JPH09504173A - アデノ関連ウイルスとその早期流産の診断への利用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、所謂自然発生的早期流産の原因となる作用物を、アデノ関連ウイルスＤＮＡ（ＡＡＶ ＤＮＡ）またはＡＡＶ抗原もしくはＡＡＶに対する（好ましくはＩｇＭ型の）抗体の存在に関し患者の試料を調べることにより検出する方法に関する。さらに、本発明は前述の方法に好適な抗体にも関する。

Description

【発明の詳細な説明】 アデノ関連ウイルスとその早期流産の診断への利用 本発明は、いわゆる自然発生的早期流産の原因となる作用物を、アデノ関連ウ イルスＤＮＡ（ＡＡＶ ＤＮＡ）またはＡＡＶ抗原またはＡＶＶに対する（好ま しくはＩｇＭ型の）抗体の存在に関し患者の試料を調べることにより、検出する 方法に関する。さらに本発明は、前述の方法を実施するために好適な抗体にも関 する。 ヘルパーウイルスの共感染に複製を依存しているヒト・パラボウイルスである アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）は、非病原性であり（Siegl，G．et al．(1985), InterVirology，23，pp．61-73；Berns，K．I，et al．(1987)，Adv．Virus Res .，32，pp．243-306）、しかしかなりの腫瘍抑制的性質を示す（Romme laere et al．(1991)，J．Virol．Methods，33，pp．233-251）と考えられていた。この ウイルスはおそらく細胞培養でみられるように宿主細胞の特定の染色体部位にウ イルスのＤＮＡを組み込むことにより、感染した個体内に残存する。最近の研究 の結果、ＡＡＶはヒトおよびマウス由来の胚茎細胞を含む多様な細胞中で分化を 誘導することが示された（Klein-Bauern schmitt et al．(1992)，J．Virol．66 ,pp．4191-4200）。ＡＡＶ感染の推定上の標的を探す過程において、自然発生的 流産の結果得られた物質を、例えば複製連鎖反応（ＰＣＲ）、サザンブロット技 術、インサイチュハイブリダイゼーショ技術等を用いて、ＡＡＶ ＤＮＡの存在 に関して分析した。さらに、流産した女性や、他の病気にかかった、あるいは健 康な女性から得られた血清試料を、例えば酵素結合免疫吸着剤アッセイ（ＥＬＩ ＳＡ）、蛍光イムノアッセイ（ＦＩＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）また は免疫蛍光アッセイ（ＩＦＡ）等の血清学的定法により、ＡＡＶ抗体の存在に関 して分析した。 驚いたことには、流産の結果得られた物質の試料中の検出可能なＡＡＶ ＤＮ ＡおよびＡＡＶに対する検出可能なＩｇＭ抗体の両方と、妊娠の最初の３カ月間 に起こる早期流産との間に重要な相関がみられた。 発明の開示 よって、本発明は、自然発生的流産の原因となる作用物の検出方法にであって 、 （ａ） ＡＡＶポリヌクレオチドに対するプローブを、ＡＡＶ核酸と前記プロ ーブとの間にヘテロ二本鎖が形成される条件下で流産の結果得られた物質の試料 の核酸とハイブリダイズさせ、 （ｂ） 前記プローブを含むポリヌクレオチド二本鎖を検出する、各工程から 成る方法に関する。 本発明の好ましい実施態様においては、上述の方法は、複製連鎖反応（ＰＣＲ ）、サザンブロットまたはインサイチュハイブリダイゼーション技術である。 本発明の別の好ましい実施態様においては、ハイブリダイゼーション技術が上 述のように応用され、プライマーｐａｎ１，ｐａｎ３，ｎｅｓｔ１およびｎｅｓ ｔ２から成る群から選択される１以上の核酸プローブが用いられる。図１はこれ らのプライマーの概略図であり、ＡＡＶタイプ２（ＡＡＶ−２）のゲノムとの関 係およびプライマーのヌクレオチド配列を示している。 本発明は更に、自然発生的流産の原因となる作用剤を検出する方法であって、 ａ） ＡＡＶ抗原に対するプローブ抗体を、流産の結果得られた物質とともに 、抗原−抗体複合体を形成できる条件下で保温し、 ｂ） 前記プローブ抗体を含む抗原−抗体複合体を検出する、各工程から成る 方法に関する。 工程ａ）において、１以上のプローブ抗体を用いてもよい。