DE69019359T3

DE69019359T3 - Menschliche parvovirus-b19-proteine und virusähnliche partikeln, deren herstellung sowie deren verwendung in diagnostischen tests und in impfstoffen.

Info

Publication number: DE69019359T3
Application number: DE69019359T
Authority: DE
Inventors: Caroline Sarah Brown
Original assignee: Universiteit Leiden
Current assignee: Universiteit Leiden
Priority date: 1989-09-14
Filing date: 1990-09-11
Publication date: 2006-09-07
Anticipated expiration: 2010-09-12
Also published as: EP0491824B2; EP0491824B1; ES2073036T5; DE69019359T2; WO1991004330A1; DK0491824T3; EP0491824A1; DE69019359D1; DK0491824T4; NL8902301A; ES2073036T3; ATE122395T1

Description

Die Erfindung betrifft sowohl das Gebiet der genetischen Manipulation mittels der rekombinanten DNA-Technologie zur Herstellung bestimmter Proteine und/oder Partikel, die aus einem oder mehreren dieser Proteine bestehen, als auch das Gebiet der Diagnostik und Impfstoff-Herstellung. Die Erfindung betrifft bestimmte virale Proteine, die sich oder auch nicht in Form virusartiger Partikel befinden können, wobei die Proteine oder Partikel zum Beispiel in Assays zum Nachweis von Antikörpern gegen diese Proteine verwendet werden können oder zum Erhalten solcher Antikörper oder zum Erreichen eines Schutzes gegen den Virus oder zum Einbau von Epitopen von Proteinen anderer Pathogene (Krankheitserreger) darin verwendet werden können, um einen Schutz gegen diese anderen Pathogene zu erreichen (und somit vielfältige Möglichkeiten zur Verwendung zu Impfzwecken bieten).
Insbesondere betrifft die Erfindung die Hüllproteine VP1 und VP2 des menschlichen Parvovirus B19 und virusartige Partikel, die aus VP2 oder aus VP1 und VP2 bestehen. Die Erfindung umfaßt weiterhin genetische Information in Form rekombinanter Expressionsvektoren, die die für diese Proteine kodierenden Gene enthalten, und Organismen, die die Fähigkeit zum Bilden der fraglichen Proteine und/oder Partikel infolge der genetischen Manipulation unter Verwendung derartiger Vektoren erlangt haben.
Das menschliche Parvovirus B19 wurde 1975 zufällig in Serumproben einiger gesunder Blutspender entdeckt. Seit dieser Zeit ist gefunden worden, daß das Virus Erythema Infectiosium – auch bekannt als die "fünfte Krankheit" – und die sog. "aplastische Krise" bei Patienten mit chronisch hämolytischer Anämie verursacht. Das B19 Virus ist weiterhin mit Abort und fötalem Tod, mit Arthritis und mit chronischer Anämie bei immundefizienten Patienten assoziiert. Infektionen können auch unter anderen Syndromen oder gänzlich asymptomatisch auftreten.
Infektionen mit diesem Virus, den man in der ganzen Welt findet, treten gewöhnlicherweise in Epidemien auf, die etwa alle 3-6 Jahre stattfinden, aber auch sporadisch in den dazwischenliegenden Jahren auftreten können.
Heute, 14 Jahre nach der Entdeckung des B19-Virus, wird die Diagnostik der Infektion mit dem Virus weltweit immer noch in nur einer begrenzten Anzahl von Laboratorien durchgeführt. Weil das Virus bei Patienten zu der Zeit, zu der die Symptome auftreten, nicht mehr nachgewiesen werden kann (Virämien und Virusexkretion gehen den Symptomen voraus), muß sich die Diagnostik auf den Nachweis von (IgM)-Antikörpern, die für B19 spezifisch sind, konzentrieren.
Diesbezüglich (und beispielsweise auch zur Herstellung geeigneter Impfstoffe) ist es notwendig, eine ausreichende Versorgung mit dem B19-Antigen zum Aufbauen der Tests zu besitzen. Was jedoch fehlt, ist ein geeignetes in vitro-Zellkultursystem zum Vermehren des Virus, mit dem genügend Antigen erhalten werden kann.
Die bestehende Parvovirus B19-Diagnostik wird mit Virusantigen durchgeführt, das mehr oder weniger zufällig verfügbar wird (das Screening/Durchmustern von Blutspenden bietet eine geschätzte Wahrscheinlichkeit von 1:50.000, daß virämisches Blut gefunden wird).
Aus diesen Gründen besteht ein großer Bedarf an Antigen, das unter Verwendung rekombinanter DNA-Techniken hergestellt wird. Demgemäß sind bereits verschiedene Vorschläge in dieser Richtung gemacht worden, aber keiner von ihnen hat sich wirklich als nützlich für den Aufbau eines diagnostischen Tests erwiesen.
Die vorliegende Erfindung basiert auf der Verwendung eines Expressionsvektor-Systems, das erst kürzlich entwickelt wurde, nämlich dem "Baculovirus-Expressionsvektor-System". In diesem System wird von einem rekombinanten Virusvektor des Baculovirus Autographa californica nuclear polyhedrosis virus (AcNPV) Gebrauch gemacht, um die Proteine des B19-Virus in Insektenzellen zu exprimieren: Spodoptera frugiperda (Sf9). Dieses System bietet viele Vorteile gegenüber den gängigen Systemen von Expressionsvektoren:

a) In Hinsicht auf die Verwendung zu diagnostischen und möglicherweise therapeutischen (Impf-) Zwecken ist keine Kreuzreaktion mit Proteinen des Baculovirus oder der Insektenzellen (bei Proteinen, die in E.coli exprimiert werden, kann dies nicht immer ausgeschlossen werden) zu erwarten.
