JPS63207397A - 組換えバキュロウイルスに感染した昆虫細胞においてヒト免疫不全ウイルスのエンベロープ遺伝子から誘導されたポリペプチド - Google Patents
組換えバキュロウイルスに感染した昆虫細胞においてヒト免疫不全ウイルスのエンベロープ遺伝子から誘導されたポリペプチドInfo
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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-
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- C12N2830/60—Vector systems having a special element relevant for transcription from viruses
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明の一つの実施例においてはバキュロウィルス、オ
ートグラファカリフォルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ
ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）核ポリヘドロシスウィルス（
ＡｃＭＮＰＶ）が用いられた。表現のために用いられた
プロモーター配列はこのウィルスから誘導されたポリヘ
ドリン（ｏｃｃ）遺伝子のものである。ＡｃＭＮＰＶと
組換えウィルスストックはスポドプテラフルギペルダ（
Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）、秋あ
わよとう、細胞中に維持された。該組換え体は組換えウ
ィルスｏｃｃ−を与えるＰｎ遺伝子が削除されるように
して組立てられた。これはプラーク形態学によって組換
えウィルスの容易な同定を簡単にする。
ートグラファカリフォルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ
ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）核ポリヘドロシスウィルス（
ＡｃＭＮＰＶ）が用いられた。表現のために用いられた
プロモーター配列はこのウィルスから誘導されたポリヘ
ドリン（ｏｃｃ）遺伝子のものである。ＡｃＭＮＰＶと
組換えウィルスストックはスポドプテラフルギペルダ（
Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）、秋あ
わよとう、細胞中に維持された。該組換え体は組換えウ
ィルスｏｃｃ−を与えるＰｎ遺伝子が削除されるように
して組立てられた。これはプラーク形態学によって組換
えウィルスの容易な同定を簡単にする。
一たん単離されたら組換えバキュロウィルスは培養され
た系列または全昆虫の一部分として維持されるいかなる
許されたもしくは半分許された細胞集合体を感染するた
めに用いられることが出来る。
た系列または全昆虫の一部分として維持されるいかなる
許されたもしくは半分許された細胞集合体を感染するた
めに用いられることが出来る。
挿入ベクトルの組立て
バキュロウィルスベクトル中の外部蛋白質をコードして
いる配列のクローン化と表現は、該コードしている配列
がポリヘドリンプロモーターおよび上流の配列と共に整
列され、そして他の他の側では該配列をコードしている
先端を切断されたポリヘドリンと共に整列されているの
で、バキュロウィルスゲノームでの相同組換えがポリヘ
ドリンプロモーターおよび不活性ポリヘドリン遺伝子と
共に整列されている外部コード配列の転移を結果として
生ずる。
いる配列のクローン化と表現は、該コードしている配列
がポリヘドリンプロモーターおよび上流の配列と共に整
列され、そして他の他の側では該配列をコードしている
先端を切断されたポリヘドリンと共に整列されているの
で、バキュロウィルスゲノームでの相同組換えがポリヘ
ドリンプロモーターおよび不活性ポリヘドリン遺伝子と
共に整列されている外部コード配列の転移を結果として
生ずる。
したがって挿入ベクトルの変種はＡＩＤＳｅｎｖ遺伝子
組立てにおいての使用のためにデザインされた。下記す
る各々の挿入ベクトルはＡＴＧ翻訳開始コードンを供給
するためにデザインされた。外部配列をこれらベクトル
の中へ挿入することは開始コードンによって設立された
翻訳機構が外部配列を通して 正確に維持されるように設計されねばならない。
組立てにおいての使用のためにデザインされた。下記す
る各々の挿入ベクトルはＡＴＧ翻訳開始コードンを供給
するためにデザインされた。外部配列をこれらベクトル
の中へ挿入することは開始コードンによって設立された
翻訳機構が外部配列を通して 正確に維持されるように設計されねばならない。
本発明の実施の詳細は付随する図を
参照しながら以下に記載される。
第１図はＬＡＶ‐１ａ単離物の全長エンベロープ遺伝子
のヌクレオチド配列を示すものである。
のヌクレオチド配列を示すものである。
該ヌクレオチド配列は予期されるアミノ酸配列と共に示
される。配列情報はＧＥＮＢＡＮＫから得られた。ヌク
レオチドの番号付けは推定されたＡＴＧ開始コードンの
第１番ヌクレオチドから行われる。アミノ酸はＡＴＧ開
始コードンから番号付けされる。シグナルペプチド細胞
外糖蛋白質（ｇｐ１２０）に該当する領域および膜間糖
蛋白質（ｇｐ４１）は指名されたペプチド開裂位置とア
スパラギンが接続されたグリコシル化位置と共に示され
る。関連する制限酵素位置はヌクレオチド配列以下にリ
ストされる。
される。配列情報はＧＥＮＢＡＮＫから得られた。ヌク
レオチドの番号付けは推定されたＡＴＧ開始コードンの
第１番ヌクレオチドから行われる。アミノ酸はＡＴＧ開
始コードンから番号付けされる。シグナルペプチド細胞
外糖蛋白質（ｇｐ１２０）に該当する領域および膜間糖
蛋白質（ｇｐ４１）は指名されたペプチド開裂位置とア
スパラギンが接続されたグリコシル化位置と共に示され
る。関連する制限酵素位置はヌクレオチド配列以下にリ
ストされる。
第２図は組換えプラスミドｐ１６１４とｐ１７７４の構
造を示す第２Ａ図および第２Ｂ図を含む。
造を示す第２Ａ図および第２Ｂ図を含む。
プラスミドｐ１７７４はＬＡＶｅｎｖ遺伝子の完全にコ
ードした配列を含む。該プラスミドは二つのステージに
おいて組立てられた。
ードした配列を含む。該プラスミドは二つのステージに
おいて組立てられた。
（ａ）ＬＡＶｅｎｖ遺伝子の２６８６ｂｐＫｐｎｌ切片
はｐ１６１４から単離されそしてｐＵＣ１８のＳｍａＩ
位置がｅｎｖ遺伝子配列から上流にあるようにＫｐｎＩ
位置ｐＵＣ１８の中にクローン化された。
はｐ１６１４から単離されそしてｐＵＣ１８のＳｍａＩ
位置がｅｎｖ遺伝子配列から上流にあるようにＫｐｎＩ
位置ｐＵＣ１８の中にクローン化された。
（ｂ）１２１ｂｐ合成オリゴマーはＳｍａＩ位置にブラ
ントエンド結び付けをされう。矢印はコードしている配
列の極性を示す。関連した制限エンドヌクレアーゼ位置
が示される。本発明のために調整される合成オリゴマー
のヌクレオチド配列はファルマシア遺伝子アッセンブラ
ー上に組立てられそしてポリヘドリン遺伝子の適当なコ
ードン使用法を用いてＬＡＶの領域の予期されたアミノ
酸配列に基づく。
ントエンド結び付けをされう。矢印はコードしている配
列の極性を示す。関連した制限エンドヌクレアーゼ位置
が示される。本発明のために調整される合成オリゴマー
のヌクレオチド配列はファルマシア遺伝子アッセンブラ
ー上に組立てられそしてポリヘドリン遺伝子の適当なコ
ードン使用法を用いてＬＡＶの領域の予期されたアミノ
酸配列に基づく。
第３Ａ図、第３Ｂ図、および第３Ｃ図を含む第３図は挿
入ベクトルの構造を示す。
入ベクトルの構造を示す。
挿入ベクトルＭＧＳ‐３，ＭＧＳ‐３＋２，ＭＧＳ‐４
およびＭＧＳ‐５は関連した制限エンドヌクレアーゼ位
置とヌクレオチド配列によって示される。プロモーター
配列の極性は左から右である。
およびＭＧＳ‐５は関連した制限エンドヌクレアーゼ位
置とヌクレオチド配列によって示される。プロモーター
配列の極性は左から右である。
第４図はチョウ（Ｃｈｏｗ）とファストマン（Ｆａｓｔ
ｍａｎ）のプログラム１９７４、バイオケミストリィ１
３，２２２を用いたコンピューター分析から得られたプ
レカーサーｇｐ１６０の第２次構造と親水度パターンを
示す。
ｍａｎ）のプログラム１９７４、バイオケミストリィ１
３，２２２を用いたコンピューター分析から得られたプ
レカーサーｇｐ１６０の第２次構造と親水度パターンを
示す。
第５図は組換えベクトルの組立てのためのアプローチを
示す。ここに示されるプラスミドは第１表および第２表
に記載される構造物に相当する文字（即ちＡ）を記述し
ているかまたは示している。
示す。ここに示されるプラスミドは第１表および第２表
に記載される構造物に相当する文字（即ちＡ）を記述し
ているかまたは示している。
挿入ベクトルＭＧＳ‐１はプラーク精製されたＡｃＭＮ
ＰＶ単離物から単離されたＤＮＡのＥｃｏＲＩ‐Ｉ制限
切片クローンから組立てられた。
ＰＶ単離物から単離されたＤＮＡのＥｃｏＲＩ‐Ｉ制限
切片クローンから組立てられた。
挿入ベクトルＭＧＳ‐１は下記の構造的特徴からなる（
第３図参照）。
第３図参照）。
ポリヘドリン遺伝子のＡＴＧ開始コードンから上流の配
列の４０００ｂｐ。
列の４０００ｂｐ。
突然変異を指示する位置および制限
位置ＳｍａＩとＫｐｎＩとによって導びかれるポリリン
カー該突然変異を指示する位置はＡＴＧ開始コードンか
らなる。
カー該突然変異を指示する位置はＡＴＧ開始コードンか
らなる。
ＥｃｏＲＩ‐Ｉクローンの終端ＥｃｏＲＩ制限位置へ直
