HUT62325A - Chicken anaemia virus vaccine and diagnostic - Google Patents
Chicken anaemia virus vaccine and diagnostic Download PDFInfo
- Publication number
- HUT62325A HUT62325A HU913433A HU343391A HUT62325A HU T62325 A HUT62325 A HU T62325A HU 913433 A HU913433 A HU 913433A HU 343391 A HU343391 A HU 343391A HU T62325 A HUT62325 A HU T62325A
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- cav
- nucleic acid
- acid sequence
- polypeptide
- dna
- Prior art date
Links
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title claims abstract description 28
- 241000725585 Chicken anemia virus Species 0.000 title abstract description 75
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 101
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 101
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract description 100
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 claims abstract description 72
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims abstract description 60
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims abstract description 13
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims abstract description 8
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 31
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 31
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 27
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 20
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 19
- 230000003053 immunization Effects 0.000 claims description 18
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 claims description 16
- 101000666833 Autographa californica nuclear polyhedrosis virus Uncharacterized 20.8 kDa protein in FGF-VUBI intergenic region Proteins 0.000 claims description 12
- 101000977027 Azospirillum brasilense Uncharacterized protein in nodG 5'region Proteins 0.000 claims description 12
- 101000962005 Bacillus thuringiensis Uncharacterized 23.6 kDa protein Proteins 0.000 claims description 12
- 101000785191 Drosophila melanogaster Uncharacterized 50 kDa protein in type I retrotransposable element R1DM Proteins 0.000 claims description 12
- 101000747704 Enterobacteria phage N4 Uncharacterized protein Gp1 Proteins 0.000 claims description 12
- 101000861206 Enterococcus faecalis (strain ATCC 700802 / V583) Uncharacterized protein EF_A0048 Proteins 0.000 claims description 12
- 101000769180 Escherichia coli Uncharacterized 11.1 kDa protein Proteins 0.000 claims description 12
- 101000976301 Leptospira interrogans Uncharacterized 35 kDa protein in sph 3'region Proteins 0.000 claims description 12
- 101000658690 Neisseria meningitidis serogroup B Transposase for insertion sequence element IS1106 Proteins 0.000 claims description 12
- 101000748660 Pseudomonas savastanoi Uncharacterized 21 kDa protein in iaaL 5'region Proteins 0.000 claims description 12
- 101000584469 Rice tungro bacilliform virus (isolate Philippines) Protein P1 Proteins 0.000 claims description 12
- 101000818096 Spirochaeta aurantia Uncharacterized 15.5 kDa protein in trpE 3'region Proteins 0.000 claims description 12
- 101000766081 Streptomyces ambofaciens Uncharacterized HTH-type transcriptional regulator in unstable DNA locus Proteins 0.000 claims description 12
- 101000804403 Synechococcus elongatus (strain PCC 7942 / FACHB-805) Uncharacterized HIT-like protein Synpcc7942_1390 Proteins 0.000 claims description 12
- 101000750910 Synechococcus elongatus (strain PCC 7942 / FACHB-805) Uncharacterized HTH-type transcriptional regulator Synpcc7942_2319 Proteins 0.000 claims description 12
- 101000644897 Synechococcus sp. (strain ATCC 27264 / PCC 7002 / PR-6) Uncharacterized protein SYNPCC7002_B0001 Proteins 0.000 claims description 12
- 101000916336 Xenopus laevis Transposon TX1 uncharacterized 82 kDa protein Proteins 0.000 claims description 12
- 101001000760 Zea mays Putative Pol polyprotein from transposon element Bs1 Proteins 0.000 claims description 12
- 101000678262 Zymomonas mobilis subsp. mobilis (strain ATCC 10988 / DSM 424 / LMG 404 / NCIMB 8938 / NRRL B-806 / ZM1) 65 kDa protein Proteins 0.000 claims description 12
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 12
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 12
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 12
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 12
- 101000933555 Bacillus subtilis (strain 168) Biofilm-surface layer protein A Proteins 0.000 claims description 10
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 10
- 101000773449 Sinorhizobium fredii (strain NBRC 101917 / NGR234) Uncharacterized HTH-type transcriptional regulator y4sM Proteins 0.000 claims description 10
- 101000987243 Streptomyces griseus Probable cadicidin biosynthesis thioesterase Proteins 0.000 claims description 10
- 241000271566 Aves Species 0.000 claims description 9
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 9
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 9
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 9
- 101000787132 Acidithiobacillus ferridurans Uncharacterized 8.2 kDa protein in mobL 3'region Proteins 0.000 claims description 8
- 101000827262 Acidithiobacillus ferrooxidans Uncharacterized 18.9 kDa protein in mobE 3'region Proteins 0.000 claims description 8
- 101000811747 Antithamnion sp. UPF0051 protein in atpA 3'region Proteins 0.000 claims description 8
- 101000977023 Azospirillum brasilense Uncharacterized 17.8 kDa protein in nodG 5'region Proteins 0.000 claims description 8
- 101000827607 Bacillus phage SPP1 Uncharacterized 8.5 kDa protein in GP2-GP6 intergenic region Proteins 0.000 claims description 8
- 101000961975 Bacillus thuringiensis Uncharacterized 13.4 kDa protein Proteins 0.000 claims description 8
- 101000961984 Bacillus thuringiensis Uncharacterized 30.3 kDa protein Proteins 0.000 claims description 8
- 101000964407 Caldicellulosiruptor saccharolyticus Uncharacterized 10.7 kDa protein in xynB 3'region Proteins 0.000 claims description 8
- 101000644901 Drosophila melanogaster Putative 115 kDa protein in type-1 retrotransposable element R1DM Proteins 0.000 claims description 8
- 101000747702 Enterobacteria phage N4 Uncharacterized protein Gp2 Proteins 0.000 claims description 8
- 101000758599 Escherichia coli Uncharacterized 14.7 kDa protein Proteins 0.000 claims description 8
- 101000768777 Haloferax lucentense (strain DSM 14919 / JCM 9276 / NCIMB 13854 / Aa 2.2) Uncharacterized 50.6 kDa protein in the 5'region of gyrA and gyrB Proteins 0.000 claims description 8
- 101000607404 Infectious laryngotracheitis virus (strain Thorne V882) Protein UL24 homolog Proteins 0.000 claims description 8
- 101000735632 Klebsiella pneumoniae Uncharacterized 8.8 kDa protein in aacA4 3'region Proteins 0.000 claims description 8
- 101000768930 Lactococcus lactis subsp. cremoris Uncharacterized protein in pepC 5'region Proteins 0.000 claims description 8
- 101000976302 Leptospira interrogans Uncharacterized protein in sph 3'region Proteins 0.000 claims description 8
- 101000778886 Leptospira interrogans serogroup Icterohaemorrhagiae serovar Lai (strain 56601) Uncharacterized protein LA_2151 Proteins 0.000 claims description 8
- 101001121571 Rice tungro bacilliform virus (isolate Philippines) Protein P2 Proteins 0.000 claims description 8
- 101000818100 Spirochaeta aurantia Uncharacterized 12.7 kDa protein in trpE 5'region Proteins 0.000 claims description 8
- 101000818098 Spirochaeta aurantia Uncharacterized protein in trpE 3'region Proteins 0.000 claims description 8
- 101001026590 Streptomyces cinnamonensis Putative polyketide beta-ketoacyl synthase 2 Proteins 0.000 claims description 8
- 101001037658 Streptomyces coelicolor (strain ATCC BAA-471 / A3(2) / M145) Glucokinase Proteins 0.000 claims description 8
- 101000750896 Synechococcus elongatus (strain PCC 7942 / FACHB-805) Uncharacterized protein Synpcc7942_2318 Proteins 0.000 claims description 8
- 101000916321 Xenopus laevis Transposon TX1 uncharacterized 149 kDa protein Proteins 0.000 claims description 8
- 101000760088 Zymomonas mobilis subsp. mobilis (strain ATCC 10988 / DSM 424 / LMG 404 / NCIMB 8938 / NRRL B-806 / ZM1) 20.9 kDa protein Proteins 0.000 claims description 8
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 8
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 claims description 8
- 230000000984 immunochemical effect Effects 0.000 claims description 8
- 101000768804 Micromonospora olivasterospora Uncharacterized 10.9 kDa protein in fmrO 5'region Proteins 0.000 claims description 7
- 101001120268 Streptomyces griseus Protein Y Proteins 0.000 claims description 7
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 claims description 7
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 7
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 claims description 5
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 claims description 5
- 244000144977 poultry Species 0.000 claims description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 4
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 3
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims 2
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 abstract description 13
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 abstract description 13
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 abstract description 12
- 238000012360 testing method Methods 0.000 abstract description 5
- 238000001514 detection method Methods 0.000 abstract description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 abstract description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 59
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 49
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 36
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 30
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 20
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 20
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 20
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 13
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 13
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 13
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 12
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 11
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 11
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 10
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 10
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 10
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 9
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 9
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 9
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 8
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 8
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 7
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 7
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 7
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 6
- 241000201370 Autographa californica nucleopolyhedrovirus Species 0.000 description 6
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 6
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 6
- 108091033411 PCA3 Proteins 0.000 description 6
- 208000007502 anemia Diseases 0.000 description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 6
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 6
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 6
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 6
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 6
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 6
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 6
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 6
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 5
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 5
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 5
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 5
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 5
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 5
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 5
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 5
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 5
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 4
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 4
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 4
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 4
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 4
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 4
- 235000013594 poultry meat Nutrition 0.000 description 4
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 4
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 3
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 3
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 3
- 241000125945 Protoparvovirus Species 0.000 description 3
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 3
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 3
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 3
- 101710181863 Structural DNA-binding protein p10 Proteins 0.000 description 3
- 101710086987 X protein Proteins 0.000 description 3
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 3
- 230000003302 anti-idiotype Effects 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 3
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 3
- 108010052305 exodeoxyribonuclease III Proteins 0.000 description 3
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 3
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 3
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 3
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 3
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 3
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 3
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 3
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 229940031626 subunit vaccine Drugs 0.000 description 3
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 3
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl beta-D-galactoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CNC2=CC=C(Br)C(Cl)=C12 OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 0.000 description 2
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 2
- 102100026189 Beta-galactosidase Human genes 0.000 description 2
- 230000007023 DNA restriction-modification system Effects 0.000 description 2
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 2
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010062016 Immunosuppression Diseases 0.000 description 2
- 125000000570 L-alpha-aspartyl group Chemical group [H]OC(=O)C([H])([H])[C@]([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 2
- 108091027974 Mature messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 2
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 2
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 241000714474 Rous sarcoma virus Species 0.000 description 2
- 101100024330 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) MSB1 gene Proteins 0.000 description 2
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 241000256251 Spodoptera frugiperda Species 0.000 description 2
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 2
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- 229940037003 alum Drugs 0.000 description 2
- 230000009435 amidation Effects 0.000 description 2
- 238000007112 amidation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 2
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 2
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 244000144992 flock Species 0.000 description 2
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 2
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 2
- FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N hypoxanthine Chemical compound O=C1NC=NC2=C1NC=N2 FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940031551 inactivated vaccine Drugs 0.000 description 2
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 2
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 2
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 2
- 150000002736 metal compounds Chemical class 0.000 description 2
- 239000002923 metal particle Substances 0.000 description 2
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 2
- -1 operators Proteins 0.000 description 2
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 2
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 238000007480 sanger sequencing Methods 0.000 description 2
- 229930182490 saponin Natural products 0.000 description 2
- 150000007949 saponins Chemical class 0.000 description 2
- 235000017709 saponins Nutrition 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 2
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 2
