KR100265393B1

KR100265393B1 - 고양이 백혈병 바이러스 백신

Info

Publication number: KR100265393B1
Application number: KR1019940701531A
Authority: KR
Inventors: 캘버트 와들리 리챠드; 레이 톰센 다렐
Original assignee: 로렌스 티. 마이젠헬더; 파마시아 앤드 업존 컴퍼니
Priority date: 1991-11-08
Filing date: 1992-10-08
Publication date: 2000-10-02
Also published as: DE69232650T2; WO1993009238A1; EP0611397B1; EP1136562A3; DK0611397T3; ATE219520T1; AU4213496A; AU672372B2; CA2120137A1; JP2852395B2; JPH06510910A; CA2120137C; AU2892392A; EP0611397A1; DE69232650D1; LV13060B; AU689355B2; ES2177530T3; MX9206018A; EP1136562A2

Abstract

고양이 백혈병 바이러스의 gag, gp70 및 gp85 유전자를 발현하는 재조합 바쿨로바이러스를 개시한다. 또한 상기 재조합체로 부터 발현된 단백질을 기본으로 하는 백신을 개시한다. 또한 결합된 점막/비경구 접종법을 개시한다.

Description

[발명의 명칭]

고양이 백혈병 바이러스 백신

[발명의 분야]

본 발명은 고양이 백혈병 바이러스의 gag, gp70 및 gp85 유전자를 발현하는 재조합 바쿨로바이러스, 백신, 및 상기 발현된 생성물을 기본으로 하는 백신의 제조 및 사용 방법을 개시한다. 또한 결합된 점막/비경구 접종법을 개시한다.

[발명의 배경]

[고양이 백혈병 바이러스]

온코르노바이러스인 고양이 백혈병 바이러스(FeLV)는 레트로바이러스계 바이 러스의 일원이다. 고양이에서, FeLV는 림프종, 골수증식성 질병, 백혈병, 면역결핍증, 재생불량성 빈혈 및 신경학적 질병을 일으킬수 있다. 상기 바이러스는 갓태어나거나 어린 고양이에게는 감염성이 높은 반면, 보다 성숙한 고양이는 가장 강한 종양원성의 FeLV 균주에 대해서조차도 내성이 있다. 동물들에게 FeLV에 대한 백신을 접종시킬수 있다. 예를들어, 초기에는 각종 면역보강제를 사용하여 생성하거나 또는 불활성인 FL74 고양이 림프종 세포를 투여함을 포함하는 FeLV에 대한 백신의 제조가 시도되었다. 그러나 이들 백신의 효능은 반론이 제기되어 왔고, 다수의 이러한 시도는 잠복기가 긴 바이러스 혈중 또는 2차 림프종 및 육종 발현에 대해서 고양이를 보호하지 못했다. 가용성 종양 세포 항원 백신은 현재 시판되고 있으며, ISCOM 및 서브유닛을 기본으로하는 기타의 실험 백신들도 또한 보고되고 있다.

FeLV 게놈은 3개의 유전자, 즉 바이러스의 주요 구성 성분들을 암호화 하는 gag 유전자, 피막 당단백질을 암호화하는 env 유전자 및 폴리머라제 단백질을 암호화하는 pel 유전자를 암호화한다. gag 유전자는 4개의 서브유닛, 즉 pl5 매트리스 단백질, 기능이 알려지지 않은 p12 단백질, p27 캡시드 단백질 및 p10 뉴클레오캡시드 단백질로 가공되는 65 kD의 폴리단백질로서 발현된다. pol 유전자는 3개의 단백질, 즉 프로테아제, 역전사효소 및 인티그라제를 암호화한다. 상기 유전자의 프로테아제 부분에 의한 자가가공(autoprocessing)은 pol 영역의 3개 단백질 모두를 생성시킨다. 또한, 프로테아제는 gag 전구체의 가공에 책임이 있다. pol 유전자는 gag-pol 융합 단백질로서 발현된다. 피막 유전자는 85kD의 당단백질인 gp85로서 발현되며, 상기는 비리온의 표면에서 발견되는 디설파이드 결합되고 막 결합된 70kD 및 15kD(p15E) 복합체로 더욱 가공된다. 상기와 같은 gag-프로테아제 영역은 고양이 혜르페스바이러스(FHV) 게놈내로 삽입되어 제조합 FHV 감염 세포에서 gag-프로테이제 융합 단백질과 gag 유전자 생성물 모두를 생성하는것으로 나타났다. 프로테아제는 또한 gag(p65)를 그의 4개의 폴리펩티드 성분으로 가공하는데 활성이 있다.

[바쿨로바이러스 발현 시스템]

바쿨로바이러스는 특정 곤충에 대단히 유독하나 척추동물 또는 식물에는 병원성이 없는 큰 그룹의 바이러스이다. 바쿨로바이러스 발현 벡터 시스템(BEVS)의 도래와 함께, 바이러스, 진균, 세균, 식물 및 동물 기원의 광범위한 유전자가 제조합 바쿨로바이러스에서 발현되었다. 간단하게, BEVS는 발현 벡터를 사용하여 이종 유전자를, 상기 유전자가 바쿨로바이러스 조절 요소의 제어하에서 발현되도록 하는 위치에서 바쿨로바이러스 게놈내로 삽입시킨다. 제조합 바쿨로바이러스는 배양된 곤충 세포주를 감염시키고, 이때 이종 단백질이 발현된다. 이러한 시스템을 사용하는 다수의 그룹들은 2개의 다른 레트로바이러스, 즉 인간 면역결핍 바이러스와 조류 백혈병 바이러스의 표면 당단백질을 발현한다. 보고된 바에 의하면, 레트로바이러스 gag 유전자도 또한 발현되며 감염된 곤충 세포에서 바이러스 유사 입자내로 조합되는 것으로 밝혀졌다.

[벡신접종]

포유동물의 백신접종은 거의 항상 피하 또는 근육내(피하가 바람직한 경로이다) 주입에 의해 수행된다. 작은 애완 동물들(개, 고양이등)의 경우에, 일부 백신들을 또한 비강내 및/또는 경구 투여할수 있다. 상기 2개의 상이한 방식으로 백신을 숙주에 투여하는것은 면역 시스템 반응이 구분되어 있으므로 불리하다. 이는 피하투여만이 실제로 전신 반응을 자극하는 반면, 점막 표면에서의 접종은 다른 면역학적 부분을 자극하는데 적합함을 의미한다.

본원에서는 FeLV의 gag, gp70 및 gp85 유전자틀 발현할 뿐아니라, gag 및 gp85 바이러스 둘다에 동시감염된 곤충 세포의 배지내로 퍼지는 미성숙 바이러스-유사 입자를 조합하는 제조합 바쿨로바이러스의 구축을 개시한다. 또한, 본 발명은 상기 바이러스의 제작 방법 및 이들 제조합 바이러스를 기본으로 하는 FeLV 백신의 제조 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 포유동물의 백신접종법을 포함하며, 놀랍게도 본 발명에 이르러 천연 바이러스 숙주의 점막 및 전신 부위 모두에 백신을 투여함으로써 잠복기가 긴 바이러스혈증에 대해 필수적으로 완전한 보호가 이룩될수 있음을 발견했다.

[정보 개시]

문헌[Noteborn, M.H.M. 등, J.Gen Virol. 71:2641-2648(1990)]에는 BEVS를 사용하여 곤충 세포에 조류 백혈병 바이러스의 표면 당단백질을 발현시키는 것이 보고되어 있다. 이 참고 문헌은 본 발명의 재조합 바풀로바이러스를 제시하고 있지 않다.

문헌 [Wells, D.E. and Compans, R. W., Virology 176:575-586(1990), Hu, S-L 등, J. Virol. 61:3617-3620(1987), 및 Rusche, J. R. 등, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 84:6924-6928(1987)]에는 BEVS를 사용하여 곤충 세포에 인간 면역결핍 바이러스(HIV)의 표면 당단백질을 발현시키는 것이 보고되어 있다. 이 참고 문헌은 본 발명의 FeLV 재조합 바쿨로바이러스를 제시하고 있지 않다.

문헌[Morikawa, S. 등, Virology 183:288-297(1991)]에는 렌티바이러스인 고양이 면역결핍 바이러스(FIV)로부터 gag 유전자의 발현에 대한 BEVS의 용도가 보고되어 있다. 발현된 단백질은 gag 서열로서 동시형질감염될때 감염된 곤충 세포에서 바이러스 유사 입자(VLP)로 조합된다. pol 서열의 봉입으로 입자 형성이 파괴된다.

상기 문헌은 본 발명의 FeLV 재조합 바쿨로바이러스를 제시하고 있지 않다.

문헌[Luo, L. 등, Virology 179:874-880 (1990), Gheysen, D. 등, Cell 59:103-112(1989), Overton, H. A. 등, Virology 170:107-116 (1989), Hu, S-L 등, J. Virol. 61:3617-3620 (1987) 및 Madisen, L. 등, Virology 158:248-250 (1987)]에는 감염된 곤충 세포에서 바이러스 유사 입자로 조합되는 렌티바이러스인 인간 면역결핍 바이러스(HIV) gag 단백질의 발현이 보고되어 있다. 발현된 단백질은 gag 서열로서 동시형질감염될때 감염된 곤충 세포에서 바이러스 유사 입자로 조합된다. 그러나, 또한 pol 서열의 봉입은 VLP를 파괴한다.

문헌[Delchaebre, M. 등, EMBO 8:2653-2660 (1989)]에는 감염된 곤충 세포에서 바이러스 유사 입자로 조합되는 렌티바이러스인 원숭이 면역결핍 바이러스(SIV) gag 단백질의 발현이 보고되어 있다.

발현된 단백질은 gag 서열과 동시형질감염될때 감염된 곤충 세포에서 바이러스 유사 입자로 조합된다. 그러나, pol 서열의 봉입은 VLP를 파괴하며, 따라서 상기 문헌은 본 발명의 FeLV 재조합 바쿨로바이러스를 제시하고 있지 않다.