通するＫｐｎＩ制限位置（該位置はポリヘドリン遺伝子
の内部にある）から延びている配列の１７００ｂｐ。
通するＫｐｎＩ制限位置（該位置はポリヘドリン遺伝子
の内部にある）から延びている配列の１７００ｂｐ。
挿入ベクトルＭＧＳ‐３はポリリンカーが制限位置Ｓｍ
ａＩ，ＫｐｎＩ，ＢｇｌＩＩおよび万能停止コードンセ
ブメントからなることを除いてはＭＧＳ‐３と同一であ
る。
ａＩ，ＫｐｎＩ，ＢｇｌＩＩおよび万能停止コードンセ
ブメントからなることを除いてはＭＧＳ‐３と同一であ
る。
挿入ベクトルＭＧＳ‐３＋２はＭＧＳ‐３の＋３位置の
二つの更なるシトシン残基を含み、そしてＭＧＳ‐３の
＋４位置に一つのより小さいグアノシン残基を有するこ
とを除いてはＭＧＳ‐３と同一である。終りの結果はコ
ードン機構がＭＧＳ‐３と関連している一つのヌクレオ
チドによってシフトされると云うことである。
二つの更なるシトシン残基を含み、そしてＭＧＳ‐３の
＋４位置に一つのより小さいグアノシン残基を有するこ
とを除いてはＭＧＳ‐３と同一である。終りの結果はコ
ードン機構がＭＧＳ‐３と関連している一つのヌクレオ
チドによってシフトされると云うことである。
挿入ベクトルＭＧＳ‐４はポリヘドリン遺伝子のＮ‐終
端部分の最初の１０個のアミノ酸に対するコードを有し
ＳｍａＩ，ＫｐｎＩ，ＢＧｌＩＩに対する制限位置が次
に続く配列と万能停止コードン切片とを含む 合成ポリリンカーによって組立てられることを除いては
ＭＧＳ‐３に対しては記述されていると同様な構造的デ
ザインを含む。このベクトルはもしポリヘドリン遺伝子
のＮ‐終端末端の最初の１４個のアミノ酸コードンが外
部遺伝子のＮ‐終端末端に融合されているとすれば表現
の増大したレベルが得られることが出来ると云う観察（
スミス（Ｓｍｉｔｈ）等、１９８３年）に基づいて組立
てられた。
端部分の最初の１０個のアミノ酸に対するコードを有し
ＳｍａＩ，ＫｐｎＩ，ＢＧｌＩＩに対する制限位置が次
に続く配列と万能停止コードン切片とを含む 合成ポリリンカーによって組立てられることを除いては
ＭＧＳ‐３に対しては記述されていると同様な構造的デ
ザインを含む。このベクトルはもしポリヘドリン遺伝子
のＮ‐終端末端の最初の１４個のアミノ酸コードンが外
部遺伝子のＮ‐終端末端に融合されているとすれば表現
の増大したレベルが得られることが出来ると云う観察（
スミス（Ｓｍｉｔｈ）等、１９８３年）に基づいて組立
てられた。
挿入ベクトルＭＧＳ‐５はＩＬ‐２の開裂可能なシグナ
ルペプチドに対するコードを有し、ＥｃｏＲＩ，Ｋｐｎ
ＩＩＩに対する制限位置が次に続く配列と、万能停止コ
ードンセグメントとを含む合成ポリリンカーによって組
立てられることを除いてＭＧＳ‐３に対して記述される
と同様な構造デザインを含む。このベクトは昆虫細胞中
に現に認められそして移されていると示されているペプ
チドシグナル配列と共に内部ＨＩＶｅｎｖ配列と供給す
ることが知られている（スミス（Ｓｍｉｔｈ）等、１９
８５年）。
ルペプチドに対するコードを有し、ＥｃｏＲＩ，Ｋｐｎ
ＩＩＩに対する制限位置が次に続く配列と、万能停止コ
ードンセグメントとを含む合成ポリリンカーによって組
立てられることを除いてＭＧＳ‐３に対して記述される
と同様な構造デザインを含む。このベクトは昆虫細胞中
に現に認められそして移されていると示されているペプ
チドシグナル配列と共に内部ＨＩＶｅｎｖ配列と供給す
ることが知られている（スミス（Ｓｍｉｔｈ）等、１９
８５年）。
ＬＡＶのコードを内部に有する配列を支持しているバキ
ュロウィルス組換え体の組立てｐＵＣ１８の中に挿入さ
れている完全ＡＩＤＳプロウィルスの２１．８ｋｂセグ
メントからなるＮＡ‐２と呼ばれる組換えプラスミドが
用いられた。
ュロウィルス組換え体の組立てｐＵＣ１８の中に挿入さ
れている完全ＡＩＤＳプロウィルスの２１．８ｋｂセグ
メントからなるＮＡ‐２と呼ばれる組換えプラスミドが
用いられた。
このクローンはある種のヒト細胞の移転感染をもたらす
ウィルスを生産することが出来るので伝えられるところ
によれば伝染性である。
ウィルスを生産することが出来るので伝えられるところ
によれば伝染性である。
ＮＡ‐２を含む完全エンベロープ遺伝子配列はＨＩＶの
ＬＡＶ種族から誘導された（バーレ‐シノウッシ（Ｂａ
ｒｒｅ‐Ｓｉｎｏｕｓｓｉ）等、１９８３年）。
ＬＡＶ種族から誘導された（バーレ‐シノウッシ（Ｂａ
ｒｒｅ‐Ｓｉｎｏｕｓｓｉ）等、１９８３年）。
ＬＡＶのエンベロープ遺伝子はｍｅｔコードンにより開
始する８６１番のアミノ酸に対するコードを有するオー
プン読み取り機構を含む（ウェイン‐ホブソン（Ｗａｉ
ｎ‐Ｈｏｂｓｏｎ）等、１９８５年）。
始する８６１番のアミノ酸に対するコードを有するオー
プン読み取り機構を含む（ウェイン‐ホブソン（Ｗａｉ
ｎ‐Ｈｏｂｓｏｎ）等、１９８５年）。
ＨＴＬＡ‐ＩＩＩ ＢＨＩＯ種族は８５６番コードンを
含む（須田立地（Ｓｔａｒｉｃｈ）等、１９８６年）。
含む（須田立地（Ｓｔａｒｉｃｈ）等、１９８６年）。
シグナルペプチド配列は３０番のアミノ酸からなる（そ
のうちの２個はＢＨＩＯとは異なる）。
のうちの２個はＢＨＩＯとは異なる）。
細胞外部分は４８６番のアミノ酸からなる（そのうちの
１４個はＢＨＩＯとは異なる）。
１４個はＢＨＩＯとは異なる）。
そして膜間領域は３４５番のアミノ酸からなる（そのう
ちの５個はＢＨＩＯとは異なる）。
ちの５個はＢＨＩＯとは異なる）。
第１図はヌクレオチドとこれらの研究において用いられ
たＬＡＶｅｎｖ遺伝子の推論されたアミノ酸配列とを示
す。アミノ酸残基は推定される開始ｍｅｔコードンを始
めとして番号付けされる。ここに参照されるアミノ酸残
基は第１図に示される番号と一致する。
たＬＡＶｅｎｖ遺伝子の推論されたアミノ酸配列とを示
す。アミノ酸残基は推定される開始ｍｅｔコードンを始
めとして番号付けされる。ここに参照されるアミノ酸残
基は第１図に示される番号と一致する。
完全ｇｐ１６０ポリペプチドに加えてＨＩＶ‐ｅｎｖ遺
伝子の領域の変種を表現することが決定された。この決
定は蛋白質構造を含むいくつかのファクターに基づきそ
してＡＩＤＳレトロウィルス単離物の異種と報告されて
いる（ベン（Ｂｅｎｎ）等、１９８５年、ハーン（Ｈａ
ｈｎ）等、１９８５年）。
伝子の領域の変種を表現することが決定された。この決
定は蛋白質構造を含むいくつかのファクターに基づきそ
してＡＩＤＳレトロウィルス単離物の異種と報告されて
いる（ベン（Ｂｅｎｎ）等、１９８５年、ハーン（Ｈａ
ｈｎ）等、１９８５年）。
親水度に対する値によって付加された蛋白質の第二次構
造を予言するコンピュータープログラムが用いられた。
造を予言するコンピュータープログラムが用いられた。
第４図に示されている分析はベーター転回を含む幾つか
の親水性領域を現わした。このような領域は抗原エピト
ープおよび構造物的位置付けと連係されていることが示
されている（ウェストホッフ（Ｗｅｓｔｈｏｆｆ）等、
１９８４年）。これらの結果と適切な制限位置の存在と
に基づいて、第４図に示されるエンベロープ蛋白質のＣ
‐終端切除型の品種を表現することが決定された。この
ような組立ての利点はＣ‐終端親水性領域で 始まる斬新的な削除が得られると云うことである。加う
るに、ｇｐ４１をコードする配列によって測定される領
域を表現することが決定された。少なくとも２個の免疫
優性エピトープが表現されるべき領域の中に含まれる。
の親水性領域を現わした。このような領域は抗原エピト
ープおよび構造物的位置付けと連係されていることが示
されている（ウェストホッフ（Ｗｅｓｔｈｏｆｆ）等、
１９８４年）。これらの結果と適切な制限位置の存在と
に基づいて、第４図に示されるエンベロープ蛋白質のＣ
‐終端切除型の品種を表現することが決定された。この
ような組立ての利点はＣ‐終端親水性領域で 始まる斬新的な削除が得られると云うことである。加う
るに、ｇｐ４１をコードする配列によって測定される領
域を表現することが決定された。少なくとも２個の免疫
優性エピトープが表現されるべき領域の中に含まれる。
これらの組立てに対して、ＩＬ‐２に対する開裂可能な
シグナルを含むベクトルがデザインされた。ＩＬ‐２シ
グナルペプチドが感染された細胞において組換えバキュ
ロウィルスゲノームから表現されるのであるが、正しい
細胞の処理を行なうＩＬ‐２の結合と結果と して生ずることが最近示されている （スミス（Ｓｍｉｔｈ）等、１９８５年）。
シグナルを含むベクトルがデザインされた。ＩＬ‐２シ
グナルペプチドが感染された細胞において組換えバキュ
ロウィルスゲノームから表現されるのであるが、正しい
細胞の処理を行なうＩＬ‐２の結合と結果と して生ずることが最近示されている （スミス（Ｓｍｉｔｈ）等、１９８５年）。
ＨＩＶ‐ｅｎｖ配列の表現に対して工夫されたクローン
化戦略は第５図に示される。
化戦略は第５図に示される。
エンベロープ遺伝子は最初に３８４６ｂｐＥｃｏＲＩ／
ＳａｃＩ制限切片としてＮＡ‐２から単離されそしてｐ
ＵＣ１９のＥｃｏＲＩ／ＳａｃＩ制限位置の中へクロー
ン化された。
ＳａｃＩ制限切片としてＮＡ‐２から単離されそしてｐ
ＵＣ１９のＥｃｏＲＩ／ＳａｃＩ制限位置の中へクロー
ン化された。
その結果得られたプラスミドはｐ７０８として命名され
た。該エンベロープ遺伝子は続いて２８００ｂｐＫｐｎ
Ｉ制限切片として再単離されそしてｐＵＣ１８のＫｐｎ
Ｉ制限位置の中へクローン化された。その結果得られた
クローンはｐ１６１４と命名された（第２Ａ図参照）。
た。該エンベロープ遺伝子は続いて２８００ｂｐＫｐｎ
Ｉ制限切片として再単離されそしてｐＵＣ１８のＫｐｎ
Ｉ制限位置の中へクローン化された。その結果得られた
クローンはｐ１６１４と命名された（第２Ａ図参照）。
このＫｐｎＩ制限切片は若干切除されているエンベロー
プ遺伝子の断片を含んでいるので、配列に相当するＮ‐