これらの抗体は、 例えばＡＡＶキャプシドあるいはその単一タンパク質、特にＶＰ１，ＶＰ２また はＶＰ３を標的としていてもよい。このような抗体の例として以下のモノクロー ナルがある： Ａ１ （ＤＳＭに1994年10月13日にＤＳＭ ＡＣＣ2195として寄託された） Ａ６９（ＤＳＭに1994年10月13日にＤＳＭ ＡＣＣ2196として寄託された） Ｂ１ （ＤＳＭに1994年10月13日にＤＳＭ ＡＣＣ2197として寄託された） Ａ２０（ＤＳＭに1994年10月13日にＤＳＭ ＡＣＣ2194として寄託された） （表１を参照） 上記の抗体は本発明の特許請求の対象である。 本発明の好ましい実施態様においては、上述の抗原の検出方法は、酵素結合免 疫吸収剤アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、蛍光イム ノアッセイ（ＦＩＡ）または免疫蛍光アッセイ（ＩＦＡ）である。 ＥＬＩＳＡの一例は、以下の、 （ａ） モノクローナル抗体Ａ２０を担持する基質を供与し、 （ｂ） （ａ）の基質を、流産の結果得られた物質と接触させて、抗原−抗体 複合体を得、 （ｃ） （ｂ）の複合体を、ポリクローナル抗ＡＡＶキャプシド抗体と接触さ せて、抗体−抗原−抗体複合体を得、 （ｄ） （ｃ）の複合体を、（ｃ）のポリクローナル抗体を標的とした酵素標 識抗体と接触させて、標識された（ｃ）の複合体を得、そして （ｅ） （ｄ）の複合体を酵素標識指示剤と接触させ、前記複合体の存在を示 す、各工程から成る。 「流産の結果得られた物質の試料」という用語は、ＡＡＶキャプシドまたはそ の一部を含む物質の一例にすぎないことは明白である。他の例としては、組み換 えＡＡＶキャプシドまたはその一部を発現する細胞が挙げられる。 本発明、すなわち抗体そのもの、またはＡＡＶ抗原検出方法と組み合わせて用 いる抗体は、いかなる物質においてもＡＡＶキャプシドおよび／またはその一部 を検出する目的に好適である。 さらに、本発明は自然発生的流産の原因となる作用物を検出する方法であって 、 （ａ） ＡＡＶまたはその抗原性部分を含む試料を、抗ＡＡＶ抗体を含む疑い のある試料と、好ましくはＩｇＭ型の抗体のみを含む抗体−抗原複合体を形成で きる条件下で保温し、そして （ｂ） 好ましくはＩｇＭ型抗体−抗原複合体である、プローブ抗原を含む抗 体−抗原複合体を検出する、各工程から成る方法に関する。 （ａ）の抗体において「ＡＡＶまたはその抗原性部分を含む試料」とは、ＡＡ Ｖキャプシドタンパク質、好ましくはＶＰ１，ＶＰ２および／またはＶＰ３を指 す。 本発明の別の好ましい実施態様においては、ＡＡＶ特異的抗体、好ましくはＩ ｇＭ抗体を検出する方法は、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ＦＩＡまたはＩＦＡである。 ＥＬＩＳＡの一例は、以下の （ａ） 抗ヒトＩｇＭ抗体を担持する基質を供与し、 （ｂ） （ａ）の基質を患者の体液と接触させて、抗体−抗体複合体を得、 （ｃ） （ｂ）の複合体を、組換えＶＰ１，ＶＰ２および／またはＶＰ３と接 触させて、ＶＰ−抗体−抗体複合体を得、 （ｄ） （ｃ）の複合体を抗ＶＰ抗体と接触させて、抗ＶＰ抗体−ＶＰ−抗体 −抗体複合体を得、 （ｅ） （ｄ）の複合体を、酵素で標識された、（ｄ）の抗ＶＰ抗体を標的と した抗体と接触させて、標識された（ｄ）の複合体を得、そして （ｆ） （ｅ）の複合体を酵素標識指示剤と接触させて、前記複合体の存在を 指示させる、各工程から成る。 残存している血清中の抗ＡＡＶ ＩｇＭ／ＩｇＧ力価は、早期流産の傾向と関 連していることは明白である。このように、効果的な危険要素の検索、妊娠失敗 の防止方法の開発、および妊娠失敗の危険に関する患者の情報のためにもまた本 発明を用いても差し支えない。 さらに、本発明は、自然発生的流産の原因となる作用物を、上述のハイブリダ イゼーションにより検出するためのキットであって、ＡＡＶポリヌクレオチドに 対するプローブを適切なコンテナ中に有するキットに関する。 本発明は、自然発生的流産の原因となる作用物を上述の免疫学的抗原検出によ り検出するためのキットであって、ＡＡＶ抗原を標的としたプローブ抗体を、適 切なコンテナ中に有するキットに関する。 