문헌[Rasmussen, L. 등, Virology 178:435-451(1990)]에는 감염된 곤충 세포에서 바이러스 유사 입자로 조합되는 렌티바이러스인 소 면역결핍 바이러스(BIV) gag 단백질의 발현이 보고되어 있다.

발현된 단백질은 gag 서열과 동시형질감염될때 감염된 곤충 세포에서 바이 러스 유사 입자로 조합된다. 그러나, pol 서열의 봉입은 VLP를 파괴하며, 따라서 상기 문헌을 본 발명의 FeLV 재조합 바쿨로바이러스틀 제시하고 있지 않다.

문헌[Kimman, T.G. 등, Veterinary Immunology ＆ Immunopathology 22:145-160(1989)]에는 점막 또는 근육내 경로를 통해 제공된 소 호흡기 합포체 바이러스 백신의 유효성에 대해 보고되어 있다.

[발명의 요약]

본 발명은 고양이 백혈병 바이러스(FeLV) 게놈의 면역원 부분을 암호화하는 DNA 서열을 포함하는 재조합 바쿨로바이러스를 제공한다. 보다 특히, 본 발명은 gag, gp70, gp85 또는 이들의 면역원 부분을 암호화하는 재조합 바쿨로바이러스를 제공한다. 가장 특히, 본 발명은 gag, gp70, gp85 또는 이들의 면역원 부분을 암호화하는 재조합 AcNPV를 제한다.

본 발명은 또한 고양이 백혈병 바이러스(FeLV) 유전자인 gag, gp70, gp85 또는 이들의 면역원 부분을 암호화하는 DNA 서열을 포함하는 재조합 바쿨로바이러스로 감염된 숙주 세포 및 세포 배양물을 제공한다.

또한, 본 발명은 본 발명의 재조합 바쿨로바이러스 또는 상기에 감염된 숙주 세포 또는 세포 배양물에 의해 생산된 gas, gp70, gp85 단백질 또는 이들의 면역원 부분을 제공한다.

본 발명은 더욱 또한 재조합 바쿨로바이러스 백신 및 상기 백신을 동물들에게 예방접종함으로써 상기 동물들을 FeLV 감염으로 부터 보호하는 방법을 제공한다.

본 발명의 두번째 태양은 백신을 점막 투여를 통해 처음 접종시킨 다음, 상기와 동일하거나 다른 백신을 비경구 투여를 통해 두번째 접종시킴을 포함하는 결합된 점막/비경구 접종법을 제공한다.

보다 특히, 본 발명의 상기 태양은 첫번째 접종이 비강내이고 두번째 접종이 근육내인 결합된 점막/비경구 접종법을 제공한다.

가장 특히, 본 발명은 FeLV 백신을 고양이에게 점막 투여한 다음, 본 발명의 재조합 바쿨로바이러스에 의해 생산된 gag 또는 gp85 단백질을 피하 투여함을 포함한다.

상기 결합된 점막/비경구 접종법의 추가의 태양은 본 발명의 방법에 사용하기에 적합한 백신접종 키트를 제공한다.

[도면의 간단한 설명]

제1도는 항원투여 0, 1, 3, 5 및 7 주후에 고양이로 부터 취한 혈청에 대한 p27 분석의 결과(백신 실험 I)를 나타낸다.

제2도는 백신접종되고 항원 투여된 고양이로 부터 취한 혈청에 대한 p27 분석의 결과(백신 실험 II)를 나타낸다.

제3도는 다른 벡터 결합물을 백신접종한 고양이의 혈청에 대한 항원 투여 9 주후의 p27 분석 결과를 나타낸다. 각각의 막대는 한마리의 고양이로 부터의 수치를 나타낸다(백신 실험 III). 나타나지 않은 부분의 수치는 음의 값으로 간주된다.

[발명의 상세한 설명]

임의의 면역원성 FeLV 단백질은 본 원에 개시된 방법 및 기법에 따라 바쿨로바이러스에서 발현될수 있다. 예를들어, FeLV의 gag, gp70 및 gp85 를 암호화하는 유전자의 위치 및 서열 뿐아니라 상기에 의해 암호화된 단백질 서열이 공지되어있으며, 당해분야에 잘 공지된 기법에 따라 단리시킬수도 있다. 예를들어, 미합중국 특허 제 4,789,702 호(FeLV gp70의 서열); EP 0 247 904(gp70의 펩티드 서열), 문헌(J.Virol.62:722-731)(gp85)을 참조하시오. 한편, 상기 공개된 gag, gp70 및 gp85의 서열을 사용하여, 당해분야에 잘 공지된 기법에 따라 상기 목적을 위해 고안된 장치로 상기 유전자를 화학합성할수 있다. 재조합 기법을 사용하여 FeLV의 gag, gp70 및 gp85, 또는 이들의 면역원 부분을 암호화하는 유전자들을 플라스미드내로 형질전환시키며, 따라서 상기 유전자들을 바람직하게 본 발명의 운반 백터에서 편리하게 상기와 같은 공급원으로 부터 수득할수 있다. 전형적인 플라스미드는 pFeLVgag3(gag 유전자를 암호화함), pTC2(gp85를 암호화함)(또한 PUC-FeLVenv로서 알려짐), ptGAΔAvaI, ptGAΔApaI, pt9:3-19(미합중국 특허 제 4,701 416 호에 보고된 gp70의 모든 암호화 항원 부분)이고; pFeLVgag3 및 pTC2가 본 발명의 실시태양에 바람직하다.

BEVS가 또한 몇몇 경우에 다량의 이종 단백질을 생산하는것으로 알려진 편리한 재조합 발현 시스템으로서 방해분야에 잘 공지되어 있다. BEVS는 본 원에 참고로 인용된 문헌[Luckow, V. A., Cloning and expression of heterologous genes in insect cells with baculovirus vectors. In: Recombinant DNA Technology and Applications. Eds. C. Ho, A. Prokop, and R. Bajpai(1990) McGraw-Hill, New York, and Luckow, V. A. ＆ Summers, M. D., Bio/Technology 6:47-55(1988)]에 상세히 고찰되어 있다. 본 발명의 재조합 바쿨로바이러스의 구축을 위해서 본 원에서는 상기 후자의 발행물에 상세히 개시된 방법을 이용한다.

다수의 공지된 바쿨로바이러스 종들이 존재하지만, BEVS에 사용하기에 바람직한 비리온은 오토그라파 칼리포니카(Autographa california) 핵 폴리헤드론 바이러스(또한 AcNPV 또는 AcMNPV로서 알려짐)이다. AcNPV는 레피도프테라 세포의 30개의 변종(바람직한 숙주는 스포도프테라 프루지페르다(Spodoptera frugiperda) 세포주 Sf9이다)을 감염시킨다.

바쿨로바이러스내로 삽입되는 외래 유전자는 바쿨로바이러스 DNA의 측면에 있는 클로닝 부위를 함유하는 플라스미드를 사용한다. 배양된 숙주 세포를 상기 플라스미드와 게놈성 야생형 바쿨로바이러스 DNA로 동시형질감염시키고, 이들은 재조합하여 이종 유전자를 갖는 바이러스성 게놈을 생산한다. 동시형질감염을 일으키는 방법 및 조건은 당해 분야에 잘 공지되어 있다. 예를들어 인산 칼슘 공침(Graham, F. L. 및 van der Eb, A. J., Virology 52:456-467(1973)), 프로타민(Wienhues, U. 등, DNA(NY) 6:81-89 (1987)), 리포펙틴(Biotechniques 11:310-312) 및 일렉트로포레이션 (Mann, S. G. and King, L. A., J. Gen. Virology 70:3501-3505(1989))이 있다. 본원에서는 인산 칼슘법을 사용하며, 이는 하기에 보다 상세히 개략되어 있으며 본 발명의 재조합 바쿨로바이러스를 생산하는데 바람직한 형질감염법이다.

전형으로, 이종 유전자를 폴리헤드론 유전자(상기는 세포의 바이러스의 복제 또는 생산에 필수적이지는 않다) 내로의 삽입을 위해 표적화 한다. 이는 일반적으로, 폴리헤드론 프로모터 및 상기 프로모터의 옆에 있는 3′및 5′DNA의 서열을 암호화하는 바쿨로바이러스 DNA를 플라스미드 운반 벡터에 포함시킴으로써 수행된다. 이어서 외래 유전자를 당해 분야에 공지된 재조합 DNA기법을 사용하여 상기 프로모터에 하향으로 상기 운반 벡터내에 삽입시킨다. 광범위하게 다양한 적합한 운반 벡터들이 공지되어 있으며 본 발명의 실시태양에 사용하기에 적합할수 있다. 이들 중에는 pACYMI, pEV55, pAC373, pACRP, pEVIV, pEV51 및 pVL941이 있으며; 바람직한 벡터는 pVL941이다. 또한, gag 및 env 유전자를 모두, 수득할 수 있는 여러개의 복수 클로닝 부위 벡터를 사용하여 단일 바이러스내로 삽입시킬수 있다. 적합한 복수 부위 벡터의 예로 p2XIVVI^-X3, pXIVVI^-, pSyn nWTVI^-(Gene 100:131-137(1991)에 개시되어 있음) 또는 pACVC2(Protein Engineering 1:359-366(1987)에 개시되어 있음)가 있다.

본 발명의 재조합 바쿨로바이러스는 DNA 도트 블롯 하이브리드 형성, 세포 친화성 기법, 플라크 하이브리드 형성 또는 당해 분야에 공지된 기타의 기법에 따른 가시적인 스크리닝에 의해 동정할수 있다. 본 발명의 재조합 바쿨로바이러스는 또한 동정 및 정제에 용이한 색소 형성 기질 및/또는 효소 기질이 존재하는 단백질을 포함할수도 있다. 재조합체는 야생형 바쿨로바이러스의 봉입체 특징이 부족하므로, 바람직한 방법은 재조합체의 가시적인 스크리닝이며; 가시적인 스크리닝은 당해 분야에 잘 공지된 기법이다.

