JPH0586088A - ニワトリ貧血ウイルスワクチン及び診断法 - Google Patents

ニワトリ貧血ウイルスワクチン及び診断法

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JPH0586088A
JPH0586088A JP3286877A JP28687791A JPH0586088A JP H0586088 A JPH0586088 A JP H0586088A JP 3286877 A JP3286877 A JP 3286877A JP 28687791 A JP28687791 A JP 28687791A JP H0586088 A JPH0586088 A JP H0586088A
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cav
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polypeptide
dna
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JP3286877A
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Paulus J A Sondermeijer
パウルス・ヤコブス・アントニウス・ソンデルメイエル
Johannes Antonius Joseph Claessens
ヨハンネス・アントニウス・ヨセフ・クラエツセンス
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Akzo NV
Original Assignee
Akzo NV
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
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Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【目的】 家禽をＣＡＶに対して免疫感作するためのワ
クチンの製造、及び診断用検査薬を製造するためのＣＡ
Ｖ関連ポリペプチドをコードする核酸配列の提供。 【構成】 ニワトリ貧血ウイルス（ＣＡＶ）の遺伝情
報、特に、ウイルスポリペプチドをコードする３個のゲ
ノム領域を含む核酸配列、その発現系及びその発現ポリ
ペプチド、並びに、ＣＡＶ感染に対するワクチン、その
製造法、予防法、並びに、ＣＡＶに感染したニワトリの
検出に有用なテストキット。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】本発明は、ニワトリ貧血ウイルス関連ポリ
ペプチドをコードする核酸配列、このような核酸配列を
含む組換え核酸分子、該核酸配列を含むベクターウイル
ス、このような核酸配列で形質転換された宿主細胞、ニ
ワトリ貧血ウイルス関連ポリペプチド、該ポリペプチド
に対して反応性の抗体、ニワトリ貧血ウイルス突然変異
体、及びニワトリ貧血ウイルス感染に対するワクチンに
係る。
【０００２】本発明は更に、免疫化学的試薬及び該試薬
を含むテストキットにも係る。
【０００３】ニワトリ貧血ウイルス（ＣＡＶ）はニワト
リに感染性貧血を誘発する。ＣＡＶは全年齢のトリに感
染すると思われるが、疾病の徴候は若ドリでしか報告さ
れていない。ＣＡＶは更に免疫抑制性である。健常なト
リでは胸腺が若ドリでのＴ細胞の産生に関与し、ファブ
リキウス嚢がＢ細胞を産生し、骨髄が赤血球に加えて白
血球も産生する。雛ドリがＣＡＶに感染すると、上記細
胞の破壊が生じる。７〜１４日以内に抑圧、貧血及び免
疫抑制が生じる。特に、数週齢までの雛ドリは重度の貧
血及び免疫抑制徴候を示す。自然感染したニワトリ群の
致死率は通常３０％までであり、生残ったニワトリの回
復は通常感染後２４〜３２日までに完全になる。
【０００４】二次感染、特にウイルス及び細菌性感染が
生じることが多く、ＣＡＶにより起因する症状を悪化さ
せ、これらの場合の致死率は３０％を優に越える。より
高齢のトリは感染し得るが、潜伏性徴候がニワトリの機
能低下の原因であるとみなされるとしても発病すること
はない。
【０００５】血清学的試験によると、試験したニワトリ
飼育群の９０％以上に何らかの時点で循環ＣＡＶ抗体が
存在しており、従ってこれらのニワトリはウイルスに感
染したことが実証されている。ＣＡＶの遍在性は十分に
報告されている。
【０００６】ＣＡＶは水平及び（母親から雛にｉｎ ｏ
ｖｏで）垂直に伝達されると考えられる。ウイルス粒子
は非常に安定しており、種々の化学物質（例えばクロロ
ホルム）でも又は６０℃に３０分間加熱しても破壊され
ない。ＣＡＶは約２４ｎｍの直径を有する無外被の球形
ウイルスであると報告されており、約２３００ｂｐの環
状一重鎖ＤＮＡゲノムを含む。
【０００７】若ドリの致死率及びより高齢のニワトリの
機能低下に結び付けられるＣＡＶの遍在性により、ＣＡ
Ｖ感染又は疾患を予防するための安全且つ有効なワクチ
ンが必要とされる。
【０００８】従来のワクチンは化学的に不活化したウイ
ルスワクチン又は改変した生ウイルスワクチンを含む。
しかしながら、不活化ワクチンは付加的な免疫感作を必
要とし、アジュバントを含み、製造費用が高く、投与す
るのに労力を要する欠点がある。更に、感染ウイルス粒
子によっては不活化プロセス後も生き残るものがあり、
動物に投与後に疾病を誘発する可能性がある。
【０００９】一般に、弱毒生ウイルスワクチンは多くの
場合体液性及び細胞性反応の両方に基づいて免疫応答を
引き起こすという理由から好適である。今までのとこ
ろ、ＣＡＶ株に由来するこのようなワクチンは組織培養
における病毒性をもつ株の連続継代によってしか製造す
ることができない。しかしながら、この処理により未制
御の突然変異がウイルスゲノムに導入され、その結果、
病毒性及び免疫特性において異種のウイルス粒子の集団
が形成される。更に周知のように、このような従来の弱
毒生ウイルスワクチンは再び病毒性をもつようになり、
接種動物に疾病を誘発し、他の動物に病原体を蔓延させ
る可能性がある。組換えＤＮＡ技術を利用することによ
り、ＣＡＶ病原体に対する免疫応答を引き起こすことが
可能な必要且つ関連するＣＡＶ免疫原物質又は該物質を
コードする遺伝情報のみを含み、生又は不活化ワクチン
の上記欠点のない改良されたワクチンを製造することが
できると考えられる。
【００１０】本発明によると、ＣＡＶ関連ポリペプチド
をコードする核酸配列が提供され、該配列は、家禽をＣ
ＡＶに対して免疫感作するためのワクチンの製造、及び
診断用検査薬を製造するために適用され得る。
【００１１】本明細書中で使用する「核酸配列」なる用
語は、リボ核酸配列及びデオキシリボ核酸配列のいずれ
かに拘わらず任意の長さのポリマー状のヌクレオチドを
意味する。原則として、この用語は該核酸分子の一次構
造を意味する。従って、この用語は二重鎖ＤＮＡ、一重
鎖ＤＮＡ、二重鎖ＲＮＡ、一重鎖ＲＮＡ及びそれらの改
変体を包含する。
【００１２】一般に、「ポリペプチド」なる用語は生物
活性を有するアミノ酸の分子鎖を意味し、特定の長さの
生成物を意味するのではなく、必要に応じて例えばグリ
コシル化、アミド化、カルボキシル化又はリン酸化によ
りｉｎ ｖｉｖｏ又は ｉｎｖｉｔｒｏで修飾され得、
従って、特にペプチド、オリゴペプチド及びタンパク質
が含まれる。
【００１３】特に本発明によると、夫々ＯＲＦ１〜３と
命名されるＣＡＶ関連ポリペプチドをコードする領域を
含む３種の核酸配列が同定及び特徴付けされた。
【００１４】ＯＲＦ−１ポリペプチドをコードする領域
はヌクレオチド８７６〜２２２５に位置し（ＳＥＱ Ｉ
Ｄ ＮＯ：１、図３）、約４４９アミノ酸長のポリペプ
チドをコードする。ＯＲＦ−１遺伝子によりコードされ
るポリペプチドのアミノ酸配列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：
２に示す。ヌクレオチド１６５７及び２１８５には多少
の配列異種性が検出された。これらの配列変化は保存さ
れるアミノ酸の置換をもたらし、従って、ポリペプチド
の生物活性にさほど影響しないとみなされる。
【００１５】ＯＲＦ−２ポリペプチドをコードする領域
はゲノムの第２のリーディングフレーム上のヌクレオチ
ド１０１〜５０２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、図３）に
位置し、約１３３アミノ酸長のポリペプチドをコードす
る。ＯＲＦ−２遺伝子によりコードされるポリペプチド
のアミノ酸配列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に示す。
【００１６】ＯＲＦ−３ポリペプチドをコードする領域
はゲノムの第３のリーディングフレーム上のヌクレオチ
ド４０３〜１０５３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、図３）
に位置し、約２１６アミノ酸長のポリペプチドをコード
する。ＯＲＦ−３遺伝子によりコードされるポリペプチ
ドのアミノ酸配列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に示す。