本発明は、自然発生的流産の原因となる作用物を上述の免疫学的抗原検出によ り検出するためのキットであって、ＡＡＶまたはその抗原性部分を適切なコンテ ナ中に有するキットに関する。 本発明を実施する方法 本技術は、組み換え核酸技術、微生物学および免疫生物学における当業者が本 発明を実施するために利用可能な方法に富んでいる。これらの技術のすべての詳 細な記述、関連する文献中にみられるであろう。例えば、 Maniatis，Fritsch & Sambrook：Molecular cloning：A Loboratory Manual(198 9)；DNA Cloning，vol．I and II(D.N．Golver ed.，1985)；Oligonucleotide s ynthesis(M.J．Gait ed.，1984)；Nucleic Acid Hybridization(B.D．Hames & S .J．Higgins eds.，1984)；Animal Cell Culture(R.I．Freshneyed.，1986)；J. D．Watson，M．Gilman，J．Witkowski，M．Zoller：Recombinant DNA，Second E dition(1992)；Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology(Acade mic Press，London，1987)；Protein Purification；Principles and Practice ，Second Edition(Springer Verlag，N.Y.)；Handbook of Experimental Immuno logy，Vol．I-IV(D.M．Weirand C.C．Blackwell eds.，1986)；Immunoassay：A Practical Guide(D.W．Chanand M.T．Perlstein eds.,1987)；ELISA and Other Solid Phase Immunoassays：Theoretical and Practica1l spects(D.M．Kemeny and S.J．Challacombe eds.，1988)；Principles and Practice of Immunoassay (C.P．Priceand D.J．Newman eds.，1991)を参照されたい。 より詳細なＡＡＶ特異的方法論的様相についての情報、例えば、細胞培養、ウ イルス増殖、ウイルス精製、タンパク質の単離等は、関連文献、例えば、Handbo ok of Parvoviruses，Vol.I and II CRC Press，Boca Raton，Fiorida，Ed．P． Tijssen；Ruffing，M．et al．(1992)，J．Virol.，66，pp．6922-6930.中にみ られる。 例えば抗原、抗体、プローブ抗原、プローブ抗体、核酸プローブ、プライマー および感度改善のための増幅技術も利用することもあるイムノアッセイまたはハ イブリダイゼーションアッセイを行うために必要な補助的な試薬は、適切なコン テナ中に満されるかまたはプラスチック、ガラス、セル等の固相上にコートされ て、試験を行うための指示とともにキットとして包装されてもよい。 本発明は以下の例により例証される。 実施例１ 自然発生的流産の結果得られた生物的掻爬物質中のＡＡＶ ＤＮＡの複製連鎖 反応（ＰＣＲ）分析による検出 ＰＣＲで用いられたプライマー（ｐａｎ１，ｐａｎ３）および重ね合わされた ＰＣＲで用いられたプライマー（ｎｅｓｔ１，ｎｅｓｔ２）はそれぞれ、ミス対 合が他の（例えば細胞の）ＤＮＡ配列の増殖へ至らないＡＡＶ−２およびＡＡＶ ５ ＤＮＡの配列とハイブリダイズするように設計された。増幅された産物はサ ザンブロット実験により識別できる。プライマーは常法により調製された。 プライマーは以下に示したミス対合（下線）をみせるよう設計された。 組織片（５μｍの新鮮、または固定化、パラフィン投入、脱パラフィン物質） から調製されたＤＮＡ（D.H．Wright and M.M．Manos in “PCR Protocols，A G uide to Methods and applications”，edited by M.A．