이어서 봉입체가 결핍된 형태붕괴체를 선택하여 DNA 도트 블롯 하이브리드 형성용 96-웰 플레이트에 놓는다. 이 하이브리드 형성 기법은 재조합 DNA 기법 분야에 잘 공지되어 있으며 특별한 언급을 필요로 하지 않는다. 가장 강한 하이브리드 형성신호에 상응하는 다수의 바이러스를 정제하고 보다 완전히 특성화하는 것이 바람직하다.

본 발명의 재조합 바쿨로바이러스를 임의의 다수의 연속적으로 배양시킨 곤충 세포주, 가장 전형적으로 안티카르사 겜미탈리스(Anticarsa gemmitalis)(대두 모충), 봄빅스 모리(Bombyx mori)(누에), 에스티그멘 아크레아(Estigmene acrea)(설트마쉬(saltmarsh) 모충), 헬리오티스 비레쎈스(Heliothis virescens)(담배 버드웜(budworm)), 류카니아 세파라타(Leucania separata), 리만트리아 디스파(Lymantria dispar)(매미나방), 말라카소마 디스스트리아(Malacasoma disstria)(포레스트 텐트)(forest tent) 모충), 맘메스트라 브라씨카에(Mammestra brassicae)(양배추 벌레), 만두카 섹스타(Manduca sexta)(담배 호른웜(hornworm)), 플루텔라 질로스텔라(Plutella zylostella)(다이아몬드-백 나방), 스토도프테라 엑시구아(Spodoptera exigua)(비터 거염벌레), 및 스포도프테라 리톨리스(Spodoptera littorlis)에 전파시킬 수도 있다. 본 발명의 재조합 바쿨로바이러스의 전파에 바람직한 곤충 세포주는 스포도프테라 프루지페르다 Sf-9이다.

본 발명의 당단백질 또는 그의 면역원성 단편을 사용하여 제조한 백신은 고정된 숙주 세포, 숙주 세포 추출물, 또는 상기 숙주세포로 부터 생산되거나 또는 화학 합성에 의해 생산된 부분적으로 또는 완전히 정제된 FeLV 당단백질 제제로 이루어질 수 있다. 본 발명에 따른 제조된 FeLV 당단백질 면역원은 바람직하게는 완전한 FeLV 바이러스가 없다. 따라서 본 발명의 백신 면역원은 실질적으로 완전히 목적하는 면역원성 FeLV 폴리펩티드 및/또는 FeLV 항원성을 나타내는 다른 FeLV 폴리펩티드로 구성된다.

면역원을 잘 공지된 방법에 의해 백신 투여 형태로 제조할 수 있다. 이어서 상기 백신을 비경구 또는 점막 투여할 수 있다.

근육내 또는 피하주입과 같은 비경구 투여를 위해서 면역원을 적합한 담체와 결합시킬 수 있다. 예를들어 수산화 알루미늄, 인산 알루미늄, 황산 칼륨 알루미늄(alum), 황산 베릴륨, 실리카, 카올린, 탄소, 유중 수적형 유화액, 수중 유적형 유화액, 무라밀 디펩티드, 세균 내독소, 지질 X, 코리네박테리움 파르븀(Corynebacterium parvum)(Propionibacterium acnes) 보르데텔라 페르투시스(Bordetella pertussis), 폴리리보뉴클레오티드, 알긴산 나트륨, 라놀린, 리소레시틴, 비타민 A, 사포닌, 리포조옴, 레바미솔, DEAE-덱스트란, 블럭 공중합체 또는 기타 합성 면역보강제를 포함하는 각종 면역보강제 또는 면역조정제를 사용하거나 사용하지 않고 물, 염수 또는 완충된 비히클로 투여할 수도 있다. 상기와 같은 면역보강제들은 다양한 출처로부터, 예를들어, Merck Adjuvant 65(Merck and Company, Inc., Rahway, N. J.)로서 시판된다. 또다른 적합한 면역보강제는 Freund′s Incomplete Adjuvant(Difco Laboratories, Detroit, Michigan)이다. 기타의 백신들을 예를들어 문헌[I. Tizard, An Introduction to Veterinary Immunology, 2nd ed. (1982)](상기는 본원에 참고로 인용되어 있다)에 개시된 바와같이 당해분야에 잘 공지된 방법에 따라 제조할 수 있다.

비경구 투여를 위한 면역원과 면역보강제의 비율은 상기가 둘다 유효량으로 존재하는 한 광범위하게 변화시킬 수 있다. 예를들어, 수산화 알루미늄은 백신 혼합물중에 약 0.5%(Al₂O₃기준)의 양으로 존재할 수 있다. 투여기준, 및 항원의 순도 및 면역원성에 따라, 면역원의 농도는 고양이 한마리당 약 1.0㎍ 내지 약 100㎎의 범위일 수 있다. 투여되는 면역원의 바람직한 농도 및 분량은 숙주의 연령 및 체중 뿐 아니라, 백신 접종 기술 분야의 통상의 지식을 가진자에게 공지된 기타의 인자들에 따라 변화시킬 수 있다. 예를들어, 고양이에서, 바람직한 범위는 약 10㎍ 내지 약 1.0㎎이고; 적합한 투여크기는 약 0.5 내지 5ml, 바람직하게 약 1.0ml이다. 따라서, 주사용량은 예를들어 혼합물중에 0.5%의 수산화 알루미늄과 함께 1.0㎎의 면역원을 함유하는 1ml을 포함할 것이다. 미성숙한 포유동물에게 비경구 투여하기 위해 상당하는 투여형태를 또한 제조할 수 있으나, 투여량당 면역원량은 어린 고앙이에 대해서는 보다 작을 수 있다. 예를들어 투여량당 약 0.25 내지 약 1.0ml일 수 있다.

점막 투여를 위해서, 면역원을 적합한 담체, 예를들어 물, 염수 또는 완충된 비히클과 배합시킬 수도 있다. 또한, 당해분야에 공지된 다양한 면역조정제를 가하여 점막 면역 반응을 특이적으로 증진시킬 수도 있다. 이러한 약제로는 콜레라 독소 또는 그의 성분, DEAE-덱스트란, 인터류킨(예:IL-5), 이. 콜라이의 LT 독소, 시가(Shiga) 독소 및 그람-음성 미생물로부터의 기타 독소가 있다. 일반 배합되면, 상기 백신을 임의의 점막 표면에, 전형적으로 및 가장 편리하게, 상기 목적에 적합한 장치를 사용하여, 예를들어 작은 비강내 캐뉼라를 사용하거나, 분무등에 의해서 외비공 및/또는 구강인두내로 도입시킬 수 있다. 점막 투여를 위한 면역원의 농도 및 투여량은 비경구 투여에 사용된 바와 유사하다.

백신접종은 2가지 투여섭생에 따라 수행될 수 있다. 바람직하게, 상기 2가지 투여 섭생은 상기 개략된 바와같이 점막에 투여하는 제1투여와, 이어서 비경구적으로 투여하는 제2투여를 포함한다. 본 발명의 상기 태양에 따라서, 제2투여는 때때로 제1의 점막 접종에 이어서 투여된다. 제1점막 접종과 나중의 제2비경구 접종사이에 경과되는 시간은 숙주의 연령, 체중, 건강 등, 예방되어야 하는 바이러스, 각 백신들의 면역원성등에 따라 변한다. 통상의 조건하에서, 점막 투여는 복제제, 즉, 살아 있는 재조합 바이러스 또는 세균이 항원을 면역 시스템에 접근하도록 하는 약제를 포함할 수 있음은 잘 인지되어 있다. 또한, 제2비경구 접종은 복제 또는 비-복제 약제중의 어느하나로 이루어진다. 그러나, 이러한 프로토콜은, 비-복제 항원이 예를들어 항원의 미소구 피막형성에 의해 점막 면역 시스템으로 전달될 수 있으므로 배타적인 항원 전달 방식이 아니다. 상기 및 기타의 인자들은 당해 분야에 잘 공지되어 있으며, 임의의 상기 인자들의 상대적인 중요성 및 영향력의 결정은 당해분야의 숙련가들의 통상적인 고려범위내에 있다. 본 발명의 상기 이중 과정은 구분된 면역원 반응을 나타내는 바이러스, 즉, 점막 부위를 통해 숙주내로 들어가지만, 또한 전신적으로 복제되는 바이러스에 대해 매우 효과적이며, 인간을 비롯한 모든 포유동물에 사용하기에 적합하다. 이러한 구분된 반응을 나타내는 바이러스성 미생물의 예로 인플루엔자 및 헤르페스 감염(인간에서); 감염성 비기관염 및 바이러스성 설사(소에서); 범백혈구감소증, 백혈병, 비기관염 및 칼리시바이러스(고양이에서); 가성광견병, 파르보바이러스 및 엔세폴로마이오카르디티스(Encepholomyocarditis) 바이러스(돼지에서); 디스템퍼, 감염성 간염 및 파르보바이러스(개)를 일으키는 것들이 있다. 세균성 미생물의 예로 스타필로코커스(Staphylococcus) 감염(인간에서), 파스테렐라 물토시다(Pasteurella multocida), 피.헤모리티카(P. hemolytica) 및 헤모필러스 솜누스(Hemophilus somnus)(소에서), 액티노바실러스 폴레로프뉴모니아(Actinobacillus pleuropneumonia), 피. 물토시다(돼지에서), 및 보르데텔라 브론코세프티카(Bordetella bronchoseptica)(돼지 및 개에서)가 있다.

본 발명의 이중 과정은 또한 점막 부위 또는 비경구 부위에서 우세하게 복제되는 미생물들, 예를들어 소에서 호흡기 합포체 및 파라인플루엔자-3 바이러스 및 고양이에서 면역결핍 바이러스에 대해 효과적인 것으로 보인다. 상기 바이러스들에 대한 백신을 목적 동물에서 각각의 백신에 대해 적합하고 당해분야에 공지된 투여량 및 농도를 사용하여 투여한다. 현재 사용 가능한 백신들은 본 발명의 상기 이중 투여 방법에 따른 투여에 적합하도록 재배합시킬 필요가 있을 수 있다.