【００１７】従って、本発明は夫々ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
Ｏ：２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３又はＳＥＱ ＩＤ Ｎ
Ｏ：４に示すアミノ酸配列を有するＯＲＦ−１ポリペプ
チド、ＯＲＦ−２ポリペプチド又はＯＲＦ−３ポリペプ
チドをコードする核酸配列を提供する。
【００１８】当業者に周知のように、通常、ゲノムの全
部分が成熟ｍＲＮＡに表わされて翻訳される訳ではな
い。生物学的に機能的な成熟タンパク質は、ＲＮＡスプ
ライシングにより数個のＯＲＦのフラグメントをｉｎ
ｖｉｖｏで継ぎ合わせて得られる。翻訳の準備のできた
成熟ｍＲＮＡの前のＲＮＡレベルで可能な改変の一例
は、パルボウイルス科のウイルスにおけるＲＮＡ転写物
のプロセッシングである。Ｂｅｒｎｓら（Ｊ．Ｇｅｎ．
Ｖｉｒｏｌ． ６８， ６０１−６１４， １９８７）
により報告されているように、パルボウイルス科のウイ
ルスは非常に小さい、エンベロープなしの一重鎖ＤＮＡ
ウイルスであり、その構造においてＣＡＶに類似してい
る。数個の翻訳フレーム中の数個のＯＲＦによって各々
コードされるパルボウイルス被覆タンパク質及び非構造
タンパク質を集合させるために、ＲＮＡプロセッシング
が必要である。
【００１９】ゲノムの転写領域の地図を作成するため
に、（Ｍａｎｉａｔｉｓら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌ
ｏｎｉｎｇ， Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａ
ｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｕ．Ｓ．Ａ．， １９８９
に記載されているような）数種の方法が慣用されてお
り、例えば、単離したＣＡＶ ｍＲＮＡのｃＤＮＡを作
製し、ＣＡＶ ｍＲＮＡ翻訳をｉｎ ｖｉｔｒｏで実施
し、Ｓ１ヌクレアーゼ保護アッセイ及びプライマーエク
ステンション分析のような数種の方法で転写物マッピン
グを行う。
【００２０】これらの技術によりＣＡＶゲノムの転写地
図を作成することができ、転写物の相対存在量を示すこ
とができる。
【００２１】したがって、種々のＯＲＦから誘導される
ヌクレアーゼ配列を含む核酸配列も本発明の範囲に含ま
れる。
【００２２】対応する免疫学的特徴を有する該ＯＲＦ−
１、ＯＲＦ−２又はＯＲＦ−３ポリペプチドの機能的等
価物をコードする核酸配列も本発明の範囲に含まれる。
【００２３】２６Ｐ４ ＣＡＶ株に由来する本発明の個
々のＯＲＦ１〜３ポリペプチドには、個々のウイルス又
はニワトリ貧血ウイルス株間に天然の変異が存在し得る
ことが理解されよう。これらの変異は例えば配列全体に
おけるアミノ酸変異、又は該配列中のアミノ酸の欠失、
置換、挿入、逆位もしくは付加であり得る。生物学的及
び免疫学的活性を本質的に変化させない予想可能なアミ
ノ酸置換の例は既に報告されている。関連するアミノ酸
間のアミノ酸置換又は進化中に頻発した置換は特に、Ｓ
ｅｒ／Ａｌａ、Ｓｅｒ／Ｇｌｙ、Ａｓｐ／Ｇｌｙ、Ａｓ
ｐ／Ａｓｎ、Ｉｌｅ／Ｖａｌ（Ｄａｙｈｆ， Ｍ．
Ｄ．， Ａｔｌａｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓｅｑｕｅ
ｎｃｅ ａｎｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ， Ｎａｔ． Ｂ
ｉｏｍｅｄ． Ｒｅｓ． Ｆｏｕｎｄ．， Ｗａｓｈｉ
ｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．， １９７８， ｖｏｌ． ５，
ｓｕｐｐｌ．３参照）である。この情報に基づいてＬ
ｉｐｍａｎ及びＰｅａｒｓｏｎは迅速且つ高感度でタン
パク質を比較し（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２７， １４３５
−１４４１， １９８５）、同種ポリペプチドの機能的
類似性を決定するための方法を開発した。このような同
種機能的等価物をコードする核酸配列は本発明の範囲に
含まれる。更に、これらの種々の機能的等価物をコード
する核酸配列を製造するために組換えＤＮＡ技術を使用
する可能性が存在する。
【００２４】本発明の核酸配列はＣｕｘｈａｖｅｎ−
１、ＴＫ−５８０３又はＧｉｆｕ−１のようなＣＡＶ株
の単離物から誘導することも可能である。
【００２５】ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１〜４に提供する情
報に基づき、当業者は本明細書に開示するＯＲＦ１〜３
ポリペプチドに対応する免疫学的特徴を有する上記のよ
うな変異した機能的等価ポリペプチドをコードする核酸
配列を単離及び同定することができよう。一般に適用さ
れているサザンブロット法又はコロニーハイブリダイゼ
ーションをこの目的に使用することができる（Ｅｘｐｅ
ｒｉｍｅｎｔｓ ｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏ
ｇｙ， Ｒ．Ｊ． Ｓｌａｔｅｒ編， Ｃｌｉｆｔｏ
ｎ， Ｕ．Ｓ．Ａ．， １９８６； Ｓｉｎｇｅｒ−Ｓ
ａｍ，Ｊ．ら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ． ８０， ８０２−８０６， １９８３；
Ｍａｎｉａｔｉｓ Ｔ．ら， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃ
ｌｏｎｉｎｇ， Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕ
ａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， ＵＳＡ， １９８
９）。例えば、特定のＣＡＶ株に由来するＤＮＡを制限
酵素で消化して電気泳動にかけ、その後、ニトロセルロ
ースフィルターに移動させ、「ブロット」する。こうし
て、フィルター上に存在する相同なＤＮＡ配列にプロー
ブをハイブリダイズさせることが可能な塩濃度及び温度
の特定条件下で、構造既知の標識化ＤＮＡフラグメント
即ち「プローブ」、即ちＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２〜４
に示すアミノ酸配列から推定される配列を含む合成オリ
ゴヌクレオチドにハイブリダイズさせることにより、フ
ィルター上のＣＡＶ関連配列を同定することができる。
フィルターを洗浄後、ハイブリダイズした物質はオート
ラジオグラフィーにより検出され得る。対応するＤＮＡ
制限フラグメントをアガロースゲルから抽出し、ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ： ２〜４に示すポリペプチドに機能的に等
価のポリペプチドを合成するために使用することができ
る。
【００２６】例えば、ｐＣＡ１、ｐＣＡ３又はそのフラ
グメントはＣＡＶの他の株のゲノムに比較して高度に保
存された配列構造を含むと予想され、ハイブリダイゼー
ション実験で使用される。このようにして動物又は特定
物質のＣＡＶ感染状態で定量的及び定性的情報が得られ
る。試験すべきサンプルは血液（特にリンパ球）、器官
物質（例えば肝臓、腎臓）、胚ホモジネート、又はこれ
らのサンプルの１種と共にインキュベートしたＭＤＣＣ
−ＭＳＢ１細胞（Ａｋｉｙａｍａら， Ｂｉｋｅｎ
Ｊ． １７， １０５−１１７， １９７４）である。
標準プロトコル（Ｂｅｒｇｅｒ及びＫｉｍｍｅｌ編，Ｍ
ｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １５２，
１８１， １９８７）にしたがって粗ＤＮＡ調製物を
調製する。各サンプルの連続希釈液をニトロセルロース
膜にブロットし、標識化ｐＣＡ１、ｐＣＡ３又はそのフ
ラグメントを用いてプローブする（Ｍａｎｉａｔｉｓ
ら，１９８９， 上掲）。検出後、同一実験で標準量の
ＣＡＶ ＤＮＡの連続希釈液から得たシグナルと比較す
ることによりシグナルを定量する。陰性のサンプルは
（検出可能な）シグナルを与えないサンプルであり、検
出限界は通常ｍｌ当たりＣＡＶ ＤＮＡ２ｐｍｏｌ未満
である。
【００２７】別の方法によると、ＣＡＶ関連ＤＮＡをλ
ｇｔ１１ファージにクローニングし、細菌宿主で発現さ
せることもできる。その後、精製ＯＲＦ１〜３ポリペプ
チドに対するポリクローナル抗血清で組換えファージを
スクリーニングし、変異ポリペプチドの対応する免疫学
的領域の存在を決定する。本明細書中で使用されるＯＲ
Ｆ１〜３ポリペプチドに対するポリクローナル抗血清の
製造については追って記載する。
【００２８】当業者に周知のように、遺伝子コードの縮
重はコドンの塩基置換を可能にし、その結果、同一のア
ミノ酸をコードする別のコドンが存在し、例えばアミノ
酸グルタミン酸のコドンはＧＡＴ及びＧＡＡの両方であ
る。したがって、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２〜４に示す
アミノ酸配列を有するポリペプチドを発現させるため
に、該ＳＥＱ ＩＤに示す核酸配列と異なるこのような
