KR100204438B1 - 치킨 아네미아 바이러스 백신 및 진단방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 치킨 아네미아 바이러스(CAV)의 유전정보를 함유하는 핵산 서열에 관한 것이다. 특히 세 개의 게놈영역은 바이러스 폴리펩티드를 암호하는 것으로 규명되었다. 상기 영역 및 폴리펩티드는 CAV 감염에 대한 또는 진단을 목적으로 하는 왁찐의 제조에 이용될 수 있다.
또 본 발명은 CAV로 감염된 치킨의 검출에 유용한 테스트 키트에 관한 것이다.
Description
제1a도 및 b도는 각각 플라스미드 pCA1 및 pCA3의 엔도뉴클레아제 제한 효소 패턴을 나타내는 것이다.
제2도는 CAV균주 26P4의 RF DNA의 DNA 서열내에 존재하는 오픈 리딩프레임(ORF)을 나타내는 것이다.
제3도는 본질적으로 HVT 게놈의 Us 영역에 상응하는 DNA 단편의 제한효소 지도를 나타내는 것이다.
제4도는 pVECO4의 제한 효소 지도를 나타내는 것이다.
본 발명은 치킨 아네미아 바이러스(chicken anemia virus)관련 폴리펩티드를 암호하는 핵산 서열, 상기 핵산 서열을 포함하는 재조합 핵산 분자, 상기 핵산 서열을 함유하는 벡터 바이러스, 상기 핵산 서열로 형질전환된 숙주 세포, 치킨 아네미아 바이러스 관련 폴리펩티드, 상기 폴리펩티드와 반응성이 있는 항체 및 치킨 아네미아 바이러스 돌연변이체, 뿐만 아니라 치킨 아네미아 바이러스 감염에 대한 백신에 관한 것이다.
본 발명은 또한 면역화학적 시약 및 상기 시약을 포함하는 테스트 키트에 관한 것이다.
상기 치킨 아네미아 바이러스(CAV)는 병아리에서 감염성 빈혈을 유발한다. 이 CAV는 모든 연령의 조류를 감염시킬 수 있지만, 발병의 징후는 단지 어린 조류에서만 발표되었다. CAV는 또한 면역억제성이다. 건강한 정상 조류에서는, 어린 조류에서 흉선은 T세포의 생성에 관여하고, 패브리시우스(Fabricius) 점액낭은 B세포를 생성하고, 그리고 골수는 백혈구 및 적혈구를 생성한다. 병아리가 CAV에 감염되면, 상기 언급한 세포들이 파괴되며, 7∼14일 이내에 울병, 빈혈 및 면역억제가 일어난다. 특히 생후 수주일까지의 병아리에서는 빈혈 및 면역억제의 심각한 징후가 나타난다. 자연감염 병아리 집단에서의 치사율은 보통 30%에 이르며, 생존 집단은 통상 감염 후 24-32일이 경과해야 완전히 회복된다.
이차 감염, 특히 바이러스 및 박테이아 감염은 흔하며, 이것은 CAV에 의해 야기되는 증상을 증강시켜 이러한 경우의 치사율을 30% 이상으로 증가시킨다. 늙은 조류도 감염될 수 있지만, 준임상적 징후가 동작 쇠퇴의 원인으로 간주되긴 하지만 질병을 발달하지는 않는다.
시험됨 병아리 사육 집단의 90% 이상에서는 순환 CAV 항체가 때때로 존재하며, 따라서 바이러스로 감염되었다고 혈청학적 증거는 나타난다. CAV 편재성은 잘 보고되어 있다.
CAV는 수평적으로 뿐 아니라 수직적으로(어미로부터 난(卵)상태의 자손에게로)전달될 수 있다. 이 바이러스 입자는 매우 안정하며 클로로포름 등의 다양한 화학물질에 의해 또는 30분간 60℃로 가열하는 것에 의해 파괴되지 않는다. 상기 CAV는 직경이 약 24nm이며 유전물질만으로 존재하는 구형의 바이러스로서, 원형의 단일쇄 DNA 게놈(약 2300bp)을 함유한다.
CAV의 편재성과 연관된 어린 조류에서의 치사율 및 늙은 조류에서의 동작쇠퇴는 CAV 감염 또는 질병을 예방하기 위한 안전하고 효능있는 백신이 필요한 이유이다.
통상적인 백신은 화학적으로 불활성화된 바이러스 백신 또는 변형된 생(生)바이러스 백신을 포함한다. 그러나 불활성화된 백신은 추가 면역화를 필요로 하고, 불리하게 보조제를 포함하고, 제조 비용이 높으며 투여하기가 어렵다. 또 어떤 감염성 바이러스 입자는 불활성화 과정에서 생존할 수 있고 동물에 투여 후 질별을 야기시킬 수도 있다.
일반적으로, 약독화된(attenuated) 생바이러스 백신은 체액성 반응 및 세포성 반응에 기초한 면역반응을 흔히 유발하기 때문에 바람직하다. 지금까지는, CAV 균주에 근거한 상기 백신은 조직 배양으로 병원성 균주를 계대배양함으로써 단지 제조될 수 있다. 그러나 이러한 처리 때문에, 조절되지 않은 돌연변이가 바이러스 게놈내로 도입되어, 병원성 및 면역화 성질이 이질적인 바이러스 입자의 집단을 생성하게 된다.
또 상기 전통적인 약독화된 생 바이러스 백신은 병원성을 회복하여 접종된 동물에서 질병을 야기시키며 다른 동물에게 병원체를 유포시키는 것이 가능하다는 것은 잘 알려져 있다. CAV 병원체에 대하여 면역반응을 야기시킬 수 있는 필수적이고 적절한 CAV 면역원성 물질만을 함유하거나, 또는 상기 물질을 암호하는 유전정보만을 함유하는 개선된 백신을 재조합 DNA 기술에 근거하여 제조할 수 있는데, 이것은 생백신 또는 불활성화 백신이 갖는 전술한 단점들을 나타내지 않는다.
본 발명은 CAV 관련 폴리펩티드를 암호하는 핵산 서열을 제공하는데, 이것을 CAV에 대하여 가금류를 면역화시킬 수 있는 백신의 제조 및 진단 테스트 제조에 사용될 수 있다.
본 명세서에서 사용한 핵산 서열 은 임의의 길이의 뉴클레오티드의 중합체 형태를 말하며, 리보핵산 서열 및 데옥시리보핵산 서열 모두 해당된다. 원칙적으로, 상기 용어는 분자의 일차구조를 의미한다. 따라서, 이 용어는 이중 및 단일쇄 DNA, 이중 및 단일쇄 RNA 및 이들의 변형체를 모두 포괄한다.
일반적으로, 폴리펩티드란 용어는 생물학적 활성을 갖는 아미노산의 분자사슬을 의미하며, 특정 길이의 생성물만을 의미하는 것은 아니며, 필요에 따라 생체내에서 또는 시험관내에서, 예를 들면, 글리코실화, 아미드화, 카르복실화 또는 포스포릴화에 의해 변형될 수 있고, 특히 펩티드, 올리고펩티드 및 단백질이 포함된다.
특히, 본 발명에서는 각각 ORF 1-3으로 명명된 CAV 관련 폴리펩티드를 암호하는 영역을 함유하는 세 개의 핵산 서열을 규명하고 특성을 밝혔다.
ORF-1 폴리펩티드를 암호하는 영역은 유전자 지도상에서 뉴클레오티드 876으로부터 2225에 이르며 (SEQ ID NO : 1, 제2도) 약 449개의 아미노산 길이의 폴리펩티드를 암호한다. ORF-1 유전자에 의해 암호화되는 폴리펩티드의 아미노산 서열은 SEQ ID NO : 2에 나타나 있다. 일부 서열 이종성(heterogeneity)이 뉴클레오티드 1657 및 2185에서 발견되었다. 이러한 서열 변이는 보존적 아미노산 변화를 일으키며 따라서 폴리펩티드의 생물학적 활성에 크게 영향을 미치지는 않는 것으로 생각된다.
ORF-2 폴레펩티드를 암호하는 영역은 유전자 지도에서 게놈의 제2리딩 프레임상에서 뉴클레오티드 101 내지 502 (SEQ ID NO :1, 제2도) 이며, 약 133개의 아미노산 길이를 갖는 폴리펩티드를 암호한다. ORF-2 유전자에 의해 암호화되는 폴리펩티드의 아미노산 서열은 SEQ ID NO : 3에 나타나 있다.
ORF-3 폴리펩티드를 암호하는 영역은 유전자 지도에서 게놈의 제3리딩 프레임상에서 뉴클레오티드 403 내지 1053(SEQ ID NO : 1, 제2도)이며, 약 216개의 아미노산 길이의 폴리펩티드를 암호한다. ORF-3 유전자에 의해 암호되는 폴리펩티드의 아미노산 서열은 SEQ ID NO : 4에 나타나 있다.
따라서, 본 발명은 각각 SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 3 또는 SEQ ID NO : 4에 제시된 아미노산 서열을 갖는 ORF-1 폴리펩티드, ORF-2 폴레펩티드 또는 ORF-3 폴리펩티드를 각각 암호하는 핵산 서열을 제공한다.
