HU215531B - Rekombináns Avipox vírusok, a vírusokkal fertőzött sejttenyészetek, a vírusokat tartalmazó, baromfiak oltására alkalmas vakcinák, a vírusok kialakítására alkalmas transzfer szekvenciák, ilyeneket tartalmazó plazmidok, valamint eljárások ezek előállítására - Google Patents

Rekombináns Avipox vírusok, a vírusokkal fertőzött sejttenyészetek, a vírusokat tartalmazó, baromfiak oltására alkalmas vakcinák, a vírusok kialakítására alkalmas transzfer szekvenciák, ilyeneket tartalmazó plazmidok, valamint eljárások ezek előállítására Download PDF

Info

Publication number
HU215531B
HU215531B HU9201746A HU9201746A HU215531B HU 215531 B HU215531 B HU 215531B HU 9201746 A HU9201746 A HU 9201746A HU 9201746 A HU9201746 A HU 9201746A HU 215531 B HU215531 B HU 215531B
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
virus
sequence
viruses
recombinant
protein
Prior art date
Application number
HU9201746A
Other languages
English (en)
Other versions
HUT62331A (en
HU9201746D0 (en
Inventor
Didier Colau
Catherine De Wannemaeker
Daniel Malarme
Georges Thiry
Original Assignee
Dimminaco Ag/Sa/Ltd.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Dimminaco Ag/Sa/Ltd. filed Critical Dimminaco Ag/Sa/Ltd.
Priority to HU9802975A priority Critical patent/HU9802975D0/hu
Publication of HU9201746D0 publication Critical patent/HU9201746D0/hu
Publication of HUT62331A publication Critical patent/HUT62331A/hu
Publication of HU215531B publication Critical patent/HU215531B/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/44—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from protozoa
    • C07K14/455—Eimeria
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/24011—Poxviridae
    • C12N2710/24041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/24043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/20011—Coronaviridae
    • C12N2770/20022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

A találmány tárgyát Avipox vírusból, közelebbről a szárnyasokhimlőjéért felelős, Fowlpox elnevezésű vírusból származó rekombinánsvírusok képezik. A találmány tárgyát képezik továbbá a találmányszerinti vírusokkal fertőzött sejttenyészetek, a vírusokat tartalmazóvakcinák és eljárások ezek előállítására, valamint a vírusokalkalmazása vektorként. A találmány tárgyát képeziktranszferszekvenciák is, melyek alkalmasak heterológ kódolószekvenciákrekombináns vírusok genomjába történő beépítésére, valamint az ilyenszekvenciákat hordozó plazmidok. A találmány szerinti rekombinánsvírusok genomjuk egy nem esszenciális részében, közelebbről a TIR-ek(terminális invertált ismétlődő régiók) intergénes régiójában legalábbegy olyan DNS-szekvenciát hordoznak, amely egy heterológ fehérjeegészét vagy részét kódolja. ŕ