Innis，D.H．Gelfand， J.J．Snoisky and T.L．White，Chapter 19，pp．153-158；Academic Press，Ne w York，1990記載の方法による）は、プライマーｐａｎ１およびｐａｎ３を組み 合わせて用いたＰＣＲにより分析され、ＡＡＶ陽性の場合は、（内部）プライマ ーｎｅｓｔ１およびｎｅｓｔ２（図１を参照）をそれぞれ用いたＰＣＲの繰返し （特異性確認のため）を続いて行った。ＰＣＲは４０サイクル行った（一サイク ルは９２℃，１分；６２℃，４分；９２℃，１５秒）（van den Brule et al.， (1989)J．Med．Virol.，29，pp．20-27）。増幅された産物は、電気泳動的分離 （２％アガロースゲル）および、ナイロン膜（Gene Screen，NEN，Dupont，Drei eich，Germany）上へのブロッティングとこれに続く、ＡＡＶ−２（ｐＴＡＶ２ ［Heilbronnetal．(1990)，J．Virol，64 pp.3012-3018）またはＡＡＶ−５に対 する³²Ｐ標識プローブ（Megaprime DNA Labelling System，Amersham，UKを用い て標識された）による高い厳密さのハイブリダイゼーションにより特徴づけら れた。このプローブは精製ＡＡＶ−５ウイルス粒子のＤＮＡからクローン化され 、アデノウイルスタイプ１２とともに増殖され、de La Maza and Carter(1980), J．Virol.，33．pp．1129-1137 およびRose(1974)Parvovirus Reproduction,pp ．1-61；In：H．Fraenkel-Conrat and R.R．Wagner,eds.，Comprehensive Virol ogy，Plenum Press,New York.中に記載されているように精製された。 実施例２ 新鮮掻爬物質中のＡＡＶ ＤＮＡのサザンブロット分析による検出 ゲノムＤＮＡを、常法にわずかな変更を加えた方法を用いて（Laird et al.(1 991)，Nucl．Acids Res.，Vol．19 pp．4293-4294）単離し、制限酵素で消化し 、ＡＡＶゲノム内の特徴的制限部位の分析を可能とした。０．８％アガロースゲ ルによる分離ののち、ＤＮＡ断片をナイロン膜（Gene Screen）上にブロッティ ングし、［α−³²Ｐ］ｄＣＴＰ（Amersham，Braunschweig，Germany）とのラン ダムプライミングにより標識された特異的ＡＡＶ−５ ＤＮＡ（表２を参照）ま たはＡＡＶ−２ ＤＮＡ （ｐＴＡＶ２、実施例１を参照）とハイブリダイズし た。 実施例３ 生検物質、例えば自然発生的流産の結果得られた掻爬物質の区分でのインサイ チュハイブリダイゼーションによるＡＡＶ ＤＮＡの検出 インサイチュハイブリダイゼーションを記載どおりにであるが（Tobiasch at al.(1992)Differentiation，50，pp．163-178）、ただし、ＡＡＶ−２ ＤＮＡ はＲＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーションで検出するという変更を加えて行った 。ＤＮａｓｅ処理後、プローブは限定アルカリ加水分解にさらされた。プラスミ ドｐＴＡＶ２（Heilbronn at al.(1990)、上部参照）をＥｃｏＲＶで直線化する ことによりリボプローブを得、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ（ＳＰ９／１７転写キッ トに供給されるベーリンガーマンハイム手順に記載されている方法）を用いた生 体外転写により、［³⁵Ｓ］−ＵＰＴで標識化した。ハイブリダイゼーションの前 に、プローブと標的ＤＮＡの両方を変性した（９３℃，１０ｍｉｎ）。［³²Ｐ］ −ＵＴＰ標識プローブとのインサイチュハイブリダイゼーションのためのプロト コル た。 実施例４ ＡＡＶキャプシドタンパク質を標的とした抗体の供給 ＡＡＶキャプシドタンパク質を標的としたモノクローナル抗体を開発するため に、２匹のＢＡＬＢ／ｃネズミに、等量の完全Freundアジュバンドと混合された 、ＶＰ１，ＶＰ２およびＶＰ３のおのおのを１００μｇ含むＰＢＳ中のゲル精製 組み換えキャプシドタンパク質混合物を１５０μｌ皮下（Ｓ．