b) Die Virusproteine können in großen Mengen (1-500 mg/l) bis sogar zu 50-75% des Gesamtproteins gebildet werden, wie auf SDS-Polyacrylamid-Gelen nachgewiesen werden kann (Summers und Smith, 1986, A Manual of methods for baculovirus vector and insect cell culture procedures; Yong Kang, 1988; Adv. in Virus Res. 35, 177-192). Dies sind beträchtlich größere Mengen als solche, die in prokaryotischen Expressionssystemen oder in Chinese hamster ovary – Zellen, wie durch Kajigaya et al. beschrieben (Blood 75(5), Suppl. 1, 44a, Abstr. 86; 1988), hergestellt werden können.
c) Die Proteine können als nicht-fusionierte Proteine hergestellt werden im Gegensatz zu z.B. dem B19-Protein, das als Fusionsprotein in E.coli durch Sisk und Berman (Biotechnology 5, 1077-1080, 1987) hergestellt worden ist. Dieses rekombinante β-Galactosidase-B19-Fusionsprotein geht nur in Gegenwart von Natriumdodecylsulfat (SDS) in Lösung. Die VP1- und VP2-Proteine, die gemäß der Erfindung in Insektenzellen exprimiert werden, können im Gegensatz dazu leicht durch Ultraschallbehandlung der Zellen in einem Puffer, der 25 mM NaHCO₃ und 20 mg/l NaN₃ (pH 9,5) enthält, gelöst werden. Bei einer solchen Behandlung gehen 95% der zellulären Proteine in die lösliche Fraktion des Überstands über.
d) Die Proteine können in einer Insektenzellinie, die einfach zu kultivieren ist, hergestellt werden, im Gegensatz zu der Herstellung von Virusproteinen in menschlichen erythroiden Knochenmarkszellen (Ozawa et al., 1987; Blood 70, 384-391) oder in menschlichen fötalen erythroiden Leberzellen (Yaegashi et al., 1989; J. Virol. 63, 2422-2426).
e) Weil in dem Baculovirus-Expressionsvektor-System prä- und posttranslationale Modifikationen auftreten, wie Phosphorylierung, Glycosylierung, Abspalten des Signalpeptids und Entfernen der Introns durch Spleißen, ist das System potentiell sehr zur Herstellung biologisch aktiver Proteine mit einer (praktisch) nativen Struktur geeignet (Yong Kang, 1988; Adv. in Virus Res. 35, 177-192). In diesem System können das VP1- und das VP2-Protein von B19 sowohl getrennt voneinander als auch zusammen exprimiert werden. Zudem besteht die Möglichkeit, daß virusartige Partikel aus einem oder mehreren dieser Proteine spontan gebildet werden.
f) Ein zusätzlicher Vorteil des Baculovirus ist, dass er sich nicht in Säugerzellen vermehrt und daher für Menschen nicht pathogen ist, was es viel sicherer macht, mit diesem System zu arbeiten und es zu verwenden.

Gemäß der Erfindung ist es tatsächlich erreicht worden, die VP1- und VP2-Hüllproteine des menschlichen Parvirus B19 mit einer hohen Ausbeute in antigenisch wirksamer Form als nicht-fusionierte Proteine, als virusartige Partikel oder nicht, unter Verwendung des Baculovirus-Expressionssystems in Insektenzellen (Spodoptera frugiperda) herzustellen. Unter Verwendung der Insektenzellen, die die Proteine des B19-Virus bilden, ist weiterhin erreicht worden, einen spezifischen und sensitiven Immunfluoreszenz-Assay (IFA) und einen spezifischen und sensitiven Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) zum Nachweis von Antikörpern gegen die VP2 und/oder VP1 und VP2 Proteine des B19-Virus zu entwickeln. Auf der Basis der Proteine des B19-Virus und virusartiger Partikel, die in Übereinstimmung mit der Erfindung in Insektenzellen gebildet werden, können jedoch auch andere diagnostischen Assays, wie ein Radioimmunoassay (RIA) oder ein Agglutinationstest entwickelt werden.
Die Erfindung wird hauptsächlich in rekombinanten VP2 und/oder VP1 und VP2 virusartigen Partikeln und/oder VP1- und VP2-Protein des menschlichen Parvovirus B19 verkörpert, die in Zellen von Spodoptera frugiperda gebildet werden, die mittels eines Baculovirus-Expressionsvektor-Systems mit der genetischen Information ausgestattet worden sind, die zur Expression von VP2-Protein und/oder VP1 und VP2 des B19-Virus benötigt wird. Die Erfindung umfasst weiterhin rekombi nante virusartige Partikel, die aus dem VP2-Protein oder dem VP1- und VP2-Protein des menschlichen Parvovirus B19 bestehen, die in Zellen von Spodoptera frugiperda gebildet werden, die mittels eines Baculovirus-Expressionsvektor-Systems mit der genetischen Information ausgestattet sind, die zur Expression des VP2-Proteins oder des VP1- und VP2-Proteins benötigt wird.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung Zellen von Spodoptera frugiperda, die mittels eines Baculovirus-Expressionsvektor-Systems mit der genetischen Information ausgestattet worden sind, die zur Expression des VP1- und/oder VP2-Proteins des menschlichen Parvovirus B19 benötigt wird.