終端の１２１ｂｐが落脱している。この遺伝子における
脱落部分はシグナルペプチド配列を含んでいるのである
が、適当なポリヘドリン遺伝子コードンしよう法を用い
てＬＡＶアミノ酸配列からデザインされる二重らせん構
造を有する合成オリゴマーの挿入によって置換された。
プ遺伝子の断片を含んでいるので、配列に相当するＮ‐
終端の１２１ｂｐが落脱している。この遺伝子における
脱落部分はシグナルペプチド配列を含んでいるのである
が、適当なポリヘドリン遺伝子コードンしよう法を用い
てＬＡＶアミノ酸配列からデザインされる二重らせん構
造を有する合成オリゴマーの挿入によって置換された。
更なる操作を容易にするために、新らしいＳｍａＩ制限
配列がＡＴＧ開始コードンの代りに付随的に導入された
。該ＡＴＧ開始コードンは挿入ベクトルによって供給さ
れるであろう。結果として得られたプラスミドはｐ１７
７４として命名され第２Ｂ図に示されている。
配列がＡＴＧ開始コードンの代りに付随的に導入された
。該ＡＴＧ開始コードンは挿入ベクトルによって供給さ
れるであろう。結果として得られたプラスミドはｐ１７
７４として命名され第２Ｂ図に示されている。
ＡＩＤＳエンベロープの種々な領域のコードン配列を含
んでいるｐ１７７４からの制限切片はＭＧＳベクトルの
中へクローン化されるので、挿入ベクトルのＡＴＧ開始
コードンはエンベロープ遺伝子のコードンと共に同一の
機構の中にある。下記の組立てがなされた（第５図参照
）。
んでいるｐ１７７４からの制限切片はＭＧＳベクトルの
中へクローン化されるので、挿入ベクトルのＡＴＧ開始
コードンはエンベロープ遺伝子のコードンと共に同一の
機構の中にある。下記の組立てがなされた（第５図参照
）。
Ａ．ＳｍａＩ／部分的ＫｐｎＩ分解切片としてＭＧＳ‐
３の中へそのＳｍａＩ位置でクローン化されたｇｐ１６
０の全長。このクローンはｇｐ１６０のコードを有する
配列のすべてを含み、その真正の翻訳終端コードンを用
いる。
３の中へそのＳｍａＩ位置でクローン化されたｇｐ１６
０の全長。このクローンはｇｐ１６０のコードを有する
配列のすべてを含み、その真正の翻訳終端コードンを用
いる。
Ａ１．ＳｍａＩ／部分的ＫｐｎＩ分解切片としてＭＧＳ
‐４の中へそのＳｍａＩ／ＫｐｎＩ位置でクローン化さ
れたｇｐ１６０の全長、このクローンはｇｐ１６０のコ
ードを有する配列の総てを含んでおり、その真正な翻訳
終端コードンを用いる。
‐４の中へそのＳｍａＩ／ＫｐｎＩ位置でクローン化さ
れたｇｐ１６０の全長、このクローンはｇｐ１６０のコ
ードを有する配列の総てを含んでおり、その真正な翻訳
終端コードンを用いる。
Ｂ．ＳｍａＩ／ＢａｍＨＩ制限切片としてＭＧＳ‐３の
ＳｍａＩ／ＢｇｌＩＩ制限位置の中へクローン化された
切除ｇｐ１６０。このクローンはｇｐ１６０のアミノ酸
１番から７５７番までに対するコードを有する配列を含
みそしてＭＧＳ‐３ベクトルによって供給される終端コ
ードンを用いる。
ＳｍａＩ／ＢｇｌＩＩ制限位置の中へクローン化された
切除ｇｐ１６０。このクローンはｇｐ１６０のアミノ酸
１番から７５７番までに対するコードを有する配列を含
みそしてＭＧＳ‐３ベクトルによって供給される終端コ
ードンを用いる。
Ｂ１．ＭＧＳ‐４のＳｍａＩ／ＢｇｌＩＩ制限位置にお
けるＳｍａＩ／ＢａｍＨＩ制限切片としての切除ｇｐ１
６０、このクローンはｇｐ１６０のアミノ酸１番から７
５７番までに対するコードを有する配列を含み、そして
ＭＧＳ‐４ベクトルによって供給される終端コードンを
用いる。
けるＳｍａＩ／ＢａｍＨＩ制限切片としての切除ｇｐ１
６０、このクローンはｇｐ１６０のアミノ酸１番から７
５７番までに対するコードを有する配列を含み、そして
ＭＧＳ‐４ベクトルによって供給される終端コードンを
用いる。
Ｃ．ＳｍａＩ／ＨｉｎｄＩＩＩの中に充填される制限切
片としてＭＧＳ‐３のＳｍａＩ位置の中にクローン化さ
れた切除ｇｐ１６０。このクローンはｇｐ１６０のアミ
ノ酸の１番から６４５番までに対するコードを有する配
列を含み、そしてＭＧＳ‐３ベクトルによって供給され
る終端コードンを用いる。
片としてＭＧＳ‐３のＳｍａＩ位置の中にクローン化さ
れた切除ｇｐ１６０。このクローンはｇｐ１６０のアミ
ノ酸の１番から６４５番までに対するコードを有する配
列を含み、そしてＭＧＳ‐３ベクトルによって供給され
る終端コードンを用いる。
Ｄ．合成ＤＮＡリンカーがＢｇｌＩＩ位置に添加せられ
てｇｐ１２０のＢｇｌＩＩ位置（アミノ酸４７２番コー
ドンで）から最後のＣ‐終端コードンまでの配列の中へ
充填せられるＳｍａＩ／部分的ＢｇｌＩＩＩ制限切片と
してクローン化せられたｇｐ１２０の全長。このクロー
ンは完全ｇｐ１２０をコードしている配列を表現するア
ミノ酸１番から５１６番までの配列を含む。翻訳終端は
ＭＧＳ‐３ベクトルによって供給されるＴＡＡにある。
てｇｐ１２０のＢｇｌＩＩ位置（アミノ酸４７２番コー
ドンで）から最後のＣ‐終端コードンまでの配列の中へ
充填せられるＳｍａＩ／部分的ＢｇｌＩＩＩ制限切片と
してクローン化せられたｇｐ１２０の全長。このクロー
ンは完全ｇｐ１２０をコードしている配列を表現するア
ミノ酸１番から５１６番までの配列を含む。翻訳終端は
ＭＧＳ‐３ベクトルによって供給されるＴＡＡにある。
Ｅ．ＳｍａｌＩ／部分的ＢｇｌＩＩＩ制限切片としてＭ
ＧＳ‐３のＳｍａＩ／ＢｇｌＩＩ制限位置の中へクロー
ン化された切除ｇｐ１２０． Ｆ．ＳｍａＩ／ＢｇｌＩＩＩ制限切片としてＭＧＳ‐３
のＳｍａＩ／ＢｇｌＩＩ位置にクローン化された切除ｇ
ｐ１２０。このクローンはアミノ酸１番から２７９番ま
でに対するコードを有する配列を含み、そしてＭＧＳ‐
３ベクトルによって供給される愁嘆コードを用いる。
ＧＳ‐３のＳｍａＩ／ＢｇｌＩＩ制限位置の中へクロー
ン化された切除ｇｐ１２０． Ｆ．ＳｍａＩ／ＢｇｌＩＩＩ制限切片としてＭＧＳ‐３
のＳｍａＩ／ＢｇｌＩＩ位置にクローン化された切除ｇ
ｐ１２０。このクローンはアミノ酸１番から２７９番ま
でに対するコードを有する配列を含み、そしてＭＧＳ‐
３ベクトルによって供給される愁嘆コードを用いる。
Ｇ．ＳｍａＩ／ＤｒａＩ制限切片としてＭＧＳ‐３のＳ
ｍａＩ位置の中へクローン化された切除ｇｐ１２０。こ
のクローンはアミノ酸１番から１２９番に対するコード
を有する配列を含み、そしてＭＧＳ‐３ベクトルによっ
て供給される終端コードンを用いる。
ｍａＩ位置の中へクローン化された切除ｇｐ１２０。こ
のクローンはアミノ酸１番から１２９番に対するコード
を有する配列を含み、そしてＭＧＳ‐３ベクトルによっ
て供給される終端コードンを用いる。
Ｈ．ＨＢｓＡｇに対するコードを有する配列がＢａｍＨ
Ｉ切片としてベクトル上の下流に位置するＢｇｌＩＩ位
置に導入される上記ＳｍａＩ／ＤｒａＩ構成物。このク
ローンはＨＢｓＡｇに対するコードを有する同一機構中
の配列が後に続くｇｐ１２０の最初から１２０番目まで
の終端アミノ酸に対するコードを有する配列を含む。
Ｉ切片としてベクトル上の下流に位置するＢｇｌＩＩ位
置に導入される上記ＳｍａＩ／ＤｒａＩ構成物。このク
ローンはＨＢｓＡｇに対するコードを有する同一機構中
の配列が後に続くｇｐ１２０の最初から１２０番目まで
の終端アミノ酸に対するコードを有する配列を含む。
Ｉ．ＭＧＳ‐３のＢｇｌＩＩ位置の中へＢｇｌＩＩ制限
切片としてクローン化されたｇｐ４１。
切片としてクローン化されたｇｐ４１。
このクローンはｇｐ１６０のＣ‐終端末端からアミノ酸
４７２番までに対するコードを有する配列を含む。
４７２番までに対するコードを有する配列を含む。
Ｊ．ｐ３１５６から単離されそして削減されたＥｒｏＲ
Ｉ位置とＫｐｎＩ位置でＭＧＳ‐５ベクトルの中へＳｍ
ａＩ／ＫｐｎＩ切片としてクローン化されたｇｐ４１。
Ｉ位置とＫｐｎＩ位置でＭＧＳ‐５ベクトルの中へＳｍ
ａＩ／ＫｐｎＩ切片としてクローン化されたｇｐ４１。
このクローンはｇｐ１６０のＣ‐終端末端からアミノ酸
４７３番までに対するコードを有する配列に融合される
ＩＬ‐２のシグナルペプチドに対するコードを有する配
列を含む。
４７３番までに対するコードを有する配列に融合される
ＩＬ‐２のシグナルペプチドに対するコードを有する配
列を含む。
Ｋ．ＭＧＳ‐３のＢｇｌＩＩ位置の中へＢｇｌＩＩ／Ｂ
ａｍＨＩ切片としてクローン化された切除ｇｐ４１。こ
のクローンはｇｐ１６０のアミノ酸４７２番から７５７
番までに対するコードを含み、そしてＭＧＳベクトルに
よって供給せられる終端コードンを用いる。
ａｍＨＩ切片としてクローン化された切除ｇｐ４１。こ
のクローンはｇｐ１６０のアミノ酸４７２番から７５７
番までに対するコードを含み、そしてＭＧＳベクトルに
よって供給せられる終端コードンを用いる。
Ｌ．ｐ３１６６から単離されｐＭＧＳ‐５のＫｐｎＩ／
ＢａｍＨＩ位置の中へＫｐｎＩ／ＢａｍＨＩ切片として
クローン化された切除ｇｐ４１。このクローンはｇｐ１
６０のアミノ酸４７２番から７５７番までに対するコー
ドを有する配列に融合されたＩＬ／２のシグナルポリペ
プチドに対するコードを有する配列を含む。
ＢａｍＨＩ位置の中へＫｐｎＩ／ＢａｍＨＩ切片として
クローン化された切除ｇｐ４１。このクローンはｇｐ１
６０のアミノ酸４７２番から７５７番までに対するコー
ドを有する配列に融合されたＩＬ／２のシグナルポリペ
プチドに対するコードを有する配列を含む。
組み換えバキュロウィルスの調整と選択ＨＩＶ ｅｎｖ
‐遺伝子 組み換えプラスミドは、ＡｃＭＮＰＶで、燐
酸カルシウムを沈殿させられ、非感染Ｓｐｏｄｏｐｔｅ
ｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ の細胞に添加された。
その際、キメラの遺伝子は、同一源の組み換えにより、
ＡｃＭＮＰＶゲノムの中へ挿入された。 組み換えウィ