Ｃ．）接種した。 ４週間後、５０μｌＰＢＳおよび５０μｌ不完全Freundアジュバント中の２５μ ｇの精製されたＵＶ不活性化ＡＡＶ−２をＳ．Ｃ．で、ネズミに追加免疫した。 ４週間後、ネズミに１００μｌのＰＢＳ中の１０μｇのＵＶ不活性化ＡＡＶ−２ をそれぞれ腹腔（ｉ．ｐ．）接種した。３日後、１匹のネズミを殺し、脾臓細胞 を、常法に従い（Harlow，E．and Lane，D．(1988)，Cold Spring Harbor Labor atory，Antibodies，A laboratoty manual）Ｘ６３／Ａｇ８細胞と融合した。そ の結果得られたハイブリドーマ培養上清をウエスタンブロット、免疫蛍光および ＥＬＩＳＡによりスクリーニングした。２匹目のネズミを６カ月後にＰＢＳ中の １００μｇの精製ＶＰ３で免疫化し（ｉ．ｐ．）、上述のようにモノクローナル 抗体を調製した。 実施例５ ＡＡＶを標的としたＩｇＧ抗体の検出のためのＥＬＩＳＡ ９６ウエルのマイクロタイタープレート（Nunc，Denmark）を、５０μｌのＣ ｓＣｌ−勾配精製ＡＡＶ２（０．０５Ｍ炭酸バッファ−ｐＨ９．６中で１：１０ ００に希釈）または５０μｌの組み換えＡＡＶ２キャプシドタンパク質ＶＰ１− ３（０．０５Ｍ炭酸バッファー中で１：８０００に希釈）でコートし、室温で一 晩保温した。プレートを２度洗浄し（洗浄バッファー：ＰＢＳ，０．０５％Ｔｗ ｅｅｎ２０）、ヒト血清（５０μｌ／ウエル，１：２５から１：８００の希釈率 ；希釈バッファーＰＢＳ，２％ＢＳＡ，０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）を加えて、 ウェットチャンバー中で３７℃で１時間に亘り保温した。洗浄後、プレートを、 ５０μｌ／ウエルのペルオキシダーゼ結合抗ヒトＩｇＧサル抗体（１：２０００ ）とともに、ウェットチャンバー中で３７℃で４５分に亘って保温した。プレー ト を４回洗浄し、５０μｌの基質溶液（２５ｍｌの０．１Ｍクエン酸バッファーｐ Ｈ５．０中の５ｍｇ ＯＰＤ＋１０μｌのＨ₂Ｏ₂３５％）を加えた。プレートを １０−１５分間遮光下で保存し、５０μｌのＩＮ Ｈ₂ＳＯ₄／ウエルにより反応 を停止した。４９２ｎｍの吸光度をタイターテックフォトメーター（Titertek p hotometer）中で測定した。バックグラウンド信号を、ヒト血清を加えない吸光 度測定により決定し、すべてのウエルについて減じた（バックグラウンド信号の 吸光度は０．０３５から０．０５の範囲であった）。 実施例６ ＡＡＶを標的としたＩｇＭ抗体の検出のためのＥＬＩＳＡ バージョンＡ プレートを実施例４に記載されているようにコートした。残存しているＩｇＧ 抗体を除くために以下の吸収プロトコルに従って処理した後ヒト血清を添加した ：２０μｌの吸収試薬（FREKA-Fluor，Fresenius，Germany）を２５μｌのＰＢ Ｓで希釈し５μｌのヒト血清を加えた。吸収は室温で少くとも１５分間行い、続 いて１：１００から１：８００の希釈度で血清を試験した。ウェットチャンバー 中で３７℃で１時間に亘り保温し、洗浄後５０μｌ／ウエルのペルオキシダーゼ 結合抗ヒトＩｇＭヤギ抗体（１：２０００，ＰＢＳ／２％ＢＳＡ／０．０５％Ｔ ｗｅｅｎ２０中）を加えた。プレートを３７℃で４５分間に亘り保温し、４回洗 浄した。ＯＰＤ反応および測光評価を実施例５に記載したとおり行った。 バージョンＢ μ−キャプチャーＥＬＩＳＡ プレートのコーティング 抗ヒトＩｇＭウサギ抗体（ＤＡＫＯ）を、タンパク質濃度６００μｇ／ｍｌで 変性し、１００ｍＭ ＮａＣｌを含む−５０ｍＭグリシン／塩酸ｐＨ２．５中で ３０分間保温したのちＩＭトリス塩基で中和した。続いて溶液をコーティング溶 液（１００ｍＭ ＮａＣｌを含む１０ｍＭトリス／塩酸ｐＨ８．５）中で平衡化 したセファデックスＰＤ１０カラムに通過させることにより変性した抗体を脱塩 した。試料をカラムから同じバッファー中に溶出した。溶液をコーティングバッ ファーでの希釈により６μｇ／ｍｌのタンパク質濃度に調整し、ポリスチレンマ イクロタイタープレート（ＮＵＮＣイムノ平底ウエル）のおのおののウエルに２ ００μｌずつ加えた。