Die Erfindung stellt weiterhin ein Verfahren zur Herstellung von VP1- und VP2-Protein des menschlichen Parvovirus B19, und Verfahren zur Herstellung virusartiger Partikel, die aus dem VP2-Protein oder aus beiden Proteinen zusammengesetzt sind, durch Kultivieren von Zellen von Spodoptera frugiperda bereit, die mittels eines Baculovirus-Expressionsvektor-Systems mit der genetischen Information ausgestattet worden sind, die zur Expression des bzw. der Proteine des B19-Virus wie erforderliche benötigt wird. Wahlweise und vorzugsweise wird das in den Zellen gebildete B19-Virusprotein und/oder die virusartigen Partikel, die in den Zellen gebildet werden und aus dem VP2-Protein oder dem VP1und dem VP2-Protein bestehen, von den Zellen abgetrennt. Ein für diesen Zweck geeignetes Verfahren umfasst eine Ultraschallbehandlung der Zellen in einem Puffer, der 25 mM NaHCO₃ und 20 mg/l NaN₃ (pH 9,5) enthält. Das Ergebnis einer solchen Behandlung ist, dass ein großer Teil der in den Zellen vorhandenen Proteine, z.B. 95%, in gelöster Form im Überstand erhalten wird. Durch Reinigungsverfahren, die als solche für sich bekannt sind, können die Proteine des B19-Virus mit einer höheren Reinheit isoliert werden.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung betrifft rekombinante Baculovirus-Expressionsvektoren, die mit der genetischen Information ausgestattet sind, die zur Expression des VP1- und/oder VP2-Proteins des menschlichen Parvovirus B19 in Zellen von Spodoptera frugiperda benötigt wird. Bevorzugte Ausführungsformen solcher rekombinanter Baculovirus-Expressionsvektoren sind die Plasmide pAcB19VP1-YM1 und pAcB19VP2-YM1, die im Folgenden beschrieben werden.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung rekombinante Baculoviren, die mit der genetischen Information ausgestattet sind, die zur Expression des VP1- und/oder VP2-Protens des menschlichen Parvovirus B19 in Zellen von Spodoptera frugiperda benötigt wird. Bevorzugte Ausführungsformen solcher rekombinanter Baculoviren sind die Viren AcB19VP1L und AcB19VP2L, die im Folgenden beschrieben werden.
Die Erfindung umfasst weiterhin die Verwendung von rekombinanten VP2 und/oder VP1 und VP2 virusartigen Partikeln und/oder VP1- und VP2-Protein des menschlichen Parvovirus B19, die in Zellen von Spodoptera frugiperda gebildet werden, die mittels eines Baculovirus-Expressionsvektor-Systems mit der genetischen Information ausgestattet worden sind, die zur Expression des/der Proteins/(e) des B19-Virus benötigt wird, in einem Assay zum Nachweis von Antikörpern, die gegen das B19-Virsuprotein gerichtet sind, in einer zu testenden Probe. Die Erfindung umfasst die Verwendung rekombinanter virusartiger Partikel, die aus dem VP1-Protein oder dem VP1- und VP2-Protein des menschlichen Parvovirus B19 bestehen, die in Zellen von Spodoptera frugiperda gebildet werden, die mittels eines Baculovirus-Expressionsvektor-Systems mit der genetischen Information ausgestattet worden sind, die zur Expression dieser B19-Virusproteine benötigt wird, in einem Assay zum Nachweis von Antikörpern gegen das B19-Virus in einer zu testenden Probe. In bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung betrifft dies die Verwendung von Zellen von Spodoptera frugiperda, die mittels eines BaculovirusExpressionsvektor-Systems mit der genetischen Information ausgestattet worden sind, die zur Expression von VP2 und/oder VP1- und/oder VP2-Protein des menschlichen Parvovirus B19 benötigt wird, in einem Assay zum Nachweis von Antikörpern gegen das B19-Virusprotein in einer zu testenden Probe, insbesondere in einem IFA oder ELISA zum Nachweis von Antikörpern gegen das B19-Virusprotein in einer zu testenden Probe.
Die Erfindung umfasst ebenfalls ein Impfstoff-Präparat zum Induzieren einer Immunantwort, die einen Schutz gegen das menschliche Parvovirus B19 vermittelt, und rekombinante VP2 und/oder VP1 und VP2 virusartige Partikel und VP1- und VP2-Protein des menschlichen Parvovirus B19, das in Zellen von Spodoptera frugiperda gebildet wurde, die mittels eines Baculovirus-Expressionssystems mit der genetischen Information ausgestattet worden sind, die zur Expression des B19-Virusproteins benötigt wird, oder einen antigenisch wirksamen Teil dieses rekombinanten B19-Proteins, in Kombination mit einem oder mehreren Trägern und/oder Adjuvantien, die zu Impfzwecken geeignet sind, umfasst. Weiterhin umfasst die Erfindung ein Impfstoff-Präparat zum Induzieren einer Immunantwort, die einen Schutz gegen das menschliche Parvovirus B19 bestehen, die in Zellen von Spodoptera frugiperda gebildet werden, die mittels eines Baculovirus-Expressionsvektor-Systems mit der genetischen Information ausgestattet worden sind, die zur Expression dieser Proteine des B19-Virus benötigt wird, in Kombination mit einem oder mehreren Trägern und/oder Adjuvantien, die für Impfzwecke geeignet sind, umfasst.
Die Erfindung umfasst weiterhin die Verwendung des rekombinanten VP1- und VP2-Proteins des menschlichen Parvovirus B19 (oder virusartiger Partikel, die aus VP2 oder aus VP1 und VP2 bestehen), die in Zellen von Spodoptera frugiperda gebildet werden, die mittels eines Baculovirus-Expressionsvektor-Systems mit der genetischen Information ausgestattet worden sind, die zur Expression des Protein des B19-Virus benötigt wird, oder eines, antigenisch wirksamen Teiles dieses rekombinanten Proteins des B19-Virus, zum Induzieren einer Immunantwort außerhalb des Säugetierkörpers, die einen Schutz gegen das menschliche Parvovirus B19 vermittelt.