당해 기술 분야에 공지된 바와 같이, 대개 게놈의 모든 부분이 번역되는 성숙 mRNA로 나타나지는 않는다. 생물학적으로 기능을 나타내는 성숙 단백질은 생체내에서 RNA 스플라이싱(splicing)에 의해 몇몇 ORF의 단편들이 더해져서 만들어질 수 있다. 성숙 mRNA가 번역되기 전의 RNA 단계에서 가능한 변형의 실례로는 파보바이러스족(Parvoviridea)에서의 RNA 전사체의 프로세싱(processing)을 들 수 있다. Berns 등 (J. Gen. Virol. 68. 601-614. 1987)이 고찰한 바와 같이, 파보바이러스족은 매우 작고 엔벨로프가 없으며 단일쇄 DNA바이러스인 점에서 구조면에서 CAV에 필적할 만 하다. RNA 프로세싱은 몇몇 번역 프레임내의 몇몇 ORF로부터 각각 암호화된 파보바이러스 비구조 단백질 및 코트(coat) 단백질을 결합시키는 데 필요하다.
게놈의 전사영역을 지도화하기 위해서는 몇몇 기술이 흔히 이용된다(Maniatis 등, Molecular Cloning, A laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, U.S.A., 1989). 상기 기술의 예로는 분리된 CAV mRNA의 cDNA제조, CAV mRNA의 시험관내 번역 및 S1 뉴클레아제-보호 분석 및 프라이머 신장 분석과 같은 전사체 매핑 방법들을 들 수 있다.
상기 기술들은 CAV 게놈의 전사 지도의 제조를 가능하게 하며 전사체를 비교적 풍부하게 할 수 있는 아이디어를 제공한다. 이러한 방법에 의해 CAV 연관 폴레펩티드를 암호하는 실제 유전자의 위치를 알 수 있다.
따라서, 서로 다른 ORF에서 유래한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 서열도 본 발명의 범위내에 속한다.
또, 상응하는 면역학적 특성을 갖는 상기 ORF-1, ORF-2 또는 ORF-3 폴리펩티드의 기능적 등가물(functional equivalent)을 암호하는 핵산 서열도 본 발명의 범주에 속한다.
26P4 CAV 균주로부터 유래하는 본 명세서에서 제시된 특정 ORF 1-3 폴리펩티드의 경우 치킨 아네미아 바이러스의 각 균주 또는 각 바이러스 사이에서 자연적인 변이가 존재할 수 있다는 것은 당업자라면 이해할 수 있다. 이러한 변이는 전체 서열에서 아미노산 차이에 의해 또는 상기 서열에서 아미노산의 결실, 치환, 삽입, 역위 또는 첨가에 의해 확인할 수 있다. 본질적으로 생물학적 활성 및 면역학적 활성을 변화시키지 않는 것으로 예측될 수 있는 아미노산 치환이 제시되었다. 관련된 아미노산 사이의 치환 및 진화과정에서 흔히 발생하는 치환으로는 Ser/Ala, Ser/Gly, Asp/Gly, Asp/Asn, Ile/Val을 특히 제시할 수 있다(Dayhof, M.D., 단백질 서열 및 구조의 도해, Nat. Biomed. Res. Found., Washington D.C., 1978, vol. 5, suppl. 3 참고). 이러한 정보에 입각하여 Lipman 및 Pearson은 신속하고 민감한 단백질 비교방법(Science 227, 1435-1441, 1985) 및 상동 폴리펩티드 사이의 기능적 유사성 측정 방법을 개발했다. 상기 상동의 기능적 등가물을 암호하는 핵산 서열은 본 발명의 범주 내에 속하다. 더욱, 상기 다양한 기능적 등가물을 암호하는 핵산 서열의 제조에 재조합 DNA 기술을 이용할수 있는 가능성도 존재한다.
본 발명에 의한 핵산 서열은 Cuxhaven-1, TK-5803 또는 Gifu-1등과 같은 CAV 균주의 분리체로부터 추출할 수 있다.
SEQ ID NO : 1-4에 제시된 정보는 당해 기술 분야의 당업자가 본 명세서에 개시된 ORF 1-3 폴리펩티드와 상응하는 면역학적 특성을 갖는 상술한 변이체 기능적 등가물 폴리펩티드를 암호하는 핵산 서열을 분리하고 규명할 수 있게 한다. 상기 목적을 위해서는 일반적으로 적용되는 서던 블로트 방법 또는 콜로니 하이브리드화가 이용될 수 있다. (분자 생물학에서의 실험, R.J. Slater, Clifton, U.S.A., 1986; Singer-Sam, J.등 Proc. Natl. Acad. Sci. 80. 802-806, 1983; Maniatis T. 등, 분자 클로닝 : 실험 매뉴얼, Cold Spring Harbor Laboratory Press, USA, 1989). 예를 들면, 특이적인 CAV 균주로부터 유래한 제한 효소 분해된 DNA를 전기영동한 후, 니트로셀룰로스 필터상에 전달, 또는 블로트시킨다. 필터상에 존재하는 상동 DNA 서열과 프로브의 하이브리드화를 가능하게 하는 염 농도 및 온도의 특이적인 조건하에서 일정한 표지화된 DNA 단편 또는 프로브(SEQ ID NO : 2-4에 제시된 아미노산 서열로부터 유래한 서열을 함유하는 합성 올리고뉴클레오티드)와 하이브리드화시킴으로써 필터상에서 CAV 관련 서열을 식별하는 것이 가능하다. 필터를 세척한 후, 하이브리드화된 물질을 자동 방사성 사진법에 의해 검출할 수 있다. 상응하는 DNA 제한 효소 단편은 아가로즈겔로부터 용출되어, SEQ ID NO : 2-4에 개시된 폴리펩티드와 기능적으로 등가물인 폴리펩티드의 합성을 지시하는데 사용될 수 있다.
예를 들어, pCA1, pCA3 또는 이들의 단편은 CAV의 다른 균주의 게놈과 비교할 때 매우 보존적인 서열 구조를 함유하고 있으며, 하이브리드화 실험에 이용된다. 이러한 식으로 동물의 또는 특이적인 물질의 CAV 감염 양상에 대한 정량적, 및 정성적 정보가 얻어진다. 시험의 대항이 되는 샘플로는 혈액(특히 임파구), 기관 물질(예, 간, 신장), 배(embryo)의 균질물, 또는 상기 샘플중 하나로 배양한 MDCC-MSB1 세포 (Akiyama 등, Biken J. 17. 105-117, 1974)를 들 수 있다. 미정제 DNA 제제는 표준 프로토콜(Berger 및 Kimmel, Methods in Enzymology 153. 181, 1987)에 따라 제조한다. 각 샘플의 일련의 희석액을 니트로셀룰로스 막에 블로팅시키고, 표지화된 pCA1, pCA3, 또는 그것의 단편으로 프로브(probe)시킨다 (Maniatis 등, 1989). 검출 후, 동일한 실험에서 CAV DNA의 표준 양의 일련의 희석액으로부터 얻어진 시그날과 비교함으로써 시그날을 정량한다. 네가티브 샘플은 전혀(검출할 수 있는) 시그날을 나타내지 않는 것이며, 여기서 검출 한계는 대개 ㎖ 당 CAV DNA 2pmole 이하이다.
또 다른 방법으로는, CAV 관련 DNA를 λgt11 파아지내로 클로닝하여 박테리아 숙주내에서 발현시킬 수 있다. 정제된 ORF 1-3 폴리펩티드에 대해 유발된 폴리클론 혈청으로 재조합 파아지를 스크리닝하여, 변이체 폴리펩티드의 해당 면역학적 영역의 존재를 결정할 수 있다. ORF 1-3에 대해 유발된 여기서 사용되는 폴리클론 혈청의 제조는 하기에서 기술된다.
당해 기술 분야에 공지된 바와 같이, 유전 정도의 축퇴(degeneracy)는 코돈내의 염기의 치환을 가능하게 하여 동일한 아미노산을 암호하는 다른 코돈으로 되게 한다. 예를 들면 아미노산 글루탐산에 대한 코돈은 GAT와 GAA이다. 결과적으로, SEQ ID NO : 2-4에 제시된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드의 발현을 위해서 상기 SEQ ID에 제시된 핵산 서열과 다른 코돈 조성을 갖는 유도체 핵산 서열(기능적 등가물)을 사용할 수 있음은 명확하다.
본 발명에 따르면, CAV 게놈 또는 그것의 단편을 포함하는 핵산 서열이 제공된다.
본 발명에 의한 바람직한 핵산 서열은 SEQ ID NO : 1에 제시된 데옥시리보 핵산 서열의 적어도 일부를 함유하는 것을 특징으로 한다.
상기 데옥시리보핵산 서열의 특히 유용한 단편은 폴리펩티드를 암호하는 것이다.
특히, SEQ ID NO : 1에서 보여지는 CAV 게놈상의 위치 876 내지 2225, 101 내지 502 또는 403 내지 1053에 위치한 ORF의 적어도 일부를 포함하는 핵산 서열은 본 발명에 포한된다.