代替コドン組成を有する誘導核酸配列（機能的等価物）
を使用できることは明白である。
【００２９】本発明によると、ＣＡＶゲノム又はそのフ
ラグメントを含む核酸配列が提供される。
【００３０】本発明の好適核酸配列は、該配列がＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：１に示すデオキシリボ核酸配列の少なく
とも一部を含むことを特徴とする。
【００３１】該デオキシリボ核酸配列の特定の有用なフ
ラグメントはポリペプチドをコードするフラグメントで
ある。
【００３２】特に、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すＣＡ
Ｖゲノム８７６〜２２２５、１０１〜５０２又は４０３
〜１０５３位に位置するＯＲＦの少なくとも一部を含む
核酸配列が本発明に包含される。
【００３３】更に、ヌクレオチド１〜８７０に結合した
ウイルスゲノム中の２２３０〜２２９８位に位置するヌ
クレオチドは、配列の制御下に置かれた異種遺伝子の発
現を制御するために使用され得る配列を含む。
【００３４】更に、上記のようにＯＲＦ１〜３ポリペプ
チド又はその機能的等価物をコードする核酸配列のフラ
グメントも本発明に含まれる。
【００３５】本明細書で使用する「フラグメント」なる
用語は、本発明の核酸配列又はポリペプチドの１種のサ
ブ配列を含むＤＮＡ又はアミノ酸配列を意味する。該フ
ラグメントは、ＣＡＶ関連ポリペプチドの１個以上の免
疫反応性及び／又は抗原決定基、即ちニワトリに免疫応
答を引き起こすことが可能であるか及び／又は相補的抗
体に特異的に結合することが可能な１個以上のエピトー
プを有するポリペプチドであるか又はこのようなポリペ
プチドをコードするものである。使用可能なポリペプチ
ドフラグメントの決定方法を以下に要約する。フラグメ
ントは特に該ＤＮＡ用の制限エンドヌクレアーゼ及び該
ポリペプチド用のプロテアーゼを使用して前駆物質分子
の酵素切断により作製され得る。他の方法としては、フ
ラグメントの化学的合成又はＤＮＡフラグメントによる
ポリペプチドフラグメントの発現などがある。
【００３６】ＯＲＦ−１、ＯＲＦ−２又はＯＲＦ−３ポ
リペプチドの免疫学的特徴が本質的に不変である限り、
ＯＲＦ１〜３ポリペプチドのこのような機能的等価物を
もたらす全ての改変は本発明の範囲に含まれる。
【００３７】本発明の核酸配列は更に、ｉｎ ｖｉｔｒ
ｏで合成されるか又は例えばＰＣＲ技術により得られる
核酸配列を含む。
【００３８】本発明の核酸配列は、天然では会合又は結
合しない種々の複製実施のＤＮＡ配列、場合によりβ−
ガラクトシダーゼのような融合タンパク質配列をコード
するＤＮＡ部分を含む該ＤＮＡ配列に連結することがで
き、その結果、適切な宿主の形質転換に使用可能な所謂
組換え核酸分子が生成される。このようなハイブリッド
ＤＮＡ分子は好ましくは例えばプラスミド、又はバクテ
リオファージ、コスミドもしくはウイルスに存在する核
酸配列から誘導される。本発明の核酸配列をクローニン
グするために使用可能な特定のベクターは当業者に知ら
れており、特にプラスミドベクター（例えばｐＢＲ３２
２、種々のｐＵＣ、ｐＧＥＭ及びＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ
プラスミド）、バクテリオファージ（例えばλｇｔ−Ｗ
ｅｓ−λＢ、Ｃｈａｒｏｎ ２８及びＭ１３誘導ファー
ジ）又はウイルスベクター（例えばＳＶ４０、アデノウ
イルス又はポリオーマウイルス）を含む（Ｒｏｄｒｉｑ
ｕｅｚ， Ｒ．Ｌ．及びＤ．Ｔ． Ｄｅｎｈａｒｄｔ
編，Ｖｅｃｔｏｒｓ： Ａｓｕｒｖｅｙ ｏｆ ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ ｖｅｃｔｏｒｓａｎｄ
ｔｈｅｉｒ ｕｓｅｓ， Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ
ｓ， １９８８；Ｌｅｎｓｔｒａ， Ｊ．Ａ．ら， Ａ
ｒｃｈ． Ｖｉｒｏｌ． １１０， １−２４， １９
９０参照）。本発明の組換え核酸分子の構築に使用され
る方法は当業者に知られており、特にＭａｎｉａｔｉ
ｓ， Ｔ．ら（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ Ａ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ； Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，
１９８２）に記載されている。例えば、相補的ＤＮＡ
末端を生成するのと同一の制限酵素で遺伝子及び所望の
クローニングベクターの両方を切断すると、クローニン
グベクター中への挿入を簡単に実施することができる。
【００３９】あるいは、一重鎖ＤＮＡを消化することに
より又は一重鎖末端を適当なＤＮＡポリメラーゼで充填
することにより平滑末端化される制限部位を改変するこ
とが必要な場合もある。その後、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ
のような酵素で平滑末端連結を行う。
【００４０】必要に応じてリンカーをＤＮＡ末端に連結
することにより任意の制限部位を形成してもよい。この
ようなリンカーは制限部位配列をコードする特定のオリ
ゴヌクレオチド配列を含み得る。制限酵素で切断したベ
クター及び核酸配列をホモポリマーテーリングにより改
変することもできる。
【００４１】本明細書中で使用する「形質転換」なる用
語は、使用される方法（例えば直接取り込み又は形質導
入）に関係なく宿主細胞に異種核酸配列を導入すること
を意味する。あるいは異種核酸配列を宿主ゲノムに組み
込んでもよい。必要に応じて組換えＤＮＡ分子は挿入し
た核酸配列の発現を調節することが可能な指定宿主に適
合可能な適切な制御配列を備える。
【００４２】本発明の組換え核酸分子は好ましくは、所
望の形質転換細胞を選択するために使用され得る１種以
上のマーカー活性（例えばｐＢＲ３２２におけるアンピ
シリン及びテトラサイクリン耐性、ｐＵＣ８におけるア
ンピシリン耐性及びβ−ガラクトシダーゼ活性）を含
む。
【００４３】適切な宿主細胞は、ポリペプチドをコード
する核酸配列又はこのような核酸配列を含む組換え核酸
分子により形質転換可能であり、且つ必要に応じて該核
酸配列によりコードされる該ポリペプチドを発現させる
ために使用可能な細胞である。宿主細胞は原核起源（例
えば大腸菌、枯草菌及びＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属種の
ような細菌）でもよいし、真核起源（例えばＳａｃｃｈ
ａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのような酵
母、又は昆虫、植物もしくは哺乳動物細胞のような高等
真核細胞（ＨｅＬａ細胞及びチャイニーズハムスター卵
巣（ＣＨＯ）細胞を含む））でもよい。昆虫細胞は、Ｓ
ｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａのＳｆ９細
胞系（Ｌｕｃｋｏｗら， Ｂｉｏ−ｔｅｃｈｎｏｌｏｇ
ｙ ６，４７−５５， １９８８）を含む。真核クロー
ニング系における本発明の核酸配列のクローニング及び
発現に関する情報はＥｓｓｅｒ， Ｋ．ら（Ｐｌａｓｍ
ｉｄｓ ｏｆ Ｅｕｋａｒｙｏｔｅｓ， Ｓｐｒｉｎｇ
ｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ， １９８６）に記載されている。
【００４４】ＣＡＶでコードされた所定量のポリペプチ
ドを得るためには、ＣＡＶゲノム又はそのフラグメント
をバキュロウイルス発現系（ＢＶＥＳ）のような発現系
で発現させることができる。この系では、Ｓｐｏｄｏｐ
ｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（Ｓｆ； ＩＰＬＢ−
Ｓｆ２１）細胞のような昆虫細胞をＡｕｔｏｇｒａｐｈ
ａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体病気ウイルス（Ａ
ｃＮＰＶ）のようなバキュロウイルスの宿主として細胞
培養する。ＡｃＮＰＶ中の遺伝子の一部は高レベルに発
現されるが、ウイルス感染サイクルに非必須である。こ
れらの遺伝子は、トランスフェクトした細胞におけるｐ
ＡｃＡＳ３のようなバキュロトランスファープラスミド
と野生型（ｗｔ）ＡｃＮＰＶ ＤＮＡとの間の相同的組
換えのためのターゲットである。ｐＡｃＡＳ３（Ｊ．
Ｖｌａｋら， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ１７９， ｐ． ３１
２−３２０， １９９０）では、非必須ｐ１０遺伝子で
なく、組換えプロセスのターゲットであるｗｔ ＡｃＮ
ＰＶの配列により囲まれたｐ１０プロモーターの下流に
異種遺伝子が挿入される。組換え体のスクリーニングを
容易にするために、ｐＡｃＡＳ３は更にＬａｃＺ遺伝子
を含み、培地にＸ−ｇａｌを添加すると組換え体プラー
クは青色に変化する。
【００４５】特に、ＭＳＢ１感染細胞から単離されたＣ
ＡＶゲノムＤＮＡはＮｒｕＩで消化され得る。ＢａｍＨ
Ｉリンカーを２．３ｋｂ分子の末端に連結し、その後、
