DD284046A5 - Verfahren zur herstellung eines aids-diagnostikums - Google Patents

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines AIDS-Diagnostikums zur Diagnose von AIDS-Virus-Infektionen zum Nachweis von AIDS-Virus-Antikoerpern, bei dem man ein AIDS-Virus-Protein-Gen oder einen Teil davon in die DNA eines Insekten-Virus iseriert, Insekten-Zellen oder Insekten mit dem erhaltenen rekombinanten Virus infiziert, die erhaltenen infizierten Insekten-Zellen oder Insekten zur Expression oder Bildung des AIDS-Virus-Proteins zuechtet und die erhaltenen Proteine zu einem Diagnose-Besteck zusammenstellt.{Immunschwaeche-AIDS; Diagnostikum; Nachweis AIDS-Virus-Antikoerper; AIDS-Virus-Protein; AIDS-Virus-Protein-Gen; Insekten-Virus; DNA-Rekombinationstechnik}

Description

Hierzu 12 Seiten Zeichnungen
Anwendungsgebiet der Erfindung
Die Anwendung der vorliegenden Erfindung erfolgt auf dem Gebiet der Medizin bei der Diagnose von Immundefiziens-Virus-Infektionen von Säugern, beispielsweise des Menschen.
Charakteristik des bekannten Standes der Technik
Das Syndrom der erworbenen Immunschwäche (AIDS) ist eine Viruserkrankung von großer weltweiter Bedeutung. Das verursachende Agens der Krankheit ist ein Retrovirus, das als menschliches Immundefiziens-Virus (HIV), manchmal auch als Lymphadenopathie-Virus (LAV) (Barre-Sinoussl et al., 1983), menschlichesT-Zell-Leukämievirus-Typ III (HTLV-III) (Popovic ot al., 1984), oder als AIDS verwandtes Virus (ARV) (Levy et al., 1984) bezeichnet wird. Die Struktur und dio Genorganisation verschiedener AIDS-Viren wurde aus der vollständigen Nucleotidsequenz molekularer Clone und der direkten Sequenzierung viraler Proteine ermittelt.
Das Mantelprotein (envelope protein) ist der vielversprechendste Kandidat bei der Entwicklung eines AIDS-Impfstoffs und -Diagnostikums (Frames et al., 1985). Antikörper gegen das Mantel-Glykoprotein lassen sich üblicherweise in AIDS-Patientenseren nachweisen (Robey et al., 1985). Außerdem stellt das Mantel-Glykoprotein ein Hauptzielantigen des AIDS-Virus dar (Barin et al., 1985).
Die Herstellung eines wirksamen AIDS-Impfstoffs hängt von der Möglichkeit ab, große Mengen eines sicheren Antigens herzustellen, das die schützende Immunität stimuliert, wenn es in Menschen injiziert wird. Die DNA-Rekombinations-Technik bietet wegen ihrer bereits verstandenen Fähigkeit, große Mengen sicherer und wirtschaftlicher Immunogene herzustellen, die beste Möglichkeit zur Antigen-Produktion. Bei der Auswahl des zu verwendeten Rekombinations-Systems (Bakterien, Hefe oder andere eukaryontische Zellen) werden die folgenden Überlegungen zu berücksichtigen sein:
Das Mantel-Glykoprotein von HIV wird spezifisch durch Glykosylierung und Spaltung prozessiert. Das Rekombinations-System sollte in der Lage sein, das Genprodukt in einer erwünschten Weise zu prozessieren.
Bakterien- und Hefe-Zellen glykosylieren nicht wirksam die in ihnen exprimierten Proteine.
Obwohl Säugerzelien anscheinend die geeigneten Expressions-Vektoren sind, weisen sie den Nachteil auf, daß sie viele unerwünschte immunreaktive Antigene enthalten und außerdem stellen sie das Risiko dar, sekundäre Agenzien zu enthalten.
Ziel der Erfindung
Ziei der Erfindung ist es, Diagnostika, gegebenenfalls zusammen mit bei der Dia'gnose üblicherweise verwendeten Reagenzien oder mit üblichen Trägern und/oder Hilfsstoffen bereitzustellen, mit denen sich anti-AIDS-Virus-Antikörper nachweisen lassen.
Darlegung des Wesens der Erfindung
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Herstellung eines AIDS-Diagnostikums zu schaffen, das nicht mit pathogenen Agenzien oder mit Agenzien kontaminiert ist, das bei der Diagnose zu falschen positiven Ergebnissen führt.
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung eines AIDS-Diagnostikums, das gekennzeichnet ist dadurch, daß man ein AIDS-Virus-Protein-Gen oder einen Teil davon in die DNA eines Insekten-Virus inseriert, Insekten-Zellen oder Insekten mit dem erhaltenen rekombinanten Virus infiziert, die erhaltenen infizierten Insekten-Zellen oder Insekten zur Expression oder Bildung des AIDS-Virus-Proteins züchtet und die erhaltenen AIDS Virus-Proteine, gegebenenfalls zusammen mit üblichen Diagnose-Reagenzien, wie einem flüssigen Träger, zu einem Diagnose-Besteck zusammenstellt.
Gegenstand der Erfindung ist auch das genannte Verfahren mit der Besonderheit, daß das Insekten-Virus ein Baculovirus ist.
Gegenstand der Erfindung ist auch das genannte Verfahren mit der Besonderheit, daß das Baculovirus das Autographa Californica Kern-Polyhedrosis-Virus ist.
Gegenstand der Erfindung ist auch das genannte Verfahren mit der Besonderheit, daß das AIDS-Virus-Gen in einen rekombinanten Baculovirus-Expressions-Vektor inseriert wird.
Gegenstand der Erfindung ist auch das genannte Verfahren mit der Besonderheit, daß der Baculovirus-Expressions-Vektor mehr als ein AIDS-Virus-Protein-Gen oder Teile davon enthält.
Gegenstand der Erfindung ist auch das genannte Verfahren mit der Besonderheit, daß das AIDS-Virus-Gen oder der Teil davon unter der Kontrolle eines Baculovirus-Promotors exprimiert wird.
Gegenstand der Erfindung ist auch das genannte Verfahren mit der Besonderheit, daß der Baculovirus-Promotor der Promotor des Polyhedrin-Gens ist.
Gegenstand der Erfindung ist auch das genannte Verfahren mit der Besonderheit, daß man den rekombinanten Baculovirus-Expressions-Vektor, der in der Lage ist, ein AIDS-Virus-Gen oder einen Teil davon in einer Insektenzelle als Wirt zu exprimieren, erhält durch:
(a) Herstellung eines rekombinanten Insertions-Vektors durch Insertion eines Baculovirus-Genom-Teils in ein Clonierungs-Vehikel und anschließende Insertion eines AIDS-Virus-Gens oder eines Teils davon in den modifizierten Inscrtions-Vektor derart, daß das AIDS-Virus-Gen oder der Teil davon unter der Kontrolle eines Baculovirus-Promotors exprimiert wird, und
(b) Übertragung des so modifizierten AIDS-Virus-Gens oder des Teils davon in einen Baculovirus-Expressions-Vektor durch Vermischen des modifizierten Insertions-Vektors mit Baculovirus-DNA, Transfektion geeigneter Insekten-Zellen, und Isolierung rekombinanter Viren, die das AIDS-Virus-Gen oder den Teil davon enthalten.
Gegenstand der Erfindung ist auch das genannte Verfahren mit der Besonderheit, daß die Insektenzelle aus der Insektenart Spodoptera fruglperda stammt. Gegenstand der Erfindung ist auch das genannte Verfahren mit der Besonderheit, daß das AIDS-Virus-Protein-Gen das env-Gen
oder oin Teil davon ist.