Description

A találmány tárgyát Avipox vírusból, közelebbről a szárnyasok himlőjéért felelős, Fowlpox elnevezésű vírusból származó rekombináns vírusok képezik. A találmány tárgyát képezik továbbá a találmány szerinti vírusokkal fertőzött sejttenyészetek, a vírusokat tartalmazó vakcinák és eljárások ezek előállítására, valamint a vírusok alkalmazása vektorként. A találmány tárgyát képezik transzferszekvenciák is, melyek alkalmasak heterológ kódolószekvenciák rekombináns vírusok genomjába történő beépítésére, valamint az ilyen szekvenciákat hordozó plazmidok.
A szárnyasok himlőjéért felelős vírus vagy Fowlpox vírus (FPV) a Poxviridae család Avipox nemzetségébe tartozik.
A Fowlpox vírus a Pox (himlő-) vírusokra jellemző tulajdonságokkal bír. Ezek nagyméretű vírusok, amelyek genomja egy lineáris, kettős szálú, mintegy 300 kb-os DNS-molekula, és amelynek egyszálú végei kovalensen kötöttek. A genomból mintegy 20 kb-nyi részt szekvenáltak, különösen a terminális invertált ismétlődő szekvenciát (az angol „Terminál Inverted Repeat sequence” kifejezés alapján rövidítése TIR) [Campbell J. A., Μ. M. Binns, F. M. Tomley, Μ. E. G. Boursnell, J. Gén. Virol. 70; 145-154 (1989); Tomley és munkatársai, J. Gén. Virol. 69, 1025-1040 (1988)]. A terminális invertált ismétlődő szekvenciák két azonos hosszúságú szekvenciából állnak, amelyek a genom mindkét végén jelen vannak, egymáshoz képest fordított orientációban.
Az első olyan vakciniavírus vagy Vaccinia, amelyet idegen fehérjék kifejezésére képes, élő rekombináns vírusként kifejlesztettek, a Pox vírus volt. A kifejezett fehérjék sora igen hosszú. Különösen a számos idegen antigén kifejezése tette lehetővé a különböző betegségek elleni immunizálások megvalósítását.
A Fowlpox vírusnak vakcina készítésére szolgáló heterológ fehérjék expresszálásának vektoraként való alkalmazását, azaz olyan rekombináns vírus alkalmazását, amely saját genomjának nem kódoló intergénes régiójában integráltan egy heterológ proteint kódoló DNS-szekvenciát tartalmaz, a 0 314 569 számú európai szabadalmi bejelentésben írták le; ez a régió egy rövid, 32 nukleotidból álló szekvencia, amely a 7 és 9 nyílt leolvasási keretek (a továbbiakban az angol „Open Reading Frames” név alapján ORF) között helyezkedik el, és genetikusán egy nem esszenciális inszerciós helyre elrendezett. Az ilyen rövid intergénes régiókban nagy a kockázata annak, hogy az inszerció elválaszt egy transzkripciós szignált a génjétől, és ezáltal egy olyan mutációt hoz létre, amely a gént inaktiválja. Ez valóban látható is; ez a 32 nukleotidból álló szekvencia egy esszenciális régiónak tűnik, mivel ki kellett terjeszteni 55 nukleotidosra annak érdekében, hogy elkerüljük az ORF 9 promoter és az ORF 7 3’-t kódoló szekvenciája között lehetséges átlapolási. Továbbá az ORF 7-et az ORF 9-től elválasztó régió esetén a természetes szekvenciába való inszerció meglehetősen instabil [Spehner és munkatársai, J. of Virol., 64, 527-533 (1990)], és lényeges az előzetes megtervezése. Azonban a rövid intergénes régiók elrendezési terve nem általánosítható.
Javasolták továbbá olyan rekombináns Fowlpox vírus és más rekombináns szárnyashimlővírusok konstruálását, amelyekben a timidin-kináz génbe inszertálnak egy idegen DNS-t, ennek leírása a W088/02022 közzétételi számú európai szabadalmi bejelentésben szerepel. Ez az inszerció egy mutációt hoz létre a génben, amely gyengítheti a vírus fertőzőképességét. Ez a törzs túlzott gyengítésének kockázatát és a rekombináns vírusból származó vakcina csökkent immunogén hatását rejti magában.
Egy rekombináns Fowlpox vírus heterológ fehérjék expressziójának vektoraként való alkalmazását ismertetik a 0 353 851 számú európai szabadalmi leírásban. Az idegen génnek a vírus genomjába való inszercióját a terminális invertált ismétlődő szekvenciában lévő nyílt leolvasási keretben (ORF) hajtják végre. Az ORF-be egy vagy több idegen gén inszerciója egy olyan gén mutációjának kockázatát jelenti, amelynek funkciója nem ismert.
A találmány szerint más régiókat javasolunk egy vagy több idegen génnek a vírus genomjába való beépítésére, ezzel az előzőekben említett inszerciós régiókkal járó hátrányokat elkerüljük.
Ebben a tekintetben a találmány tárgyát képezi egy legyengített Avipox vírustörzsből származó rekombináns Avipox vírus, amely genomjának nem esszenciális részében legalább egy olyan DNS-szekvenciát tartalmaz, amely az Avipox vírusra nézve heterológ fehérjét vagy annak egy részét kódolja, valamint a rekombináns vírus tartalmaz még olyan elemeket, amelyek ezen fehérjének a rekombináns vírussal fertőzött sejtben való expresszióját biztosítják, a genom nem esszencális része az Avipox vírus egy nem kódoló intergénes régiójából áll, egy olyan régióból, amely két, az expressziószignálokat magában foglaló nyílt leolvasási keret között helyezkedik el.
Az Avipox vírus genomjának nem esszenciális részén egy olyan régiót értünk, amely módosítható anélkül, hogy a vírus in vitro és in vivő fejlődésében érintett funkciókat érintené. Nem esszenciális részként a genom egy nem kódoló intergénes régióját választottuk, amely két ORF között helyezkedik el, amelyek expressziós szignáljukat is tartalmazzák.
A találmány szerinti intergénes régiók nagyok, így minimális annak kockázata, hogy egy inszerció elválasztja a transzkripciós szignálokat a nekik megfelelő géntől, és nincs szükség elrendezésükre sem. Ezenfelül ezeknek az intergénes régióknak a szekvenciái nem kódolóak, ezért nem áll fenn annak veszélye, hogy egy ORF-en belül mutáció következzen be. Nagy tartományon olyan tartományt értünk, amely legalább 60 nukle otidból álló szekvenciát tartalmaz. Általában olyan régiót választunk, amelynek szekvenciája több mint 100 nukleotidból áll. Előnyösen több mint 200 nukleotidból álló szekvenciát tartalmazó régiót választunk. Különösen előnyösen olyan régiót választunk, amely 400-nál több nukleotidból álló szekvenciát tartalmaz.
Továbbá általában olyan intergénes régiót választunk, amelybe legalább egy DNS-szekvencia van klónozva, és az Avipox vírus két TIR-régiója közül az
HU 215 531 Β egyikben helyezkedik el. Általában legalább egy DNSszekvenciát klónozunk az Avipox vírus két TIR-régiója közül legalább az egyikbe. Előnyösen a vírus mindkét TIR-régiójába legalább egy DNS-szekvencia van klónozva. Még előnyösebben a βΐ régió jelölésű intergénes régiót és/vagy a β2 régió jelölésű intergénes régiót választjuk, a βΐ régió jelölésű intergénes régió az 1675 és 2165 számú nukleotidok között helyezkedik el, a β2 régió jelölésű intergénes régió a 2672 és 3605 számú nukleotidok között helyezkedik el, kezdő nukleotidként a TIR-régiókban jelen lévő BamHI restrikciós helyet vesszük. Ez a BamH 1 restrikció hely, amelyet az intergénes régiók elhelyezésére választunk, a Tomley és munkatársai [J. Gén. Virol. 69, 1025-1040. (1988)] által ismertetett szekvencia első nukleotidja. Ezek a találmány szerinti régiók a következő módon is meghatározhatók: a βΐ régió jelölésű intergénes régió az ORF1 és ORF2 jelölésű nyílt leolvasási keretek között helyezkedik el, az ORF1 a 416 számú nukleotid - az ATG A nukleotidja - és az 1674 számú nukleotid - a stopkodon 3. nukleotidja - között helyezkedik el, és az ORF2 a 2166 számú nukleotid - az ATG A nukleotidja
- és a 2671 számú nukleotid - a stopkodon 3. nukleotidja között helyezkedik el, kiindulási nukleotidként a TIR-ekben lévő BamH 1 restrikciós hely szerepel, és a β2 régió jelölésű intergénes régió az ORF2 és az ORF3 között helyezkedik el, az ORF2 jelölésű nyílt leolvasási keret a 2166 számú nukleotid - az ATG A nukleotidja - és a 2671 számú nukleotid - a stopkodon 3. nukleotidja - között helyezkedik el, és az ORF3 jelölésű nyílt leolvasási keret a 3606 számú nukleotid - a stopkodon 3. nukleotidja - és a 4055 számú nukleotid
- az ATG A nukleotidja - között helyezkedik el, kiindulási nukleotidként a TIR-eken belül lévő BamH 1 restrikciós helyet véve. A találmány egy különösen előnyös megvalósítási módjaként a βΐ régión belül egy olyan részt választunk, amely az 1775 és 2065 számú nukleotidok között helyezkedik el, a β2 régión belül egy olyan részt, amely a 2772 és 3505 számú nukleotidok között helyezkedik el. Jó eredményeket értünk el a βΐ régión belül elhelyezkedő, BI inszerciós helyként jelölt 1842 számú nukleotidnál és/vagy a β2 régión belül elhelyezkedő, B2 inszerciós helyként jelölt 3062 számú nukleotidnál végzett klónozással.
Jó eredményeket érünk el akkor is, ha legalább egy DNS-szekvenciát klónozunk a β2 régióba az Avipox vírus két TIR-régiójának egyikén belül. Ugyancsak jó eredményeket érünk el, ha egy DNS-szekvenciát klónozunk a két TIR-régió mindegyikének βΐ régiójába. Ez a találmány további előnyét jelenti, mivel lehetőség van arra, hogy genomonként a heterológ DNS-szekvencia két kópiáját nyerjük.
A legyengített Avipox vírustörzsből származó rekombináns Avipox víruson olyan, az Avipox nemzetségbe tartozó vírust értünk, amely legyengített, és amelynek genomja egy heterológ szekvenciát és emellett expressziós szignálokat tartalmaz. Vímsként általában az Avipox nemzetségbe tartozó vírust, például Fowlpox, Pigeonpox vagy Canarypox vírust alkalmazunk. Szokásosan Fowlpox vírust alkalmazunk. Fowlpox vírusként előnyösen egy csirkehimlő vírus vagy Fowlpox vakcinatörzset alkalmazunk, például a SOLVAY cég által POXINE márkanéven termelt és forgalmazott vakcina-, vagy a SOLVAY cég által CHICK-N-POX, POULVAC CHICK-N-POX, CHICK-N-POX TC, POULVAC CHICK-N-POX TC, POULVAC POXINE és POULVAC P márkanéven termelt és forgalmazott vakcinatörzset. Különösen előnyös módon Fowlpox vírusként a SOLVAY cég által CHICK-N-POX, POULVAC CHICK-N-POX, CHICK-N-POX TC, POULVAC CHICK-N-POX TC, POULVAC POXINE és POULVAC P márkanéven (rövidítése CNP) forgalomba hozott vakcinát alkalmazunk.
A legyengítést embrión való egymást követő paszszálásokkal érjük el, vagy ha a vírus már adaptálódott a tenyésztett sejtekhez, sejttenyészeten végzett passzázsokkal érjük el.
A genetikus expresszió szignáljaiként olyan elemeket értünk, amelyek képesek a rekombináns vírussal fertőzött sejtben a heterológ proteint kódoló gén kifejezésére, és amelyek a vírus számára felismerhetők, különösen a promoter- és terminátorelemek, amelyek szakember számára ismertek, leírásuk például a Moss, B., Annu. Rév. Biochem. 59, 661-88 (1990) szakirodalmi helyen szerepel. Általában Pox promotert alkalmazunk. Szokásosan Vaccinia vagy Fowlpox promotert alkalmazunk. Előnyösen a Vaccinia Pl 1 és P7.5 promoteijét alkalmazzuk, amelyek leírása a Venkatesan és munkatársai, Cell, 125, 805-813 (1981); Cochran és munkatársai, J. of Virol., 54 (1), 30-37 (1985) és Bertholet C., R. Drillien, R. Wittek, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 2096-2100 (1985) szakirodalmi helyeken szerepel.
Az Avipox vírusra nézve heterológ fehérje egy részét vagy egészét kódoló legalább egy DNS-szekvencián olyan, egy genomból származó DNS-ffagmentumot vagy egy cDNS-kópiát vagy egy szintetikus DNS-t éltünk expressziós szignálok kíséretében, amelynek szekvenciája az Avipoxra nézve idegen fehéije egészét vagy egy részét kódolja.
Az alábbiakban a találmány jobb megértését segítő 1-11. ábrákat ismertetjük.
Az 1. ábrán rekombináns Avipox vírus konstruálását mutatjuk be, amit Mackett és munkatársai [J. of Virol. 49 (3), 857-64 (1984)] munkájából adaptáltunk. A Fowlpox vírussal (FPV) fertőzött sejteket (F) transzferplazmid segítségével transzfektáljuk (T). Ez a plazmid (P) egy promotert (Pr) hordoz, amelynek olyan az orientációja, hogy lehetővé teszi egy szomszédos heterológ gén (g) expresszálódását, amely gén mindkét oldalán vírus DNS-szekvenciákkal szomszédos. A homológ rekombináció (R) a sejt- (S) citoplazma belsejében történik meg a génnel szomszédos szekvenciák és a vírusgenomban lévő szekvenciák között. Ennek eredménye a heterológ gén inszerciója a vírus genomjába. Ez a genom becsomagolható, és rekombináns vírusrészecskék (VR) hozhatók létre. M jelentése a sejt (S) magja.
A 2. ábrán a Fowlpox genomjának két végét mutatjuk be vázlatosan, a jobb oldali TIR (TIR-R) és a bal oldali TIR (TIR-L) téglalapokkal szimbolizált részeket, és a vonallal szimbolizált egyedi szekvenciát. A szagga3
HU 215 531 Β tott vonal a genom központi régióját jelöli. A TIR-L EcoRI restrikciós fragmentuma 6,2 kb méretű, míg a TIR-R hasonló fragmentuma 9,0 kb. Ez a vázlatos ábrázolás mutatja, hogy ez a két fragmentum egy közös szekvenciával és egy egyedi szekvenciával bír. Megjelöltük a BamHl helyet, amely a TIR-eken belül az EcoRI-tői a 3’-vég irányában helyezkedik be.
A 3. ábra a pTIRBl plazmid (PTIRB1) restrikciós térképe néhány egyedi hellyel, és az ORF-k elhelyezkedésével. Az egyedi BamHl helyet alkalmazzuk a heterológ gének klónozására.
Az ábrán látható jelölések jelentése a következő: őri (ORi) az Escherichia coli (E. coli) belsejében a plazmidban a replikáció kezdetének helye, Ap: Ampicillin rezisztenciagén, ORF 1-ORF 6: a Fowlpox nyílt leolvasási keretei.
A 4. ábra a 3. ábrához hasonló restrikciós térkép, de a pTIRB2 plazmidra (PTIRB2) vonatkozik.
Az 5. ábra a pl ILac plazmid (Pl 1LAC) restrikciós térképe. Ez a plazmid az E. coli LacZ génjét hordozza a Vaccinia promoter Pl 1 szabályozása alatt. Az ábrán alkalmazott rövidítések jelölése a következő: Pl 1: Vaccinia promoter P11; LACZ: β-galaktozidázt kódoló gén; ORi: replikáció kezdete az E. coli-ban; szál+: az M13 fág belsejébe csomagolt szál; Ap: Ampicillin rezisztenciagén.
A 6. ábrán példaként bemutatunk egy vektort, amely alkalmas arra, hogy a LacZ gént a TIR-ekbe bevigye. Ez a vektor a pTIRBlP75Lac (PTIRBlP75LAC). A P7.5-LacZ kazettát a PTIRBl BamHl helyére klónoztuk az óramutató járásával megegyező irányítottsággal. A P7.5 jelölés jelentése Vaccinia promoter P7.5.
A 7. ábrán a vonalkázott négyszöggel jelölt LacZ gén inszertjeit mutatjuk be a CNP genomon belül vázlatosan. A P7.5-LacZ és Pl 1-LacZ kazettákat mindkét orientációban a terminális régiókba (TIR) inszertáljuk. A jobb oldali TIR-régiót az ábrán nem mutatjuk be. A nyilak jelentése a négyszöggel jelölt gének transzkripciójának iránya. A léptékek nem pontosak.
A 8. ábrán az IBDV A szegmentjét, a primerek pozícióját és az EDGÁR törzs A szegmentjének RNS-e reverz transzkripciójával és sokszorozásával kapott különböző fragmentumokat mutatjuk be. Az ábrán a jelölések jelentése a következő:
A: a nyílt leolvasási keretek (ORF-ek) szerkezete.
P: az A szegment sokszorozásának kivitelezéséhez alkalmazott „primerek”.
>,< : a „primerek” orientációja az A szegment kódolószekvenciájához viszonyítva.
fgtPCR: az A szegment RNS-jának sokszorozásával létrehozott fragmentumok.
pb: bázispárok.
A 9. ábrán (9a.-9e. ábrák) az Edgár törzsből származó A szegment RNS-ének megfelelő sokszorozott DNS nukleotidszekvenciája látható, és az 1, 2 és 3 ORF-ek transzlációja aminosavakká. A 0, 1, lb, 2, 3,4,5 és 6 primerek azok a primerek, amelyeket az Edgár törzs A szegmentjének megfelelő DNS-fragmentumok reverz transzkripcióval és sokszorozással való létrehozására alkalmazunk.
A 10. ábrán vázlatosan bemutatjuk az EDGÁR törzs A szegmentjének megfelelő DNS-szegment felépítésének módját reverz transzkripcióval és sokszorozással nyert fragmentumok alkalmazásával.
* helyirányított mutagenezis.
All. ábra a pTIR75ElLAC plazmid (PTIR75E1LAC) restrikciós térképe.
A plazmidnak vastag vonallal jelölt része megfelel azoknak a szekvenciáknak, amelyek homológok az FPV genommal. Az ábrán alkalmazott rövidítések jelentése a következő: ORi: a plazmid E. coli-n belül való replikációjának kezdőhelye; Ap: Ampicillin rezisztenciagén; P7.5: Vaccinia promoter P7.5; ORF1-IBDV: az Edgár törzs A szegmentjének ORF 1 jelölésű nyílt leolvasási kerete; Pl 1: Vaccinia promoter Pl 1; LACZ: β-galaktozidázt kódoló gén; pb: bázispárok; ORF 1-ORF 6: a Fowlpox nyílt leolvasási keretei.
A 12. ábrán az FPV/IBDV rekombinánsokban kifejeződött IBDV-fehérjék ELISA-teszttel nyert jellemzését mutatjuk be. A jellemzés a következő módon történt : 50 μΐ sejtszuszpenziót és ennek a szuszpenziónak kétszeres sorozathígításait helyeztük a lyukakba. A második anti-IBDV antitest (monoklonális anti-VP3 vagy ariti-VP2) inkubálása után a szignált biotin+sztreptavidinnel kapcsolt lúgos foszfatázzal jelzett egér antiIgG-rendszer segítségével sokszoroztuk.
A 12a. ábra az anti-VP3 monoklonális antitesttel való meghatározásnak felel meg. A 12b. ábra az antiVP2 monoklonális antitesttel való meghatározásnak felel meg.
Ezeken az ábrákon az X tengely jelentése a sejtextra ktumok kétszeres hígítási sora logaritmikus egységekben, az Y tengely jelentése a 690 nm-nél és a 405 nmnel mért abszorpciók aránya.
A 13. ábrán a FPV/IBDV rekombinánsokban kifejeződött IBDV-fehérjék Westem-blotanalízissel való jellemzésének eredményét mutatjuk be. Ezt a jellemzést a következő módon végeztük: sejtszuszpenziókat 3000 g mellett centrifugáltunk, a kapott felülúszókat 185 000 g mellett ultracentrifugáltuk, a két centrifugálásnál kapott csapadékot egyesítettük, és foszfáttal pufferolt sóoldatban (PBS, Gibco gyártmány) újra szuszpendáltuk.
Nátrium-dodecil-szulfátot (SDS) tartalmazó akrilainidgél lyukaiba lyukanként 20-40 pg FPV/IBDV rekombináns fehérjét, illetve 5 pg IBDV-vel fertőzött sejtet (pozitív kontroll) helyezünk. Membránra való átvitel után az IBDV-fehérjéket poliklonális szérummal mutatjuk ki, amely minden IBDV-fehéijét felismer, ezt a 13a. ábrán mutatjuk be, vagy anti-VP3 monoklonális antitestet használunk a kimutatásra, ezt a 13b. ábrán mutatjuk be. A szignál sokszorozását biotinnal és sztreptavidin-lúgos foszfatáz konjugátummal jelzett antiIgG-rendszer segítségével végezzük. Az ábrán PM jelentése molekulatömeg marker- (jelző-) proteinek.
A találmány megvalósításának vázlatos bemutatása az 1. ábrán szerepel [Mackett és munkatársai szerinti módosítás, J. of Virol. 49 (3), 857-864. (1984)]. Az Avipoxszal vagy Fowlpoxszal fertőzött sejteket transzferplazmiddal transzfektáljuk. Ez a plazmid egy olyan piomotert hordoz, amely megfelelően orientált ahhoz,
HU 215 531 Β hogy lehetővé tegye a vele szomszédos, mindkét végén vírus DNS-szekvenciához csatlakozó heterológ gén expresszióját. A homológ rekombináció a sejt citoplazmájának belsejében játszódik le a génnel szomszédos szekvenciák és a vírusgenomban jelen lévő szekvencia között. így jön létre a heterológ gén inszerciója a vírusgenomba. Ez a genom becsomagolható, és rekombináns vírusrészecskék hozhatók létre. Az inszerciónak ezt a sejteknek Poxszal való fertőzése, majd ezt követően egy plazmiddal való átvitele révén megvalósított eljárását Vaccinia vírussal fejlesztették ki, és általánosan használják számos laboratóriumban rekombináns Pox vírusok konstruálására [Mackett és munkatársai, DNA cloning. A practical approach, 2. kötet, 191-211 (1985)].
A találmány szerinti eljárás szokásosan a következő szakaszokból áll:
- az első szakasz a szkrinelésre alkalmas transzferplazmidok konstruálása,
- a második szakasz a heterológ antigéneket kódoló gének klónozása a plazmidokba,
- a harmadik szakasz a rekombináns Avipox vírusok konstruálása, és
- a negyedik szakasz a vakcinálási vizsgálatok elvégzése rekombináns vírusok alkalmazásával.
Előnyösen az eljárás a következő szakaszokból áll:
a) A szkrinelésre alkalmas transzferplazmidok konstruálása
- TIR-t hordozó fragmentumok klónozása.
- Klónozási helyek inszerciója a TIR-ekbe.
- Vaccinia Pl 1 és P7.5 promoterek klónozása.
- A LacZ gént hordozó kazetta konstruálása, és ennek klónozása a Pl 1 vagy P7.5 helytől a 3’-vég irányába.
- A Pl lLacZ vagy P7.5LacZ elemek klónozása a TIR-transzferplazmidokba.
b) Rekombináns CNP vírusok konstruálása (LacZ gén előzetes vizsgálatok elvégzéséhez) — A QT35 sejtek transzfekciója a CNP vírussal és egy transzferplazmiddal.
- A LacZ gén expressziója alapján szkrínelés rekombinánsok iránt, majd ezt követő tisztítás.
- A rekombinánsok genomjának elemzése és a LacZ expressziója.
c) Vakcinálási vizsgálatok
- Csirkék vakcinálása rekombináns vírusokkal, szárnyashimlő elleni védelem LacZ rekombináns vírus alkalmazásával.
d) A heterológ antigéneket (heterológ fehérjéket) kódoló gének klónozása transzferplazmidokba
- A heterológ antigéneket kódoló gének klónozása a Pl 1 vagy P7.5 helytől a 3’-vég irányába.
- A Pll antigén és P7.5-LacZ vagy P7.5-antigén és Pll-LacZ kazetták klónozása a TIR-plazmidokba.
e) Rekombináns CNP vírusok konstruálása
- QT35 sejtek transzfekciója a CNP vírussal és egy transzferplazmiddal.
- A LacZ gén expressziója alapján szkrínelés rekombináns vírusok iránt, majd ezt követő tisztítás.
— Az antigén sejttenyészetben való expressziójának vizsgálata és a rekombináns vírusok genomjának vizsgálata.
f) Vakcinálás
- Vakcinálás a rekombináns CNP vírusokkal.