In dem nun folgenden experimentellen Teil wird beispielhaft und illustrativ gezeigt, wie die Erfindung ausgeführt wurde und wie sie ausgeführt werden kann. Wie durch die Beispiele gezeigt wird, wurden die DNA-Sequenzen, die für die Strukturproteine VP1 und VP2 des menschlichen Parvovirus B19 kodieren, von dem B19-Virus aus dem Serum eines Patienten isoliert. Dann wurde die B19-DNA über Subklonierungsschritte in pUC19 und pUC7 in dem Baculovirusvektor pAcYM1 hinter dem Promoter für das Polyhedrin-Gen des Baculovirus kloniert. Mittels Kotransfektion dieses rekombinanten Vektors mit Wildtyp-Baculovirus-DNA, gefolgt von Rekombination in den Insektenzellen (Spodoptera frugiperda) wurde schließlich rekombinanter Virus isoliert, der nach Infektion in den Insektenzellen zu der Bildung der Hüllproteine VP1 und VP2 von B19 führt, die sich oder auch nicht in Form virusartiger Partikel befanden. Unter Verwendung dieser B19-Proteine wurden sensitive und spezifische IFA- und ELISA-Tests entwickelt, die einen schnellen und einfachen Nachweis von Antikörpern, die für B19 spezifisch sind, ermöglichen. Die auf diese Weise gebildeten Proteine, die sich oder auch nicht in der Form virusartiger Partikel befinden können, können auch als leicht erhältliche Antigene für andere diagnostische Tests dienen, wie RIAs und Agglutinations-Tests, und zu der (möglichen) Herstellung von Impfstoffen und Impfstoffen aus Untereinheiten.
Beschreibung der Figuren
1 zeigt die genetische Struktur des menschlichen Parvovirus B19, der ein Einzelstrang-DNA-Virus ist mit einer DNA von etwa 5.500 Nukleotiden. Nach Ozawa et al., 1987; J. Virol. 61, 2395-2406 enthalten die Nukleotide 2444-4787 die Sequenz, die für das VP1 (84 kD) kodiert, und die Nukleotide 3125-4787 die für das VP2 (58 kD) kodierende Sequenz Nicht gezeigt sind die vier Donor-Stellen, die sich zwischen den Nukleotiden 2177 und 2195 befinden, und die zwei Akzeptorstellen für das Spleißen, die sich zwischen den Nukleotiden 3043 und 3050 befinden. Für die Bildung von VP2 während der Virusreplikation wird die dazwischenliegende Sequenz (Nukleotide 2177-3050, die das Initiationskodon für VP1 einschließen) durch Spleißen entfernt. 1 zeigt weiterhin ein Diagramm der Klonierungen zur Herstellung des rekombinanten Baculovirus mit den Genen des menschlichen Parvovirus B19.
Beispiel 1: Expression von VP1 des Parvovirus B19
1. Isolierung von DNA des Parvovirus B19 aus Patientenserum.
Nachdem B19-DNA in dem Serum eines Patienten mittels der "Polymerase-Ketten-Reaktion" (polymerase chain reaction/PCR) und Dot-Spot-Hybridisierung mit DNA-Proben, die für B19 spezifisch sind (Salimans et al., 1989; J. Virol. Meth. 23, 19-28), nachgewiesen wurde, wurde die B19-DNA daraus isoliert durch Inkubation mit Proteinase K und SDS (1 ml Serum wurde bei 37 °C für 2 h mit 100 μg Proteinase K in einen Puffer inkubiert, der 10 mM Tris-Cl (pH 7,5), 5 mM EDTA und 0,5% SDS enthielt), Phenol-Extraktion zum Entfernen des Proteins und DNA-Präzipitation mittels Ethanol. Die DNA wurde bezüglich Größe, Restriktionsenzymmustern und Southern Blot-Analyse (Maniatis et al., 1982; Molecular cloning: A laboratory manual. Cold Spring Harbor, N.Y.) mit DNA-Sonden, die für B19 spezifisch sind, überprüft.
2. Subklonierung in pUC19 (1)
Die Techniken zur Manipulierung der B19-DNA und der Plasmid-DNA wurden im wesentlichen wie durch Maniatis et al. (1982; Molecular cloning: A laboratory manual) beschrieben durchgeführt. Die B19-DNA wurde mit HindIII (bp 2430) und ScaI (bp 4920) geschnitten und in pUC19 (geschnitten mit HindIII und SmaI) ligiert, um so eine größere Menge an kodierenden Sequenzen zu erhalten (durch Ligieren von ScaI in SmaI wurde diese Schnittstelle entfernt). Das erhaltene Plasmid (pUC19-B19VP1) wurde mittels Restriktionsenzym-Analyse und Hybridisierung überprüft und in E.coli JM101 transformiert und vervielfältigt.
3. Subklonierung in pUC7 (1).
Um BamHI-Restriktionsschnittstellen an den Enden der B19-DNA zu erzeugen, wurde die DNA in pUC7 kloniert, der einen symmetrischen Polylinker mit zwei BamHI-Schnittstellen enthält. Die B19-DNA wurde aus pUC19 mit HindIII und EcoRI geschnitten und auch mit ScaI, um den Rest der Vektor-DNA zu entfernen. Das DNA-Fragment von B19 mit der richtigen Länge wurde aus einem Agarose-Gel isoliert, mit dem großen Fragment der Klenow-Polymerase aufgefüllt und mit einem HincII-geschnittenen pUC7-Plasmid (ebenfalls mit stumpfen Enden versehen) ligiert. Die ligierte DNA (pUC7-B19VP1) wurde in E.coli JM101 transformiert und vervielfältigt. Getrennte Kolonien wurden mittels Restriktionsenzym-Analyse und Hybridisierung mit einer B19-spezifischen DNA-Sonde (das 700 bp PstI-Fragment von B19, Salimans et al., 1989; J. Virol. Meth. 23, 19-28) auf die Gegenwart von B19-DNA hin untersucht.