ＢａｍＨＩで消化し、脱ホスホリル化したｐＡｃＡＳ３
プラスミドにこれを連結する。ＤＨ５αコンピテント大
腸菌細胞を新しい構築物ｐＡｃＣＡ３で形質転換する。
単一コロニーを選択し、試験し、及び１００ｍｌまで培
養することができる。ＣｓＣｌ勾配遠心分離によりプラ
スミドＤＮＡを単離及び精製し、精製したＤＮＡを４℃
のＴＥ緩衝液中１μｇ／ｍｌの濃度で貯蔵する。１０μ
ｇのｐＡｃＣＡ３を、水１００μｌ中のｗｔ ＡｃＮＰ
Ｖ ＤＮＡ２μｇ及びＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ試薬ＢＲＬ
（Ｂｅｔｈｅｓｄａ， Ｍａｒｙｌａｎｄ， ＵＳＡ）
３０μｇと混合する。６ｃｍφ培養皿で無血清培地５ｍ
ｌ中のＳｆ２１細胞５×１０6個をこの混合物に加え
る。３７℃で３時間インキュベーション後、新しい培地
を加え、３７℃でインキュベートする。翌日、細胞に培
地中の１．５％低融点アガロースを重層し、５日間３７
℃でインキュベートする。Ｘ−ｇａｌを含有する新しい
アガロースを終濃度２００μｇ／ｍｌまで加える。青色
のプラークを３回プラーク精製して、組換えウイルスの
ストックを作る。
【００４６】感染細胞及びその培養上清について、ウエ
スタンブロッティングにより組換えバキュロウイルスを
用いて組換えＣＡＶポリペプチドの発現をスクリーニン
グする。最高レベルの組換えＣＡＶポリペプチド発現を
与えるプラーク及び／又はウエスタンブロットアッセイ
で最良に認識されるポリペプチドを選択し、ワクチン製
剤用ＣＡＶポリペプチドの製造に充てる。
【００４７】一般に、本発明で有用なベクターを構築す
る際にＤＮＡ配列をクローニングするためには原核生物
が好適である。例えば、大腸菌Ｋ１２が特に有用であ
る。使用可能な他の微生物株としては、ＤＨ５α又はＪ
Ｍ１０１のような大腸菌株を挙げることができる。
【００４８】発現のために、本発明の核酸配列は発現制
御配列に作動的に結合される。このような制御配列はプ
ロモーター、エンハンサー、オペレーター、インデュー
サー、リボソーム結合部位等を含み得る。
【００４９】宿主細胞が細菌であるとき、有用な発現制
御配列の例として、Ｔｒｐプロモーター及びオペレータ
ー（Ｇｏｅｄｄｅｌら， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒ
ｅｓ． ８， ４０５７， １９８０）、ｌａｃプロモ
ーター及びオペレーター（Ｃｈａｎｇら， Ｎａｔｕｒ
ｅ ２７５， ６１５，１９７８）、外膜タンパク質プ
ロモーター（Ｎａｋａｍｕｒａ， Ｋ．とＩｎｏｕｇ
ｅ， Ｍ．， ＥＭＢＯ Ｊ． １， ７７１−７７
５， １９８２）、バクテリオファージλプロモーター
及びオペレーター（Ｒｅｍａｕｔ， Ｅ．ら， Ｎｕｃ
ｌ． ＡｃｉｄｓＲｅｓ． １１， ４６７７−４６８
８， １９８３）、α−アミラーゼ（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌ
ｉｓ）プロモーター及びオペレーター、選択された宿主
細胞に適合可能な終止配列と他の発現増進及び制御配列
を挙げることができる。宿主細胞が酵母であるとき、有
用な発現制御配列の例は、例えばα交配因子を含む。昆
虫細胞の場合、バキュロウイルスの多角体（ｐｏｌｙｈ
ｅｄｒｉｎ）又はｐ１０のプロモーターを使用すること
ができる（Ｓｍｉｔｈ， Ｇ．Ｅ．ら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌ
ｌ． Ｂｉｏｌ． ３， ２１５６−６５， １９８
３）。宿主細胞が哺乳動物起源であるとき、有用な発現
制御配列の例は例えばＳＶ−４０プロモーター（Ｂｅｒ
ｍａｎ， Ｐ．Ｗ．ら， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２２，
５２４−５２７， １９８３）又は例えばメタロチオネ
インプロモーター（Ｂｒｉｎｓｔｅｒ， Ｒ．Ｌ．，
Ｎａｔｕｒｅ ２９６， ３９−４２， １９８２）又
は熱ショックプロモーター（Ｖｏｅｌｌｍｙら， Ｐｒ
ｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８
２， ４９４９−５３， １９８５）を含む。あるい
は、ＣＡＶに存在する発現制御配列、特にＯＲＦ１〜３
の発現を調節する配列も適用できる。遺伝子発現を最大
にするためには、ＲｏｂｅｒｔｓとＬａｕｅｒ（Ｍｅｔ
ｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ６８， ４７
３， １９７９）も参照されたい。
【００５０】本発明は更に、ＣＡＶ関連抗原の免疫学的
特徴を示すポリペプチドも含み、即ち該ポリペプチド
は、このようなポリペプチドが通常会合する全ウイルス
又は他のタンパク質を本質的に含まないＣＡＶ関連抗原
の１種以上の免疫反応性及び／又は抗原決定基を含む。
【００５１】より具体的には、本発明は夫々ＳＥＱ Ｉ
Ｄ ＮＯ：２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３及びＳＥＱ Ｉ
Ｄ ＮＯ：４に示すアミノ酸配列を有するＯＲＦ−１、
ＯＲＦ−２又はＯＲＦ−３の少なくとも一部を含むポリ
ペプチドを提供する。
【００５２】本質的に同一の免疫学的特性を示す該アミ
ノ酸配列の誘導体、即ち免疫学的等価物も本発明の範囲
に含まれることが理解されよう。
【００５３】さらに、ＣＡＶ感染に対する家禽の免疫又
は診断目的に使用可能なＯＲＦ１〜３ポリペプチド又は
その機能的等価物のフラグメントを含むポリペプチドも
本発明に含まれる。このような使用可能なポリペプチド
フラグメントを既知のアミノ酸配列内で検出するために
は種々の方法が知られている。
【００５４】エピトープを含む本発明のポリペプチドの
適切な免疫化学的に活性なポリペプチドフラグメント
は、所謂ペプスカン（ｐｅｐｓｃａｎ）法に基づく特許
出願ＷＯ８６／０６４８７， Ｇｅｙｓｅｎ， Ｈ．
Ｍ．ら（Ｐｒｏｄ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ８
１， ３９９８−４００２， １９８４）， Ｇｅｙｓ
ｅｎ， Ｈ．Ｍ．ら（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔ
ｈ． １０２， ２５９−２７４， １９８４）に記載
の方法により検出可能であり、この方法では該当する完
全ポリペプチドの部分的配列に対応する部分的にオーバ
ーラップする一連のポリペプチドを合成し、抗体に対す
るそれらの反応性を調査する。
【００５５】更に、上述のアミノ酸配列を有するポリペ
プチドの多数の領域を理論的考察及び既知のエピトープ
との構造一致に基づいてエピトープと指定することがで
きる。これらの領域の決定は、ＨｏｐｐとＷｏｏｄｓ
（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ７
８， ３８２４−３８２８， １９８１）による親水性
基準並びにＣｈｏｕとＦａｓｍａｎ（Ａｄｖａｎｃｅｓ
ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ４７， ４５−１４
８， １９８７）による二次構造予測とを組み合わせる
ことにより行われる。
【００５６】必要であり得るＴ細胞エピトープは同様
に、Ｂｅｒｚｏｆｓｔｙの両親媒性基準（Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ ２３５， １０５９−６２， １９８７）により理
論的根拠に基づいて誘導され得る。
【００５７】本発明の別の実施態様によると、上記核酸
配列によりコードされるアミノ酸配列を有するポリペプ
チドが使用される。
【００５８】家禽のＣＡＶ感染に対する免疫感作は、例
えば免疫学的関連における本発明のポリペプチドを所謂
サブユニットワクチンとして動物に投与することにより
実施され得る。本発明のサブユニットワクチンは、場合
により医薬上許容可能なキャリヤーの存在下で純粋なポ
リペプチドを含み得る。ポリペプチドは場合により、例
えば融合産物の精製に有利であり得る非関連タンパク質
に共有結合し得る。具体例はβ−ガラクトシダーゼ、プ
ロテインＡ、プロキモシン、血液凝固因子Ｘａ等であ
る。
【００５９】これらのポリペプチド自体に対する中和抗
体を形成する能力が低い場合もある。小フラグメントは
その免疫原性を高めるためにキャリヤー分子に結合する
ことが好ましい。この目的に適切なキャリヤーは高分子
であり、例えば天然ポリマー（キーホールリンペットヘ
モシアニン、アルブミン、トキシン類のようなタンパク
質）、ポリアミノ酸（ポリリシン、ポリアラニン）のよ
うな合成ポリマー、又はサポニンのような両親媒性化合
物のミセルである。あるいはこれらのフラグメントはそ
のポリマー、好ましくは線状ポリマーとして提供され得
る。
【００６０】このようなサブユニットワクチンで使用さ
れるポリペプチドは例えば該ポリペプチドをＣＡＶから
単離することにより、組換えＤＮＡ技術により、又は化
学的合成により当業者に周知の方法により製造され得
る。
【００６１】必要に応じて、ワクチンで使用される本発
明のポリペプチドは、例えばグリコシル化、アミド化、
カルボキシル化又はリン酸化によりｉｎ ｖｉｔｒｏ又