Gegenstand der Erfindung ist auch das genannte Verfahren mit der Besonderheit, daß das AIDS-Virus-Protein-Gen das env
gp160Genist. .
Gegenstand der Erfindung ist auch das genannte Verfahren mit der Besonderheit, daß das AIDS-Virus-Protein-Gen das env
gp120-Genist.
Gegenstand der Erfindung ist auch das genannte Verfahren mit der Besonderheit, daß das AIDS-Virus-Protein-Gen das env
gp41-Genist.
Gegenstand der Erfindung ist auch das genannte Verfahren mit der Besonderheit, daß das AIDS-Virus-Protein-Gen oder der Teil
davon vom env-Gen abgeleitet ist und in den Insertions-Vektoren A, B, C, D, E, F, G, H, I, J, K, L, A-1 oder B-1 enthalten ist.
Gegenstand der Erfindung ist auch das genannte Verfahren mit der Besonderheit, daß das AIDS-Virus-Protein-Gen oder der Teil
davon für ein immunogenes Fragment des AIDS-Virus-env-Proteins codiert.
Gegenstand der Erfindung ist auch das genannte Verfahren mit der Besonderheit, daß das AIDS-Virus-Protein-Gen das gag-Gen
oder ein Teil davon ist.
Gegenstand der Erfindung ist auch das genannte Verfahren mit der Besonderheit, daß das AIDS-Virus-Protein-gen das pol-Gen
oder ein Teil davon ist.
Gegenstand der Erfindung ist auch das genannte Verfahren mit der Besonderheit, daß man die exprimierten AIDS-Virus-Proteine
reinigt, Indem man eine Lentil-Lectin-Affinitätschromatographie zur Isolierung von Glykoproteinen und sodann eine
Größenauftrennung der Glycoproteine durch Molekularsieb-Chromatographie durchführt. Gegenstand der Erfindung ist auch das genannte Verfahren mit der Besonderheit, daß man die AIDS-Virus-Proteine in einen
festen, gegebenenfalls transparenten Träger, wie die Bohrungen einer Polystyrol-Pluüe, einen Filter oder Film einbringt oderdaran bindet.
Gegenstand der Erfindung ist ferner eine Verwendung als Diagnostikum zum Nachweis von AIDS-Virus-Antikörpern, wie
menschlichen Antikörpern, wobei man ein Probenmaterial mit dem Diagnostikum in Berührung bringt und die Bindung oder
Reaktion zwischen dem AIDS-Virus-Protein und dem Antikörper bestimmt. Gegenstand der Erfindung ist auch die Verwendung mit der Besonderheit, daß η,. .n den Nachweis als ELISA (enzymelinked solid
phase immuno-absorbent assay) oder als Western-Blot-Analyse ausführt.
Fig. 1: zeigt die Nukleotid-Sequenz des Mantel-Gens des LAV-1 a-lsolats in votler Länge. Die Nukleotid-Sequenz wird zusammen mit der davon abgeleiteten Aminosäure-Sequenz dargestellt. Die Sequenz-Information wurde von „GENBANK" erhalten. Die Numerierung der Nukleotide beginnt beim ersten Nukleotid des vermuteten ATG-Startcodons. Die Aminosäuren sind ausgehend vom ATG-Startcodon durchnumeriert. Die dem extrazellulären Signalpeptid-Glykoprotein (gp120) und dem Transmembran-Glykoprotein (gp41) entsprechenden Bereiche werden zusammen mit den vorgeschlagenen Peptid-Spaltstellen und den asparaginverbundenen Glykosylierungsstellen gezeigt. Die zweckdienlichen Restriktions-Spaltstellen sind unter den Nukleotid-Sequenzen angegeben.
Fig. 2: die die Figuren 2 A und 2 B enthält, zeigt die Strukturen der rekombinanten Plasmide p1614 und p1774. Das Plasmid p1774 enthält die vollständige codierende Sequenz des LAV-env-Gens. Das Plasmid wurde in zwei Stufen konstruiert: (a) das 2686 bp Kpnl-Fragment des LAV-env-Gens wurde aus p1614 isoliert und in die Kpnl-Spaltstelle von pUC18 cloniert, so daß die Smal-Spaltstelle von pUC18 stromaufwärts von der env-Gensequenz war; (b) das synthetische 121 bp Oligomer wurde mit stumpfen Enden in die Smal-Spaltstelle ligiert. Die Pfeile geben die Polarität der codierenden Sequenzen an. Entsprechende Restriktions-Spaltstellen sind angegeben. Die Nukleotid-Sequenz der für die Erfindung hergestellten synthetischen Oligomere wurde mit einem „Pharmacia Gene Assembler", basierend auf der vorhergesagten Aminosäure-Sequenz des LAV-Bereichs konstruiert, wobei die bevorzugte Codon-Benutzung des Polyhedrin-Gens benutzt wurde.
Fig.3: die die Figuren 3A, 3B und 3C enthält, zeigt die Strukturen der Insertions-Vektoren. Die Insertions-Vektoren MGS-3,
MGS-3 + 2, MGS-4 und MGS-5 werden zusammen mit den entsprechenden Restriktions-Spaltstellen und der Nukleotid-Sequenz gezeigt. Die Polarität der Promotor-Sequenzen ist von links nach rechts.
Fig. 4: zeigt die vorhergesagte Sekundär-Struktur und die Hydrophilie-Muster des Voi läuferö gp160, wie sie durch Computeranalyse mit dem Programm von Chow und Fastman erhalten werden (Biochemistry 13 [19741, S. 222).
Fig. 5: zeigt Wege zur Konstruktion der rekombinaten Vektoren. Die hier gezeigten Plasmide werden beschrieben oder sind mit einem Buchstaben (z. B. A) bezeichnet, der den in den Tabellen 1 und 2 beschriebenen Konstrukten entspricht.
Nachstehend werden Beispiele für besondere Ausführungsformen von Arten der erfindungsgemäß hergestellten Polypeptide
angegeben.
AIDS-Virus-env-Protein, exprimiert von einem rekombinanten Insekten-Virus; AIDS-Virus-env-Protein, exprimiert von einem rekombinanten Insekten-Baculovirus; AIDS-Virus-env-Protein, exprimiert in rekombinanten, infizierten Zellen; AIDS-Virus-env-Protein, exprimiert in rekombinanten, infizierten Insekten-Zellen;
AIDS-Virus-env gp 160-Protein; AIDS-Virua-env gp 120-Protein; AIDS-Virus-env gp 41 -Protein;
lmmunogenes Fragment eines AIDS-Virus-env-Proteine;
AIDS-Virus-env-Protein, eingebaut in oder gebunden an ein Substrat oder einen Träger; AIDS-Virus-env-Protein, eingebaut in oder gebunden an einem Film;
AIDS-Virus-env-Proteln, eingebaut in oder gebunden an einem transparenten Substrat oder Träger; AIDS-Polypeptid, gebunden an ein festes Substrat aus Polystyrol, das gegebenenfalls als Mikrotiterplatte mit mehreren Bohrungen ausgebildet ist;
AIDS-Viru3-env-Protein, oingebaut in oder gebunden an einen Nitrocellulosefilm oder eine Nitrocellulose-Membran; immunogenes Fragment eines AIDS-Virus-env-Pi oteins, eingebaut in oder gebunden an ein festes Substrat oder einen Träger; AIDS-Virus-Protein, Mantel und Korn, exprimiert in Insektenzellen; AIDS-Virus-gag-Protein, exprimiert durch ein rekombinantes Insektenvirus; und AIDS-Virus-pol-Protein, exprimiert durch ein rekombinantes Insektenvirus.
Das Baculovirus-Expressionssystem bietet eine attraktive und entwicklungsfähige Gelegenheit zur Herstellung eines wirksamen HIV-Mantel-lmmu'nogens.