- A CNP elleni védettség szintjének értékelése a heterológ antigén expressziójával.
A találmány azokra a transzferszekvenciákra is vonatkozik, amelyek lehetővé teszik, hogy a heterológ DNS az előzőekben meghatározott módon, különösen a B1 vagy B2 helyeknél beépüljön az Avipox vírus genomjába. A találmány tárgyát képezik azok a plazmidok is, amelyek ezeket a szekvenciákat hordozzák. Transzferplazmidon olyan plazmidot értünk, amely a heterológ gént tartalmazza egy promoter hatása alatt, amely az Avipox számára felismerhető, és ahol a gén mindkét oldalán a B1 vagy B2 helyek két oldalán elhelyezkedő szekvenciákkal szomszédos. Ezeknek a FVPre nézve homológ szekvenciáknak a hosszúsága, amelyek a heterológ génekkel szomszédosak, elegendő kell, hogy legyen ahhoz, hogy megengedje a jobb és a bal oldalon a heterológ gén rekombinációját. Általában legalább 1 kb méretű szekvenciákat választunk. Jó eredményeket értünk el a B1 helytől az 5’-vég felé mintegy 1850 nukleotid és a 3’-vég felé 4321 nukleotid hosszúságú, és a B2 helyen az 5’-vég felé 3070 nukleotid és a 3 -vég felé 3100 nukleotid hosszúságú szekvenciákkal. A transzferplazmidok szerepet játszanak a rekombinans Avipox vírusok izolálásánál, előzetesen az Avipox vírussal fertőzött QT35 fürjsejtek transzfekcióját is felhasználjuk az eljárásban.
A találmány tárgyát képezi olyan eukarióta sejtek tenyészete is, amelyek legyengített Avipox vírustörzsből származó rekombináns Avipox vírussal fertőzöttek, és genomjuknak nem esszenciális részében legalább egy olyan DNS-szekvenciát tartalmaznak, amely egy, az Avipox vírusra nézve heterológ fehéqe egészét vagy egy részét kódolja, valamint olyan elemeket tartalmaznak, amelyek annak biztosítására képesek, hogy ez a fehérje a fenti rekombináns vírussal fertőzött sejtben expresszálódjon; a fenti nem esszenciális rész az Avipox vírus két ORF-egysége között elhelyezkedő, nem kódoló intergénes tartományából áll, beleértve az expressziós szignálokat.
Előnyösen szárnyasok sejtjeinek tenyészetét használjuk. Jó eredményeket értünk el fürjsejtek tenyészetével. Kiváló eredményeket kaptunk a QT35 fürjsejtek tenyészetével a Cho által leírt módon [Cho B. R., Avian Diseases 25, (4), 839-846 (1981)].
A rekombináns Avipox vírust vektorként fejlesztettük ki, amely képes a heterológ protein egészének vagy egy részének kifejezésére. A találmány ennek megfelelően a találmány szerinti vírus olyan vektorként való alkalmazására is vonatkozik, amely egy heterológ fehérje egészét vagy egy részét, például különösen egy antigént képes kifejezni.
A találmány tárgyát képezi az olyan vakcina is, amely legyengített Avipox vírustörzsből származó rekombináns Avipox vírust tartalmaz, amely rekombináns Avipox vírus genomjának nem esszenciális részében leg5
HU 215 531 Β alább egy olyan DNS-szekvenciát tartalmaz, amely egy, az Avipox vírusra nézve heterológ protein egészét vagy egy részét kódolja, valamint olyan elemeket is tartalmaz, amelyek biztosítják ennek a proteinnek a fenti rekombináns vírussal fertőzött sejtekben való kifejeződését; a genom nem esszenciális része az Avipox vírus két nyílt leolvasási kerete (ORF) közötti nem kódoló intergénes régióból áll, beleértve ezek expressziós szignáljait.
Heterológ fehérjén olyan fehérjét vagy annak egy részét értjük, amely az Avipox vírusra nézve idegen, vagy egy természetes vagy módosított fehérje. Általában ez a fehérje egy olyan antigén, amely lehetővé teszi egy vakcina kifejlesztését egy patogén organizmus ellen. Az antigének általában olyan anyagok fehérjéi, amelyek fertőzők szárnyasokra, így vírusok, baktériumok, klamidiumok, mikoplazmák, protozoák, gombák és férgek.
Ezek közé elsősorban a következők tartoznak: Adenoviridae, például az aplasztikus anémiáért (AA) felelős vírus, valamint az „egg drop” szindrómáért (EDS) felelős vírus, a Bimaviridae, például a fertőző nyálkatömlőkór vírusa (IBDV az angol elnevezés rövidítéseként), a Coronaviridae, például a fertőző bronchitis vírusa (IBV), a Herpesviridae, például a Marek-kór vírusa (MDV), valamint a fertőző légcsőhurutért felelős vírus (ILTV), az Orthomyxoviridae, például az influenzáért felelős vírus, a Paramyxoviridae, például a Newcastlekór vírusa (NDV), a Picomaviridae, például az agygerincvelő-gyulladás vírusa (AE), a Reoviridae, az ínhüvelygyulladásért felelős vírus, a Retro-vírus, például a lymphoid leukózisért felelős vírus (LL), valamint a csirkék vérszegénységéért felelős vírus (CAV).
Ezek körébe tartoznak főként a klamidiumok, például a Chlamydia psittaci.
Ezek körébe tartoznak különösen a mikoplazmák, például a Mycoplasma gallisepticum és M. synoviae.
A baktériumok közül ezek körébe tartoznak főként az Escherichia coli, a Haemophilus, ezen belül például a H. paragallinarum, amely a náthát okozza, a Pasteurella, köztük a P. multocida, amely a kolerát okozza, a Salmonella, ezen belül a tífuszt okozó S, gallinarium, és a S. pullorum, Clostridium, ezen belül például a C. botulinum, amely a botulizmust okozó toxint termeli, a C. perfringens és a C. septicum, amelyek dermatózisokat okoznak, és a C. colinum, Campilobacter jejuni és Streptococcus aureus.
A protozoák köréből elsősorban az Eimeria, amely kokcidiózist okoz, és a Cryptosporidiosis baileyi, amely a kriptosporodiózisért felelős.
A férgek közül elsősorban a laposférgek (cestodák) és a nematódák, köztük az Ascaridia galli.
A gombák közül elsősorban az Aspergillus fúmigatus.
Előnyös antigének a fertőző nyálkatömlőkórt okozó vírus (IBDV), a fertőző bronchitis vírusa (IBV), a csirkék anémiájáért felelős vírus (CAV), az Eimeria protozoa, amely kokcidiózist okoz, a Newcastle-kór vírusa (NDV) és a Marek-kór vírusa (MDV).
A különösen előnyös antigének a fertőző nyálkatömlőkór vírusa (IBDV), a fertőző bronchitis vírusa (IBV), a csirkeanémiáért felelős vírus (CAV) és az
Eimeria protozoa, amely kokcidiózist okoz. Jó eredményeket értünk el az alábbi körülmények között.
- IBDV esetén: a nyílt leolvasási keretek mindegyike vagy egy része, poliprotein és poliprotein részek előállítására. Ilyen proteinek elsősorban a VP2, a VP3 és a VP4. Ezek minden kombinációját és módosítását is értjük a fentieken. A módosítások lehetnek például egy hasítási hely inszerciói.
- IBV esetén: az E2 antigén.
- Eimeria esetén: a TA4 természetes felületi antigén, és olyan TA4 felületi antigén, amely módosított proteolitikus hasítási hellyel bír.
- CAV esetén: a P50 protein.
Kiváló eredményeket értünk el IBDV alkalmazásával olyan heterológ proteinnel, amely annak a poliproteinnek egy része, amely a 9. ábrán bemutatott szekvencia 1-493, ezt követően 1010-1012 aminosavjait tartalmazza, amelyben benne foglaltatik a VP2 protein.
A DNS-szekvencia kódolhatja a teljes fehérjét vagy más módon a fehérje fragmentumait, és kiválthatja az állatból a megfelelő immunválaszt. Más molekulák az antigének mellett ugyancsak figyelembe vehetők, ezek közé tartoznak például a növekedési faktorok, az immunír oduláló szerek, például az interleukinok. A találmány tárgyát képezi in vivő baromfiban egy olyan faktor előállítása, amely az állat metabolizmusában szerepet játszik, például egy növekedési hormon vagy egy növekedési hormont indukáló faktor előállítása. A találmány tárgyát képezi fehérjék vagy peptidek előállítása sejttenyészetekben in vitro vagy állatban in vivő. Az adott heterológ fehérjétől függően az különösen alkalmas lehet enzimként, nutritív anyagként, vagy a humán vagy állatgyógyászat területén humán célú gyógyszer vagy állatgyógyászati készítmény formájában. Továbbá többszörös rekombináns vírusok, amelyek néhány heterológ gént hordoznak, állíthatók elő néhány génnek egyazon genomba való klónozásával, amely klónozás történhet azonos helyre vagy különböző régiókba vagy helyekre. Többértékű termék hozható létre úgy is, hogy különböző rekombináns vírusokat kombinálunk.
Az Avipox vírus célállatai a találmány szerint madarak, elsősorban baromfik. A rekombináns vírus használható a szárnyasoktól eltérő fajokban is.
A találmány szerinti vakcina különböző formákban adagolható, ez szakember számára ismert. Szokásosan a vakcinát orálisan a tápban vagy az ivóvízben adagoljuk, vagy orron át, vagy szubkután injekció formájában aeroszolként, intramuszkuláris injekcióként vagy az úgynevezett számyhártya-eljárással a számymembrán ál szúrásával. Előnyösen a vakcinát a számymembrán átszúrásával, az úgynevezett számyhártya-eljárással juttatjuk be, vagy intramuszkuláris vagy szubkután injekció formájában adjuk be.
A találmány szerinti vakcinát szakember számára ismert módon formáljuk. Szokásosan a vakcinakészítmény olyan stabilizálószereket tartalmaz, amelyek a vakcina adagolási módjának megfelelnek. A vakcina tárolható fagyasztva szárított formában.
A következőkben a találmányt példákban mutatjuk be.
HU 215 531 Β
1. példa
A CNP vírus és DNS-ének tisztítása
Fowlpox vírusként a SOLVAY cég (Brüsszel, Belgium) által a POULVAC CHICK-N-POX, CHICK-N-POX, CHICK-N-POX TC, POULVAC CHICK-N-POX TC, (CNP) márkanéven forgalomba hozott vakcinatörzset alkalmazzuk mint legyengített élő vakcinát. Kiindulási tenyészetként egy mezei törzset alkalmaztunk, amelyet néhányszor tojáson passzál tünk, majd a sejtekhez in vitro adaptáltuk két passzálással CEF-en (csirkeembrió fibroblaszt), és öt passzálással QT35 fúrj sejtvonalon, amint azt Cho leírja [Cho B. R., Avian Diseases 25, (4), 839-846 (1981)]. A QT35 fúrj sejtvonalat Dr. Moscovicitől (6816 Northwest 18th Avenue, Gainesvilié, Florida 32605, USA) kaptuk, aki ezt izolálta és közreadja.
A CNP-t QT35 sejtvonalon tenyésztettük, amelynek tápközege: El99 (Gibco, 500 m), F12 (Gibco, 500 ml), LAH (Gibco, laktalbumin hidrolizátum, 25 ml), FCS (Gibco, magzati borjúszérum, 25 ml) és 200 g/l-es fruktózoldatból 5 ml; az inkubálás hőmérséklete 38 °C; az inkubálást 3% szén-dioxidot tartalmazó légtérben végeztük. A fertőzés szokásos gyakorisága (moi) 0,01 vírus/sejt, a sejtek 80%-a összenőtt.
A vírustenyészet tisztítását a következő módon végezzük: a CNP Fowlpox vírussal fertőzött sejteket foszfáttal pufferolt sóoldatban (PBS, forgalmazója Gibco) felvesszük, majd 6000 g mellett 15 percig centrifugáljuk. A csapadékot 1 mmol/l-es, pH=9-es, 0,25 mg/ml végkoncentrációra tripszinnel kiegészített pufferben (Gibco) újraszuszpendáljuk, majd ultrahanggal kezeljük. Ezt az anyagot rárétegezzük egy 36 tömeg/térfogat%-os szacharózoldatra, és 45 percig 30 000 g mellett centrifugáljuk. A kiülepedett csapadékot 1 mmol/l-es, pH=9,0 -as triszpufferben vesszük fel. Végül a vírusokat 30 percig 40 000 g mellett centrifugáljuk. A csapadékot lizálópufferben vesszük fel: 10 mmol/l-es, pH=8,0-as trisz-HCl, 10 mmol/1 EDTA, 1% SDS (nátrium-dodecil-szulfát), 500 pg/ml proteináz K (Boehringer), 0,1 mg/ml RN-áz (Boehringer), és ebben a pufferben 2 órán át 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk. A DNS-t fenollal kiextraháljuk, majd etanollal kicsapjuk. 20 pg tisztított DNS-t mintegy 40 db 150 cm2-es befertőzött lombikból nyerünk.
2. példa
A CNP EcoRl genom könyvtárának és BamHl genom könyvtárának létrehozása A Maniatis és munkatársai [Maniatis, T., E. F.
Fritisch és J. Sambrook. Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y., 1982] által leírt genetikai technikát alkalmazzuk. A Pharmacia, Boehringer és Biolabs által forgalmazott restrikciós enzimeket, polimerázokat, ligázokat és foszfatázokat alkalmazzuk. A szintetikus DNS-eket az Eurogentec cégtől szereztük be.
A vírus DNS EcoRl és BamHl restrikciós fragmentjeit a pUC18 vektorba Egáljuk a Messing [Messing, J. 1983. Methods Enzymol. 101, 20-78 (1983)] által leírt módon, majd ezt E. coli, MC1061 (araD139, (ara, leu) 7697, lacX74, galU, galK, hsdR, strA, Pharmacia) baktériumokba visszük be. A két genomkönyvtárat -70 °C hőmérsékleten glicerinben tároljuk a transzformált sejtek két szuszpenziója formájában. A plazmidok 24%-a tartalmaz egy inszertet. Méretük és Bgl2 vagy HinFl által való hasítási módjuk alapján 17 BamHl fragmentumot és 45 EcoRl fragmentumot különböztettünk meg. Az inszertek 0,5-15 kb méretűek, a BamHl inszertek összege így 82 kb, az EcoRl fragmentumok 210 kb-t tesznek ki. A Fowlpoxgenomjának mérete közel 300 kb [Coupar és munkatársai, Virology, 179, 159-167 (1990)]. Ennek megfelelően a BamH 1 izolált fragmentumai 25%-ot, az EcoRl fragmentumai 70%-ot tesznek ki a teljes genomra vonatkoztatva.
3. példa
A TIR-hordozó fragmentumok klónozása
A terminális invertált ismétlődések (TIR) a Pox genom végein lévő két ellentétes irányítottságú, egyébként azonos szekvencia. A Fowlpox HP-törzse genomjának egyik végén egy 17 kb-nál nagyobb szekvenciát írtak le [Campbell J. A., Μ. M. Binns, F. M. Tomley, Μ. E. G. Boursnell, J. Gén. Virol. 70, 145-154 (1989); Tomley és munkatársai, J. Gén. Virol., 69, 1025-1040 (1988)]. Ez egy mintegy 10 kb ismétlődő szekvenciából és egy 7,0 kb csatlakozószekvenciából áll.
A TIR EcoRl fragmentumokat klónozzuk. Az ismétlődő szekvencia egy EcoRl helyet tartalmaz. Amint az a 2. ábrán látható, két EcoRl-fragmentumot klónozunk, mindegyik a TIR egy részét hordozza, és egy egyedi, ehhez kapcsolódó szekvenciát. Az egyedi szekvenciát a TIR-ekhez közelebbi végén egy EcoRl hely határolja. Ezt a két fragmentumot egy olyan oligonukleotid segítségével izoláltuk, amely az ismétlődő részben elhelyezkedő szekvencia komplementere. Az első fragmentum 6,2 kb méretű, konvencióként TÍR-L-ként jelöljük. A második fragmentum 9,0 kb méretű, és konvencióként TIR-R-ként jelöljük. A CNP TIR-L EcoRl fragmentumának szekvenciája azonos a;: irodalomban közölttel.
A TIR és az egyedi szekvencia közötti kapcsolódás helye a TIR-L és TIR-R szekvenciák összehasonlításából levezetve a 4007 számú nukleotidnál van, az első számú nukleotidnak a Tomley és munkatársai [J. Gén. Virol., 69, 1025-1040 (1988)] által közölt szekvencia BamH 1 helyét tekintjük. A kapcsolódás a fenti szerzők által ORF-3-ként jelölt nyílt leolvasási keretben található.
4. példa
A BamHl hely létrehozása a TIR-en belül helyirányított mutációval
A nyílt leolvasási keretekre (ORF) a TIR-ek nukleotidszekvenciájának elemzése alapján következtetünk. Az ORF 1 a 416 és 1674 számú nukleotidok között, az ORF 2 a 2166 és 2671 számú nukleotidok között, végül az ORF 3 a 3606 és 4055 számú nukleotidok között helyezkedik el, és a komplementer szálon van kódolva. A TIR-ek BamHl helyének első nukleotidját, a G-t
HU215 531 Β tekintjük az 1. számú nukleotidnak. Ezek az ORF-ek két nagy nem kódoló intergénes szekvenciát határolnak, ezek a βΐ jelölésű régió az ORF 1 és az ORF 2 között, másrészt a β2 régió az ORF 2 és az ORF 3 között. Ezt a két intergénes régiót választjuk inszerciós régióként.
Egy egyedi klónozási helyet viszünk be helyirányított mutációval (BioRad mutációs kit) a β 1 és a β2 régióba. Klónozási helyként a BamH 1 helyet választjuk, mivel ez kompatibilis a többi restrikciós hellyel, így a Bell és Bgl2 helyekkel. A klónozási hely helyét közelítőleg az egyes intergénes régiók közepén választjuk meg, hogy elkerüljük annak kockázatát, hogy a transzkripciós szignált elválasszuk a hozzá tartozó géntől, azaz
- a β 1 régióban: a Β1 hely az 1842 számú nukleotidnál lévő 5’GATC 3’ szekvencia, amelyet az 5’-végnél G, és a 3’-végnél C BamH 1. GGATCC által való inszerciójával alakítunk át;
- a β2 régióban: a B2 hely a 3062 számú nukleotidnál lévő 5’GGATT 3’, amelyet BamHl-vé alakítunk a második T CC-vé való mutációja révén.
A TIR-L fragmentumot hordozó plazmidban két BamH 1 hely van (3. példa). Az egyik hely a pUC 18 vektorból származik. A másik hely a TIR-ből származik, és a klónozásra kiválasztott EcoRI helytől a 3’-vég irányában 71 nukleotid távolságra helyezkedik el [Campbell J. A., Μ. M. Binns, F. M. Tomley, Μ. E. G. Boursnell, J. Gén. Virol. 70, 145-154 (1989); 2. ábra]. Ezt a két BamHI helyet a TIR-L-t hordozó plazmidból BamHI restrikcióval, majd ezt követően Klenow-polimerázos kitöltéssel és ligálással kiiktatjuk. Az így kapott plazmid a pTIRl.
A BamHI helynek a BI helyen való létrehozására a pTIRl 0,9 kb méretű Hindii fragmentumát a pBSPlus vektorba, amelyet a Stratagene cég hoz forgalomba, klónozzuk. A mutációs primer: 5’TTTCGAAAGA CTTTGGATCCGTAGTATAATATTATA 3’. A vastagon szedett nukleotidok, azaz a GGATCC képviselik azt a szekvenciát, amelyet a BamH 1 felismer.
A B2 helyen a BamHI hely létrehozására a pTIRl egy 1,7 kb méretű Xbal fragmentumát klónozzuk a pBSPlus-ba. A primer az 5’TATATCACGGGATCCAAAAGGTTATTAGTAGTC 3’. A vastagon szedett nukleotidok, azaz a GGATCC, képviselik azt a szekvenciát, amelyet a BamHI felismer.
Az egyes mutáns fragmentumok ismételt inszerciója a pTIRl-be ligációval történik:
- a BI esetén; a pTIRl-ből a Hind3-Scal (1491 bp) + a pBSPlus-ból mutáció után a Seal -Aat2 (485 bp) + a pTIRl-ből az
Aat2-EcoRl (4220 bp) + a pTIRl-ből az EcoRI-Hind3 (2635 bp);
- a B2 esetén; a pTIRl-ből az Xhol-Spll (8512 bp) + a pBSPlus-ból mutáció után az Spll-Xhol (318 bp).
Ezzel a két ligációval a pTIRB 1 és pTIRB2 vektorokat hozzuk létre. Ezek restrikciós térképét a 3. és 4. ábrákban mutatjuk be.
A pTIRBID plazmid a pTIRl plazmidból származik annak 2657 bp méretű EcoRI-Hpal fragmentumá20 nak deléciójával.
5. példa
Pll ésP7.5 Vaccinia promoterek klónozása A Pl 1 és a P7.5 Vaccinia promoterekként ismertek.
A Pl 1 a Pl 1 fehérjét kódoló gén promotere, amely a vírusfertőzés késői szakaszában íródik át. A P7.5 a P7.5 fehérjét kódoló gén promotere, amely azonnal és a késői fázisokban is átíródik.
Egyedi Bgl2 és Bell helyekkel bíró vektorok konst30 ruálása
Két olyan klónozóvektort konstruáltunk, amelyek az egyedi Bgl2, Bell és BamHI helyeket tartalmazzák, hogy lehetővé tegyük a BamH 1 -gyei kompatibilis kazetták egymást követő klónozását. A pBSPlus BamHI he35 lyébe a Bgl2 és Bell szekvenciákat a következő szintetikus DNS klónozásával vittük be:
Bg12 Be 11 BamHI
5’ GATCGAGATCTTGATCAG 3’
3’ CTCTAGAACTAGTCCTAG 5’
A vektorok a pBSLKl és pBSLK2. A linkerek orientációja a következő:
pBSLKl . . . Ava1/Sma1-BamH1-Be 11-Bg12-Xba1 . . . pBSLK2... Ava1/Sma1-Bg11-Bc11-BamHl-Xba1...
A P7.5 promoter klónozása
A pGS20 plazmid 143 bp hosszúságú Bell -BamHI fragmentuma tartalmazza a P7.5 promoterszekvenciát [Mackett és munkatársai, J. of Virol., 49 (3), 857-864 (1984)]. A szekvenciát az alábbiakban mutatjuk be [Venkatesan és munkatársai, Cell, 125, 805-813 (1981); Cochran és munkatársai, J. of Virol., 54 (1), 30-37 (1985)]. A késői és az azonnali promotereket aláhúzással jelöltük. Az utolsó BamHI bázis 10 bázispártávolságra van a géniniciátor ATG-egységétől.
5’TGATCACTAATTCCAAACCCACCCGCTTTTTATAGTAAGTTTTTCACCCATAAATAATAAATA Bell Késői
CAATAATTAATTTCTCGTAAAAGTAGAAAATATATTCTAATTTATTGCACGGTAAGGAAGTAGAA
Azonnal
TCATAAAGAACAGTGACGGATCC
BamHI
A Bell -BamHI fragmentumot a pBSLKl és pBSLK2 plazmidok Bell és BamHI helyeire klónozzuk, így a plP75 és p2P75 plazmidokat nyerjük. A Bell emésztés lehetővé tételére a pBSLKl és pBSLK2 plaz8
HU215 531 Β midokat a JM110 törzsből extraháljuk, amely utóbbi az ATCC-től (American Type Culture Collection) szerezhető be az ATCC 47013 hivatkozási számon.
AP11 promoter klónozása
A Pl 1 promoter szekvenciáját szintetikus DNS formájában klónozzuk Bertholet és munkatársai [Bertholet C., R. Drillien, R. Wittek, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 2096-2100 (1985)] szekvenciaadatainak alkalmazásával. Hanggi és munkatársai [EMBO Journal, 5 (5), 1071-1076 (1986)] kimutatták, hogy a mRNS első nukleotidjától az 5’-vég felé eső 30 nukleotidos fragmentum tartalmazza a promotert.
A szintetikus DNS egy 40-mer fragmentum, amely egy Bgl2 helyet és egy BamHl helyet hordoz a végein. Ezt a DNS-t pBSLK.l-be klónozzuk a plPl 1 létrehozására. és pBSLK2-be a p2Pl 1 létrehozására. Ezt követően a p?.Pl 1 Bgl2-BamHl fragmentumát a pACYC184 Xho2-BamHl helyére klónozzuk. A pACYC184 Chang és Cohen [Chang, A. C. Y. és Cohen, S. N., J. Bacteriol. 134, 1141-1156 (1978)] által leírt vektor. Az Xho2 (GGATCT) és Bgl2 (AGATCT) közötti ligáció helyreállítj a a Bgl2-t.
A Pl 1-nek a szintetikus DNS-t hordozó szekvenciája a következő:
5’GATCAAATTTCATTTTGTTTTTTTCTATGCTATAAATAAG 3’ TTTAAAGTAAAACAAAAAAAGATACGATATTTATTCCTAG
Bg 1 2
BamHl
6. példa
Olyan LacZ gént hordozó kazetta konstruálása, amely a BamHl restrikciós hellyel kompatibilis
A LacZ gén expressziója teszi lehetővé a rekombináns vírusok szkrínelését.
A LacZ gént hordozó Bgal2-BamHl kazettát helyspecifikus mutációval konstruáljuk. Ezt a kazettát a pBSPlus plazmidba (Stratagene) klónozzuk, amelyből a LacZa-fragmentum hiányzik annak érdekében, hogy 20 elkerüljük a két homológ szekvencia, a LacZ és a
LacZa között létrejövő rekombinációt. Az így kapott plazmid a pBSMutLacZl. A LacZ gén végeinek szekvenciáját a mutációt követően az alábbiakban adjuk meg. A számok megfelelnek a természetes protein ami25 nosavai számozásának.