ルスは、ｏｃｃ−プラクの影響により、正体を鑑定した
。
‐遺伝子 組み換えプラスミドは、ＡｃＭＮＰＶで、燐
酸カルシウムを沈殿させられ、非感染Ｓｐｏｄｏｐｔｅ
ｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ の細胞に添加された。
その際、キメラの遺伝子は、同一源の組み換えにより、
ＡｃＭＮＰＶゲノムの中へ挿入された。 組み換えウィ
ルスは、ｏｃｃ−プラクの影響により、正体を鑑定した
。
この様なプラクは、同一と見做し得る細胞素性上の効果
を示すが、核の噛み合いを全く示さない。 組み換えウ
ィルスを得る為に、引続き就かして、プラクの精製を実
施した。
を示すが、核の噛み合いを全く示さない。 組み換えウ
ィルスを得る為に、引続き就かして、プラクの精製を実
施した。
野生型のウィルスのＤＮＡと、それらの制限特性と雑種
形成特性とを比較する事によって、組み換えウィルスの
ＤＮＡを解析して、ＨＩＶ ｅｎｖ の規則的連鎖の
指定の場所に挿入された事を確かめた。
形成特性とを比較する事によって、組み換えウィルスの
ＤＮＡを解析して、ＨＩＶ ｅｎｖ の規則的連鎖の
指定の場所に挿入された事を確かめた。
感染した昆虫の細胞に於いて、組み換えバキュロウィル
スにより生じる ＨＩＶ ｅｎｖの発現 昆虫の細胞に於て、組み換えウィルスにより生じる Ｈ
ＩＶ ｅｎｖ の規則的連鎖が発現したという事は、プ
レプロ蛋白質の形で第一次遺伝情報翻訳物質が合成され
て、且つ、この翻訳物質が含んでいるあらゆるアミノ酸
は、ポリヘドリンプロモーターによって、発現ベクトル
のＡＴＧ開始コドンから下流の方へと、遺伝暗号が指定
されて合成されている という事になるべきである。
この第一次生成物は、組み換えベクトルによって供給さ
れたコドンから翻訳されたアミノ酸 で構成されている
であろう。 例えば、構成Ａの第一次翻訳物質は、端末
Ｎに於ては、Ｍｅｔ‐Ｐｒｏ‐Ｇｌｙ‐Ａｒｇ‐Ｖａｌ
と表現されるべきである。 そのＭｅｔ‐Ｐｒｏ‐Ｇ
ｌｙコドンは、■■■の結果として供給される。
スにより生じる ＨＩＶ ｅｎｖの発現 昆虫の細胞に於て、組み換えウィルスにより生じる Ｈ
ＩＶ ｅｎｖ の規則的連鎖が発現したという事は、プ
レプロ蛋白質の形で第一次遺伝情報翻訳物質が合成され
て、且つ、この翻訳物質が含んでいるあらゆるアミノ酸
は、ポリヘドリンプロモーターによって、発現ベクトル
のＡＴＧ開始コドンから下流の方へと、遺伝暗号が指定
されて合成されている という事になるべきである。
この第一次生成物は、組み換えベクトルによって供給さ
れたコドンから翻訳されたアミノ酸 で構成されている
であろう。 例えば、構成Ａの第一次翻訳物質は、端末
Ｎに於ては、Ｍｅｔ‐Ｐｒｏ‐Ｇｌｙ‐Ａｒｇ‐Ｖａｌ
と表現されるべきである。 そのＭｅｔ‐Ｐｒｏ‐Ｇ
ｌｙコドンは、■■■の結果として供給される。
ｅｎｖ 前駆物質の糖蛋白質の分裂が起る可能性■ある
２ヶ所の作用場所で、先ず最初に、アミノ酸３０ヶの
暗号ペプチドの余剰部分が、端末Ｎに於て取り外され、
そして、次に、アミノ酸を３４５ヶ含む大きな経膜的蛋
白質と、アミノ酸が４８６ヶの細胞外部分とが 生じる
。 細胞が効率よく出来てゆくのには、暗号ペプチドの
認識と分裂とが必要である と一般に信じられている。
２ヶ所の作用場所で、先ず最初に、アミノ酸３０ヶの
暗号ペプチドの余剰部分が、端末Ｎに於て取り外され、
そして、次に、アミノ酸を３４５ヶ含む大きな経膜的蛋
白質と、アミノ酸が４８６ヶの細胞外部分とが 生じる
。 細胞が効率よく出来てゆくのには、暗号ペプチドの
認識と分裂とが必要である と一般に信じられている。
ＨＩＶ ｅｎｖ 遺伝子の規則的連鎖が、組み換えバキ
ュロウィルスから発現した事を、確かめるには、現在感
染中のＳ‐メチオニン（３５）、Ｓ‐シスチン（３５）
、又は、Ｈ‐マンノーゼ（３）の存在のもとで、いろい
ろな組み換えウィルスの夫々を用いて、昆虫の細胞の培
養組織を感染させた。 細胞から取出した抽出物に標識
を■って、ＳＤＳ ポリアクリルアミド ゲル、電気泳
動法（ＰＡＧＥ） 及び 放射能写真術（オートラジオ
グラフィー）によって 表示した。
ュロウィルスから発現した事を、確かめるには、現在感
染中のＳ‐メチオニン（３５）、Ｓ‐シスチン（３５）
、又は、Ｈ‐マンノーゼ（３）の存在のもとで、いろい
ろな組み換えウィルスの夫々を用いて、昆虫の細胞の培
養組織を感染させた。 細胞から取出した抽出物に標識
を■って、ＳＤＳ ポリアクリルアミド ゲル、電気泳
動法（ＰＡＧＥ） 及び 放射能写真術（オートラジオ
グラフィー）によって 表示した。
ＨＩＶ 組み換えバキュロウィルス により感染された
昆虫細胞中で作られた 組み換え蛋白質の本物らしさを
評価する為に、三種の血清を用いた。
昆虫細胞中で作られた 組み換え蛋白質の本物らしさを
評価する為に、三種の血清を用いた。
１．疾病管理センター（Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｄｉｓ
ｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ；ＣＤＣ；米国ジョージア州
アトランタ市所在）により、ＨＩＶ‐正の参考基準とし
て提供された ＨＩＶ‐正 人の血清 ２．又、ＣＤＣにより、ＨＩＶ‐負の参考基準として提
供された ＨＩＶ‐負の 人の血清 ３．精製した感染性ＨＴＬＶ‐ＩＩＩウィルスから調整
された精製ｇｐ１２０エンベロープ蛋白質をゲル化する
為に、山羊の中で作った多クローン性の抗体 その結果を第１表及び第二表に纏めた。：組み換えｇｐ
１６０の蛋白質は、ウェスタン吸取分析法（Ｗｅｓｔｅ
ｒｎ Ｂｌｏｔ ｏｎｏｌｙｓｉｓ）に加えて、ＥＬＩ
ＳＡや放射免疫沈降反応の如き典型的な診断学的検定法
に於て用いられて、成功をおさめて来た。
ｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ；ＣＤＣ；米国ジョージア州
アトランタ市所在）により、ＨＩＶ‐正の参考基準とし
て提供された ＨＩＶ‐正 人の血清 ２．又、ＣＤＣにより、ＨＩＶ‐負の参考基準として提
供された ＨＩＶ‐負の 人の血清 ３．精製した感染性ＨＴＬＶ‐ＩＩＩウィルスから調整
された精製ｇｐ１２０エンベロープ蛋白質をゲル化する
為に、山羊の中で作った多クローン性の抗体 その結果を第１表及び第二表に纏めた。：組み換えｇｐ
１６０の蛋白質は、ウェスタン吸取分析法（Ｗｅｓｔｅ
ｒｎ Ｂｌｏｔ ｏｎｏｌｙｓｉｓ）に加えて、ＥＬＩ
ＳＡや放射免疫沈降反応の如き典型的な診断学的検定法
に於て用いられて、成功をおさめて来た。
ＨＩＶ エンベロープ蛋白質の精製
組み換えＨＩＶエンベロープ蛋白質は、ＨＩＶ組み換え
ＡｃＮＰＶウィルスに感染させた後４〜５日の間に、Ｓ
．ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａの細胞中に作られる。 発現し
た蛋白質の大部分のものは、感染した細胞と関連がある
。 本書の中で述べるエンベロープＨＩＶ遺伝子生成物
は、総て、同じ性質を有しており、即ち、それらは、本
来、細胞と関連があり、糖蛋白質であるから、一つの生
成方法を、この申請書中に述べるＨＩＶエンベロープ遺
伝子生成物、或いは、その他の類似構造物の総てに、用
いる事が出来る。 次に示すものは、発現ベクトルＡｃ
３０４６から作られた 組み換えｇｐ１６０蛋白質を
精製する方法の一例 である。
ＡｃＮＰＶウィルスに感染させた後４〜５日の間に、Ｓ
．ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａの細胞中に作られる。 発現し
た蛋白質の大部分のものは、感染した細胞と関連がある
。 本書の中で述べるエンベロープＨＩＶ遺伝子生成物
は、総て、同じ性質を有しており、即ち、それらは、本
来、細胞と関連があり、糖蛋白質であるから、一つの生
成方法を、この申請書中に述べるＨＩＶエンベロープ遺
伝子生成物、或いは、その他の類似構造物の総てに、用
いる事が出来る。 次に示すものは、発現ベクトルＡｃ
３０４６から作られた 組み換えｇｐ１６０蛋白質を
精製する方法の一例 である。
Ｓ．ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａの細胞を、組み換え型Ａｃ３
０４６に感染させる。 感染後４−５日で、その細胞を
集めて洗滌し、細胞培養媒質を無くする。 その細胞群
を、先ず、普通の方法を用いて分別し、核膜画分と細胞
質膜画分とに分ける。 糖蛋白質画分にはｇｐ１６０蛋
白質を含有していて、可溶性にされ、そして、その糖蛋
白質は、普通の方法を用いた ひらまめレクチン親和性
クロマトグラフィーを用いて、精製される。 その糖蛋
白質画分には、ｇｐ１６０蛋白質が含まれていて、この
段階では、ＳＤＳ‐ポリアクリルアミドゲル分析法によ
り判定した処では、そのｇｐ１６０蛋白質は、糖蛋白質
画分全体の２５％−５０％である。 更にそのｇｐ１６
０を精製するには、糖蛋白質画分を、分子節液体クロマ
トグラフィーカラムの中を通過させるのである。 カラ
ムからは、そのｇｐ１６０蛋白質が、高分子量画分とし
て抜き取られ、そのｇｐ１６０蛋白質は、その高分子量
画分中の蛋白質全量のうち、約９０％である。
０４６に感染させる。 感染後４−５日で、その細胞を
集めて洗滌し、細胞培養媒質を無くする。 その細胞群
を、先ず、普通の方法を用いて分別し、核膜画分と細胞
質膜画分とに分ける。 糖蛋白質画分にはｇｐ１６０蛋
白質を含有していて、可溶性にされ、そして、その糖蛋
白質は、普通の方法を用いた ひらまめレクチン親和性
クロマトグラフィーを用いて、精製される。 その糖蛋
白質画分には、ｇｐ１６０蛋白質が含まれていて、この
段階では、ＳＤＳ‐ポリアクリルアミドゲル分析法によ