4. Klonierung in den Baculovirus-Vektor pAcYM1 (1)
Die Techniken zur Manipulierung des Baculovirus, des Baculovirus-Vektors und der Insektenzellen wurden im wesentlichen wie von Summers und Smith 1986 beschrieben (A manual of methods for baculovirus vector and insect cell culture procedures) durchgeführt. Die dem Polyhedrin-Promoter folgende Restriktionsschnittstelle des Baculovirus ist eine BamHI-Schnittstelle. Da die B19-DNA ebenfalls eine interne BamHI-Schnittstelle enthält, entschied man sich für die folgende Strategie: Die B19-DNA wurde aus pUC7 mit EcoRI herausgeschnitten und der verbleibende Teil von pUC7 wurde mit ScaI (dieser ScaI-Restriktionsverdau ist nicht für die Klonierung der VP2-DNA erforderlich) geschnitten. Die B19-DNA wurde aus dem Gel isoliert, mit Alkalischer Phosphatase (Calf Intestial Alkaline Phosphatase, CIP) dephosphoryliert, und schließlich wurde ein partieller Restriktionsverdau mit BamHI durchgeführt. Das BamHI-Fragment mit der richtigen Größe (2,5 kb für VP1 und 1,8 kb für VP2) wurde dann mit dem Baculovirus-Vektor pAcYMI ligiert, mit BamHI geschnitten und mit CIP behandelt (Matsuura et al., 1987; J. Gen. Virol. 68, 1233-1250). Das so erhaltene Plasmid (pAcB19VP1-YM1) wurde in E.coli HB101 vervielfältigt. Rekombinante Plasmide wurden auf die Gegenwart der B19-DNA (mit für B19-DNA spezifischen Sonden) und auf deren richtige Orientierung relativ zum Polyhedrin-Promoter (mittels Restriktionsenzyzn-Analyse) hin überprüft. Konstrukte mit der richtigen Orientierung wurden in den Bakterienzellen gezüchtet und aus ihnen nach dem "the rapid boiling" Verfahren von Holmes und Quigley (1981; Anal. Bioch. 114, 193-197) mit einer abschließenden Reinigung über einen CsCl-Gradienten isoliert.
5. Kotransfektion mit Wildtyp-Baculovirus-DNA; AcNPV (1).
Mittels einer Kotransfektion des Konstrukts pAeB19VP1-YM1 mit Wildtyp-Baculovirus-DNA (AcNPV) wurde die DNA in die Insektenzellen (Spodoptera frugiperda) (gemäß dem Verfahren II von Summers and Smith, 1986; A manual of methods for baculovirus vector and insect cell culture procedures) eingeführt. Bei 0,5-3,0% der Infektionen rekombinierte der rekombinante Vektor (pAcB19VP1-YM1) mit der Wildtyp-Virus-DNA während der Aufnahme in die Zellen, womit ein rekombinanter Virus, der B19-DNA enthält, AcB19VP1L, gebildet wurde. Das Polyhedrin-Gen ist durch die VP1-DNA ersetzt worden (in Beispiel 2, in dem die Bildung des rekombinanten Virus AcB19VP2L beschrieben wird, wird es durch die VP2-DNA ersetzt).
6. Reinigung des rekombinanten Virus (AcB19VP1L)
Der Virus-Titer (sowohl Wildtyp wie Rekombinante), der durch die Sf-Zellen gebildet wurde, wurde mittels eines Plaque-Assays bestimmt. 20 Plaque-bildende Einheiten (plaque-forming units, pfu) wurden auf eine Einzelzellschicht von Sf-Zellen in einer Schale mit 96 Vertiefungen (20 pfu/Vertiefung) gebracht und bei 27 °C inkubiert. Drei Tage nach der Infektion wurden die Überstände entfernt und zurückbehalten und die Zellen wurden lysiert und auf Nitrocellulose getropft (Pet et al., 1989; Nucl. Acid Res. 17, 451). Das Durchmustern/Screening auf die Gegenwart von rekombinantem Virus wurde mit einer DNA-Sonde, die für Parvovirus B19 spezifisch ist, durchgeführt. Der Titer der Vertiefungen, die die gesammelten Überstände des rekombinanten Virus enthielten, wurde mittels eines Plaque-Assays bestimmt und dann auf 1 pfu/Vertiefung in einer Schale mit 96 Vertiefungen verdünnt. Nach einem wie oben beschriebenen Durchmustern mit dem Dot-Spot-Hybridisierungs-Assay wurde der Titer der positiven Überstände in einem Plaque-Assay bestimmt. Weiterhin wurde ein Durchmustern mit einem Mikroskop auf die Abwesenheit des Polyhedrin-Proteins in den Plaques durchgeführt, was auf die Plaques hindeutet, die rekombinanten Virus enthalten. Diese Plaques wurden auf einer Sf-Einzelzellschicht in einer Schale mit 96 Vertiefungen inokuliert. Nach drei Tagen wurde die Dot-Spot-Hybridisierung wiederholt und positive Vertiefungen wurden in einem Plaque-Assay überprüft. Die Rekombinanten wurden als rein betrachtet, wenn weniger als 1 in 500 Plaques den Wildtyp-Virus enthielten.
7. Assay des rekombinanten Virus (AcB19VP1L).
Gesamt-DNA wurde aus Zellen, die mit rekombinantem Virus infiziert worden waren, isoliert, mit Restriktionsenzymen geschnitten und nach Southern-Blotting durch Hybridisierung mit DNA-Sonden, die für das Parvovirus B19 spezifisch sind, überprüft.