Baculoviren lassen sich als hochwirksame eurkaryontische Clonierungs- und Expressions-Vektoren zur Herstellung rekombinanter Proteine in gezüchteten Insektenzellen verwenden.
Baculoviren weisen mehr als die notwendigen Voraussetzungen zur Verwendung als eukaryontische Clonierungs- und Expressions-Vektoren auf. Baculoviren sind sicher, da sie einen engen Wirtsbereich haben, der auf Arthropoden beschränkt ist; sie sind in der Lage, sehr große Mengen exogener DNA zu beherbergen; ihre Zellkultursysteme sind sicher, nicht transformiert und effizient; und sio besitzen den hochwirksamen Polyhedrin-Promotor, der aktiver ist als alle anderen in Virusinfizierten eukarvontischen Zellen bekannten Promotoren.
Das Baculovirensystem bietet außerdem große Vorteile bei der Herstellung von Polypeptiden zur Verwendung in diagnostischen Verfahren. Viele Menschen und Tiere besitzen im allgemeinen Antikörper, die mit bakteriellen Antigpr «n, mit Hefe-Antigenen und mit heterologen Histokompatibilitäts-Antigenen reagieren. Das Vorliegen dieser Antikörper, irn.indert die Zuverlässigkeit diagnostischer Verfahren wegen falsch positiver Reaktionen mit kontaminierenden Bakterien-! .-oteinen, Hefe- und Säuger-Proteinen, die in von den entsprechenden Expressions-Systemen hergestellten Präparaten vorgefunden werden. Menschen und Tiere haben höchstwahrscheinlich keine Vorgeschichte der immunologischen Aussetzung gegen Lepidoptera-Zellen oder Baculovirus-Antigene. Es ist deshalb wahrscheinlicher, daß die in diesem System zur Herstellung rekombinanter Proteine verwendeten Lepidoptera-Zellen und das Baculovirus nicht das Problem kontaminierender Antigene aufweisen, die von üblicherweise in Menschen oder Tieren gegenwärtigen Antikörpern erkannt werden. Daher ist es unwahrscheinlich, daß Lepidoptera-Zellen oder Baculovirus bedingte Kontaminationen zu falsch positiven Reaktionen in Diagnose-Verfahren führen, in denen die in diesem System hergestellten rekombinanten Antigene verwendet werden.
In einer Ausführungsform der Erfindung wurde das Baculovirus AutographacalifornicaKeinpolyhedrosis-Virus (AcMNPV) verwondet. Die zur Expression verwendete Promotor-Sequenz ist die des von diesem Virus abgeleiteten Polyhedrin (occ)-Gens. AcMNPV und rekombinante Virus-Stämme wurden in Spodoptera frugiperda (Heerwurm)-Zellen gehalten. Die Rekombinante wurde so konstruiert, daß das Pn-Gen deletiert wurde. Damit wird das rekombinante Virus occ". Dies gestattet eine einfache Identifizierung rekombinanter Viren anhand der Plaque-Morphologie. Wenn es einmal isoliert ist, kann ein rekombinantes Baculovirus zur Infektion beliebiger permissiver oder semipermissiver bzw. susceptibler Zellpopulationen verwendet werden, die als kultivierte Zellinie oder als Teil eines ganzen Insekts gehalten wird.
Ausfuhrungsbeispiele Beispiel 1 Konstruktion von Insertlons-Vektoren
Für die Clonierung und Expression einer für ein Fremdprotein codierenden Sequenz in einem Baculovirus-Vektor ist es erforderlich, daß die codierende Sequenz mit dem Polyhedrin-Promotor und E'-Sequenzen und auf der anderen Seite mit verkürzten codierenden Sequenzen des Polyhedrins so ausgerichtet wird, daß die homologe Rp' ombination mit dem Baculovirus-Genom zum Transfer der mit dem Polyhedrin-Promotor und einem inaktiven PoIyI, jdrin-Gen ausgerichteten, fromden, codierenden Sequenz führt.
Dementsprechend wird eine Reihe von Insertions-Vektoren zur Verwendung bei AIDSönv-Gen-Konstruktionen entworfen. Jeder nachfolgend beschriebene Insortions-Vektor wird so geplant, daß er das ATG-Tran slations-Startcodon liefert. Die Insertion fremder Sequenzen in diese Vektoren muß so durchgeführt werden, daß der durch das Startcodon festgelegte Translations-Rahmen durch die fremden Sequenzen in richtiger Weise beibehalten wird.
Der Insertions-Vektor MGS-1 wird aus einem EcoRI-l-Restriktionsfragment-DNA-Clon konstruiert, der aus einem Plaquegereinigten AcMNPV-lsolat isoliert wurde.
Der Insertions-Vektor MGS-1 weist die folgenden Strukturmerkmale auf (vgl. Fig.3): 4000bp Sequenz stromaufwärts vom ATG-Startcodon des Polyhedrin-Gens; ein durch gezielte Mutagenese (site directed mutagenesis) eingeführter Polylinker, der aus einem ATG-Startcodon und den Restriktions-Spaltstellen Smal und Kpnl besteht; 1700 bp Sequenz, die sich von der Kpnl-Restriktions-Spaltstelle (die innerhalb des Polyhedrin-Gens liegt) bis zur terminalen EcoHI-Restriktions-Spaltstelle des EcoRI-l-Clons erstrecken.
Der Insertions-Vektor MGS-3 ist identisch mit MGS-1, mit der Ausnahme, daß der Polylinker aus den Restriktions-Spaltstellen Smal, Kpnl, BgIII und einem universellen Stopcodon-Segment besteht.
Der Insertions-Vektor MGS-3 + 2 ist identisch mit MGS-3, mit der Ausnahme, daß er zwei zusätzliche Cytosin-Reste an Position +3 von MGS-3 und einen Guanosin-Rest weniger an Position +4 von MGS-3 aufweist. Das Endergebnis ist eine Verschiebung des Codon-Rahmens um ein Nukleotid gegenüber MGS-3.
Der Insertions-Vektor MGS-4 enthält dieselben Struktur-Merkmale wie MGS-3, mit der Ausnahme, daß er mit einem synthetischen Polylinker konstruiert ist, der Sequenzen enthält, die für die ersten zehn Aminosäuren des N-terminalen Bereichs des Polyhedrin-Gene codieren, auf die die Restriktions-Spaltstellen für Smal, Kpnl, BgIII und ein universelles Stopcodon-Segment folgen. Dieser Vektor wird auf Grundlage der Beobachtung konstruiert, daß sich gesteigerte Expressions-Raten erhalten lassen, wenn die ersten 14 Aminosäure-Codons des N-Terminus des Polyhedrin-Gens mit dem N-Terminus des fremden Gens verbunden werden (Smith et al., 1983).
Der Insertlons-Vektor MGS-5 enthält dieselben Strukturmerkmale, wie MGS-3, mit der Ausnahme, daß er mit einem synthetischen Polylinker konstruiert ist, der für das spaltbare Slgnal-Poptid von IL-2 codierende Sequenzen enthält, gefolgt von Restriktions-Spaltstellen für EcoRI, Kpnl, BgIII und einem universellen Stopcodon-Segment, Dieser Vektor wird verwendet, um interne HIV-env-Seqi_enzen mit binar Signalpeptid-Sequenz zu liefern, die bekanntlich in Insekten-Zellen wirksam erkannt und entfernt wird (Smith et al., 1985).
Beispiel 2 Konstruktion rekombinanter Baculovlren, die LAV-codlerende Sequenzen enthalten
Es wird ein als NA:2 bezeichnetes rekombinantes Plasmid verwendet, dies besteht aus einem 21,8 kb-Segment eines vollständigen AIDS-Provirus, das in pUC18 inseriert ist. Berichten zufolge ist dieser Clon infektiös, da er nach der Transfektion bestimmtor menschlicher Zeilen Viren bilden kann. Die vollständigen in NA-2 enthaltenen Mantel-Gen-Sequenzen werden von dem LAV-Stamm von HIV abgeleitet (Barre-Sinoussi et al., 1983).