り判定した処では、そのｇｐ１６０蛋白質は、糖蛋白質
画分全体の２５％−５０％である。 更にそのｇｐ１６
０を精製するには、糖蛋白質画分を、分子節液体クロマ
トグラフィーカラムの中を通過させるのである。 カラ
ムからは、そのｇｐ１６０蛋白質が、高分子量画分とし
て抜き取られ、そのｇｐ１６０蛋白質は、その高分子量
画分中の蛋白質全量のうち、約９０％である。
本発明と関連して若干興味があるのは、Ｂｉｏ／Ｔｅｃ
ｈｎｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．４、（１９８６年９月号）の
７９０−７９５ページに公表されている論文で、著者が
Ｍ．Ｐ．Ｋｉｅｎｙその他 であって、題名が″組み
換え痘疹ウィルスから発現させた ＡＩＤＳウィルスｅ
ｎｖ蛋白質″という論文である。 この論文が開示して
いる処では、ＬＡＶのｅｎｖ蛋白質の遺伝暗号を指定す
るｅｎｖの規則的連鎖が、痘疹ウィルスのベクトルの中
に取り入れられた というのである。
ｈｎｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．４、（１９８６年９月号）の
７９０−７９５ページに公表されている論文で、著者が
Ｍ．Ｐ．Ｋｉｅｎｙその他 であって、題名が″組み
換え痘疹ウィルスから発現させた ＡＩＤＳウィルスｅ
ｎｖ蛋白質″という論文である。 この論文が開示して
いる処では、ＬＡＶのｅｎｖ蛋白質の遺伝暗号を指定す
るｅｎｖの規則的連鎖が、痘疹ウィルスのベクトルの中
に取り入れられた というのである。
そうすると、結果として生じた 生きた組み換えウィル
スＶＶＴＧｅＬＡＶは、感染した哺乳類の細胞の中での
ｅｎｖ蛋白質の製造を決定する事になる。 この組み替
え蛋白質は、ＡＩＤＳの患者から取った血清と反応し、
ＬＡＶレトロウィルスの真正のｅｎｖと同じ様にして処
理され、糖蛋白質化される様に思われる。 又、ハツカ
鼠にＶＶＴＧｅＬＡＶを接種すると、痘疹の遺伝決定子
を認識する抗血清の滴定値は高い値が出て来るが、ＬＡ
Ｖのｅｎｖ蛋白質を認識する抗体の滴定値は、ほんの小
さな値しか出て来ない。 組み換えウィルスで感染され
た細胞は、処理された形のｅｎｖ蛋白質を、迅速に培養
媒質中へ遊離する。 然しながら、例えば、ＬＡＶウィ
ルス又はＨＩＶウィルスに対する免疫反応を引き出す為
のワクチンの場合の様に、ｅｎｖ蛋白質そのものを製造
したり利用したりする為には、この方法は、必ずしも完
全に満足出来るものではない。詳しく云うと、ベクトル
として痘疹ウィルスを用いているからである。
スＶＶＴＧｅＬＡＶは、感染した哺乳類の細胞の中での
ｅｎｖ蛋白質の製造を決定する事になる。 この組み替
え蛋白質は、ＡＩＤＳの患者から取った血清と反応し、
ＬＡＶレトロウィルスの真正のｅｎｖと同じ様にして処
理され、糖蛋白質化される様に思われる。 又、ハツカ
鼠にＶＶＴＧｅＬＡＶを接種すると、痘疹の遺伝決定子
を認識する抗血清の滴定値は高い値が出て来るが、ＬＡ
Ｖのｅｎｖ蛋白質を認識する抗体の滴定値は、ほんの小
さな値しか出て来ない。 組み換えウィルスで感染され
た細胞は、処理された形のｅｎｖ蛋白質を、迅速に培養
媒質中へ遊離する。 然しながら、例えば、ＬＡＶウィ
ルス又はＨＩＶウィルスに対する免疫反応を引き出す為
のワクチンの場合の様に、ｅｎｖ蛋白質そのものを製造
したり利用したりする為には、この方法は、必ずしも完
全に満足出来るものではない。詳しく云うと、ベクトル
として痘疹ウィルスを用いているからである。
この発明と関連して、又興味深いのは、Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖ
ｏｌ．３，Ｎｏ．１２（１９８３年１２月号）、１９３
−１９２ページに所載の Ｇ．Ｅ．Ｓｍｉｔｈその他に
よる″バキュロウィルス発現ベクトルで感染した昆虫細
胞に於いての 人ベーターインターフェロンの製造″と
いう題名の論文 と、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃ
ｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｖｏｌ．４，Ｎｏ．
３，（１９８４年３月号）、３９９−４０６ページに所
載の Ｇ．Ｄ．Ｐｅｎｎｏｃｋその他による″バキュロ
ウィルスベクトルを有する昆虫の細胞中に於ける Ｅｓ
ｃｈｅｒｉｃｈｉａ Ｃｏｌｉベーターガラクシダーゼ
の強力で統制された発現″という題名の論文 とである
。 又、興味のあるのは、同時係属、同時譲渡の特許申
請書‐‐連番号Ｎｏ．８１０，９３８（１９８５年１２
月１８日出願）である。 欧州特許公報Ｎｏ．０，１２
７，８３９（１９８４年１２月１２日公知）と、欧州特
許公報Ｎｏ．０，１５５，４７４（１９８５年９月２５
日公知）も又、この発明と関連して興味深いものである
。 之等の論文や、之等の特許公報や、特許出願は、本
書に組み込まれ、この明細書の一部となっている。
ａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖ
ｏｌ．３，Ｎｏ．１２（１９８３年１２月号）、１９３
−１９２ページに所載の Ｇ．Ｅ．Ｓｍｉｔｈその他に
よる″バキュロウィルス発現ベクトルで感染した昆虫細
胞に於いての 人ベーターインターフェロンの製造″と
いう題名の論文 と、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃ
ｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｖｏｌ．４，Ｎｏ．
３，（１９８４年３月号）、３９９−４０６ページに所
載の Ｇ．Ｄ．Ｐｅｎｎｏｃｋその他による″バキュロ
ウィルスベクトルを有する昆虫の細胞中に於ける Ｅｓ
ｃｈｅｒｉｃｈｉａ Ｃｏｌｉベーターガラクシダーゼ
の強力で統制された発現″という題名の論文 とである
。 又、興味のあるのは、同時係属、同時譲渡の特許申
請書‐‐連番号Ｎｏ．８１０，９３８（１９８５年１２
月１８日出願）である。 欧州特許公報Ｎｏ．０，１２
７，８３９（１９８４年１２月１２日公知）と、欧州特
許公報Ｎｏ．０，１５５，４７４（１９８５年９月２５
日公知）も又、この発明と関連して興味深いものである
。 之等の論文や、之等の特許公報や、特許出願は、本
書に組み込まれ、この明細書の一部となっている。
人の後天性免疫不全症候群、Ｈｕｍａｎ Ａｅｇｕｉｒ
ｅｄ Ｉｍｍｕｎｅ Ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｓｙｎｄ
ｒｏｍｅ（ＡＩＤＳ）は、米国、中央アフリカ、ヨーロ
ッパ、及び、世界のその他の地域で、流行しているから
、この発明は、大変重要なものである。
ｅｄ Ｉｍｍｕｎｅ Ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｓｙｎｄ
ｒｏｍｅ（ＡＩＤＳ）は、米国、中央アフリカ、ヨーロ
ッパ、及び、世界のその他の地域で、流行しているから
、この発明は、大変重要なものである。
上に述べた様に、この病気ＡＩＤＳの原因となる原体は
、人免疫不全ウィルス、Ｈｕｍａｎ Ｉｍｕｎｅｄｅｆ
ｉｃｉｅｎｃｙ Ｖｉｒｕｓ（ＨＩＶ）という名称のレ
トロウィルスの一つであって、それは、又、リンパ節障
害ウィルス、Ｌｙｍｐｈａｄｅｎｏｐａｔｈｙ Ｖｉｒ
ｕｓ（ＬＡＶ）、人Ｔ細胞白血病ウィルスＩＩＩ型、Ｈ
ｕｍａｎ Ｔ‐ｃｅｌｌ Ｌｅｎｋｅｍｉａ Ｖｉｒｕ
ｓ Ｔｙｐｅ ＩＩＩ（ＨＴＬＶ‐ＩＩＩ） 又は、Ａ
ＩＤＳ関連ウィルス、ＡＩＤＳ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｖｉ
ｒｕｓ（ＡＲＶ）とも、いろいろの名前で呼ばれている
ものである。 いくつかのＡＩＤＳウィルスの構造と遺
伝子の機構とが、分子クローンが完全なヌクレオチド連
鎖である事と、ウィルスの蛋白質が真直に順序よく配列
している事とから、解明されて来た。 ＨＩＶエンベロ
ープ遺伝子（ｅｎｖ）は、分子量が１６０，０００の糖
蛋白質を合成する遺伝暗号を指定し、ｇｐ１６０と呼ば
れる。 ウィルスに感染した細胞に於ては、ｇｐ１６０
の前駆物質が、基本のアミノ酸の一定に得られた規則的
連鎖の処にくっついているが、結局は、端末がＮの糖蛋
白質ｇｐ１２０と、より小さな端末がＣの蛋白質ｇｐ４
１とを作る事になる。 ＨＩＶ糖蛋白質であるｇｐ１６
０、ｇｐ１２０、及び、ｇｐ４１は、夫々、大凡８３３
個、４８８個、及び、３４５個のアミノ酸を含有してい
る。
、人免疫不全ウィルス、Ｈｕｍａｎ Ｉｍｕｎｅｄｅｆ
ｉｃｉｅｎｃｙ Ｖｉｒｕｓ（ＨＩＶ）という名称のレ
トロウィルスの一つであって、それは、又、リンパ節障
害ウィルス、Ｌｙｍｐｈａｄｅｎｏｐａｔｈｙ Ｖｉｒ
ｕｓ（ＬＡＶ）、人Ｔ細胞白血病ウィルスＩＩＩ型、Ｈ
ｕｍａｎ Ｔ‐ｃｅｌｌ Ｌｅｎｋｅｍｉａ Ｖｉｒｕ
ｓ Ｔｙｐｅ ＩＩＩ（ＨＴＬＶ‐ＩＩＩ） 又は、Ａ
ＩＤＳ関連ウィルス、ＡＩＤＳ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｖｉ
ｒｕｓ（ＡＲＶ）とも、いろいろの名前で呼ばれている
ものである。 いくつかのＡＩＤＳウィルスの構造と遺
伝子の機構とが、分子クローンが完全なヌクレオチド連
鎖である事と、ウィルスの蛋白質が真直に順序よく配列
している事とから、解明されて来た。 ＨＩＶエンベロ
ープ遺伝子（ｅｎｖ）は、分子量が１６０，０００の糖
蛋白質を合成する遺伝暗号を指定し、ｇｐ１６０と呼ば
れる。 ウィルスに感染した細胞に於ては、ｇｐ１６０
の前駆物質が、基本のアミノ酸の一定に得られた規則的
連鎖の処にくっついているが、結局は、端末がＮの糖蛋