Der reine rekombinante Virus wurde verwendet, um Insektenzellen (Sf) mit einer M.d.I. (Multiplizität der Infektionen; multiplicity of infection, m.o.i.) von 1-5 zu infizieren und die VP1 und VP2-Proteine des Parvovirus in diesen Zellen zu exprimieren. Dann wurden die Hüllproteine VP1 und VP2 des menschlichen Parvovirus B19, die in dem Baculovirus-Expressionsvektor-System gebildet worden waren, analysiert und mit den nachfolgend beschriebenen Techniken überprüft:
8. Biosynthese des rekombinanten VP1-Proteins.
Zwei Tage nach der Infektion mit dem rekombinanten Virus (AcB19VP1L, M.d.I. 5) wurden die Insektenzellen (10⁶ Sf-Zellen in 35 mm-Petrischalen) für 4 h bei 27 °C in Methionin-freiem "Grace"-Medium kultiviert, zu dem 100 μCi ³⁵S-Methionin zur Bestimmung der de novo-Synthese von Proteinen zugegeben worden war. Nachdem der Überstand verworfen worden war, wurden die Zellen in PBS (Phosphat-gepufferte Salzlösung) aufgenommen. Sowohl Überstand wie auch die Zellfraktion wurden mit Lysierungs-Puffer versetzt, für 5 min gekocht und auf einem 10%-igen SDS-Polyacrylamid-Gel analysiert. Die gleichen Experimente wurden mit uninfizierten Zellen und mit Zellen, die mit dem Wildtyp-Baculovirus infiziert worden waren, durchgeführt. Die Autoradiographie (nicht gezeigt) enthüllte, daß die Polyhedrin-Bande (30 kD), die stark bei der Infektion mit dem Wildtyp dominierte, bei den rekombinanten Viren verschwand, und, daß ein Protein der Größe des VP1 von B19 (84 kD) synthetisiert wurde.
9. SDS-PAGE-Analyse
Nach Infektion mit dem rekombinanten Virus (M.d.I. 5) wurden Zellen von Spodoptera frugiperda auf einem 10%-igen SDS-Polyacrylamid-Gel für 5 Tage auf die Bildung des VP1-Proteins des B19-Virus hin überprüft. Die Gele wurden mit "Fast Green" gefärbt. Die Ergebnisse der Gele (nicht gezeigt) enthüllten, daß vom Tag 2 an VP1 in großen Mengen als ein stabiles Produkt gebildet wurde, das noch nach 5 Tagen deutlich vorhanden war. VP1 wurde in Mengen gebildet, die mit denen des Polyhedrin-Proteins in Zellen, die mit dem Wildtyp-Baculovirus infiziert worden waren, vergleichbar sind.
10. Antigenizität der gebildeten Proteine
100 ng des Proteins der Zell-Lysate von Sf-Zellen zwei Tage nach Infektion (M.d.I. 5) wurden der Elektrophorese auf einem 10%-igen SDS-Polyacrylamid-Gel unterworfen und auf Nitrocellulose "geblottet" (3 h; 70V in 25 mM Tris, 192 mM Glycin und 20% Methanol). Dann wurden 20 menschliche Seren auf ihre Reaktivität mit den rekombinanten VP1-Antigen getestet (15 IgG-positive Seren und fünf IgG-negative Seren). Die Reaktionen wurden bei Raumtemperatur durchgeführt: Absättigen über Nacht durch Inkubation der Nitrocellulose-Filter in PBS/5% fötalem Kälberserum (Foetal Calf Serum, FCS)/0,05% Tween 20; Inkubation für 1,5 h mit Seren (1:500-Verdünnung für die positiven Seren und 1:50-Verdünnung für die negativen Seren), die mit PBS/5% FCS verdünnt worden waren; gefolgt von dem Waschen der Filter für 1 h mit PBS/0,05 Tween 20 und dann einer Inkubation mit Alkalische Phosphatasemarkiertem Ziege-Anti-Mensch-Gesamt-Ig (Tago, Kat.-Nr.: 2493), 1:500-verdünnt in PBS/0,05% Tween 20/5% FCS; nach jeweils zweimaligem Waschen in PBS/0,05% Tween 20 und PBS wurden die gebundenen Antikörper mit 5-Brom-4-Chlor-3-Indolylphosphat (BCIP) nachgewiesen. Die 15 positiven IgG-Seren reagierten alle mit der rekombinanten VP1-Bande auf dem Gel und die fünf negativen IgG-Seren zeigten überhaupt keine Reaktion.
11. Testen der Seren in einem Immunfluoreszenz-Assay.
Sf-Zellen, die mit rekombinantem Virus (AcB19VP1L, M.d.I. 1) infiziert worden waren, wurden nach 3-4 Tagen in TC100-Medium (Gibco-BRL) überführt, mit uninfizierten Zellen bis zu einem Pro zentsatz von ungefähr 25% an Zellen gemischt, die rekombinantes VP1 von B19 enthalten, und mit einer Konzentration von ungefähr 500 Zellen/Vertiefung (5 μl) in Glasschalen mit 18 Vertiefungen (nutacon, Kat.-Nr. 10-404) getropft, und nach Lufttrocknen in 100% Aceton für 20 min bei –20 °C fixiert. Dann wurden die Zellen mit menschlichen Seren (positive und negative Seren bezüglich der B19-Ig) mit verschiedenen Verdünnungen in VBS (Veronal-gepufferte Salzlösung) inkubiert. Diese Seren waren mit Leber-Pulver zur Reduzierung einer möglichen Hintergrund-Anfärbung vorbehandelt worden. Nach einer Inkubation für 1-2 h bei 37 °C wurden die Glasschalen in PBS gewaschen und an der Luft getrocknet vor einer Inkubation mit einer 1:40-Verdünnung von FITC-markiertem Ziege-Anti-Mensch-IgG (Kallestad, Kat.-Nr.: 104) in VBS mit 1:500 "Evans Blue" (Hoffmann La Roche). Nach Waschen in PBS und. Lufttrocknen wurde Tris/Glyzerin-Puffer (1 g Tris in PBS, 80% Glyzerin, pH 9,9) zugegeben und eine Analyse unter dem UV-Mikroskop durchgeführt. Bei B19-IFAs mit positiven Patientenseren konnten die fluoreszierenden Zellen beobachtet werden. Die Nützlichkeit des B19-IFA wurde in einer Anzahl von Experimenten, wie im Folgenden beschrieben, getestet:
a) "Doppel-Blind"-Experiment.