En 5 ’ ,
Bg 12 Ncol 8 9 10 . . . AGATCTCACC ATG GCC GTC GTT. .
Me t Alá Val Val <- β-gal
En 3 ’ , . . . CAA AAA TAA TAA TAA CCGGGCAGG GGGGATCC. . . ... Gin Lys *** *** * * *
->
7. példa
A LacZ gén klónozása a P7.5 vagy Pl 1 promoterek mögé
A pBSMutLacZl LacZ, Bgl2-BamHl kazettáját a p2P7.5 és p2Pl 1 Bgal2-BamHl helyeire klónozzuk, hogy p75Lac-t és pllLac-t hozzunk létre. A LacZ gén expresszióját E. coli-ban elérjük, ha a P7.5 vagy Pl 1 promoterek után helyezzük el. A transzformáns kolóniák kék színűek X-Gal-tartalmú tápközegen (kromogén szubsztrát: 5-bróm-4-klór-3-indolil-p-D-galaktopiranozid), amely β-galaktozidáz hatására kék elszíneződést mutat. Ez a vizsgálat igazolja, hogy a gén működőképes. A pACYC184 Xho2 és a Hind3 helyeire a P11 Lac kazettát is klónozzuk a pl 1 Lac plazmid Bgl2-Hind3 fragmentuma formájában, így a pACPllLac-t hozzuk létre. A pl lLac térképe az 5. ábrán látható.
8. példa
A P75Lac és PllLac kazetták klónozása a pTIRBl éspTIRB2plazmidokba A pl 1 Lac (vagy pACPllLac) Bgl2-BamHl fragmentuma és a p75Lac Bgl2-BamHl fragmentuma hordozza a LacZ gén által követett P7.5 vagy Pll promotert (7. példa). Ezeket a fragmentumokat a pTIRBl és pTIRB2 BamH 1 helyeire klónozzuk (4. példa) a két lehetséges orientációban, a LacZ fenotípust használjuk szkrínelésre. Nyolc lehetséges rekombináns közül hat plazmidot izoláltunk. Ezek számozását az alábbiakban adjuk meg. Tételezzük fel, hogy a „+” orientáció az, amelynél a LacZ gén transzkripciója az ORF 1-től az
ORF2 vagy az ORF2-től az ORF3 irányában történik, és a orientáció az ennek megfelelő fordított orientáció. A plazmidok nevében a „P75Lac” és „Pl 1 Lac” azt jelenti, hogy ezek a kazetták orientációjúak, míg a „L,acP75” és „LacPl 1” jelölés a kazetták orientá50 cióját jelöli. Példaként a pTIRBlP75Lac plazmid térképét a 6. ábrán mutatjuk be.
Szám Prom Hely Őri Ncv
3 P7.5 B1 pTIRBl P75Lac
4 P7.5 B2 + pTIRB2P75Lac
5 P7.5 B2 - pTIRB2LacP75
8 Pll B1 + pTIRBIPllLac
HU 215 531 Β
Táblázat (folytatás)
Szám Prom Hely Őri Név
9 Pll B1 + pTIRBlLacPll
10 Pll B2 - pTIRB2LacPll
Szám =a plazmidnak adott szám.
Prom =promoter.
B1 vagy B2 hcly=a TIR-bc bevitt BamHl klónozási hely.
Őri =orientáció. Az orientáció +, ha a LacZ transzkripciójának iránya az ORF1 -tői az ORF2 vagy az ORF2-től az ORF3 irányába történik. A - orientáció ennek a fordítottja.
Név =a transzferplazmid neve.
9. példa
A transzfer- és szkrínelési körülmények optimalizálása, és a CNP-LacZ rekombináns vírusok izolálása A rekombináns CNP vírus konstrukciójának lényegét az 1. ábrán mutatjuk be. A transzfereljárás a következő.
Az 1. napon (D=l) 25 cm2 felszínű, 5 ml szaporító tápközeget (amelynek az összetétele az 1. példában szerepel) tartalmazó lombikokat 2,5 χ 106 QT35 sejttel oltunk be.
A 2. napon (D=2) a következő transzfert hajtjuk végre.
Vírus: 1 ml-es fiola fagyasztva szárított CNP-vakcinát 3 ml steril Milli Q vízzel rehidratálunk, és -70 °C hőmérsékleten tároljuk. Ezt a vírustörzsoldatot olvasztjuk ki, és tesszük ki enyhe ultrahangkezelésnek 1 percen át. Ezután az El 19-F12 tápközegben meghígítjuk, ez a tápközeg megfelel az 1. példában leírt El 19 tápközegnek LAH vagy szérum, vagy fruktóz nélkül, a hígítást úgy végezzük, hogy 2 ml tápközegre 0,05 vírusfertőzési gyakoriság jusson sejtenként. A tápközeget ezután a vírusszuszpenzióval helyettesítjük, és a tenyészetet 2 órán át 38 °C hőmérsékleten inkubáljuk.
Plazmidok: 29 pg plazmidot 400 pl vízzel elegyítünk, és az elegyhez hozzácsepegtetünk 100 pl 1,25 mol/l-es CaCl2-t, és 500 μΐ 2 χ BBS-puffert (BESvel pufferolt sóoldat) (50 mmol/1 BES (Sigma), 280 mmol/1 NaCl, 1,5 mmol/1 Na2HPO4; pH=7,0), és az elegyet 25 °C hőmérsékleten 15-30 percen át inkubáljuk. Ezután a tápközeget a sejtekről eltávolítjuk, és a sejtekhez a plazmidkészítményből 1 ml-t adunk. Az elegyet ezután 30 percig 38 °C hőmérsékleten inkubáljuk. 4 ml LAH-mentes tápközeget 5%-os magzati borjúszérummal egészítünk ki, és 15 mmol/l-es, pH = 7,2-es Hepest (Sigma) adunk hozzá. Az elegyet 38 °C hőmérsékleten 4 órán át inkubáljuk. Ezután a tápközeget 5 ml El 19 jelölésű szaporító tápközeggel helyettesítjük (amelynek összetétele az 1. példában szerepel).
A 0. napon (D=0) a vírussejteket az 1. példában leírt módon összegyűjtjük.
A szkrínelést a β-galaktozidáztermelés alapján végezzük, amelyet „plakkvizsgálatban” Petri-csészén mutatunk ki. A vizsgálatot 6 cm átmérőjű Petri-csészén végezzük a következő módon.
Az 1. napon (D=l): 5 ml szaporító tápközeget 2.5 χ 106 sejttel oltunk be.
A 2. napon (D=2): ezt a tenyészetet 1 ml 1:10 és 1:100 hígítású vírussal fertőzzük be, majd 4 órán át 38 °C hőmérsékleten inkubáljuk, ezután 4 ml szaporító tápközeget (összetétele az 1. példában megadott) adunk hozzá.
A 3. napon (D=3): a tápközeget 5 ml agarózréteggel helyettesítjük, amely 1 térfogat 2%-os agarózból [lásd a plakkagarózt (FMC) vízben oldva] és 1 térfogat következő elegyből áll: 9 ml 2χ 199 tápközeg (Gibco), 0 5 ml LAH (Gibco) és 0,1 ml a végtérfogatra számított 15 mmol/1 koncentrációt biztosító HEPES, pH=7,2, és 1 0 ml FCS. A megolvasztott agarózt és a fenti elegyet elegyítés előtt 38 °C hőmérsékleten tartjuk. Az agarózt 30 percig szobahőmérsékleten hagyjuk gélesedni, és az elegyet 38 °C hőmérsékleten inkubáljuk.
A 6. napon (D=6): a tenyészetre 2 ml, PBS-ben (Gibco) lévő 1%-os agarózt rétegezünk, amely agaróz 0,3 mg/ml X-Gal-t (5-bróm-4-klór-3-indolil^-Dg ilaktopiranozid, Boehringer) tartalmaz. Az X-Gal-t 30 mg/ml koncentrációra oldjuk dimetil-szulfoxidban (DMSO, Fluka).
A 7. napon (D=7): megszámláljuk a kék plakkok arányát a színtelen plakkokéhoz képest. Ezután 5 plakkot egyenként eltávolítunk Pasteur-pipetta alkalmazásával. A vírussejteket 500 μΐ szaporító tápközegben tároljuk -70 °C hőmérsékleten.
Az egyes plazmidok rekombinációs gyakoriságát az alábbi táblázatban mutatjuk be. A rekombináns vírusok jelölése „V”, amelyet a transzferplazmid száma követ (amint azt a 8. példában megadtuk). A rekombinánsok százalékos mennyisége 0,1% és 0,5% közötti, amely a Pox vírusokra az irodalomban szereplő adatoknak megfelelő. A rekombináns genomokat vázlatosan a 7. ábrán mutatjuk be.
Vírus Kék/összes %
V3 7/1400 0,5
V4 10/2000 0,5
V5 15/5000 0,3
V8 1/1000 0,1
V9 60/25 000 0,25
V10 50/30 000 0,17
Kék/összcs=a kék plakkok száma/összes plakkok száma. %=a kék plakkok százalékos mennyisége.
10. példa
A CNP/LacZ rekombináns vírusok tisztítása Egy kiónt nyerünk a Petri-csészén lévő kék plakkok egymást követő tisztításával (a 9. példában leírt módon). Lényegében, amikor minden plakk kék, minden vírus kifejezi a LacZ gént, már nincs jelen vadvírusszennyezés. Ennek a homogenitásnak az eléréséhez három vagy négy passzálás szükséges. Példaként az alábbi táblázatban bemutatjuk a kék plakkok arányának passzálások során való változását.
HU 215 531 Β
A passzálások száma
Első Második Harmadik Negyedik
Vírus Kék/összcs % Kék/összcs % Kck/összcs % Kék/összcs %
V3 20/200 10 40/50 80 22/22 100
V4 1/20 20 20/30 70 95/100 95 100/100 100
V5 50/500 10 2/5 40 30/30 100
V8 50/200 25 4/5 80 8/8 100
V9 1/5 20 1/1 100
V10 1/100 1 3/20 15 12/12 100
Kék/összcs=a kck plakkok száma/összcs plakkok száma. %=a kck plakkok százalékos mennyisége.
A V8 rekombináns vírussal fertőzött QT35 sejtek metszetének elektromikroszkópos fényképén világosan láthatók a Pox vírusok szerkezetére, különösen belső szerkezetére jellemző struktúrák, amelyek kutyacsont formájúak.
11. példa
Az egyes rekombinánsok nagy mennyiségben való előállítása
Hat rekombináns mennyiségét sokszorozzuk meg lombikokban való három egymást követő passzálással. A második passzálás után a titer 4 χ 105-1,1 χ 107 TCID50 (szövettenyészet-fertőző dózis, az angol „tissue culture infectious dose” rövidítéseként) ml-enként. Csak a V10 titere alacsonyabb mint 104. A többi rekombináns, amelynek titere szokásosan 105 és 107 közötti, valóban megsokszorozódik a vad törzshöz hasonlóan.
12. példa „Plakkvizsgálat, a TIR-be inszertált Lacz gén stabilitásának vizsgálata
A bekövetkezett rekombináció típusától függően a vírus genomjába inszertált LacZ gén lehet stabil vagy instabil (ezt Shuman és munkatársai [Virology, 170, 302-306 (1989)] egyértelműen kinyilvánították). így ha az inszert két oldalán két rekombináció van, az inszertált LacZ gén stabil. Másrészt egy egyszerű rekombináció eredményeként a komplett transzferplazmid, és ezáltal a LacZ gén inszertálódik. Ez a vírus két plakkot ad. Azonban a vírus genomja direkt orientációban homológ szekvenciát hordoz, amelynek rekombinációja az inszert elvesztését és nem kék plakkok megjelenését eredményezheti.
Ezen túlmenően, a Pox vírusok TIR-egységének szekvenciájában bekövetkezett változás átvihető más TIR-egységekre a vírusfertőzés és a replikációs ciklusok során. Egy kettős rekombináció viheti be a LacZ-t a TIR-L-be; az ilyen vírus plakkja kék. A következő fertőzés során az ilyen rekombináns TIR-L és egy vad TIR-R közötti rekombináció révén egy vegyes populáció (a TIR-L/LacZ, TIR-L/LacZ-TIR-R/Lacz és WT (vad vírus) jön létre. Másrészt más rekombinációk révén az utolsó lehetséges típus, a TIR-R/LacZ jöhet létre. Ennek folytán egy kék plakk háromféle típusú ví20 rust tartalmazhat: olyan vírusokat, amelyek a LacZ gént elvesztették, olyan vírusokat, amelyek a LacZ génből egyetlen kópiát tartalmaznak, és olyan vírusokat, amelyek a LacZ két kópiáját hordozzák.
A víruskészítmények homogenitását „plakkvizsgá25 lattal” ellenőrizzük néhány, egymást követő, folyékony tápközegben végzett fertőzés után (9. példa). A V3, V4, V5, V8, V9 és V10 vímsok harmadik passzálását követé „plakkvizsgálat” eredményét az alábbi táblázatban mutatjuk be.
Vírus P3: Kék/összcs % P6: kék/összcs %
V3 60/70 85 -
V4 80/90 88 70/80 88
V5 96/100 95 -
V8 50/50 100 40/40 100
V9 70/70 100 -
V10 3/10 30 -
P ! cs P6=a vírus 3. cs 6. passzálása.
Kik/összes=a kck plakkok száma/összcs plakkok száma.
°/t=a kék plakkok százalékos mennyisége.
- =ncm vizsgáltuk.
A fentiekből az a következtetés vonható le, hogy a V8 és V9 rekombináns víruskészítmények homogének. A V8 a hatodik passzálásig stabil. Másrészt a V3, V4 és V5 készítmények nem homogének. 5-20% vad típusú v rust tartalmaznak. A V10 esetén ez az arány még magasabb.
13. példa
A CNP/LacZ genom vizsgálata Southem-blotelem55 zéssel
A víruskészítmények homogenitását Southem-blotvizsgálattal teszteltük [Maniatis, T., E. F. Fritisch, és J. Sambrook. Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor,
Ν. Y., 1982], A rekombináns vírusok és a nem rekom11
HU215 531 Β bináns vírusok genomjának restrikciós fragmentumait méretük alapján különböztetjük meg.
A vírus DNS-készítésének eljárása a következő.
Az 1. napon (D=l): 5 ml szaporító tápközeget tartalmazó 25 cm2 felületű lombikba 2χ 105 6 QT35 sejtet oltunk.
A 2. napon (D=2): a sejteket 0,01 fertőzési gyakorisággal befertőzzük.
Az 5. napon (D=5): a sejteket egy kaparó (Costar) segítségével eltávolítjuk. Az elegyet 10 percig 6000 g mellett centrifugáljuk. 500 pl lizálópuffert adunk a centrifugálás üledékéhez, a puffer összetétele 10 mmol/1 tris-HCl, pH = 8,0, 10 mmol/1 EDTA, 0,1% SDS, 0,1 mg/ml RN-áz, 0,1 mg/ml proteináz K. A sejteket Eppendorf-csőbe visszük át. A kapott szuszpenziót keverjük, és 1 órán át 50 °C hőmérsékleten inkubáljuk. A vizes fázist ezután fenol-kloroformmal háromszor extraháljuk. A DNS-t 0,3 mol/l-es nátrium-acetáttal és térfogat etanollal -20 °C hőmérsékleten 15 perc alatt kicsapjuk. Az elegyet 10 percig 18 300 g mellett centrifugáljuk. A centrifugálás üledékét 500 μΐ vízben szuszpendáljuk. Ebből a DNS-szuszpenzióból mintegy 5 μΐ elegendő a Southem-bloteljáráshoz.
BI hely
A genomokat EcoRl-vel emésztjük. Mintaként EcoRl-vel emésztett pTIRBlLacP75 plazmidot alkalmazunk. Ez a minta megkülönbözteti a rekombinánst és a szülő TIR-L és TIR-R fragmentumokat. A fragmentumok mérete a vad vírus esetén 9,3 és 6,2 kb; 7,4, 5,1 (dublett) és 4,4 V3; 7,4, 4,9 és 4,4 kb V8; és végül 10,4, 7,3 és 2,0 kb (dublett) V8 esetén. A V8 és V9 vírusok a LacZ gén két kópiáját tartalmazzák, mindkét TIR-ben egyet, és nem tartalmazzák a szülő típusú TIR-fragmentumot. Másrészt viszont ezt a V3 vírus tartalmazza.
Mivel a LacZ egy kópiája mindkét TIR-be klónozható, arra a következtetésre jutottunk, hogy a Β1 inszerciós hely a vírus fejlődése és tenyésztett sejteken való szaporodása szempontjából nem esszenciális. Továbbá figyelembe véve, hogy a LacZ gén mintegy kb méretű, a fenti kettős rekombináns izolálása azt bizonyítja, hogy CNP vírus genomjába 6 kb inszertálható.
B2 hely
A Southem-blotvizsgálat rekombináns TIR-L és TIR-R fragmentumok jelenlétét, valamint a V4, V5 és VI0 vírusok szülőfragmentumainak jelenlétét mutatja. Ezért ezek a készítmények nem tekinthetők homogénnek.
14. példa
Alternatív módszer a Bl inszerciós helyen kettős rekombináns izolálására
A TIR-ekben végbemenő rekombináció arra enged következtetni, hogy a vírus szaporulatában stabil kettős rekombinánsok jelennek meg, amelyek egy vad TIR-t és egy rekombináns TIR-t hordoznak. A vírusplakkokíit ismételten izoláljuk egy kék plakkról, ehhez Petricsészés „plakkvizsgálatot” vagy egy új „plakkvizsgálatot” vagy egy 96 lyukú mikrotiterlemezen végzett vizsgálatot alkalmazunk. Az egyes plakkok genomját Southem-blot vagy PCR alkalmazásával elemezhetjük. Mindkét lehetőséget kihasználtuk.
A Southem-blotvizsgálatot a V3 vírus harmadik passzálása utáni „plakkvizsgálaf’-ból kapott 10 különböző kék színű plakkvírus genomjának vizsgálatára használtuk, egy készítmény homogénnek bizonyult, és a LacZ inszertet mindkét TIR-ben tartalmazta.
A mikrotiterlemezen való vizsgálathoz olyan hígítást végzünk, hogy lyukanként 0 vagy 1 vírusplakk legyen jelen. Ezt az optimális hígítást előzetes titrálással becsüljük meg. Jó eredményeket értünk el egy Petricsésze „plakkvizsgálat” 1 ml térfogatban felvett vírus Szuszpenziójának 50 μΐ mennyiségét alkalmazva 1 mikrotiterlemez befertőzésére (200 μΐ/lyuk, 20 ml/lemez). Ha a plakkok tisztán láthatók, feljegyezzük a plakkokat tartalmazó lyukakat. Fagyasztást és kiolvasztást követően egy-egy lyukból 100 μΐ anyagot veszünk ki.
A PCR-vizsgálathoz az össz-DNS-t a következő körülmények mellett gyorsan extraháljuk: az elegyet 10 percig 10 000 g mellett centrifugáljuk, az üledéket 200 μΐ lizálópufferben vesszük fel, amelynek összetétele 10 mmol/1 trisz-HCl, pH = 8,0, 10 mmol/1 EDTA és 0.1 % SDS, és amely puffer kiegészítésül tartalmaz még 0.1 mg/ml RN-ázt és 0,1 mg/ml proteináz K-t, és az így kapott elegyet 1 órán át 50 °C hőmérsékleten inkubáljuk. A vizes fázist háromszor extraháljuk fenol/kloroformmal. A vizes fázisból a DNS-t etanollal csapjuk k . A kapott üledéket 50 μΐ vízben vesszük fel. A szuszpenzió 10 μΐ-nyi mennyiségét alkalmazzuk PCR-vizsgálathoz. A PCR végrehajtásának körülményei a Perkin-Elmer cég (GeneAmp DNA Amplification Reagent Kit) által ajánlottak. A megsokszorozott fragmentumokat agarózgélen elemezzük.
Az 5168 és 5169 számú primerek a Β1 inszerciós hely mindkét oldalán hibridizálódnak, az inszerciós helytől a 3’-, illetve az 5’-vég irányába. Szekvenciájuk a következő:
Szám
5 169 5
5 168 5
3254 5
’ - > 3 ’ szekvencia Az alábbival komplementer
CCTTTACTGTTAGTTCTACAATCGAAATTATGC 3’ FPV CATGTAGATTTTAATCCGTTAACACGCGCAG 3’ FPV GCCGGAAAACCTACCGGATTGATGG 3’ LacZ
Egy 220 bp méretű fragmentumot építünk be vad TIR-ekbe, és egy több mint 3 kb méretű fragmentumot a LacZ gént tartalmazó TIR-rekombinánsba. A LacZ gén kimutatására egy második beépítéshez az 5168 jelölésű prímért alkalmazzuk a Bl helytől a 3’-vég irányába, és a 3254-primert a LacZ gén belsejében. Egy 674 bp méretű fragmentumot is beépítünk. A primerek ilyen megfontolt megválasztása lehetővé teszi a rekom12
HU 215 531 R bináns TIR-eknek a nem rekombináns TIR-ektől való megkülönböztetését. Egy vírusszuszpenziót akkor tekintünk homogén, kettős rekombinánsnak, ha a WT (vad) fragmentum nem épül be. Kontrollként a WT vírus genomja és a pTIRBl és pTIRBlLac plazmidok szolgálnak.
Primerek Vad fragmentumok Rekombináns fragmentum
5169+5168 220 bp 3 kb
3254+5168 - 674 kb
- =nincs beépült fragmentum.
15. példa
A LacZ gén expressziója szövettenyészetben a
CNP/LacZ rekombináns vírusok által
A p-galaktozidáz-(p-gal) aktivitást o-nitro-fenil-βD-galaktopiranozid (ONPG) szubsztrátként való alkalmazásával mérjük. Az enzim az ONPG-t galaktózzá és o-nitro-fenollá alakítja, mely utóbbi sárga színű, és mennyisége a 420 nm-nél adott abszorpcióval mérhető. Ezt az abszorpciót β-gal-egységekké kalibrációs görbe szerint alakítjuk a következő összefüggés figyelembevételével :
„1 β-gal-egység= 1 μιηοΐ termelt ΟΝΡ/3χ 106 sejt/az extraktum 60 perces inkubálása 28 °C hőmérsékleten”.
Ezt a „β-gal” vizsgálatot a következő módon végezzük el egy 25 cm2 felszínű lombik esetén. Pox vírusok esetén a fertőzésnek azonnali és késői fázisa különböztethető meg. A rövidebb, az azonnali fázis mintegy 6 órán át tart. A genom replikációjának idejére fejeződik be. A késői fázis a replikációval kezdődik, és a fertőzési ciklus a vírusrészecskék kiszabadulásával fejeződik be, azaz mintegy 3 nappal később. Ahhoz, hogy a LacZ gén az azonnali fázisban kellően kifejeződjön, az azonnali fázist mesterségesen megnyújtjuk citozin-βarabinofuranozid (AraC) alkalmazásával, amely egy replikációs inhibitor.
a) Sejtek
Az 1. napon (D= 1) egy lombikba 3 χ 106 QT35 sejtet viszünk be 5 ml szaporító tápközegbe.
A 2. napon (D=2) a sejteket 3 vírus/sejt fertőzési gyakorisággal befertőzzük. Az elegyet 1 órán át 38 °C hőmérsékleten inkubáljuk. A vírusinokulumot ezután pipettával távolítjuk el. AraC-nal (Sigma) 40 pg/ml koncentrációban kiegészített vagy ezt nem tartalmazó 5 ml fenntartó tápközeget adunk egy-egy lombikba. A tenyészeteket 16 órán át 38 °C hőmérsékleten inkubáljuk.
b) Begyűjtés a 3. napon (D = 3)
A sejteket a lombikról lekaparjuk.
A tenyészetet 10 percig 6000 g mellett centrifugáljuk, a centrifugálás üledékét 500 μΐ PBS-ban újraszuszpendáljuk, a szuszpenziót összekeverjük, és 1,4 ml-es Eppendorf-csőbe visszük át.
A sejteket ezután 50 μΐ CHC13 és 5 μΐ 10%-os SDS hozzáadásával lizáljuk. A sejtszuszpenziót rövid ideig keverjük. Ezután a szuszpenziót 9000 g mellett 5 percig centrifugáljuk.
c) Enzimes reakció mintához elegendő ONPG-szubsztrátot a következő módon készítünk: 27,7 mg ONPG (Sigma) és 50 ml 1 ml 0,1 mol/l-es MgSO4 és 1 ml 2-merkapto-etanol(Merck) tartalmú hígítóanyag elegyét pufferrel 100 ml végtérfogatra egészítjük ki (90 ml 0,1 mol/l-es NaHPO4, pH = 7,0, 0,1 mol/1 magnézium-szulfát, 1 ml merkapto-etanol).
1,95 ml ONPG-oldatot és 50 μΐ sejtszuszpenziót elegyítünk, és az elegyet 28 °C hőmérsékleten 1 órán át inkubáljuk. Ezután a szuszpenzióhoz 2 ml 1 mol/l-es Na2CO3-t adunk, és a kapott szuszpenzió abszorpcióját 420 nm-nél mérjük.
A rekombináns vírusok β-galaktozidázaktivitásának összehasonlító eredményeit az alábbiakban ismertetjük β-gal-egységekben megadva.
Vírus Azonnali (AraC) Azonnali+késői (-AraC)
Absz. β-galE Absz. β-gal E
Wt 0 0 0 0
73 0,28 57 0,58 120
V4 0,34 71 0,58 120
75 0,26 52 0,49 101
V8 0,05 10 0,65(1:5) 670
79 0,05 10 0,31 (1:10) 640
wt =ncm rekombináns, vadtípus;
azonnali (Arac) =az azonnali szaporodási fázist mesterségesen 16 órával elhalasztjuk AraC adagolásával;
azonnali+késői (-AraC)=tcrmészctcs, azonnali és késői fázisok AraC nélkül;
Absz. =abszorpció;
β-gal E =a mért β-galaktozidázcgység;
1:5 és 1:10 =az extraktumok előzetes 5-szörös és
10-szcrcs hígításai.
A P7.5 Vaccinia promoter a fertőzés azonnali és késői fázisaiban működik (V3, V4 és V5); a PH promoter csak a késői fázisban fejt ki aktivitást (V8 és V9); a Vaccinia esetén a Pl 1 promoter erősebb, mint a P7.5 promoter. így a CNP vírusban megőrződött a két promoter időszakos szabályozó hatása, valamint relatív erőssége, függetlenül a B1 vagy B2 helynél történt inszerciótól vagy a LacZ orientációjától.
16. példa
Csirkék vakcinálása CNP/LacZ rekombináns vírussal. Védelem szárnyashimlővel szemben. Immunválasz fi-galaktozidázra A CNP/LacZ rekombinánsok vakcinálóerejét vizsgáljuk. A két kritérium, amelyek szerint a szelekciót végezzük, a számyashimlő ellen nyújtott védelem és a βgalaktozidázra adott immunválasz.
a) Adagolás a szárny átlyukasztásával
A V4 és V8 rekombináns vírusok szuszpenzióját vagy a CNP vakcinatörzs szuszpenzióját egynapos, igazoltan specifikus patogénmentes (SPF) csirkékbe injek13
HU 215 531 Β táljuk be szárnyuk membránját átlyukasztva (az úgynevezett ,,számyhártya”-eljárással) (WW).
A vizsgálatot három, egyenként 28-30 csirkéből álló csoporton végezzük, amelyek vakcinálását V4 vagy V8 vagy CNP alkalmazásával végezzük, és negatív kontrollként nem vakcináit csirkék 15 fős csoportját alkalmazzuk.
