DE69422634T2

DE69422634T2 - Adeno-assozierter virus - dessen diagnostischen anwendung für frühe abtreibung

Info

Publication number: DE69422634T2
Application number: DE69422634T
Authority: DE
Inventors: Karsten Geletneky; Andrea Kern; Juergen Kleinschmidt; Michele Rabreau; Joerg Schlehofer; Edda Tobiasch
Original assignee: Deutsches Krebsforschungszentrum DKFZ
Current assignee: Deutsches Krebsforschungszentrum DKFZ
Priority date: 1993-10-28
Filing date: 1994-10-28
Publication date: 2000-07-27
Anticipated expiration: 2014-10-29
Also published as: DK0725837T3; EP0725837A1; JPH09504173A; EP0725837B1; DE69422634D1; US6927281B1; CA2175256A1; ATE188746T1; WO1995011997A1

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis eines verursachenden Erregers des sogenannten spontanen Frühaborts durch Untersuchen von Patientenproben auf die Anwesenheit von Adeno-assoziierter Virus-DNA (AAV- DNA) oder AAV-Antigen oder Antikörpern, vorzugsweise vom IgM-Typ, gegen AAV. Weiterhin betrifft die Erfindung Antikörper, die für dieses Verfahren geeignet sind.
Die Adeno-assoziierten Viren (AAV), die menschliche Parvoviren sind, welche für ihre Vermehrung auf begleitend infizierende Helferviren angewiesen sind, werden für nicht pathogen gehalten (Siegl, G. u. a. (1985), Intervirology, 23, Seite 61-73; Berns, K. I. u. a. (1987), Adv. Virus Res., 32, Seite 243-306), sondern man nimmt vielmehr an, daß sie Tumor unterdrückende Eigenschaften haben (Rommelaere u. a. (1991), J. Virol. Methods, 33, Seite 233-251). Der Virus kann in infizierten Personen überdauern, möglicherweise durch Integration seiner DNA in bestimmte Chromosomenorte des Wirtszellengenoms, wie in der Zellkultur zu sehen ist. Kürzlich in unseren Laboratorien durchgeführte Studien haben gezeigt, daß AAV in der Lage ist, bei einer Vielzahl von Zellen, die vom Menschen und der Maus abstammen (Klein-Bauernschmitt u. a. (1992), J. Virol. 66, Seite 4191- 4200), sowie bei embryonalen Stammzellen eine Differenzierung herbeizuführen. Im Verlauf der Suche nach mutmaßlichen Zielen einer AAV-Infektion haben wir Material von Spontanaborten auf die Anwesenheit von AAV-DNA unter Anwendung von zum Beispiel der Polymerase-Kettenreaktion (PCR), der Southern-Blot-Technik und der in situ-Hybridisierungstechnik analysiert. Außerdem haben wir Serumproben von Frauen, die eine Fehlgeburt hatten, und von anderen erkrankten oder gesunden Frauen auf die Anwesenheit von Antikörpern gegen AAV analysiert, und zwar unter Anwendung von serologischen Standardverfahren wie zum Beispiel dem Festphasen-Enzymimmunoassay (ELISA), dem Fluoreszenzimmuno-Assay (FIA), dem Radioimmuno-Assay (RIA) oder Immunfluoreszenz-Assay (IFA).
Wir haben überraschenderweise einen bedeutsamen Zusammenhang sowohl zwischen nachweisbarer AAV-DNA in Proben von Abortmaterial als auch nachweisbaren IgM-Antikörpern gegen AAV und dem Frühabort, der während des ersten Drittels der Schwangerschaft aufgetritt, festgestellt.