30 Patientenseren worden gemäß dem Verfahren in Verdünnungen von 1:50 und 1:500 getestet, ohne daß der "Untersuchende" wußte, welche der Seren positiv und welche negativ waren. Nach dem Ablesen durch mehrere Mitarbeiter wurden die Ergebnisse mit den Daten des RIA-Tests (Cohen et al., 1983; J. Hyg. 91, 113-130) verglichen: In dem B19-IFA wurden alle 17 IgG-positiven Seren als positiv abgelesen und alle 13 IgG-negativen Seren als negativ.
b) Titration.
Von einer Anzahl von Seren, die für B19-Antikörper positiv waren (positiv gemäß den Testergebnissen des RIA, der mit aus einem Serum isolierten Virus als Antigen durchgeführt worden war, Cohen et al., 1983; J. Hyg. 91, 113-130), wurde der IFA-Titer bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 zusammengefaßt. Die Daten zeigen, daß dieser B19-IFA zu Ergebnissen führt, die mit den RIA-Daten korrespondieren: Seren mit hohen positiven Werten im RIA haben ebenfalls hohe Titer im B19-IFA, und Seren mit niedrigen positiven Werten im RIA ergeben geringere Titer in dem B19-IFA.
Tabelle 1: Vergleich zwischen RIA und IFA für einen Assay von B19-Antikörpern

w.E. = willkürliche Einheiten; < 1 = negativer Wert RIA; < 32 = negativer Wert IFA bei der niedrigsten Verdünnung von IgG; < 10 = negativer Wert IFA bei der geringsten Verdünnung von IgM.

c) Durchmustern der Spender.
100 zufällig ausgewählte Blutspender wurden auf die Gegenwart von IgG-Antikörpern, die für B19 spezifisch sind, durchgemustert, und die Ergebnisse zeigten, daß in diesem B19-IFA 76% der Spender positiv waren, was sehr gut mit den Daten, wie sie für das menschliche Parvovirus B19 für diese Altersgruppe beschrieben wurden, übereinstimmt.
Beispiel 2: Expression von VP2 des Parvovirus B19
Subklonierung von VP2 in pUC7.
Die Klonierung des VP2 des Parvovirus B19 ging von B19-DNA aus, die gemäß dem in Abschnitten 1 und 2 von Beispiel 1 beschriebenen Verfahren in pUC19 kloniert worden ist. Ein 1,8 kb-Fragment, das für VP2 kodiert, wurde mit HpaII (bp3083) und EcoRI aus dem pUC19-Konstrukt (pUC19-B19VP1) geschnitten, aus einem Agarose-Gel isoliert, mit dem großen Fragment der Klenow-DNA-Polymerase aufgefüllt und mit einem pUC7-Plasmid ligiert, das mit HincII geschnittene worden war. Das neue pUC7-Konstrukt (pUC7-B19VP2) wurde dann in E.coli JM101 vervielfältigt. Die Bakterienkolonien wurden dann auf die Gegenwart einer B19-Insertion mittels Restriktionsenzym-Analyse und Hybridisierung mit einer B19-spezifischen DNA-Sonde (Salimans et al., 1989; J. Virol. Meth. 23, 19-28) getested. Im weiteren wurde das gleiche Verfahren verfolgt, das für VP1 in den Abschnitten 4-7 von Beispiel 1 beschrieben ist, um einen rekombinanten Baculovirus mit der DNA, die für das VP2 des menschlichen Parvovirus kodiert, zu bilden, und VP2 in den Insektenzellen (AcB19VP2L) zu bilden.
Beispiel 3: Expression von VP1 und VP2 des Parvovirus B19 unter Verwendung einer Doppelinfektion von Insektenzellen
Zwei Tage nach Infektion mit den rekombinanten Viren (AcB19VP1L und AcB19VP2L, M.d.I. 5) wurden die Insektenzellen (10⁶ Sf-Zellen in 35 mm Petri-Schalen) für 4 h bei 27 °C in Methionin-freiem "Grace"-Medium kultiviert, zu dem 100 μCi ³⁵S-Methionin zugegeben worden waren, um die de novo-Synthese von Proteinen zu bestimmen. Nachdem der Überstand verworfen worden war, wurden die Zellen in PBS (Phosphat-gepufferte Salzlösung) überführt. Sowohl der Überstand als auch die Zellfraktion wurden mit Lysierungs-Puffer versetzt, für 5 min gekocht und auf einem 10%-igen SDS-Polyacrylamid-Gel analysiert. Es wurden die gleichen Experimente mit uninfizierten Zellen und mit Zellen, die mit dem Wildtyp-Baculovirus infiziert worden waren, durchgeführt. Die Autoradiographie (nicht gezeigt) enthüllte, daß die Polyhedrin-Bande (30 kD), die stark bei einer Infektion mit dem Wildtyp dominierte, in den Zellen, die mit den rekombinanten Viren infiziert worden waren, verschwand, und, daß Proteine mit einer Größe des VP1 (84 kD) und des VP2 (58 kD) von B19 synthetisiert wurden. Die Ergebnisse wurden durch SDS-PAGE-Analyse, wie in Abschnitt 9 von Beispiel 1 beschrieben, bestätigt.