또 뉴클레오티드 1내지 870에 부착된 바이러스 게놈내의 위치 2230 내지 2298에 위치한 뉴클레오티드의 상기 서열의 조절하에 위치하는 이형 유전자의 발현을 조절하는데 사용될 수 있는 서열을 함유하고 있다.
또, ORF 1-3 폴리펩티드 또는 상술한 그것의 기능적 등가물을 암호하는 핵산 서열의 단편도 본 발명에 포함된다.
본 명세서에서 사용되는 단편 (fragment)이라는 용어는 본 발명의 폴리펩티드 또는 핵산 서열 중의 하나의 일부 서열을 포함하는 DNA 또는 아미노산 서열을 의미한다. 상기 단편은 CAV 관련 폴리펩티드의 하나 이상의 면역반응성 결정기(determinant) 및/또는 항원성 결정기를 갖는 폴리펩티드이거나 또는 암호한다. 즉, 병아리내에서 면역반응을 유발할 수 있는 및/또는 상보적인 항체와 특이적으로 결합할 수 있는 하나 이상의 에피토프를 갖는다. 이용할 수 있는 폴리펩티드 단편을 결정하는 방법의 개요는 하기에 제시되어 있다. 단편은 전구체 분자를 효소로 절단하여 생성될 수 있는데, 이때 DNA에 대해서는 제한 엔도뉴클레아제를 사용하며, 폴리펩티드에 대해서는 프로테아제를 사용한다. 다른 방법으로는 단편의 화학적 합성 또는 DNA 단편에 의한 폴리펩티드 단편의 발현을 들 수 있다.
ORF-1, ORF-2 또는 ORF-3 폴리펩티드의 면역학적 특성이 본질적으로 영향을 받지 않는다면, ORF 1∼3 폴리펩티드의 기능적 등가물로 되는 모든 변형도 본 발명의 범주내에 속한다.
본 발명에 의한 핵산 서열은 시험관내에서 합성되거나 또는 예를 들어 PCR 기술을 통하여 수득된 핵산 서열도 포함한다.
본 발명에 의한 핵산서열은 선택적으로 β-갈락토시다제와 같은 융합 단백질 서열을 암호하는 DNA 부분을 포함하여, 자연계에서는 결합 또는 연결되지 않는. 각종 복제에 영향을 주는 DNA 서열에 결찰시킬 수 있으며, 이것은 소위 재조합 핵산 분자를 생성하며 이것은 적합한 숙주의 형질전환에 사용될 수 있다. 그러한 하이브리드 DNA 분자는 예를 들어, 플라스미드로부터 유도되거나, 또는 박테리오파아지, 코스미드 또는 바이러스에 존재하는 핵산 서열로부터 유도된다. 본 발명에 의한 핵산 서열을 클로닝하는데 사용될 수 있는 특이적인 벡터는 당해 기술 분야에 공지되어 있으며, pBR322, 다양한 pUC, pGEM 및 블루스크립트 플라스미드 등의 플라스미드 벡터, 박테리오파아지 (예, λgt-Wes-λB, Charon 28 및 M13에서 유도된 파아지)또는 바이러스 벡터(예, SV40, 아데노 바이러스 또는 폴리오마바이러스)를 포함한다(Rodriquez, R.L. 및 D.T. Denhardt 벡터 : 분자클로닝 벡터 및 그것의 사용에 관한 연구, Butterworths, 1988 ; Lenstra, J.A.등, Arch. Virol. 110. 1-24, 1990참고). 본 발명에 의한 재조합 분자의 제조에 사용될 수 있는 방법은 당해 기술 분야의 당업자에게는 공지된 것으로서, 특히 Maniatis T.등(Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982)에 개시되어 있다. 예를 들어, 유전자 및 원하는 클로닝 비히클(vehicle)이 동일한 제한효소로 절단되어 상보적인 DNA 말단이 생성될 때, 클로닝 벡터내로의 삽입이 용이하게 행해질 수 있다.
또 다르게는, 단일쇄 DNA를 분해시키거나 또는 단일쇄 말단을 적합한 DNA 폴리머라제로 채움으로써 블런트(blunt)말단으로 생성된 제한효소 부위를 변형시키는 것이 필요할 수 있다. 이어서 T4 DNA 리가제와 같은 효소로의 블런트 말단 결찰이 행해질 수 있다.
필요에 따라서는, DNA 말단에 링커를 결찰시킴으로써 어떤 제한효소 부위도 생성할 수 있다. 이러한 링커는 제한 효소 부위 서열을 암호하는 특이적인 올리고뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 제한 효소로 절단된 벡터 및 핵산 서열은 또한 호모폴리머 테일링(homopolymeric tailing)에 의해 변형될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 형질전환이란 용어는 사용되는 방법, 가령 직접적인 투입 또는 형질 도입에는 관계없이 이형 핵산 서열을 숙주 세포내로 도입하는 것을 말한다. 또 다르게는, 이종 핵산 서열이 숙주 게놈내로 삽입될 수 있다. 필요에 따라, 재조합 DNA 분자는 삽입된 핵산 서열의 발현을 조절할 수 있는, 명시된 숙주와 양립할 수 있는 적절한 조절 서열을 구비한다.
본 발명에 의한 상기 재조합 핵산 분자는 바람직하게는 하나 이상의 마커 활성을 포함하는 데, 이것은 원하는 형질전환체를 선별하는데 사용될 수 있다. 마커 활성의 예로는 pBR322의 암피실린 및 테트라사이클린 내성, pUC8의 암피실린 내성 및 β-갈락토시다제 활성을 들수 있다.
적합한 숙주 세포는 폴리펩티드를 암호하는 핵산서열 또는 이러한 핵산서열을 포함하는 재조합 핵산분자에 의해 형질전환될 수 있는 세포로서, 필요에 따라, 상기 핵산 서열에 의해 암호화된 상기 폴리펩티드를 발현시키는데 사용될 수 있는 세포이다. 상기 숙주 세포는 박테리아(예, E. coil. 바실러스 서브틸리스 및 슈도모나스 종)와 같은 원핵세포, 또는 효모(예, 사카로마이세스 세레비시에)와 같은 하등 진핵 세포, 또는 곤충세포, 식물세포 또는 포유 동물 세포(예, HeLa 세포 및 차이니즈 햄스터 난소(CHO)세포)와 같은 고등 진핵 세포일 수 있다. 상기 곤충 세포로는 Spodoptera frugiperda의 Sf9 세포주(Luckow 등, Bio-technology 6. 47-55, 1988)를 들수 있다. 진핵 클로닝 시스템에서 본 발명의 핵산서열의 클로닝 및 발현에 대한 정보는 Esser, K. 등의 진핵 세포의 플라스미드 Springer -Verlag, 1986에서 발견할 수 있다.
CAV에 의해 암호화된 폴리펩티드의 일정량을 얻기 위해서, CAV 게놈 또는 그것의 단편을 바쿨로바이러스 발현 시스템(BVES)과 같은 발현 시스템내에서 발현시킬 수 있다. 상기 시스템에서는 Spodoptera frugiperda(Sf : IPLB - Sf21)세포와 같은 곤충 세포를 오토그라파 캘리포티카 핵 다각체병 바이러스(Autographa californica nuclear polyhedrosis virus) ( AcNPV)와 같은 바쿨로바이러스에 대한 숙주로서 세포 배양액에서 유지시킨다. AcNPV의 일부 유전자는 높은 수준으로 발현되지만, 바이러스의 감염 주기에 비-필수적이다.
상기 유전자는 형질 감염된 세포내에서 pAcAS3와 같은 바쿨로-전달 플라스미드 야생형(wt) AcNPV DNA 사이의 상동 재조합의 표적이다. pAcAS3 (J. Vlak 등, Virology 179. 312-320, 1990)내에서 이종 유전자는 비필수적인 p10유전자 대산애 p10프로모터의 하류에 삽입되며, 이때 이것은 재조합 과정의 표적인 wt AcNPV 서열에 의해 둘러싸여 있다. 재조합체에 대한 스크리닝을 촉진시키기 위해서는, pAcAS3가 또한 LacZ 유전자를 포함하며, 이것은 배지에 X-gal을 첨가할 때 재조합체 플라크가 청색으로 변할 수 있게 한다.
특히, MSB1으로 감염된 세포로부터 분리된 CAV 게놈 DNA는 Nrul으로 분해시킬 수 있다. BamHI 링커를 2.3kb 분자의 말단에 결찰시킨후, 이를 BamHI으로 분해되고 탈인산화된 pAcAS3플라스미드 내로 결찰시킨다. DH5 α 감응성 E. coli 세포를 새로운 구조체 pAcCA3으로 형질전화시킨다. 단일 콜로니를 선택하여 테스트한 후 100㎖로 배양한다. CsCl 구배 원심 분리에 의해 플라스미드를 DNA를 분리 및 정제한 후, 1㎍/㎖의 정제된 DNA를 4℃의 TE 완충액내에 보관한다. pAcCCA3 10㎍을 wt AcNPV DNA 2㎍ 및 리포펙틴 시약(미합중국, 메릴랜드주, 베체스다 소재 BPL로부터 입수) 30㎍과 100㎕의 물에서 혼합한다. 직경 6cm의 배양 접시내의 무혈청 배지 (5㎖)의 Sf21 세포( 5×106)를 상기 혼합물에 첨가한다. 37℃에서 3시간 배양시킨 후, 새로운 배지를 첨가하고 37℃에서 배양한다. 다음날 세포를 배지내에서 1.5% 저융점 아가로스로 덮어씌운 후, 37℃에서 5일간 배양한다. 200㎍/㎖의 최종 농도로 X-gal을 함유한 새로운 아가로스를 첨가한다. 재조합 바이러스의 스톡을 생성하기에 앞서, 청색 플라크를 3번 플라크-정제시킬 수 있다.