Minden csirkének 10 μΐ mennyiségű 5xl05 TCID50/ml dózisú (Tissue Culture Infectious Dose=szövettenyészet-fertőző dózis) vírusszuszpenziót adunk be, amely ekvivalens 5 χ 103 TCID50-nel madaranként. A 29. napon a csirkéket virulens vírussal hozzuk érintkezésbe (Aphis, USA eredetű Fowl Pox Challenge Vírus).
nap múlva végzett kiértékelésnél a szárnyashimlő ellen vakcináit csirkék mindegyikének védettségét mutatja a károsodás hiánya. Másrészt a nem vakcináit csirkék fele károsodott. A β-galaktozidáz elleni antitesttiter közvetlen ELISA-vizsgálata a V4 vírussal vakcináit 29 csirke közül 21-nél (72%), a V8 vírussal vakcináit 28 csirke közül pedig 20 (71%) esetén mutatta ki, hogy a vírus szerokonverziót hozott létre, azaz szeropozitívek a csirkék.
A 100 fölötti optikai sűrűséget adó legnagyobb hígítás az ELISA-titer, ezeknél a csirkéknél az átlagos antiβ-galaktozidáz ELISA-titer a szérumban 1:800.
b) Adagolás intramuszkulárisan vagy szubkután úton
Egynapos csirkéket az első napon intramuszkulárisan (IM, 27 csirke) vagy szubkután (SC, 34 csirke) vakcinálunk 104·4 TCID50 dózisú V8 víms alkalmazásával. A csirkéket 27 nap múlva tesszük ki fertőzésnek. A vakcináit csirkék mindegyike (100%) védett a szárnyashimlővel szemben. A β-galaktozidáz elleni szerokonverziót az IM úton vakcináit 27 csirke közül 24-nél (88%) és az SC úton vakcináit 34 csirke közül 27-nél (79%) észleltünk.
Az immunizálás eredményeit összefoglalva az alábbiakat találtuk:
- a genomjuk TIR-régiójában, a B1 vagy B2 helyen LacZ gént tartalmazó rekombináns vírusok megőrizték immunogén hatásukat;
- a P7.5 és Pl 1 promoterek működnek az állatban;
- β-galaktozidáz ellen antitestválasz indukálódott, ami úgy tekinthető, mint a CNP-rekombináns által kifejezett heterológ protein;
- az intramuszkuláris (IM), szubkután (SC) és számymembrán-átlyukasztásos (WW) adagolási módok egyenértékűek mind a számyashimlő elleni védelem szempontjából, mind a β-galaktozidáz elleni szerokonverzió százalékos értéke szempontjából.
17. példa
Szárnyasbronchitisz-vírus E2 glikoproteinjét kódoló gén inszerciöja transzfervektorokba A fertőző számyasbronchitiszért felelős vírus (IBV) egy koronavírus. Ennek a vírusnak a legfontosabb felületi antigénje az E2 protein, amely két, az SÍ és S2 alegységből áll [Cavanagh, D., J. Gén. Virol., 64, 2577-2583 (1983); Cavanagh, D. és munkatársai, Vírus research, 11, 141-150 (1988)]. Számos szerotípus létezik, köztük a Massachusetts, jelölése M41, és a holland szerotípusok, különösen a Dl466 és D274 [Kusters, J. G. és munkatársai, J. Gén. Virol. 68, 343-352(1987)].
Kifejlesztettünk egy rekombináns CNP-vakcinát, amely az IBV E2 proteinjét fejezi ki, hogy hatékony vakcinát nyerjünk a fertőző számyasbronchitisz vírusa (IBV) ellen.
Az M41 szerotípusú E2 proteingént Dr. Kusterstől [Utrechti Egyetem, Hollandia] kaptuk, ugyancsak tőle kaptuk az E2 gén Dl466, D207 és D274 szerotípusú nagy ffagmentjeit.
Az M41 szerotípusú E2 gén BamHI kazettáját helyspecifikus mutációval konstruáltuk. A fragmentumokból, ugyancsak BamHI-gyei kompatibilis kazettákon a Dl466 törzs teljes génjét és egy teljes D207/D274 hibrid gént konstruáltunk. Ezt a három kazettát a P7.5 promotertől a 3’-vég irányába klónozva a következő három plazmidot hoztuk létre: p75M41, p'75D1466 és P75D207.
A P7.5-E2 kazettákat a pTIRBl transzfervektor BamHI helyére klónoztuk, és ezt követően a PllLac kazettát az E2-től a 3’-vég irányába, a BamHI helyre klónoztuk. A kapott transzferplazmidok a PTIRBlP75M41Lac, pTIRBlP75D1466Lac és pTIRBl P75D207Lac. A rekombináns vírusakat transzferrel konstruáltuk, és a 9., 10. és 11. példákban leírt módon tisztítottuk. A genomjukat Southem-blotelemzessel vizsgáltuk a 13. példában leírt módon. Az E2 antigén expresszióját a következő immunológiai eljárásokkal vizsgáltuk: ELISA-, Westem-blot- és immunfluoreszcenciás vizsgálat, specifikus antitestek alkalmazásával. A rekombináns vírusokból egy nagyobb mennyiséget állítottunk elő. Ezeknek a rekombinánsoknak egy dózisával baromfit vakcináltunk. A vakcinálás hatékonyságát patogén vírusokkal való fertőzést követően vizsgáltuk a fertőző bronchitisz esetén szokásos módszerekkel, valamint a vírus ellen képződött antitestek szintjének meghatározásával.
18. példa
Eimeria gén inszerciöja a transzferplazmidokba,
CNP/TA4 rekombinánsok konstruálása
Az Eimeria nemzetségbe baromfiparaziták tartoznak, amelyek a kokcidiózisért felelősek. Az E. tenella, E. necatrix, E. maxima fajok felületi antigénjeit leírták, ezek leírása nevezetesen a 0 164 176 és 0 231 537 számú európai szabadalmi leírásokban szerepel.
A kokcidiózis ellen hatékony rekombináns vakcinát fejlesztettünk ki.
A TA4 vagy A4 jelölésű E. tenella antigén egy 25 kd méretű protein, amely két alegységből áll, egy 17 kd-os és egy 8 kd-os, egymáshoz diszulfidhíddal kötött alegységből. A gént egy genomkönyvtárból, valamint mRNS-ből izolálták. A gén teljes leírása az előzőekben említett szabadalmi leírásokban található.
A TA4 gén BamHI kazettáját szubklónozással konstruáltuk. A pTA406 plazmid a TA4 kódolószekvenciát tartalmazza. A pTA410 plazmid olyan TA4 gént hordoz, amelynek két alegysége a proteolitikus szekvencia mó14
HU 215 531 Β dosítása folytán elválasztott. A natív Arg-Arg-Leu szekvenciát az Arg-Glu-Lys-Arg szekvencia helyettesíti [Kieny és munkatársai, Protein engineering, 2. (3); 219-225 (1988)], amely helyspecifikus mutációval hozható létre. Ezt a két BamHI kazettát a plP7.5 plazmid P7.5 promoterétől a 3’-irányba klónoztuk olyan orientációval, hogy a TA4 gén a P7.5 kontrollja alatt álljon.
A P7.5-TA406 és P7.5-TA410 kazettákat pTIRBID transzfervektor BamHI helyére klónoztuk. Ezután a Pll-Lac kazettát a TA4 géntől a 3’-irányba eső BamHI helyre klónoztuk. A kapott transzferplazmidok a pTIRTA406Lac és pTIRTA410Lac.
A rekombináns vírusokat a 9., 10. és 11. példában leírt transzfer révén kapjuk. Kék plakkokat nyerünk. A TA406 gént hordozó rekombináns a V20, a TA410 gént hordozó a V21.
Egy kettős rekombináns V21 vírust, azaz olyan vírust, amely mindkét TIR-egységében egy-egy kópia TA410-t és LacZ-t hordoz, mikrotiterlemezen tisztítunk, és genomját a 14. példában leírt módon PCR alkalmazásával vizsgáljuk. Az alkalmazott primerek és a beépített fragmentumok mérete az alábbi táblázatban szerepel. Az 1871 számú primer a LacZ gén komplementere.
Primerek Vad fragmentumok Rekombináns fragmentumok
5169+5168 220 bp 4 kb
5169+1871 - 1,2 kb
A TA4 antigén expresszióját a következő immunológiai vizsgálatokkal határozzuk meg: ELISA-, Westem-blot- vagy immunfluoreszenciás vizsgálat, specifikus antitestek alkalmazásával.
A rekombináns vírusokból nagyobb mennyiséget termelünk. A rekombinánsok megfelelő dózisával baromfit vakcinálunk. A vakcina hatékonyságát virulens Eimeriával való fertőzést követően vizsgáljuk a szérumnak kokcidiózis vizsgálatára szolgáló módszerekkel való ellenőrzésével, a tömeggyarapodás nyomon követésével és klinikai tünetek megfigyelésével.
19. példa
A fertőző nyálkatömlőkór-vírus poliprotein génjének inszerciója transzfervektorokba A fertőző nyálkatömlőkór kóroki tényezője egy, a
Bimaviridae családba tartozó vírus. Az IBDV jelölésű vírus (az angol Infectious Bursal Disease Vírus elnevezés rövidítéseként) egy igen fertőző kórt okoz (fertőző nyálkatömlőkór), amely a fiatal csirkéket érinti, és a Fabricius nyálkatömlők limfoid sejtjeinek roncsolásával jár, A vírus genomja két dupla szálú RNS-t tartalmazó szegmentből áll, az A szegment mintegy 3400 bázispárméretű, a B szegment mintegy 2900 bázispárméretű. A vírusrészecskék burok nélküliek, ikozaéder formájúak, és mintegy 60 nm átmérőjűek. Négyféle vírusproteint egyértelműen azonosítottak: a 90 K (K=kilodalton) molekulatömegű VPl-t, a 37-40 K molekulatömegű VP2-t, a 32-35 K molekulatömegű VP3-t és a 24-29 K molekulatömegű VP4-t [Dobos P., Journal of Virology 32, 1046-1050 (1979); Fahey K. J., O’Donnell I. J. és Azad A. A., J. Gén. Virology 66, 1479-1488 (1985)]. A VP2 egy 41-54 K molekulatömegű VPX prekurzorból származik.
A B szegment kódolja a VP1 -t, amely valószínűleg a vírus-polimeráz. Az A szegment három más proteint kódol. Ezek a proteinek proteolitikus hasítással jönnek létre egy mintegy 110 K molekulatömegű prekurzorbol, amely az A szegment egy nagy, nyílt leolvasási keretének felel meg. A VP4 fehérje részt vesz ebben a proteolitikus hasításban [Jagadish Μ. N., Staton V. J., Hudson P. J. és Azad A. A., J. Virology 62, 1084-1087 (1988)]. A VP2 és VP3 proteinek alkotják a vírus külső fehérjeburkát. A VP2 tartalmazza azokat az antigén determinánsokat, amelyek a vírust semlegesítő antitestek szintézisének indukálására képesek [Becht H., Müller H. és Müller Η. K., J. Gén. Virology 69, 631-640 (1988); Fahey K. J., Emy K. és Crooks J., J. Gén. Virology 70, 1473-1481 (1989)].
A fertőző nyálkatömlőkór ellen rekombináns Fowlpox vakcinát fejlesztettünk ki. A kifejlesztés lépései a következők
A kiválasztott IBDV törzs, nevezetesen az EDGÁR törzs genetikai anyagának izolálása. Az EDGÁR vírus beszerzési helye a United States Department of Agriculture (USDA, APHIS 6505 Belcrest Road, Hyattsville, MD 20782, United States).
Az A szegmentnek megfelelő cDNS nukleotidszekvenciájának szintézise, klónozása és meghatározása.
A fenti cDNS, ennek a genetikai anyagnak Fowlpoxszal fertőzött állati sejtekben való kifejeződéséhez szükséges szekvenciák, és a rekombináns Fowlpox vírusok szkrínelését lehetővé tevő szekvenciák inszerciója pTIRBl transzferplazmidba a 4. példában leírt módon.
A rekombináns vírusok izolálása és tisztítása.
A rekombináns vírusok genetikai elemzése.
A rekombináns vírusok által hordozott IBDV gének sejttenyészetben in vitro történő expressziójának vizsgálata.
Csirkék vakcinálása a rekombináns vírusokkal, és a fertőző nyálkatömlőkór elleni védettség vizsgálata.
1. lépés
Az EDGÁR törzs vírus RNS-t a vírussal fertőzött csirkék nyálkatömlőjéből izoláljuk. Mintegy 40 g, a vírussal történt fertőzés után a 7. napon összegyűjtött nyálkatömlőt 40 ml TNE-pufferben homogenizálunk (TNE: 10 mmol/1 trisz-HCl, 100 mmol/1 NaCl, 1 mmol/1 EDTA, pH=8). A homogenizált terméket 17 000 g mellett centrifugáljuk, a kapott vizes fázist olyan kétfázisú, előre elkészített szacharózgradiensre rétegezzük rá, amely egy 40 és egy 60 tömeg/térfogat%-os, TNEpufferben készült szacharózrétegből áll. A gradienst 134 000 g mellett 2 óra 30 percen át centrifugáljuk. A 40%-60% közötti szacharózgradiens köztes fázist összegyűjtjük, ez tartalmazza a részlegesen tisztított vírust. Ebből a fázisból 5 ml-t hozzáadunk 5 ml olyan pufferhez, amely 10 mmol/1 trisz-HCl-t, 100 mmol/1 NaCl-t, 0,5% SDS-t, 10 mmol/1 EDTA-t és 2 mg/ml proteináz K-t tartalmaz, és pH-ja=7,5. Az elegyet 1 órán át 37 °C
HU 215 531 Β hőmérsékleten inkubáljuk. Ezután a vizes fázist fenol/kloroformmal extraháljuk. A vizes fázisból a nukleinsavakat etanollal, 0,8 mol/1 LiCl jelenlétében kicsapjuk, majd a csapadékot 500 μΐ vízben vesszük fel.
2. lépés
A szintézist és az A szegmentnek megfelelő cDNS beépítését a „GENEAMP RNA PCR KIT, PERKIN ELMER CETUS” helyen leírt eljárás szerint végezzük, és az első DNS-szál reverz transzkriptázzal történő szintézisének primerjeként olyan szintetikus oligonukleotidokat 10 vagy primereket alkalmazunk, amelyek az A szegment szekvenciájával komplementerek. Ezeknek a szintetikus oligonukleotidoknak a meghatározását más IBDV törzsek A szegmentje közölt szekvenciájának elemzésével végeztük, ezek a törzsek a 002-73 ausztrál törzs 15 [Hudson P. J., McKem N. M., Power Β. E. és Azad A.
A., Nucleic acids research 14, 5001-5012 (1986)], a CU-1 német törzs [Spies U., Müller H. és Becht H., Nucleic acids reseach 17, 7982 (1989)] és az 52/70 brit törzs [Bayliss C. D., Spies U., Shaw K., Peters R. W., 20 Papageorgiou A., Müller H. és Boursnell Μ. E. G., J.
Gén. Virology 71, 1303-1312 (1990)]. A primerek szekvenciája, valamint helyzete az EDGÁR törzs A szegmentjéhez viszonyítva a 8. és 9. ábrákon látható.
Az IBDV törzsek közzétett szekvenciáinak elemzé- 25 se azt mutatja, hogy az A szegment egyazon kódolószálán a VP2, VP4 és VP3 fehérjéket kódoló ORF1 nagy, nyílt leolvasási kereten kívül még két másik nyílt leolvasási keret is van. Ezek egyike az ORF2, amely az ORF 1 ATG-jétől az 5’-vég felé 34 bp távolságra kezdődik, és az ORF 1-t 435 bp hosszúságban átfedi. A másik az ORF3, amely az ORF2-től az 5’-vég irányába 32 bp távolságra kezdődik, és 31 bp hosszúságú. Ezeknek az ORF-eknek a vírus biológiájában betöltött lehetséges szerepe még nem tisztázott.
Négy olyan kettős szálú cDNS-fragmentumot hoztunk létre, amelyeket a következő primer párok határolnak: 0-lb (585 bp), 1-2 (1129 bp), 3-4 (670 bp),
5-6 (1301 bp), és amelyek az A szegment ORF1 és ORF2 egységeit hidalják át (lásd a 8. ábrán). 40
Ezeket a fragmentumokat a pBSPlus vagy pBSLKl plazmidokba klónoztuk; így hat plazmidot konstruáltunk (lásd a 8. és 10. ábrán).
A plazmid neve Mcret (bp) Konstrukciós vizsgálat
pBSIVDVO 3478 pBSPlus (Pstl +Hinc2)+ a 0-lb fragmentum 277 bp Pstl fragmentuma
pBSlA2 3932 pBSLKl (Pstl+T4 DNS-polimeráz, Sacl)+az 1 -2 fragmentum 760 bp Sacl fragmentuma
pBSIB 3538 pBSLKl (Pstl+T4 DNS-polimeráz, Sacl)+az 1-2 fragmentum 369 bp Sacl fragmentuma
pEDGAR34i 3887 pBSLKl (Pstl+T4 DNSpolimeráz, Hinc2)+670 bp 3-4 fragmentum
pBS3A 4175 pBSLKl (Pstl +T4 DNS-polimeráz, Sphl)+az 5-6 fragmentum 956 bp Sph 1 fragmentuma
pBS3B 3509 pBSLKl (Pstl+T4 DNS-polimeráz, Sphl)+az 5-6 fragmentum 345 bp Sphl fragmentuma
Meghatározzuk ezen plazmidok IBDV-ffagmentumainak nukleotidszekvenciáját, és ezeket úgy rendezzitk, hogy helyreállítsuk az EDGÁR törzs A szegmentjének szekvenciáját, amelyet PCR-eljárással illesztünk be (lásd a 9. ábrát). Az EDGÁR törzs eredeti szekvenciáit, amelyeket az egyéb IBDV törzsek közölt szekvenciái alapján meghatározott primerekkel helyettesítet30 tünk, ugyancsak meghatározzuk ezeknek a régióknak az amplifikációs termékeiből az ezeken kívül elhelyezkedő primerek felhasználásával.
Az A szegmentnek a kapott kiónokból való rekonstrukcióját vázlatosan a 10. ábrán mutatjuk be. Az eljárás 35 lépései a következők:
1. pEDGAR 12 konstruálása: pBSlA2 (EcoRl+T4 DNS-polimeráz, Sacl) +pBSlB (Sphl +T4 DNS-polimeráz, Sacl)
2. pEDGARM12 konstruálása pEDGAR12 helyspecifikus mutációjával:
a) a pEDGAR 12 IBDV-szekvenciától az 5’-vég felé elhelyezkedő Sphl helyének deléciója: eredeti szekvencia:
Sphl ’ GTCTGATCTCTACGCATGCAAGCTTTTGTTCCCTTTAGTGAGGG 3 ’ Mutációs primer
5’ GTCTGATCTCTACGGTTCCCTTTAGTGAGGG 3’
b) a pEDGAR 12 EcoRl helyének deléciója és egy Sphl hely bevitele az IBDV-szekvenciától a 3’-vég irányába.
Eredeti szekvencia:
EcoRl ’ CGACTCACTATAGGGCGAATTCCCCCCAGCGACCGTAACGACTG 3 ’ <- IBDV
Mutációs primer:
Sphl
5’ CGACTCACTATAGGGCGGATCCCGCATGCCCCAGCGACCGTAACGACTG 3’ <- IBDV
HU215 531 Β
3. ρACEDGARM12 konstruálása: 4.
A pEDGARM12 Bell -Sphl helyének inszerciója a pACYC 184 Bell-Sphl helyére.
A pEDGARM34i konstruálása a pEDGAR34i hely specifikus mutációjával:
Az Sphl hely kicserélése egy Nsil helyre.
Sph 1
Eredeti szekvencia: 5’ GCTCGAAGTTGCTCAGGCATGC/XAGCTTTTG 3’ IBDV ->
Mutációs Nsil primer 5 ’ GCTCGAAGTTGCTCATGCATGCAAGCTTTTG 3 ’
IBDV ->
5. pEDGAR45 konstruálása:
pBS3A (Hinc2 + Pstl)+pEDGAR34i Hinc2-Pstl fragmentuma
6. pACEDGAR 14 konstruálása: pACEDGARM12 (Sphl +T4 DNS-polimeráz, BamHI) +pEDGARM34i (Nsil +T4 DNS-polimeráz, BamHI)
7. pACEDGAR 15 konstruálása:
pACEDGAR14 (BamHI+T4 DNS-polimeráz, Sall)+pEDGAR45 (Pvu2-Sall)
8. pACEDGAR 1 konstruálása pACEDGARl 5 (Sphl +EcoRV)+pBS3B (Sphl +Pvu2). Ez a plazmid a Bell-BamHI fragmentumon az
A szegment ORF1 teljes szekvenciáját tartalmazza.
9. pBSIBDVOb konstruálása a pBSIBDVO helyspecifikus mutációjával:
ORF3 bevitele az ORF1 és ORF2 kezdetét hordozó pBSIBDVO plazmidba;
Eredeti szekvencia:
pBSPlus -> —ORF2—>
’ CCCGGGGATCCTCTAGAGTCCCTCCTTCTACAACGTGATCATTGATGG 3 ’
Be 1 1
Mutációs primer:
—ORF2—>
pBSPlus -> --------------ORF3-------------->
’ CCCGGGGATCCTCTAGAGTCTGATCAGGATGGAAC1 CCTCCTTCTACAACGCTATCATTGATGG 3
Be 1 1
10. pACEDGAR2 és pACEDGAR3 konstruálása:
A pACEDGAR2 és pACEDGAR3 plazmidokat a pACEDGAR 1 plazmid Bcll-Rsr2 régiójának a pBSIBDVO, illetve a pBSIBDVOb plazmidok 35 Bcll-Rsr2 fragmentumára való kicserélésével nyerjük.
A 3 plazmid, a pACEDGARl, a pACEDGAR2 és pACEDGAR3 így lehetővé teszi, hogy az EDGÁR törzs A szegmentjének az ORF 1, az ORF 1-ORF2 és az ORF1-ORF2-ORF3 egységeit a Bell-BamHI fragmentumon izoláljuk.
A fenti három plazmidnak az ORF-ek ATG oldalán való szekvenciája az alábbi:
pACEDGARl pACEDGAR2 pACEDGAR3
Be 1 1 ’ TGATCACAGCGATGACA ... 3 ’
----ORF1---->
Be 1 1 ’ TGATCATTGATGGTTAGTAGAGATCAGACAAACCATCGCAGCGATGACA ... 3 ’ -------------------ORF2---------------------->
---ORF1---->
Be 1 1 ’ TGATCAGGATGGAACTCCTCCTTCTACAACGCTATCATTGATGGTTAGT ... 3 ’ --------------ORF 3-------------->
------ORF 2----->
3. lépés
Ezeket a BcIl-BamHl fragmentumokat ezután a p2P75 plazmid BamHI helyére klónozzuk, így a p75EDGARl, p75EDGAR2 és p75EDGAR3 plazmidokat hozzuk létre, és az A szegment kódolószekvenciáját (szekvenciáit) a P7.5 promoter szabályozása alá helyezzük.
Ezeket a kódolószekvenciákat a Pl 1 promoter szabályozása alá is helyezzük. A Pll promotert hordozó pACPll plazmid Bcll-BamHl fragmentumát a pACEDGARl, pACEDGAR2 és pACEDGAR3 plazmidok BamHI helyére inszertáljuk, így a pl 1 EDGÁR 1, p: 1EDGAR2 és pllEDGAR3 plazmidokat hozzuk létre.
Ezekből a plazmidokból izoláljuk a P75-EDGAR vagy Pl 1-EDGÁR Bcll-BamHl kazettákat, és ezeket a pTIRBl plazmid BamHI helyére inszertáljuk, így a pTIR75EDGARl, pTIR75EDGAR2, pTIR75EDGAR3,
HU 215 531 Β pTIRl 1EDGAR1, pTIRllEDGAR2 és a pTIRllEDGAR3 plazmidokat hozzuk létre. A pTIRBl plazmidon belül a Bell-BamHI orientációja, amelyet megőriztünk, olyan, hogy a transzkripció iránya a P7.5 és Pll promotereknél kezdődik, és egybeesik a pTIRBl plazmidban jelen lévő ORF1 és ORF2 irányával.
A Pl 1-LACZ kazettát hordozó pACPl 1LAC plazmid Bgl2-BamHI fragmentumát a pTIR75EDGARI és a pTIR75EDGAR2 plazmidok BamHI helyére inszertáljuk, így a pTIR75ElLAC és pTIR75E2LAC plazmidokat hozzuk létre. APU -LACZ orientációja a plazmidokon belül olyan, hogy a LACZ gén transzkripciójának iránya egybeesik az ORF1 és ORF2 transzkripciójának irányával.
Hasonló módon hozzuk létre a pTIRHElLAC, pTIRllE2LAC és pTIRllE3LAC plazmidokat a p75LAC plazmid Bgl2-BamHl fragmentumának formájában izolált p75-LACZ kazettának a pTIRl 1EDGAR1, pTIRllEDGAR2 és pTIRllEDGAR3 plazmidok BamHI helyére való inszerciójával.
Végül a pTIRl 1VP2LAC plazmidot úgy hozzuk létre, hogy a pllEDGARl plazmid Xhol (T4 DNS-polimerázzal kezelt)-Bgl2 fragmentumát a pTIRl 1E1LAC plazmid T4 DNS-polimerázzal kezelt PpuMl helyére és Bgl2 helyére inszertáljuk. A pTIRllVP2LAC transzferplazmid a VP2 protein teljes szekvenciáját tartalmazza a P11 promoter szabályozása alatt, valamint a VP4 protein aminoterminális részét is; a konstrukció folytán a három utolsó aminosav (Asp, Leu és Glu; a VP3 karboxilterminális része) és a poliprotein transzlációs stopkodonja (TGA) azonos fázisban egyesülnek. A 9. ábráról látható, hogy ez a heterológ protein ezért megfelel a poliprotein egy részének, amely az 1-493. aminosavakat, majd ezt követően az 1010-1012 aminosavakat tartalmazza, és amelyben a VP2 protein benne foglaltatik.
Példaként all. ábrán bemutatjuk a pTIR75ElLAC plazmidot.
4. és 5. lépés
Az EDGÁR törzs ORF-jeit tartalmazó rekombináns Fowlpox vírusokat izoláljuk, tisztítjuk és jellemezzük a 9., 10., 11., 12., 13. és 14. példákban leírt módon. A rekombináns vírusok jelölése a következő:
V11=P7.5E1 V12=P7.5E2
V14=P11E1 V15=P11E2
V17=P11VP2 V16=P11E3
A kettős rekombináns TIR-ek PCR-vel való szelektálásához alkalmazott primerek megkülönböztetik a WT TIR-eket és a LacZ-, El-, E2-, E3- vagy VP2-tartalmú TIR-eket. A primerek kombinációi, valamint a bevitt fragmentumok mérete az alábbi táblázatból látható.
Az IBDV16, 3, lb és 22 primerek az IBDV-hez hibridizálódnak. Az IBDV16, lb és 3 primerek a VP2 kódolórészéhez hibridizálódnak. Az IBDV22 primer a VP3 kódolórészéhez hibridizálódik, és ezért nem a V17 genomjához. Az 5168 és 5169 primerek a FPVhez hibridizálódnak. Az 1871 primer a β-galaktozidázgénhez hibridizálódik. Ezeknek a primereknek a szekvenciáját „A primerek listája és szekvenciájuk” táblázatban adjuk meg.
Primerek Vírus Fragmentumok (nt)
5169+5168 WT 220
rekombinánsok 6,0 kb
5169+1871 V8 310
rekombinánsok 3,6 kb
5169+IBDV16 Vll 341
V14, V17 339
V12 373
V15 371
V16 402
5169+IBDVlb V17 766
IBDV22 + 1871 Vll, V12 379
V14, V15, V16 479
V17 -
IBDV3 + 1871 V14, V15, V16 2280
V17 732
6. lépés
A rekombináns vírusok IBDV antigénjeinek a QT35 sejtekben való kifejeződését összehasonlítjuk. A Cu-1 IBDV törzs ellen termelt antitestekhez H. Müller professzor [Institut fúr Virologie, Justus-Liebig-Universitát, Giessen, Németország] szívességéből jutottunk. Ezek a következők:
1. Cu-1 törzs ellen hiperimmunizált nyúlból származó poliklonális szérum (No. B22),
2. a VP-3 proteint natív és denaturált formájában felismerni képes anti-VP3 egér monoklonális antitest (No. I/A10),
3. a VP-2 protein konformációs epitópjainak felismerésére képes anti-VP2 egér monoklonális antitest (No. Bl); a BI antitest olyan antitest, amely képes a Cu-1 vírustörzs neutralizálására.
a) A fertőzés kísérleti körülményei
Az első napon (D= 1) 25 cm2 felületű lombikba ml szaporító tápközegbe (amelynek összetétele az 1. példában szerepel) 2,5 χ 106 QT35 sejtet oltunk. 8 lombikot készítünk ilyen módon.
A második napon (D=2) a sejteket a VI1, V12,
V14, V15, V16, V17 és V8 (negatív kontroll) rekombináns vírusok mindegyikével és IBDV-vel (nyálkatömlc 2 törzs, pozitív kontroll) 0,01 vírus/sejt fertőzési gyakorisággal beoltjuk.
Az 5. napon (D = 5) a fertőzött sejteket összegyűjtjük, és a tápközeget fagyasztjuk, majd kiolvasztjuk.
b) Az expressziós termékek szendvics típusú ELISAtesztje
Az ELISA-tesztet első antitestként a B22 poliklonális antitesttel, második antitestként vagy az antiVP3 monoklonális antitesttel (No. I/A10), vagy az antiVP2 semlegesítő monoklonális antitesttel (No. Bl) végezzük. Az ELISA-teszttel kapott görbéket a 12a. ábrán mutatjuk be anti-VP3, és a 12b. ábrán anti-VP2 esetén.
HU 215 531 Β
Ezen vizsgálatok eredménye a következőket mutatja.
1. (Lásd a 12a. ábrát): a VP3 protein kifejeződött minden olyan rekombinánsban (VI1, V12, V14, V15 és V16), amelyik legalább egy, a poliproteint kódoló szekvenciát tartalmaz (ŐREI, VP2-VP4-VP3 proteinek), de nem fejeződött ki a VI7 rekombinánsban, mivel ez csak a VP2-t és a VP4 aminoterminális részét kódoló régiót tartalmaz, és nem fejeződött ki a V8 rekombinánsban sem, mivel ez nem tartalmaz IBDV-szekvenciát.
A VP3 fehérje kifejeződésének szintje alacsonyabb a VI1 és V12 rekombinánsokban, mint a VI4, VI5 és VI6 rekombinánsokban, ami feltehetően összefüggésben van a különböző rekombinánsokban jelen lévő promoterek erősségével: a p7.5 promoter aktivitása (a VI1 és VI2 rekombinánsokban) kevésbé erős, mint a pll promoteré (a VI4, VI5 és VI6 rekombinánsokban) (lásd a 15. példát).
Nem észleltünk különbséget a VP3 kifejeződésének szintjében, amely az A szegment leolvasási keretének függvénye, amelyet a különböző rekombinánsokba bevittünk: ORFl-t a VI1 és V14 rekombinánsokba, ORFl+ORF2-t a V12 és V15 rekombinánsokba és ORF1 +ORF2+ORF3-t a VI6 rekombinánsba.
2. (Lásd a 12b. ábrát): a fehérje minden rekombinánsban kifejeződött, kivéve a V8-t, amely nem tartalmaz IBDV-frekvenciát.
A kifejeződés szintje a legmagasabb a VI7 rekombináns esetén, ebben az esetben közel áll ahhoz az értékhez, amelyben a VP2 fehérje kifejeződik az IBDV vírussal fertőzött sejtekben.
Ebben az esetben is korrelációt figyelhetünk meg a különböző rekombinánsokban jelen lévő promoterek erőssége és a VP2 protein kifejeződésének mértéke között.
Az eredmények másrészt azt mutatják, hogy az amerikai EDGÁR törzs VP2 proteinjében is jelen van a VP2 proteinnek az az epitópja, amelyet a Cu-1 törzs ellen termelt B1 neutralizáló antitest felismer, másrészt, hogy a VP2 protein minden rekombinánsban megőrzi eredeti konformációját, legalábbis ebben a régióban.
c) Az expressziós termékek Western-blotanalízise
Elvégeztük a különböző rekombinánsok által termelt proteinek Westem-blotanalízisét egyrészt a minden IBDV-proteint felismerő poliklonális szérum (B22) alkalmazásával, másrészt anti-VP3 monoklonális antitest (I/A10) alkalmazásával.
Az eredmények, amelyek a 13a. ábrán láthatók, azt mutatják, hogy a poliklonális szérum az IBDV-vei fertőzött sejtek extraktumában lényegében három fehérjét ismer fel, amelyek a következőknek felelnek meg: VP2 (=40 kd), VP3 (=32 kd) és VP4 (=28 kd). Megfigyelhetünk egy mintegy 46 kd molekulatömegű fehérjét is, ez képezheti a VP2 prekurzorát (VPX, = 48-49 kd).
Minden olyan rekombináns esetén (VI1, V12, V14, VI5 és VI6), amely legalább a poliproteint kódoló szekvenciát tartalmazza (ORF1, VP2-VP3-VP4), az anti-IBDV poliklonális szérum alkalmazásakor kimutathatjuk a VP3, VP4 és valószínűleg a VPX-nek megfelelő molekulatömegű fehérjéket (13a. ábra).
A VI7 rekombináns esetén találunk csak olyan fehérjét, amelynek molekulatömege közel áll a VP2+VP4 amino-terminális régiója által adott fúziós proteinéhez (« 52 kd).
Az anti-VP3 monoklonális antitest két fehérjét ismer fel (13b. ábra), a VP3-t és feltehetőleg a VP3 egy bomlástermékét az IBDV-vel fertőzött sejtekben és minden, a poliproteint kifejező rekombináns esetén. Nem ismerhető fel IBDV-protein a VI7 rekombináns esetén, amely a VP2-VP4 fúziós fehérjét fejezi ki.
Ezek az eredmények mind azt mutatják, hogy a poliproteint kódoló leolvasási keret (ORF1) transzlációja minden rekombinánsban megtörténik, függetlenül további leolvasási keretek jelenlététől, így az ORF2 (VI2 és V15 rekombinánsok) vagy ORF2 és ORF3 együttes jelenlététől (VI6 rekombináns). A prekurzor poliprotein hasítása pontosan történt, de VP2 esetén nem tűnik teljesnek, feltételezhető, hogy a VPX prekurzor teljes érése az IBDV vírusrészecskéknek a sejt felületére való szállítása után történik meg [Müller H. és Becht H., Journal of Virology 44 (1), 384-392 (1982)].
7. lépés
Az FPV/IBDV rekombinánsok vakcináló erejét vizsgáltuk.
a) Szerokonverzió VI1 alkalmazásával
Egy első vakcinálási sorozatban összehasonlítottuk az FPV/IBDV rekombinánsok által létrehozott szerokonverziót β-galaktozidáz ellen és az IBDV vírus ellen három különböző adagolási út alkalmazásával: intramuszkuláris adagolással (IM), szubkután adagolással (SC) és a szárny átlyukasztásával (WW).
Egynapos csirkéket vakcináltunk ΙΟ44 VI1 rekombináns vírus alkalmazásával az IM, SC vagy WW adagolási módokkal. Az állatokat 11 nap múlva eutanázia mellett leöltük.
A szérumok direkt ELISA-analízise azt mutatta, hogy az intramuszkuláris úton vakcináit 14 csirke közül 2 (14%), a szubkután úton vakcináit 6 csirke közül 3 (50%) és a szárny átlyukasztásával vakcináit 15 csirke közül 8 (53%) kifejlesztett antitestet β-galaktozidazzal szemben, míg az intramuszkulárisan vakcináit 14 csirke közül 5 (36%), a szubkután úton vakcináit 6 csirke közül 1 (17%) és a szárny átlyukasztásával vakcináit 15 csirke közül 1 (7%) fejlesztett ki antitesteket az IBDV vírussal szemben.
Az eredményeket összegezve az IBDV proteinek k fejeződnek a vakcináit csirkékben rekombináns FPV/IBDV 11 hatására, és ez a rekombináns néhány csirkében kivált antitestválaszt. A három adagolási út közül az intramuszkuláris adagolás nagyobb választ vált ki, mint a másik kettő.
b) Korai védelem VI1, VI5 és VI6 alkalmazásával
Egynapos csirkéknek 104>4 dózisban V8 (negatív kontroll) és VI1, VI5 vagy V16 vírust adtunk be intramuszkuláris úton, majd 10 nap múlva a szemen át 849 VB vírus 100 LD50 dózisával (a letális dózis 100szorosa) fertőztük be ezeket. A 849VB törzset a Van Den Berg, Gonze és Meulemans, Avian Pathology, 20, 153-143 (1991) szakirodalmi helyen írják le.
A csirkéket eutanázia mellett 20 nap múlva leöltük.
HU 215 531 Β
A védettség indexeként a nyáltakömlő tömegének a teljes tömeghez viszonyított arányának 100-szorosát alkalmazzuk.
A kontrollcsoportban, amelyet V8 vírussal vakcináltunk, és IBDV-fertőzésnek nem tettünk ki, ez az arány 0,57 (10 csirke átlaga).
A fertőzésnek kitett V8 csoportban ez az arány 0,11 (9 csirke).
A VI1, V15 és V16 vírusokkal vakcináit csirkék esetén az arány 0,11 (20 csirke), 0,12 (18 csirke), illetve 0,12 (18 csirke).
Ezen eredmények alapján a VI1, V15 és V16 rekombinánsokkal nem érünk el korai védettséget az IBDV vírussal szemben.
c) Késői védettség létrehozása Vll, VI5 és VI6 alkalmazásával
A b) pontban leírt módon V8, VI1, V15 és VI6 alkalmazásával vakcináit csirkéket ezek beinjektálása után 42 nappal teszünk ki IBDV-fertőzésnek.
A fertőzést megelőzően gyűjtött szérumokat ELISAeljárással megvizsgáljuk a β-galaktozidáz és az IBDV vírus ellen adott antitestválasz értékelésére.
Az anti-β-galaktozidáz-válasz azt mutatja, hogy az összes vakcináit csirkében, azaz mind a 70 csirkében 100%-os szerokonverziót értünk el. A titerek 1:200 és 1:51 200 közöttiek. Nincs szignifikáns különbség a VI1 esetén kapott titerek, amelynek LacZ génje a P7.5 szabályozása alatt áll, ésaV8,V15 és VI6 esetén kapott titerek között, amely utóbbiak LacZ génjei a P11 promoter szabályozása alatt állnak.
A V8 vírussal vakcináit 10 csirke anti-IBDV-válasza 0, és a válasz pozitív valamennyi, a VI1, VI5 és V16 vírussal vakcináit csirkében. Részletezve, a VI1 vírussal vakcináit 20 csirkében a titerek 1:800 és 1:51 200 közöttiek, átlaguk 1:6400. A VI5 vírussal vakcináit 20 csirkében 1:6400 és 1:102 400 közötti, átlagosan 1:25 600, míg a V16 vírussal vakcináit 20 csirke esetén 1:6400 és 1:204 800 közötti, átlagosan 1:25 600. Az antitestszint lényegesen magasabb a V15 vagy V16 vírussal vakcináit csoportok esetén, mint annál, amelyet a VI1 vírussal vakcináltunk.
A tenyésztett sejtekhez adaptált PBG68 vakcinatörzs szeroneutralizációs titere a VI1 negatív kontroll esetén 1:10; a VI5 vírus esetén 20-ból 4 szérum és a VI6 vírus esetén 20-ból 1 szérum szeroneutralizációs titere 1:20. Ez a titer láthatóan alacsony, és csak néhány államál észlelhető.
Az arány (nyálkatömlő tömege/össztömeg) χ 100 érték a nem fertőzött V8 kontrollcsoportnál 0,66 (10 csirke).
A fertőzött V8 csoportnál ez az érték 0,1 (1 túlélő). A VI1 (3 csirke), V15 (11 csirke) és V16 (8 csirke) csoportoknál a fenti érték 0,1, 0,11, illetve 0,11. Ezek az értékek azt mutatják, hogy a nyálkatömlők sorvadása ellen nem jelentkezik védelem.
A fertőzést követő 4. napon a mortalitás szinte teljes a kontrollcsoportban (10 csirkéből 9). A Vll csoportban 20 csirkéből 3 élt túl, míg a VI5 vírussal vakcináit csoportból 20 csirkéből 11, és a VI6 vírussal vakcináit csoportból 20 csirkéből 8 élt túl. Ennek megfelelően a VI5 vagy V16 vírussal vakcináit állatoknál mintegy 50%-os védettséget észleltünk.
d) Védelem VI4, VI5 és V17 vírusokkal
Négyhetes baromfiak négy csoportjának 0,2 ml VS (negatív kontroll), VI4, VI5, illetve V17 rekombináns vírust adtunk. A víms mennyisége állatonként 1(|6·4 TCID50. Az adagolás intramuszkulárisan történt.
nap múlva minden állat szérumát megvizsgáltuk az anti-lBDV antitesttiter értékelésére. Az IBDV letális dózisának 100-szorosát injektáltuk a V14, VI5 és VI7 rekombináns vírusokkal kezelt csoportok állataiba, illetve a V8 rekombináns vírussal kezelt állatok csoportjának néhány tagjába.
nap múlva, azaz a vakcinálást követő 32. napon a V8 csoport kontrollállatait, valamint azokat az állatokat, amelyek a fertőzést túlélték, eutanázia mellett leöltük, és meghatároztuk a nyáltakömlő tömege/állat tömege χ 100 értéket.
Eredményeink a következők:
- Mortalitás: a fertőzésbe belepusztult állatok a következő módon oszlanak meg: V8 csoport: 14 állatból 12 (85%), V14 csoport: 24 állatból 21 (87%), V15 csoport: 25 állatból 17 (68%); és VI7 csoport: 25 állatból 0 (0%).
Más szóval a VI7 rekombinánssal vakcináit minden szárnyas ellenállt a fertőzésnek. A védettség ebben a csoportban teljes. Ezen túlmenően a szárnyasok egyike sem mutatta a betegség legkisebb klinikai tünetét sem. A V15 rekombinánssal kapott 32%-os védettség közel áll az előző példában elért 50%-os védettséghez.
- ELISA: A vírus elleni titerek a következők: V8 esetén a titer kevesebb, mint 1:10 és negatívnak tekinthető, V14 esetén 1:12 800 (1:6400 és 1:51 200 közötti), VI5 esetén 1:6400 (1:800 és 1:25 600 közötti), V17 esetén 3 állat kivételével 1:100 alatti (1:800, 1 6400 és 1:51 200).
Ennek következtében az FPV/IBDV rekombináns poliproteinjének expressziója által indukált IBDV elleni antitestválasz igen magas. Ezzel ellentétben a teljes vírus elleni, VI7 által indukált válasz alacsony.
Szeroneutralizáció: a PBG68 törzs elleni szeroneutralizációs titerek átlagos értékei V8, V14 és V15 esetén 1:10 alattiak, lényegében negatívnak tekinthetők, V17 alkalmazásakor a 20 állatból 5 titere 1:20 fölötti, azaz részletezve a titerek a következők: 1:20, 1:20, 1 40, 1:80 és 1:320.
Ezek alapján szeroneutralizáció csak azoknál a baromfiaknál figyelhető meg, amelyeket V17 rekombináns vírussal vakcináltunk.
- Nyálkatömlők: a nyálkatömlő tömege/állat tömege χ 100 értékek a következők: nem fertőzött V8: 0,68 (±0,13), fertőzött V8: 0,09 (±0,01), V14: 0,10 (±0,02), V15: 0,13 (±0,04) és V17:
34 (±0,23).
A fentiekből láthatóan a Fabricius nyálkatömlő részleges védelme csak a VI7 rekombináns vírussal kezelt csoportnál észlelhető. Valójában a 24 állatból 8 esetén mutatkozott olyan arány, mint a nem fertőzött kontrolinál. A többi 16 esetén a kapott érték magasabb, mint az egyéb fertőzött csoportoknál.
HU 215 531 Β pTIRB1D Azonos a pTIRB 1 -gyei, de az
EcoRI-Hpal fragmentum deléciójával.
Transzfervektorok LacZ-vel
Következtetések
A vakcinálási sorozat fő következtetései a következők:
- az IBDV poliproteint kifejező rekombinánsok erős
ELISA-választ indukálnak szárnyasokban, magas titer jelentkezik a vírussal szemben; 5 pTIRB lP75Lac pTIRBl +p75Lac P75-Lac kazettája egy, a BamHl helyhez
- a poliprotein VP2 részét kifejező rekombináns klónozott Bgl2-BamHl frag-
tökéletesen védi a szárnyasokat a mortalitástól, mentumban.
és részlegesen védi őket a nyálkatömlő elsorvadá- pTIRB2P75Lac Mint a fenti, de pTIRB2-ben.
sától. 10 pTIRB2LacP75 Mint a fenti, de ellenkező orien-
A plazmidok listája tációval.
Név Jellemzők pTIRBIPllLac pTIRBl +pl lLac Pl 1-Lac ka-
E. coli-ba való klónozásra szolgáló vektorok zettája egy, a BamHl helyhez
pUC18 Klónozóvektor (Messing 1983) klónozott Bgl2-BamHl frag-
pBSPlus Klónozóvektor (Stratagene) 15 mentumban.
pBSLKl pBSPlus Bell és Bgl2 hellyel a pTIRB lLacP 11 Mint a fenti, de ellenkező orien-
polilinkeren belül. tációval.
pBSLK2 Azonos a pBSLKl-gyel, de a pTIRB2LacPll Mint a fenti, de pTIRB2-ben.
Bell és Bgl2 helyek fordított IB V E2 génjét hordozó plazmidok
sorrendben vannak. 20 p75M41 M41 szerotípus E2 génje a P7.5-
pACYC184 Klónozóvektor (Chang, 1978) től 3’-irányban klónozva.
Vaccinia promoterek P75D1466 Mint fent, de Dl466 szerotípus.
pGS20 Transzfervektor Vacciniahoz p75D207 Mint fent, de D207/D274 sze-
(Mackett 1984) rotípus.
plP75 pGS20 pBSLKl +Bacll -BamHl 25 IB V E2 génjét hordozó vektorok
fragmentuma Vaccinia pTIRB 1P75M41 Lac M41 és Pl 1-Lac
P7.5 promoterrel a P7.5-E2 kazettái TIRB1
Bell-BamHl belsejében. BamH 1 helyére klónozva.
p2P75 Azonos a PlP75-tel, de a pTIRB lP75D1466Lac Mint fent, de D1466 E2 génje.
pBSLK2-n belül. 30 pTIRB lP75D207Lac Mint fent, de D207/D274 E2
plPll pBSLKl +40-mer szintetikus génje.
DNS a Vaccinia Pl 1 promo- Eimeria TA4-et hordozó plazmidok
terrel a Bgl2-BamHI-ben. pTA406 Az Eimeria tenella TA4 anti-
p2Pl 1 Azonos a p 1P11 -gyei, de a génjének cDNS-ja egy BamH 1
pBSLK2-n belül. 35 kazettába klónozva.
pACPll Azonos a plPl 1-gyel, de a pTA410 Mint a fenti, de a proteolitikus
pACYCl 84 Xho2-BamHI egy- hely különböző.
ségén belül. p75TA406 TA406 gén a P7.5 promotertől a
LacZ gén 3 ’-vég irányában klónozva.
pBSMutLacZl pBSPlus LacZ-vel 40 p75TA410 Mint fent, de TA410 gén
Bgl2-BamHl kazettában. pTIRTA406 P7.5-TA406 kazetta a
p75Lac p2P75+Bg!2-BamHl kazetta pTIRB 1D BamH 1 helyére
LacZ-vel a Bgl2-BamHl- klónozva.
ben. pTIRTA410 Mint fent, de P7.5-TA410 ka-
pllLac Azonos a P75Lac-val, de 45 zetta.
p2P 11 -ben. Eimeria TA4-t hordozó transzfervektorok
pACPl lLac p AC Y C184+p 11 - Lac kazetta pTIRTA406Lac pTIRTA406-ba klónozott
a pl llac kazetta Bgl2-Hind3 p 11 Lac kazetta.
fragmentumában az pTIRTA410Lac Mint fent, de pTIRTA410-ben.
Xho2-Hind3-ban. 50 IBDV klónozására szolgáló plazmidok
Transzfervektorok CNP-hez pBSIBDVO pBSPlus (Pstl-Hinc2) EDGÁR
pTIRl pUC18 a CNP EcoRI TIR-L 0-lb fragmentum 277-bp Pstl
fragmentumával. A CNP fragmentuma PCR révén előál-
BamH 1 pUC 18 linkerének lítva.
BamH 1 helyét elválasztó 55 pBSIBDVOb pBSIBDVO-ból származik
fragmentumot kiiktattuk. helyspecifikus mutációval.
pTIRBl A BamHl inszerciója pTIRl-be pBSlA2 pBSLKl (Pstl +T4 DNS-polime-
az ORF1 és ORF2 közé. ráz, Sacl)+EDGAR 1-2 frag-
pTIRB2 Azonos a pTIRB 1 -gyei, de az mentum 760-bp Sacl fragmentu-
ORF2 és ORF3 között. 60 ma PCR révén előállítva.
HU215 531 Β
pBSIB pBSLKl (Pstl +T4 DNS-polimeráz, Sacl)+EDGÁR 1 -2 fragmentum 369-bp Sacl fragmentuma PCR révén előállítva.
pEDGAR34i pBSLKl (Pstl+T4 DNS-polimeráz, Hinc2)+670-bp EDGÁR 3-4 fragmentum
pEDGARM341 pEDGAR34i-ből származik helyspecifikus mutációval.
pBS3A pBSLKl (Pstl +T4 DNS-polimeráz, Sphl)+EDGÁR 5-6 fragmentum 956-bp Sphl fragmentuma PCR révén előállítva.
pBS3B pBSLKl (Pstl +T4 DNS-polimeráz, Sphl)+EDGÁR 5-6 fragmentum 345-bp Sphl fragmentuma PCR révén előállítva.
pEDGAR12 PBS1A2 (EcoRl+T4 DNSpolimeráz, Sacl)+pBSlB fragmentum (Sphl +T4 DNS-polimeráz, Sacl)
pEDGARM12 pEDGAR 12-ből származik helyspecifikus mutációval.
pACEDGARM12 pEDGARM12 Bell-Sphl fragmentumának inszerciója a pACYC184 Bcll-Sphl helyére.
pEDGAR45 pBS3A (Hinc2-Pstl)+ +pEDGAR34i Hinc2-Pstl fragmentuma
pACEDGAR 14 pACEDGARM12 (Sphl+T4 DNS-polimeráz, BamHl)+pEDGARM34i fragmentum (Nsil +T4 DNS-polimeráz, BamHl)
pACEDGAR 15 pACEDGAR14 (BamHl+T4 DNS-polimeráz, Sál 1)+pEDGAR45 fragmentum (Pvu2-Sall)
pACEDGAR pACEDGAR 15 (Sphl-EcoRV) +pBS3B fragmentum (Sphl-Pvu2)
pACEDGAR2 pACEDGARl Bcll-Rsr2 fragmentumának helyettesítése pBSIBDVO Bcll-Rsr2 fragmentumával.
pACEDGAR3 Azonos a pBSIBDVOb Bcll-Rsr2 fragmentumával.
IBDV-t és egy Vaccinia promotert tartalmazó plazmidok
p75EDGARl pACEDGARl Bell-BamHl fragmentuma p2P75 BamHl helyére inszertálva.
p75EDGAR2 Azonos a pACEDGAR2 Bell-BamHl fragmentumával.
p75EDGAR3 Azonos a pACEDGAR3 Bell-BamHl fragmentumával.
pl 1 EDGÁR 1 p ACP11 P11 -t hordozó Bell-BamHl fragmentum pACEDGARl BamHl helyére inszertálva.
pl 1EDGAR2 Mint fent, de pACEDGAR2 plazmidban.
pl 1EDGAR3 Mint fent, de pACEDGAR3 plazmidban.
Csak IBDV-t hordozó transzfervektorok
pTIR75-EDGÁR 1 p75EDGARl Bell-BamHl fragmentuma pTIRB 1 BamH 1 helyére inszertálva.
pTIR75-EDGAR2 Azonos a p75EDGAR2 plazmiddal.
pTIR75-EDGAR3 Azonos a p75EDGAR3 plazmiddal.
pTIRl 1-EDGÁR 1 Azonos a pl 1 EDGÁR 1 plazmiddal.
pTIRl 1-EDGAR2 Azonos a pl 1EDGAR2 plazmiddal.
pTIRll-EDGAR3 Azonos api 1EDGAR3 plazmiddal.
IBDV-5 és Lac-t hordozó transzfervektorok
pTIR75ElLAC pACPllLAC Bgl2-BamHl fragmentuma pTIR75EDGARl BamH 1 helyére inszertálva.
pTIR75E2LAC Azonos a pTIR75EDGAR2 plazmiddal.
pTIRHElLAC p75LAC Bgl2-BamHl fragmentuma a pTIRl 1EDGAR1 BamH 1 helyére inszertálva.
pTIRllE2LAC Azonos a pTIRl 1EDGAR2 plazmiddal.
PTIR11E3LAC Azonos a pTIRl 1EDGAR3 plazmiddal.
pTIRl 1VP2LAC pl 1 EDGÁR 1 Xhol (T4 DNSpolimeráz)-Bgl2 fragmentuma pTIR 11E1 Lac PpuM 1 (T4 DNSpolimeráz)-Bgl2 helyére klónozva.
Organizmusok listája
Név Jellemzők
1. E. COLI BAKTÉRIUMOK
MCI 061 araD139, (ara, leu)7697, lacX74, galU, galK, hsdR, strA (Pharmacia)
JM1110 dam- fenotípusok (N3837dam4) helyett alkalmazva
2 CNP VÍRUS
LVCO Az USDA standard Fowlpox provokáló törzse
CNP Fowlpox vakcinatörzs (SOLVAY)
V3 Rekombináns CNP vírus a P7.5-LacZ kazettával TIRB1ben
\4 Azonos V3-mal, de a kazetta TIRB2-ben van.
V5 Azonos a V4-gyel, de a kazetta orientációja ellenkező.
HU 215 531 Β 2
V8 Azonos a V3-mal, de a kazetta Pl 1-Lac. 4. SEJTEK QT35 Fúrj sejtvonal
V9 Azonos a V8-cal, de a kazetta CEF Csirkeembrió fibroblaszt
ellenkező orientációjú. 5. CNP/1BD VÍRUS
V10 Azonos a V9-cel, de a kazetta 5 Vll A Pl lLac és P7.5E1 kazettákat
TIRB2-ben van. hordozza.
3. IBDV VÍRUS V12 A Pl lLac és P7.5E2 kazettákat
EDGÁR EDGÁR törzs, amerikai izolá- hordozza.
tum, izolálója S. A. EDGÁR, V14 A P7.5E1 és Pl lLac kazettákat
Aubum Egyetem, 3-szor csir- 10 hordozza.
kén és egyszer tojásembrión V15 A P7.5E2 és Pl lLac kazettákat
tenyésztve. Az USDA standard hordozza.
provokáló (fertőző) törzse. V16 A P7.5E3 és Pl lLac kazettákat
849VB Patogén törzs, amelyet a Van hordozza.
Den Berg, Gonze és 15 V17 A P7.5VP2 és Pl lLac kazettá-
Meulemans, az Avian Patho- kat hordozza.
logy, 20, 133-143 (1991) szak- 6. CNP/TA4 VÍRUS
irodalmi helyen ismertetnek. V21 A Pl lLac és P7.5TA410 kazet-
PBG98 CEF sejtekhez adaptált törzs tákat hordozza.
Bursine 20
(nyálkatömlő)2 QT35 sejtekhez adaptált
vakcinatörzs
A primerek listája és szekvenciájuk
Szám Szekvencia az 5’->3’ irányban Az alábbinak komplementere
5169 5’ CCTTTACTGTTAGTTCTACAATCGAAATTATGC 3’ FPV
5168 5 ’ CATGTAGATTTTAATCCGTTAACACGCGCAG’ FPV
3254 5’ GCCGGAAAACCTACCGGATTGATGG 3’ Lac
1871 5’ GAAACCAGGCAAAGCGCC 3’ Lac
IBDV 16 5’ CCAGGGTGTCGTCCGGAATGG 3’ IBDV
IBDVlb 5’ CCCAAGATCATATGATGTGGGTAAGC TGAGG 3’ IBDV
IBDV3 5’ TGAGCAACTTCGAGCTGATCCCAAATCCTG 3’ IBDV
IBDV22 5’ CTGCTCTTGACTGCGATGGAG 3’ IBDV
SZABADALMI IGÉNYPONTOK

