ワクチンの十分な記載、そ
れらの処方、接種の順序および時期、ならびに使用者に
関する付加的要因を含ませる。

ネコについては、例えば、かかるワクチン接種キット
には、各鼻孔に0.5ml投与すべきFHVΔtkgp85およびFHV
Δtkgag（２×10⁵pfu/ワクチン）を含有する1mlの単一
用量の粘膜処方を含有させることができる。非経口処方
には、筋肉内投与用に、1mlのAcNPVgp85およびAcNPVgag
（２×10⁵pfu/ワクチン）を含有させる。

ヒトについては、かかるワクチン接種キットには、各
鼻孔に1ml投与すべきアデノウイルス／インフルエンザ
ウイルス組換え体を含有する2mlの単一用量の粘膜処方
を含有させることができる。非経口処方には、筋肉内投
与用に、1mlの不活化インフルエンザウイルスを含有さ
せる。

子ネコについては、かかるワクチン接種キットには、
各鼻孔に2.5ml投与すべきウシ・ヘルペスＩ型／ウシ・
ウイルス性下痢ウイルス（BVDV）gp53またはウシ呼吸系
シンシチウムウイルス（BSRV）F/Gを含有する5mlの単一
用量の粘膜処方を含有させることができる。非経口処方
には、筋肉内投与用に、5mlのAcNPVgp53またはAcNPV/G
を含有させる。

イヌについては、かかるワクチン接種キットには、各
鼻孔に0.5ml投与すべきイヌ・ヘルペスウイルス／イヌ
・パルボウイルス組換え体を含有する1mlの単一用量の
粘膜処方を含有させることができる。非経口処方には、
筋肉内投与用に、1mlのバキュロウイルス／パルボウイ
ルス組換え体を含有させる。

ブタについては、かかるキットには、各鼻孔に1ml投
与すべきPRVΔtk/伝染性胃腸炎（TGE）組換え体を含有
する2mlの単一用量の粘膜処方を含有させることができ
る。非経口処方には、筋肉内投与用に、2mlのバキュロ
ウイルス/TGE組換え体を含有させる。

フロントページの続き (56)参考文献特開昭62−151186（ＪＰ，Ａ) 特開昭63−68075（ＪＰ，Ａ) 特表昭61−500662（ＪＰ，Ａ) 特表平１−503273（ＪＰ，Ａ) 欧州公開173997（ＥＰ，Ａ１) (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) C12N 15/00 C12N 7/00 A61K 39/21