白質ｇｐ１２０と、より小さな端末がＣの蛋白質ｇｐ４
１とを作る事になる。 ＨＩＶ糖蛋白質であるｇｐ１６
０、ｇｐ１２０、及び、ｇｐ４１は、夫々、大凡８３３
個、４８８個、及び、３４５個のアミノ酸を含有してい
る。
成熟したｇｐ１２０は、ウィルスのエンベロープと関連
があり、ｅｘｔｅｒｎａｌであると考えられている。
一方、ｇｐ４１は、疎水性残渣の日本の長い伸びた部分
を有しており、之等のうちの一つ、又は、両方が、ウィ
ルスのエンベロープと交差する事があるかもしれない。
があり、ｅｘｔｅｒｎａｌであると考えられている。
一方、ｇｐ４１は、疎水性残渣の日本の長い伸びた部分
を有しており、之等のうちの一つ、又は、両方が、ウィ
ルスのエンベロープと交差する事があるかもしれない。
ｇｐ１６１の前駆物質と、成熟したｇｐ１２０と、ｇ
ｐ４１の蛋白質は、最も良く曝■された人から採取した
抗血清で検出される。 又、Ｔｈｅｌｐｅｒ／ｉｎｄｕ
ｃｅｒのリンパ球の細胞表面で、ｇｐ１２０の蛋白質が
Ｔ４分子に結合している事、並びに、ＨＩＶ ｇｐ１６
０蛋白質は、Ｔ４レセプター蛋白質を発現する細胞と共
に、シンシチウムの生成を誘発する事が可能であるとい
う事が、明らかになって来た。 又、端末がカルボキシ
ル基のアミノ酸が１０４個もｇｐ１６０にあるのは、Ｔ
４＋ Ｔ‐リンパ球を溶かす為には不必要だという事も
、分っている。
ｐ４１の蛋白質は、最も良く曝■された人から採取した
抗血清で検出される。 又、Ｔｈｅｌｐｅｒ／ｉｎｄｕ
ｃｅｒのリンパ球の細胞表面で、ｇｐ１２０の蛋白質が
Ｔ４分子に結合している事、並びに、ＨＩＶ ｇｐ１６
０蛋白質は、Ｔ４レセプター蛋白質を発現する細胞と共
に、シンシチウムの生成を誘発する事が可能であるとい
う事が、明らかになって来た。 又、端末がカルボキシ
ル基のアミノ酸が１０４個もｇｐ１６０にあるのは、Ｔ
４＋ Ｔ‐リンパ球を溶かす為には不必要だという事も
、分っている。
ＨＩＶ ｇｐ１６０のＡＩＤＳウィルスエンベロープ糖
蛋白質は、本発明によると、感染性ＨＩＶ隔離集団から
培養繁殖したＡＩＤＳウィルスｅｎｖ遺伝子 から発現
される。
蛋白質は、本発明によると、感染性ＨＩＶ隔離集団から
培養繁殖したＡＩＤＳウィルスｅｎｖ遺伝子 から発現
される。
発現に用いられるＨＩＶｅｎｖ遺伝子は、天然のＨＩＶ
ｅｎｖ遺伝子中に見られる規則的な連鎖を合成する遺伝
暗号だけを指定する。
ｅｎｖ遺伝子中に見られる規則的な連鎖を合成する遺伝
暗号だけを指定する。
そのＨＩＶｅｎｖ遺伝子を組み換えバキュロウィルス中
に挿入するに当り、発現した結果その成熟蛋白質が中に
変化したアミノ酸や追加したアミノ酸を含まない様にす
るのである。 いくつかの組み換えをしたうちで、１つ
は完全なＨＩＶｅｎｖ遺伝子を含んでおり、もう一つは
、ｇｐ１６０のＣ端で、約１００個のアミノ酸に対して
、連鎖がほん少し欠如していたのを除けば、完全である
。 この欠如は、発現した組み換えｇｐ１６０蛋白質が
安定化するのを助ける為になされたもので、ｇｐ４１に
存在する二つの疎水性領域はなくならない。
に挿入するに当り、発現した結果その成熟蛋白質が中に
変化したアミノ酸や追加したアミノ酸を含まない様にす
るのである。 いくつかの組み換えをしたうちで、１つ
は完全なＨＩＶｅｎｖ遺伝子を含んでおり、もう一つは
、ｇｐ１６０のＣ端で、約１００個のアミノ酸に対して
、連鎖がほん少し欠如していたのを除けば、完全である
。 この欠如は、発現した組み換えｇｐ１６０蛋白質が
安定化するのを助ける為になされたもので、ｇｐ４１に
存在する二つの疎水性領域はなくならない。
上述の如くして、昆虫細胞発現システムの中で、ＨＩＶ
ｇｐ１６０が作られたが、又、上記の中で示唆した様
に、哺乳類の細胞の蛋白質の汚染は全く無い。 ｇｐ１
６０蛋白質の発現と精製とは、天然の蛋白質の構造とそ
の生物的活性とを維持する様な条件の下で行われた。
結果として発現したＨＩＶｅｎｖ蛋白質は、ＡＩＤＳ患
者の血清と非常に良く反応するという事が、免疫沈降反
応検定法、Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ検定法、ＥＬＩＳ
Ａ検定法により、実証された。
ｇｐ１６０が作られたが、又、上記の中で示唆した様
に、哺乳類の細胞の蛋白質の汚染は全く無い。 ｇｐ１
６０蛋白質の発現と精製とは、天然の蛋白質の構造とそ
の生物的活性とを維持する様な条件の下で行われた。
結果として発現したＨＩＶｅｎｖ蛋白質は、ＡＩＤＳ患
者の血清と非常に良く反応するという事が、免疫沈降反
応検定法、Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ検定法、ＥＬＩＳ
Ａ検定法により、実証された。
観発明のＨＩＶ ｇｐ１６０蛋白質は、例えば、ＳＤＳ
‐ポリアクリルアミドＦＰＬＣ分析法で測定して５０％
以上の純度で、１ミリリットル当り約１００マイクログ
ラムのエンベロープ蛋白質濃度の、殺菌した水性緩衝剤
の中で、いろんな量、純度、形態で作られて来た。 Ｈ
ＩＶ ｇｐ１６０蛋白質は、４℃に於て、少くとも６週
間安定である という事が分っている。 この蛋白質は
、１回使用するだけの量又は容積で提供されて来たし、
−７０℃で貯蔵すれば、申し分なく貯蔵される。 望む
べくは、蛋白質及び生物活性を失うのを避ける為に、冷
凍、解凍のサイクルを繰返す事は避けるべきで、稀釈す
るのも、適切な蛋白質又は洗浄剤を含む溶液で行うべき
である。 適切な稀釈剤は、殺菌した水又は溶剤媒質中
に、牛属動物の血清アルブミン（ＢＳＡ）又はその相当
品を０．１％、血清を０．１％、及び、水又は緩衝剤中
に硫酸ドヂシルナトリウム又はその他適切な洗浄剤を０
．１％含有している。 この発明に準拠して作った蛋白
質、即ちＨＩＶ ｇｐ１６０は、上記の如く、用いると
有用であり、必要に応じ、或いは、計画使用次第で、い
ろんな大きさに包装されて来た。 例えば、蛋白質が２
５マイクログラム、５０マイクログラム、或いは、１０
０マイクログラム といった具合である。 その蛋白質
は、試験管で使用しても有用であり、又、ワクチンの開
発、Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ法、ＥＬＩＳＡ
法、レセプター結合法、免疫沈降反応法、抗血清の製造
、シンシチウムの生成 を含めたいろんな面のＡＩＤＳ
研究に関連した他の研究に対しても有用であり、物理的
研究を含む他の用途に対しても、参考標準としても有用
である。
‐ポリアクリルアミドＦＰＬＣ分析法で測定して５０％
以上の純度で、１ミリリットル当り約１００マイクログ
ラムのエンベロープ蛋白質濃度の、殺菌した水性緩衝剤
の中で、いろんな量、純度、形態で作られて来た。 Ｈ
ＩＶ ｇｐ１６０蛋白質は、４℃に於て、少くとも６週
間安定である という事が分っている。 この蛋白質は
、１回使用するだけの量又は容積で提供されて来たし、
−７０℃で貯蔵すれば、申し分なく貯蔵される。 望む
べくは、蛋白質及び生物活性を失うのを避ける為に、冷
凍、解凍のサイクルを繰返す事は避けるべきで、稀釈す
るのも、適切な蛋白質又は洗浄剤を含む溶液で行うべき
である。 適切な稀釈剤は、殺菌した水又は溶剤媒質中
に、牛属動物の血清アルブミン（ＢＳＡ）又はその相当
品を０．１％、血清を０．１％、及び、水又は緩衝剤中
に硫酸ドヂシルナトリウム又はその他適切な洗浄剤を０
．１％含有している。 この発明に準拠して作った蛋白
質、即ちＨＩＶ ｇｐ１６０は、上記の如く、用いると
有用であり、必要に応じ、或いは、計画使用次第で、い
ろんな大きさに包装されて来た。 例えば、蛋白質が２
５マイクログラム、５０マイクログラム、或いは、１０
０マイクログラム といった具合である。 その蛋白質
は、試験管で使用しても有用であり、又、ワクチンの開
発、Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ法、ＥＬＩＳＡ
法、レセプター結合法、免疫沈降反応法、抗血清の製造
、シンシチウムの生成 を含めたいろんな面のＡＩＤＳ
研究に関連した他の研究に対しても有用であり、物理的
研究を含む他の用途に対しても、参考標準としても有用
である。
Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ 分析法は、ＡＩＤＳ抗体の
検出に対して役立つ 最も特異で鋭敏な方法の一つであ
って、いろんな面のＡＩＤＳ研究に屡々用いられ、上述
の如く、ｇｐ１６０の前駆物質や成熟ｇｐ１２０とｇｐ
４１の蛋白質は、ＡＩＤＳに対し血清的に陽性の人から
採取した抗血清により 検出される。 従って、この発
明の実施例の一つに於ては、ＡＩＤＳの抗体検出に関し
て用いる為に、ＡＩＤＳウィルスのエンベロープ又はｅ
ｎｖ蛋白質を、適当な気質、即ち、磁器、ガラス、ポリ
スチレンプラスチック板、受皿、又は、硝酸繊維素製の
膜状帯片の如きフイルム に塗布する。
検出に対して役立つ 最も特異で鋭敏な方法の一つであ
って、いろんな面のＡＩＤＳ研究に屡々用いられ、上述
の如く、ｇｐ１６０の前駆物質や成熟ｇｐ１２０とｇｐ
４１の蛋白質は、ＡＩＤＳに対し血清的に陽性の人から
採取した抗血清により 検出される。 従って、この発
明の実施例の一つに於ては、ＡＩＤＳの抗体検出に関し
て用いる為に、ＡＩＤＳウィルスのエンベロープ又はｅ
ｎｖ蛋白質を、適当な気質、即ち、磁器、ガラス、ポリ
スチレンプラスチック板、受皿、又は、硝酸繊維素製の
膜状帯片の如きフイルム に塗布する。
特に、本発明のこの実施態様によると、電気泳動的に分
離したＡＩＤＳ組み換えエンベロープ蛋白質であるＨＩ
Ｖｇｐ１６０を、Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ法に用いる
硝酸繊維素製の膜状帯片、即ち、吸取帯片の上に含浸す