Das Mantel-Gen von LAV enthält ein mit einem Met-Codon beginnendes und für 861 Aminosäuren codierendes offenes Leseraster (Wain-Hobson et al., 1985). Der HTLV-Ill-BHIO-Stamm enthält 856 Codons (Starich et al., 1986). Die Signalpeptid-Sequenz besteht aus 30 Aminosäuren (von denen sich zwei von BHIO unterscheiden); der extrazelMäre bereich besteht aus 486 Aminosäuren (von denen sich 14 von BHIO unterscheiden); und der Transmembran-Bereich besteht aus 345 Aminosäuren (von denen sich 5 von BHIO unterscheiden). Fig. 1 zeigt die Nukleotid- und die davon abgeleiteten Aminosäure-Sequenzen des LAV-env-Gens, das bei dieson Experimenten verwendet wird. Die Aminosäure-Reste sind beginnend mit dem vermuteten Mot-Startcodon durchnumeriert. Hier genannte Aminosäure-Reste entsprechen den in Fig. 1 angegebenen Nummern.
Zusätzlich zum vollständigen gp160 Polypeptid wird eine Reihe von Domänen des HIV-env-Gens exprimiert. Dies wird aus verschiedenen Gründen durchgeführt, beispielsweise der Proteinstruktur und der bekannten Heterogcnität von AIDS-Retrovirus-Isolaten (Bonn et al., 1985; Hahn et al., 1985). Es wird ein Computerprogramm verwendet, das die'Sekundärstruktur von Proteinen zusammen mit den Hydrophilie-Werten berechnen kann (Chow und Fastman, 1984). Die in Fig. 4 gezeigte Analyse ergibt mehrere hydrophile Domänen, die Beta-Windungen enthalten. Es wurde bereits gezeigt, daß solche Domänen mit antigenen Epitopen und struktureller Positionierung in Zusammenhang stehen (Westhoff et al., 1984). Aufgrund dieser Ergebnisse und des Vorliegens bequemer Restriktions-Spaltstellen wird eine Reihe C-terminaler, verkürzter Formen des in Fig.4 angegebenen Mantel-Proteins exprimiert. Der Vorteil solcher Konstruktionen ist, daß damit progressive Delotionen erhalten werden, die mit der C-terminalen, hydrophoben Domäne beginnen. Außerdem werden die von gp41-codierenden Sequenzen überstrichenen Bereiche exprimiert. Mindestens zwei immundominante Epitope sind in den zu exprimierenden Bereichen enthalten. Für diese Konstrukte wird ein Vektor geschaffen, der die spaltbare Signalsequenz von IL-2 enthält. Es wurde kürzlich gezeigt, daß das IL-2-Signalpeptid ein korrektes zelluläres Prozessieren des IL-2-Gens verursacht, das von einem rekombinanten Baculovirus-Genom in infizierten Zellen exprimiert wird (Smith et al., 1985).
Die für die Expression von HlV-env-Sequenzen entworfene Clonierungs-Strategie ist in Fig. 5 dargestellt. Das Mantel-Gen wird zuerst als 3846 bp EcoRI/Sacl-Restriktions-Fragment aus NA-2 isoliert und in der EcoRI/Sacl-Restriktions-Spcltstelle von pUC19 cloniert. Das erhaltene Plasmid wird als p708 bezeichnet. Anschließend wird das Mantel-Gen wieder als 2 800 bp Kpnl-Restriktions-Fragment isoliert und in der Kpnl-Restriktions-Spaltstelle von pUC18 cloniert. Der erhaltene Clon wird als p1614 (vgl. Fig. 2A) bezeichnet. Dieses Kpnl-Restriktions-Fragment enthält ein leicht verkürztes Stück des Mantel-Gens, so daß 121 bp der dem N-Terminus entsprechenden Sequenz fehlen. Dieser fehlende Bereich des Gens, der die Signalpeptid-Sequenzen enthält, wird durch die Insertion eines doppelsträngigen, synthetischen Oligomers ersetzt, da? ausgehend von der LAV-Aminosäure-Sequenze entworfen wurde, wobei die bevorzugte Polyhedrin-Gen-Codonnutzung angewendet wird. Um weitere Manipulationen zu erleichtern, wird gleichzeitig damit eine neue Smal-Restriktionssequonz anstelle des ATG-Startcodons eingefügt. Das ATG-Startcodon wird dann vom Insertions-Vektor geliefert. Das so erhaltene Plasmid wird als p1774 bezeichnet. Es ist in Fig.2 B abgebildet.
Restriktions-Fragmente von p1774, die die Codon-Sequanzen verschiedener Domänen des AIDS-Mantel-Proteins enthalten, werden in den MGS-Vektoren so cloniert, daß das ATG-Startcodon des Insertions-Vektors im Leseraster mit den Codons des Mantel-Gens ist. Die folgenden Konstrukte werden hergestellt (vgl. Fig. 5).
A. gp160 wird in voller Länge als Smal/partiell gespaltenes Kpnl-Fragment in die Smal-Spaltstelle von MGS-3 cloniert. Dieser Clon enthält alle codierenden Sequenzen von gp160 und benutzt sein natürliches Translations-Stopcodon.
A1. gp160 wird in voller Länge als Smal/partiell gespaltenes Kpnl-Fragment in die Smal/Kpnl-Spaltstelle von MGS-4 cloniert. Dieser Clon enthält alle codierenden Sequenzen von gp160 und benutzt sein natürliches Translations-Stopcodon.
B. Verkürztes gp'i60 wird als Smal/BamHI-Restriktions-Fragment in die Smal/Bglll-Spaltstelle von MGS-3 cloniert. Dieser Clon enthält Sequenzen, die für die Aminosäuren 1 bis 757 von gp160 codieren und benutzt ein vom MGS-3-Vektor zur Verfügung gestelltes Stopcodon.
B1. Verkürztes gp160 wird als Smal/BamHI-Restriktions-Fragment in die Smal/Bglll-Spaltstelle von MGS-4 cloniert. Dieser Clon enthält Sequenzen, die für die Aminosäuren 1 bis 757 von gp160 codieren und benutzt ein vom MGS-4-Vektor geliefertes Stopcodon.
C. Verkürztes gp160 wird als Smal/aufgefülltes Hindlll-Restriktions-Fragment in die Smal-Spaltstelle von MGS-3 cloniert. Dieser Clon enthält Sequenzen, die für die Aminosäuren 1 bis 645 von gp160 codieren und benutzt ein vom MGS-3-Vektor bereitgestelltes Stopcodon.
D. gp120 wird in voller Länge als Smal/partialgespaltenes Gglll-Restriktions-Fragment cloniert, an das ein synthetischer DNA-Linker an der BGIII-Spaltstelle angehängt wurde, um die Sequenzen von der Bglll-Spaltstelle (bei Aminosäure-Codon 472)
bis zum letzten C-terminalen Codon von yp120 aufzufüllen. Dieser Clon enthält Sequonzzen, die die Aminosäuren 1 bis 51 β codieren. Dies ist die vollständig für gp120 codierende Sequenz. Ds3 Translations-Stopcodon befindet sich bei einem vom MGS-3-Vektor gelieferten TAA.
E. Verkürztes gp120 wird als Sma l/partiell gespaltenes BgI Il-Restriktions-Fragment in die Sma I/Bgl Il-Restriktions-Spaltstelle von MGS-3 cloniert.
F. Verkürztes gp120 wird als Sma I/Bgl Il-Restriktions-Fragment in die Sma I/Bgl Il-Spaltstelle von MGS-3 cloniort. Dieser Clon enthält Sequenzen, die die Aminosäuren 1 bis 279 codieren und benutzt ein vom Vektor MGS-3 geliefertes Stopcodon.