プレートを３７℃で２４時間に亘り、高湿度雰囲気下で保 温し、内容物をデカントし、２５０μｌ／ウエルの０．０５％のＴｗｅｅｎ２０ を含むトリス緩衝食塩水（ＴＢＳ）（０．０２Ｍトリス塩酸ｐＨ７．４，０．１ ５Ｍ ＮａＣｌ）（洗浄バッファー）によりウエルを４回洗浄した。ウエルを続 いて、１％Ｔｗｅｅｎ２０および５％シュクロスを含むＴＢＳ（ブロッキング溶 液）とともに、４℃で保温することによりブロックし、続いて洗浄バッファー（ ０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＴＢＳ）中で２回洗浄した。 アッセイ ＥＬＩＳＡの第２の工程は患者の血清を、抗体をコートしたプレートと接触さ せることに関するものであった。保温の間、ＩｇＭは免疫学的に固相抗体と結合 した。未結合物質を除きマイクロタイタープレートを洗浄したのち、プレートを 精製組換えＡＡＶ核キャプシドタンパク質ＶＰ１，ＶＰ２およびＶＰ３とともに 保温した。未結合物質を除きマイクロタイタープレートを洗浄したのち、ヒトＩ ｇＭ抗体−ＶＰ複合体をＡ１，Ａ６９およびＢ１抗体とともに保温することによ り検出した。未結合モノクローナル抗体を吸引により除き、プレートを洗浄した 。プレートを、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）と結合した抗マスクイム ノグロブリンヤギ抗体とともに保温することにより、結合したモノクローナル抗 体を検出した。続いて未結合の酵素−抗体結合物を洗浄により除き、Ｈ₂Ｏ₂と３ ，３′、５，５′テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を含む溶液を加えた。適当 な間をおいたのち、硫酸の添加により反応を停止した。ＥＬＩＳＡのカットオフ （ｃｕｔｏｆｆ）値を、５個の陰性試料の平均光学密度に加えた３標準偏差（い かなる特異的結合も補正するため）として計質した。カットオフ値よりも高い吸 収値を有する試料のみを陽性とした。 特に、１０ｍｇ／ｍｌの牛血清アルブミンを含むＴＢＳ中に１：２００で希釈 した血清試料を１００μｌ加え、血清を含むウエルを室温で１時間に亘り保温す ることにより、プレート上の抗ヒトＩｇＭを血清と反応させた。保温後、血清試 料を吸引により除き、ウエルを洗浄溶液（ＴＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０） で５回洗浄した。ＶＰ１，ＶＰ２およびＶＰ３抗原混合物の１００μｌのアリコ ート（濃度１０−１０ｎＭ ＶＰ１，ＶＰ２およびＶＰ３）をおのおののウエル に加え、室温で少くとも２時間に亘り保温し、続いて吸引により過剰のプローブ を除去しＴＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で５回洗浄した。Ａ１，Ａ６９およ びＢ１モノクローナル抗体を生産するハイブリドーマ由来の培養上清（抗体濃度 １−１０ｎＭ）の混合物を１００μｌ加え、続いてプレートを５回標準的にＴＢ Ｓ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄することにより、結合したＶＰ１，ＶＰ２ およびＶＰ３を検出した。西洋ワサビペルオキシダーゼと結合した抗マウスＩｇ Ｇヒツジ抗体（Dako，Hamburg/Germany）の１／２０００希釈液を２００μｌ加 え、１．５時間に亘り室温で保温し続いてプレートを５回標準洗浄することによ り、モノクローナル抗体結合を検出した。酵素活性を、１００μｌのＴＭＢ溶液 （Serex，Maywood，N.J./USA）を加えることにより明らかにした。プレートを所 望の発色に至るまで保温し、５０μｌの２Ｎ硫酸の添加により反応を停止させた 。陰性対照および陽性対照の光学濃度（ＯＤ₄₅₀）を試料と同様に決定した。 ５個の陰性血清から計算したカットオフ値はＯＤ₄₅₀＝０．４０であった。 実施例７ ＡＡＶキャプシド検出のためのＥＬＩＳＡ プレートコーテング コーティングバッファー溶液（５０ｍＭ ＮａＨＣＯ₃ ｐＨ９．６）中で平衡 化したタンパク質濃度を１．