Offenbarung der Erfindung

Demgemäß betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Nachweis des verursachenden Erregers eines Spontanaborts, umfassend die Stufen:
a) Hybridisieren einer Sonde für ein AAV-Polynucleotid mit Nucleinsäuren einer Probe von Abortmaterial unter Bedingungen, die die Bildung einer Heteroduplex zwischen einer AAV-Nucleinsäure und der Sonde erlauben, und
b) Nachweis eines Polynucleotiddoppelstranges, der die Sonde enthält.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das oben genannte Verfahren eine Polymerase-Kettenreaktion (PCR), ein Southern Blot oder eine in situ-Hybridisierungstechnik.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird eine Hybridisierungstechnik verwendet, wie oben beschrieben, wobei eine oder mehrere Nucleinsäuresonde(n) verwendet wird/werden, die aus der Gruppe bestehend aus den Primern pan1 (SEQ ID No. 1), pan3 (SEQ ID No. 4), nest1 (SEQ ID No. 2) und nest2 (SEQ ID No. 3) ausgewählt ist/sind. Die Fig. 1 zeigt eine schematische Darstellung dieser Primer mit Bezug auf das Genom vom AAV Typ 2 (AAV-2) und die Nucleotidsequenzen der Primer.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiter ein Verfahren zum Nachweis des verursachenden Erregers eines Spontanaborts, umfassend die Stufen:
a) Inkubieren eines Sondenantikörpers gegen ein AAV-Antigen mit einer Probe von Abortmaterial unter Bedingungen, die die Bildung eines Antigen-Antikörper-Komplexes erlauben, und
b) Nachweis des Antigen-Antikörper-Komplexes, der den Sondenantikörper enthält.
In Stufe (a) können ein oder mehrere Sondenantikörper verwendet werden. Diese Antikörper können zum Beispiel gegen ein AAV-Capsid oder ein einzelnes Protein davon, insbesondere VP1, VP2 oder VP3, gerichtet sein. Beispiele für die Antikörper sind die folgenden monoklonalen:
A1; hinterlegt am 13. Oktober 1994 bei DSM unter DSM ACC2195
A69; hinterlegt am 13. Oktober 1994 bei DSM unter DSM ACC2196
B1; hinterlegt am 13. Oktober 1994 bei DSM unter DSM ACC2197
A20; hinterlegt am 13. Oktober 1994 bei DSM unter DSM ACC2194 (siehe Tabelle 1).
Die Antikörper, wie oben angegeben, sind Gegenstand der vorliegenden Erfindung.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das Verfahren des Antigennachweises wie oben ausgeführt ein Festphasen- Enzymimmunoassay (ELISA), ein Radioimmunoassay (RIA), ein Fluoreszenz- Immunoassay (FIA) oder ein Immunfluoreszenz-Assay (IFA).
Ein Beispiel für den ELISA umfaßt die folgenden Stufen:
(a) Bereitstellen eines Substrats mit dem monoklonalen Antikörper A20,
(b) Kontaktieren des Substrats von (a) mit einer Probe eines Abortmaterials, um einen Antigen-Antikörper-Komplex zu erhalten,
(c) Kontaktieren des Komplexes von (b) mit einem polyklonalen Anti- AAV-Capsid-Antikörper, um einen Antikörper-Antigen-Antikörper-Komplex zu erhalten,
(d) Kontaktieren des Komplexes von (c) mit einem Enzym-markierten Antikörper gegen den polyklonalen Antikörper von (c), um einen markierten Komplex von (c) zu erhalten, und
(e) Kontaktieren des Komplexes von (d) mit einem Enzym-markierten Indikator, um die Anwesenheit dieses Komplexes nachzuweisen.
Es ist klar, daß der Ausdruck "Probe eines Abortmaterials" nur ein Beispiel für die Materialien ist, die AAV-Capside oder Teile davon enthalten. Ein weiteres Beispiel sind Zellen, die rekombinante AAV-Capside oder Teile davon exprimieren.
Die vorliegende Erfindung, d. h. die Antikörper allein oder in Verbindung mit dem AAV-Antigen-Nachweisverfahren, ist dazu geeignet, AAV-Capside und/oder Teile davon in jedem Material nachzuweisen.
Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Nachweis des verursachenden Erregers eines Spontanaborts, umfassend die folgenden Stufen:
a) Inkubieren einer Probe, die AAV oder einen antigenen Teil davon enthält, mit einer Probe, die vermutlich Anti-AAV-Antikörper enthält, unter Bedingungen, die die Bildung eines Antikörper-Antigen-Komplexes, der vorzugsweise nur Antikörper vom IgM-Typ enthält, erlauben und
b) Nachweis eines Antikörper-Antigen-Komplexes, vorzugsweise des IgM-Antikörper-Antigen-Komplexes, der das Sondenantigen enthält.
In Stufe (a) bezieht sich der Ausdruck "Probe, die AAV oder einen antigenen Teil davon enthält" auf AAV-Capsidproteine, besonders auf VP1, VP2 und/oder VP3, ganz bevorzugt.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das Verfahren zum Nachweis von AAV-spezifischen Antikörpern, insbesondere IgM-Antikörpern, ein ELISA, ein RIA, ein FIA oder ein IFA.
Ein Beispiel für den ELISA umfaßt die folgenden Stufen:
(a) Bereitstellen eines Substrats mit einem Anti-Mensch-IgM- Antikörper,
(b) Kontaktieren des Substrats von (a) mit der Körperflüssigkeit eines Patienten, um einen Antikörper-Antikörper-Komplex zu erhalten,
(c) Kontaktieren des Komplexes von (b) mit rekombinantem VP1, VP2 und/oder VP3, um einen VP-Antikörper-Antikörper-Komplex zu erhalten,
(d) Kontaktieren des Komplexes von (c) mit einem Anti-VP-Antikörper, um einen Anti-VP-Antikörper-VP-Antikörper-Antkörper-Komplex zu erhalten,
(e) Kontaktieren des Komplexes von (d) mit einem Enzym-markierten Antikörper gegen den Anti-VP-Antikörper von (d), um einen markierten Komplex von (d) zu erhalten, und
(f) Kontaktieren des Komplexes von (e) mit einem Enzym-markierten Indikator, um die Anwesenheit dieses Komplexes nachzuweisen.
Es ist ersichtlich, daß hartnäckige Anti-AAV-IgM/IgG-Titer im Serum mit einer Prädisposition für Frühabort verknüpft sind. Daher kann die vorliegende Erfindung auch für erfolgreiches Screening nach Risikofaktoren, die Entwicklung von Verfahren zur Verhinderung des Scheiterns einer Schwangerschaft und zur Information von Patienten über die Risiken bezüglich des Scheiterns einer Schwangerschaft eingesetzt werden.
Darüber hinaus betrifft die vorliegende Erfindung einen Kit zum Nachweis des verursachenden Erregers eines Spontanaborts durch Hybridisierung, wie oben beschrieben, der eine Sonde für ein AAV-Polynucleotid in einem geeigneten Behältnis umfaßt, wobei die Sonde aus den Primern pan 1, pan 3, nest 1 und nest 2, wie oben angegeben, ausgewählt ist. Die vorliegende Erfindung betrifft weiter einen Kit zum Nachweis des verursachenden Erregers eines Spontanaborts durch immunologischen Antigen-Nachweis, wie oben beschrieben, der einen Sonden-Antikörper gegen ein AAV-Antigen in einem geeigneten Behältnis umfaßt, wobei die Sonden-Antikörper A1, A20, A69 und/oder B1 sind, wie oben angegeben.