본 발명의 상기 이중 투여 섭생을 또한 2개의 백신 성분을 적합한 부위에서 동시에 투여함으로써 수행할 수 있다. 정확하게 동시에 두 부위에 투여하는 것은 당해분야의 숙련가들에게는 가능하지 않은 것으로 인식되므로, 동시 투여의 기간에는 경험될 수도 있는 지연, 예를들어 제2투여를 위해 숙주를 준비하고, 투여를 위해 제2투여량을 준비하고, 제1투여량의 투여후의 고통의 징후에 대해 숙주를 관찰하는 등이 포함된다. 따라서, 본 발명의 동시 투여법을 따른 경우, 예를들어 고양이에게 비강내 및/또는 경구로 적합한 투여량의 적합한 백신 제형을 투여하고 동시에 적합한 백신을 사용하여 근육내에 백신접종한다.

백신을 본 발명의 이중과정에 따라 투여하는 경우, 상기 백신은, 동일하거나 상이한 벡터로 제조되거나 상기 벡터내에 존재하거나, 또는 동일하거나 상이한 비히클내로 배합되는 동일한 면역원 성분을 함유할 수도 있다. 상기 개시한 동시적인 이중 투여는 2개의 면역원 부분을 모두 자극하고 따라서 나중의 제2투여의 필요성을 감소시키는 것으로 보인다.

본 발명의 FeLV 백신의 예방접종을 또한 종래의 투여섭생에 따라 수행할 수도 있다. 전형적으로, 제1투여량을 비경구 부위, 또는 보다 드물게, 몇몇 백신의 경우 점막 부위에 투여한다. 제1접종 부위의 선택은 치료되는 동물 뿐 아니라 상기 부위에 대한 백신의 이용성 및 적합성에 따라 변한다. 적절한 기간에 이어서, 필요한 경우, 제2투여량을 투여한다. 전통적으로, 제2투여량은 제1투여와 동일한 부위에 투여한다. 즉, 제1투여 부위가 점막이면 제2투여 부위도 점막이다. 어느 부위가 초기 투여에 적합한가의 결정, 제2투여의 필요성 및 제2투여전까지의 기간, 제공되는 투여량등은 모두 공지된 인자들이고 포유동물 백신접종 분야의 숙련가에게 공지되어 있다.

예를들어, 고양이를 예방접종할 때, 제1투여는 태어난지 6 내지 10주째에 수행할 수 있다. 이어서 백신의 제2투여량을 제1투여 숙주후, 예를들어 약 2 내지 4 주후에 투여해야 한다. 한편, 백신을 1ml 투여량으로 한번에, 예를들어 태어난지 약 6 내지 10주째에 투여할 수 있다. 그러나, 2가지 투여 섭생이 고양이의 최대로 효과적인 면역화에 바람직한 것으로 간주된다. 1년마다 재접종이 권장된다. 성숙한 고양이는 어느때라도 재접종할 수 있다. 예방접종되지 않은 모체에서 태어난 어린 고양이는 약 3 내지 10일째에 접종하고, 다시 4 내지 6개월째에 접종하고, 그후에 해마다 접종한다.

본 발명의 FeLV 백신 뿐 아니라 공지된 백신을, 종래의 기법에 따라 투여하거나, 본 발명의 이중 방법에 따라 투여할 때, 다른 질병들에 대한 다른 백신들과 배합시켜 다가 백신을 얻을 수도 있다. 또한, 본 발명의 백신 뿐 아니라 공지된 백신을, 종래의 기법에 따라 투여하거나, 본 발명의 이중 방법에 따라 투여할 때 다른 약제들, 예를들어 항생제와 배합시킬 수도 있다.

“바이러스-유사 입자”는 밀도(크로마토그래피시), 및 크기, 모양 및 고리구조(EM 분석시)가 미성숙한 FeLV 입자와 닮은, 바클로바이러스 감염된 곤충 세포에 의해 생산된 입자이다.

본 발명의 실시에 사용되는 대부분의 재조합 DNA 법은 표준 방법이며, 당해분야에 잘 공지되어 있고, 예를들어 문헌[J. Miller, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y. (1972), D. A. Morrison, Transformation and Preservation of Competent Bacterial Cells by Freezing, Methods Enzymol. 68:326-331(1979), J. Sambrook 등, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor laboratory Press(1989), J. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley ＆ Sons(1984), and M. D. Summers and G. E. Smith, Texas Agricultural Experimental Bulletin No. 1555(1987)](상기는 모두 본원에 참고로 인용되어 있다)에 상세히 개시되어 있다. 표시한 것을 제외하고, 모든 제한 효소, 화학약제 및 물질, 또는 이의 등가물들은 시판되고 있다. 엔도뉴클레아제 제한은 제조자의 지시사항에 따른다.

추가의 노력없이, 당해분야의 숙련가는 선행 설명을 이용하여 본 발명을 그의 가장 넓은 범위로 실시할 수 있을 것으로 보인다. 하기의 상세한 실시예들은 본 발명의 다양한 재조합 바쿨로바이러스의 제작방법 및/또는 본 발명의 다양한 공정의 수행방법을 개시하며, 단지 예시적일 뿐이지 어떠한 방식으로도 선행설명을 제한하는 것은 아니다. 당해분야의 숙련가는 상기 공정으로부터 반응물, 및 반응조건 및 기법 모두에 대한 적합한 변형을 정확하게 인지할 것이다.

[물질 및 방법]

[세포, 바이러스 및 플라스미드]

모 바쿨로바이러스인 오토그라피카 칼리포니카 핵 폴리헤드론 바이러스(Autographica californica nuclear polyhedrosis, AcNPV), E2 균주를 맥스 서머스(Max Summers, Texas A ＆ M University)로 부터 입수한다. 스포도프테라 프루지페르다(Spodoptera frugiperda) 세포주, Sf-9를 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(CRL 1711)으로 부터 입수한다. 플라스미드 pFeLVgag 3, pTC2 및 pCG113, 및 FeLV-A/FGA 세포주를 세투스사(Cetus Corp.)로 부터 입수하였다. 세포, 모 바이러스 및 재조합 바이러스를 문헌[Texas Agricultural Experimental Bulletin No. 1555)1987)]에 상세히 개시된 방법에 의해 전파시킨다.

플라스미드 pVL941은 문헌[Luckow, V. E. and M. D. Summers, Virology 170:31-39(1989)]에 개시되어 있다.

FeLV-A/FGA는 FeLV 서브그룹 A로 잠복기가 길게 감염된 크란델 고양이 신장(Crandell Feline Kidney, CRFK) 세포주이고, 문헌[J. Virol. 64:4930-4938(1990)]에 개시되어 있다. FeLV-A/FGA 세포를 10% 송아지 태아 혈청(FCS)으로 보충된 둘베코의 개질된 이글배지(DMEM)에서 배양한다.

CT600 세포 및 Gp50 단클론성 항체(MAB)는 Dr. N. Pedersen, Davis, CA로 부터 입수한다.

AcNPV-gp50은 가성광견병 바이르스로부터 피막 단백질 gp50을 발현하는 재조합 바쿨로바이러스 바이러스이고, 문헌[J. Cell. Biochem. 43:67-79(1990)]에 개시된 프로토콜에 따라 합성한다.

FeLV의 gag 및 gp85를 발현하는 FHV 재조합체를 J. Nunberg of Cetus Corp. 로부터 수득하고, 발현은 문헌[J. Virol. 64:4930-4938(1990)]에 개시되어 있다.

FeLV 전 바이러스는 문헌[Theilen 등., Nature 222:589-590(1969)]에 개시된 바와같이 FL74 세포주에서 생산된다. gp70은 문헌[Vaccine 7:142-146(1989)]에 개시된 바와같이 정제된 FL74 세포로 부터의 바이러스를 사용하여 제조한다.

[동물]

특정 병원균이 없는 고양이를 모든 실험에 사용한다. 동물들을 개별적인 우리나 고양이 6 내지 8 마리 우리의 수용 시설에 수용한다. 동물들에게 고양이 먹이와 물을 무제한으로 공급하였다.

[바이러스 감염된 세포 특이적인 폴리펩티드의 표지화]

³⁵S-메티오닌(50μCI/ml)을 사용한 표지화는 통상적인 메티오닌 농도의 1/10을 함유하는 10% FCS+그레이스 배지에서 수행한다.³H-글루코스아민(50μ Ci/ml) 표지화는 그레이스 배지+10% FCS에서 수행한다. 상기 두 표지화 배지에서 이스톨레이트와 락트알부민 가수분해물을 생략한다. 세포를 5 내지 10개의 플라크 형성 단위(pfu)/세포의 감염도(MOI)로 감염시키고 감염후 24 내지 48 시간째에 표지한다. 메티오닌 표지된 세포 및 배지를 수확하고 문헌[J. Virol. 60:216-223(1986)]에 개시된 바와같이 면역침강반응을 위해 가공한다. 글루코스아민 표지된 세포 및 배지를 SDS-PAGE 해리완충액중에서 직접 수확한다.

[슈크로즈 구배 분석]

100ml의 스피너 플라스크에서 배양한 Sf-9세포(1×10⁶세포/ml)를, 단독 감염시킨 배양물에 대해서는 10pfu/세포의 MOI에서, 또는 이중 감염시킨 배양물에 대해서는 각 바이러스의 5pfu/세포의 MOI에서, 재조합 바쿨로바이러스 AcNPV-gag, AcNPV-gp85, AcNPV-gp70, 또는 대조용 바이러스, AcNPV-gp50으로 감염시킨다. 감염된 세포 배양물을 감염 후 64 시간째에 수확한다. 세포가 유착되면 지속적으로 감염시킨 FeLV-A/FGA 세포의 상등액으로부터 FeLV를 수확한다. 세포 및 세포 부스러기를 저속 원심분리에 의해 제거한다.