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 description 2
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 2
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 2
- DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N (2R)-6-amino-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2R,3S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[(2S,3S)-2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[2-[[2-[[2-[(2-amino-1-hydroxyethylidene)amino]-3-carboxy-1-hydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1,5-dihydroxy-5-iminopentylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]hexanoic acid Chemical compound C[C@@H]([C@@H](C(=N[C@@H](CS)C(=N[C@@H](C)C(=N[C@@H](CO)C(=NCC(=N[C@@H](CCC(=N)O)C(=NC(CS)C(=N[C@H]([C@H](C)O)C(=N[C@H](CS)C(=N[C@H](CO)C(=NCC(=N[C@H](CS)C(=NCC(=N[C@H](CCCCN)C(=O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)N=C([C@H](CS)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](C)N=C(CN=C([C@H](CO)N=C([C@H](CS)N=C(CN=C(C(CS)N=C(C(CC(=O)O)N=C(CN)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N 0.000 description 1
- OJHZNMVJJKMFGX-RNWHKREASA-N (4r,4ar,7ar,12bs)-9-methoxy-3-methyl-1,2,4,4a,5,6,7a,13-octahydro-4,12-methanobenzofuro[3,2-e]isoquinoline-7-one;2,3-dihydroxybutanedioic acid Chemical compound OC(=O)C(O)C(O)C(O)=O.O=C([C@@H]1O2)CC[C@H]3[C@]4([H])N(C)CC[C@]13C1=C2C(OC)=CC=C1C4 OJHZNMVJJKMFGX-RNWHKREASA-N 0.000 description 1
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 2-diethylaminoethanol Chemical compound CCN(CC)CCO BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- TVZGACDUOSZQKY-LBPRGKRZSA-N 4-aminofolic acid Chemical compound C1=NC2=NC(N)=NC(N)=C2N=C1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 TVZGACDUOSZQKY-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 1
- 108010042708 Acetylmuramyl-Alanyl-Isoglutamine Proteins 0.000 description 1
- 101000768957 Acholeplasma phage L2 Uncharacterized 37.2 kDa protein Proteins 0.000 description 1
- 101000823746 Acidianus ambivalens Uncharacterized 17.7 kDa protein in bps2 3'region Proteins 0.000 description 1
- 101000916369 Acidianus ambivalens Uncharacterized protein in sor 5'region Proteins 0.000 description 1
- 101000769342 Acinetobacter guillouiae Uncharacterized protein in rpoN-murA intergenic region Proteins 0.000 description 1
- 101000823696 Actinobacillus pleuropneumoniae Uncharacterized glycosyltransferase in aroQ 3'region Proteins 0.000 description 1
- 101000786513 Agrobacterium tumefaciens (strain 15955) Uncharacterized protein outside the virF region Proteins 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 101000618005 Alkalihalobacillus pseudofirmus (strain ATCC BAA-2126 / JCM 17055 / OF4) Uncharacterized protein BpOF4_00885 Proteins 0.000 description 1
- 102100020724 Ankyrin repeat, SAM and basic leucine zipper domain-containing protein 1 Human genes 0.000 description 1
- 101000967489 Azorhizobium caulinodans (strain ATCC 43989 / DSM 5975 / JCM 20966 / LMG 6465 / NBRC 14845 / NCIMB 13405 / ORS 571) Uncharacterized protein AZC_3924 Proteins 0.000 description 1
- 241001135975 BK virus variant RF Species 0.000 description 1
- 101000823761 Bacillus licheniformis Uncharacterized 9.4 kDa protein in flaL 3'region Proteins 0.000 description 1
- 101000819719 Bacillus methanolicus Uncharacterized N-acetyltransferase in lysA 3'region Proteins 0.000 description 1
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 1
- 101000789586 Bacillus subtilis (strain 168) UPF0702 transmembrane protein YkjA Proteins 0.000 description 1
- 101000792624 Bacillus subtilis (strain 168) Uncharacterized protein YbxH Proteins 0.000 description 1
- 101000790792 Bacillus subtilis (strain 168) Uncharacterized protein YckC Proteins 0.000 description 1
- 101000819705 Bacillus subtilis (strain 168) Uncharacterized protein YlxR Proteins 0.000 description 1
- 101000948218 Bacillus subtilis (strain 168) Uncharacterized protein YtxJ Proteins 0.000 description 1
- 101000718627 Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki Putative RNA polymerase sigma-G factor Proteins 0.000 description 1
- 108010071023 Bacterial Outer Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101000641200 Bombyx mori densovirus Putative non-structural protein Proteins 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 201000006082 Chickenpox Diseases 0.000 description 1
- 101000947633 Claviceps purpurea Uncharacterized 13.8 kDa protein Proteins 0.000 description 1
- 208000003322 Coinfection Diseases 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000557626 Corvus corax Species 0.000 description 1
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 1
- 241000450599 DNA viruses Species 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000006145 Eagle's minimal essential medium Substances 0.000 description 1
- 102100027723 Endogenous retrovirus group K member 6 Rec protein Human genes 0.000 description 1
- 101000948901 Enterobacteria phage T4 Uncharacterized 16.0 kDa protein in segB-ipI intergenic region Proteins 0.000 description 1
- 101710091045 Envelope protein Proteins 0.000 description 1
- 101000805958 Equine herpesvirus 4 (strain 1942) Virion protein US10 homolog Proteins 0.000 description 1
- 101000790442 Escherichia coli Insertion element IS2 uncharacterized 11.1 kDa protein Proteins 0.000 description 1
- 241001646716 Escherichia coli K-12 Species 0.000 description 1
- 101000788354 Escherichia phage P2 Uncharacterized 8.2 kDa protein in gpA 5'region Proteins 0.000 description 1
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 1
- 108700039887 Essential Genes Proteins 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 description 1
- 108010074860 Factor Xa Proteins 0.000 description 1
- 101000770304 Frankia alni UPF0460 protein in nifX-nifW intergenic region Proteins 0.000 description 1
- 241000701047 Gallid alphaherpesvirus 2 Species 0.000 description 1
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 1
- 101000797344 Geobacillus stearothermophilus Putative tRNA (cytidine(34)-2'-O)-methyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 101000748410 Geobacillus stearothermophilus Uncharacterized protein in fumA 3'region Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 101000772675 Haemophilus influenzae (strain ATCC 51907 / DSM 11121 / KW20 / Rd) UPF0438 protein HI_0847 Proteins 0.000 description 1
- 101000631019 Haemophilus influenzae (strain ATCC 51907 / DSM 11121 / KW20 / Rd) Uncharacterized protein HI_0350 Proteins 0.000 description 1
- 101000768938 Haemophilus phage HP1 (strain HP1c1) Uncharacterized 8.9 kDa protein in int-C1 intergenic region Proteins 0.000 description 1
- 101000785414 Homo sapiens Ankyrin repeat, SAM and basic leucine zipper domain-containing protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000833492 Homo sapiens Jouberin Proteins 0.000 description 1
- 101000651236 Homo sapiens NCK-interacting protein with SH3 domain Proteins 0.000 description 1
- 101000812677 Homo sapiens Nucleotide pyrophosphatase Proteins 0.000 description 1
- UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N Hypoxanthine nucleoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 241000711450 Infectious bronchitis virus Species 0.000 description 1
- 241000702626 Infectious bursal disease virus Species 0.000 description 1
- 102100024407 Jouberin Human genes 0.000 description 1
- 101000782488 Junonia coenia densovirus (isolate pBRJ/1990) Putative non-structural protein NS2 Proteins 0.000 description 1
- 101000811523 Klebsiella pneumoniae Uncharacterized 55.8 kDa protein in cps region Proteins 0.000 description 1
- 125000002061 L-isoleucyl group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])[C@](C([H])([H])[H])([H])C(C([H])([H])[H])([H])[H] 0.000 description 1
- 125000002842 L-seryl group Chemical group O=C([*])[C@](N([H])[H])([H])C([H])([H])O[H] 0.000 description 1
- 101000818409 Lactococcus lactis subsp. lactis Uncharacterized HTH-type transcriptional regulator in lacX 3'region Proteins 0.000 description 1
- 101000878851 Leptolyngbya boryana Putative Fe(2+) transport protein A Proteins 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 241001502481 Meleagrid alphaherpesvirus 1 Species 0.000 description 1
- 102000003792 Metallothionein Human genes 0.000 description 1
- 108090000157 Metallothionein Proteins 0.000 description 1
- 101000758828 Methanosarcina barkeri (strain Fusaro / DSM 804) Uncharacterized protein Mbar_A1602 Proteins 0.000 description 1
- 101001122401 Middle East respiratory syndrome-related coronavirus (isolate United Kingdom/H123990006/2012) Non-structural protein ORF3 Proteins 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 101001055788 Mycolicibacterium smegmatis (strain ATCC 700084 / mc(2)155) Pentapeptide repeat protein MfpA Proteins 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- 102100039306 Nucleotide pyrophosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108010038807 Oligopeptides Proteins 0.000 description 1
- 102000015636 Oligopeptides Human genes 0.000 description 1
- 101000740670 Orgyia pseudotsugata multicapsid polyhedrosis virus Protein C42 Proteins 0.000 description 1
- 101710116435 Outer membrane protein Proteins 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 101000769182 Photorhabdus luminescens Uncharacterized protein in pnp 3'region Proteins 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 101710182846 Polyhedrin Proteins 0.000 description 1
- 108010039918 Polylysine Proteins 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 101710188315 Protein X Proteins 0.000 description 1
- 101000961392 Pseudescherichia vulneris Uncharacterized 29.9 kDa protein in crtE 3'region Proteins 0.000 description 1
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 1
- 101000731030 Pseudomonas oleovorans Poly(3-hydroxyalkanoate) polymerase 2 Proteins 0.000 description 1
- 101001065485 Pseudomonas putida Probable fatty acid methyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 101100173636 Rattus norvegicus Fhl2 gene Proteins 0.000 description 1
- 101000711023 Rhizobium leguminosarum bv. trifolii Uncharacterized protein in tfuA 3'region Proteins 0.000 description 1
- 101000948156 Rhodococcus erythropolis Uncharacterized 47.3 kDa protein in thcA 5'region Proteins 0.000 description 1
- 101000917565 Rhodococcus fascians Uncharacterized 33.6 kDa protein in fasciation locus Proteins 0.000 description 1
- 101000790284 Saimiriine herpesvirus 2 (strain 488) Uncharacterized 9.5 kDa protein in DHFR 3'region Proteins 0.000 description 1
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 101000936719 Streptococcus gordonii Accessory Sec system protein Asp3 Proteins 0.000 description 1
- 101000788499 Streptomyces coelicolor Uncharacterized oxidoreductase in mprA 5'region Proteins 0.000 description 1
- 101001102841 Streptomyces griseus Purine nucleoside phosphorylase ORF3 Proteins 0.000 description 1
- 101000708557 Streptomyces lincolnensis Uncharacterized 17.2 kDa protein in melC2-rnhH intergenic region Proteins 0.000 description 1
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- 101000649826 Thermotoga neapolitana Putative anti-sigma factor antagonist TM1081 homolog Proteins 0.000 description 1
- 241001664469 Tibicina haematodes Species 0.000 description 1
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 1
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 1
- 206010046980 Varicella Diseases 0.000 description 1
- 101000827562 Vibrio alginolyticus Uncharacterized protein in proC 3'region Proteins 0.000 description 1
- 101000778915 Vibrio parahaemolyticus serotype O3:K6 (strain RIMD 2210633) Uncharacterized membrane protein VP2115 Proteins 0.000 description 1
- HMNZFMSWFCAGGW-XPWSMXQVSA-N [3-[hydroxy(2-hydroxyethoxy)phosphoryl]oxy-2-[(e)-octadec-9-enoyl]oxypropyl] (e)-octadec-9-enoate Chemical compound CCCCCCCC\C=C\CCCCCCCC(=O)OCC(COP(O)(=O)OCCO)OC(=O)CCCCCCC\C=C\CCCCCCCC HMNZFMSWFCAGGW-XPWSMXQVSA-N 0.000 description 1
- 230000003187 abdominal effect Effects 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000001261 affinity purification Methods 0.000 description 1
- 230000004520 agglutination Effects 0.000 description 1
- 230000001476 alcoholic effect Effects 0.000 description 1
- 102000004139 alpha-Amylases Human genes 0.000 description 1
- 108090000637 alpha-Amylases Proteins 0.000 description 1
- 229940024171 alpha-amylase Drugs 0.000 description 1
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229960003896 aminopterin Drugs 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000000676 anti-immunogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002421 anti-septic effect Effects 0.000 description 1
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 1
- 210000000628 antibody-producing cell Anatomy 0.000 description 1
- 229940064004 antiseptic throat preparations Drugs 0.000 description 1
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 1
- 238000000376 autoradiography Methods 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- 230000021523 carboxylation Effects 0.000 description 1
- 238000006473 carboxylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 1
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 108091036078 conserved sequence Proteins 0.000 description 1
- 229940028617 conventional vaccine Drugs 0.000 description 1
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 1
- 238000012136 culture method Methods 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000002845 discoloration Methods 0.000 description 1
- 230000001804 emulsifying effect Effects 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000009585 enzyme analysis Methods 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 230000008826 genomic mutation Effects 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 125000000291 glutamic acid group Chemical group N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)* 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 230000003394 haemopoietic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 108060003552 hemocyanin Proteins 0.000 description 1
- 229920001519 homopolymer Polymers 0.000 description 1
- 230000008348 humoral response Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 1
- 238000003125 immunofluorescent labeling Methods 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 239000004816 latex Substances 0.000 description 1
- 229920000126 latex Polymers 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229940023832 live vector-vaccine Drugs 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 239000000693 micelle Substances 0.000 description 1
- 229940031348 multivalent vaccine Drugs 0.000 description 1
- BSOQXXWZTUDTEL-ZUYCGGNHSA-N muramyl dipeptide Chemical compound OC(=O)CC[C@H](C(N)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](C)O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H](O)[C@@H]1NC(C)=O BSOQXXWZTUDTEL-ZUYCGGNHSA-N 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 229920005615 natural polymer Polymers 0.000 description 1
- 210000000440 neutrophil Anatomy 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 239000006174 pH buffer Substances 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 229920001308 poly(aminoacid) Polymers 0.000 description 1
- 108010054442 polyalanine Proteins 0.000 description 1
- 229920000447 polyanionic polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920000656 polylysine Polymers 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 108010064037 prorennin Proteins 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 239000001397 quillaja saponaria molina bark Substances 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 238000009938 salting Methods 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 1
- 239000004017 serum-free culture medium Substances 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 229920001059 synthetic polymer Polymers 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 1
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 1
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 238000000844 transformation Methods 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 230000010066 viral adhesion Effects 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
- C12N2750/00011—Details
- C12N2750/10011—Circoviridae
- C12N2750/10022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
Description
A találmány csirke anémia vírus eredetű polipeptidet kódoló nukleinsav szekvenciával, ilyen nukleinsav szekvenciát tartalmazó rekombináns nukleinsav molekulával, az említett nukleinsav szekvenciát tartalmazó vektor vírussal, ilyen nukleinsav szekvenciával transzformált gazdasejttel, csirke anémia vírus eredetű polipeptiddel és ezekkel reagáló ellenanyagokkal, csirke anémia vírus mutánssal mint a csirke anémia vírus fertőzés elleni vakcinával foglalkozik.