웨스턴 블로팅에 의해 재조합 바쿨로스바이러스와 재조합 CAV 폴리펩티드의 발현에 대해서 감염된 세포를 스크리닝하고 이것의 상층액을 배양한다. 재조합 CAV 폴리펩티드-발현의 최고수준을 나타내는 플라크, 및/또는 웨스턴-블로트 분석에서 가장 잘 인지되는 폴리펩티드는 백신 제조를 위한 CAV 폴리펩티드의 생성을 위해 선별될 수 있다.
일반적으로, 본 발명에서 유용한 벡터를 제조하는데 있어서 DNA 서열을 클로닝하는데에는 원핵 세포가 바람직하다. 예를 들면, E. coil K12가 특히 유용하다. 사용될 수 있는 다른 미생물 균주로는 DH5α 또는 JM101과 같은 E. coli균주가 포함된다.
발현을 위해서는 본 발명의 핵산 서열이 발현 조절 서열에 작동적으로 연결된다. 이러한 조절 서열은 프로모터, 인핸서 (enhancer), 오퍼레이터, 인듀서(inducer), 리보솜 결합 부위 등을 포함할 수 있다.
숙주 세포가 박테리아인 경우에 있어서 유용한 발현 조절 서열의 예로는, Trp 프로모터 및 오퍼레이터(Goeddel 등, Nucl. Acids Res. 8, 4057, 1980); lac 프로모터 및 오퍼레이터(chang 등, Nature 275, 615, 1978); 외부막 단백질 프로모터 (Nakamura. K 및 Inouge, M., EMBO J. 1. 771-775,1982); 박테리오파아지 λ 프로모터 및 오퍼레이터(Remaut, E 등, Nucl. Acids Res.11 4677-4688, 1983); α-아밀라제(B. subtilis) 프로모터 및 오퍼레이터, 종결 서열 및 선택된 숙주세포와 양립할 수 있는 다른 발현 증가 및 조절 서열을 들수 있다.
숙주세포가 효모인 경우에 있어서 유용한 발현 조절서열의 예로는 α-메이팅(mating)인자를 들수 있다. 곤충세포의 경우에 있어서는 바쿨로바이러스의 폴리헤드린 또는 P10 프로모터가 사용될 수 있다(Smith, G. E. 등, Mol. Cell. Biol. 3. 2156-65, 1983). 숙주세포가 포유류에서 유래한 경우에 유용한 발현 조절 서열의 예로는, SV-40 프로모터 (Berman, P. W. 등, Science 222. 524-527, 1983) 또는 메탈로티오네인 프로모터(Brinster, R. L., Nature 296. 39-42, 1982) 또는 열 쇼크 프로모터( Voellmy 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82. 4949-53, 1985)를 들 수 있다. 또 다르게는, CAV내에 존재하는 발현 조절서열, 특히 ORF 1-3의 발현을 조절하는 서열이 사용될 수도 있다. 유전자 발현의 최대화에 대해서는 Roberts 및 Lauer, Methods in Enzymology 68. 473, 1979를 참고할 수 있다.
본 발명은 또한 CAV 관련 항원의 면역학적 특성을 나타내는 폴리펩티드를 포함한다. 즉, 이 폴리펩티드는 CAV 관련 항원의 하나 이상의 면역반응성 결정기 및/또는 항원성 결정기를 포함하며, 본질적으로 통상 결합되어 있는 다른 단백질 또는 전체 바이러스가 없다.
더 상세히 언급하며, 본 발명은 SEQ IN NO : 2, SEQ ID NO : 3 및 SEQ ID NO : 4에 나타난 각각의 아미노산 서열을 갖는 ORF-1, ORF-2 또는 ORF-3의 적어도 일부를 포함하는 폴리펩티드를 제공한다.
본질적으로 동일한 면역학적 특성을 나타내는 상기 아미노산 서열의 유도체, 즉 면역학적 등가물도 본 발명의 범주내에 속한다는 것이 이해될 것이다.
또한, CAV 감염에 대하여 가금류를 면역화 시키거나 또는 진단 목적에 사용될 수 있는, ORF 1-3 폴리펩티드의 단편 또는 그것의 기능적 등가물을 포함하는 폴리펩티드로 본 발명에 포함된다. 공지된 아미노산 서열내에서 그러한 이용가능한 폴리펩티드 단편을 검출하기 위한 각종 방법이 알려져 있다.
본 발명에 의한 폴리펩티드중 에피토프를 함유하고 있는 적합한 면역화학적 활성 폴리펩티드 단편은 특허출원 WO 86/06487, Geysen, H. M. 등, (Proc. Natl. Acad. Sci. 81, 3998-4002, 1984), Geysen H.M 등, (J. Immunol. Meth. 102, 259-274, 1987)에 기술된 방법에 의해 발견될 수 있다. 상기 방법은 소위 펩스캔(Pepscan)방법에 근거한 것으로서, 완전한 폴리펩티드의 부분서열과 상응하는 부분적으로 중복되는 일편의 폴리펩티드를 합성하고 항체와의 반응성을 조사한다.
또 전술한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드의 많은 영역은 공지된 에피토프와의 구조적 일치 및 이론적 고찰에 근거하여 에피토프로 지정될 수 있다. 이러한 영역의 결정은 친수성 기준(Hopp 및 Woods, Proc. Natl. Acad. Sci. 78, 3824-3828, 1981) 및 2차구조 양상 (Chou 및 Fasman, Advances in Enzymology 47, 45-148, 1987)에 근거한다.
필수적일 수 있는 T-세포 에피토프는 Berzofsky의 양쪽성 기준(Science 235, 1059-62, 1987)을 이용하는 이론적 배경하에서 마찬가지로 추론될 수 있다.
본 발명의 다른 구체예에서는 상기 언급한 핵산 서열에 의해 암호화되는 아미노산 서열을갖는 폴리펩티드가 사용된다.
CAV 감염에 대한 가금류의 면역화는, 예를 들어 본 발명에 의한 폴리펩티드를 면역학적으로 적절한 용어로는 소위 서브유니트 백신으로서 상기 동물에 투여함으로써 이루어질 수 있다. 본 발명에 의한 서브유니트 백신은 선택적으로 약학적 허용 담체의 존재하에서 순수한 형태의 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 상기 폴리펩티드는 선택적으로 비관련 단배질과 공유결합될 수 있으며, 이는 가령 융합 생성물의 정제에 도움이 될 수 있다. 이러한 단백질의 예로는 β-갈락토시다제, 단백질 A, 프로키모신, 혈액 응고 인자 Xa 등을 들수 있다.
어떤 경우에는, 상기 폴리펩티드 자체에 대하여 중화 항체를 유발할 수 있는 능력이 낮을 수 있다. 작은 단편들은 면역원성을 증가시키기 위하여 담체 분자와 결합되는 것이 바람직하다. 이러한 목적에 접합한 담체로는 천연 중합체 (키 홀 림페트 헤모시아닌과 같은 단백질, 알부민, 독소), 폴리아미노산 등의 합성 중합체 (폴리리신, 폴리알라닌)와 같은 고분자, 또는 사포닌과 같은 양쪽성 화합물의 마이셀(micelle)을 들 수 있다. 또 다르게는, 상기 단편들은 그것의 중합체, 바람직하게는 선형 중합체로 제공될 수 있다.
상기 서브유니트 백신에 사용되는 폴리펩티드는 당해 기술분야에 공지된 방법, 예를 들면 재조합 DNA 기술 또는 화학적 합성에 의해 CAV로 상기 폴리펩티드를 분리시킴으로써 제조될 수 있다.
필요하다면, 백신에 사용될 본 발명의 폴리펩티드가 시험관내에서 또는 생체 내에서 글리코실화, 아미드화, 카르복실화 또는 인산화 등에 의해 변형될 수 있다.
서브유니트 백신 대신 생벡터(live vector)백신을 사용할 수도 있다. 본 발명에 의한 핵산서열은 재조합 DNA 기술에 의해 미생물(예를 들면 박테리아 또는 바이러스)내로 도입되어, 이로써 생성된 재조합 미생물은 여전히 복제할 수 있고, 삽입된 핵산 서열에 의해 암호화되는 폴리펩티드를 발현할 수 있게 된다.
예를 들면, 생체내 상동 재조합 기술은 이종 핵산 서열(예를 들어, 본 발명에 의한 핵산서열)을 벡터 미생물의 게놈내로 도입하는데 이용할 수 있다.