はｉｎ ｖｉｖｏで修飾され得る。
【００６２】サブユニットワクチンの代わりに生ベクタ
ーワクチンも使用できる。本発明の核酸配列は、組換え
体微生物が複製する能力を維持し、その結果、挿入され
た核酸配列によりコードされるポリペプチドを発現する
ように、組換えＤＮＡ技術により微生物（例えば細菌又
はウイルス）に導入される。
【００６３】例えばｉｎ ｖｉｖｏ相同的組換え技術を
使用して異種核酸配列、例えば本発明の核酸配列をベク
ター微生物のゲノムに導入することができる。
【００６４】まず最初に、ベクターゲノムの挿入領域、
即ち感染又は複製に必要な機能のようなベクターの必須
機能を破壊することなく異種配列の取り込みに使用可能
な領域、に対応するＤＮＡフラグメントを、標準ｒｅｃ
ＤＮＡ技術にしたがってクローニングベクターに挿入す
る。挿入領域は多数の微生物で報告されている（例えば
ＥＰ ８０，８０６、ＥＰ １１０，３８５、ＥＰ ８
３，２８６、ＥＰ ３１４，５６９、ＷＯ ８８／０２
０２２及びＷＯ ８８／０７０８８）。
【００６５】第２に、必要に応じて第１段階から得られ
た組換えＤＮＡ分子中に存在する挿入領域内に欠失を導
入する。これは例えば第１段階からの組換えＤＮＡ分子
を適切なエキソヌクレアーゼＩＩＩで消化又は制限酵素
処理することにより実施され得る。
【００６６】第３に、第１段階の組換えＤＮＡ分子中に
存在する挿入領域に、又は該組換えＤＮＡ分子から欠失
したＤＮＡの代わりに異種核酸配列を挿入する。挿入領
域ＤＮＡ配列はベクターゲノムとの相同的組換えが行わ
れるようにするために十分な長さを有するべきである。
その後、適切なベクターＤＮＡ配列を両側に有する挿入
部を含む組換えＤＮＡ分子の存在下に適切な細胞をベク
ターゲノムＤＮＡで形質転換させ、こうして組換えＤＮ
Ａ分子とベクターゲノムとの対応する領域間で組換えが
行われる。こうして組換えベクター子孫を細胞培養で形
成することができ、例えばハイブリダイゼーション、異
種核酸配列と共に組み込まれる遺伝子によりコードされ
る酵素活性の検出、又は組換えベクターにより免疫学的
に発現される抗原異種ポリペプチドの検出により、例え
ば遺伝子型又は表現型により選択することができる。
【００６７】次に、この組換え体微生物をニワトリに投
与して免疫感作し、その後、そのまましばらく維持する
か、あるいは接種動物の体内で複製し、本発明の挿入核
酸配列によりコードされるポリペプチドをｉｎ ｖｉｖ
ｏ発現させ、接種動物の免疫系を刺激する。本発明の核
酸配列を取り込むために適切なベクターは、ウイルス、
例えば（鳥類）ポックスウイルス（例えば牛痘ウイルス
又は鶏痘ウイルス）（ＥＰ ３１４，５６９及びＷＯ
８８／０２０２２）、ＨＶＴ（ＷＯ８８／０７０８８）
のようなヘルペスウイルス、アデノウイルスもしくはイ
ンフルエンザウイルス、又は細菌（例えば大腸菌又は特
定のＳａｌｍｏｎｅｌｌａ種）に由来し得る。この型の
組換え体微生物を使用すると、宿主細胞で合成されたポ
リペプチドは表面抗原として露出され得る。この関連で
は、該ポリペプチドとＯＭＰタンパク質もしくは例えば
大腸菌の線毛タンパク質との融合、又は生物により認識
されるシグナル配列及びアンカー配列の合成が予想され
る。該免疫原性ポリペプチドは必要に応じてより大きい
全体の一部であり、免疫すべき動物の体内に放出される
ことも予想される。これらのいずれの場合も、種々の病
原体及び／又は所与の病原体の種々の抗原に対する保護
を生じる１種以上の免疫原性産物が発現されることも予
想される。
【００６８】本発明のワクチンは、本発明の核酸配列を
含むベクターウイルスに感染した宿主細胞を培養するこ
とにより製造することができ、その後、ウイルスを含む
細胞及び／又は細胞中で増殖したベクターウイルスを場
合により純粋な形で収集し、場合により凍結形態のワク
チンに調製する。
【００６９】本発明の核酸配列を含む上記宿主細胞を、
該核酸配列によりコードされるポリペプチドの発現に好
ましい条件下で培養することもできる。ワクチンは粗培
養物、宿主細胞溶解物又は宿主細胞抽出物のサンプルを
使用して調製され得るが、別の実施態様によると、本発
明のより精製度の高いポリペプチドは所期用途に依存し
てワクチンに調製される。生成されたポリペプチドを精
製するためには、本発明の核酸配列を含む宿主細胞を十
分な容量で培養し、生成されたポリペプチドをこのよう
な細胞又はタンパク質が分泌される場合は培地から単離
する。培地に分泌されるポリペプチドは、標準技術、例
えば塩分画、遠心分離、限外濾過、クロマトグラフィ
ー、ゲル濾過又はイムノアフィニティークロマトグラフ
ィーにより単離及び精製され得、細胞内ポリペプチドは
まず該細胞を収集し、例えば音波処理又は他の機械的破
砕手段（例えばフレンチプレス）により細胞を破砕した
後、ポリペプチドを他の細胞内成分から分離し、ポリペ
プチドをワクチンに調製することにより単離され得る。
細胞破砕は化学的（例えばＥＤＴＡ処理）又は酵素的手
段（例えばリゾチーム消化）により実施することもでき
る。
【００７０】上述のように、従来のウイルス弱毒方法に
は欠点がある。常習的な弱毒化方法は、化学物質で処理
することにより特異的突然変異を誘発するか、又は異種
宿主動物もしくは組織培養物で連続継代する。これらの
突然変異がウイルスゲノムでランダムに発生するのはこ
れらの技術の決定的な特徴であり、自発復帰細胞が発生
する場合には、突然変異の位置決めをしたり又はその変
異を反復するのは困難である。組換えＤＮＡ技術の開発
に伴い、ウイルスゲノムを非常に正確に操作する可能性
が生まれた。Ｍｕｒｐｈｙら， （Ｉｍｍｕｎｉｚａｔ
ｉｏｎ ａｇａｉｎｓｔ ｖｉｒｕｓｅｓ， ｉｎ：
Ｆｉｅｌｄｓ， Ｂ．Ｎ．ら編，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ 第
２版， Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ， Ｎ．Ｙ． １９９
０）により記載されているように、ゲノムの突然変異、
例えば非必須遺伝子もしくはその一部の欠失、挿入もし
くは置換、又は調節領域への挿入、置換もしくは欠失等
によりウイルスを弱毒化するいくつかの可能性が存在す
る。
【００７１】ｒｅｃＤＮＡ技術により天然に存在しない
このような弱毒化したＣＡＶ突然変異体を発生させるこ
とが可能な方法の一例を以下に記載する。
【００７２】まず最初に、突然変異が配置され得るＣＡ
Ｖゲノム領域を決定する。これらはコーディング又は非
コーディング領域の両方であり得、例えば調節領域、又
はウイルス接着タンパク質（の一部）をコードする領
域、又は宿主特異性を決定する因子であり得る。
【００７３】次に、組換えベクターの作製について上述
した方法に従って、突然変異、例えば欠失及び／又は挿
入及び／又は置換をウイルスゲノムに導入する。
【００７４】従って、組換えＤＮＡ技術によりゲノムに
導入された突然変異を有する天然に存在しない弱毒ＣＡ
Ｖも本発明の範囲に含まれる。
【００７５】本発明のポリペプチドに対する抗体又は抗
血清は、受動的免疫治療、診断用イムノアッセイ及び抗
イディオタイプ抗体の製造に使用され得る。
【００７６】上記のようなＣＡＶ関連ポリペプチドＯＲ
Ｆ１〜３を使用してポリクローナル（単一特異性）及び
モノクローナルの両方の抗体を製造することができる。
ポリクローナル抗体が所望される場合は、ポリクローナ
ルな抗血清を製造及び処理するための方法は当業者に知
られている（例えばＭａｙｅｒ及びＷａｌｔｅｒ編，Ｉ
ｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ
Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇ
ｙ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｌｏｎｄｏ
ｎ， １９８７）。要約すると、選択された哺乳動物
（例えばウサギ）に上記免疫原の１種を免疫感作当たり
タンパク質約２０μｇ〜約８０μｇの割合で（多重）注
入する。免疫感作は許容可能なアジュバントと共に与え
られ、一般に免疫原とアジュバントは等量とする。許容
可能なアジュバントの例は、フロイント完全、フロイン
ト不完全、ミョウバン沈殿物又はＷ／Ｏエマルジョンを
含み、初期免疫感作にはフロイント完全アジュバントが
好適である。全ブースター免疫感作にはフロイント不完
全アジュバントが好適である。初期免疫感作は、ウサギ
の背中の複数の皮下部位に約１ｍｌのエマルジョンを投
与することにより行われる。等量の免疫原を使用するブ
ースター免疫感作は約１カ月間隔で与えられ、十分な抗
体濃度が各ウサギ血清に存在するまで続けられる。当業
者に既知の方法により血液を採取し、血清を分離する。
【００７７】上記のようにウサギを精製タンパク質で免
疫感作することにより製造した多重特異性抗血清から、
Ｈａｌｌら（Ｎａｔｕｒｅ ３１１， ３７９−３８
７，１９８４）の方法の改良法により免疫原の各々に対
する単一特異性抗体をアフィニティー精製する。本明細
書中で使用する「単一特異性抗体」なる用語は、関連抗
原に対する均一な結合特性を有する単一抗体種又は多重
抗体種として定義される。本明細書中で使用される「均
一な結合」なる用語は、抗体種が特定の抗原又はエピト