Claims (33)

1. Rekombináns Avipox vírus, amely az Avipox vírus egy legyengített törzséből származik, és genomjának nem esszenciális részében legalább egy olyan DNS-szekvenciát tartalmaz, amely egy, az Avipox vírusra nézve heterológ fehérje egészét vagy egy részét kódolja, valamint hordoz olyan szekvenciaelemeket is, melyek a fehérjének a rekombináns Avipox vírussal fertőzött sejtben történő kifejeződését lehetővé teszik, azzal jellemezve, hogy a genom nem esszenciális része, a terminális invertált ismétlődő szekvenciák (TIR-régiók) legalább egyikének két - az expreszsziós szignálokat is magában foglaló - nyílt leolvasási kerete között elhelyezkedő, nem kódoló intergénes régió.
2. Az 1. igénypont szerinti vírus, azzal jellemezve, hogy egy legyengített Fowlpox vírustörzsből származik.
3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti vírus, azzal jellemezve, hogy a nem esszenciális rész egy több mint 60 nukleotidból álló szekvenciát tartalmazó intergénes régió.
4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti vírus, azzal jellemezve, hogy az intergénes régió a vírus két
TIR-régiójának egyikében helyezkedik el. (Elsőbbsége: 1991. május 27.; joghatálya: 1994. július 1.)
5. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti vírus, azzal jellemezve, hogy a vírus két TIR-régiójának legalább egyikébe legalább egy DNS-szekvencia van k ónozva.
6. A 4. vagy 5. igénypont szerinti vírus, azzal jellemezve, hogy intergénes régióként a βΐ jelzésű régiót tartalmazza, amely az 1675. és 2165. számú nukleotidok között helyezkedik el, kiindulási nukleotidként a TIRrégiókban található BamHI restrikciós helyet véve.
7. A 4. vagy 5. igénypont szerinti vírus, azzal jellemezve, hogy intergénes régióként a β2 jelzésű régiót tartalmazza, amely a 2672. és 3605. számú nukleotidok között helyezkedik el, kiindulási nukleotidként a TIRrégiókban található BamHI restrikciós helyet véve.
8. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti vírus, azzal jellemezve, hogy mindkét TIR-régióban lévő βΐ régióba egy-egy heterológ fehérje egészét vagy részét kódoló DNS-szekvencia van klónozva.
9. Az 1-8. igénypontok bármelyike szerinti vírus, azzal jellemezve, hogy a heterológ fehérje a fertőző nyálkatömlőkór-vírus (IBDV), a fertőző bronchitiszvíms (IBV), a csirkeanémiáért felelős vírus (CAV), a kokcidiózisért felelős Eimeria protozoa, a Newcastle23
HU 215 531 Β kór vírusa (NDV) vagy a Marek-kór vírusa (MDV) antigénjeinek bármelyike.
10. A 9. igénypont szerinti vírus, azzal jellemezve, hogy a heterológ fehérje a fertőző nyálkatömlőkórvírus (IBDV), a fertőző bronchitiszvírus (IBV), a csirkeanémiáért felelős vírus (CAV) vagy az Eimeria protozoa antigénjeinek bármelyike.
11. A 10. igénypont szerinti vírus, azzal jellemezve, hogy a heterológ fehérjét kódoló szekvencia az IBDV poliproteinjét vagy annak egy részletét, az IBV E2antigénjét, az Eimeria TA4 jelzésű felszíni antigénjét vagy a CAV P50-proteinjét kódoló nyílt leolvasási keretek bármelyikének egésze vagy annak egy része.
12. A 11. igénypont szerinti vírus, azzal jellemezve, hogy a heterológ fehérje a poliprotein egy olyan részlete, melyben az 1-493. aminosavakat az 1010-1012. aminosavak követik.
13. Szárnyas eredetű gazdasejtek tenyészete, azzal jellemezve, hogy a sejtek az 1-12. igénypontok bármelyike szerinti rekombináns Avipox vírussal vannak fertőzve.
14. A 13. igénypontok szerinti sejttenyészet, azzal jellemezve, hogy QT35 jelű fürjsejtek tenyészete.
15. Vakcina, azzal jellemezve, hogy az 1-12. igénypontok bármelyike szerinti Avipox vírust tartalmaz.
16. Transzferszekvencia, azzal jellemezve, hogy lehetővé teszi, hogy egy heterológ fehérjét vagy annak egy részét kódoló DNS-szekvencia egy Avipox vírus genomjába inszertálódjék úgy, hogy az 1-12. igénypontok bármelyike szerinti Avipox vírus keletkezzék.
17. Plazmid, azzal jellemezve, hogy 17. igénypont szerinti szekvenciát tartalmaz.
18. Eljárás olyan rekombináns Avipox vírus előállítására, amely az Avipox vírus egy legyengített törzséből származik, és genomjának nem esszenciális részében legalább egy olyan DNS-szekvenciát tartalmaz, amely egy, az Avipox vírusra nézve heterológ fehérje egészét vagy egy részét kódolja, valamint hordoz olyan elemeket is, melyek a fehérjének a rekombináns Avipox vírussal fertőzött sejtben történő kifejeződését lehetővé teszik, azzal jellemezve, hogy a heterológ fehérjét vagy részét kódoló szekvenciát a vírusgenomban a TIR-régiók legalább egyikének két - az expressziós szignálokat is magában foglaló - nyílt leolvasási kerete között elhelyezkedő, nem kódoló intergénes régióba építjük be.
19. A 18. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy kiindulási vírusként egy legyengített Fowlpox vírustörzsből származó vírust alkalmazunk.
20. A 18. vagy 19. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a heterológ fehérjét vagy részét kódoló szekvenciát egy több mint 60 nukleotidból álló szekvenciát tartalmazó intergénes régióba építjük be. (Elsőbbsége : 1991. május 27.)
21. A 18-20. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a heterológ fehérjét vagy részét kódoló szekvenciát a vírus két TIR-régiójának egyikében elhelyezkedő intergénes régióba építjük be. (Elsőbbsége: 1991. május 27.)
22. A 21. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a heterológ fehérjét vagy részét kódoló szekvenciát a βΐ jelzésű intergénes régióba építjük be, amely az 1675. és 2165. számú nukleotidok között helyezkedik el, kiindulási nukleotidként a TIR-régiókban található BamHI restrikciós helyet véve.
23. A 21. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a heterológ fehérjét vagy részét kódoló szekvenciát a β2 jelzésű intergénes régióba építjük be, amely a 2672. és 3605. számú nukleotidok között helyezkedik el, kiindulási nukleotidként a TIR-régiókban található BamHI restrikciós helyet véve.
24. A 18-20. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy mindkét TIR-régióban lévő β 1 régióba beépítünk egy-egy heterológ fehérje egészét vagy részét kódoló DNS-szekvenciát.
25. A 18-24. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy heterológ fehérjét kódoló szekvenciaként a fertőző nyálkatömlőkór-vírus (IBDV), a fertőző bronchitiszvírus (IBV), a csirkeanémiáért felelős vírus (CAV), a kokcidózisért felelős Eimeria protozoa, a Newcastle-kór vírusa (NDV) vagy a Marek-kór vírusa (MDV) antigénjeinek bármelyikét kódoló szekvenciát építünk be.
26. A 25. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy heterológ fehérjét kódoló szekvenciaként a fertőző nyálkatömlőkór-vírus (IBDV), a fertőző bronchitiszvírus (IBV), a csirkeanémiáért felelős vírus (CAV) vagy az Eimeria protozoa antigénjeinek bármelyikét kódoló szekvenciát építünk be.
27. A 26. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy heterológ fehérjét kódoló szekvenciaként az IBDV poliproteinjét vagy annak egy részletét, az IBV EZ antigénjét, az Eimeria TA4 jelzésű felszíni antigénjét vagy a CAV P50 proteinjét kódoló nyílt leolvasási keretek bármelyikének egészét vagy részét építjük be.
28. A 27. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a heterológ fehérjét kódoló szekvenciakent a poliprotein egy olyan részletét kódoló szekvenciát építünk be, melyben az 1-493. aminosavakat az 1010-1012. aminosavak követik.
29. Eljárás szárnyas eredetű gazdasejttenyészet előállítására, azzal jellemezve, hogy szárnyas eredetű gazdasejteket a 18—28. igénypontok bármelyike szerint előállított rekombináns Avipox vírussal fertőzünk.
30. A 29. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy QT35 jelű fürjsejtek tenyészetét fertőzzük.
31. Eljárás vakcina előállítására, azzal jellemezve, hogy a 18-28. igénypontok bármelyike szerint előállított Avipox vírust alkalmas hordozóval elegyítjük.
32. Eljárás egy heterológ fehérjét vagy részét kódoló DNS-szekvenciát homológ rekombinációval egy Avipox vírusgenomba inszertálni képes transzferszekvencia előállítására, azzal jellemezve, hogy egy Avipox vírus genomjából egy, a TIR-régiók egyikének - expressziós szignálokat is magába foglaló - nyílt leolvasási keretei között elhelyezkedő, nem kódoló intergénes régióját és az azzal szomszédos régiókat tartalmazó Sz ekvenciát izolálunk.
33. Eljárás a 32. igénypont szerinti szekvenciát tartalmazó plazmid előállítására, azzal jellemezve, hogy egy 32. igénypont szerint előállított szekvenciát plazmidba építünk.
HU9201746A 1991-05-27 1992-05-26 Rekombináns Avipox vírusok, a vírusokkal fertőzött sejttenyészetek, a vírusokat tartalmazó, baromfiak oltására alkalmas vakcinák, a vírusok kialakítására alkalmas transzfer szekvenciák, ilyeneket tartalmazó plazmidok, valamint eljárások ezek előállítására HU215531B (hu)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
HU9802975A HU9802975D0 (en) 1992-05-26 1992-05-26 Recombinant avipox viruses, the culture of cells infected by these viruses, vaccines for poultry, transfer sequences for production of viruses and plas mids containing of these sequences and process for producing thereof and use of viruses as vectors