첫 번째 단계에서, 벡터 게놈의 삽입 영역에 상응하는 DNA 단편, 즉 감염 또는 복제에 필수적인 것처럼 벡터의 본질적 기능을 파괴하지 않고 이종 서열의 삽입에 사용될 수 있는 영역이 표준 재조합 DNA 기술에 의해 클로닝 벡터 내로 삽입된다. 많은 미생물(가령, EP 80, 806, EP 110, 385, EP 83, 286, EP 314, 569, WO 88/02022 및 WO 88/07088 등)에 대해서 삽입 영역이 보고되었다.
두 번째, 필요하다면, 첫 번째 단계로부터 수득된 재조합 DNA 분자 내에 존재하는 삽입 영역에 결실이 도입될 수 있다. 이것은 첫 번째 단계로부터 수득된 재조합 DNA 분자를 예컨대 적합한 엑소뉴클레아제 III로 분해시키거나 또는 제한 효소 처리함으로써 수행될 수 있다.
세 번째 단계에서는, 첫 번째 단계의 재 조합 DNA 분자 내에 존재하는 삽입 영역 속에 상기 재조합 DNA 분자로부터 결실된 DNA 대신에 이종 핵산 서열이 삽입된다. 상기 삽입 영역 DNA 서열은 벡터 게놈과의 상동 재조합이 일어날 수 있는 적절한 길이를 가져야 한다. 이어서, 재조합 DNA 분자와 벡터 게놈의 상응 영역 사이에서 재조합이 일어나도록, 적절한 벡터 DNA 서열로 플랭킹된(flanked)삽입영역을 함유하는 재조합 DNA 분자의 존재하에, 적합한 세포를 벡터 게놈 DNA로 형질전환시킬 수 있다. 재조합 벡터 자손은 이제 세포 배양액에서 생성될 수 있으며, 예컨대 유전형에 의해 또는 표현형에 의해, 예를 들면 하이브리드화, 이종 핵산 서열과 함께 동시 삽입된 유전자에 의해 암호화된 효소 활성의 검출, 또는 재조합 벡터에 의해 발현된 이종, 항원성 폴리펩티드의 검출 등에 의해 선택될 수 있다.
다음에는, 상기 재조합 미생물을 면역화를 위해 병아리에 투여할 수 있으며, 그후 그것은 얼마동안 그 자체로 유지되거나, 또는 접종된 동물의 체내에서 복제되어, 본 발명에 따른 삽입된 핵산 서열에 의해 암호화된 폴리펩티드를 생체내에서 발현하여, 접종된 동물의 면역계를 자극시키게 된다. 본 발명에 의한 핵산서열의 삽입에 적합한 벡터는 조류의 폭스 바이러스(예, 백시니아 바이러스 또는 계두 바이러스(EP 314,569 및 WO 88/02022)), 헤르페스 바이러스 (예, HVT (WO 88/07088)), 아데노 바이러스 또는 인플루엔자 바이러스 등의 바이러스, 또는 박테리아 (예,E. coli 또는 특정 살모넬라종)로부터 유도될 수 있다.
상기 유형의 재조합 미생물과 함께, 숙주세포내에서 합성된 폴리펩티드도 표면항원으로서 노출될 수 있다. 이것과 관련하여, 생물체에 의해 인식되는 시그날 및 고정(anchor)서열의 합성물, 또는 E. coli 등의 OMP 단백질, 또는 필리 단백질과 상기 폴리펩티드의 융합을 고려할 수 있다.
필요하다면, 더 큰 전체의 부분으로서 상기 면역원성 폴리펩티드를 면역화되는 동물의 내부에서 방출시키는 것도 가능하다. 이러한 모든 경우에 있어서, 다양한 병원체 및/또는 주어진 병원체에 대한 다양한 항원에 대하여 보호를 제공하는 발현을 하나 이상의 면역원성 생성물이 일으키는 것도 가능하다.
본 발명에 의한 백신은 본 발명에 의한 핵산 서열을 포함하는 벡터 바이러스로 감염된 숙주세포를 배양한 후, 바이러스를 함유하는 세포 및/또는 세포내에서 생장하는 벡터 바이러스를 선택적으로 순수한 형태로 수거하여, 선택적으로 동결건조 형태로 백신으로 형성시킴으로써 제조할 수 있다.
본 발명에 의한 핵산서열을 포함하는 상기 언급한 숙주세포는 상기 핵산 서열에 의해 암호화되는 폴리펩티드의 발현에 바람직한 조건하에서 배양시킬 수도 있다. 백신은 미정제 배양액 샘플, 숙주 세포 용해액 또는 숙주 세포 추출물을 사용하여 제조할 수 있지만, 다른 구체예에서는 의도하는 용도에 따라 본 발명에 따른 더 정제된 폴리펩티드가 백신으로 형성된다.
폴리펩티드를 정제하기 위해서는, 본 발명에 의한 핵산 서열을 함유하는 숙주 세포를 적당한 부피로 배양한 후, 생성된 폴리펩티드를 상기 세포로부터 또는 단백질이 방출된다면 배지로부터 분리한다. 배지내로 방출된 폴리펩티드는 표준 방법, 예를 들면 염에 의한 분획화, 원심분리, 한외여과, 크로마토그래피, 겔여과 또는 면역 친화성 크로마토그래피에 의해 분리 및 정제된다. 세포사이의 폴리펩티드는 상기 세포를 우선 수거하여 초음파처리 또는 다른 기계적 파괴 수단(예, 프렌치 프레스)에 의해 세포를 파괴시킨 후, 다른 세포간 성분으로부터 폴리펩티드를 분리하여 폴리펩티드를 백신을 형성시킨다.
세포 파괴는 화학적 수단 (예, EDTA처리) 또는 효소적 방법(예, 리소짐 분해)에 의해 달성될 수도 있다.
전술한 바와 같이 바이러스를 약독화시키는 고전적 방법은 일부 단점을 갖고 있다. 이는 보통 화학물질 처리에 의한 특이적 돌연변이의 유발 또는 이종 숙주 동물 또는 조직 배양액내에서의 계대 배양에 의해 실시된다. 바이러스 게놈내에서 이러한 돌연변이가 일어나는 무작위 방식이 이러한 기술의 중요한 면인데, 그것은 자연발생에 의한 회복(revertnat)이 일어나느 경우 그 위치를 결정하거나 반복하는 것이 어렵기 때문이다. 재조합 DNA기술의 개발과 더불어 바이러스 게놈을 정확한 방법으로 조작할 수 있는 가능성도 존재한다. Murphy 등(Innmmization against visused, in : Fields, B.N. 등, Virology 2판, Raven Press, N.Y.1990)의 고찰에 의하면, 게놈의 돌연변이에 의해, 예를 들어 비필수 유전자 또는 그것의 일부에서의 결실, 삽입 또는 치환 또는 조절 영역 등에서의 삽입, 치환, 또는 결실 등에 의해 바이러스를 약독화시킬 수 있는 몇가지 가능성이 존재한다.
재조합 DNA 기술을 이용함으로써 자연적으로는 발생되지 않는 약독화된 CAV돌연변이체를 개발할 수 있는 방법의 예가 이하에서 기술된다.
첫번째 단계에서는, 돌연변이가 위치할 수 있는 CAV 게놈 영역이 결정된다. 이것은 코딩 영역 또는 비코딩 영역일 수 있으며, 예를 들면 조절 영역, 바이러스 접착-단백질 또는 이것의 일부를 암호화는 영역 또는 숙주 특이성을 결정하는 인자를 암호하는 영역 등일 수 있다.
다음에는, 상기 재조합 벡터의 수립에서 제시한 방법에 따라 바이러스 게놈내에 돌연변이, 예를 들면 결실 및/또는 삽입 및/또는 치환을 도입시킬 수 있다.
따라서, 재조합 DNA 기술에 의해 게놈내에 돌연변이가 도입된 자연계에는 존재하지 않는 약독화된 CAV도 본 발명의 범주내에 속한다.
본 발명의 폴리펩티드에 대해 생성된 항체 또는 항혈청은 수동 면역요법, 진단 면역분석 및 항-이디오타입 항체의 생성에 사용될 수 있다.
전술한 CAV 관련 폴리펩티등 ORF 1-3는 폴리클론성, 단일특이성 및 단일클론성 항체를 생성하는데 이용될 수 있다. 폴리클론 항체를 원하는 경우, 폴리클로 형청을 생성하여 프로세싱할 수 있는 기술이 당해 기술 분야에 공지되어 있다(예컨데, Mayer 및 Walter, Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology, Academic Press, 런던, 1987). 요약하면, 선택된 포유동물, 예를 들면 토끼를 상기 언급한 면역원중의 하나로(1회 면역화 당 약 20㎍ 내지 80㎍의 단백질 사용)1회 또는 수차례 주사한다. 면역화는 허용가능한 보조제와 함께 주어지는데, 일반적으로 면역원과 보조제의 체적이 동일하다. 허용 가능보조제는 프로인트 완전 보조제, 프로인트 불완전 보조제, 명반 침강물 또는 물/기름 유화액을 들수 있으며, 초기 면역화를 위해서는 프로인트 완전 보조제를 사용하는 것이 바람직하다. 프로인트 불완전 보강제는 모든 부스타 면역화에 대해 바람직하게 사용된다. 초기 면역화는 유화액 약 1㎖을 토끼의 등의 여러 피하 부위에 투여하는 것으로 구성된다. 동일 부피의 면역원을 사용하는 부스터(booster)면역화는 약 1달 간격으로 주어지면, 각 토끼 혈청에서 충분한 수준의 항체가 존재할 때까지 계속된다. 혈액을 수거하여 당해 기술분야에 공지된 방법에 의해 혈청을 분리한다.