A találmány egy immunkémiai reagensre és ezt a reagenst tartalmazó készletre/kitre is kiterjed.
A csirke anémia vírus (CAV) fertőző vérszegénységet okoz csirkékben. Míg a CAV szemlátomást bármilyen korú madarakat megfertőzhet, a betegség tüneteit csak fiatal madaraknál észlelték. A csirke anémia vírusok immunszupresszívek is. Normális, egészséges madarakban, fiatal madarak esetén a tímusz felelős a T-sejtek termeléséért, a Fabriciusz tömlő képezi a B-sejteket, és a csontvelő termeli a vörös-vérsejtek mellett a fehér-vérsejteket. CAV fertőzött csirkéknél a fent említett sejtek pusztulása következik be. Elesettség, vérszegénység, és immunszupresszió jön létre 7-14 napon belül. Különösen néhány hetes korukig mutatnak a csirkék súlyos, vérszegénységre és immunszupresszióra utaló jeleket. A természetes úton fertőződött csirke állományban az elhullás aránya rendszerint 30 %-ig emelkedik, és a túlélők 24-32 nap múlva gyógyulnak fel teljesen.
Gyakoriak a másodlagos fertőzések, különösen vírusos és bakteriális infekciók súlyosbítják a CAV okozta tüneteket, és ezeknél az eseteknél az elhullást jóval 30 % fölé • ·· ·· ·
- 3 emelik. Idősebb madarak is fertőződhetnek, de bennük nem fejlődik ki a betegség, azonban szubklinikai tüneteknek tudható be a csirkék hozamának csökkenése.
Szerológiai bizonyítékok arra utalnak, hogy a vizsgált csirke tenyész-állományok 90 %-ánál valamely időpontban kimutatható keringő CAV ellenanyagok jelenléte, tehát fertőződtek a vírussal. A CAV általános előfordulása jól dokumentált.
A CAV horizontálisan és vertikálisan (tojóról a tojásban lévő csirkére) egyaránt átvihető. A vírusrészecskék igen stabilak, különböző vegyszerek, pl. kloroform, vagy 30 percig tartó 60 °C-on való hevítés nem pusztítják el. A CAVot kb. 24 nm átmérőjű csupasz gömb alakú vírusként írták le, és körkörös, egyszálú, kb. 2300 bázispárból álló DNS-t tartalmaz .
A CAV általános előfordulása, a fiatalkori magas elhullási arány és idősebb csirkéknél a hozam csökkenése szükségessé teszi egy biztonságos és hatásos, a CAV fertőzés vagy a betegség megelőzésére szolgáló vakcina kidolgozását.
A konvencionális vakcinák lehetnek kémiailag inaktivált vírus vakcinák vagy módosított élő-vírus vakcinák. Az inaktivált vakcinák azonban további immunizálást tesznek szükségessé, hátrányuk, hogy adjuvánst tartalmaznak, előállításuk költséges, és beadásuk munkaigényes. Továbbá, néhány fertőző vírus-részecske túlélheti az inaktivációs eljárást, és betegséget okozhatnak az állatba való beadás után.
Általában a gyengített vírus vakcinák kedveltek, mivel gyakran mind humorális, mind celluláris reakcióra épülő immunválaszt váltanak ki. Mostanáig, az ilyen, CAV-törzs alapú vakcinákat a virulens törzsek szövettenyészeten való sorozatos passzálásaival állíthattunk csak elő. Azonban, e kezelés következtében ellenőrizhetetlen mutációk jönnek létre a vírus genomban, ami virulencájukat és immunizáló sajátságaikat illetően a vírus részecskék heterológ populációját eredményezi. Jól ismert továbbá, hogy a hagyományos gyengített vírus vakcinák visszaalakulhatnak virulensekké, így a beoltott állat megbetegedését és a kórokozónak más állatokra való terjedését okozhatják. A rekombináns DNS technológiára alapozva olyan fejlettebb vakcinák állíthatók elő, melyek csak a CAV kórokozó elleni immunválasz kiváltásához szükséges és releváns immunogén anyagot, illetve az említett anyagot kódoló genetikai információt tartalmazzák, és nem mutatják az élő vagy inaktivált vakcinák fent említett hátrányos tulajdonságait.
A találmány értelmében egy CAV eredetű polipeptidet kódoló nukleinsav szekvenciát állítunk elő, amely baromfiak CAV-val szembeni immunizálására alkalmas vakcina és diagnosztikum előállítására használható.
A nukleinsav szekvencia fogalmán bármely hosszúságú, nukleotidok polimerizált formáját értjük, mind ribonukleinsav, mind dezoxiribonukleinsav szekvenciákat. Lényegében, az elnevezés a molekula elsődleges szerkezetére utal, így, az elnevezés mind a kétszálú és egyszálú DNS-re, mind a kétszálú és egyszálú RNS-re és ezek módosulataira vonatkozik.
Általánosságban, a polipeptid fogalom aminosavak « « • · ···· « β • ·· · · ···· »· * ·· ·· · ·
- 5 biológiai aktivitással rendelkező molekula láncára utal, nem utal meghatározott hosszúságú termékre, és kívánság szerint in vivő vagy in vitro módosítható, pl. glikozilezéssel, amidálással, karboxilezéssel vagy foszforilezéssel; így többek között peptideket, oligopeptideket és proteineket foglal magában.
Közelebbről, a találmány szerint három, egyenként ORF 1-3-ként jelölt CAV eredetű polipeptidet kódoló szakaszt tartalmazó nukleinsav szekvenciát azonosítottunk és jellemeztünk.
Az ORF-1 polipeptidet kódoló szakasz a 876-tól a 2225. nukleotidig terjed (lásd 1. szekvencia, 2. ábra), és egy körülbelül 449 aminosav hosszúságú polipeptidet kódol. Az ORF-1 gén által kódolt polipeptid aminosav szekvenciáját a 2. szekvencia mutatja. Némi szekvencia-heterogenitást észleltünk az 1657. és a 2185. nukleotidoknál. Ezek a szekvencia-variációk konzervatív aminosav cserékben nyilvánulnak meg, és így nem befolyásolhatják lényegesen a polipeptid biológiai aktivitását.
Az ORF-2 polipeptidet kódoló szakasz a genom egy másik leolvasó keretének 101-502. nukleotidjait foglalja magában (lásd 1. szekvencia, 2. ábra), és egy kb. 133 aminosav hosszúságú polipeptidet kódol. Az ORF-2 gén által kódolt polipeptid aminosav szekvenciáját a 3. szekvencia mutatja.
Az ORF-3 polipeptidet kódoló szakasz a genom egy harmadik leolvasó keretének 403-1053. nukleotidjait foglalja magában (lásd 1. szekvencia, 2. ábra), és egy kb. 216 aminosav hosszúságú polipeptidet kódol. Az ORF-3 gén által • ••·
- 6 kódolt polipeptid aminosav szekvenciáját a 4. szekvencia mutatja.
A találmány tárgya tehát ORF-1 polipeptidet, ORF-2 polipeptidet és ORF-3 polipeptidet kódoló nukleinsav-szekvenciák, melyek a 2., 3., illetve a 4. szekvenciával ábrázolt aminosav szekvenciákkal rendelkeznek.
Ismeretes, hogy rendszerint a genomnak nem minden része fordul elő a transzlációra kerülő, érett mRNS-en. Az érett, biológiai funkcióval rendelkező proteinek különböző ORF-k fragmentjeiből in vivő adódhanak össze RNS-kapcsolódás útján. Az RNS szinten végbemenő lehetséges modifikáció például - ilyen modifikációk a transzlációra kész, érett mRNS létrejötte előtt mehetnek végbe - a Parvovirusok esetén az átírt RNS átalakulásainak sorozata (processing). Amint azt Berns és munkatársai közölték [J. Gén. Virol. 68, 601-614 (1987)], a Parvovirusok felépítésükben összehasonlíthatók a CAV-val, lévén nagyon kis, buroknélküli, egyszálú DNS-t tartalmazó vírusok. RNS Mprocessing'’-re van szükség a parvovírus burok-proteinek és nem-struktúráiis proteinek összeállításához, melyek mindegyikét több transzlációs egységen, több ORF kódolja.
A genom átírt szakaszának a térképét, különböző rutinszerűen használt technikával készíthetjük el (pl. Maniatis és munkatársai, Molecular Cloning, A laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, U.S.A., 1989), így pl. cDNS készítése izolált CAV mRNS-ből, CAV RNS in vitro transzlációja és a traszkripciős termék térképezésének néhány módja, mint az SÍ nukleáz-védő vizsgálatok és primer··· · * *· * · , · · : %.*:.:. ..· ..· ’..· ··;» »·,<
- 7 kiterjesztéses analízisek.
Ezek a technikák lehetővé teszik a CAV genom transzkripciós térképének elkészítését, és benyomást kapunk az átírt termékek relatív gyakoriságáról. Ily módon lokalizálhatók a CAV eredetű polipeptideket kódoló aktuális gének.
Ennél megfelelően a különböző ORF eredtű nukleotid szekvenciákból levezetett nukleinsav-szekvenciák is a találmány tárgykörébe tartoznak.
A talámány tárgyát képezik az említett ORF-1, ORF-2 vagy ORF-3 polipeptidekkel funkcionálisan ekvivalens, megfelelő immunológiai tulajdonságokkal rendelkező polipeptidet kódoló nukleinsav-szekvenciák is.
Természetes, hogy a 26P4 CAV törzs eredetű, itt leírt, adott ORF 1-3 polipeptidekhez képest egyes vírusok vagy csirke anémia vírus törzsek között természetes variációk létezhetnek. Ezek a variációk a teljes szekvencián belül (egy) aminosav különbséggel (különbségekkel) vagy deléciókkal, szubsztitúciókkal, inszerciókkal, inverziókkal vagy (egy) aminosav (aminosavak) addíciójával jellemezhetők. Leírtak olyan aminosav szubsztitúciókat, amelyek várhatóan nem változtatják meg alapjaiban a biológiai és immunológiai aktivitást. Rokon aminosavak közötti helyettesítések vagy olyan helyettesítések, amelyek gyakran fordultak elő az evolúció során, többek között a Ser/Alá, Ser/Gly, Asp/Gly, Asp/Asn, Ile/Val (lásd Dayhof, M.D., Atlas of protein sequence and structure, Nat. Biomed. Rés. Found., Washington D.C., 1978, suppl. 3). Erre az információra alapozva fejlesztett ki Lipman és Pearson egy gyors és érzékeny, protein-összehason• ·
- 8 lításra és homológ polipeptidek közti funkcionális hasonlóság megállapítására szolgáló módszert [Science, 227. 14351441 (1985)]. Ezen találmány tárgykörébe tartoznak az ilyen homológ, funkcionális ekvivalenseket kódoló nukleinsav-szekvenciák is. Ezenfelül, fennáll a lehetősége annak, hogy rekombináns DNS technológia felhasználásával ezeket a különböző funkcionális ekvivalenseket kódoló nukleinsav-szekvenciákat előállítsuk.
A találmány szerinti nukleinsav-szekvenciák olyan CAV törzsek izolátumaiból nyerhetők, mint például a Cuxhaven-1, TK-5803 vagy Gifu-1.
Az 1-4. szekvencián megadott információk lehetővé teszik a szakmában járatos személynek a fent említett, különböző, funkcionálisan ekvivalens, a szóbanforgó ORF 1-3 polipeptideknek megfelelő immunológiai sajátságokkal rendelkező polipeptideket kódoló nukleinsav-szekvenciák izolálását és azonosítását. Erre a célra az általánosan alkalmazott Southern biot technika vagy a telep-hibridizáció használható fel [Experiments in Molecular Biology, ed. R.J. Slater, Clifton, U.S.A., 1986; Singer-Sam, J. és munkatársai Proc. Natl. Acad. Sci. 80, 802-806, (1983); Maniatis T. és munkatársai, Molecular Cloning, A laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, USA (1989)]. Például eljárhatunk úgy, hogy az adott CAV törzsből származó restrikciós endonukleázzal emésztett DNS-t elektroforetizáljuk, és ezután egy nitrocellulóz szűrőre visszük át. így lehetővé válik a szűrőn a CAV eredetű szekvenciák azonosítása, meghatározott jelölt DNS fragmentumhoz vagy próbához való hibridizálás • ·· ·· «·····«·« * · * * ·· 4 4
- 9 útján, mely a 2-4. szekvencián bemutatott aminosav-szekvenciákból kikövetkeztetett szekvenciával rendelkező szintetikus oligonukleotid. Meghatározott körülmények - úgy mint sókoncentráció és hőmérséklet - mellett a próba a szűrőn található homológ DNS-szekvenciákhoz hibridizál. A szűrő mosása után a hibridizált anyag autoradiográfiával mutatható ki. A megfelelő DNS restrikciós fragmens most már eluálható az agaróz gélből, és felhasználható a 2-4. szekvencia szerinti polipeptidekkel funkcionálisan ekvivalens polipeptid szintézisének irányítására.