る。 そのＨＩＶ ｅｎｖ ｇｐは、本発明に準拠して
、一つの昆虫細胞発現システムの中で作られるから、哺
乳類の細胞の蛋白質の汚染は全く無い。 Ｗｅｓｔｅｒ
ｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ ｓｔｒｉｐｅ として使用する
為に、硝酸繊維素製帯片上に沈積したこの物質は、ＡＩ
ＤＳ患者の結成と非常によく反応する という事が分っ
て来たし、硝酸繊維素製帯片状に沈積されたＨＩＶ ｇ
ｐ１６０を、人ＡＩＤＳに正の血清でテストすると、１
／１００〜１／１０，０００ という稀釈状態に於ても
、テストは成功して来た。 その上に明確に結合した抗
体は、アルカリ性ホスファターゼ又はペルオキシダーゼ
の様な酵素を組み合わせた試薬であろうと、共役二次抗
体であろうと、特殊な抗抗体であろうと、或いは、放射
線沃素処理した蛋白質Ａであろうと、何れでも検出する
事が可能である。 この発明の之等の特殊な実施態様を
用いるＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ ａｎａｌｙｓｉｓ用
の免疫学的手法、即ち、Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ ａ
ｎａｌｙｓｉｓ用の担体、即ち、ＨＩＶ ｅｎｖ 蛋白
質を含浸した吸取帯片は、公知である。
離したＡＩＤＳ組み換えエンベロープ蛋白質であるＨＩ
Ｖｇｐ１６０を、Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ法に用いる
硝酸繊維素製の膜状帯片、即ち、吸取帯片の上に含浸す
る。 そのＨＩＶ ｅｎｖ ｇｐは、本発明に準拠して
、一つの昆虫細胞発現システムの中で作られるから、哺
乳類の細胞の蛋白質の汚染は全く無い。 Ｗｅｓｔｅｒ
ｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ ｓｔｒｉｐｅ として使用する
為に、硝酸繊維素製帯片上に沈積したこの物質は、ＡＩ
ＤＳ患者の結成と非常によく反応する という事が分っ
て来たし、硝酸繊維素製帯片状に沈積されたＨＩＶ ｇ
ｐ１６０を、人ＡＩＤＳに正の血清でテストすると、１
／１００〜１／１０，０００ という稀釈状態に於ても
、テストは成功して来た。 その上に明確に結合した抗
体は、アルカリ性ホスファターゼ又はペルオキシダーゼ
の様な酵素を組み合わせた試薬であろうと、共役二次抗
体であろうと、特殊な抗抗体であろうと、或いは、放射
線沃素処理した蛋白質Ａであろうと、何れでも検出する
事が可能である。 この発明の之等の特殊な実施態様を
用いるＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ ａｎａｌｙｓｉｓ用
の免疫学的手法、即ち、Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ ａ
ｎａｌｙｓｉｓ用の担体、即ち、ＨＩＶ ｅｎｖ 蛋白
質を含浸した吸取帯片は、公知である。
このＨＩＶ ｇｐ１６０帯片、即ち、担体は、本発明に
準拠した、適切な数の使い棄ての皿の中で、つまり例え
ば、８個の別々の皿の中に８個の帯片という風にして、
調整をした。 定温放置は総て、皿の中で行う事が可能
で、Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ、或いは、検出結果を明
らかにする為に 便利な貯蔵容器として皿を用いる事が
出来る様に、蓋が一枚とり付けてある。 本発明に準拠
して調整した斯かる帯片の各々を、１０％ＳＤＳポリア
クリルアミドのゲル上で電気泳動に依り■■させられた
組み換えＨＩＶｇｐ１６０エンベロープ蛋白質で 含浸
し、然る後、硝酸繊維素製の膜又は帯片又は担体に、電
気泳動的に移される。 その結果として出来た製品は、
動物に対して試験管内でＡＩＤＳエンベロープ抗体を検
出するのに有効であり、そして、ＡＩＤＳ抗体検出用の
Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇを含めたあらゆる面
のＡＩＤＳ研究 に関連した細胞培養又は組織培養の研
究に有用であり、そして、品質管理、血液銀行のスクリ
ーニングやＡＩＤＳの診断にも有用である。 硝酸繊維
素膜の担体又は帯片は、室温で少くとも６週間は安定で
ある事が分って来たし、冷乾所であれば皿の中での様に
、適切に貯蔵される。
準拠した、適切な数の使い棄ての皿の中で、つまり例え
ば、８個の別々の皿の中に８個の帯片という風にして、
調整をした。 定温放置は総て、皿の中で行う事が可能
で、Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ、或いは、検出結果を明
らかにする為に 便利な貯蔵容器として皿を用いる事が
出来る様に、蓋が一枚とり付けてある。 本発明に準拠
して調整した斯かる帯片の各々を、１０％ＳＤＳポリア
クリルアミドのゲル上で電気泳動に依り■■させられた
組み換えＨＩＶｇｐ１６０エンベロープ蛋白質で 含浸
し、然る後、硝酸繊維素製の膜又は帯片又は担体に、電
気泳動的に移される。 その結果として出来た製品は、
動物に対して試験管内でＡＩＤＳエンベロープ抗体を検
出するのに有効であり、そして、ＡＩＤＳ抗体検出用の
Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇを含めたあらゆる面
のＡＩＤＳ研究 に関連した細胞培養又は組織培養の研
究に有用であり、そして、品質管理、血液銀行のスクリ
ーニングやＡＩＤＳの診断にも有用である。 硝酸繊維
素膜の担体又は帯片は、室温で少くとも６週間は安定で
ある事が分って来たし、冷乾所であれば皿の中での様に
、適切に貯蔵される。
本発明に準拠して、例えば９６個の別々の皿という様な
適当な数の使い捨ての皿の中で、ＨＩＶ ｇｐ１６０の
ＥＬＩＳＡ用の板を調整した。 定温放置は、総て、皿
の中で行った。 各皿には、適量のＨＩＶ ｇｐ１６０
を加える。例えば、１ミリリットル当り、ＨＩＶ ｇｐ
１６０を１μｇの濃度の精製したＨＩＶ ｇｐ１６０を
１００μｇと云う具合である。 ＨＩＶ ｇｐ１６０の
蛋白質は、皿の中のプラスチックスに適当な時■の間触
れる様にさせる、例えば、４℃で一晩中といった具合で
ある。 然る後、ＥＬＩＳＡ用の板の場合、残った溶液
を各皿から取り除き、ＥＬＩＳＡ板を室温で乾燥するに
任せる。 その結果として出来た 皿に加えたＨＩＶ
ｇｐ１６０の付着した板は、室温で少くとも６週間は安
定である事が分った。 そして、冷たく乾いた所であれ
ば、皿の中での様に、適切に貯蔵される。 結果として
生じた製品は、動物についてのＡＩＤＳのエンベロープ
抗体又は抗原の検出、及び、ＥＬＩＳＡ検出法を含めた
いろんな面のＡＩＤＳ研究に関連する細胞培養又は組織
培養研究 に有用であり、ＡＩＤＳ抗体又は抗原に対す
る人の血清のスクリーニング、及び、診断学 に有用で
ある。
適当な数の使い捨ての皿の中で、ＨＩＶ ｇｐ１６０の
ＥＬＩＳＡ用の板を調整した。 定温放置は、総て、皿
の中で行った。 各皿には、適量のＨＩＶ ｇｐ１６０
を加える。例えば、１ミリリットル当り、ＨＩＶ ｇｐ
１６０を１μｇの濃度の精製したＨＩＶ ｇｐ１６０を
１００μｇと云う具合である。 ＨＩＶ ｇｐ１６０の
蛋白質は、皿の中のプラスチックスに適当な時■の間触
れる様にさせる、例えば、４℃で一晩中といった具合で
ある。 然る後、ＥＬＩＳＡ用の板の場合、残った溶液
を各皿から取り除き、ＥＬＩＳＡ板を室温で乾燥するに
任せる。 その結果として出来た 皿に加えたＨＩＶ
ｇｐ１６０の付着した板は、室温で少くとも６週間は安
定である事が分った。 そして、冷たく乾いた所であれ
ば、皿の中での様に、適切に貯蔵される。 結果として
生じた製品は、動物についてのＡＩＤＳのエンベロープ
抗体又は抗原の検出、及び、ＥＬＩＳＡ検出法を含めた
いろんな面のＡＩＤＳ研究に関連する細胞培養又は組織
培養研究 に有用であり、ＡＩＤＳ抗体又は抗原に対す
る人の血清のスクリーニング、及び、診断学 に有用で
ある。
次の出版参考文献は、本発明を支える為に引用したもの
である。 之等の参考文献が開示されているという事は
、本書の中に組み込まれており、本命最初の一部をなし
ているのである。
である。 之等の参考文献が開示されているという事は
、本書の中に組み込まれており、本命最初の一部をなし
ているのである。
Claims (60)
- （１）組換え昆虫ウィルスから表現されるＡＩＤＳウィ
ルスの￥ｅｎｖ￥蛋白質 - （２）組換え昆虫バキュロウィルスから表現される特許
請求の範囲（１）によるＡＩＤＳウィルス￥ｅｎｖ￥蛋
白質 - （３）組換え昆虫ウィルスから表現されるＡＩＤＳウィ
ルス￥ｅｎｖ￥ｇｐ１６０蛋白質 - （４）組換え昆虫ウィルスから表現されるＡＩＤＳウィ
ルス￥ｅｎｖ￥ｇｐ１２０蛋白質 - （５）組換え昆虫ウィルスから表現されるＡＩＤＳウィ
ルス￥ｅｎｖ￥ｇｐ４１蛋白質 - （６）組換え昆虫ウィルスから表現されるＡＩＤＳウィ
ルス￥ｅｎｖ￥蛋白質の免疫源切片 - （７）昆虫細胞においてＡＩＤＳウィルス￥ｅｎｖ￥蛋
白質の表現に対するＡＩＤＳウィルス￥ｅｎｖ￥蛋白質
をその中に取り入れた組換え昆虫バキュロウィルス - （８）該ウィルスはＡＩＤＳウィルス￥ｅｎｖ￥蛋白質
の免疫源切片に対する遺伝子をその中に取り入れた特許
請求の範囲（７）による組換え昆虫バキュロウィルス - （９）ＡＩＤＳウィルス￥ｅｎｖ￥ｇｐ１６０蛋白質に
対する遺伝子をその中に取り入れた特許請求の範囲（７
）による組換え昆虫バキュロウィルス - （１０）ＡＩＤＳウィルス￥ｅｎｖ￥ｇｐ１２０蛋白質
に対する遺伝子をその中に取り入れた特許請求の範囲（