이어서 상등액을 100,000xg에서 1시간동안 원심분리시킨다. 상기 고속 회전으로부터의 펠렛을 인산염 완충 염수(PBS)에 재현탁하고, 20 내지 60% 슈크로즈 구배(PBS 중의)의 층으로 나누고 SW41 로터에서 100,000xg에서 16시간동안 원심분리시킨다. 상부로부터 구배물을 분획화하였다. 각 분획(0.5ml)을 슈크로즈 농도 및 단백질 함량(BCA 단백질 분석 키트, Pierce Chemical Co.)에 대해 분석한다. 웨스턴 블롯을 사용하여 각 분획중의 특정 단백질을 검출한다. 일부 분획중의 바이러스 입자의 존재를 전자 현미경에 의해 직접 관찰한다.

[웨스턴 블롯 분석]

웨스턴 블롯 분석을 위해, 각 구배의 분획물로 부터의 분액을 램리(Laemmli)법 (Nature 227:680-685(1970)을 사용하여 11% N,N-디알리타르디타르아미드(DATA)-가교결합된 폴리아크릴아미드겔상에서 분리시킨다. 단백질을 전기영동에 이어서, 문헌[Towbin, H. 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:4350-4354(1979)]의 방법에 따라 0.22㎛ 니트로셀룰로즈상에서 전기 블롯팅시킨다. 니트로셀룰로즈 상의 채워지지 않은 부위를 0.1% 트윈-20 함유 PBS 및 0.1% Brij-58 함유 트리스-염수(pH7.4)에서 순차적으로 배양시켜 차단한다. 블롯을 주항체와 함께 배양시키고 색 전개를 문헌[Hink, W. F. 등., Biotechnology Progress 7:9-14(1991)]에 개시된 바와같이 수행한다. gag 및 gp70을 검정하기 위해서, 문헌[Lutz, H. 등., Am. J. Vet. Res. 44:2054-2059(1983), Lutz, H. 등., Vet. Immunol. Immunopathol. 2:425-440(1981) 및 Grant, C.J. 등., J. Immunol. 131:3042-3048(1983)]에 개시된 바와같이 단클론성 항체를 사용한다.

[EM 분석]

EM을 위해 슈크로즈 구배의 피크 분획물을, 0.05% 소혈청 알부민(BSA) 용액을 함유하는 2% 포스포텅스텐산(PTA) 용액(pH 6.0) 100㎕와 상기 분획 50㎕를 혼합함으로써 제조한다. 혼합물 한방울을 탄소-포름발 코팅된 그리드(Ted Pella Inc., Redding, California)로 옮긴다. 샘플이 30초간 흡수되도록 하고 상기 그리드의 테두리에 여과지를 접촉시켜 과잉의 유체를 제거한다. JEOL 1200 투과 전자 현미경상에서 60KV에서 그리드를 관찰한다.

[백신으로 사용하기 위한 항원의 제조]

스피너 플라스크중의 스포도프테라 프루지페르다(Sf-9) 세포를 5개의 플라크 형성 단위(pfu)/세포의 감염도에서 1×10⁶세포/ml의 세포 농도로 감염시킨다. 상기 세포를 AcNPVgp85 또는 AcNPVgp70의 재조합 바이러스로 감염시키거나, 또는 AcNPVgp85와 AcNPVgag로 동시감염시킨다. 감염후 72시간째에 각 배양물을 수확한다. gp85 또는 gp70으로 감염시킨 세포를 백신으로서 시험한다. 저속 원심분리에 의해 감염된 세포를 세포 배지로부터 분리시키고 사용할 때까지 냉동보관한다. gag/gp85 입자를 100,000xg에서 1시간동안 원심분리시켜 감염된 세포의 상등액 100ml 로부터 정제한다. 상기 과정으로부터의 펠렛을 PBS 5ml에 재현탁시키고 백신으로 배합하기 전에 냉동보관한다.

FeLV gp70, gp85 또는 gag를 발현하는 FHV 재조합체를 CRFK 세포에서 배양하고 감염 3일후에 수확한다. 세포 부스러기를 제거하여 등명화시킨 후에, 상등액을 적정하고 사용전에 -70℃에서 보관한다. 백신을 10⁵-10⁷pfu/ml을 함유하도록 배합한다.

[실험실 분석]

고양이에서의 p27 수준을 시판하는 키트(Synbiotics, San Diego, CA)를 사용하여 측정한다. FeLV의 특이적 항원 그룹인 p27은 지속적으로 감염시킨 동물의 혈액에서 발견되며, 따라서 바이러스혈증의 시험에 사용될 수 있다. 본 실험실에서의 표준화는, 공지된 양성 및 음성 혈청의 환경내에서, 0.25 이상의 0.D값이 바이러스혈중에 대해 양성임을 지시한다.

FeLV 특이적 항체를 정제된 gp70 및 정제된 전 바이러스에 대해 2가지 ELISA로 측정한다. FL74세포(Theilen 등., Nature 222:569-570(1969))로부터 분열된 바이러스 및 gp70 단클론성 항체를 사용하여 친화성 크로마토그래피에 의해 gp70을 제조한다. 컬럼 용출물을 농축시키고, 이를 사용하여 2㎍ 단백질/ml로 ELISA 플레이트를 코팅시킨다. 4℃에서 18시간동안 배양시킨 후에, 플레이트를 인산염 완충 염수(PBS)로 세척한 다음 고양이 혈청을 가하고, 0.05% 트윈 20을 함유하는 PBS(PBST)로 1:10으로 희석한다. 이어서 적합하게 희석된 양고추냉이 퍼옥시다제 표지된 항-고양이 면역글로불린(Kirkegaard and Perry, Gaithersburg MD., USA)을 실온에서 45분간 상기 플레이트와 반응시킨다. 추가의 세척 단계후에, 기질과 색소원을 가하여 발색시킨 후에 ELISA 판독기상에서 플레이트를 판독한다. 각 플레이트는 적합한 음성 및 양성 대조용을 함유한다. 혈청을 중복 시험하고 2회이상의 전처리 수준의 OD 값의 증가를 양성으로 기록한다. 전 바이러스 분석을 위해 바이러스를, 아미콘 필터를 통해 여과시키고 구배 원심분리시킴(Vaccine 7:142-146(1989))으로써 FL74 세포로부터 제조한다. 물질을 -20℃에서 보관하고 공지된 양성 및 음성 혈청으로 적정하여 사용에 적합한 희석율을 찾는다. 분석은 gp70 항체 검정에 대해 개시된 바와 유사한 방식으로 실시한다.

[실시예 1]

FeLV gag, gp85 및 gp70의 발현

[바쿨로바이러스 발현 벡터 내로의 gag 유전자의 클로닝]

플라스미드 pFeLVgag3로 부터 엔도뉴클레아제 절단에 의해 2.2kB XbaI-EcoRI 단편을 제거한다. 상기 단편은 FeLV gag 유전자의 암호화 서열 뿐 아니라 pol 유전자의 프로테아제 부분(뉴클레오티드 517-2786)(J. Virol. 62: 722-731(1988))을 함유한다. 상기 단편의 말단을 클레노우 효소를 사용하여 보수하고 BamHI 링커를 가한다. 이어서 상기 단편을 BamHI으로 미리 절단시킨 플라스미드 pVL941 내로 연결시킨다. 생성된 플라스미드를 pVLgag로 한다.

[바쿨로바이러스 발현 벡터 내로의 gp85 피막 단백질의 클로닝]

gp85 유전자를 PstI 효소로 절단시켜 플라스미드 pTC2로부터 제거한다. 2kB 단편을 단리하고 그 말단을 T4 DNA 폴리머라제로 처리하여 보수한 다음 BamHI 링커를 가한다. 상기 BamHI 단편을 BamHI으로 미리 절단시킨 플라스미드 pVL941의 BamHI 부위에 연결시킨다. 생성된 플라스미드를 pVLgp85로 한다.

[바쿨로바이러스 발현 벡터 내로의 gp70 피막 단백질의 클로닝]

env 유전자의 gp70 부분을, 3개의 인프레임 종결 코돈을 함유하는 합성 올리고뉴클레오티드를 사용하여 gp85 유전자의 끝을 절단시켜 제작한다. 상기 올리고뉴클레오티드를 뉴클레오티드 7298(J. Virol. 62:722-731(1988))에서 AluI 부위에서 gp85 암호화 서열에 연결시키고 p15E 단백질을 암호화하는 서열은 제거한다. 상기 변경된 유전자를 pVL941(챠트 C.1)의 BamHI 부위에 연결시켜 플라스미드 pVL70을 제작한다.

[바쿨로바이러스 형질절환]

플라스미드 pVLgag, pVL85 및 pVL70을 표준 바쿨로바이러스 발현 벡터 기법(Texas Agricultural Experimental Station Bulletin No. 1555(1987))을 사용하여 야생형 AcNPV와 동시형질감염시킨다. 상기 개시한 바와같이, (-)바이러스(+)봉입 플라크를 가시적으로 스크리닝하고, gag 또는 gp70에 대한 단클론성 항체를 사용하여 감염된 Sf9 세포로부터³⁵S-메티오닌 표지된 단백질을 면역침강시킴으로써 확인된 gag, gp85 및 gp70 단백질의 발현에 의해 재조합 바쿨로바이러스, AcNPV-gag, AcNPV-gp85 및 AcNPV-gp70 각각을 선별한다.