G. Verkürztes gp120 wird als Smal/Dral-Restriktions-Fragment in die Smal-Spaltstelle von MGS-3 cloniort. Dieser Clon enthält Sequenzon, die für die Aminosäuren 1 bis 129 codieren und benutzt ein vom Vektor MGS-3 geliefertes Stopcodon. H. HBsAG-< odierende Sequenzen werden in das oben beschriebene Smal/Dral-Konstrukt als BamHI-Fragment in die stromabwärts auf dem Vektor gelegene BgI Il-Spaltstelle eingebaut. Dieser Clon enthält Sequenzen, die für die ersten 129 N-terminalon Aminosäuren von gp120 codieren, gefolgt im l.eseraster von Sequenzen, die das HBsAg codieren.
!. gp41 wird als BgI Il-Restriktions-Fragment in die BgI Il-Spaltstelle von MGS-3 cloniert. Dieser Clon enthält Sequenzen, die für die Aminosäure 472 bis zum C-Terminus von gp160 codieren.
J. gp41 wird als aus P3156 isoliertes Smal/Kpnl-Fragment in die vorbereitete EcoRI-Spaltstelle und die Kpnl-Spaltstelle des Vektors MGS-5 cloniert. Dieser Clon enthält Sequenzen, die für das Signalpeptid von IL-2 codieren und mit Sequenzen verbunden sind, die für Aminosäure 473 bis zum C-Terminus von gp160 codioren.
K. Verkürztes gp41 wird als BGI ll/BamH I-Fragment in die BgI Il-Spaltstelle von MGS-3 cloniert. Dieser Clon enthält Sequenzen, die für die Aminosäuren 472 bis 757 von gp160 codieren und benutzt das vom Vektor MGS-3 gelieferte Stopcodon.
L. Verkürztes gp41 wird als aus p3160 isoliertes Kpnl/BamHI-Fragment in die Kpnl/BamHI-Spaltstelle von pMGS-5 cloniert.
Dieser Clon enthält Sequenzen, die für das Signalpeptid von IL-2 codieren und mit Sequenzen verbunden sind, die für die
Aminosäuren 472 bis 7F7 von gp160 codieren.
Beispiel 3 Herstellung und Selektion rekomblnanter Baculovlren
Die rekombinanten HIV-env-Gen-Plasmide werden zusammen mit AcMNPV mit Calciumphosphat gefällt und nichtinfizierte Spodopiera frugiperda-Zellen werden mit dem Präzipitat versetzt. Die Chimären Gene werden sodann durch homologe Rekombination in das AcMNPV-Genom inseriert. Rekombinante Viren werden anhand der occ~-Plaquemorphologie identifiziert.
Solche Plaques weisen einen identifizierbaren cytopathischen Effekt, jedoch keine Kerneinschlüsse auf. Nacheinander werden zwei weitere Plaque-Reinigungen ausgeführt, um das rekombinante Virus zu erhalten. Die Insertion der HlV-env-Sequenzen an einer spezifischen Stelle der rekombinanten Virus-DNA wird durch Vergleich ihrer Restriktions- und Hybridisierungs-Merkmale
mit Wildtyp-Virus-DNA untersucht.
Beispiel 4
Expression von HlV-env ausgehend von rekombinanten Baculovlren In Infizierton Insekten-Zellen Die Expression von HlV-env-Sequenzen durch die rekombinanten Viren in Insektenzellen sollte zur Synthese primärer Translätions-Hrodukte als prä-pro-Proteine führen, die alle codierten Aminosäuren ab dem stromabwärts vom Polyhedrin-Promotor gelegenen ATG-Startcodon des Expressions-Vektors enthalten. Diese primären Produkte bestehen aus Aminosäuren, die ausgehend von den vom rekombinanten Vektor gelieferten Codons translatiert werden. Beispielsweise sollte das primäre Translations-Produkt des Konstrukts A am N-Terminus die Sequenz Met-Pro-Gly-Arg-Val aufweisen. Die Met-Pro-Gly-Codons werden als Ergebnis der Clonierungsstrategie geliefert.
Durch zwei potentielle Prozessierungsstellen für die Spaltung des env-Vorläufer-Glykoproteins würden erstens 30 Aminosäurereste des Signalpeptlds am N-Terminus entfernt werden, und zweitens würde ein großes Transmembranorotein entstehen, das 345 Aminosäuren und einen extrazellulären Anteil mit 486 Aminosäuren enthält. Es wird allgemein davon ausgegangen, daß Erkennung und Spaltung des Signalpeptids zur wirksamen Prozessierung durch die Zelle erforderlich sind.
Zur Bestimmung der Expression von HIV-env-Gen-Sequenzen durch rekombinante Baculoviren werden Insektenzellkulturen mit jedem der verschiedenen rekombinanten Viren infiziert, in Spätstadien der Infektion in Gegenwart von 35S-Methionin, 35S-Cystin oder 3H-Mannose. Markierte Zellextrakte werden durch SDS-Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese (PAGE) und Autoradiographie
sichtbar gemacht.
Zur Auswertung der Richtigkeit der in den mit rekombinanten HIV-Baculoviren infizierten Insektenzellen hergestellten rekombinanten Proteine werden drei Serumtypen verwendet:
1. HIV-positive menschliche Seren, die vom Center for Disease Control (CDC, Atlanta," Georgia) als HIV-positive Standardkontrolle bereitgestellt wurden;
2. HIV-negative menschliche Seren, die ebenso von CDC als HIV-negative Standardkontrolle bereitgestellt wurden; und
3. Polyclonale Ziegen-Antikörper, die gegen gereinigtes gp120-Mantel-Protein gerichtet sind, das aus gereinigten, infektiösen HTLV-Ill-Viren hergestellt wurde.
Die Ergebnisse sind in den Tabellen I und Il zusammengefaßt:
Tabelle I
IsolatNr.
Kontrollen uninf. Sf Zellen wt inf. Sf Zellen Rekombinante Vektoren
Beschreibung
HlV-neg
Serum HIV-pos
gp120-pos
Fortsetzung von Tabelle I
Isolat Nr. Beschreibung Hl·
A. 2863 vollst. gp160 _
1-861
A1.3715 nd
B. 3046 verkürztes gp160
1-757 -
B1.3540 nd
C.3774 verkürztes gp160 nd
1-645
D. 4646 gp120,1-516 nd
E. 2040 verkürztes gp120 -
1-472
F.2165 verkürztes gp120 -
1-279
G. 2196 verkürztes gp120 -
1-129
H. 3076 Aminosäure 1-129 nd
in Fusion mit HBsAg
1.3156 gp41,472-861 -
J. 4585 IL-2Signal/gp41 nd
K. 3166 verkürztes gp41 -
472-757
L IL-2 Signal/verkürztes -
gp41
nd: nicht bestimmt
Serum
HIV-pos
gp120-pos
nd
nd nd
nd
nd
nd
Tabelle Il
Zusammenfassung von Isolat, vorhergesagter und beobachteter Ergebnisse
Konstrukt/ Mantel- Vorhergesagte Größe2 Glykosyliert Beobach
Isolat Nr. Aminosäuren1 Nichtglykosyliert 160000 tete Große
A. 2863 vollst. gp160 93200 120000 160000
1-861 56000 41000 120000
37000 wieinA 41000
A1.3715 wieinA 150000 wieinA
B. 3046 verkürztes gp160 82003 120000 150000
1-757 56000 30000 120000
26000 wie in B 30000
B1.3540 wie in B 130000 wie in B
C.3774 verkürztesgp160 69000 120000
1-645 56000 18000
14000 120000
D. 4646 gp120,1-516 56000 110000 n.d.
E. 2040 verkürztes gp120 51000 110000
1-472 60000 90000
F.2165 verkürztes gp120 30000 60000
1-279 15000
G.2196 verkürztes gp120 12000 15000
1-129 40000
H. 3076 Aminosäure 1-129 35000
in Fusion mit
HBsAg 46000
1.3156 gp41,472-861 42000 46000
J.4585 IL-2-Signal/ 42000 n.d.
gp41 33000
Κ.3Ϊ66 verkürztes gp41 30000 n.d.