ープに結合できることを意味する。
【００７８】近親交配マウス、好ましくはＢａｌｂ／ｃ
を適当なタンパク質で免疫感作することにより、ＣＡＶ
免疫原の各々に対して反応性のモノクローナル抗体が生
成され得る。等量の許容可能なアジュバント中０．５ｍ
ｌ用量当たり約１００ｎｇ〜約１０μｇの免疫原をマウ
スの腹腔内に免疫する。このような許容可能なアジュバ
ントは、フロイント完全、フロイント不完全、ミョウバ
ン沈殿物及びＷ／Ｏエマルジョンを含む。一次免疫後約
１４、２１及び６３日後にアジュバントなしで等量の免
疫原をマウスの静脈にブースター免疫する。最後のブー
スター免疫から約３日後に各マウスの抗免疫原抗体を血
清学的に試験する。当業者に周知の方法（Ｋｏｈｌｅｒ
とＭｉｌｓｔｅｉｎ， Ｎａｔｕｒｅ ２５ ６； ４９
５−４９７， １９７５）により、抗体産生マウスから
脾細胞を単離し、ＳＰ−２／０等のようなマウスミエロ
ーマ細胞と融合する。ダルベッコの改良イーグル培地
（ＤＭＥＭ）のような適当な細胞培養培地でヒポキサン
チン、チミジン及びアミノプテリン中で増殖することに
よりハイブリドーマ細胞を選択した。好ましくはＭａｃ
Ｐｈｅｒｓｏｎの軟質寒天法（Ｓｏｆｔ．Ａｇａｒ Ｔ
ｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ
Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，
Ｋｒｕｓｅ及びＰａｔｅｒｓｏｎ編，Ａｃａｄｅｍｉ
ｃ Ｐｒｅｓｓ， ２７６， １９７３）を使用して抗
体産生ハイブリドーマをクローニングする。個々のコロ
ニーを適当な培養培地で培養するために培養プレートの
個々のウェルに移す。適当な免疫原でスクリーニングす
ることにより、抗体産生細胞を確認する。当業者に既知
の方法により免疫原陽性ハイブリドーマを維持する。ハ
イブリドーマをｉｎ ｖｉｔｒｏで培養することによ
り、又は当業者に既知の手順によりハイブリドーマをマ
ウスに注入した後マウスの腹水を調製することにより特
異的抗モノクローナル抗体を製造する。
【００７９】抗イディオタイプ抗体は、防御が所望され
る病原体の抗原の「固有の構造（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｉ
ｍａｇｅ）」を有するイムノグロブリンであり、ワクチ
ン中で免疫原として使用することができる（Ｄｒｅｅｓ
ｍａｎら，Ｊ． Ｉｎｆｅｃｔ． Ｄｉｓｅａｓｅ １
５１， ７６１， １９８５）。抗イディオタイプ抗体
を製造するための方法は当業者に周知である（ＭａｃＮ
ａｍａｒａら， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２６， １３２
５， １９８４）。
【００８０】本発明のワクチンは従来の有効な免疫感作
手順で投与することができ、即ち投与処方物に適合可能
な方法で予防薬及び／又は治療薬として有効且つ免疫原
性の量を１回又は繰り返して投与する。ワクチンは、例
えば皮内、皮下、筋肉内、腹腔内、静脈内又は鼻孔内に
投与され得る。
【００８１】更に、ワクチンは例えば活性及び／又は貯
蔵寿命を増加するために、多くの場合他の成分と混合し
た水性媒体又は含水懸濁液を含有し得る。これらの成分
は塩、ｐＨ緩衝液、安定剤（例えばスキムミルク又はカ
ゼイン加水分解物）、免疫応答を改良するための乳化剤
アジュバント（例えば油、ムラミルジペプチド、水酸化
アルミニウム、サポニン、ポリアニオン及び両親媒性物
質）及び保存剤であり得る。
【００８２】当然のことながら、本発明のワクチンは更
に多価ワクチンを製造するために、家禽の他の病原体に
関連する免疫原を含んでもよいし、又は感染性気管支炎
ウイルス、ニューカッスル病ウイルス、感染性包嚢病ウ
イルス又はマレーク病ウイルスの抗原のようなこれらの
免疫原をコードする核酸配列を含んでもよい。
【００８３】本発明は更に、本発明のポリペプチドの少
なくとも１種又はその抗原性フラグメントを含有する
「免疫化学的試薬」に係る。
【００８４】「免疫化学的試薬」なる用語は、本発明の
ポリペプチドが適切な支持体に結合しているか又は標識
物質を備えることを意味する。
【００８５】使用可能な支持体は例えば微量試験ウェル
もしくはキュベット、チューブもしくはキャピラリー、
膜、フィルター、テストストリップの内壁、又は例えば
ラテックス粒子、赤血球、染料ゾル、金属ゾルもしくは
ゾル粒子としての金属化合物のような粒子の表面であ
る。
【００８６】使用可能な標識物質は特に、放射性同位
体、蛍光化合物、酵素、染料ゾル、金属ゾル又はゾル粒
子としての金属化合物である。
【００８７】本発明の核酸配列は、任意の種類の組織中
でＣＡＶ関連核酸を検出するためのハイブリダイゼーシ
ョン実験で用いられる特異的プローブを設計するために
も使用され得る。
【００８８】本発明は更に、ＣＡＶ感染の診断に有用な
該核酸配列を含むテストキットも提供する。
【００８９】本発明は更に、イムノアッセイで使用され
るテストキットにも係り、該テストキットは本発明の少
なくとも１種の免疫化学的試薬を含む。
【００９０】このテストキットを使用して行われる免疫
化学反応は好ましくはサンドイッチ反応、凝集反応、競
合反応又は阻害反応である。
【００９１】サンドイッチ反応を実施するために、テス
トキットは例えば固体支持体（例えば微量試験ウェルの
内壁）に結合した本発明のポリペプチドと、本発明の標
識化ポリペプチド又は標識化抗抗体のいずれかとから構
成され得る。
【００９２】
【実施例】実施例１ ＣＡＶ株２６Ｐ４の起源 Ｉｎｔｅｒｖｅｔ Ａｍｅｒｉｃａ（Ｍｉｌｌｓｂｏｒ
ｏ， ＤＥＬ）で（ＣＡＶに対して血清陰性であった）
８週齢センチネルＳＰＦニワトリを、ＣＡＶ感染に対し
て血清変換の徴候を示すトリの存在下で飼育した。２週
間後、これらのセンチネルトリの肝臓のＲＰＭＩ中２０
％ｖ／ｖホモジネートを作り、０．２μｍフィルターで
濾過した。この濾液をＣＡＶに適切な宿主細胞（Ｇｏｒ
ｙｏら，Ａｖｉａｎ ｐａｔｈｏｌｏｇｙ １６， １
４９−１６３， １９８７）であるＭＤＣＣ−ＭＳＢ１
細胞（Ａｋｉｙａｍａ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｋｅｎ
Ｊ．１７， １０５−１１７， １９７４）と共に組織
培養フラスコ中でインキュベートした。単離物の１つ２
６Ｐ４は、ＣＰＥ及び、ＵＳＤＡにより提供される陽性
抗ＣＡＶ血清で陽性の免疫蛍光反応を示したことからＣ
ＡＶとして同定した。
【００９３】２６Ｐ４の培養 従来技術（Ｇｏｒｙｏら， 上掲）に従って組織培養フ
ラスコ中ＭＤＣＣ−ＭＳＢ１細胞上で２６Ｐ４ウイルス
の培養を実施した。
【００９４】ウイルスゲノムのクロ ーニング ＣＡＶ株２６Ｐ４のウイルスＤＮＡの複製形（ＲＦ）を
単離するために、１０6細胞／ｍｌを含むＭＳＢ１細胞
の培養物５００ｍｌを調製し、約１０6 ＴＣＩＤ５０
／ｍｌのウイルス力価でこの培養物に感染させた。標準
Ｈｉｒｔ抽出（ＭｃＭａｓｔｅｒら， Ｊ． Ｖｉｒｏ
ｌ ３８，３１７−３２６， １９８１）を使用してウ
イルスＤＮＡを調製した。感染後ＲＦウイルスＤＮＡの
最大量が得られる時点は、経時変化実験で感染後３０時
間であることが判明した。
【００９５】感染細胞からのＤＮＡを０．８％アガロー
ス／エチジウムブロミドゲルで分析し、標準プロトコル
（Ｍａｎｉａｔｉｓら， １９８９， 上掲）に従って
ＮＡ４５ ＤＥＡＥ膜（ＳｃｈｌｅｉｃｈｅｒとＳｃｈ
ｕｌｌ）を使用して環状のウイルスＲＦ ＤＮＡを示す
１．７ｋｂバンドをアガロースゲルから単離した。
【００９６】ウイルスＤＮＡ５００ｎｇを、２５μｌ容
量中Ｈｉｎｄ ＩＩＩ又はＢａｍＨＩ制限エンドヌクレ
アーゼのいずれか２０Ｕで消化した。同様に細菌プラス
ミドｐＧＥＭ ７ｚｆ＋（Ｐｒｏｍｅｇａ ｃｏｒ
ｐ．）２μｇをＨｉｎｄ ＩＩＩ又はＢａｍＨＩのいず
れかで消化し、脱リン酸化し、プロテイナーゼＫ（Ｍａ
ｎｉａｔｉｓら， １９８９， 上掲）と共にインキュ
ベートした。ベクター及び挿入用ＤＮＡ調製物をフェノ
ール／クロロホルム抽出し、９６％エタノール２容及び
ｐＨ６．０の３Ｍ酢酸ナトリウム１／１０容で沈殿させ
た。標準手順（Ｍａｎｉａｔｉｓら， １９８９， 上
掲）に従ってＴ４ ＤＮＡリガーゼを用いてベクターと
挿入用ＤＮＡを連結した。連結混合物を使用して大腸菌
ＤＨ５αコンピテント細胞（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ ｃｏｒ
ｐ．）を形質転換させ、その後、１００μｇ／ｍｌアン
ピシリン（Ａｐ）を含有するＬＢ−寒天プレート上で培
養した。プラスミドＤＮＡをＡｐ耐性コロニーから単離
し、制限酵素分析により２．３ｋｂ挿入物をスクリーニ
ングした。
【００９７】２つのプラスミドは、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ消
化２．３ｋｂ ＣＡＶ ＲＦ ＤＮＡを含むｐＣＡ１、
及びｐＣＡ１に対して逆方向に挿入されたＢａｍＨＩ消
化ＣＡＶ ＲＦ ＤＮＡを含むｐＣＡ３として同定され
た。両方のプラスミドの制限パターンを図１及び図２に
示す。
【００９８】実施例２ ＤＮＡ配列分析 ＣＡＶゲノムのＤＮＡ配列を決定するために、Ｈｅｎｉ
ｋｏｆｆ（Ｇｅｎｅ ２８， ３５１， １９８４）に