Methoden zur Durchführung der Erfindung:

Das Fachgebiet ist reich an Verfahren, die dem Fachmann auf dem Gebiet der rekombinanten Nucleinsäurentechnik, der Mikrobiologie und Immunobiologie zum Durchführen der vorliegenden Erfindung zur Verfügung stehen. Ausführliche Beschreibungen aller dieser Techniken sind in der einschlägigen Literatur zu finden. Siehe beispielsweise Maniatis, Fritsch & Sambrook: Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1989); DNA Cloning, Bd. I und II (D. N. Glover Hrsg., 1985); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait Hrsg., 1984); Nucleic Acid Hybridization (B. D. Hames & S. J. Higgins, Hrsg., 1984); Animal Cell Culture (R. I. Freshney Hrsg., 1986); J. D. Watson, M. Gilman, J. Witkowski, M. Zoller: Recombinant DNA, 2. Auflage (1992); Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology (Academic Press, London, 1987); Protein Purification: Principles and Practice, 2. Auflage (Springer Verlag, N. Y.); Handbook of Experimental Immunology, Bd. I-IV (D. M. Weir und C. C. Blackwell, Hrsg., 1986); Immunoassay: A Practical Guide (D. W. Chan und M. T. Perlstein Hrsg., 1987); ELISA and Other Solid Phase Immunoassays: Theoretical and Practical Aspects (D. M. Kemeny und S. J. Challacombe Hrsg., 1988); Principles and Practice of Immunoassay (C. P. Price und D. J. Newman Hrsg., 1991).
Ausführlichere Informationen über spezielle methodologische Aspekte von AAV, wie beispielsweise Zellkultur, Viruswachstum, Virusreinigung, Isolierung von Proteinen, sind in der einschlägigen Literatur zu finden, zum Beispiel im Handbook of Parvoviruses, Bd. I und II, CRC Press, Boca Raton, Florida, Hrsg. P. Tijssen; Ruffing, M. u. a. (1992), J. Virol. 66, Seite 6922-6930.
Alle Reagenzien, wie beispielsweise Antigene, Antikörper, Sondenantigene, Sondenantikörper, Nucleinsäuresonden, Primer und Hilfsreagenzien, die notwendig sind, um einen Immunoassay oder einen Hybridisierungsassay durchzuführen, möglicherweise unter Verwendung von Amplifizierungtechniken für die verbesserte Empfindlichkeit, können in geeignete Behältnisse gegeben oder auf jeder Festphase wie zum Beispiel Plastik, Glas und Zellen aufgebracht und zusammen mit den Anweisungen zur Durchführung des Tests in Kits verpackt werden.
Die vorliegende Erfindung wird anhand der nachfolgenden Beispiele erläutert.