A pCAl, pCA3 vagy ezek fragmense más CAV törzsek genomjával való összehasonlítás alapján várhatóan igen nagy mértékben megtartott szekvencia struktúrát tartalmaz, és hibridizációs kísérletekben használjuk őket. Ezúton kvantitatív és kvalitatív információt nyerünk egy állat vagy adott anyag CAV fertőzöttségi állapotáról. A vizsgálandó mintákat, amelyek lehetnek vér (elsősorban limfociták), szervekből származó anyagok (pl. máj, vese), embrió-homogenizátum vagy MDCC-MSB1 sejtek [Akiyama és munkatársai, Biken J. 17, 105117 (1974)] ezen minták valamelyikével inkubáljuk. Ismert módon [Berger és Kimmel, eds., Methods in Enzymology 152, 181 (1987) ] nyers DNS preparátumot készítünk. Minden egyes minta hígítási sorozatát nitrocellulóz membránra visszük át, és jelölt pCAl-gyel, pCA3-mal vagy ezek fragmensével próbáljuk” (Maniatis és munkatársai, 1989, id. h.). Előhívás után a jeleket mennyiségileg az ugyanazon kísérletben, standard mennyiségű CAV DNS hígítási sorozataiból kapott jelekkel való összehasonlítással határozzuk meg. Negatívnak te kintjük a mintát, ha nem ad (detektálható) jelet, a detekciós határ rendszerint millliliterenként 2 pmolnál kevesebb CAV DNS.
Eljárhatunk úgy is, hogy a CAV eredetű DNS-t lambdagtll fágba klónozuk, és baktérium gazdaszervezetben expreszszáljuk. A rekombináns fágok azután a tisztított ORF 1-3 polipeptidek ellen termelt poliklonális szérummal szűrhatők ki, meghatározva a polipeptid variánsok különböző immunológiai régióinak jelenlétét. Az alábbiakban ismertetjük az itt használt, az ORF 1-3 ellen termelt poliklonális szérumok előállítását.
Ismeretes, hogy a genetikai kód degeneráltsága lehetővé teszi a kodonban bázisok szubsztitúcióját, ami más, de ugyanazon aminosavat kódoló kodont eredményez, pl. mind a GAT, mind a GAA glutaminsav aminosavat kódoló kodon. Következésképp világos, hogy a 2-4. szekvencián bemutatott aminosav-szekvenciával rendelkező polipeptid expressziójához felhasználható olyan nukleinsav-szekvencia származék (funkcionális ekvivalens), amely ilyen, az említett szekvenciákon bemutatott nukleinsav-szekvenciától különböző, alternatív kodon összeállítással rendelkezik.
A találmány kiterjed a CAV genomra vagy annak fragmensét tartalamzó nukleinsav-szekvenciára.
A találmány szerinti előnyös nukleinsav-szekvencia az 1. szekvencián bemutatott dezoxiribonukleinsav-szekvenciának legalább egy részét tartalmazza.
Az említett dezoxiribonukleinsav leghasznosabb részeit azok a részek képezik, amelyek egy polipeptidet kódol11 nak.
A találmány különösen az 1. szekvencián bemutatott, az ORF-nak legalább a CAV genomján a 876-2225., a 101-502. vagy a 403-1053. helyeken található nukleinsav-szekvencia részére vonatkozik.
Ezenkívül a vírus genomon a 2230.-tól a 2298.-ig terjedő helyen található nukleotidok, az 1.-től a 870.-ig terjedő nukleotidokhoz kapcsolva olyan szekvenciákat tartalmaznak, amelyek az említett szekvenciák ellenőrzése alá helyezett heterológ gének expressziójának kontrolljára használhatók fel.
A találmány kiterjed továbbá az ORF 1-3 polipeptideket vagy ezek fent említett funkcionális ekvivalenseit kódoló nukleinsav-szekvenciák fragmenseire is.
A fragmens olyan DNS- vagy aminosav-szekvencia, amely a találmány szerinti valamely nukleinsav-szekvenciának vagy polipeptidnek a szubszekvenciáját tartalmazza. Az említett fragmens vagy egy polipeptid, vagy a CAV eredetű polipeptid egy vagy több immunreaktív és/vagy antigén hatású determinánsát hordozó polipeptidet kódol, pl. egy vagy több, a csirkében immunválaszt kiváltani képes epitoppal rendelkezik és/vagy képes a komplementer ellenanyaghoz specifikusan kötődni. A felhasználható polipeptid-fragmensek meghatározására szolgáló módszereket az alábbiakban vázoljuk. Fragmensek - többek között - előállíthatok a prekurzor molekula enzimatikus hasításával, restrikciós endonukleázokat használva a DNS-hez, és proteázokat a polipeptidekhez. A fragmensek előállíthatók azonban kémiai szintézissel vagy DNS fragmens-
ről a polipeptid fragmensek szintézisével.
A találmány tárgykörébe tartoznak mindazon módosítások, amelyek az ORF 1-3 polipeptideknek ilyen funkcionális ekvivalenseit eredményezik, amennyiben az ORF-1, ORF-2 vagy ORF-3 polipeptidek immunológiai sajátságai alapvetően változatlanok maradnak.
A találmány szerinti nukleinsav-szekvenciához tartoznak az in vitro szintetizált vagy pl. PCR technológiával kapott nukleinsav szekvenciák is.
A találmány szerinti nukelinsav-szekvencia különböző, olyan replikációt befolyásoló DNS-szekvenciákhoz kapcsolható, amelyekkel a természetben nem aszociálódik vagy kapcsolódik, amelyek adott esetben olyan fúziós protein-szekvenciákat kódoló DNS részeket tartalmaznak, mint pl. B-galaktozidáz, ezáltal ún. rekombináns nukleinsav molekulát eredményezve, amely alkalmas gazdaszervezet transzformációjára használható. Ilyen hibrid DNS molekulák előállítására leginkább plazmidok vagy bakterifágokban található nukleinsav-szekvenciák, kozmidok vagy vírusok használhatók.
A találmány szerinti nukleinsav-szekvenciák klónozására felhasználható specifikus vektorok a technika állása szerint ismertek, többek között ide tartoznak plazmid vektorok, mint a pBR322, a különféle pUC, pGEM és Bluescript plazmidok, bakteriofágok, pl. lambda gt-Wes-lambda B, Charon 28 és az M13 eredetű fágok vagy vírus vektorok, mint az SV40, adenovírus vagy polioma vírus [lásd továbbá Rodriquez,
R.L. és D.T. Denhardt, ed., Vectors: A survey of molecular cloning vectors and their uses, Butterworths, 1988; Lenstra,
J.A. és munkatársai, Arch. Virol. 110, 1-24 (1990)]. A találmány szerinti rekombináns nukleinsav molekulák konstrukciójához használható módszerek ismertek a szakterületen jártas szakemberek számára, többek között hozzáférhető a Maniatis T. és munkatársai (Molecular Cloning A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory, 1982). Például a klónozásra használt vektorba való inszerció könnyűszerrel elvégezhető, ha mind a gént, mind a kívánt klónózási hordozót ugyanazzal a restrikciós enzimmel (enzimekkel) vágtuk el, mivel így komplementer DNS végeket képeztünk.
Szükség lehet arra is, hogy a restrikciós helyeket módosítsuk tompa végek kialakítására vagy az egyszálú DNS leemésztésével, vagy az egyszálú végeknek megfelelő DNS polimerázzal való feltöltésével. Ezután elvégezhető a tompa végek ligálása, olyan enzimmel, mint pl. a T4 DNS ligáz.
Kívánt esetben előállítható bármely DNS restrikciós felismerő hely úgy, hogy linkereket a DNS végekhez kapcsolunk. Ilyen linkerek restrikciós hely szekvenciákat kódoló specifikus oligonukleotid szekvenciákat tartalmazhatnak. A restrikciós enzimmel elvágott vektor és nukleinsav szekvencia homopolimer végek hozzákapcsolásával (farokképzéssel) is módosítható.
Transzformáció” fogalmán heterológ nukleinsav szekvenciának a gazdasejtbe való bejuttatását értjük, függetlenül az alkalmazott módszertől, pl. direkt felvétel vagy transzdukció. A heterológ nukleinsav szekvencia integrálódhat a gazda genomba. A rekombináns DNS molekulák kívánt esetben az adott gazdaszervezettel kompatibilis, megfelelő • · ·
- 14 kontroll szekvenciákkal láthatók el, amelyek az inszertált nukleinsav-szekvencia expresszióját szabályozni képesek.
A találmány szerinti rekombináns nukleinsav molekulák lehetőleg egy vagy több marker aktivitást tartalmaznak, amelyek felhasználhatók a kívánt transz formánsok szelektálására. Ilyenek az ampicillin és tetraciklin rezisztencia a pBR322-ben és az ampicillin rezisztencia, valamint béta-galaktozidáz aktivitás a pUC8-ban.
Alkalmas gazdasejt az olyan sejt, amely polipeptidet kódoló nukleinsav-szekvenciával vagy ilyen nukleinsav-szekvenciát tartalmazó rekombináns nukleinsav molekulával transzformálható, és amely, ha szükséges, felhasználható az említett nukleinsav-szekvencia által kódolt, említett polipeptid expressziójára. A gazdasejt lehet prokarióta eredetű, pl. baktérium, mint pl. Escherichia coli, Bacillus subtilis és Pseudomonas fajták; vagy eukarióta eredetű, mint az élesztők, pl. Saccharomyces cerevisiae, vagy magasabb rendű eukarióta sejtek, mint a rovar, növény vagy emlős sejtek, beleérteve a HeLa sejteket és kínai hörcsög ovárium (CHO) sejteket. Rovar sejtek közé tartozik a Spodoptera frugiperda Sf9 sejtvonala [Luckow és munkatársai, Bio-technology 6, 4755 (1988)]. A találmány szerinti nukleinsav-szekvenciák eukarióta klónozási rendszerekbe való klónozására és expreszsziójára vonatkozó információk találhatók Esser K. és munkatársai (Plasmids of Eukaryotes, Springer-Verlag, 1986) kiadványában .
Hogy a CAV kódolta polipeptidből számottevő mennyiséget kapjunk, a CAV genomját vagy ennek fragmenseit egy ex15
pressziós rendszerben, mint amilyen a baculovírus expressziós rendszer (BVES), fejezhetjük ki. Ennél a rendszernél, rovar sejteket, mint amilyenek a Spodoptera frugiperda (Sf; IPLBSf21) sejtek, tartunk sejtkultúrában gazdasejtként a baculovírus, mint a Autographa californica nuclear polyhedrosis vírus (AcNPV) számára. Az AcNPV néhány génje magas szinten expresszálódik, de azok nem esszenciálisak a vírus fertőzési ciklusához. Ezek a gének válnak a homológ rekombináció célpontjaivá a transzfektált sejtekben a baculo-transzfer plazmid, mint a pAcAS3 és a vad típusú (wt) AcNPV DNS között. A pAcAS3-ban [J. Vlak és munkatársai, Virology 179, 312-320 (1990)] a nem esszenciális plO gén helyett heterológ géneket iktattunk be a plO promoter után, amelyet vad típusú, a rekombináns folyamat cépontját képező AcNPV szekvenciák vesznek körül. A rekombinánsok kiválogatásának megkönnyítésére a pAcAS3 a LacZ gént is tartalmazza, így ha X-Gal-t adunk a táptalajhoz, ez a rekombináns plakkok kék elszíneződését okozza.
Közelebbről, a fertőzött MSB1 sejtekből izolált CAV genom DNS emészthető Nrul-gyel. A 2,3 kb nagyságú molekula végéhez BamHI linkért kapcsoltunk, és ezután ezt BamHI-gyel emésztett, defoszforilezett pAcAS3 plazmiddal ligáltuk. Az új pAcCA3 konstrukcióval kompetens E, coli DH5-a sejteket transzformáltunk. Különálló kolóniákat szelektáltunk, teszteltünk, és 100 ml-es kultúrát indítottunk. CsCl-gardiens centrifugálással plazmid DNS-t izoláltunk és tisztítottunk, és a tisztított DNS-t 1 pg/ml koncentrációban, TE pufferben, 4 °C-on tároltuk. 100 μΐ vízben 10 pg pAcCA3 DNS-t összeke* · · · · ······· « • · ·· « · · »
- 16 vertünk, 2 Mg vad típusú AcNPV DNS-sel és 30 Mg Lipofectin reagenssel (BRL, Bethesda, Maryland, USA). Ehhez a keverékhez szérum-mentes tápfolyadékban, 5xl06 Sf21 sejtet adtunk 6 cm átmérőjű sejt-tenyésztő edénybe. 37 ’C-on 3 óráig tartó inkubálás után friss tápfolyadékot adtunk hozzá, és 37 °C-on folytattuk az inkubálást. A következő napon a sejteket a tápfolyadékhoz adott 1,5 %-os, alacsony olvadáspontú agarózzal rétegeztük felül, és 5 napig 37 °C-on inkubáltuk. Új, 200 pg/ml végkoncentrációban X-Gal-t tartalmazó agarózt rétegeztünk rá. A kék plakkokat három plakktisztítási ciklusnak vetettük alá, amíg rekombináns vírus törzstenyészeteket kaptunk.
A fertőzött sejteket, és tenyészetük felülúszóját Western biot módszerrel vizsgáltuk rekombináns CAV polipeptideket expresszáló, rekombináns baculovírusok jelenlétére. A legmagasabb mértékű rekombináns CAV polipeptid expressziót mutató és/vagy Western blotnál a legjobb felismerő képességgel rendelkező polipeptideket expresszáló plakkokat kiválasztottuk vakcina készítés céljára szoláló CAV polipeptidek előállítására.
Általában leginkább prokarióták használhatók a találmány szempontjából hasznos DNS szekvenciák klónozására szolgáló vektorok konstrukciójánál. Például különösen alkalmas az E.coli K12. Egyéb felhasználható mikróbák például az
E. coli DH5-a vagy JM101 törzsek.
A találmány szerinti nukleinsavakat, expreszió céljából mesterségesen expressziós kontroll szekvenciákhoz kötöttük. Ilyen kontroll szekvenciák promotereket, enhancer (erősítő) szekvenciákat, operátorokat, idukáló szekvenciákat, riboszóma kötőhelyeket stb-t tartalmazhatnak.