Beispiel 4: Bildung und Reinigung des Capsid-Proteins VP2 des menschlichen Parvovirus-Stammes B19
Sf-Zellen wurden mit dem VP2-rekombinanten Baculovirus (M.d.I. 20) infiziert. 72 h nach dem Beginn der Infektion wurden die Zellen in PBS gewaschen, geernet und dann in PBS Ultraschall-behandelt. Die Zelltrümmer wurden mittels Zentrifugation (10 min, 1.000 × g) entfernt, wonach der Überstand auf ein 40%-iges Sucrose(Saccharose)-Kissen gelegt wurde und eine Zentrifugation für 2,5 h bei 100.000 × g durchgeführt wurde. Das Pellet wurde in PBS resuspendiert und dann auf einem linearen Sucrose-Gradienten (15-30%, w/w) getrennt. Nach einer Zentrifugation für 2,5 Stunden bei 110.000 × g wurde eine opaleszierende Bande beobachtet. Das Material dieser Bande wurde mittels Elektronenmikroskopie untersucht. Es wurden Partikel gefunden, die bezüglich des Durchmessers (ungefähr 21 nm) und der Morphologie eine große Ähnlichkeit mit dem Capsid des Parvovirus aufwiesen. Nach Analyse der Fraktion des Sucrose-Gradienten mittels SDS-PAGE und einer Silberanfärbung wurde ein Protein mit der Größe des VP2 (58 kD) gefunden. Mittels Radio-Immunpräzipitation und Western-Blot-Analyse mit einem menschlichen Serum, das für den Parvovirus B19 spezifisch ist, wurde gezeigt, daß das VP2-Protein tatsächlich hieran beteiligt war. Die Tatsache, daß nach Silberanfärbung keine anderen Proteine nachgewiesen wurden, deutet auf einen hohen Reinheitsgrad. Die Menge des Proteins in den Gradientenfraktionen, die an diesen Partikeln angereichert waren, wurde mittels des Bradford-Verfahrens bestimmt. Auf der Basis der erhaltenen Daten wurde die Zahl der Partikel pro infizierte Insektenzelle auf mindestens 10⁵ geschätzt, wobei angenommen wurde, daß jeder Partikel aus bis zu 60 Molekülen besteht. Um zu bestimmen, ob die gereinigten VP2-Partikel für den Aufbau eines diagnostischen Tests verwendet werden können, wurde ein ELISA mit acht B19-positiven und drei B19-negativen menschlichen Seren durchgeführt. In Tabelle 2 werden die Ergebnisse mit denen für das gereinigte rekombinante VP1-Protein erhaltenen verglichen. Alle B19-positiven Seren erkennen das VP2-Capsid. Zudem erwies sich die Reaktion von sieben der acht Seren mit den VP2-Capsiden als stärker positiv als die mit dem gereinigten VP1-Protein. Tabelle 2: ELISA zum Nachweis von Parvovirus-spezifischen Antikörpern in elf menschlichen Seren mit dem rekombinanten VP1- und VP2-Protein als Antigen.

^*Extinktion < 0,5: negativ; > 0,5: positiv

Claims

Rekombinante virusartige Partikel, bestehend aus dem VP2-Protein des menschlichen Parvovirus B19, die in den Zellen von Spodoptera frugiperda gebildet wurden, wobei die Zellen einen rekombinanten Baculovirus-Expressionsvektor ausgestattet mit der genetischen Information umfassen, die zur Expression des VP2-Proteins des menschlichen Parvovirus B19 darin notwendig ist.
Rekombinante virusartige Partikel nach Anspruch 1, wobei der rekombinante Baculovirus-Expressionsvektor in einem rekombinanten Baculovirus enthalten ist.
Verfahren zur Herstellung der virusartigen Partikel nach Anspruch 1 oder 2, bestehend aus dem VP2-Protein des menschlichen Parvovirus B19, durch Kultivieren von in Anspruch 1 oder 2 definierten Spodoptera frugiperda Zellen.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei die virusartigen Partikel, die in den Zellen gebildet wurden, von den Zellen abgetrennt werden.
Verwendung der rekombinanten virusartigen Partikel nach Anspruch 1 oder 2 in einem Assay zum Nachweis von Antikörpern gegen das B19-Virusprotein VP2 in einer zu testenden Probe.
Verwendung der Zellen von Spodoptera frugiperda nach Anspruch 1, und in denen VP2 in der Form virusartiger Partikel exprimiert worden ist in einem Assay zum Nachweis von Antikörpern gegen das Parvovirus B19-Protein VP2 in einer zu testenden Probe.
Verwendung nach Anspruch 6, wobei der Assay ein IFA oder ELISA ist.
Impfstoff-Präparat zum Induzieren einer Immun-Antwort, die Schutz gegen das menschliche Parvovirus B19 vermittelt, umfassend rekombinante virusartige Partikel nach Anspruch 1 oder 2 in Kombination mit einem oder mehreren Trägern und/oder Adjuvantien, die für Impfzwecke geeignet sind.
Verwendung der rekombinanten virusartigen Partikel nach Anspruch 1 oder 2 zum Induzieren einer Immun-Antwort außerhalb des Säugetier-Körpers, die Schutz gegen das menschliche Parvovirus B19 vermittelt.
Zellen von Spodoptera frugiperda, umfassend einen rekombinanten Baculovirus, der einen rekombinanten Baculovirus-Expressionsvektor ausgestattet mit der genetischen Information umfasst, die für die Expression des VP1-Proteins des menschlichen Parvovirus B19 erforderlich ist, und einen rekombinanten Baculovirus, der einen rekombinanten Baculovirus-Expressionsvektor umfasst, der mit der genetischen Information ausgestattet ist, die notwendig ist zur Expression des VP2-Proteins des menschlichen Parvovirus B19.
Verfahren zur Herstellung von VP1- und VP2-Protein des menschlichen Parvovirus B19 und/oder virusartigen Partikeln, bestehend aus VP1- und VP2-Protein des menschlichen Parvovirus B19, durch Kultivieren von Spodoptera frugiperda Zellen nach Anspruch 10.
Verfahren zur Herstellung eines Impfstoff-Präparats zum Induzieren einer Immun-Antwort, die Schutz gegen das menschliche Parvovirus B19 vermittelt, unter Verwendung eines Verfahrens nach Anspruch 11.
Verwendung von Spodoptera frugiperda Zellen nach Anspruch 10 in einem Assay zum Nachweis von Antikörpern gegen das B19-Virus in einer zu testenden Probe.
Verwendung nach Anspruch 13, wobei der Assay ein IFA oder ELISA zum Nachweis von Antikörpern gegen das B19-Virus in einer zu testenden Probe ist.