従って漸次欠失したフラグメントを作製し、５μｇのｐ
ＣＡ１及びｐＣＡ３をＳｐｈ Ｉ、次いでＣｌａ Ｉ制
限酵素と共にインキュベートした。プロテイナーゼＫイ
ンキュベーション、フェノール／クロロホルム処理及び
エタノール沈殿後、増大するインキュベーション時間間
隔でサンプルをエキソヌクレアーゼＩＩＩと共にインキ
ュベートした。ＤＮＡフラグメントをＳ１ヌクレアーゼ
及びＫｌｅｎｏｗポリメラーゼで平滑末端化し、最後に
Ｔ４ ＤＮＡリガーゼで環化し、大腸菌ＤＨ５αコンピ
テント細胞に形質転換させ、アンピシリンプレート上で
平板培養した。耐性コロニーからのプラスミドＤＮＡの
挿入物のサイズを分析した。
【００９９】微量調製物の二重鎖プラスミドＤＮＡに対
しジデオキシチェーンターミネーション法を直接使用し
てＳａｎｇｅｒら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ． ＵＳＡ ７４， ５４６３， １９７７）によ
り報告されているようにＤＮＡ配列分析を実施した。ｐ
ＧＥＭ ７ｚｆ＋多重クローニング部位の上流及び下流
に直接ハイブリダイズするＴ７及びＳｐ６プロモーター
プライマーを使用した。
【０１００】配列データを収集し、Ｇｅｎｅ Ｍａｓｔ
ｅｒプログラム（ＢｉｏＲａｄ ｃｏｒｐ．）を使用し
てＩＢＭ ＰＣで解析した。
【０１０１】実施例３ ＯＲＦ１を含むＣＡＶ Ｄ ＮＡの、シチメンチョウヘ ル
ペスウイルス（ＨＶＴ） のウイルスゲノムへの挿入 実施例１に要約したようにＣＡＶ ＲＦ ＤＮＡを単離
した。ＨＶＴに挿入及び有効に発現させるためのＯＲＦ
１を作製するために、特に最初のＡＴＧコドンに先行
する配列を最小のリーダー配列となるように削減しなけ
ればならなかった。そのために、２μｇのＣＡＶ ＲＦ
ＤＮＡを制限酵素Ａｐａ Ｉ及びＭｒｏＩで消化し
た。これらの消化によりＣＡＶ ＲＦ ＤＮＡの直鎖状
分子が得られ、ＯＲＦ １は中央に位置し、ＯＲＦ １
の最初のＡＴＧはＭｒｏ Ｉ部位の側に位置する。イン
キュベーション、フェノール抽出及びエタノール沈殿
後、実施例２に記載したように増大するインキュベーシ
ョン時間間隔でこれらのフラグメントをエキソヌクレア
ーゼＩＩＩと共にインキュベートし、平滑末端にした。
エキソヌクレアーゼは、Ａｐａ Ｉからのように３’オ
ーバーハンギング部位を消化することができないので、
ＲＦ ＤＮＡフラグメントはＯＲＦ １の最初のＡＴＧ
の方向にＭｒｏ Ｉ部位から消化される。平滑化したフ
ラグメントを、リン酸化しておいた５０倍モル過剰のＥ
ｃｏＲ Ｖリンカー（Ｂ．Ｍａｎｎｈｅｉｍｃｏｒ
ｐ．）に標準手順に従ってＴ４リガーゼで連結した。リ
ンカー連結混合物をＥｃｏＲ Ｖで消化し、６５℃で１
０分間不活化した。この混合物をＥｃｏＲＶで消化し且
つ脱リン酸化したｐＧＥＭ５ｚｆ＋ベクター（Ｐｒｏｍ
ｅｇａ ｃｏｒｐ．）５００ｎｇに連結した。連結混合
物を大腸菌ＤＨ５αコンピテント細胞に形質転換し、Ａ
ｐプレート上で平板培養した。Ａｐａ Ｉ及びＳｐｅ
Ｉによる二重消化により、プラスミド挿入物の残りのサ
イズについて耐性コロニーのミニプレパレーションＤＮ
Ａ単離物を分析した。約１．９ｋｂのサイズを有する挿
入物の向きを制限分析により調べ、Ｓｐ６又はＴ７プラ
イマーのいずれかを用いてサンガー配列決定法により試
験した。
【０１０２】こうしてＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すよ
うに１〜４７５に連続するヌクレオチド８６０〜２２９
８の配列から構成される１．９ｋｂ ＣＡＶ挿入物を有
するプラスミドｐＣＡ４を作製し、ＥｃｏＲ Ｖリンカ
ーに連結し、ＥｃｏＲ Ｖ消化ｐＧＥＭ５ｚｆ＋に挿入
した。特に、挿入物の最初のＡＴＧに先行する短いリー
ダー配列をサンガー配列決定法により分析した処、付加
的なＡＴＧコドンを含まないことが判明した。
【０１０３】Ｉｇａｒａｓｈｉ， Ｔ．ら（Ｖｉｒｏｌ
ｏｇｙ １５７， ３５１， １９８７）により報告さ
れているようなＨＶＴのゲノム構造に基づいて、ウイル
スの非反復の短い配列エレメント（Ｕｓ）中の領域を外
来遺伝子の挿入のために選択した。ＨＶＴ感染ＣＥＦか
ら全ＤＮＡを部分的に消化することにより構築したλＥ
ＭＢＬ３ライブラリーから対応するＤＮＡフラグメント
をスクリーニングした。ＢａｍＨＩ制限部位の不在によ
り特徴付けられる、λ単離物の１つの挿入物をλＨＶＴ
０４と命名し、物理的マッピング（図４）により詳細に
分析した。１７．５ｋｂの挿入フラグメント中に存在す
る配列は、逆反復構造の部分を含むＵｓ領域の大部分を
示した（Ｉｇａｒａｓｈｉ， Ｔ．ら，１９８７， 上
掲）。λＨＶＴ０４からの１．２ｋｂのＸｈｏＩ制限フ
ラグメントの１つをＳａｌＩで消化したｐＧＥＭ３Ｚに
サブクローニングし、ＤＮＡフラグメントの挿入に使用
可能な非反復ＢｇｌＩＩ部位を含むプラスミドｐＭＤＯ
７を形成した。
【０１０４】ＨＶＴウイルスのゲノムに挿入後に外来遺
伝子を発現させることが可能な強力なプロモーターをラ
ウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）のＬＴＲ配列から選択し
た。このプロモーターをｐＲＳＶｃａｔ（Ｇｏｒｍａｎ
ら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．
７９， ６７７７， １９８２）からの５８０ｂｐＮｄ
ｅＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ制限フラグメント上にマッピング
し、該フラグメントの両方の部位で二重鎖合成リンカー
によりｐＧＥＭ３Ｚ（Ｐｒｏｍｅｇａ）のＨｉｎｄＩＩ
Ｉ及びＰｓｔＩ部位の間に挿入した。ベクターｐＧＥＭ
３ＺからのＨｉｎｄＩＩＩ部位とＬＴＲ−プロモーター
を有するＲＳＶフラグメントのＮｄｅＩ部位との間の結
合は、一方の部位でＨｉｎｄＩＩＩ、他方の部位でＮｄ
ｅＩに適合可能な付着末端を含む３０ｂｐリンカーを用
いて行った。しかしながら、連結後、両方の制限部位
は、６塩基対認識配列の外側ヌクレオチドの故意の改変
により復元されない。これらの２つの部位を除去するだ
けでなく、リンカーそれ自体の内側に存在する新しい制
限部位（ＢａｍＨＩ）を、対応する位置に形成した。Ｌ
ＴＲフラグメントからのＨｉｎｄＩＩＩ部位をｐＧＥＭ
３ＺからのＰｓｔＩ部位に結合する第２の２０ｂｐリン
カーを合成したが、この場合どちらの末端の認識配列も
破壊せず、ｐＧＥＭ３Ｚのポリリンカーに既に存在する
切断部位例えばＰｓｔＩ、ＳａｌＩ、ＸｈｏＩ及びＢａ
ｍＨＩに、３つの便利な非反復制限部位ＢｇｌＩＩ、Ｘ
ｈｏＩ及びＥｃｏＲＶを付加した。したがって、形成さ
れるｐＧＥＭ３Ｚの誘導体ｐＶＥＣＯ１はＬＴＲプロモ
ーター配列を有する６５０ｂｐ制限フラグメントと、そ
の直後に配置された、外来遺伝子を挿入するために使用
可能な７個の制限部位とを含む。６５０ｂｐフラグメン
トはその一方の側にＢａｍＨＩ制限部位を有しており、
このフラグメントをｐＭＤＯ７からの１．２ｋｂＨＶＴ
挿入物中に存在する非反復ＢｇｌＩＩ部位にそのまま移
した。これらの２つの制限酵素により形成された付着末
端は相互に適合可能であるが、連結すると、ＢｇｌＩＩ
又はＢａｍＨＩの元の認識配列のいずれもが復元しな
い。ＴＲに向かう向きにＬＴＲを有する構築物の１つを
ｐＶＥＣＯ４と命名し、制限マッピング（図５）により
分析した。この汎用ＨＶＴ組換えベクターの構造は、Ｌ
ＴＲプロモーターのすぐ下流に外来遺伝子を挿入するこ
とができ、その後、ｉｎ ｖｉｖｏ組換えによりＨＶＴ
ゲノムに完全な発現カセットを組み込むことができるよ
うに構成される。さらに多重遺伝子挿入を実現できるよ
うに、ＬＴＲの下流の種々の制限部位、特に酵素Ｂｇｌ
ＩＩ、ＸｈｏＩ及びＥｃｏＲＶの制限部位の位置を設計
する。
【０１０５】ｐＣＡ４からのＣＡＶ ＤＮＡ挿入物をＥ
ｃｏＲＶ消化によりプラスミドから取り出し、ＥｃｏＲ
Ｖで消化し且つ脱リン酸化したｐＶＥＣＯ４に挿入し
た。もう一度挿入フラグメントの向きを調べ、右向きの
プラスミドをｐＣＡ５と命名した。
【０１０６】Ｇｒａｈａｍ， Ｆ．及びｖ．ｄ． Ｅ
ｂ， Ａ．（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５２， ４５６， １
９７３）によるリン酸カルシウムＤＮＡ沈殿に基づく方
法により、プラスミドｐＣＡ５からの線状化ＤＮＡを、
ＨＶＴ感染細胞から調製した全ＤＮＡと共にＣＥＦに導
入した。構築物からのプラスミドＤＮＡ２μｇを最終容
量５６０μｌ Ｈ2Ｏ中ＨＶＴ感染細胞からの線状ＤＮ
Ａ１５μｇと混合し、ＨＢＳＰ（２０ｍＭ ＫＣｌ、５
６０ｍＭ ＮａＣｌ、２４ｍＭグルコース、３ｍＭ Ｎ
ａ2ＨＰＯ4、１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０）７
５０μｌに加えた。１Ｍ ＣａＣｌ2溶液１９０μｌを
漸次加え、混合物を室温で３０分間インキュベートする
ことにより沈殿を形成した。一方、２％ウシ胎児血清を
補充したイーグル最小必須培地のグラスゴー改良培地に
基づく組成を有する培地６／Ｂ８に１０日齢胚からの二
次ＣＤＦの懸濁液１５ｍｌを１ｍｌ当たり細胞５×１０
5個の密度でφ１０ｃｍの皿に接種した。リン酸カルシ
ウムで沈殿したＤＮＡを細胞懸濁液に静かに加え、空気