Amennyiben a gazdasejtek baktériumok, az alkalmazható expressziós kontroll szekvenciák például a Trp promoter és operátor [Goeddel, és munkatársai, Nucl. Acids. Rés. 8, 4057 (1980)]; a lac promoter és operátor [Chang, és munkatársai, Natúré 275. 615 (1978)]; a külső membrán protein promoter [Nakamura, K. és Inouge, Μ., EMBO J. JL, 771-775 (1982)]; a lambda bakteriofág promoterek és operátorok [Remaut E. és munkatársai, Nucl. Acids. Rés. 11. 4677-4688 (1983)]; az α-amiláz (B. subtilis) promoter és operátor, terminációs szekvencia és egyéb, a választott gazdasejttel kompatibilis, expressziót fokozó és kontroll szekvenciák. Ha a gazdasejt élesztő, az alkalmazható expressziós kontroll szekvenciák lehetnek például az alfa-szaporodási (mating) faktor. Rovar sejtek esetében a polihedrin vagy a baculovírusok plO promotere használható [Smith G.E. és munkatársai Mól. Cell. Bioi., 1, 2156-2165 (1983)]. Ha a gazdasejt emlős eredetű, az alakalmazható expressziós kontroll szekvenciák lehetnek például SV-40 promoter [Berman P.W. és munkatársai, Science, 222. 524-527 (1983)] vagy pl. metallothionein promoter [Brinster R.L., Natúré, 296. 39-42 (1982)] vagy egy hő-sokk promoter [Voellmy és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 4949-53 (1985)]. Alkalamazhatók azonban a CAVban jelenlevő expressziós kontroll szekvenciák, különösen az ORF 1-3 expresszióját szabályozók. A gén-expresszió maximalizálására lásd még Roberts és Lauer, Methods in Enzymology 68. 473 (1979) irodalmi helyet.
• « · «
- 18 A találmány kiterjed továbbá a CAV eredetű antigén immunológiai jellemzőit mutató polipeptidre is, vagyis a CAV eredetű antigén egy vagy több immunreaktív és/vagy antigén hatású determinánsát hordozó polipeptidre, amely alapvetően mentes az egész vírustól vagy más fehérjéktől, amelyekkel egyébként kapcsolt.
A találmány különösen olyan polipeptidekre vonatkozik, amelyek az ORF 1-nek, ORF 2-nek és ORF 3-nak legalább a 2-4. szekvenciákon bemutatott részét tartalmazzák.
Nyilvánvaló, hogy az említett aminosav-szekvenciákkal alapvetően azonos immunológiai sajátságokat mutató származékok, vagyis immunológiai ekvivalensek, szintén a találmány tárgyát képezik.
Emellett a találmány tárgykörébe tartozik az ORF 1-3 polipeptid fragmensét vagy ezek funkcionális megfelelőjét tartalmazó polipeptid, amely CAV fertőzés ellen baromfiak immunizálására vagy diagnosztikai célra felhasználható. Különböző módszerek léteznek ilyen alkalmazható polipeptid fragmensek detektálására, ismert aminosav szekvencián belül.
A találmány szerinti polipeptid megfelelő, immunkémiailag aktív epitopot (epitopokat) hordozó polipeptid fragmense kimutatására szolgáló módszert ismertet a WO 86/06487 számon közrebocsátott nemzetközi szabadalmi bejelentés, Geysen H.M. és munkatársai, [Proc. Natl. Acad. Sci. 81, 3998-4002 (1984)], Geysen H.M. és munkatársai, [J. Immunoi. Meth. 102. 259-274 (1987)], amely az ún. pepscan módszeren alapul, amelyben a vizsgálat tárgyát képező komplett polipeptid-szekvencia részleteinek megfelelő, részleges • ·
- 19 átfedéssel rendelkező polipeptidek sorozatát szintetizálják, és azok ellenanyagokkal szembeni reaktivitását vizsgálják.
Emellett elméleti meggondolások és a már ismert epitopokkal való szerkezeti egyezés alapján epitopoknak nevezhetjük a polipeptid számos, az említett aminosav-szekvenciával rendelkező szakaszát. Ezeknek a szakaszoknak a meghatározása a Hopp és Woods szerinti hidrofilitási kritérium [Proc. Natl. Acad. Sci., 78, 3824-3828 (1981)], valamint Chou és Fasman másodlagos szerkezetre vonatkozó megállapításainak [Advances in Enzymology 47, 45-148 (1987)] kombinációján alapul.
Az esetleg szükséges T-sejt epitopok elméleti alapon hasonló módon származtathatók Berzofsky amfifilitási kritériuma segítségével [Science, 235. 1059-62 (1987)].
A találmány egy másik megvalósítási módjában egy a fent említett nukleinsav-szekvencia által mehatározott aminosav-szekvenciával rendelkező polipeptidet használtunk.
Baromfiak CAV fertőzés elleni immunizálása elérhető például úgy, hogy az állatoknak a találmány szerinti polipeptid immunológiailag releváns készítményét, ún. alegység vakcina formájában adagoljuk. A találmány szerinti alegység vakcina tartalmazhat tiszta formában egy polipeptidet, esetleg egy farmakológiailag elfogadható vívőanyag jelenlétében. A polipeptidet esetleg kovalensen köthetjük egy idegen proteinhez, amely pl. előnyös lehet a fúziós termék tisztításánál. Ilyenek például a β-galaktozidáz, a protein A, a prokimozin, a véralvadási faktor Xa stb.
Néhány esetben ezen polipeptidek ellen kapott neut• ···
- 20 ralizációs ellenanyagok szintje alacsony lehet. A kisebb fragmenseket immunogenitásuk fokozása érdekében lehetőleg hordozó molekulákhoz kapcsoljuk. A célnak megfelelő hordozók makromolekulák, mint pl. természetes polimerek (fehérjék, mint a kürtőscsiga hemocianin, albumin, toxinok), szintetikus polimerek, mint a poliaminosavak (polilizin, polialanin) vagy amfifil vegyületekből, pl. szaponinokból képzett micellák. Ezek a fragmensek önmaguk polimerjeiként is előállíthatók, célszerűen mint lineáris polimerek.
Az ilyen alegység vakcinákban használatos polipeptidek ismert módon állíthatók elő, például CAV-ból való izolálással, rekombináns DNS technikával vagy vegyi szintézissel.
A találmány szerinti vakcina céljára hasznáható polipeptidek kívánt esetben in vitro vagy in vivő módosíthatók, pl. glikozilezéssel, amidálással vagy foszforilezéssel.
Az alegység vakcinák alternatívái az élő vektor vakcinák. A találmány szerinti nukleinsav-szekvenciát rekombináns DNS technikák segítségével egy mikroorganizmusba (pl. baktériumba vagy vírusba) juttatjuk oly módon, hogy a rekombináns mikroorganizmus szaporodásra, így a beültetett nukleinsav-szekvencia által kódolt polipeptid expresszálására képes legyen.
Például heterológ nukleinsav-szekvencia, pl. a találmány szerinti nukleinsav-szekvencia vektor mikroorganizmusba való bejuttatására használható az in vivő homológ rekombinációs technika.
Először a vektor-genom inszerciós régiójának megfelelő DNS szakaszt, vagyis amely a heterológ szekvencia be···· ·· ······, • · · · · · ···· ·· · *· ·· * · · ·
- 21 építésére felhasználható, a vektor olyan létfontosságú funkcióinak megszüntetése nélkül, amelyek a fertőzéshez vagy szaporodáshoz szükségesek, standard rekombináns DNS technikák szerint a klónozáshoz használt vektorba építjük be. Inszerciós régiókat számos mikroorganizmus esetén leírtak (pl. EP 80 806, EP 110 385, EP 83 286, EP 314 569, WO 88/02022 és WO 88/07088 számon közrebocsátott szabadalmi bejelentésekben) .
Másrészt az első lépésben nyert rekombináns DNS molekulában jelen levő inszerciós szekvencia kívánt esetben kiiktatható. Ez pl. az első lépésben kapott rekombináns DNS molekula megfelelő exonukleáz III emésztésével vagy restrikciós enzimes kezeléssel érhető el.
Harmadszor, a heterológ nukleinsav-szekvenciát az első lépésben kapott rekombináns DNS molekulában jelen levő inszerciós régióba vagy az említett rekombináns DNS molekulából kiiktatott DNS helyére építjük be. Az inszerciós régió DNS szakaszának elegendő hosszúságúnak kell lennie, hogy lehetővé tegye a vektor genommal való homológ rekombinációt.
Ezután megfelelő sejteket transzformálunk a vektor genomiális DNS-sel a rekombináns DNS molekula jelenlétében, amely tartalmazza a megfelelő vektor DNS szekvenciával határolt inszertet, miáltal a rekombináns DNS molekulában és a vektor genomban lévő régiók között a rekombináció létrejöhet. Ily módon rekombináns vektor utódok állíthatók elő sejtkultúrában és pl. genotípusos vagy fenotípusos jegyek alapján szelektálhatóak pl. hibridizációval, a heterológ nukleinsav-szekvenciával együtt beépült gén által kódolt ·· « • · ··«<··'· ··· · * «·«·«··· ·· ·· ·« « ·
- 22 enzim aktivitásának meghatározásával vagy immunológiai módszerrel detektálva a rekombináns vektor által expresszált antigén-szerkezetileg heterológ polipeptidet.
A következő lépésben ezek a rekombináns mikrooganizmusok immunizálás céljából beadhatók csirkéknek, ahol valameddig fennmaradnak vagy még szaporodnak is a beoltott állat szervezetében, in vivő expresszálva a találmány szerinti, inszertált nukleinsav-szekvencia által kódolt polipeptidet, a beoltott állat immunrendszerének stimulációját eredményezve. A találmány szerinti nukleinsav-szekvencia beépítésére alkalmas vektorok nyerhetők olyan vírusokból, mint a (madár) himlő vírusok pl. a vakcinia vírus vagy csirke himlő vírus (EP 314 569 és WO 88/02022 számon közrebocsátott szabadalmi bejelentések), herpesz vírusok, mint pl. a HVT (WO 88/07088 számon közrebocsátott szabadalmi bejelnetés), adenovírus vagy influenza vírus, vagy olyan baktériumokból, mint pl. az E. coli vagy bizonyos Salmonella fajok. Az iyen típusú rekombináns mikroorganizmusokkal a gazdasejtben szintetizált polipeptid, mint felületi antigén jelenik meg. Ebben az öszszefügésben az említett polipeptidnek OMP proteinekkel vagy pl. E. coli pilus proteinekkel vagy az organizmus által felismert szignál vagy horgony szekvenciákkal alkotott fúziói elfogadottak.
Lehetséges az is, hogy az immunválaszt kiváltó polipeptidet - kívánt esetben egy nagy egész részeként - az immunizálandó állatban szabadítjuk fel. Az említett esetekben az is lehetséges, hogy egy vagy több immunválaszt kiváltó olyan termék expresszálódjék, amely különböző patogének ····
4 4 «« · « %»· ..· ···· ··,’
- 23 és/vagy az adott patogén különböző antigénjei ellen vált ki immunválaszt.
A találmány szerinti vakcina úgy állítható elő, hogy a találmány szerinti nukleinsav-szekvenciát tartalmazó vektor vírussal fertőzött gazdasejtet tenyésztünk, majd a vírust tartalmazó sejtek és/vagy a sejtekben szaporodott vektor vírusok - lehetőség szerint tiszta formában - összegyűjthetők, és vakcinává alakíthatók, célszerűen liofilizált formában.
A találmány szerinti nukleinsav-szekvenciát tartalmazó, fent említett gazdasejtek tenyészthetők olyan körülmények között is, amelyek az említett nukleinsav-szekvencia által kódolt polipeptid expressziója szempontjából kedvezőek. Vakcinák előállíthatók a nyers tenyészetből, a gazdasejt lizátumából vagy a gazdasejt kivonatából, egy másik megvalósítási mód szerint a találmány szerinti tisztább polipeptidet állítunk elő vakcina céljára, a felhasználásnak megfelelően. Az előállított polipeptidek tisztítása céljából a találmány szerinti nukleinsav-szekvenciát tartalmazó gazdasejteket megfelelő térfogatban tenyésztjük, és a polipeptideket a sejtekből vagy a tápfolyadékból izoláljuk, ha azok oda kiválasztódnak.
A tápfolyadékba kiválasztott polipeptidek ismert módszerek szerint izolálhatók és tisztíthatók, így például kisózással, centrifugálással, ultraszűréssel, kromatográfiával, gélszűréssel, immun-affinitás kromatográfiával, míg az intracelluláris polipeptidek izolálása esetén először a sejteket összegyűjtjük, roncsoljuk pl. ultrahanggal vagy más • · · ·
-24mechanikai beavatkozással, amilyen a French sajtó, ezt követően elválasztjuk a polipeptideket az egyéb intracelluláris alkotórészektől, és a polipeptidet vakcinává alakítjuk. A sejtek roncsolása megoldható kémiai úton (pl. EDTA kezeléssel) vagy enzimátikusan, mint a lizozimmal való emésztés.