Beispiel 1

Nachweis durch Analyse von AAV-DNA mittels Polymerase-Kettenreaktion (PCR) in einem biologischen, z. B. Kürettage-, Material eines Spontanaborts.
Die Primer, die beim PCR (pan1, pan3 (SEQ ID No. 1 und 4)) bzw. nested PCR (nest1, nest2 (SEQ ID No. 2 und 3)) verwendet wurden, waren dafür vorgesehen, Sequenzen von AAV-2- und AAV-5-DNA zu hybridisieren, wobei Fehlpaarungen, die nicht zur Amplifizierung von anderen (z. B. zellulären) DNA-Sequenzen führten, zugelassen waren. Die amplifizierten Produkte können mittels Southern- Blot-Experimenten unterschieden werden. Die Primer wurden nach Standard- Verfahren hergestellt.
Die Primer waren dafür vorgesehen, Fehlpaarungen (unterstrichen) wie unten veranschaulicht aufzuzeigen:
DNA aus histologischen Schnitten (5 um, eines frischen oder fixierten, in Paraffin eingebetteten, entparaffinierten Materials [Verfahren wie von D. H. Wright und M. M. Manos in "PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications", herausgegeben von M. A. Innis, D. H. Gelfand, J. J. Snoisky und T. L. White, Kapitel 19, Seite 153-158, Academic Press, New York, 1990 beschrieben]) wurde mittels PCR unter Verwendung der Primer pan1 (SEQ ID No. 1) und pan3 (SEQ ID No. 4) in Kombination und nachfolgend, in AAV-positiven Fällen, durch eine Wiederholung des PCR (zur Bestätigung der Spezifizität) unter Verwendung der (internen) Primer nest1 (SEQ ID No. 2) bzw. nest2 (SEQ ID No. 3) (siehe die Figur) analysiert. PCRs wurden in 40 Zyklen (ein Zyklus = 92ºC, 1 min. 62ºC, 4 min.; 92ºC 15 sec.) (von den Brule u. a., (1989), J. Med. Virol., 29, Seite 20-27) durchgeführt. Amplifizierte Produkte waren durch elektrophoretische Auftrennung (2% Agarosegel) und Blotting auf eine Nylonmembran (Gene Screen, NEN, Dupont, Dreieich, Deutschland) und nachfolgend durch Hybridisierung mit hoher Stringenz mit ³²P-markierten Sonden (markiert unter Verwendung von Megaprime® DNA Labelling System, Amersham, UK) von AAV-2 (pTAV2 [Heilbronn et al. (1990), J. Virol. 64, Seite 3012-3018]) oder von AAV-5 gekennzeichnet. Diese Sonde wurde aus DNA aus gereinigten AAV-5-Virionen kloniert, mit Adenovirus Typ 12 vermehrt und wie in de La Maza und Carter (1980), J. Virol. 33, Seite 1129-1137 und in Rose (1974), Parvovirus Reproduction, Seite 1-61, in: H. Fraenkel-Conrat und R. R. Wagner, Hrsg., Comprehensive Virology, Plenum Press, New York beschrieben, gereinigt.

Beispiel 2

Nachweis mittels Southern-Blot-Analyse von AAV-DNA in frischem Kürettage-Material

Genomische DNA wurde unter Verwendung von Standardverfahren mit leichten Modifikationen isoliert (Laird u. a. (1991), Nucl: Acids Res., Bd. 19, Seite 4293- 4294) und mit Restriktionsenzymen verdaut, wobei die Analyse von charakteristischen Restriktions-Schnittstellen innerhalb des AAV-Genoms zugelassen war. Nach Auftrennung durch 0,8% Agarosegele wurden die DNA- Fragmente auf Nylonmembranen (Gene Screen) geblottet und hybridisierten AAV-2-DNA (pTAV2, siehe Beispiel 1) oder spezifische AAV-5-DNA (siehe Tabelle 2 und SEQ ID No. 9), die durch 'Random Priming' mit [α-³²P]dCTP (Amersham, Braunschweig, Deutschland) markiert wurde.

Beispiel 3

Nachweis von AAV-DNA durch in situ-Hybridisierung in Biopsiematerialschnitten, z. B. Kürettagen eines Spontanaborts

In situ-Hybridisierung wurde wie beschrieben durchgeführt (Tobiasch u. a. (1992), Differentiation, 50, Seite 163-178), jedoch mit der Modifizierung, daß AAV-2-DNA durch RNA-DNA-Hybridisierung nachgewiesen wurde. Nach der DNase- Behandlung wurden die Sonden begrenzter Alkalihydroylse unterworfen. Nach Linearsierung des Plasmids pTAV2 (Heilbronn u. a. (1990), siehe oben) mit EcoRV wurden Ribosonden erhalten und mit [³&sup5;S]-UTP durch in vitro- Transkription mit T7-RNA-Polymerase (Methode wie in dem Verfahren von Boehringer Mannheim beschrieben, das mit dem "SP6/17 Transkriptionskit" ausgestattet war) markiert. Vor der Hybridisierung wurden sowohl die Sonde als auch die Ziel-DNA denaturiert (93ºC, 10 min.). Für die in situ-Hybridisierung mit Sonden, die mit [³²P-]-UTP markiert waren, war das Protokoll wie in Dürst u. a. (1992), Virology, 189, Seite 132-140, beschrieben.