각각의 면역원에 대한 단일특이성 항체는 Hall 등 (Nature 311, 379-387, 1984)의 방법을 변형시켜서 다가특이적 항혈청으로부터 친화성 정제된다. 이때 상기 항혈청은 상술한 바와 같이 토끼를 정제된 단백질로 면역화시킴으로써 제조된 것이다. 본 발명에서 사용되는 단일특이성 항체는 해당 항원에 대하여 동종 결합 특성을 갖는 단일 항체종 또는 다중 항체종으로서 정의된다. 이때 동종결합이란 특정 항원 또는 에피토프에 대한 항체종의 결합능력을 나타내는 것이다.
각각의 CAV 면역원에 대해 반응성이 있는 단일클론 항체는 동계교배 마우스, 바람직하게는 Balb/c를 적당한 단백질로 면역화시킴으로써 제조될 수 있다. 상기 마우스의 0.5㎖의 투여량 당 약 100ng 내지 10㎍의 면역원을 동일 부피의 허용 가능 보조제와 함께 복강내로 면역화시킨다. 이러한 허용 가능 보조제로는 프로인트 완전 보조제, 프로인트 불완전 보조제, 명반 침강물 및 물/기름 유화액을 들수 있다. 상기 마우스는 최초 면역화후 약 14, 21 및 63일경에 보조제 없이 동일한 양의 면역원을 사용하여 정맥내로 부스터 면역화시킨다. 최종 부스터 면역화후 약 3일경에 각각의 마우스를 항-면역원 항체에 대해 혈청학적을 테스트한다. 항체를 생성하는 마우스의 비장세포를 분리한 후, 당해 기술 분야에 공지된 기술(Kohler 및 Milstein, Nature 256; 495-497, 1975)에 의해 SP-2/0등과 같은 쥐 골수종 세포와 융합시킨다. 하이브리도마 세포는 둘베코 변형 이글 배지(DMEM)와 같은 적합한 세포 배양 배지내에서 히포크산틴, 티미딘 및 아미노프테린에서 생장시킴으로써 선택된다. 바람직하게는 MacPherson의 소프트 아가 기술(Soft Agar Techiniques, Tissue Culture Methods and Applications, Kruse 및 Paterson, Academic Press, 276, 1973)을 이용하여 항체 생성 하이브리도마를 클로닝하고, 각 콜로니를 배양 플레이트의 각 웰(well)로 전달하여 적당한 배양 배지내에서 배양한다. 항체 생성 세포는 적당한 면역원으로 스크리닝함으로써 동정한다. 면역원 포지티브 하이브리도마 세포는 당해 기술 분야에 공지된 기술에 의해 유지된다. 특이적이 항-모노클론 항체는 하이브리도마를 시험관내에서 배양하거나 또느 마우스내에서 복수액을 제조한 후 당해 기술분야에 공지된 방법에 따라 하이브리도마를 주입시킴으로써 생성된다.
항-이디오타입 항체는 보호가 필요한 병원체의 항원의 내부 이미지 (internal image)를 전달하는 면역글로불린이며, 백신에서 면역원으로서 사용될 수 있다(Dreesman 등, J. Infect. Disease 151, 761, 1985). 항-이디오타입 항체를 야기시키는 기술은 당해 기술분야에 공지된 것이다(MacNamara 등, Science 226, 1325, 1984).
본 발명에 의한 백신은 통상적인 활성 면역화 방법을 투여할 수 있는데, 예방학적으로 및/또는 치료학적으로 유효하고 면역원성을 나타내는 양만큼, 그리고 투여 제제와 양립할 수 있는 방법으로 1회 또는 반복 투여할 수 있다. 상기 백신은 예를 들어, 피내로, 피하내로, 근육내로, 보강내로, 정맥내로 또는 비강내로 투여할 수 있다.
또, 상기 백신은 수성 배지 또는 물을 함유하는 현탁액을 함유할 수 있으며, 예컨대, 활성 및/또는 보존기간을 증가시키기 위하여 다른 성분과 혼합되는 경우도 있다. 이러한 성분으로는 염, pH 완충액, 안정화제(예, 탈지유 또는 카세인 가수분해물), 면역반응을 향상시키기 위한 유화성 보조제(예, 오일, 뮤라밀 디펩티드, 수산화 알루미늄, 사포닌, 다가 음이온 및 양쪽성 물질) 및 방부제를 들수 있다.
본 발명에 의한 백신은 가금류의 다른 병원체에 관련된 면역성을 포함할 수 있고 또는 이들 면역원을 암호하는 핵산 서열을 함유하여 다가 백신을 생성할 수 있으며, 이들의 예로는 감염성 기관지염 바이러스, 뉴캣슬 질환 바이러스, 감염성 점액낭 질환 바이러스 또는 마레크 질병 바이러스의 항원을 들 수 있다.
본 발명은 또한 면역화학적 시약에 관한 것으로서, 이들 시약은 본 발명에 의한 적어도 하나의 폴리펩티드 또는 그것의 항원성 단편을 포함한다.
면역화학적 시약이라는 용어는 본 발명의 폴리펩티드가 적합한 지지체에 결합되어 있거나 또는 표지화 물질을 구비한 것을 의미한다.
사용될 수 있는 지지체의 예로는 마이크로테스트 웰 또는 큐벳의 내벽, 튜브 또는 모세관, 막, 필터, 테스트 스트립 또는 입자표면 (예, 라텍스 입자, 적혈구, 염료 졸, 금속 졸 또는 졸 입자로서의 금속 화합물)을 들 수 있다.
사용될 수 있는 표지화 물질로는 방사성 동위원소, 형광 화합물, 효소, 염료 졸, 금속 졸 또는 졸 입자로서의 금속 화합물을 들수 있다.
본 발명에 의한 핵산서열은 모든 종류의 조직에서 CAV 관련 핵산을 검출하기 위한 하이브리드화 실험에 있어서 특이적 프로브를 고안하는데 사용될 수도 있다.
또한 본 발명은 CAV 감염의 진단에 유용한 핵산서열을 포함한느 테스트 키트를 제공한다.
본 발명은 면역분석에 사용될 수 있는 테스트 키트에 관한 것으로서, 이 테스트 키트는 본 발명에 의한 면역화학적 시약을 적어도 하나 함유하고 있다.
상기 테스트 키트를 사용하여 야기되는 면역화학적 반응으로는 바람직하게는 샌드위치 반응, 응집반응. 경쟁반응 또는 억제 반응이 있다.
샌드위치 반응을 실시하기 위해서는, 테스트 키트가 예를 들어, 마이크로테스트 웰의 내벽 등의 고체 지지체에 결합된 본 발명의 폴리펩티드, 및 본 발명에 의한 표지화된 폴리펩티드 또는 표지화된 항-항체로 이루어질 수 있다.
[실시예 1]
[CAV 균주 26P4의 기원]
생후 8주된 센티늘(sentinel) SPF 치킨(CAV에 대하여 혈청 음성)을 인터베트 아메리카(Millsboro, DEL)에서 CAV 감염을 향한 혈청전환 징후를 보이는 조류의 존재하에서 유지시켰다. 2주후 상기 센티늘 조류의 간의 RPMI중의 20% V/V 호모게네이트를 제조하여 0.2㎛ 필터를 통하여 여과시켰다. CAV (Goryo등, Avian Pathology 16, 149-163, 1987)에 대해 적합한 숙주세포인 MDCC-MSB1 세포(Akiyama 등, Biken J. 17, 105-117, 1974)를 포함하는 조직배양 플라스크내에서 상기 여과액을 배양시켰다.
26P4로 표시된 분리물 중의 하나를 , USDA에 의해 제공되는 포지티브 항-CAV-혈청과의 포지티브 면역-형광 및 CPE에 근거하여 CAV로 동정했다.
[26P4의 배양]
26P4 바이러스의 배양은 당해 기술분야에서 제시하는 바에 따라 (Goryo등) 조직 배양 플라스크내의 MDCC-MSB1 세포상에서 수행되었다.
[바이러스 게놈의 클로닝]
CAV 균주 26P4 바이러스 DNA의 복제형(replicative form) (RF)을 분리하기 위해, 1㎖당 106개의 MSB1 세포를 함유하는 500㎖의 배양액을 제조한 후, 약 106 TCID 50/㎖의 바이러스 역가로 감염시켰다. 바이러스 DNA는 표준허트(Hirt) 추출(McMaster 등, J. Virol 38. 317-326, 1981)을 이용하여 제조했다. 최대량의 RF 바이러스 DNA를 수득할 수 있는 시점을 찾기 위하여 감염 후 30시간에 걸쳐 시간추이 실험을 실시했다.