７）による組換え昆虫バキュロウィルス - （１１）ＡＩＤＳウィルス￥ｅｎｖ￥ｇｐ４１蛋白質に
対する遺伝子をその中に取り入れた特許請求の範囲（７
）による組換え昆虫バキュロウィルス - （１２）基質または担体中に取り入れられるか、または
その上に固定された特許請求の範囲（１）によるＡＩＤ
Ｓウィルス￥ｅｎｖ￥蛋白質 - （１３）薄膜中に取り入れられるか、またはその上に固
定された特許請求の範囲（１）によるエイズウィルス￥
ｅｎｖ￥蛋白質 - （１４）透明な基質または担体中に取り入れられるかま
たはその上に固定された特許請求の範囲（１）によるＡ
ＩＤＳウィルス￥ｅｎｖ￥蛋白質 - （１５）ニトロセルロース薄膜または膜に取り入れられ
るか、またはその上に固定された特許請求の範囲（１）
によるＡＩＤＳウィルス￥ｅｎｖ￥蛋白質 - （１６）固形の基質または担体中に取り入れられるか、
またはその上に固定された特許請求の範囲（６）による
ＡＩＤＳウィルス￥ｅｎｖ￥蛋白質の免疫源切片 - （１７）特許請求の範囲（６）によるＡＩＤＳウィルス
￥ｅｎｖ￥蛋白質の免疫源切片からなるＡＩＤＳウィル
スに対するワクチン - （１８）特許請求の範囲（３）によるＡＩＤＳウィルス
￥ｅｎｖ￥蛋白質からなるワクチン - （１９）特許請求の範囲（４）によるＡＩＤＳウィルス
￥ｅｎｖ￥１２０蛋白質からなるワクチン - （２０）特許請求の範囲（５）によるＡＩＤＳウィルス
￥ｅｎｖ￥ｇｐ４１蛋白質からなるワクチン - （２１）特許請求の範囲（６）によるＡＩＤＳウィルス
￥ｅｎｖ￥蛋白質の免疫源切片とそれのための液状担体
とからなるＡＩＤＳ抗体の検出に有用な診断学的組成物 - （２２）ＡＩＤＳ抗体に特許請求の範囲（１）による組
換え昆虫ウィルスから表現されたＡＩＤＳ￥ｅｎｖ￥蛋
白質を接触させること、そして該ＡＩＤＳウィルス抗体
と該蛋白質との間での固定または反応を測定することか
らなるＡＩＤＳウィルス抗体を検出する方法 - （２３）該ＡＩＤＳウィルス￥ｅｎｖ￥蛋白質は該蛋白
質の該ＡＩＤＳウィルス抗体との固定または反応を検出
することが出来るようにラベルされている特許請求の範
囲（２２）に記載の方法 - （２４）組換え感染細胞中に表現された特許請求の範囲
（１）によるＡＩＤＳウィルス￥ｅｎｖ￥蛋白質 - （２５）組換え感染昆虫細胞中に表現された特許請求の
範囲（１）によるＡＩＤＳウィルスｅｎｖ蛋白質 - （２６）昆虫細胞におけるＡＩＤＳウィルス蛋白質、エ
ンベロープ及びコア - （２７）ＡＩＤＳウィルス￥ｅｎｖ￥蛋白質遺伝子また
はＡＩＤＳウィルスエンベロープ遺伝子（￥ｅｎｖ￥）
を昆虫のウィルスのＤＮＡの中へ挿入すること、得られ
た組換えウィルスにより昆虫細胞または昆虫を感染させ
ること、そして得られた感染した昆虫または昆虫細胞を
培養してＡＩＤＳウィルス￥ｅｎｖ￥蛋白質を表現また
は生成することからなるＡＩＤＳウィルス￥ｅｎｖ￥蛋
白質を製造する方法 - （２８）該昆虫ウィルスはバキュロウィルスである特許
請求の範囲（２７）に記載の方法 - （２９）組換え昆虫ウィルスから表現されたＡＩＤＳウ
ィルス￥ｇａｇ￥蛋白質 - （３０）組換え昆虫ウィルスから表現されたＡＩＤＳウ
ィルス￥ｐｏｌ￥蛋白質 - （３１）（ａ）バキュロウィルスゲノームの一部をクロ
ーン化ビヒクルの中へ挿入し、その後選択されたＡＩＤ
Ｓウィルス遺伝子またはその一部を該選択されたＡＩＤ
Ｓウィルス遺伝子またはその一部がバキュロウィルスプ
ロモーターのコントロール下において表現されるように
変性された挿入ベクトルの中へ挿入することにより組換
え挿入ベクトルを調整すること、 （ｂ）上記のように変性されたＡＩＤＳウィルス遺伝子
またはその一部を、該変性された挿入ベクトルをバキュ
ロウィルスＤＮＡと混合することによってバキュロウィ
ルス表現ベクトルの中へ移転すること、適当な昆虫細胞
へ移転感染すること、そして選択されたＡＩＤＳ遺伝子
またはその一部を含む組換えウィルスを単離すること、 以上からなる選択されたＡＩＤＳウィルス遺伝子または
その一部を宿主細胞の中で表現することが出来る組換え
バキュロウィルス表現ベクトルを組立てる方法。 - （３２）該選択されたＡＩＤＳウィルス遺伝子またはそ
の一部は￥ｅｎｖ￥遺伝子またはその一部である特許請
求の範囲（３１）に記載の方法 - （３３）該選択されたＡＩＤＳウィルス遺伝子またはそ
の一部は￥ｇａｇ￥遺伝子またはその一部である特許請
求の範囲（３１）に記載の方法 - （３４）該選択されたＡＩＤＳウィルス遺伝子またはそ
の一部は￥ｐｏｌ￥遺伝子またはその一部である特許請
求の範囲（３１）に記載の方法 - （３５）該バキュロウィルスプロモーターはポリヘドリ
ン遺伝子プロモーターである特許請求の範囲（３１）に
記載の方法 - （３６）該バキュロウィルスはオートグラファ カリフ
ォルニカ核ポリヘドロシスウィルスである特許請求の範
囲（３１）に記載の方法 - （３７）ＡＩＤＳ￥ｅｎｖ￥遺伝子から選択されたＡＩ
ＤＳウィルス遺伝子またはその一部は■はした図面にお
いて表現されそして図示された挿入ベクトルＡ、Ｂ、Ｃ
、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｊ、Ｋ、Ｌ、Ａ−１または
Ｂ−１にある特許請求の範囲（３１）に記載の方法 - （３８）敏感な宿主昆虫細胞を組換えバキュロウィルス
ベクトルで感染させること、そして該感染細胞を培養し
てＡＩＤＳウィルスポリペプチドを表現させることから
なり、しかして該バキュロウィルスは１個またはそれ以
上のＡＩＤＳウィルス蛋白質遺伝子又はその一部を含ん
でいる選択されたＡＩＤＳウィルスポリペプチドを合成
する方法 - （３９）該敏感な昆虫細胞は昆虫種スポドプテラ フル
ジペルダ（￥Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒ
ｄａ￥）から得られる特許請求の範囲（３８）に記載の
方法 - （４０）該ＡＩＤＳ遺伝子またはその一部は￥ｅｎｖ￥
遺伝子またはその一部である特許請求の範囲（３８）に
記載の方法 - （４１）該ＡＩＤＳ遺伝子またはその一部は￥ｇａｇ￥
遺伝子またはその一部である特許請求の範囲（３８）に
記載の方法 - （４２）該ＡＩＤＳ遺伝子またはその一部は￥ｐｏｌ￥
遺伝子またはその一部である特許請求の範囲（３８）に
記載の方法 - （４３）該ＡＩＤＳウィルス遺伝子またはその一部はバ
キュロウィルスプロモーターのコントロール下において
表現された特許請求の範囲（３８）に記載の方法 - （４４）該バキュロウィルスプロモーターはポリヘドリ
ン遺伝子プロモーターである特許請求の範囲（４３）に
記載の方法 - （４５）該バキュロウィルスはオートグラファ カリフ
ォルニカ（￥Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎ
ｉｃａ￥）核ポリヘドロシスウィルスである特許請求の
範囲（３８）に記載の方法 - （４６）該選択されたＡＩＤＳウィルス蛋白質遺伝子ま
たはその一部はＡＩＤＳ￥ｅｎｖ￥遺伝子からであり、
そして添付した図面において表現されそして図示された
挿入ベクトルＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｊ
、Ｋ、Ｌ、Ａ−１またはＢ−１にある特許請求の範囲（
３８）に記載の方法。 - （４７）ポリペプチドをレンチルレクチン親和性クロマ
トグラフにかけて糖蛋白質を単離し、次いでモレキュラ
ーシーブクロマトグラフィーを用いて糖蛋白質のサイズ
分画を行なうことからなるＡＩＤＳ￥ｅｎｖ￥遺伝子ポ
リペプチドの精製方法 - （４８）該ＡＩＤＳ￥ｅｎｖ￥遺伝子ポリペプチドは特
許請求の範囲（４６）に記載の方法に従って製造される
特許請求の範囲（４７）の方法 - （４９）固体基質に固定されまたは取り入れられた特許
請求の範囲（３８）に記載の方法に従って昆虫細胞中で
製造されたＡＩＤＳポリペプチドまたはその一部 - （５０）固体基質に固定されまたは取り入れられた特許
請求の範囲（４０）、（４１）、（４２）および（４６
）に記載の方法に従って製造されたＡＩＤＳポリペプチ
ド又はその一部 - （５１）固体基質に固定されまたは取り入れられた特許
請求の範囲（４７）に記載の方法に従って製造されたＡ
ＩＤＳポリペプチドまたはその一部 - （５２）多重ウェルを含むトレイの中で成形されたポリ
スチレンからなる固体基質に固定された特許請求の範囲
（４９）によるＡＩＤＳポリペプチド - （５３）フィルターまたは薄膜に固定された特許請求の
範囲（４９）によるＡＩＤＳポリペプチド - （５４）特許請求の範囲（１）の組換えＡＩＤＳウィル
ス蛋白質とヒトＡＩＤＳウィルス抗体を接触させること
からなるヒトＡＩＤＳウィルス抗体を検出し測定する方
法 - （５５）該組換えＡＩＤＳウィルスポリペプチドまたは
蛋白質またはそれらの一部は特許請求の範囲（３８）に
記載の方法によって製造される特許請求の範囲（５４）
に記載の方法 - （５６）該組換えＡＩＤＳウィルスポリペプチドまたは
蛋白質またはそれらの一部は特許請求の範囲（４７）に
記載の方法によって精製される特許請求の範囲（５４）
に記載の方法 - （５７）該組換えＡＩＤＳ蛋白質は固体基質に固定され
る特許請求の範囲（５４）に記載の方法 - （５８）該接触には酵素連結固相免疫吸収分析法（ＥＬ
ＩＳＡ法）が含まれる特許請求の範囲（５４）に記載の
方法 - （５９）該接触にはウェスタン・ブロット分析が含まれ
る特許請求の範囲（５４）に記載の方法 - （６０）特許請求の範囲（１）のＡＩＤＳウィルスｅｎ
ｖ蛋白質とそのための生理学上の担体とからなるＡＩＤ
Ｓに対するワクチン
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