Amint azt korábban említettük, a vírusok legyengítése klasszikus módjának van néhány hátránya. Rutinszerűen, ez úgy történik, hogy specifikus mutációkat indukálnak vegyi anyagokkal való kezeléssel vagy heterológ gazdaállatban, illetve szövettenyészeten való sorozatos passzálással. Ezen technikák kritikus pontja a vírus genomban ezúton létrejövő mutációk random volta, mivel nehéz azokat lokalizálni vagy spontán revertánsok létrejötte esetén azokat megismételni. A rekombináns DNS technológia fejlődésével a vírus genom nagyon precíz manipulálásának lehetősége adott. Ahogy azt Murphy és munkatársai áttekintik [Immunization against viruses, Fields B. N. és munkatársai (szerk.) Virology 2. kiadás, Raven Press, N.Y. (1990)] számos módja létezik egy vírus legyengítésének genomja mutációja útján, pl. deléciókkal, inszerciókkal vagy szubsztitúciókkal egy nem létfontosságú génben vagy annak egy részletében vagy inszerciókkal, szubsztitúciókkal vagy deléciókkal a regulációs régiókban, stb.
Az alábbiakban egy példáját ismertetjük annak, hogyan állítottunk elő egy, a természetben elő nem forduló, legyengített CAV mutánst a rekombináns DNS technika alkalmazásával.
Először meghatározzuk a CAV genom azon régióit, ahol • · • ·
- 25 a mutációk elhelyezkedhetnek. Ezek lehetnek mind kódoló, mind nem kódoló régiókban, pl. regulációs régióban, vagy a vírus adhéziós proteint (vagy egy részét) kódoló régiójában vagy a gazda-specificitást meghatározó régiójában.
Ezután, a mutációkat, pl. deléciókat és/vagy inszerciókat és/vagy szubsztitúciókat a fent említett módszerek szerint juttathatjuk a vírus genomba rekombináns vektor előállítása céljából.
így a természetben elő nem forduló, genomjába rekombináns DNS technikával bejuttatott mutációt hordozó, legyengített CAV szintén a találmány tárgyát képezi.
A találmány szerinti polipeptid ellen termelt ellenanyagok vagy antiszérum potenciálisan felhasználhatók a passzív immunterápiában, diagnosztikai immunpróbákban és anti-idiotípus ellenanyagok előállításában.
Az említett ORF 1-3 CAV eredetű polipeptidek felhasználhatók mind monospecifikus poliklonális, mind monoklonális ellenanyagok előállítására. Ha poliklonális ellenanyag kívánatos, poliklonális szérumok előállításának és kezelésének technikái a gyakorlatból ismertek (pl. Mayer és Walter szerk., Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology, Academic Press, London, 1987). Röviden összefoglalva ezt úgy végezzük, hogy egy kiválasztott emlősnek, pl. nyúlnak a fent említett immunogének egyikét, immunizálásonként mintegy 20-80 Mg proteint adunk (többször ismételve). Az immunizálást elfogadható adjuvánssal végezzük, általában azonos térfogatú immunogén és adjuváns keverékével oltunk. Elfogadható adjuvánsok közé tartoznak a komplett Freund, az
inkomplett Freund, az alum-precipitátum vagy víz-az-olajban emulziók, míg a kezdő immunizáláshoz a komplett Freund adjuváns ajánlott. Az emlékeztető oltásokhoz az inkomplett Freund adjuváns célszerű. A kezdeti immunizálás kb. 1 ml emulziónak, több részletben a hát bőre alá való beadásából áll. Az emlékeztető immunizálásokat azonos mennyiségű immunogén felhasználásával havonta adjuk, és azokat mindaddig folytatjuk, amíg az egyes nyulak szérumában megfelelő ellenanyag-szint meg nem jelenik. Azután ismert módon vért veszünk, és abból szérumot nyerünk.
Az egyes immunogének elleni monospecifikus ellenanyagokat olyan polispecifikus antiszérumból készítjük affinitás tisztítással Hall és munkatársai [Natúré 311, 379-387 (1984)] módosított módszere szerint, amelyet nyulak tisztított fehérjékkel a fentiek szerinti immunizásával nyertünk. Monospecifikus ellenanyagon egyetlen ellenanyag-féleséget vagy a szóban forgó antigénre nézve homogén kötő sajátságokkal rendelkező több ellenanyag-féleséget értünk. A homogén kötődés az ellenanyag-féleség specifikus antigénhez vagy epitophoz való kötődési képességére utal.
Az egyes CAV immunogénekkel szembeni reaktív monoklonális ellenanyagok beltenyésztett egereknek, előnyösen Balb/c egereknek az adott proteinnel való immunizálásával állíthatók elő. Az egereket 0,5 ml, az immunogénnek kb. 100 ng-tól 10 Mg-ig terjedő dózisával immunizáljuk, a megfelelő adjuváns egyenlő mennyiségével együtt intraperitoneálisan. Ilyen alkalmas adjuvánsok a komplett Freund, inkomplett Freund, alum-precipitátum és víz-az-olajban típusú emulziók.
- 27 Az egereket intravénás emlékeztető immunizálásban részesítjük, az első immunizálás után kb. a 14., 21. és a 63. napokon, azonos mennyiségű, adjuvást nem tartalmazó immunogénnel. Az utolsó emlékeztető oltás után kb. a harmadik napon az egyes egereket szerológiai módszerekkel teszteljük anti-immunogén ellenanyagok jelenlétére nézve. Az ellenanyag-termelő egerekből lépsejteket izolálunk, és ezeket ismert módon olyan egér mielóma sejtekkel fuzionáltatjuk, mint az SP-2/0 vagy hasonló [Köhler és Milstein, Natúré 256. 495-497, 1975)). Hibridóma sejteket szelektálunk hipoxantint, timidint és aminopterint tartalmazó, olyan megfelelő sejttenyésztő folyadékban, mint a Dulbecco szerinti módosított Eagle médiumban (DMEM) való növekedés alapján. Az ellenanyagot termelő hibridómákat klónozzuk, legáltalánosabban MacPherson lágy agar technikája felhasználásával (Soft Agár Techniques, Tissue Culture Methods and Applications, szerk. Kruse és Peterson, Academic Press, 276, 1973). Különálló kolóniákat tenyésztő lemez külön lyukaiba viszünk át, megfelelő tenyésztő folyadékban való szaporítás céljából. Az ellenanyag-termelő sejteket a megfelelő immunogénnel való szűréssel azonosítjuk. Az immunogén pozitív hibridóma sejteket ismert módon tartjuk fenn. Specifikus monoklonális ellenanyagokat a hibridómák in vitro tenyésztésével vagy ismert módon a hibridómák egerekbe való beadásával és hasűri folyadék termelésével állítunk elő.
Anti-idiotípus ellenanyagok azok az immunglobulinok, amelyek a patogén azon antigénjének egy belső tükörképét hordozzák, amely ellen védelmet kívánunk létrehozni, és vak- 28 cinában immunogénként felhasználhatók [Dreesman és munkatársai, J. Infect. Disease 151, 761 (1985)]. Anti-idiotípus ellenanyagok létrehozására szolgáló módszerek a gyakorlatból ismertek [MacNamara és munkatársai, Science, 226, 1325 (1984)].
A találmány szerinti vakcina a szokásos aktív immunizációs séma szerint adható be: az adagolási formulával összeegyeztethető módon, egyszeri vagy többszöri beadással és olyan mennyiségben, hogy az profilaktikusan és/vagy terápiásán hatásos és immunogén legyen. A vakcina beadható pl. intradermálisan, szubkután, intramuszkulárisan, intraperitoneálisan, intravénásán vagy intranazálisan.
A vakcina továbbá tartalmazhat egy vizes közeget vagy vizet tartalmazó szuszpenziót, gyakran egyéb összetevőkkel keverve, pl. a hatás növelése vagy a lejárati idő növelése érdekében. Ezek az összetevők lehetnek sók, pH pufferek, stabilizátorok (mint sovány tej vagy kazein hidrolizátum), az immunválaszt fokozó emulgeáló adjuvánsok (olajok, muramil-dipeptid, alumínium-hidroxid, szaponin, polianionok és amfipátiás anyagok) és konzeválószerek.
Természetesen a találmány szerinti vakcina tartalmazhat más, a baromfiak egyéb kórokozóira jellemző immmunogéneket vagy azokat kódoló nukleinsav-szekvenciákat, mint pl. a fertőző bronchitis vírusa, a baromfipestis vírusa, a fertőző burza betegség vírusa vagy a Marék féle betegség vírusa, multivalens vakcina előállítás céljából.
A találmány kiterjed egy immunkémiai reagens-re is, amely reagens a találmány szerinti polipeptidek legalább • · · ·
- 29 egyikét vagy ezeknek egy ellenanyag választ kiváltó fragmensét tartalmazza.
Az immunkémiai reagens fogalma azt jelöli, hogy a találmány szerinti polipeptidek megfelelő hordozóhoz vannak kötve vagy egy jelölő anyaggal vannak ellátva.
A felhasznált hordozók lehetnek pl. mikrokémcső vagy küvetta belső fala, cső vagy kapilláris, membrán, szűrő, tesztcsík vagy egy részecske felszíne, mint pl. latex részecske, vörös vérsejt, festékszemcse, fémszemcse vagy fémvegyületek mint részecskék.
A felhasználható jelölő anyag lehet többek között radioaktív izotóp, fluoreszkáló anyag, enzim, festékszemcse, fémszemcse vagy fémvegyület mint részecske.
A találmány szerinti nukleinsav-szekvencia specifikus próbák tervezésére is felhasználható, hibridizációs kísérletek céljára, CAV eredetű nukleinsavak kimutatására bármilyen szövetből.
A találmány tárgykörébe egy az említett nukleinsav-szekevenciát tartalmazó, a CAV fertőzés diagnózisára felhasználható teszt kit/készlet is beletartozik.
A találmány egy immunvizsgálatban felhasználható teszt készletere is vonatkozik, amely legalább egy a találmány szerinti immunkémiai reagenst tartalmaz.
A teszt készlet felhasználásakor lezajló immunkémiai reakció célszerűen szendvics reakció, agglutinációs reakció, kompetíciós reakció vagy inhibíciós reakció.
Szendvics reakció kivitelezése esetén a teszt készlet tartalmazhat pl. szilárd hordozóhoz, pl. mikrokémcső belső falához kötött találmány szerinti polipeptidet, valamint vagy a találmány szerinti jelölt polipeptidet, vagy jelölt második ellenanyagot.
A mellékelt 1. ábra a pCAl és pCA3 plazmidok restrikciós endonukleáz enzim mintáját mutatja be.
A. A pCAl plazmidot Hindin emésztéssel linearizált molekulaként tüntettük fel.
B. A pCA3 plazmidot BamHI emésztéssel linearizált formaként tüntettük fel.
A 2. ábrán a satírozott részek a 26P4 CAV törzs RF DNS DNS-szekvenciáján található nyitott leolvasási kereteket (ORF) mutatják. Az ORF-ket felülről lefelé ORFl-nek, 0RF2nek és ORF3-nak számoztuk. A CAV RF DNS-t Dral emésztéssel linearizált molekulaként tüntettük fel.
A 3. ábra a HVT genom Us régiójának alapvetően megfelelő DNS fragmens restrikciós enzim térképe. A négy nyitott leolvasási keretből és a köztük lévő nem kódoló szekvenciákból álló inszerciós régió relatív pozícióját jelöltük.
A 4. ábra a pVECO4 restrikciós térképe, amely a pMDO7
1,2 kb Xhol HVT fragmense egyedi BglII helyére beiktatott LTR promotert mutatja.
A találmány szerinti megoldást a következő példákkal szemléltetjük a korlátozás szándéka nélkül.
1. példa
A 26P4 CAV törzs eredete
Az Intervet America cégnél (Millsboro, DÉL, USA) 8
··· ·· ·
- 31 hetes jelző SPF csirkéket (melyek szeronegatívak voltak CAV-ra nézve), együtt tartottunk CAV fertőzésre nézve szerokonverzió jeleit mutató madarakkal. Két hét múlva ezeknek a jelző madaraknak a májából 20 térf%-os homogénizátumot készítettünk RMPI médiumban, és ezt 0,2 Mm-es szűrőn átszűrtük. Ezt a szűrletet szövettenyésztő palackokban MDCC-MSB1 sejtekkel inkubáltuk [Akiyama és munkatársai, Biken J. 17, 105-117 (1974)], melyek megfelelő gazdasejtek a CAV számára [Goryo és munkatársai, Avian pathology 16, 149-163 (1987)]. Az izolátumok egyikét a CPE és az USDA által szolgáltatott pozitív anti-CAV-szérummal adott pozitív immunfluoreszcencia alapján CAV-ként azonosítottuk.
A 26P4 tenyésztése
A 26P4 vírus tenyésztését ismert módon MDCC-MSB1 sejtekben, szövettenyésztő palackokban végeztük (Goryo és munkatársai, id. h.).
A vírus genom klónozása
A 26P4 CAV törzs vírus DNS-e replikátív formájának (RF) izolálására 500 ml MSB1 sejttenyészetet készítettünk, amely 106 sejt/ml töménységű volt, és ezt kb. 106 TCIDso/ml titerű vírussal fertőztük. Standard Hirt extrakcióval vírus DNS-t tisztítottunk [McMaster és munkatársai J. Virol 38. 317-326, (1981)]. Úgy találtuk, hogy a fertőzés utáni 30. órában kapható a maximáis mennyiségű RF vírus DNS.