따라서, 재조합 바이러스 AcNPV-gag는 gag 생성물 뿐만 아니라 pol 유전자의 프로테아제 부분을 암호화하는 DNA를 함유한다. 이러한 구조는 gag 종결 신호가 곤충 세포내에서 억제되는 경우 FeLV 감염된 포유동물 세포에서와 같이 78kD의 gag-프로테아제 융합 단백질 또는 p65 gag 전구체의 발현을 허용할 수 있다. 이와 동일한 gag-프로테아제 영역을 문헌[Cole, G.E., J. Virol. 64:4930-4938(1990)]에 의해 고양이 헤르페스 바이러스(FHV) 게놈내로 삽입시켰다. 상기 재조합 바이러스는 곤충세포에서 gag 유전자 생성물과 gag-프로테아제 융합 단백질 모두를 생산하는 것으로 나타났다. 상기 프로테아제는 또한 재조합 FHV 감염된 세포에서 gag p65가 그의 4개의 폴리펩티드 성분내로 가공되는데 활성인 것으로 나타났다. 또한, 2가지 형태의 피막 유전자, 즉 gp85 당단백질을 암호화하는 완전한 길이의 유전자(재조합 바이러스 AcNPV-gp85)와 상기 유전자의 단지 gp70 부분만을 암호화하는 유전자(재조합 바이러스 AcNPV-gp70)를 바쿨로바이러스내에 삽입한다. gp70 유전자 생성물은 gp85 당단백질의 p15E 부분이 부족하며 감염 세포의 배지내로 분비되어야 한다. gp85 유전자는 67kD의 주쇄를 갖는 단백질을 암호화하는 반면 gp70 유전자는 45kd의 주쇄를 갖는 단백질을 암호화한다.

[FeLV gp70 및 gp85 발현]

³⁵S-메티오닌 표지된 감염 세포 폴리펩티드의 면역침강 반응은 AcNPV-gp85 및 AcNPV-gp70 감염세포에서, gp85 및 gp70의 2가지 형태를 합성하고 이들이 상기 세포내에 남아 있음을 보인다. EndoH의 처리로 AcNPV-gp85 감염 세포에서 74kd 종들의 분자량 및 AcNPV-gp70 감염세포에서 53kd 종들의 분자량이 각각, 보다 낮은 분자량 형태인 60kd 및 41kd으로 감소된다. gp85 및 gp70의 단지 보다 높은 분자량 형태들만이 글루코스아민 표지와 결합된다. 소량의 gp85 및 pg70이 또한 감염 세포의 배지에서 발견된다.

[FeLV gag 발현 및 입자 조합]

AcNPV-gag 감염된 Sf-9 세포의 세포외 유체를 바이러스-유사입자의 존재에 대해 슈크로즈 구배 분석법으로 검사한다. AcNPV-gag 및 AcNPV-gp50 감염된 세포의 고속 펠렛의 상등액을 분획화한다. AcNPV-gp50은 가성광견병 바이러스(PRV)로 부터 gp50 당단백질 유전자를 생산하는 재조합 바이러스이며 대조용으로서 작용한다. AcNPV-gag 및 AcNPV-gp50은 모두 동일한 분획에서 주 단백질 피크를 갖는다. 상기 분획들의 EM 분석은 상기가 바쿨로바이러스 입자를 가짐을 나타낸다. 곤충 세포는 크기(100nm), 모양 및 고리 구조가 미성숙 FeLV 입자를 닮은 입자를 생산한다. 바쿨로바이러스 생산된 물질에서는 오직 미성숙 입자들만이 발견되는 반면, FeLV-A/FGA 상등액 제제에서는 성숙입자 및 미성숙 입자 모두가 발견된다. 웨스턴 블롯 분석은 gag의 발현으로 바이러스-유사 입자들이 생성됨을 나타낸다(데이타는 나타내지 않았음).

AcNPV-gag 감염된 세포 상등액을 구배 분획화하고 웨스턴 블롯에 의해 분석하여, 다수의 면역반응성 폴리펩티드가 존재함을 발견했다(데이타는 나타내지 않았음). 이는 gag-pol 유전자 생성물(폴리단백질)이 가공되며 생물학적으로 활성임을 제시한다.

FeLV-A/FGA 세포주에 의해 생산된 구배 분획화된 FeLV 입자들의 웨스턴 블롯은 감염된 곤충 세포 상등액에 사용된 것과 동일한 조건하에서 분획화될 때 천연 gp85 및 gag 유전자 생성물이 어떻게 보이는 가에 대한 정보를 제공한다. 피막 단백질에 대한 항체는 분자량 80kd의 단일 밴드와 반응한다. p27에 대한 항체는 상기와 동일한 분획에서 27kd의 폴리펩티드와 반응한다. 대부분의 gp70은 문헌[Zelikman, I. 등., Biotechnol. Appl. Biochem. 11:209-216(1989)]에 보고된, 정제시 바이러스 입자로부터 분리되는 gp70이 존재하는 구배의 윗부근에 남게 된다.

AcNPV-gag 및 AcNPV-gp85가 동시감염된 세포로 부터의 구배의 면역블롯 분석은 gp70이 FeLV에 대해 발견된 것과 똑같이 gp85가 발견됨을 밝힌다. 소량이 상기 구배의 상부에서 발견되나, 바이러스 입자에서 발견되는 것보다는 훨씬 더 적은 비율로 발견된다. AcNPV-gp85 단독으로 감염된 세포 상등액을 유사하게 분석할 때, 상기 구배에서 면역반응성 밴드는 발견되지 않는다.

gp85와 gag의 상호작용 특이성을 증명하기 위해서, 세포를 AcNPV-gag와 AcNPV-gp70으로 동시 감염시켰다. gp70은 당단백질의 p15E 부분을 제거함으로써 분비되는 것으로 구상되지만, 감염 세포로부터 거의 분비되지 않는다. 표면 당단백질의 결합이 임의적이거나, 또는 상기 분자의 15kd 부분이 gag에 대한 인식 신호로 작용하지 않는 경우, gp70 면역반응성 폴리펩티드가 gag 입자와 동일한 밀도로 발견될 것이 기대된다. gp 반응은 단지 상기 구배의 상부에서만 일어난다. gp70 반응성은 상응하는 바이러스 입자의 밀도에서 발견되지 않는다(데이타는 나타내지 않았음).

또한, 세포를 AcNPV-gag 및 AcNPV-gp50으로 동시 감염시켰다. gp50은 PRV의 표면 및 감염된 세포의 표면에서 발견되는 당단백질이다(Ben-Porat, T., and Kaplan, A.S., Virology 41:265-273(1970)). gp50을 검출하기 위해서, 토끼를 gp50을 생산하는 재조합 백신 바이러스로 예방접종하여 생산된 다클론성 항체를 사용한다(J. Virol. 61:3977-3982(1987)). 또한, gp50은 gag입자의 밀도에서 발견되지 않으며(데이타는 도시하지 않았음), 이는 gp85의 상기 입자내로의 결합이 특이적임을 가리킨다.

gp85 env 유전자의 gp70 부분에 대한 발현을 위해서, 올리고뉴클레오티드를 3개의 인프레임 종결 코돈을 갖도록 설계한다. 상기 올리고뉴클레오티드를 뉴클레오티드 7298(Donahue, P.R. 등. J. Virol. 62:722-731(1988))의 AluI 부위에서 gp85 암호화 서열내로 연결시키고, p15E 단백질에 대한 암호화 서열을 제거하여 끝이 절단된 gp70 단백질이 생산된다. 고양이 헤르페스 바이러스내로 삽입하기 위해서, 상기 gp70 유전자를 FHV△tK 벡터 pCG113 내로 BGH 폴리A신호와 HCMV IE 프로모터 사이에 삽입하여 p113-70B 플라스미드를 제작한다. 상기를 FHV UT88의 DNA와 함께 크란델 고양이 신장(CRFK) 세포내로 동시 형질감염시킨다. 문헌[Nunberg, J.H. 등. Proc. Nat1. Acad. Sci. USA 81:3675-3679(1984)]의 표준 기법에 따라 재조합 바이러스를 단리시킨다. gp70에 대한 단클론성 항체를 사용하여 감염 세포로부터³⁵S-메티오닌 표지된 단백질을 면역침강 및 웨스턴 블롯팅시켜 gp70 단백질의 발현을 확인한다.

[실시예 2]

결합된 점막/비경구 백신접종

[백신 실험 I]

두 그룹의 고양이를 본 실험에 사용한다. 첫번째 그룹(n=6)을 각각 1.3×10⁵pfu 및 10⁷pfu를 함유한 FHV△tkgp85 1.0ml로 비강내/경구(0 일째 및 21일째)로 2회 접종한다. 이는 작은 비강 캐뉼라가 부착된 주사기를 사용하여 수행한다. 동물들을 부드럽게 구속하고 약 0.25ml을 각각의 비강내에 점적하고 구강인두의 후면에 0.5ml을 놓는다. 두번째 그룹(n=6)을 0일째에 8×10⁶개의 AcNPVgp85 감염된 SF-9 세포로 근육내 접종하고, 21일 및 33일째에 10⁷개의 AcNPVgp85 감염된 Sf-9 세포로 근육내 접종한다. 동물들을 0, 2, 4 및 7일째에 투여된 융합성 CT600 세포의 상등액 1ml로 비강내/비경구 항원투여한다. 5일째에, 고양이를 5mg/체중kg으로 사용된 Depo-Medrol(The Upjohn Company, Kalamazoo, MI)로 면역억제시킨다. 항원투여 0일째는 초기 백신 접종 40일후이다. 6마리의 백신접종하지 않은 고양이를 대조용으로 작용하도록 동시에 항원투여한다.

[백신 실험 II]

단일 그룹의 동물(n=17)을 본 실험에 사용하고, 2×10⁵pfu의 FHV△tk gp70 1.0ml로 비강내/경구 접종한다. 27일후에, 모든 동물들을 동일 제제로 재접종한다. 2차 접종 후 39일째에, 고양이에게 근육내 주사로 AcNPVgp70으로 감염된 2.5×10⁷개의 Sf-9 세포를 투여한다. 상기 접종후 64일째에, 고양이를 2개의 서브그룹으로 나눈다. 첫번째 서브그룹(n=10)을 실험 I에 개시한 바와같이 면역억제하고 항원 투여한다. 두번째 서브그룹(n=7)을 8마리의 지속적으로 FeLV-감염시킨 고양이 및 6마리의 백신접종하지 않은 음성 대조용과 함께 우리에 둔다.