감염된 세포의 DNA를 0.8% 아가로스/에티듐 브로마이드 겔 상에서 분석한 후, 표준 프로토콜(Maniatis 등, 1989)에 따라 NA45 DEAE 막(Schleicher 및 Schull)을 이용함으로써 아가로스 겔로부터 원형의 바이러스 RF DNA를 나타내는 1.7kb 밴드를 분리시켰다.
바이러스 DNA(500ng)을 25㎕부피내에서 2㎍ 박테이라 플라스미드 pGEM7zft(Promega corp.)을 20 U의 Hind III 또는 Bam HI 제한 엔도뉴클레아제로 분해시키고, 탈인산화한 후, 단백질 분해 효소 K(Maniatis 등, 1989)로 배양했다. 벡터 및 DNA 삽입체 제제를 페놀/클로로포름으로 추출하고 2부피의 96% 에탄올 및 1/10 부피의 3M 아세트산나트륨(pH 6.0)으로 침전시켰다. 벡터 및 DNA 삽입체를 T4 DNA리가제로 결찰시키는 것은 표준 방법( Maniatis 등, 1989)에 따라 실시했다. 생성된 결찰 혼합물을 사용하여 E. coli DH5α 감응 세포(Clontech corp.)를 형질전환시킨 후 100㎍/㎖의 암피실린(Ap)을 함유하는 LB-아가 평판상에 플레이팅하였다. Ap 내성 콜로니로부터 플라스미드 DNA를 분리한 후, 제한 효소 분석에 의해 2.3kb 삽입체를 스크리닝했다.
하기 두 플라스미드를 동정했다 : Hine III 분해된 2.3kb CAV RF DNA를 함유하는 pCA1, 및 Bam HI으로 분해된 CAV RF DNA가 pCA1과 비교하여 반대 방향으로 삽입된 pCA3. 이들 플라스미드의 제한효소 양상은 제1도에 제시되어 있다.
[실시예 2]
[DNA 서열 분석]
CAV 게놈의 DNA 서열을 측정하기 위하여, Henikoff의 방법(Gene 28, 351, 1984)을 따라 5㎍의 pCA1 및 pCA3를 SphI으로 배양한 후 Cla I 제한효소로 배양함으로써, 점진적으로 결실된 단편을 생성했다. 단백질 분해효소 K 배양, 페놀/클로로포름 처리 및 에탄올 침전을 실시한 후, 시간 간격을 증가시키면서 샘플을 엑소뉴클레아제 III로 배양시켰다. S1 뉴클레아제 및 클레노우(Klenow) 폴리머라제를 이용하여 DNA단편을 평체말단 (blunt end)으로 만든 후 T4 DNA 리가제로 최종적으로 원형화시키고, E. coli DH5α감응 세포내로 형질전환시킨 뒤, 암피실린 평판상에 플레팅하였다. 내성 콜로니로부터의 플라스미드 DNA를 삽입체의 크기에 대해 분석했다.
DNA 서열 분석은 Sanger등 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463, 1977)에 의해 공표된 바와 같이 소량 제제의 이중쇄 플라스미드 DNA에 대하여 디데옥시-사슬 종결법을 이용하여 실시했다. T7 및 Sp6 프로모터 프라이머를 사용하여, pGEM 7zf+ 다중 클로닝 부위의 상류 및 하류에서 직접 하이브리드화시켰다.
서열 데이터를 모아서 결합하여, 유전자 마스터 프로그램(BioRad corp.)을 이용하여 IBM PC상에서 분석했다.
[실시예 3]
ORF1을 포함하는 CAV DNA의 칠면조 헤르페스 바이러스 게놈내로의 삽입]
실시예 1에서 개략적으로 개시된 바와 같이 CAV RF DNA를 분리했다. HVT에서의 삽입 및 효율적인 발현을 위해 ORF 1을 제조하기 위해서는, 특히 첫 번째 ATG 코돈의 선행서열을 최소화의 리더서열로 잘라내야만 한다. 이를 위해서 2㎍의 CAV RF DNA를 제한 효소 ApaI 및 Mro I으로 분해시켰다. 분해 결과, ORF 1의 첫 번째 ATG가 Mro I 부위의 측면에 위치하고 ORF 1이 중간에 위치하는 CAV RF DNA 성형 분자가 생성된다. 불활성화, 페놀 추출 및 에탄올 침전 후, 시간 간격을 증가시키면서 이들 단편들을 엑소뉴클레아제 III로 배양한 후 실시예 2에 제시된 바와 같이 평체 말단으로 만들었다.
엑소뉴클레아제는 Apa I에 의한 것과 같은 3'이 돌출된 부위를 분해할 수 없으므로, RF DNA단편은 ORF 1의 첫 번째 ATG 방향에서 Mro I 부위로부터 분해된다. 평체 말단을 갖는 단편은 T4 리가제를 이용하여 50배 몰 과량의 인산화 된 EcoR V 링커( B. Mannheim corp.)와 결찰시켰는데, 모두 표준 방법에 따른다. 상기 링커-결찰 혼합물을 EcoR V로 분해시키고 65℃에서 10분간 불활성화시켰다. 상기 혼합물을 EcoR V로 분해되고 탈인산화된 pGEM5zf+ 벡터(Promega Corp.)(500ng)와 결찰시켰다. 상기 결찰 혼합물을 E. coli DH5α감응 세포내로 형질전환시킨 후, Ap 평판상에 플레이팅시켰다. 내성 콜로니의 소량 DNA 분리물을 Apa I 및 Spe I으로 이중 분해시킨 후 플라스미드 삽입체의 남아있는 크기에 대해 분석했다. 약 1.9kb의 크기를 갖는 삽입체에 대하여 제한 효소 분석을 실시하여 배향을 연구하고, Sp6 또는 T7 프라이머로 Sanger 서열결정을 실시했다.
생성된 플라스미드 pCA4 SEQ ID NO : 1에 제시된 바와 같이 1 내지 475에서 연속된 뉴클레오티드 860 내지 2298의 서열로 구성된 1.9kb CAV 삽입체를 갖는 것으로서 확립되었고, 이를 EcoR V 링커에 결찰시킨 후, EcoR V로 분해된 pGEM 5zf+에 삽입시켰다. 특히 상기 삽입체의 첫 번째 ATG에 선행하는 짧은 리더 서열은 Sanger 서열분석한 결과 부가적인 ATG 코튼을 함유하지 않음이 입증되었다.
Igarashi, T 등 (Virology 157, 351, 1989)이 제시한 바와 같이 HVT의 게놈 구조에 근거하여, 상기 바이러스의 독특한-짧은 서열 성분(Us)내의 영역을 외부 유전자 삽입을 위해 선택하였다. HVT로 감염된 CEF에서 유래한 전체 DNA를 부분적으로 분해시킴으로써 제조된 λEMBL3 라이브러리로부터, 상응하는 DNA 단편이 스크리닝되었다. Bam HI 제한효소 부위가 없는 것이 특징인 λ-분리체중의 하나의 삽입체를 λHVT04로 명명하고, 물리적 매핑(제3도)에 의해 상세히 분석했다. 17.5kb 삽입 단편내에 존재하는 서열은 역위 반복 구조(inverted repeat structure) (Igarashi, T 등, 1987)의 일부를 포함하는 Us 영역의 주요부분을 나타냈다. λHVT04에서 유래한 1.2kb Xho I 제한 효소 단편중의 하나를 Sal I 분해된 pGEM32 내로 서브클로닝하여, DNA단편을 삽입시킬 수 있는 독특한 Bgl II 부위를 함유한는 플라스미드 pMDO7을 생성했다.
HVT의 게놈내로 삽입된 후 외부 유전자의 발현을 지시할 수 있는 강한 프로모터를 라우스 사코나 바이러스(Rous Sarcoma Virus) (RSV)의 LTR 서열로부터 선택했다. 상기 프로모터는 pRSVcat (Gorman 등, Proc. Natl. Acad. Sci 79, 6777, 1982)에서 유래한 580bp NdeI/ Hind III 제한효소 단편상에서 매핑되었고 pGEM 3Z (Promega)의 Hind III 및 Pst I 부위 사이에서 이중쇄 합성 링커를 사용하여 단편의 양쪽 부위에서 삽입되었다. 벡터 pGEM3Z에서 유래한 Hind III 부위 및 LTR-프로모터를 수반하는 RSV 단편의 Nde I 부위사이의 연결은 한쪽 단부에서는 Hind III 및 다른 쪽 단부에서는 Nde I 부위와 양립할 수 있는 접착성 말단을 함유하는 30bp 링커로 수행되었다. 그러나, 결찰후에는 6bp 인식 서열의 외부 뉴클레오티드의 정교한 변형 때문에 두 제한 효소 부위가 회복되지 않는다. 상기 두 부위의 제거와 더불어, 링커 자체에 존재하는 새로운 제한효소 부위(BamHI)가 해당 위치에 생성된다. LTR 단편으로부터의 Hind III 부위에서 pGEM3Z로부터 유래한 Pst I 부위까지 연결된 두 번째 20bp 링커를 합성했다. 이 경우 양쪽 말단의 인식서열이 파괴되지 않도록 했으며, pGEM3Z 폴리 링커내에 이미 존재하는 것들 (예, Ps+I. SalI, XhoI 및 BamHI)에 3개의 편리한 독특한 제한 효소 부위(BglII. XhoI 및 EcoR V)를 첨가했다. 생성된 pGEM3Z 유도체는 pVECO1으로 명명되었으며, 이것은 LTR 프로모터 서열 및 이와 인접하여 외부 유전자의 삽입에 이용가능한 7개의 제한 효소 부위를 갖는 650bp 제한효소 단편을 함유하고 있다.