５ｎｇ／ｍｌに調整したＡ２０抗体（上記参照）を １００μｌずつポリスチレンマイクロタイタープレート（ＮＵＮＣ イムノ平底 ウエル）のそれぞれのウエルに加えた。プレートを４℃で２４時間に亘り保温し 、内容物をデカントし、ウエルを５回、２５０μｌ／ウエルのリン酸緩衝食塩水 （ＰＳＢ）（洗浄バッファー）で洗浄した。３％ＢＳＡを含むＰＢＳ（ブロッキ ング溶液）２６０μｌで、少くとも３０分間室温で保温することによりブロック ウエルをし、続いてこのウェルを６回洗浄バッファー中で洗浄した。 アッセイ ＡＡＶキャプシドをＰＢＳを含む標準希釈液で希釈することにより１０−１０ ０００キャプシド／ｍｌの範囲内で標準曲線を用意した。 未知試料を適当に希釈溶液中に希釈し、１００μｌをテストウエルに添加した 。 組織培養上清をアッセイするときには、１：１０から１：１０⁸までの稀釈液を １００μｌずつテストウエルに添加した。 プレートを３時間に亘り室温で保温した。プレートを洗浄バッファー中で５回 洗浄し、３％ＢＳＡを含むＰＢＳで１：１０００に希釈した抗ＡＡＶポリクロー ナルウサギ抗血清１００μｌをそれぞれのウエルに添加した。プレートを室温で ２時間前回のように保温し、続いてＰＢＳ Ｔｗｅｅｎ中で５回洗浄した。ミエ ロペルオキシダーゼ結合抗ウサギＩｇＧヤギ抗体の１：２０００希釈の抗体希釈 液を１００μｌ加え、１時間に亘り室温で保温し、続いて５回のプレートの標準 洗浄により、ＡＡＶキャプシドを検出した。０．１Ｍ酢酸ナトリウムバッファー ｐＨ６中に調製された、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）の０．１ｍｇ／ｍｌ 溶液を１００μｌずつそれぞれのウエルに添加して酵素活性を明らかにした。プ レートを室温で所望の発色に至るまで保温したが、このときより低い濃度範囲即 ち１０キャプシド／ｍｌ以下の標準を検出するにはより長い保温時間が必要であ った。未知試料の濃度はそれらの光学密度を標準曲線と比較して決定した。 実施例８ 自然発生的流産の結果得られた掻爬物質中のＡＡＶ−ＤＮＡの検出 全体で５０個の自然発生的流産の結果得られた掻爬物質の離礁を、ＰＣＲまた はサザンブロットまたは両方により、ＡＡＶ ＤＮＡの存在に関して分析した。 ４１の試料は妊娠後最初の３カ月間の流産であり、９の試料は妊娠後第２または 第３の３カ月間の流産であった。 妊娠の最初の３カ月間中に得られた４１試料のうち、１４はサザンブロットに より分析可能な新鮮物質を含み、その方法により９つの試料が陽性を示した。他 のすべての分析試料は、パラフィン投入組織の区分であり、ＰＣＲにより分析し た。これらのうち、３０は妊娠の最初の３カ月間の流産によるものであり、その うちの１２がＡＡＶ ＤＮＡ陽性を示した。妊娠後第２または第３の３カ月間の 試料９個は、ＰＣＲではすべて陰性であった。 このように、４１試料中の２１、すなわち、妊娠後最初の３カ月間の自然発生 的流産の５０％に、ＡＡＶ特異的ＤＮＡ配列が検出されたが、９個の妊娠後第２ または第３の３カ月間自然発生的流産は陰性であった（表３参照）。 実施例９ 健康な発端者（proband）、流産とは関係のないさまざまな症候群の患者、お よび妊娠後最初の３カ月間で自然発生的流産のあった妊婦から採取された全部で １４８の血清試料の血清をＡＡＶを標的とした抗体に関して分析した。 得られた結果を表４に示す。一般的にＩｇＧ特異的抗体の普及は極めて高く、 異なったグループの発端者／患者においては６２％から１００％の間であった。 しかしながら、ＩｇＭ特異的抗体は、顕著に「妊娠問題」と関連していることが 明らかとなった。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｇ０１Ｎ 33/569 0276−2Ｊ Ｇ０１Ｎ 33/569 Ｌ // Ｃ１２Ｎ 15/09 9162−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (72)発明者 ゲレトネキー，カルステン ドイツ連邦共和国 69115 ハイデルベル グ レーメル ストラーセ 20 (72)発明者 ラブロー，ミシェル フランス国 ボルドー Ｆ―33200 リュ エフ マルソー 13 (72)発明者 シュレホーフェル，ヨルグ ドイツ連邦共和国 69181 ライメン フ ァイルガッセ 14 (72)発明者 トビアシュ，エッダ ドイツ連邦共和国 69221 ドッセンハイ ム アム ペトルス ９