A fertőzött sejtekből nyert DNS-t 0,8 %-os agaróz/etidium-bromid gélen analizáltuk, és az agaróz gélből a • «· ·
- 32 cirkuláris vírus RF DNS-t reprezentáló 1,7 kb nagyságú csíkot standard módszerek szerint (Maniatis és munkatársai, 1989, id. h.) NA45 DEAE membrán (Schleicher és Schull) felhasználásával izoláltuk.
500 ng vírus DNS-t 20 egység Hindin vagy BamHI restrikciós endonukleázzal emésztettünk 25 μΐ térfogatban.
μg bakteriális pGEM 7zf+ plazmid DNS-t (Promega Corp.) szintén vagy HindlII-mal vagy BamHI-gyel emésztettünk, defoszforileztünk, és proteináz K-val inkubáltunk (Maniatis és munkatársai, 1989, id. h.). A vektor és az inszert DNS készítményeket fenol/kloroform keverékével extraháltuk, és kétszeres térfogatú 96 %-os alkohollal, valamint 1/10 térfogatú 3 mol/l-es nátrium-acetáttal (pH=6,0) kicsaptunk. A vektor és inszert DNS-t standard eljárások szerint T4 DNS ligázzal ligáltuk (Maniatis és munkatársai, 1989, id. h.). A ligációs keveréket használtuk fel kompetens DH5-a (Clontech Corp.) sejtek transzformálására, melyeket ezután 100 Mg/ml ampicillint (Ap) tartalmazó LB agar lemezekre oltottunk. Az Ap rezisztens kolóniákból plazmid DNS-t izoláltunk, és ezeket restrikciós enzimes analízissel 2,3 kb nagyságú inszert jelenlétére vizsgáltuk.
Két plazmidot azonosítottunk: a pCAl-t, amely tartalmazta a HindlII-mal emészett 2,3 kb CAV RF DNS inszertet, és a pCA3-t, amely a pCAl-hez képest fordított pozícióban tartalmazta a BamHI-gyel emésztett CAV RF DNS inszertet. Mindkét plazmidot - restrikciós mintájuk megadásával - az 1. ábra ismerteti.
4*«i <· · * * * -· · 9 ···· ·« * ·· ·· · «
2. példa
DNS-szekvencia analízis
A CAV genom DNS-szekvenciájának Heikoff szerint [Gene 28, 351, (1984)] végzett meghatározására fokozatosan deletált fragmenseket állítottunk elő: 5 μg pCAl és pCA3 DNS-t Sphl, majd Clal restrikciós endonukleázokkal inkubáltunk. Proteináz K-val való inkubálás, fenol/koroformos kezelés és alkoholos kicsapás után a mintákat növekvő idő-intervallumokig Exonukleáz III-mal inkubáltuk. A DNS fragmenseket SÍ nukleázzal és Klenow polimerázzal tompa végűvé, és végül T4 DNS ligázzal körkörössé alakítottuk, kompetens E. coli DH5-űt sejtekbe transz formáltuk, és ampicillin lemezekre oltottuk. A rezisztens telepekből nyert plazmid DNS-t analizáltuk az inszertek méretére nézve.
DNS-szekvencia analízist végeztünk, amint azt Sanger és munkatársai publikálták [Proc. Natl. Acad. Sci.USA, 74. 5463, (1977)], didezoxi-lánc-terminációs technikával, direkt dupla szálú plazmid DNS minipreparátumokon. A pGEM 7zf+ plazmidon, a többszörös klónozási helytől fel- és lefelé direkt hibridizáló T7 és Sp6 promoter primereket használtunk.
A szekvenciára vonatkozó adatokat összegyűjtöttük, összeállítottuk, és Gene Master program használatával (BioRad Corp.) IBM PC-n analizáltuk.
3. példa
ORF 1-t tartalmazó CAV DNS beiktatása pulyka herpesz vírus (HVT) qenomiába
CAV RF DNS-t izoláltunk az 1. példa szerinti módon. Inszercióra és a HVT-ben hatásos expresszióra alkalmas ORF előállítására az első AGT kodont megelőző szekvenciákat legalább a vezető szekvenciáig le kellett vágni. Ezért 2 pg CAV RF DNS-t emésztettünk Apai és Mrol restrikciós enzimekkel. Az emésztéssel lineáris CAV RF DNS molekulát kaptunk, ahol az ORF-1 középen helyezkedik el, és az ORF-l első ATG kodonja az Mrol hely felőli oldalon van. Inaktiválás, fenolos extrakció és alkoholos kicsapás után a fragmenseket növekvő idő-intervallumokig exonukleáz III-mal inkubáltuk, és tompa végűvé tettük, amint azt a 2. példában ismertettük. Mivel az exonukleáz nem tudja leemészteni az olyan túlnyúló 3'-végeket, mint amilyen az Apal-nél jelentkezik, ez az enzim az RF DNS fragmenst az Mrol hely felől fogja emészteni, az ORF-1 első ATG kodonja irányába. A tompa végűvé alakított fragmenseket ismert módon T4 ligázzal, 50-szeres moláris feleslegben levő foszforilezett EcoRV linkerrel (B. Mannheim Corp.) ligáltuk. A linker-ligációs keveréket EcoRV-tel emésztettük, és 65 C°-on, 10 percig tartó kezeléssel inaktiváltuk. Ezt a keveréket ligáltuk 500 ng EcoRV-tel emésztett, defoszforilezett pGEM5 zf+ vektorral (Promega Corp.). A ligációs keveréket kompetens E. coli DH5-a sejtekbe transzformáltűk, és Amp lemezekra oltottuk. A rezisztens kolóniákból nyert DNS minipreparátumokat Apai-gyei és Spel-gyel való dupla emésztés• ·
- 35 sel analizáltuk a megmaradt plazmid inszert méretére nézve. Restrikciós analízissel tanulmányoztuk a kb. 1,9 kb nagyságú inszertek orientációját, és azokat Sanger szerinti szekvenálással vizsgáltuk, Sp6 vagy T7 primerrel.
Ezúton állítottuk elő a pCA4 plazmidot, amely egy 1,9 kb CAV inszertet tartalmaz, amely az 1. szekvencián bemutatott 860-2298 nukleotid-szekvenciából áll, és folytatódik az 1-475 nukleotid sorrenddel, az inszert EcoRV linkerhez van ligáivá és EcoRV-tel emésztett pGEM5zf+-ba inszertálva. Különösen az inszert első ATG-jét megelőző, rövid szekvenciáról derült ki, hogy az a Sanger szekvenálás szerint nem tartalmaz további ATG kodont.
Igarashi T. és munkatársainak (Virology 157. 351 (1987)] a HVT genom felépítésére vonatkozó közleményére alapozva, a vírus különösen rövid (Us) régióját választottuk ki az idegen gének inszerciójára. A megfelelő DNS szakaszt egy lambda-EMBL3 génbankból válogattuk ki, amelyet HVT-vel fertőzött CEF-ből nyert teljes DNS részleges emésztésével készítettünk. A lambda izolátumok egyikének inszertjét, amelyet a BamHI restrikciós hely teljes hiánya jellemzett, lambdaHVT04-nak neveztük, és fizikai térképezéssel részleteiben elemeztünk (3. ábra). A 17,5 kb nagyságú inszertált fragmens az Us régió nagyobb részét reprezentálja, beleértve a fordított ismétlődő szekvencia (inverted repeat) struktúrát is (Igarashi T. és munkatársai, 1987, id. h.). A lambdaHVT04 egy 1,4 kb nagyságú Xhol restrikciós fragmensét Sall-gyel emésztett pGEM3z-be szubklónoztuk, így kaptuk a pMDO7 plazmidot, amely egyetlen, DNS fragmens inszerciójára • · · · * · · ·· • · · Λ · · ··»···· ·« · · ·· · «
- 36 alkalmas BglII helyet tartalmaz.
Egy erős promotert választottunk Rous szarkóma vírus (RSV) LTR szekvenciájából, amely idegen gének expreszszióját a HVT vírus genomba való inszerciójuk után képes irányítani. A promotert pRSVcat-ból [Gorman és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci. 29, 6777 (1982)] egy 580 bp méretű Ndel/HindlII restrikciós fragmensen lokalizáltuk, és a fragmens mindkét végén duplaszálú szintetikus linkereket alkalmazva, pGEM3z-be (Prómega), a Hindin és a PstI helyek közé iktattuk be. A pGEM3z vektor HindlII helye és az LTR promo tert hordozó RSV fargmens Ndel helye közti kapcsolatot egy bp hosszúságú, egyik végén HindlII-mal, a másik végén
Ndel-vel kompatibilis ragadós végeket tartalmazó linkerrel létesítettük. Azonban, a ligáció után a hat bázispárból álló restrikciós felismerő szekvencia külső nukleotidjai szándékos módosításának köszönhetően, egyik restrikciós hely sem őrződött meg. Továbbá, ezen két hely eltávolítása mellett, magában a linkerben meglevő új restrikciós helyet (BamHI) hoztunk létre a megfelelő pozícióban. Egy második, 20 bp hosszúságú linkért szintetizáltunk, amely az LTR fragmens HindlII helyét, a pGem3z PstI helyével kötötte össze, ebben az esetben anélkül, hogy bármelyik végen megszűntette volna a restrikciós helyeket, és a pGem3z polilinker régióján már jelenlevőkhöz, pl. PstI, Sáli, Xhol és BamHI, még három, könnyen felhasználható, egyedi restrikciós helyet, BglII, Xhol és EcoRV, adtunk. A pGEM3z ezúton nyert pVECOl-nek nevezett származéka, 650 bp hosszúságú restrikciós fragmenst tartalmazott, amely az LTR promoter szekvenciát és közvetle37 nül ezután idegen gének inszerciójára alkalmas, hét restrikciós helyet hordozott.
A 650 bp hosszúságú fragmenst mindkét végén BamHI restrikciós helyek határolták, ezt a pMDO7-ből nyert 1,2 kb hosszúságú HVT inszert egyedi BglII helyére vittük át. Az e két restrikciós enzim által létrehozott kohezív végek kompatibilisek, de a ligáció után egyik eredeti, a BglII-ből vagy a BamHI-ből származó restrikciós szekvencia sem marad meg. A kapott konstrukciók egyikét, amely az LTR-t a TR-ek felé eső orientációban hordozta, pVECO4-nek neveztük, és restrikciós térképezéssel ellenőriztük (4. ábra). Ennek az univerzális HVT rekombinációs vektornak a szerkezete lehetővé teszi idegen géneknek közvetlenül az LTR promotertől lefelé való inszercióját, és ezután a komplett expressziós kazettának in vivő rekombináció útján a HVT genomba való inszercióját. Az LTR-től lefelé eső különböző restrikciós helyek elhelyezkedését, különösen azokat, amelyek BglII, Xhol és EcoRV enzimek számára szolgálnak, oly módon terveztük meg, hogy még többszörös gén inszerció is elképzelhető legyen.
A CAV DNS inszertet a pCA4-ből EcoRV emésztéssel eltávolítottuk, és EcoRV-tel emésztett, defoszforilezett pVECO4-be inszertáltuk. Az inszertált fargmens orientációját még egyszer ellenőriztük, és a helyes orientációval rendelkező plazmidot pCA5-nek neveztük.
A pCA5 plazmidból nyert, linearizált DNS-t, HVT-vel fertőzött sejtekből preparált teljes DNS-sel együtt a Graham
F. és v.d. Eb A. szerinti kalcium-foszfátos DNS-kicsapási • *
- 38 módszer felhasználásával [Virology 52, 456 (1973)] CEF-be juttattuk. A konstrukcióból nyert 2 mikrogram plazmid DNS-t összekevertünk 15 pg HVT-vel fertőzött sejtekből nyert linearizált DNS-sel vízben 560 μΐ végtérfogatban, és ehhez 750 pl HBSP-t adtunk (20 mmol/1 KC1, 560 mmol/1 NaCl, 24 mmol/1 glükóz, 3 mmol/1 Na2HPO4, 100 mmol/1 HEPES, pH=7,0). A csapadékot 190 pl 1 mol/l-es CaCl2 oldat fokozatos hozzáadásával, és a keverék 30 percig, szobahőmérsékleten való inkubálásával kaptuk.
Eközben 10 napos embrióból nyert másodlagos CEF 6/B8 tápfolyadékkal (Glasgow szerint módosított, 2 % borjú szérummal kiegészített Eagle-féle minimál esszenciális tápközeg) készült 15 ml szuszpenziót 10 cm átmérőjű Petri-csészékbe helyeztük 5xl05/ml sűrűségben. A kalcium-foszfáttal kicsapott DNS-t óvatosan a sejtszuszpenzióhoz adtuk, és a Petri-csészéket 37 C’-on inkubáltuk 5 % CO2-t tartalmazó nedves légtérben. Öt óra elteltével a tápfolyadékot etávolítottuk, és 10 ml, azonos térfogatú HBSP-t és 30 % glicerint tartalmazó oldatot rétegeztünk a sejtekre. Egytől két percig tartó inkubálást követően az oldatot eltávolítottuk, a sejteket 6/B8 tápfolyadékkal mostuk, és a sejteket friss tápfolyadékban 3-tól 5 napig inkubáltuk, amíg a vírusra jellemző CPE ki nem fejlődött. A CAV eredetű polipeptideket expreszszáló HVT rekombinánsokat immunfluoreszcens festéssel detektáltuk CAV antigénre specifikus mono- vagy polivalens szérumokkal.