상기 650bp 단편의 양 말단은 BamHI 제한 효소 부위에 의해 플랭킹되어 있으며, pMD07에서 유래한 1.2kb HVT 삽입체내에 존재하는 독특한 BglII 부위로 그대로 전달된다. 상기 두 제한 효소에 의해 생성되는 접착성 말단은 양립할 수 있으나, 결찰은 Bg1 II 또는 Bam HI에 대한 원래의 인식 서열중 어느 것도 회복시키지 않는다. TRs 방향으로 LTR을 함유하는, 생성 구조체 중의 하나는 pVECO4로 명명되었으며, 제한효소 매핑(제4도)에 의해 조사되었다. 상기 보편적 HVT 재조합 벡터의 구조는 LTR 프로모터의 하류에 인접하여 외부 유전자를 삽입할 수 있게 하고, 이어서 완전한 발현 카세트를 생체내 재조합에 의해 HVT 게놈내로 삽입시킬 수 있다. LTR 하류의 다른 제한 효소 부위의 위치, 특히 효소 BglII, XhoI 및 EcoR V에 대한 것은 다중유전자 삽입이 관찰될 수 있도록 고안된다.
EcoR V분해를 이용하여 pCA4의 CAV DNA 삽입체를 플라스미드로부터 제거하여, EcoR V로 분해되고 탈인산화된 pVECO4내로 삽입했다. 삽입된 단편의 배향을 다시 한번 검사하고, 올바른 배향을 갖는 플라스미드를 pCA5로 명명했다.
Graham, F. 및 v. d. Eb, A. (Virology 52, 456, 1973)에 의한 칼슘포스페이트 DNA 침전법에 근거한 방법에 의해, 플라스미드 pCA5의 선형화된 DNA를 HVT 감염세포에서 유래한 전체 DNA와 함께 CEF내로 도입했다. 상기 구조체의 플라스미드 DNA 2㎍을 HVT 선형화된 감염세포의 DNA 15㎍과, 최종체적 560㎕ H2O에서 혼합한 후, HBSP (20mM KCl, 56mM NaCl, 24mM 글루코스, 3mM NaHPO4, 100mM HEPES, pH7.0) 750㎕에 첨가했다. 1MCaCl2용액(190㎖)을 점진적으로 첨가하고 혼합물을 실온에서 30분간 배양시킴으로써 침전물을 형성시켰다. 송아지 태아 혈청(2%)을 보충한 이글 최소 필수 배지의 글라스고우 변형에 근거한 조성을 갖는 6/B8 배지내에서 생후 10일된 배에서 유래한 이차 CEF 현탁액(15㎖)을 직경 10cm 접시에 접종하여 1㎖당 5×105세포 밀도가 되게 했다. 칼슘 포스페이트 침전된 DNA를 상기 현탁액에 서서히 첨가하고, 공기중 5% CO2를 함유하는37℃의 가습 배양기내에서 접시를 배양했다. 5시간 후 배지를 제거하고, 동일 부피의 HBSP 및 30% 글리세롤을 함유하는 10㎖용액을 세포위로 층지게 하였다.
1분 내지 2분동안 배양시킨 후, 상기 용액을 제거하고, 6/B8 배지로 세포를 세척한 뒤, 신선한 배지로 교환된 접시를 바이러스 CPE가 형성될 때까지 3 내지 5일간 배양시켰다. CAV 관련 폴리펩티드를 발현시키는 HVT 재조합체의 검출은 CAV 항원에 대한 특이적이 단일-또는 다가 혈청을 이용하는 면역형과 염색법에 의해 실시했다.
[서열 목록]
(1)일반정보 :
(i) 출원인 :
(A) 이름 : 악조 엠 브이
(B) 거리 : 벨퍼베그 76
(C) 도시 : 아른헴
(E) 국가 : 네덜란드왕국
(F) 우편번호 (ZIP) : 6824 비엠
(ii) 발명의 명칭 : 치킨 아네미아 바이러스 백신 및 진단 방법
(iii) 서열 수 : 4
(v) 컴퓨터 해독 형태 : 사용할 수 없음
(2) SEQ ID NO : 1에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 2298 bp
(B) 형태 : 핵산
(C) 가닥 : 단일쇄
(D) 위상 : 원형
(ii) 분자형태 : DNA (게놈)
(vi) 원공급원 :
(A) 유기체 : 치킨 아네미아 바이러스
(C) 각분리체 : 26P4
(ix) 특질 :
(A) 이름/키(KEY) : CDS
(B) 위치 : 876..2225
(D) 다른 정보 : /표지 = ORF1
(x) 특질 :
(A) 이름/키(KEY) : CDS
(B) 위치 : 101..502
(D) 다른 정보 : /표지=ORF2
(vi) 특질 :
(A) 이름/키(KEY) : CDS
(B) 위치 : 403..1053
(D) 다른 정보 : /표지 =ORF3
(xi) 서열기술 : SEQ ID NO : 1 :
(2) SEQ ID NO : 2에 대한 정보 :
(i) 서열특징 :
(A) 길이 : 449 아미노산
(B) 형태 : 아미노산
(D) 위상 : 선형
(ii) 분자형태 : 단백질
(xi) 서열 기술 : SEQ ID NO : 2 :
(2) SEQ ID NO : 3에 대한 정보 :
(i) 서열특징 :
(A) 길이 : 133 아미노산
(B) 형태 : 아미노산
(D) 위상 : 선형
(ii) 분자형태 : 단백질
(xi) 서열 기술 : SEQ ID NO : 3 :
(2) SEQ ID NO : 4 에 대한 정보
(i) 서열특징 :
(A) 길이 : 216 아미노산
(B) 형태 : 아미노산
(D) 위상 : 선형
(ii) 분자형태 : 단백질
(xi) 서열 기술 : SEQ ID NO : 4 :
Claims (11)
- CAV 관련 폴리펩티드를 암호하는 핵산 서열로서, 상기 서열이a. SEQ ID NO : 2에 제시된 아미노산 서열을 갖는 ORF 1;b. SEQ ID NO : 3에 제시된 아미노산 서열을 갖는 ORF 2;c. SEQ ID NO : 4에 제시된 아미노산 서열을 갖는 ORF 3로 구성된 군으로부터 선택된 폴리펩티드, 또는 ORF 1, ORF 2 또는 ORF 3에 대해 생성된 폴리클론 항혈청과 반응할 수 있는 폴리펩티드를 암호하는 것을 특징으로 하는 핵산 서열.
- CAV 게놈을 포함하는 핵산 서열로서, 상기 서열이 SEQ ID NO : 1에 제시된 데옥시 리보 핵산 서열을 함유하는 것을 특징으로 하는 핵산 서열.
- 제2항에 있어서, 상기 서열이 SEQ ID NO : 1에 제시된 서열의 위치 876 내지 2225, 101 내지 502 또는 403 내지 1053에 위치한 DNA 서열을 함유하는 것을 특징으로 하는 핵산 서열.
- 제1항, 제2항 또는 제3항의 핵산 서열을 포함하는 재조합 핵산 분자.
- 제4항에 있어서, 상기 핵산 서열이 발현 조절 서열에 작동적으로 연결되는 것을 특징으로 하는 재조합 핵산 분자.
- 제1항, 제2항 또는 제3항의 핵산 서열을 함유하는 벡터 바이러스.
- 제1항, 제2항 또는 제3항의 핵산 서열 또는 제4 내지 제5항 중 어느 한 항의 재조합 핵산 분자로 형질전환되거나 또는 제8항의 벡터 바이러스를 함유하는 숙주 세포.
- CAV 관련 항원의 면역학적 특성을 갖는 폴리펩티드로서, 상기 폴리펩티드가a. SEQ ID NO : 2에 제시된 아미노산 서열을 갖는 ORF 1;b. SEQ ID NO : 3에 제시된 아미노산 서열을 갖는 ORF 2;c. SEQ ID NO : 4에 제시된 아미노산 서열을 갖는 ORF 3로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 ORF 1, ORF 2 또는 ORF 3에 대해 생성된 폴리클론 항혈청과 반응할 수 있는 폴리펩티드를 함유하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
- 제1항, 제2항 또는 제3항의 핵산 서열에 의해 암호화되는 CAV 관련 폴리펩티드.
- 제8항 또는 제9항에 의한 폴리펩티드를 포함하는 면역화학적 시약.
- 제10항에 의한 면역화학적 시약을 포함하며 면역-분석을 실시하기 위한 테스트 키트.
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