472-757 33000
L. IL-2-Signal/ 30000 n.d.
verkürztes gp41
1: Aminosäurereste, die im nicht-prozessierten prä-pro-Genprodukt vorhergesagt wurden und von der Nukleotid-Sequenz bestimmt wurden. 2: Geschätzt entsprechend den vorliegenden Aminosäureresten, und vorhergesagten prozessierten Formen. 3: Hauptimmunreaktive Polypeptide, n.d.: nicht bestimmt
Die rokombinanten gp160-Proteine werden erfolgreich In typischen diagnostischen Tests, wie ELISA und Radioimmunpräzipitation zusätzlich zu Western-Blot-Analysen eingesetzt.
Pdlsplel 5
Reinigung von HIV-Mantel-Piotelnen
Rekomblnante HIV-Mantel-Protelne werden in S. frugiperda-Zellen with rend 4 bis 5 Tagen nach der Infektion mit einem rekombinanten HIV-AcNPV-Virus hergestellt. Die Mehrzahl der exprimierien Proteine ist mit den infizierten Zellen assoziiert. Da alle hier beschriebenen HIV-Genprodukte ähnliche Eigenschaften aufweisen, d. h., sie sind vorwiegend zeilassoziiert, und sie sind Glycoproteine, läßt sich ein und dasselbe Reinigungsverfahren für alle hier beschriebenen HIV-Mantel-Genprodukte oder ähnliche Konstrukte verwenden. Im folgenden wird das Verfahren beispielhaft anhand der Reinigung des vom Expressionsvektor Ac3046 hergestellten rekombinanten gp160-Proteins erläutert.
S. frugiperda-Zellen werden mit dem rekombinanten Vektor Ac3046 infiziert. 4 bis 5 Tage nach der Infektion werden die Zellen gesammelt und das Zellkulturmedium wird durch Waschen entfernt. Die Zellen werden zuerst nach Standardverfahren in Kern· und Cytoplasmamembran-Fraktionen getrennt. Die Glykoprotein-Fraktion enthält das gp160-Protein. Sie wird gelöst, und die Glykoproteine werden in an sich bekannter Weise du roh eine Lentil-Lectin-Affinitätschromatographie gereinigt. Die Glykoprotein-Fraktion enthält das gp160-Protein. In diesem Stadium stellt das pg160-Protein 25 bis 50% der gesamten Glykoprotein-Fraktion dar. Dies ergibt sich aus der SDS-Polyacrylamid-Gel-Analyse. Zur weiteren Reinigung von gp160 wird die Glykoprotein-Fraktion an einer Molekularsieb-Flüssigkeitschromatographie-Säulo gereinigt. Das gp160-Protein eluiert von der Säule als Hochmolekulargewichtsfraktion. Das gp160-Protein bildet etwa 90% des Gesamtproteins in der Hochmolekularfraktion.
Interessant ist im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung die Veröffentlichung mit dem Titel „AIDS Virus Env Protein Expressed from a Recombinant Vaccinia Virus" von M. P. Kieny et al., Bio/Technology 4 (September 1986), Seiten 790-795. In dieser Veröffentlichung wird beschrieben, wie die codierende Sequenz des env-Proteins von LAV in einen Vaccinia-Virus-Vektor eingebaut wird. Das erhaltene rekombinante Lebendvirus WTGeLAV bewirkt sodann die Bildung von env-Protein in infizierten Säugerzellen. Dieses rekombinante Protein reagiert mit Seren von AIDS-Patienten und wird anscheinend genau wie das echte env-Protein des LAV-Retrovirus prozessiert und glykosyliert. Außerdem ruft die Inokulation von Mäusen mit WTGeLAV Antiseren mit hohen Titern hervor, die Vaccinia-Determinanten erkennen, jedoch nur mit niedrigen Antikörper-Titern, die die env-Proteine von LAV erkennen. Mit diesem rakombinanten Virus infizierte Zellen sezernieren rasch die prozessierte Form des «mv-Proteins in das Kulturmedium. Diese Möglichkeit zur Herstellung und Benutzung des env-Proteins, beispielsweise in einem Impfstoff, zur Erzeugung einer Immunantwort gegen das LAV- oder HIV-Virus, ist nicht völlig zufriedenstellend, insbesondere wegen der Verwendung des Vaccinia-Virus als Vektor.
Von weiterem Interesse im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung sir d der Artikel „Production of Human Beta Interferon in Insect Cells Infected with Baculovirus Expression Vector" von G. E. Smith et al., Molecular and Cellular Biology, 3, Nr. 12 (Dezember 1983), Seiten 183-192; und die Veröffentlichung „Strong and Regulated Expression of Escherichia coli Beta? Galactosidase in Insect Cells with a Baculovirus Vector" von G. D. Pennock et al., Molecular and Cellular Biology, 4, Nr. 3 (März 1984), Seiten 399-406. Von weiterem Interesse ist die gleichzeitig anhängige und übertragene, am 18. Dezember 1985 eingereichte Patentanmeldung mit der Seriennummer 810938. Außerdem sind die EP-A-0127839 (veröffentlicht am 12. Dezember 1984) und die EP-A-0155474 (veröffentlichtem 25. September 1985) von Interesse im Hinblick auf die vorliegende Erfindung. Auf den Offenbarungsgehalt dieser Veröffentlichungen und dieser Offonlegungsschriften und der Patentanmeldung wird hiermit Bezug genommen.
Da AIDS (Human Acquired Immune Deficiency Syndrome) in den USA, Zentralafrika, Europa und in anderen Gebieten der Erde epidemisch ist, ist die vorliegende Erfindung von großer Bedeutung. Wie bereits ausgeführt, ist das verursachende Agens dieser Krankheit (AIDS) ein als menschliches Immundefizienz-Virus (HIV) bezeichnetes Retrovirus, das bisweilen auch als Lymphadenopathie-Virus (LAV), menschliches T-Zell-Leukämie-Virus-Typ III (HTLV-III) oder AIDS-verwandtes Virus (ARV) bezeichnet wird. Die Struktur- und Genorganisation mehrerer AIDS-Viren wurde aus der vollständigen Nukleotid-Sequenz molekularer Clone und durch direkte Sequenzierung viraler Proteine aufgeklärt. Das HIV-Mantel-Gen (env) codiert ein Glykoprotein mit einem Molekulargewicht von 160000 und wird als gp160 bezeichnet. In mit dem Virus infizierten Zellen wird der gp160-Vorläufer an einer konservierten Sequenzz basischer Aminosäuren gespalten. Dabei entstehen ein N-terminales Glykoprotain gp120 und ein kleineres C-terminales Protein gp41. Die HIV-Glykoproteine gp160, gp120 bzw. gp41 enthalten etwa 833,488 und 345 Aminosäuren.
Das reife gp120 ist mit dem Virusmantel assoziiert. Man nimmt an, daß es ein externes Protein ist, während gp41 zwei lange Bereiche hydrophober Reste aufweist, von denen einer oder beide durch den Virusmantel hindurchreichen können. Der gp160-Vorläufer und die reifen gp120- und gp41 -Proteine werden durch Antiseren bei den meisten exponierten Individuen nachgewiesen. Außerdem wurde gezeigt, daß das gp120-Protein an das T4-Molekül der Zelloberfläche von Helfer/Induktor-T-Lymphocyten bindet und daß das HIV-gp160-Protein in der Lage ist, eine Syncytium-Bindung mit Zellenn zu induzieren, die das T4-Rezeptor-Protein exprimieren. Es ist ferner bekannt, daß die 104 carboxyterminalen Aminosäuren von gp160 nicht zur Fusion von T4+ T-Lymphocyten erforderlich sind.