Beispiel 4

Bereitstellen von Antikörpern gegen AAV-Capsidproteine

Um monokolonale Antikörper gegen AAV-Capsidproteine zu produzieren, wurde zwei BALB/c-Mäusen subkutan (s. c.) 150 ul eines Gemischs von gelgereinigten rekombinanten Capsidproteinen in PBS enthaltend jeweils 100 ug VP1, VP2 und VP3, gemischt mit einem gleichen Volumen an komplettem Freunds Adjuvans, injiziert. Nach vier Wochen wurden die Mäuse s. c. mit 25 ug gereinigtem UV-inaktiviertem AAV-2 in 50 ul PBS und 50 ul inkomplettem Freunds Adjuvans geboostet. Nach vier Wochen wurde den Mäusen intraperitoneal (i. p.) je 10 ug UV-inaktiviertes AAV-2 in 100 ul PBS injiziert. Drei Tage später wurde eine Maus getötet und die Milzzellen wurden mit X63/Ag8-Zellen nach Standardverfahren (Harlow, E. und Lane, D. (1988), Cold Spring Harbor Laboratory, Antibodies, A Laboratory Manual) fusioniert. Die sich ergebenden Hybridomakulturüberstände wurden mittels Western Blot, Immunfluoreszenz und ELISA gescreent. Die zweite Maus wurde sechs Monate später mit 100 ug gereinigtem VP3 in PBS (i. p.) immunisiert und monoklonale Antikörper wurden hergestellt wie oben beschrieben.

Beispiel 5:

ELISA zum Nachweis von IgG-Antikörpern gegen AAV

96er Mikrotiterplatten (Nung, Dänemark) wurden mit 50 ul CsCl-Gradientengereinigtem AAV 2 (Verdünnung 1 : 1000 in 0,05 M Carbonatpuffer, pH 9,6) oder mit 50 ul rekombinanten AAV-2-Capsidproteinen VP1-3 (1 : 8000 in 0,05 M Carbonatpuffer) beschichtet und über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert. Die Platten wurden zweimal gewaschen (Waschpuffer: PBS, 0,05% Tween® 20) und menschliche Seren wurden zugegeben (50 ul/Vertiefung, Verdünnungen 1 : 25 bis 1 : 800, Verdünnungspuffer: PBS, 2% BSA, 0,05% Tween® 20) und bei 37ºC in einer Feuchtkammer 1 Stunde lang inkubiert. Nach dem Waschen wurden die Platten mit 50 ul/Vertiefung Peroxidase-gekoppelten Affen Anti-Mensch-IgG- Antkörpern (1 : 2000) bei 37ºC in einer Feuchtkammer 45 Minuten lang inkubiert. Die Platten wurden viermal gewaschen und 50 ul Substratlösung (5 mg OPD in 25 ml 0,1 M Citratpuffer pH 5,0 + 10 ul H&sub2;O&sub2; 35%) wurde hinzugefügt. Die Platten wurden 10 bis 15 Minuten im Dunkeln gelagert, und die Reaktion wurde mit 50 ul 1 N H&sub2;SO&sub4;/Vertiefung beendet. Extinktionen wurden bei 492 nm mit einem Titertek® Photometer gemessen. Das Hintergrund- bzw. Störsignal wurde durch Messung der Extinktion ohne Hinzufügen von menschlichen Seren ermittelt und bei jeder Vertiefung subtrahiert (die Störsignallöschung lag im Bereich von 0,035 bis 0,05).

Beispiel 6:

ELISA zum Nachweis von IgM-Antikörpern gegen AAV

Version A

Die Platten wurden wie im Beispiel 4 beschrieben beschichtet. Menschliche Seren wurden hinzugefügt, nachdem sie gemäß dem folgenden Absorptionprotokoll behandelt worden waren, um verbleibende IgG-Antikörper zu entfernen: 20 ul Absorptionreagenz (FREKA-Fluor, Fresenius, Deutschland) wurden mit 25 ul PBS verdünnt, und 5 ul menschliches Serum wurde hinzugefügt. Die Absorption wurde mindestens 15 Minuten bei Raumtemperatur durchgeführt, und danach wurden die Seren in Verdünnungen von 1 : 100 bis 1 : 800 getestet. Die Inkubation erfolgte während einer Stunde bei 37ºC in einer Feuchtkammer und nach dem Waschen wurde 50ul/Vertiefung Peroxidasegekoppelter Ziegen Anti-Mensch-IgM-Antikörper (1 : 2000 in PBS/2% BSA/0,05% TWEEN® 20) hinzugefügt. Die Platten wurden 45 Minuten bei 37ºC inkubiert und viermal gewaschen. Die OPD-Reaktion und photometrische Bewertung wurden wie im Beispiel 5 beschrieben durchgeführt.

Version B

u-Einfang ELISA (u-capture ELISA)

Plattenbeschichtung

Kaninchen Anti-Mensch-IgM-Antikörper (DAKO) wurde zuerst in einer Proteinkonzentration von 600 ug/ml denaturiert, in 50 mM Glycin/HCl pH 2,5 mit 100 mM NaCl 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert und anschließend mit 1 M Tris-Base neutralisiert. Der denaturierte Antikörper wurde dann entsalzt, indem die Lösung über eine Sephadex®-PD10-Säule geleitet wurde, die in der Beschichtungslösung (10 mM Tris/HCl pH 8,5 mit 100 mM NaCl) äquilibriert wurde. Die Probe wurde aus der Säule in denselben Puffer eluiert. Die Lösung wurde auf eine Proteinkonzentration von 6 ug/ml durch Verdünnung in Beschichtungspuffer eingestellt, und 200 ul wurden zu jeder Vertiefung auf einer Polystyrol-Mikrotiterplatte gegeben (NUNC immuno flat-bottomed well). Die Platte wurde bei 37ºC 24 Stunden lang in einer feuchten Atmosphäre inkubiert, der Inhalt dekantiert und die Vertiefungen wurden viermal mit 250 ul/Vertiefung Tris gepufferter Salzlösung (TBS) (0,02 M Tris/HCl, pH 7,4, 0,15 M NaCl) mit 0,05% Tween® 20 (Waschpuffer) gewaschen. Die Vertiefungen wurden dann mit TBS, das 1% Tween® 20 und 5% Saccharose (Blocklösung) enthielt, durch Inkubation bei 4ºC und nachfolgend 2 Waschschritten in Waschpuffer (TBS mit 0,05% Tween® 20) blockiert.