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．自然発生的流産の原因となる作用物の検出方法であって、 （ａ） ＡＡＶポリヌクレオチドに対するプローブを、ＡＡＶ核酸のプロー ブとの間にヘテロ二本鎖を形成できる条件下で流産の結果得られた物質の試料の 核酸とハイブリダイズさせ、 （ｂ） 前記プローブを含む二本鎖ポリヌクレオチドを検出する、各工程か らなる方法。 ２．ＰＣＲ，サザンブロットあるいはインサイチュハイブリダイゼーション技術 である請求の範囲第１項記載の方法。 ３．プライマーｐａｎ１，ｐａｎ３，ｎｅｓｔ１およびｎｅｓｔ２からなる群か ら選択される１以上のプローブが使用されることを特徴とする請求の範囲第１項 記載の方法。 ４．自然発生的流産の原因となる作用物の検出方法であって、 （ａ） ＡＡＶ抗原に対するプローブ抗体と、流産の結果得られた物質の試 料を、抗原−抗体複合物を形成できる条件下で保温し、 （ｂ） 前記プローブ抗体を含む抗原−抗体複合物を検出する各工程からな る方法。 ５．前記プローブ抗体がＡ１（ＤＳＭ ＡＣＣ ２１９５，１９９４年１０月１ ３日寄託）、Ａ２０（ＤＳＭ ＡＣＣ ２１９４，１９９４年１０月１３日寄託 ）、Ａ６９（ＤＳＭ ＡＣＣ ２１９６，１９９４年１０月１３日寄託）、およ び／またはＢ１（ＤＳＭ ＡＣＣ ２１９７，１９９４年１０月１３日寄託）で あることを特徴とする請求の範囲第４項記載の方法。 ６．ＥＬＩＳＡ，ＲＩＡ，ＦＩＡまたはＩＦＡであることを特徴とする請求の範 囲第４項または第５項記載の方法。 ７．自然発生的流産の原因となる作用物の検出方法であって、 （ａ） ＡＡＶもしくはその抗原性部分を含む試料を、抗ＡＡＶ抗体を含む 疑いのある試料と、抗原−抗体複合物を形成できる条件下で保温し、 （ｂ） 前記プローブ抗原を含む抗原−抗体複合物を検出する、各工程から なる方法。 ８．前記ＡＡＶの抗原性部分がＶＰ１，ＶＰ２またはＶＰ３であることを特徴と する請求の範囲第７項記載の方法。 ９．前記抗原−抗体複合物中の抗体がＩｇＭ型であることを特徴とする請求の範 囲第７項または第８項記載の方法。 １０．ＥＬＩＳＡ，ＲＩＡ，ＦＩＡまたはＩＦＡであることを特徴とする請求の 範囲第７項ないし第９項いずれか１項記載の方法。 １１．前記ＡＡＶポリヌクレオチドに対するプローブを適切なコンテナ中に含む ことを特徴とする請求の範囲第１項記載の方法を実施するためのキット。 １２．前記ＡＡＶ抗原に対するプローブ抗体を適切なコンテナ中に含むことを特 徴とする請求の範囲第４項記載の方法を実施するためのキット。 １３．前記プローブ抗体がＡ１（ＤＳＭ ＡＣＣ ２１９５，１９９４年１０月 １３日寄託）、Ａ２０（ＤＳＭ ＡＣＣ ２１９４，１９９４年１０月１３日寄 託）、Ａ６９（ＤＳＭ ＡＣＣ ２１９６，１９９４年１０月１３日寄託）、お よび／またはＢ１（ＤＳＭ ＡＣＣ ２１９７，１９９４年１０月１３日寄託） であることを特徴とする請求の範囲第１２項記載のキット。 １４．ＡＡＶまたはその抗原性部分を適切なコンテナ中に含むことを特徴とする 請求の範囲第７項記載の方法を実施するためのキット。 １５．前記ＡＡＶの抗原性部分がＶＰ１，ＶＰ２および／またはＶＰ３であるこ とを特徴とする請求の範囲第１４項記載のキット。 １６．ＡＡＶ抗原に対する抗体。 １７．前記抗体がＡＡＶキャプシドまたはそのタンパク質に対するものであるこ とを特徴とする請求の範囲第１６項記載の抗体。 １８．前記抗体がＡ１（ＤＳＭ ＡＣＣ ２１９５，１９９４年１０月１３日寄 託）であることを特徴とする請求の範囲第１７項記載の抗体。 １９．前記抗体がＡ２０（ＤＳＭ ＡＣＣ ２１９４，１９９４年１０月１３日 寄託）であることを特徴とする請求の範囲第１７項記載の抗体。 ２０．前記抗体がＡ６９（ＤＳＭ ＡＣＣ ２１９６，１９９４年１０月１３日 寄託）であることを特徴とする請求の範囲第１７項記載の抗体。 ２１．前記抗体がＢ１（ＤＳＭ ＡＣＣ ２１９７，１９９４年１０月１３日寄 託）であることを特徴とする請求の範囲第１７項記載の抗体。