Erfindungsgemäß wird das AIDS-Virus-Mantel-Glykoprotein gp160 von HIV von einem AIDS-Virus-env-Gen exprimiert, das aus einem infektiösen HlV-lsolat cloniert wurde. Das für die Expression verwendete HIV-env-Gen codiert lediglich für die im natürlichen HIV-env-Gen vorgefundenen Sequenzen. Das HIV-env-Gen wird in ein rekombinantes Baculovirus inseriert, so daß die Expression eines reifen Proteins erfolgt, das keine veränderten oder zusätzlichen Aminosäuren enthält. Von den verschiedenen hergestellten Rekombinanten enthält eine das vollständige HIV-env-Gen und eine andere ist bis auf eine kleine Deietion in der Sequenz von etwa 100 Aminosäuren am C-Termiiius von gp160 vollständig. Die Deletion wird durchgeführt, um die Stabilisierung des exprimierten rekombinanten Proteins gp160 zu unterstützen. Dadurch werden jedoch die zwei in gp41 vorkommenden hydrophoben Domänen nicht entfernt.
Das HIV-gp160 wird, wie nachstehend beschrieben, in einem Insekten-Zell-Expressions-System hergestellt und ist, wie bereits vorstehend erläutert, frei von Kontaminationen durch Säuger-Zell-Proteine. Die Expression und Reinigung des gp160-Proteins wird unter Bedingungen durchgeführt, bei denen die natürliche Protein-Struktur und dessen biologische Aktivität erhalten
bleiben. Das entstehende exprimierte HlV-env-Protein ist hochreaktiv mit Seren von AIDS-Patienten. Dies wird durch Immunpräzipitation, Westem-Blot-Anulyse und durch EUSA-Tests gezeigt.
Das erfindungsgemäße HIV-gp160-Protein wird in unterschiedlicher Menge, Reinheit und Form hergestellt, beispielsweise in einem sterilen wäßrigen Puffer mit einer Konzentration von etwa 100 Mlkrogramm Mantel-Protein pro Milliliter bei einer Reinheit von mehr als 50%, bestimmt durch SDS-Polyacrylamid-FPLC-Analyse. Es wurde gefunden, daß das HIV-gp160-Protein mindestens sechs Wochen bei 40C stabil ist. Dieses Protein wird in Mengen oder Volumina zum einmaligen Gebrauch bereitgestellt und läßt sich zufriedenstellend bei -7O0C lagern. Wiederholtes Einfrieren und Auftauen sollten möglichst vermieden werden. Verdünnungen sollten mit Lösungen durchgeführt werden, die geeignete Proteine oder Detergerzien enthalten, um eine, ι Verlust an Proteinen und biologischer Aktivität zu vermeiden. Geeignete Verdünnungsmittel sind 0,1%iges Rinderserumslbumin (BSA) oder Äquivalente davon, 0,1%iges Serum in sterilem Wasser oder Kulturmedium und 0,1%igos Natriumdodecylsulfat oder andere geeignete Detergenzien in Wasser oder Puffer. Das erfindungsgemäß hergestellte Protein HIV-gp160 läßt sich, wie vorstehend angegoben, verwenden. Es läßt sich in verschiedenen Größen, je nach Gebrauch oder vorgesehener Verwendung, verpacken, beispielsweise in Packungen mit 25 Mikrogramm, 50 Mikrogramm oder 100 Mikrogramm Protein. Das Protein Ist für In-vitro-Untersuchungen und andere Untersuchungen verwendbar, die verschiedene Aspßkte der AIDS-Forschung betreffen. Dazu gehören Impfstoffentwicklung, Anfertigung von Western-Blots, ELISA, Rezeptor-Bindung, Immunpräzipitation, Herstellung von Antiseren, Bildung von Synzytien und andere Verwendungen, einschließlich physikalischer Untersuchungen und die Verwendung als Standardkontrollmaterial.
Die Western-Blot-Analyse ist eine der spezifischsten und sensitivisten Methoden, die es für den Nachweis von AIDS-Antikörpern gibt. Sie wird häufig in verschiedenen Bereichen der AIDS-Forschung angewendet. Dabei lassen sich der gp160-Vorläufor und die reifen Proteine gp120 und gp41 durch Antiseren von AIDS-serumpositiven Individuen nachweisen. Dementsprechend wird in einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung das AIDS-Virus-Mantel- oder env-Protein auf einem geeigneten Substrat aufgebracht, beispielsweise Keramik, Glas, Polystyrol-Plastikplatten, Bohrungen oder Film, wie Nitrozellulose-Membran-Streifen, zur Verwendung in Verbindung mit dem Nachweis von AIDS-Antikörpern.
Besonders im Zusammenhang mit dieser Ausführungsform der Erfindung wird elektrophoretisch getrenntes, rekombinantes AIDS-Mantel-Protein HIV-gp160 auf Nitrozellulose-Membran-Streifen aufgebracht, die beim Western-Blot oder als Blot-Streifen verwendbar sind. Da das HIV-env-gp erfindungsgemäß in einem Insekten-Zell-Expressions-System hergestellt wird, ist es frei von kontaminierenden Säuger-Zell-Proteinen. Es wurde gefunden, daß diese Substanz, aufgebracht auf Nitrozellulose-Streifen zur Verwendung als Western-Blot-Streifen hoch reaktiv mit AIDS-Patienten-Seren ist, und das auf Nitrozellulose-Streifen aufgebrachte HIV-gp160 wurde erfolgreich mit menschlichen AIDS-positiven Seren in Verdünnungen von 1:100 bis zu 1:10000 getestet. Die spezifisch darauf gebundenen Antikörper lassen sich entweder mit enzymgebundenen Reagenzien nachweisen, wie alkalischer Phosphatase oder Peroxidase, mit konjugierten zweiten Antikörpern oder mit spezifischen anti-Antikörpern oder mit radioaktivem Jod markiertem Protein A. Die immunologischen Verfahren zur Western-Blot-Analyse, die bei diesen besonderen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung angewendet werden, d.h. die mit dem HlV-env-Protein imprägnierten Träger oder Blot-Streifen zur Western-Blot-Analyse, sind übliche Verfahren.
Die HIV-gp160-Streifen oder-Träger werden erfindungsgemäß in Einwegschalen in einer geeigneten Anzahl, wie acht Streifen in acht verschiedenen Bohrungen, hergestellt. Alle Inkubationen lassen sich in der Schale durchführen. Es wird ein Deckel mitgeliefert, so daß die Schalen als bequeme Lagerbehälter für die entwickelten Western-Blots oder Untersuchungsergebnisse verwendet werden können. Jeder dieser Streifen wird orfindungsgemäß mit rekombinantem HIV-gp160-Mantel-Protein imprägniert, das durch Elektrophorese auf eini m 10%igen SDS-Polyacrylamid-Gel aufgetrennt und sodann elektrophoretisch auf Nitrozellulose-Membran oder -Streifen odei Träger übertragen wird. Das erhaltene Produkt eignet sich zum Nachweis von anti-AIDS-Mantel-Antikörpern in vitro, zur Untersuchung von Tiermaterial, von Zellen oder Gewebekulturen, im Zusammenhang mit verschiedenen Aspekten der AIDS-Forschung, einschließlich Western-Blot zum Nachweis von AIDS-Antikörpern, und für Qualitätskontrolle, Absuchen von Blutbanken und für die Diagnose von AIDS. Es wurde gefunden, daß die Nitrozellulose-Membran-Träger oder -Streifen mindestens sechs Wochen bei Raumtemperatur stabil sind und sich beispielsweise in den Schalen an einem kühlen, trockenen Platz gut lagern lassen.