中５％ＣＯ2を含有する腐食化インキュベータで３７℃
で皿をインキュベートした。５時間後、培地を除去し、
等容量のＨＢＳＰ及び３０％グリセロールを含有する溶
液１０ｍｌを細胞に重層した。１〜２分間のインキュベ
ーション後、溶液を除去し、細胞を培地６／Ｂ８で洗浄
し、皿を新しい培地と共に３〜５日間ウイルスＣＰＥが
生じるまでインキュベートした。これらのＣＡＶ抗原に
対する特異的な一価又は多価抗血清を使用して免疫蛍光
染色によりＣＡＶ関連ポリペプチドを発現するＨＶＴ組
換え体の検出を行った。
【０１０７】配列表 （１）一般情報： （ｉ） 出願人： （Ａ） 名称： ＡＫＺＯ ＮＶ （Ｂ） 番地： Ｖｅｌｐｅｒｗｅｇ ７６ （Ｃ） 都市名： Ａｒｎｈｅｍ （Ｅ） 国名： オランダ国 （Ｆ） 郵便番号（ＺＩＰ）： ６８２４ ＢＭ （ｉｉ） 発明の名称： ニワトリ貧血ウイルスワクチ
ン及び診断法 （ｉｉｉ） 配列の数： ４ （ｖ） コンピュータ読み取り可能形： 適用不可 （２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の情報： （ｉ） 配列の特徴： （Ａ） 配列の長さ： ２２９８塩基対 （Ｂ） 配列の型： 核酸 （Ｃ） 鎖の数： １本鎖 （Ｄ） トポロジー： 環状 （ｉｉ） 分子の型： ＤＮＡ（ゲノム） （ｖｉ） 起源： （Ａ） 生物名： ニワトリ貧血ウイルス （Ｃ） 株名： ２６Ｐ４ （ｉｘ） 特徴： （Ａ） 特徴を表す記号： ＣＤＳ （Ｂ） 存在位置： ８７６〜２２２５ （Ｄ） 他の情報： ／ラベル＝ＯＲＦ１ （ｉｘ）特徴： （Ａ） 特徴を表す記号： ＣＤＳ （Ｂ） 存在位置： １０１〜５０２ （Ｄ） 他の情報： ／ラベル＝ＯＲＦ２ （ｉｘ）特徴： （Ａ） 特徴を表す記号： ＣＤＳ （Ｂ） 存在位置： ４０３〜１０５３ （Ｄ） 他の情報： ／ラベル＝ＯＲＦ３
【０１０８】
【化１】
【０１０９】
【化２】
【０１１０】
【化３】
【０１１１】（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の情報： （ｉ） 配列の特徴： （Ａ） 配列の長さ： ４４９アミノ酸 （Ｂ） 配列の型： アミノ酸 （Ｄ） トポロジー： 直鎖状 （ｉｉ） 分子の型： タンパク質
【０１１２】
【化４】
【０１１３】
【化５】
【０１１４】
【化６】
【０１１５】（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３の情報： （ｉ） 配列の特徴： （Ａ） 配列の長さ： １３３アミノ酸 （Ｂ） 配列の型： アミノ酸 （Ｄ） トポロジー： 直鎖状 （ｉｉ） 分子の型： タンパク質
【０１１６】
【化７】
【０１１７】（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４の情報： （ｉ） 配列の特徴： （Ａ） 配列の長さ： ２１６アミノ酸 （Ｂ） 配列の型： アミノ酸（Ｄ） トポロジー：
直鎖状 （ｉｉ） 分子の型： タンパク質
【０１１８】
【化８】
【０１１９】
【化９】
【図面の簡単な説明】
【図１】ＨｉｎｄＩＩＩ消化により線状化された分子と
してのプラスミドｐＣＡ１のエンドヌクレアーゼ制限酵
素パターンを示す。
【図２】ＢａｍＨＩ消化により線状化された分子として
のプラスミドｐＣＡ３のエンドヌクレアーゼ制限酵素パ
ターンを示す。
【図３】陰影領域はＣＡＶ株２６Ｐ４のＲＦ ＤＮＡの
ＤＮＡ配列中に存在するオープンリーディングフレーム
（ＯＲＦ）を示す。ＯＲＦは上から下に向かってＯＲＦ
１、ＯＲＦ２及びＯＲＦ３とする。ＣＡＶ ＲＦ ＤＮ
ＡはＤｒａＩ消化により線状化された分子として示され
る。
【図４】ＨＶＴゲノムのＵｓ領域に本質的に対応するＤ
ＮＡフラグメントの制限酵素地図である。４つのオープ
ンリーディングフレームとその間の非コード配列とから
構成される挿入領域の相対位置を示す。
【図５】ｐＭＤＯ７からの１．２ｋｂ ＸｈｏＩ ＨＶ
Ｔフラグメントの非反復ＢｇｌＩＩ部位に挿入されるＬ
ＴＲ−プロモーターを示すｐＶＥＣＯ４の制限酵素地図
である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｑ 1/68 8114−4Ｂ Ｇ０１Ｎ 33/569 Ｌ 9015−2Ｊ (72)発明者 ヨハンネス・アントニウス・ヨセフ・クラ エツセンス オランダ国、5831・エム・エル・ボツクス メール、メース・25

Claims (20)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ＣＡＶ関連ポリペプチドをコードする核
    酸配列。
  2. 【請求項２】 該配列がａ．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に
    示すアミノ酸配列を有するＯＲＦ１、ｂ．ＳＥＱ ＩＤ
    ＮＯ：３に示すアミノ酸配列を有するＯＲＦ２、ｃ．
    ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に示すアミノ酸配列を有するＯ
    ＲＦ３、及びその機能的等価物から構成される群から選
    択されるポリペプチドの少なくとも一部をコードするこ
    とを特徴とする請求項１に記載の核酸配列。
  3. 【請求項３】 ＣＡＶゲノムの少なくとも一部を含む核
    酸配列。
  4. 【請求項４】 該配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示す
    デオキシリボ核酸配列の少なくとも一部を含むことを特
    徴とする請求項３に記載の核酸配列。
  5. 【請求項５】 該核酸配列が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１
    に示す８７６〜２２２５、１０１〜５０２又は４０３〜
    １０５３位に位置するＤＮＡ配列の少なくとも一部を含
    むことを特徴とする請求項４に記載の核酸配列。
  6. 【請求項６】 請求項１から５のいずれか一項に記載の
    核酸配列を含む組換え核酸分子。
  7. 【請求項７】 核酸配列が発現制御配列に作動的に結合
    していることを特徴とする請求項６に記載の組換え核酸
    分子。
  8. 【請求項８】 請求項１から５のいずれか一項に記載の
    核酸配列を含むベクターウイルス。
  9. 【請求項９】 請求項１から５のいずれか一項に記載の
    核酸配列又は請求項６もしくは７に記載の組換え核酸分
    子で形質転換されるか又は請求項８に記載のベクターウ
    イルスを含む宿主細胞。
  10. 【請求項１０】 ＣＡＶ関連抗原の免疫学的特徴を有す
    るポリペプチド。
  11. 【請求項１１】 ａ．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示すア
    ミノ酸配列を有するＯＲＦ１、ｂ．ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
    Ｏ：３に示すアミノ酸配列を有するＯＲＦ２、ｃ．ＳＥ
    Ｑ ＩＤ ＮＯ：４に示すアミノ酸配列を有するＯＲＦ
    ３、及びその機能的等価物から構成される群から選択さ
    れるアミノ酸配列の少なくとも一部を含むことを特徴と
    する請求項１０に記載のポリペプチド。
  12. 【請求項１２】 請求項１から５のいずれか一項に記載
    の核酸配列によりコードされるＣＡＶ関連ポリペプチ
    ド。
  13. 【請求項１３】 請求項１０から１２のいずれか一項に
    記載のポリペプチドに対して免疫反応性の抗体又は抗血
    清。
  14. 【請求項１４】 組換えＤＮＡ技術によりＣＡＶゲノム
    に導入される突然変異の結果として得られることを特徴
    とする天然に産生されない弱毒ＣＡＶ。
  15. 【請求項１５】 請求項７に記載の組換え核酸分子、請
    求項８に記載のベクターウイルス、請求項９に記載の宿
    主細胞、請求項１０から１２のいずれか一項に記載のポ
    リペプチド又は請求項１４に記載のＣＡＶを含むことを
    特徴とする家禽をＣＡＶ感染から保護するためのワクチ
    ン。
  16. 【請求項１６】 請求項９に記載の宿主細胞を培養し、
    その後、ＣＡＶ含有物質を集めて、免疫活性を有する医
    薬製剤に加工することを特徴とするＣＡＶワクチンの製
    造方法。
  17. 【請求項１７】 請求項１０から１２のいずれか一項に
    記載のポリペプチドを、免疫活性を有する医薬製剤に加
    工することを特徴とするＣＡＶワクチンの製造方法。
  18. 【請求項１８】 請求項１５に記載の有効量のワクチン
    を動物に投与することを特徴とする、家禽をＣＡＶ感染
    から保護するための方法。
  19. 【請求項１９】 請求項１０から１２のいずれか一項に
    記載のポリペプチドを含む免疫化学的試薬。
  20. 【請求項２０】 請求項１９に記載の免疫化学的試薬を
    含む、イムノアッセイを実施するためのテストキット。
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