Analyse

Die zweite Stufe des ELISA umfaßte das Kontaktieren von Patientenseren mit der mit Antikörpern beschichteten Platte. Während der Inkubation wurde das IgM immunologisch an den Festphasen-Antikörper gebunden. Nach dem Entfernen des ungebundenen Materials und dem Waschen der Mikrotiterplatten wurden die Platten mit gereinigten rekombinanten AAV-Nucleocapsidproteinen VP1, VP2 und VP3 inkubiert. Nach dem Entfernen des ungebundenen Materials und dem Waschen der Mikrotiterplatten wurden Komplexe von Mensch-IgM-Antikörper-VP- Komplexen durch Inkubation mit den A1, A69 und B1 Antikörpern nachgewiesen. Ungebundene monoklonale Antikörper wurden durch Ansaugen entfernt, und die Platten wurden gewaschen. Die gebundenen monoklonalen Antikörper wurden durch Inkubation der Platten mit Ziegen Anti-Maus-Immunoglobulin-Antikörpern, die mit Merrettich-Peroxidase (HRP) gekoppelt waren, nachgewiesen. Nach dem Entfernen von ungebundenem Konjugat durch Waschen wurde eine Lösung, die H&sub2;O&sub2; 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin (TMB) enthielt, hinzugefügt. Die Reaktionen wurde nach einem geeigneten Zeitraum durch Hinzufügen von Schwefelsäure beendet. Der Beendungswert für den ELISA wurde errechnet als durchschnittliche optische Dichte von fünf negativen Proben plus 3 Standardabweichungen (um eine nichtspezifische Bindung zu korrigieren). Proben, die Absorptionswerte hatten, welche oberhalb des Beendungswerts lagen, wurden als positiv angesehen.
Im Besonderen wurde das Anti-Mensch-IgM auf der Platte mit Serum reagiert, indem 100 ul Serumproben in einer Verdünnung von 1 : 200 in TBS mit 10 mg/ml Rinderserumalbumin hinzugefügt wurde und die Serum enthaltenden Vertiefungen 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert wurden. Nach der Inkubation wurden die Serumproben durch Ansaugen entfernt, und die Vertiefungen wurden 5 Mal mit Waschlösung (TBS + 0,05% Tween®20) gewaschen. Aliquote von 100 ul des VP1-, VP2- und VP3-Antigengemischs (Konzentration von 10-10 nM VP1, VP2 und VP3) wurden zu jeder Vertiefung hinzugegeben, und die Platten wurden mindestens 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert, und nachfolgend wurde überschüssige Sonde durch Ansaugen und 5maligem Waschen mit TBS + 0,05% Tween®20 entfernt.
Gebundenes VP1, VP2 und VP3 wurde durch Hinzufügen von 100 ul eines Gemisches aus Hybridomaüberständen von Hybridomas, die die monoklonalen Antikörper A1, A69 und B1 produzierten (Antikörperkonzentration 1-10 nM), nachgewiesen, und nachfolgend wurden die Platten 5 Mal mit TBS + 0,05% Tween®20 nach Standardverfahren gewaschen. Die Bindung von monoklonalen Antikörpern wurde durch Hinzufügen von 200 ul einer 1 /2000 Verdünung eines Schaf Anti-Maus-IgG Merrettich-Peroxidase-gekoppelten Antikörpers (Dako, Hamburg, Deutschland) nachgewiesen und 1,5 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert, und danach wurde die Platte 5 Mal nach Standardverfahren gewaschen. Die Enzymaktivität wurde durch Hinzufügen von 100 ul einer Lösung aus TMB (Serex, Maywood, N. J., USA) nachgewiesen. Die Platte wurde inkubiert, bis die gewünschte Farbentwicklung erreicht war und durch Hinzufügen von 50 ul 2 N-Schwefelsäure beendet. Die optischen Dichten (OD&sub4;&sub5;&sub0;) von negativen und positiven Kontrollseren sowie Proben wurden bestimmt. Der Beendungswert, wie er aus fünf negativen Seren errechnet wurde, betrug OD&sub4;&sub5;&sub0; = 0,40.