Die HIV-gp160-ELISA-Platten werden erfindungsgemäß in Einwegschalen mit einer geeigneten Anzahl, beispielsweise mit 96 verschiedenen Bohrungen hergestellt. Alle Inkubationen werden in den Schalen durchgeführt. In jede Bohrung wird eine geeignete Menge HIV-gp160 gegeben, beispielsweise 100 Mikroliter gereinigtes HIV-gp160 mit einer Konzentration von 1 Mikrogramm HIV-gp160 pro Milliliter. Das HIV-gp160-Proteir wird an das Plastik in der Bohrung ausreichend lange angelagert, beispielsweise über Nacht bei 40C. Die hintsrbleibende Lösung wird dann aus jeder Bohrung der ELISA-Platte entfernt, und die ELISA-Platten werden bei Raumtemperatur getrocknet. Die erhaltenen Platten mit dem auf die Bohrungen aufgebrachten HIV-gp160 sind mindestens sechs Wochen bei Raumtemperatur stabil und lassen sich beispielsweise in Schalen an einem kühlen, trockenen Platz gut lagern. Das erhaltene Produkt ist zum Nachweis von AIDS-Mantel-Antikörpern oder -Antigenen bei Untersuchungen von Tieren und Zeil- oder Gewebekulturen im Rahmen verschiedener Aspekte der AIDS-Forschung verwendbar, dazu gehören ELISA-Tests, und auch das Absuchen und die Diagnose von menschlichen Seren nach AIDS-Antikörpern oder -Antigenen.
Zur weiteren Erläuterung der Erfindung wird auf dia folgenden Veröffentlichungen verwiesen:
Barin, F., McLane, M. F. Allan, J. S. and Lee, T. H., 1985. Virus envelope proteins of HTLV-III represents the major target antigen for antibodies in AIDS patients. Science 228:1094-1096.
Barre-Sinoussi, F.Chermmann, J. C, Rey, F., Nugeybe, M.T., Chamaret, S., Gruest, J., Dauguet, C, Axler-Blin, C, Vezinet-Brun, F., Rouzioux, C, Rozenbaum, W., and fvlontagnier, L. 1983. Isolation of a T-lymphotropic retrovirus from a patient at risk of acquired immune deficiency syndrome (AIDS). Science 220:868-870.
Chakrabarti, S., Robert-Guroff, M., Wong-Staal, F., GaIIo, R.C, Moss, B. 1966. Expression of HTLV-III invelope gene by a recombinant vaccinia virus. Nature 320: 535-537.
Francis, D. P., Petricciani, J. C. 1985. The prospects for and pathways toward a vaccine for AIDS. New Eng. Journal of Med. 1586-1590.
Hu, Shiu-Lok, Kosowski, S.G., Dalrymple, J.M. 1986. Expression of AIDS virus envelope gene recombinant vaccinia viruses.
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Claims (20)

1. Verfahren zur Herstellung eines AIDS-Diagnostikums, gekennzeichnet dadurch, daß man ein AIDS-Virus-Protein-Gen oder einen Teil davon in die DNA eines Insekten-Virus inseriert, Insekten-Zellen oder Insekten mit dem erhaltenen rekombinanten Virus infiziert, die erhaltenen infizierten Insekten-Zellen oder Insekten zur Expression oder Bildung des AIDS-Virus-Proteins züchtet, und die erhaltenen AIDS-Virus-Proteine, gegebenenfal'a zusammen mit üblichen Diagnose-Reagenzien, wie einem flüssigen Träger, zu einem Diagnose-Besteck zusammenstellt.
?. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß das Insekten-Virus ein Baculovirus ist.
3. Vei fahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß das Baculovirus das Autographa Californica Kern-Polyhedrosis-Virus ist.
4. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß das AIDS-Virus-Gen in einen rekombinänton Baculovirus-Expressions-Vektor inseriert wird.
5. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß der Baculovirus-Expressions-Vektor mehr als ein AIDS-Virus-Protein-Gen oder Teile davon enthält.
6. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß das AIDS-Virus-Gen oder der Teil davon unter der Kontrolle eines Baculovirus-Promotors exprimiert wird.
7. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß der Baculovirus-Promotor der Promotor des Polyhedrin-Gens ist.
8. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß man den rekombinanten Baculovirus-Expressions-Vektor, der in der Lage ist, ein AIDS-Virus-Gen oder einen Teil davon in einer Insekten-Zelle als Wirt zu exprimieren, erhält durch:
(a) Herstellung eines rekombinanten Insertions-Vektors durch Insertion eines Baculovirus-Genom-Teils in ein Clonierungs-Vehikel und anschließende Insertion eines AIDS-Virus-Gens oder eines Teils davon in den modifizierten Insertions-Vektor derart, daß das AIDS-Virus-Gen oder der Teil davon unter der Kontrolle eines Baculovirus-Promotors exprimiert wird, und
(b) Übertragung des so modifizierten AIDS-Virus-Gens oder des Teils davon in einen Baculovirus-Expressions-Vektor durch Vermischen des modifizierten Insertions-Vektors mit Baculovirus-DNA, Transfektion geeigneter Insekten-Zellen, und Isolierung rekombinanter Viron, die das AIDS-Virus-Gen oder den Teil davon enthalten.
9. Verfahren nach Anspruch !,gekennzeichnet dadurch, daß die Insektenzelle aus der Insektenart Spodoptera frugiperda stammt.
10. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß das AIDS-Virus-Protein-Gen das env-Gen oder ein Teil davon ist.
11. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß das AIDS-Virus-Protein-Gen das env gp160-Genist.
12. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß das AIDS-Virus-Protein-Gen das env gp120-Genist.
13. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß das AIDS-Virus-Protein-Gen das env gp41-Genist.
14. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet daduich, daß das AIDS-Virus-Protein-Gen oder der Teil davon vom env-Gen abgeleitet ist und in den Insertions-Vektoren A, B, C, D, E, F, G, H, I, J, K, L, A-1 oder B-1 enthalten ist.
15. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß das AIDS-Virus-Protein-Gen oder der Teil davon für ein immunogenes Fragment des AIDS-Virus-env-Proteins codiert.
16. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß das AIDS-Virus-Protein-Gen das gag-Gen oder ein Teil davon ist.
17. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß das AIDS-Virus-Protein-Gen das pol-Gen oder ein Teil davon ist.
18. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß man die exprimierten AIDS-Virus-Proteine reinigt, indem man eine Lentil-Lectin-Affinitätschromatographie zur Isolierung von Glykoproteinen und sodann eine Größenauftrennung der Glykoproteine durch Molekularsieb-Chromatographie durchführt.
19. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß man die AIDS-Virus-Proteine in einen festen, gegebenenfalls transparenten Träger, wie die Bohrungen einer Polystyrol-Platte, einen Filter oder Film einbringt oder daran bindet.
20. Verwendung des erfindungsgemäß hergestellten AIDS-Diagnostikums, gekennzeichnet dadurch, daß es zum Nachweis von AIDS-Virus-Antikörpern, wie menschlichen Antikörpern eingesetzt wird, wobei man ein Probenmaterial mit dem Diagnostikum in Berührung brinpt und die Bindung oder Reaktion zwischen dem AIDS-Virus-Protein und dem Antikörper bestimmt.
21. Verwendung nach Anspruch 20, gekennzeichnet dadurch, daß man den Nachweis als ELISA (enzyme-linked solid phase immuno-absorbent assay) oder als Western ülot-Analyse ausführt.
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