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】（ａ）バキュロウイルス発現ネコ白血病ウ
イルス（FeLV）gp85タンパク質よりなる投与剤１用量お
よび（ｂ）FeLV gp85遺伝子をコードするDNAを発現する
ように設計された組換えネコヘルペスウイルス（FHV）
よりなる投与剤１用量よりなる多剤投与型FeLVワクチ
ン。
【請求項２】（ａ）バキュロウイルス発現FeLV gp85お
よびgagタンパク質よりなる投与剤１用量および（ｂ）F
eLV gp85およびFeLV gag遺伝子をコードするDNAを発現
するように設計された組換えFHVよりなる投与剤１用量
よりなる多剤投与型FeLVワクチン。
【請求項３】（ａ）バキュロウイルス発現FeLV gp85お
よびgagタンパク質よりなる投与剤１用量および（ｂ）
バキュロウイルス発現FeLV gp85、gp70およびgagタンパ
ク質よりなる投与剤１用量よりなる多剤投与型FeLVワク
チン。
【請求項４】（ａ）バキュロウイルス発現FeLV gp70タ
ンパク質よりなる投与剤１用量および（ｂ）FeLV gp70
遺伝子をコードするDNAを発現するように設計された組
換えFHVよりなる投与剤の別々の２用量よりなる多剤投
与型FeLVワクチン。
【請求項５】（ａ）バキュロウイルス発現FeLV gp85タ
ンパク質よりなる非経口投与用投与剤１用量および
（ｂ）FeLV gp85をコードするDNAを発現するように設計
された組換えFHVよりなる粘膜投与用投与剤１用量より
なる多剤投与型FeLVワクチン接種キット。
【請求項６】（ａ）バキュロウイルス発現FeLV gp85お
よびgagタンパク質よりなる非経口投与用投与剤１用量
および（ｂ）FeLV gp85およびgag遺伝子をコードするDN
Aを発現するように設計された組換えFHVよりなる粘膜投
与用投与剤１用量よりなる多剤投与型FeLVワクチン接種
キット。
【請求項７】（ａ）バキュロウイルス発現FeLV gp85お
よびgagタンパク質よりなる非経口投与用投与剤１用量
および（ｂ）バキュロウイルス発現FeLV gp85タンパク
質、バキュロウイルス発現FeLV gp70タンパク質および
バキュロウイルス発現FeLV gagタンパク質よりなる非経
口投与用投与剤１用量よりなる多剤投与型FeLVワクチン
接種キット。
【請求項８】（ａ）非経口投与用のバキュロウイルス発
現FeLV gp70タンパク質よりなる投与剤１用量および
（ｂ）FeLV gp70遺伝子をコードするDNAを発現するよう
に設計された組換えFHVよりなる粘膜投与用投与剤の別
々の２用量よりなる多剤投与型FeLVワクチン接種キッ
ト。
【請求項９】（ａ）バキュロウイルス発現FeLV gp85タ
ンパク質の投与剤１用量を用意し；（ｂ）FeLV gp85遺伝子をコードするDNAを発現するよう
に設計された組換えFHVの投与剤１用量を用意し；つい
で（ｃ）該バキュロウイルス発現FeLV gp85タンパク質の
投与剤および該組換えFHVの投与剤をネコに投与するこ
とよりなる、該ネコにFeLVに対する免疫を付与する方
法。
【請求項１０】投与工程が、ネコに、組換えFHV投与剤
を投与し、ついで、バキュロウイルス発現FeLVタンパク
質の投与剤を投与することよりなる請求項９記載の方
法。
【請求項１１】ネコに、組換えFHV投与剤を粘膜投与
し、バキュロウイルス発現FeLVタンパク質投与剤を非経
口投与する請求項９記載の方法。
【請求項１２】投与工程が、ネコに、バキュロウイルス
発現FeLVタンパク質投与剤を投与し、ついで、組換えFH
Vの投与剤を投与することよりなる請求項９記載の方
法。
【請求項１３】（ａ）バキュロウイルス発現FeLV gp85
およびgagタンパク質の投与剤１用量を用意し；（ｂ）FeLV gp85およびgag遺伝子をコードするDNAを発
現するように設計した組換えFHVの投与剤１用量を用意
し；ついで（ｃ）該バキュロウイルス発現FeLV gp85およびgagタン
パク質投与剤および該組換えFHV投与剤をネコに投与す
ることよりなる、該ネコにFeLVに対する免疫を付与する
方法。
【請求項１４】投与工程が、ネコに、組換えFHV投与剤
を投与し、ついで、バキュロウイルス発現FeLVタンパク
質投与剤を投与することよりなる請求項13記載の方法。
【請求項１５】ネコに、組換えFHV投与剤を粘膜投与
し、バキュロウイルス発現FeLVタンパク質投与剤を非経
口投与する請求項13記載の方法。
【請求項１６】投与工程が、ネコに、バキュロウイルス
発現FeLVタンパク質投与剤を投与し、ついで、組換えFH
V投与剤を投与することよりなる請求項13記載の方法。
【請求項１７】（ａ）バキュロウイルス発現FeLV gp85
およびgagタンパク質の第１投与剤１用量を用意し；（ｂ）バキュロウイルス発現FeLV gp85、gp70およびgag
タンパク質の第２投与剤１用量を用意し；ついで（ｃ）該バキュロウイルス発現FeLV gp85およびgagタン
パク質の投与剤、および該バキュロウイルス発現FeLV g
p85、gp70およびgagタンパク質の投与剤をネコに投与す
ることよりなる、該ネコにFeLVに対する免疫を付与する
方法。
【請求項１８】投与工程が、ネコに、バキュロウイルス
発現FeLVタンパク質の第１投与剤１用量を投与し、つい
で、バキュロウイルス発現FeLVタンパク質の第２投与剤
１用量を投与することよりなる請求項17記載の方法。
【請求項１９】バキュロウイルス発現FeLVタンパク質の
第１および第２の投与剤をネコに非経口投与する請求項
17記載の方法。
【請求項２０】投与工程が、ネコに、バキュロウイルス
発現FeLVタンパク質の第２投与剤１用量を投与し、つい
で、バキュロウイルス発現FeLVタンパク質の第１投与剤
１用量を投与することよりなる請求項17記載の方法。
【請求項２１】（ａ）バキュロウイルス発現FeLV gp70
タンパク質の投与剤１用量を用意し；（ｂ）FeLV gp70遺伝子をコードするDNAを発現するよう
に設計された組換えFHVの第１投与剤１用量を用意し；（ｃ）FeLV gp70遺伝子をコードするDNAを発現するよう
に設計された組換えFHVの第２投与剤１用量を用意し；（ｄ）該バキュロウイルス発現FeLV gp70タンパク質の
投与剤および組換えFHVの第１および第２の投与剤をネ
コに投与することよりなる、該ネコにFeLVに対する免疫
を付与する方法。
【請求項２２】投与工程が、ネコに、組換えFHVの第１
および第２投与剤を投与し、ついで、バキュロウイルス
発現FeLVタンパク質の投与剤を投与することよりなる請
求項21記載の方法。
【請求項２３】ネコに、組換えFHVの第１および第２投
与剤を粘膜投与し、バキュロウイルス発現FeLVタンパク
質の投与剤を非経口投与する請求項21記載の方法。
【請求項２４】投与工程が、ネコに、バキュロウイルス
発現FeLVタンパク質の投与剤を投与し、ついで、組換え
FHVの第１および第２投与剤を投与することよりなる請
求項21記載の方法。
【請求項２５】（ａ）バキュロウイルス発現FeLV gp85
およびgagタンパク質よりなる第１投与剤１用量；およ
び（ｂ）バキュロウイルス発現FeLV gp85およびgagタンパ
ク質よりなる第２投与剤１用量よりなる多剤投与型FeLV
ワクチン。
【請求項２６】（ａ）バキュロウイルス発現FeLV gp85
およびgagタンパク質よりなる非経口投与用の第１投与
剤１用量：および（ｂ）バキュロウイルス発現FeLV gp85およびバキュロ
ウイルス発現FeLV gagタンパク質よりなる非経口投与用
の第２投与剤１用量よりなる多剤投与型FeLVワクチン接
種キット。
【請求項２７】（ａ）バキュロウイルス発現FeLV gp85
およびgag蛋白質の第１投与剤１用量を用意し；（ｂ）バキュロウイルス発現FeLV gp85およびgag蛋白質
の第２投与剤１用量を用意し；ついで（ｃ）該バキュロウイルス発現FeLV gp85およびgagタン
パク質の第１投与剤および該バキュロウイルス発現FeLV
gp85およびgagタンパク質の第２投与剤をネコに投与す
ることよりなる、該ネコにFeLVに対する免疫を付与する
方法。
【請求項２８】バキュロウイルス発現FeLVタンパク質の
第１および第２投与剤をネコに非経口投与する請求項27
記載の方法。