Beispiel 7:

ELISA zum Nachweis von AAV-Capsiden

Plattenbeschichtung

100 ul des A20-Antikörpers (siehe oben), der in Beschichtungspufferlösung (50 mM NaHCO&sub3;, pH 9,6) äquilibriert und auf eine Proteinkonzentration von 1,5 ng/ml eingestellt wurde, wurde zu jeder Vertiefung auf einer Polystyrol-Mikrotiterplatte (NUNC immuno flat-bottomed well) gegeben. Die Platte wurde 24 Stunden bei 4ºC inkubiert, der Inhalt dekantiert und die Vertiefungen 5 Mal mit 250 ul/Vertiefung Phosphat gepufferter Salzlösung (PBS) (Waschpuffer) gewaschen. Die Vertiefungen wurden mit 260 ul 3%iger BSA in PBS (Blocklösung) blockiert, indem mindestens 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert wurde und anschließend 6 Waschschritte in Waschpuffer durchgeführt wurden.

Analyse

Eine Standardkurve im Bereich von 10-10.000 Capsiden/ml wurde durch Verdünnen von AAV-Capsiden in einer Standardverdünnungslösung, die PBS enthielt, angefertigt.
Unbekannte Proben wurden in geeigneter Weise in Verdünnungslösung verdünnt und 100 ul zu den Testvertiefungen hinzugefügt. Wenn Gewebekulturüberstände zu analysieren waren, war 100 ul einer 1 : 10 bis 1 : 108 Verdünnung zu der Testvertiefung zuzugeben. Die Platte wurde 3 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Die Platte wurde 5 Mal in Waschpuffer gewaschen, und 100 ul Kaninchen Anti-AAV-polyklonales Antiserum in einer Verdünnung von 1/1000 in 3 %igem BSA in PBS wurden zu jeder Vertiefung hinzugegeben. Die Platte wurde 2 Stunden bei Raumtemperatur wie zuvor inkubiert und danach 5 Mal in PBS Tween gewaschen. AAV-Capsid wurde durch Hinzufügen von 100 ul einer 1/2000 Verdünnung eines Ziegen Anti-Kaninchen-IgG Myeloperoxidasegekoppelten Antikörpers, hergestellt in Antikörperverdünnungsmittel, nachgewiesen und 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert, und danach wurde die Platte 5 Mal mittels Standardverfahren gewaschen. Die Enzymaktivität wurde nachgewiesen durch Hinzufügen von 100 ul einer 0,1 mg/ml Lösung von Tetramethylbenzidin (TMB), hergestellt in 0,1 M Na-Acetatpuffer, pH 6, zu jeder Vertiefung. Die Platte wurde bei Raumtemperatur inkubiert, bis die gewünschte Farbentwicklung erreicht war, wobei längere Inkubationszeiten notwendig waren, um niedrigere Konzentrationsbereiche nachzuweisen, d. h. Standards von weniger als 10 Capsiden/ml. Die Konzentration von unbekannten Proben wurde durch Vergleich ihrer optischen Dichte mit der Standardkurve bestimmt.

Beispiel 8:

Nachweis von AAV-DNA in Kürettage-Material von Spontanaborten

Insgesamt 50 Proben von Kürettage-Material von Spontanaborten wurden auf die Anwesenheit von AAV-DNA entweder mittels PCR oder Southern Blot oder beidem hin untersucht. 41 Proben kamen von Aborten im ersten Drittel und 9 Proben von Aborten im zweiten und dritten Drittel der Schwangerschaft.
Von den 41 Proben, die während des ersten Drittels der Schwangerschaft genommen wurden, bestanden 14 aus frischem Material, das mittels Southern Blot getestet werden konnte. Durch dieses Verfahren konnten 9 Proben als positiv festgestellt werden. Alle anderen getesteten Proben waren Schnitte aus Geweben, die in Paraffin eingebettet waren und mittels PCR analysiert wurden. 30 Proben davon kamen von Aborten im ersten Drittel der Schwangerschaft. Es zeigte sich, daß 12 dieser Proben positiv auf AAV-DNA waren. Alle 9 Proben aus dem zweiten oder dritten Drittel der Schwangerschaft waren mittels PCR negativ.
Daher konnten bei 21 von 41 Proben, i. e. 50% von Spontanaborten im ersten Drittel der Schwangerschaft, AAV-spezifische DNA-Sequenzen nachgewiesen werden, während 9 Spontanaborte im zweiten oder dritten Drittel negativ waren (siehe Tabelle 3).