[백신 실험 III]

7개 그룹의 동물들을 본 실험에 사용한다. 첫번째 그룹(n=8)에서, 고양이에게 29일 간격으로 바쿨로바이러스 AcNPVgp70으로 감염시킨 Sf-9세포를 2회 근육내 접종시킨다. 두번째 그룹(n=8)에서, 동물들에게 Sf-9 세포를 2회 접종시킨다. 첫번째 접종물은 AcNPVgp70 및 gp85/gag 입자로 이루어진 반면 두번째 접종물은 gp85/gag 입자로만 이루어졌다. 세번째 그룹(n=8)에서, 고양이에게 먼저 1ml 투여량당 2×10⁵pfu 함유 FHV△tkgp85를 비강내/경구 접종하고 29일후에 AcNPVgp85로 감염시킨 Sf-9 세포로 근육내 접종한다. 네번째 그룹(n=8)의 고양이에게 먼저 FHV△tkgp85 및 FHV△tk gag로 비강내/경구로 동시 접종한다. 각 접종물은 2×10⁵pfu를 함유한다. 29일후에, 동물들에게, 감염된 곤충 세포를 고속 원심분리시킨 후에 모은 상등액으로부터의 gag/pg85 입자를 근육내 접종한다. 다섯번째 그룹(n=6)에서, 고양이에게 2×10⁵pfu의 FHV△tkgp70을 29일 간격으로 2회 비강내 접종한다. 마지막 그룹(n=8)에서, 동물들에게 먼저 2×10⁵pfu 함유 FHV△tkgp70 1ml 투여량을 비강내/경구 접종한다. 29일 후에, 동물들에게 AcNPVgp70을 근육내 접종한다. 최종 백신접종 44일후에, 각 그룹으로 부터의 모든 고양이를 실험 I에서와 같이 면역억제/항원 투여한다. 8마리의 백신접종하지않은 부합되는 동물들에게 대조용으로서 작용하도록 유사하게 항원투여한다.

[백신접종 실험들의 결과]

백신 실험 I에서(FHV△tkgp85 또는 AcNPVgp85로 접중한 고양이 사용), 어느 동물도 백신접종에 대한 어떠한 결정적인 징후도 나타내지 않았다. 항원투여후, 동물들을 방혈시키고 바이러스혈증의 측정으로서 p27 수준을 분석한다. 제1도는 항원투여전, 및 항원투여 3,5 및 7주후에 취한 방혈액으로 부터의 결과를 나타낸다. 6마리의 대조용 고양이(제1(a)도)중에서, 5마리가 잠복기가 긴 바이러스 혈성으로 되었고, 1마리는 절대로 감염되지 않았다. FHV△tkgp85(제1(b)도) 및 AcNPVgp85(제1(c)도)의 백신 그룹 모두에서, 6마리중 4마리가 바이러스혈성으로 되었다. 감염된 동물들에서 바이러스혈증의 수준은 대조용과 다르지 않다. ELISA는 FHV△tkgp85로 백신접종한 고양이들중 어느것도 pg70 또는 전 FeLV에 대한 반응을 보이지 않은 반면, AcNPVgp85로 백신접종한 6마리중 4마리의 고양이가 전 FeLV ELISA에 대해 반응하고 6마리중 1마리의 고양이가 정제된 gp70에 반응했음을 나타낸다.

백신 실험 II를 1) p15E 서브유닛의 배제가 효능을 개선시키는지의 여부, 2) 결합된 점막 및 비경구 최초항원자극이 백신 보호 효과를 증진시킬 수 있는지의 여부, 및 3) 천연 항원 투여 시스템이 면역성 검출의 기회를 증가시킬 수 있는지의 여부를 시험하기 위해서 기획한다.

결합된 백신 투여섭생은 동물 및 다수의 고양이에서 결정적인 징후를 나타내지 못하며, 7/17의 다수의 동물들은 별도로 투여된 재조합 바이러스의 선행 반응에 비해 gp70 대한 반응을 보였다. 훨씬 더 많은 수, 즉 16/17이 또한 전 바이러스 분석에서 반응했다. 주사 항원투여로 대조용의 3/4이 감염된 반면, 백신을 투여한 동물의 3/10만이 7주째에 p27 양성이었다(제2(a)도 및 제1(b)도). 접촉 항원투여는 단지 대조용의 2/6만을 감염시킨 반면, 백신 접종동물의 단지 1/6 만이 항원투여 7주후에 매우 낮은 p27 수준을 나타냈다.

이 결과는 gp70의 결합된 점막/비경구 접종이 주사/면역억제 항원투여 시스템에서 조차도 항원투여에 대한 보호를 제공할 수 있음을 가리킨다. 한편 접촉/항원투여 시스템에서 대조용의 낮은 감염율은 백신/접촉 항원투여 그룹의 해석의 난해성에 기인한다. 백신/감염 항원투여 그룹에 나타난 보호는 이중 접종 스케줄에 기인하거나, 또는 p15E가 면역 억제성인 경우, gp70 서브유닛의 사용에 기인할 수 있다. 상기 위치를 더욱 탐침조사하고 면역성에 있어서 gag 단백질의 중요성을 시험하기 위해서, 추가로 일련의 고양이를 다수의 상이한 백신 투여섭생을 이용하여 백신접종한다. 접촉 항원투여를 사용하여 대조용에서 설정된 빈약한 감염률과, 면역억제면에서 백신의 명백한 성공 때문에, 최종 실험에서 모든 고양이들에게 감염/면역억제 모델을 사용하여 항원투여한다.

항원투여 9주 후에서의 6가지 백신 투여섭생에 대한 p27수치(백신 시험 III)를 제3도에 나타냈다. 두 벡터중 어느 한 벡터 단독의 gp70으로 처리한 동물들은 백신 실험 I에서 gp85와 유사하게 낮은 수준의 보호를 나타냈다. gp70을 사용한 점막 및 비경구 면역성에 대한 이중 접종은 50%의 보호를 제공하였으며 항원투여 9주후에 여전히 바이러스혈성인 상기 그룹의 고양이들은 보다 낮은 p27 수준을 갖는 듯했다. gp85의 이중 접종은 보호 수준을 개선시키며 또한 gp70의 사용에 비해 p27 수준을 강하시켰다. 이는 gp85의 단일 부위 접종에 비해 gp70의 이중부위 접종으로 나타난 미리 증진된 보호가 p15E의 가능한 면역억제효과 보다는 오히려 2개 부위에서의 면역학적 자극에 기인함을 가리킨다. gag/gp85 입자의 부분으로서 gag 단백질의 봉입은 또한 단지 비경구 용도만이 사용된다는 사실에도 불구하고 백신 효능을 개선시켰다. 점막 및 비경구 부위를 모두 gp85 및 gag 모두를 사용하여 백신접종하는 경우, 항원투여 9주후에 100% 보호가 이룩된다. 8마리의 상기 그룹의 고양이에서, 3마리는 2 내지 4주 사이에 일시적인 바이러스혈증을 나타낸 반면, 5마리는 절대 바이러스혈성으로 되지 않았다.

항체 스코어(데이타는 나타내지 않았음)는 gp70 분석을 이용한 경우 단지 적은수만이 양성을 나타낸 반면, 전 바이러스 분석을 이용한 경우 FHV△tkgp70 만으로 백신접종시킨 고양이들을 제외한 모든 동물들이 백신접종 후 혈청변환을 보임을 나타낸다.

[백신접종 키트]

본원에 개시된 바와같이, 백신의 이중 점막/비경구 투여에 대한 설명서 및 투여 백신을 포함한 키트가 안전하고 비용면에서 효율적인 백신 공급 수단으로서 제작될 수 있다. 백신접종 키트는 일회용 또는 수회 사용 바이알, 앰풀 또는 기타 적합한 용기중에 백신을 함유한다. 점막 투여를 위해서 배합된 백신은 상술한 바와같은 용기 중에 있거나 또는 분무된 형태로 있을 수 있다. 비경구용으로, 숙주 포유동물에게 적합한 유효 투여량을 함유하는 1회 용량 주사기는 투여를 용이하고 신속히 수행하는 수단의 일례이다. 한편, 상기 키트는 수회사용 바이알 또는 기타 적합한 용기중에 점막 및 비경구 백신을 함유할 수 있으며, 즉시 사용되거나, 또는 사용전에 혼합하거나 일부 추가의 제제를 필요로 할 수도 있다. 투여되는 포함된 백신(들) 및 그의 제형, 접종 순서 및 타이밍 뿐 아니라 사용자에게 관련된 추가의 인자들을 보다 충분하게 나타내는 설명서가 포함되어 있다.

예로서, 고양이를 위한 백신 접종 키트는 단일 투여량으로 각 콧구멍에 0.5ml 씩 투여되는 FHV△tkgp85 및 FHV△tkgag(2×10⁵pfu/백신) 함유 점막 제형 1ml을 함유할 수 있다. 비경구 제형은 근육내 투여를 위해 AcNPVgp85 및 AcNPVgag(2×10⁵pfu/백신) 1ml을 함유한다.

인간을 위한 상기 백신 접종 키트는 단일 투여량으로 각 콧구멍에 1ml씩 투여되는 아데노바이러스/인플루엔지 바이러스 재조합체 함유 점막 제형 2ml을 함유할 수 있다. 비경구 제형은 근육내 투여를 위해 불활성화된 인플루엔자 바이러스 1ml을 함유한다.

소를 위한 상기 백신접종 키트는 단일 투여량으로 각 콧구멍에 2.5ml씩 투여되는 소 헤르페스 타입I/소 바이러스성 설사 바이러스(BVDV)gp53 또는 소 호흡기 합포체 바이러스(BSRV)F/G 함유점막 제형 5ml을 함유할 수 있다. 비경구 제형은 근육내 투여를 위해 AcNPVgp53 또는 AcNPVF/G 5ml을 함유한다.