Claims (20)
1. CAV eredetű polipeptidet kódoló nukleinsav-szekvencia.
2. Az 1. igénypont szerinti nukleinsav-szekvencia, azzal jellemezve, hogy egy az alábbi csoportba tartozó polipeptidnek vagy funkcionális megfelelőinek legalább egy részét kódolja:
a) ORF-1, melynek aminosav-szekvenciáját a 2. szekvencia mutatja,
b) ORF-2, melynek aminosav-szekvenciáját a 3. szekvencia mutatja,
c) ORF-3, melynek aminosav-szekvenciáját a 4. szekvencia mutatja.
3. A CAV genom legalább egy részét tartalmazó nukleinsav-szekvencia .
4. A 3. igénypont szerinti nukleinsav-szekvencia, azzal jellemezve, hogy az 1. szekvencián bemutatott dezoxi-ribonukleinsav-szekvenciának legalább egy részét tartalmazza.
5. A 4. igénypont szerinti nukleinsav szekvencia, azzal jellemezve, hogy az 1. szekvencián bemutatott DNS-szekvenciának legalább a 876-2225, 101-502 vagy 403-1053 pozícióban található részét tartalmazza.
6. Egy rekombináns nukleinsav molekula, mely magában foglalja az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti nukleinsav-szekvenciát.
7. A 6. igénypont szerinti rekombináns nukleinsav molekula, azzal jellemezve, hogy egy expressziós kontroll szekvenciához működőképesen van kapcsolva.
8. Egy vektor vírus, amely az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti nukleinsav-szekvenciát tartalmazza.
9. Az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti nukleinsav-szekvenciával, illetve a 6. vagy 7. igénypont szerinti rekombináns nukleinsav molekulával transzformált vagy a 8. igénypont szerinti vektor vírust tartalmazó gazdasejt.
10. Egy a CAV eredetű antigén immunológiai jellemzőivel bíró polipeptid.
11. A 10. igénypont szerinti polipeptid, azzal jellemezve, hogy az alábbi csoportba tartozó aminosav-szekvenciák legalább egy részét vagy funkcionális megfelelőjüket tartalmazza:
a) ORF-1, melynek aminosav-szekvenciáját a 2. szekvencia mutatja,
b) ORF-2, melynek aminosav-szekvenciáját a 3. szekvencia mutatja,
c) ORF-3, melynek aminosav-szekvenciáját a 4. szekvencia mutatja.
12. Egy az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti nukleinsav-szekvencia által kódolt CAV eredetű polipeptid.
13. A 10-12. igénypontok bármelyike szerinti polipeptiddel immunreaktív ellenanyag vagy antiszérum.
14. Egy a természetben elő nem forduló attenuált CAV, azzal jellemezve, hogy a CAV genomba rekombináns DNS technikával bevitt mutáció eredménye.
15. Baromfiak CAV fertőzése ellen védő vakcina, az• ·
- 41 zal jelemezve, hogy egy a 7. igénypont szerinti rekombináns nukleinsav molekulát, egy a 8. igénypont szerinti vektor vírust, egy a 9. igénypont szerinti gazdasejtet, egy a 10-12. igénypontok bármelyike szerinti polipeptidet vagy egy a 14. igénypont szerinti CAV-ot tartalmaz.
16. Eljárás CAV vakcina előálítására, azzal jellemezve, hogy egy a 9. igénypont szerinti gazdasejtet tenyésztünk, a CAV-ot tartalmazó anyagot összegyűjtjük, és immunizáló aktivitással bíró gyógyászati készítménnyé alakítjuk.
17. Eljárás CAV vakcina előállítására, azzal jellemezve, hogy a 10-12. igénypontok bármelyike szerinti polipeptidet immunizáló aktivitással rendelkező gyógyászati készítménnyé alakítjuk.
18. Eljárás baromfiak CAV fertőzés ellen védő kezelésére, azzal jellemezve, hogy a 15. igénypont szerinti vakcina hatásos mennyiségét adagoljuk az állatoknak.
19. Egy a 10-12. igénypontok bármelyike szerinti polipeptidet tartalmazó immunkémiai reagens.
20. Egy a 19. igénypont szerinti immunkémiai reagenst tartalmazó, immunvizsgálat kivitelezésére alkalmas készlet.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US60588190A | 1990-10-31 | 1990-10-31 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HU913433D0 HU913433D0 (en) | 1992-01-28 |
| HUT62325A true HUT62325A (en) | 1993-04-28 |
Family
ID=24425583
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU913433A HUT62325A (en) | 1990-10-31 | 1991-10-31 | Chicken anaemia virus vaccine and diagnostic |
Country Status (10)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5554525A (hu) |
| EP (1) | EP0483911A3 (hu) |
| JP (1) | JPH0586088A (hu) |
| KR (1) | KR100204438B1 (hu) |
| CN (1) | CN1041326C (hu) |
| AU (1) | AU8688891A (hu) |
| CA (1) | CA2054542A1 (hu) |
| HU (1) | HUT62325A (hu) |
| MX (1) | MX9101810A (hu) |
| ZA (1) | ZA918426B (hu) |
Families Citing this family (23)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6071520A (en) * | 1990-09-12 | 2000-06-06 | Leadd Bv | Chicken anemia virus mutants and vaccines and uses based on the viral proteins VP1, VP2 and VP3 or sequences of that virus coding therefor |
| NL9002008A (nl) * | 1990-09-12 | 1992-04-01 | Stichting Centr Diergeneeskund | Recombinant dna en rna en daarvan afgeleide produkten. |
| US6162461A (en) * | 1990-09-12 | 2000-12-19 | Leadd B.V. | Chicken anemia virus mutants and vaccines and uses based on the viral proteins VP1, VP2 and VP3 or sequences of that virus coding therefor |
| US20080234466A1 (en) * | 1990-09-12 | 2008-09-25 | Noteborn Mathieu H M | Delivery method for the tumor-specific apoptosis-inducing activity of apoptin |
| US6217870B1 (en) | 1990-09-12 | 2001-04-17 | Leadd, Bv | Chicken anemia virus mutants and vaccines and uses based on the viral proteins VP1 VP2 and VP3 or sequences of that virus coding therefor |
| NL9301272A (nl) * | 1993-07-20 | 1995-02-16 | Aesculaap Bv | Chicken Anemia Virus mutanten en vaccins en toepassingen gebaseerd op de virale eiwitten VP1, VP2 en VP3 of daarvoor coderende sequenties van dat virus. |
| US20030138443A1 (en) * | 1993-03-08 | 2003-07-24 | Noteborn Mathews H.M. | Cloning of chicken anemia virus DNA |
| US5981502A (en) * | 1990-09-12 | 1999-11-09 | Leadd B.V. | Methods and compositions for inducing apoptosis in tumor cells |
| US5789567A (en) * | 1994-07-06 | 1998-08-04 | Cornell Research Foundation, Inc. | Chicken infectious anemia virus vaccine |
| GB9414888D0 (en) * | 1994-07-23 | 1994-09-14 | Univ Belfast | Method and composition |
| ES2167536T3 (es) | 1995-01-06 | 2002-05-16 | Akzo Nobel Nv | Vacuna dirigida contra el agente de la anemia infecciosa en pollos de engorde. |
| WO1996040931A1 (en) * | 1995-06-07 | 1996-12-19 | Aesculaap B.V. | Neutralizing conformational epitopes of chicken anemia virus |
| WO1997018329A1 (en) * | 1995-11-14 | 1997-05-22 | Ragland William L | Efficient method of detecting an infectious agent in blood |
| US6593134B1 (en) | 2000-03-10 | 2003-07-15 | Cornell Research Foundation, Inc. | Method of propagating chicken infectious anemia virus |
| JP4489262B2 (ja) * | 2000-07-28 | 2010-06-23 | 日立プラズマディスプレイ株式会社 | カラー表示の色再現補正回路及びカラーディスプレイ |
| AUPR567401A0 (en) * | 2001-06-14 | 2001-07-12 | University Of Melbourne, The | Circovirus vaccines |
| BR0212279A (pt) * | 2001-09-05 | 2004-10-13 | Biomune | Vacina obtida de linhagem celular para vìrus causador de anemia em galinhas |
| BRPI0611534A2 (pt) | 2005-05-12 | 2010-09-21 | Novartis Ag | genes e proteìnas da brachyspira hyodysenteriae e uso das mesmas para diagnose e terapia |
| JP2007331603A (ja) | 2006-06-15 | 2007-12-27 | Kanzaki Kokyukoki Mfg Co Ltd | 船内外機のシフト装置 |
| MX2010001381A (es) | 2007-08-03 | 2010-09-14 | Spirogene Pty Ltd | Genes y proteinas de brachyspira hyodysenteriae y usos de los mismos. |
| GB0720250D0 (en) | 2007-10-17 | 2007-11-28 | Univ Edinburgh | Immunogenic compositions containing escherichia coli h7 flagella and methods of use thereof |
| EP2363407A1 (en) | 2008-02-28 | 2011-09-07 | Murdoch University | Novel sequences of Brachyspira, immunogenic compositions, methods for preparation and use thereof |
| AU2009227986C1 (en) | 2008-03-27 | 2014-06-19 | Murdoch University | Novel sequences of Brachyspira, immunogenic compositions, methods for preparation and use thereof |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU7966987A (en) * | 1986-09-08 | 1988-04-07 | Applied Biotechnology, Inc. | Empty viral capsid vaccines |
| ES2070997T3 (es) * | 1989-12-04 | 1995-06-16 | Akzo Nobel Nv | Virus de herpes recombinante de pavos y vacunas vector vivas derivadas de los mismos. |
| NL9002008A (nl) * | 1990-09-12 | 1992-04-01 | Stichting Centr Diergeneeskund | Recombinant dna en rna en daarvan afgeleide produkten. |
-
1991
- 1991-10-22 ZA ZA918426A patent/ZA918426B/xx unknown
- 1991-10-23 EP EP19910202737 patent/EP0483911A3/en not_active Withdrawn
- 1991-10-29 MX MX9101810A patent/MX9101810A/es unknown
- 1991-10-30 CA CA002054542A patent/CA2054542A1/en not_active Abandoned
- 1991-10-30 KR KR1019910019391A patent/KR100204438B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1991-10-30 AU AU86888/91A patent/AU8688891A/en not_active Abandoned
- 1991-10-30 CN CN91111520A patent/CN1041326C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1991-10-31 HU HU913433A patent/HUT62325A/hu unknown
- 1991-10-31 JP JP3286877A patent/JPH0586088A/ja active Pending
-
1992
- 1992-07-20 US US07/917,722 patent/US5554525A/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| HU913433D0 (en) | 1992-01-28 |
| EP0483911A2 (en) | 1992-05-06 |
| ZA918426B (en) | 1992-12-30 |
| MX9101810A (es) | 1992-07-08 |
| KR920008068A (ko) | 1992-05-27 |
| US5554525A (en) | 1996-09-10 |
| JPH0586088A (ja) | 1993-04-06 |
| CN1041326C (zh) | 1998-12-23 |
| CA2054542A1 (en) | 1992-05-01 |
| AU8688891A (en) | 1992-05-07 |
| KR100204438B1 (ko) | 1999-06-15 |
| EP0483911A3 (en) | 1993-02-24 |
| CN1062168A (zh) | 1992-06-24 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| HUT62325A (en) | Chicken anaemia virus vaccine and diagnostic | |
| JP4149008B2 (ja) | 同じ細胞中でのブタ再生性呼吸系症候群ウイルスポリペプチド類の発現 | |
| US5069901A (en) | Preparation of a recombinant subunit vaccine against pseudorabies infection | |
| JPH10506782A (ja) | 組換え型シチメンチョウヘルペスウイルス、及びその使用 | |
| JPH08500969A (ja) | 七面鳥の組換えヘルペスウイルス及びそれらの使用 | |
| JP3159476B2 (ja) | 組換えマレック病ウィルス | |
| CA2166371A1 (en) | Avian herpesvirus-based live recombinant avian vaccine, in particular against gumboro disease | |
| US5283191A (en) | Mareks' disease virus vaccine | |
| HU228708B1 (en) | Feline calicivirus genes and vaccines, in particular recombined vaccines | |
| EP0520753B1 (en) | Recombinant fowlpox vaccine for protection against Marek's disease | |
| US20100008948A1 (en) | Recombinant herpesvirus useful in vaccine production | |
| EP0704528B1 (en) | Rabbit hemorrhagic disease virus (RHDV) recombinant capsids and proteins, diagnostic kits and vaccines containing them | |
| EP0513921B1 (en) | Recombinant vaccine against Marek's disease | |
| US6241989B1 (en) | Recombinant multivalent viral vaccine | |
| HU208494B (en) | Process for producing serum and active component against pig-cholera virus | |
| EP0704529A2 (en) | Vaccine against rabbit hemorrhagic disease virus | |
| US5789567A (en) | Chicken infectious anemia virus vaccine | |
| WO2000020600A1 (en) | Avian pneumovirus vaccine and diagnostic agent | |
| US7087234B1 (en) | Recombinant multivalent viral vaccine | |
| US5690939A (en) | Recombinant vaccine against marek's disease | |
| HUT56136A (en) | Process for producing vaccine against infectious bronchitis virus | |
| JPH07236489A (ja) | ウマヘルペスウイルス感染からウマを防御するためのワクチン | |
| JP3428666B2 (ja) | 組換えマレック病ウイルスおよびその製法 | |
| Hong-Mei et al. | Construction and immunological characterization of recombinant Marek's disease virus expressing IBDV VP2 fusion protein | |
| KR101560793B1 (ko) | 비병원성 전염성낭병 변이 바이러스 및 이의 백신으로써의 용도 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| DFD9 | Temporary protection cancelled due to non-payment of fee |