Beispiel 9:

Ein Gesamtserum aus 148 Serumproben, die von gesunden Probanden, kranken Patienten mit unterschiedlichen Syndromen, die nicht mit einem Abort in Verbindung standen, und Schwangeren mit Spontanabort während des ersten Drittels der Schwangerschaft genommen worden waren, wurden auf Antikörper gegen AAV getestet.
Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 4 gezeigt. Im allgemeinen war das Vorherrschen von spezifischen IgG-Antikörpern ziemlich hoch, zwischen 62 und 100% in den unterschiedlichen Gruppen der Probanden/Patienten. Es wurde jedoch gezeigt, daß spezifische IgM-Antikörper signifikant in Verbindung mit "Schwangerschaftsproblemen" standen. Tabelle 1
As: Aminosäure Tabelle 2 388 bp-Teil von BamH1b-Fragment von AAV5 (SEQ ID No. 9) Tabelle 3 Fortsetzung Tabelle 3
n. d. = nicht durchgeführt
* = 3 im PCR positive Proben wurden mittels Southern-Blot-Analyse getestet Tabelle 4
*) mit Uterusmyom oder normale Schwangerschaft, Hysterektomie (normal)

Claims

1. Verfahren zum Nachweis des verursachenden Erregers eines Spontanaborts, umfassend die Stufen:

(a) Hybridisieren einer Sonde für ein Adeno-assoziiertes Virus- (AAV) Polynucleotid mit Nucleinsäuren einer Probe von Abortmaterial unter Bedingungen, die die Bildung einer Heteroduplex zwischen einer AAV- Nucleinsäure und der Sonde erlauben, und

(b) Nachweis eines Polynucleotiddoppelstranges, der die Sonde enthält.

2. Verfahren nach Anspruch 1, das eine PCR, ein Southern Blot oder eine in situ-Hybridisierungstechnik ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei eine oder mehrere Sonde(n) verwendet wird/werden, die aus der Gruppe, bestehend aus den Primern pan1 (SEQ ID NO. 1), pan3 (SEQ ID NO. 4), nest1 (SEQ ID NO. 2) und nest2 (SEQ ID NO. 3), ausgewählt ist/sind.

4. Verfahren zum Nachweis des verursachenden Erregers eines Spontanaborts, umfassend die Stufen:

(a) Inkubieren eines Sondenantikörpers gegen ein AAV-Antigen mit einer Probe von Abortmaterial unter Bedingungen, die die Bildung eines Antigen-Antikörper- Komplexes erlauben, und

(b) Nachweis des Antigen-Antikörper-Komplexes, der den Sondenantikörper enthält.

5. Verfahren nach Anspruch 4, wobei der Sondenantikörper A1 (DSM ACC2195, hinterlegt am 13.10.1994), A20 (DSM ACC2194, hinterlegt am 13.10.1994), A69 (DSM ACC2196, hinterlegt am 13.10.1994) und/oder B1 (DSM ACC2197, hinterlegt am 13.10.1994) ist.

6. Verfahren nach Anspruch 4 oder 5, das ein ELISA, ein RIA, ein FIA oder ein IFA ist.

7. Verfahren zum Nachweis des verursachenden Erregers eines Spontanaborts, umfassend die Stufen:

(a) Inkubieren einer Probe, die AAV oder einen antigenen Teil davon enthält, mit einer Probe, die vermutlich anti-AAV-Antikörper enthält, unter Bedingungen, die die Bildung eines Antikörper-Antigen-Komplexes erlauben, und

(b) Nachweis des Antikörper-Antigen-Komplexes, der das Sondenantigen enthält.

8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei der antigene Teil von AAV VP1, VP2 oder VP3 ist.

9. Verfahren nach Anspruch 7 oder 8, wobei der Antikörper in dem Antikörper- Antigen-Komplex dem IgM-Typ angehört.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 9, das ein ELISA, ein RIA, ein FIA oder ein IFA ist.

11. Kit zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1, umfassend eine Sonde für ein AAV-Polynucleotid in einem geeigneten Behältnis, wobei die Sonde aus der Gruppe der Primer

pan1 AACTGGACCAATGAAAACTTTCC (SEQ ID NO. 1)

pan3 AAAAAGTCTTTGACTTCCTGCTT (SEQ ID NO. 4)

nest1 AAGGTGCGCGTGGACCAGAAATG (SEQ ID NO. 2)

nest2 AGTTCAAATTTGAACATCCGGTC (SEQ ID NO. 3)

ausgewählt ist.

12. Kit zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 4, umfassend einen Sondenantikörper gegen ein AAV-Antigen in einem geeigneten Behältnis, wobei der Sondenantikörper A1 (DSM ACC2195, hinterlegt am 13.10.1994), A20 (DSM ACC2194, hinterlegt am 13.10.1994), A69 (DSM ACC2196, hinterlegt am 13.10.1994) und/oder B1 (DSM ACC2197, hinterlegt am 13.10.1994) ist.

13. Verwendung eines Antikörpers gegen ein AAV-Antigen in einem Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 6.

14. Verwendung eines Antikörpers nach Anspruch 13, wobei der Antikörper gegen ein AAV-Capsid oder ein Protein davon gerichtet ist.

15. Antikörper, nämlich A1 (DSM ACC2195, hinterlegt am 13.10.1994).

16. Antikörper, nämlich A20 (DSM ACC2194, hinterlegt am 13.10.1994).

17. Antikörper, nämlich A69 (DSM ACC2196, hinterlegt am 13.10.1994).

18. Antikörper, nämlich B1 (DSM ACC2197, hinterlegt am 13.10.1994).