개를 위한 상기 백신 접종 키트는 단일 투여량으로 각 콧구멍에 0.5ml씩 투여되는 개 헤르페스 바이러스/개 파르보바이러스 재조합체 함유 점막 제형 1ml을 함유할 수 있다. 비경구 제형은 근육내 투여를 위해 바쿨로바이러스/파르보바이러스 재조합체 1ml을 함유한다.

돼지를 위한 상기 백신접종 키트는 단일 투여량으로 1ml씩 각 콧구멍에 투여되는 PRV△tk/전파성 위장염(TGE) 재조합체 함유 점막 제형 2ml을 함유할 수 있다. 비경구 제형은 근육내 투여를 위해서 바쿨로바이러스/TGE 재조합체 2ml을 함유한다.

Claims

(a) 바쿨로바이러스 발현된 FeLV gp85 단백질을 포함하는 투여량; 및 (b) FeLV gp85 유전자를 암호화하는 DNA를 발현하도록 조작된 재조합 고양이 헤르페스 바이러스(FHV)를 포함하는 투여량을 포함하는 다중 투여용 고양이 백혈병 바이러스(FeLV)백신.
(a) 바쿨로바이러스 발현된 FeLV gp85 및 gag 단백질을 포함하는 투여량; 및 (b) FeLV gp85 및 FeLV gag 유전자를 암호화하는 DNA를 발현하도록 조작된 재조합 FHV를 포함하는 투여량을 포함하는 다중 투여용 FeLV 백신.
(a) 바쿨로바이러스 발현된 FeLV gp85 및 gag 단백질을 포함하는 투여량; 및 (b) 바쿨로바이러스 발현된 FeLV gp85, gp70 및 gag 단백질을 포함하는 투여량을 포함하는 다중 투여용 FeLV 백신.
(a) 바쿨로바이러스 발현된 FeLV gp70 단백질을 포함하는 투여량; 및 (b) FeLV gp70 유전자를 암호화하는 DNA를 발현하도록 조작된 재조합 FHV를 포함하는 2개의 분리된 투여량을 포함하는 다중 투여용 FeLV 백신.
(a) 바쿨로바이러스 발현된 FeLV gp85 단백질을 포함하는 비경구 투여용 투여량; 및 (b) FeLV gp85 유전자를 암호화하는 DNA를 발현하도록 조작된 재조합 FHV를 포함하는 점막 투여용 투여량을 포함하는 다중 투여용 FeLV 백신 키트.
(a) 바쿨로바이러스 발현된 FeLV gp85 및 gag 단백질을 포함하는 비경구 투여용 투여량; 및 (b) FeLV gp85 및 gag 유전자를 암호화하는 DNA를 발현하도록 조작된 재조합 FHV를 포함하는 점막 투여용 투여량을 포함하는 다중 투여용 FeLV 백신 키트.
(a) 바쿨로바이러스 발현된 FeLV gp85 및 gag 단백질을 포함하는 비경구 투여용 투여량; 및 (b) 바쿨로바이러스 발현된 FeLV gp85 단백질, 바쿨로바이러스 발현된 FeLV gp70 단백질 및 바쿨로바이러스 발현된 FeLV gag 단백질을 포함하는 비경구 투여용 투여량을 포함하는 다중 투여용 FeLV 백신 키트.
(a) 바쿨로바이러스 발현된 FeLV gp70 단백질을 포함하는 비경구 투여용 투여량; 및 (b) FeLV gp70 유전자를 암호화하는 DNA를 발현하도록 조작된 재조합 FHV를 포함하는 점막 투여용의 2개의 분리된 투여량을 포함하는 다중 투여용 FeLV 백신 키트.
(a) 바쿨로바이러스 발현된 FeLV gp85 단백질의 투여량을 제공하는 단계; (b) FeLV gp85 유전자를 암호화하는 DNA를 발현하도록 조작된 재조합 FHV의 투여량을 제공하는 단계; 및 (c) 바쿨로바이러스 발현된 FeLV gp85 단백질의 투여량 및 재조합 FHV의 투여량을 고양이에게 투여하는 단계를 포함하는, 고양이에게 FeLV에 대한 면역성을 부여하는 방법.
제9항에 있어서, 투여 단계가, 고양이에게 재조합 FHV의 투여량을 투여한 후에 바쿨로바이러스 발현된 FeLV 단백질의 투여량을 투여함을 포함하는 방법.
제9항에 있어서, 고양이에게 재조합 FHV의 투여량을 점막 투여하고, 바쿨로바이러스 발현된 FeLV 단백질의 투여량을 비경구 투여하는 방법.
제9항에 있어서, 투여 단계가, 고양이에게 바쿨로바이러스 발현된 FeLV 단백질의 투여량을 투여한 후에 재조합 FHV의 투여량을 투여함을 포함하는 방법.
(a) 바쿨로바이러스 발현된 FeLV gp85 및 gag 단백질의 투여량을 제공하는 단계; (b) FeLV gp85 및 gag 유전자를 암호화하는 DNA를 발현하도록 조작된 재조합 FHV의 투여량을 제공하는 단계; 및 (c) 바쿨로바이러스 발현된 FeLV gp85 및 gag 단백질의 투여량 및 재조합 FHV의 투여량을 고양이에게 투여하는 단계를 포함하는, 고양이에게 FeLV에 대한 면역성을 부여하는 방법.
제13항에 있어서, 투여 단계가, 고양이에게 재조합 FHV의 투여량을 투여한 후에 바쿨로바이러스 발현된 FeLV 단백질의 투여량을 투여함을 포함하는 방법.
제13항에 있어서, 고양이에게 재조합 FHV의 투여량을 점막 투여하고, 바쿨로바이러스 발현된 FeLV 단백질의 투여량을 비경구 투여하는 방법.
제13항에 있어서, 투여 단계가, 고양이에게 바쿨로바이러스 발현된 FeLV 단백질의 투여량을 투여한 후에 재조합 FHV의 투여량을 투여함을 포함하는 방법.
(a) 바쿨로바이러스 발현된 FeLV gp85 및 gag 단백질의 제1투여량을 제공하는 단계; (b) 바쿨로바이러스 발현된 FeLV gp85, gp70 및 gag 단백질의 제2투여량을 제공하는 단계; 및 (c) 바쿨로바이러스 발현된 FeLV gp85 및 gag 단백질의 투여량 및 바쿨로바이러스 발현된 FeLV gp85, gp70 및 gag 단백질의 투여량을 고양이에게 투여하는 단계를 포함하는, 고양이에게 FeLV에 대한 면역성을 부여하는 방법.
제17항에 있어서, 투여 단계가, 고양이에게 바쿨로바이러스 발현된 FeLV 단백질의 제1투여량을 투여한 후에 바쿨로바이러스 발현된 FeLV 단백질의 제2투여량을 투여함을 포함하는 방법.
제17항에 있어서, 바쿨로바이러스 발현된 FeLV 단백질의 제1 및 제2투여량을 고양이에게 비경구 투여하는 방법.
제17항에 있어서, 투여 단계가, 고양이에게 바쿨로바이러스 발현된 FeLV 단백질의 제2투여량을 투여한후 바쿨로바이러스 발현된 FeLV 단백질의 제1투여량을 투여함을 포함하는 방법.
(a) 바쿨로바이러스 발현된 FeLV gp70 단백질의 투여량을 제공하는 단계; (b) FeLV gp70 유전자를 암호화하는 DNA를 발현하도록 조작된 재조합 FHV의 제1투여량을 제공하는 단계; (c) FeLV gp70 유전자를 암호화하는 DNA를 발현하도록 조작된 재조합 FHV의 제2투여량을 제공하는 단계; 및 (d) 바쿨로바이러스 발현된 FeLV gp70 단백질의 투여량 및 재조합 FHV의 제1 및 제2투여량을 고양이에게 투여하는 단계를 포함하는, 고양이에게 FeLV에 대한 면역성을 부여하는 방법.
제21항에 있어서, 투여 단계가, 고양이에게 재조합 FHV의 제1 및 제2투여량을 투여한후 바쿨로바이러스 발현된 FeLV 단백질의 투여량을 투여함을 포함하는 방법.
제21항에 있어서, 고양이에게 재조합 FHV의 제1 및 제2투여량을 점막 투여하고 바쿨로바이러스 발현된 FeLV 단백질의 투여량을 비경구 투여하는 방법.
제21항에 있어서, 투여 단계가, 고양이에게 바쿨로바이러스 발현된 FeLV 단백질의 투여량을 투여한후 재조합 FHV의 제1 및 제2투여량을 투여함을 포함하는 방법.
(a) 바쿨로바이러스 발현된 FeLV gp85 및 gag 단백질을 포함하는 제1투여량; 및 (b) 바쿨로바이러스 발현된 FeLV gp85 및 gag 단백질을 포함하는 제2투여량을 포함하는 다중 투여용 FeLV 백신.
(a) 바쿨로바이러스 발현된 FeLV gp85 및 gag 단백질을 포함하는 비경구 투여용 제1투여량; 및 (b) 바쿨로바이러스 발현된 FeLV gp85 단백질 및 바쿨로바이러스 발현된 FeLV gag 단백질을 포함하는 비경구 투여용 제2투여량을 포함하는 다중 투여용 FeLV 백신 키트.
(a) 바쿨로바이러스 발현된 FeLV gp85 및 gag 단백질의 제1투여량을 제공하는 단계; (b) 바쿨로바이러스 발현된 FeLV gp85 및 gag 단백질의 제2투여량을 제공하는 단계; 및 (c) 바쿨로바이러스 발현된 FeLV gp85 및 gag 단백질의 제1투여량 및 바쿨로바이러스 발현된 FeLV gp85 및 gag 단백질의 제2투여량을 고양이에게 투여함을 포함하는, 고양이에게 FeLV에 대한 면역성을 부여하는 방법.
제27항에 있어서, 바쿨로바이러스 발현된 FeLV 단백질의 제1 및 제2투여량을 고양이에게 비경구 투여하는 방법.