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
BE9100507A BE1004877A3 (fr) 1991-05-27 1991-05-27 Virus de l'avipox recombinant, culture de cellules infectees par ce virus et vaccins pour la volaille derives de ce virus.

Publications (3)

Publication Number Publication Date
HU9201746D0 HU9201746D0 (en) 1992-08-28
HUT62331A HUT62331A (en) 1993-04-28
HU215531B true HU215531B (hu) 2000-05-28

Family

ID=3885526

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU9201746A HU215531B (hu) 1991-05-27 1992-05-26 Rekombináns Avipox vírusok, a vírusokkal fertőzött sejttenyészetek, a vírusokat tartalmazó, baromfiak oltására alkalmas vakcinák, a vírusok kialakítására alkalmas transzfer szekvenciák, ilyeneket tartalmazó plazmidok, valamint eljárások ezek előállítására

Country Status (23)

Country Link
EP (1) EP0517292B1 (hu)
JP (1) JP3411307B2 (hu)
KR (1) KR100244601B1 (hu)
CN (1) CN1055501C (hu)
AR (1) AR248045A1 (hu)
AT (1) ATE189480T1 (hu)
AU (1) AU656185B2 (hu)
BE (1) BE1004877A3 (hu)
BR (1) BR9202024A (hu)
CA (1) CA2069594A1 (hu)
DE (1) DE69230627T2 (hu)
DK (1) DK0517292T3 (hu)
ES (1) ES2145000T3 (hu)
HU (1) HU215531B (hu)
IE (1) IE921686A1 (hu)
IL (1) IL101780A (hu)
MX (1) MX9202512A (hu)
NZ (1) NZ242620A (hu)
PT (1) PT517292E (hu)
RU (1) RU2130971C1 (hu)
SG (1) SG49876A1 (hu)
TW (1) TW288048B (hu)
ZA (1) ZA923321B (hu)

Families Citing this family (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0597016A4 (en) * 1991-07-26 1996-04-24 Virogenetics Corp Infectious bursal disease virus recombinant poxvirus vaccine.
PT623172E (pt) * 1992-01-13 2005-02-28 Virogenetics Corp Vacina de virus vaccinia recombinante do virus da doenca de marek
FR2697534A1 (fr) * 1992-11-02 1994-05-06 Rhone Merieux Virus herpès de la dinde recombinant pour la réalisation de vaccin de la maladie de Gumboro, son procédé de préparation et vaccin obtenu.
US6136318A (en) * 1993-02-26 2000-10-24 Cochran; Mark D. Recombinant fowlpox viruses and uses thereof
US5925358A (en) * 1993-02-26 1999-07-20 Syntro Corporation Recombinant fowlpox viruses and uses thereof
EP0696204A4 (en) * 1993-02-26 1999-03-31 Syntro Corp Recombined chickenpox virus and its use
FR2728794B1 (fr) * 1994-12-30 1997-03-21 Rhone Merieux Vaccin recombinant aviaire a base de virus herpes aviaire, notamment contre la maladie de gumboro
FR2728795B1 (fr) * 1994-12-30 1997-03-21 Rhone Merieux Vaccin vivant recombinant aviaire, utilisant comme vecteur un virus herpes aviaire
GB9711957D0 (en) 1997-06-09 1997-08-06 Isis Innovation Methods and reagents for vaccination
GB0118532D0 (en) 2001-07-30 2001-09-19 Isis Innovation Materials and methods relating to improved vaccination strategies
GB2382578A (en) * 2001-11-30 2003-06-04 Isis Innovation Fowlpox-based vaccine
WO2003047617A2 (en) 2001-11-30 2003-06-12 Isis Innovation Limited Vaccine
DK1407033T3 (da) * 2002-05-16 2006-05-22 Bavarian Nordic As Intergeniske områder som insertionssteder i genomet af Modified Vaccinia Virus Ankara (MVA)
CA2515890C (en) * 2003-02-20 2013-09-17 Therion Biologics Corporation Novel insertion sites in pox vectors
GB2402391A (en) * 2003-06-04 2004-12-08 Oxxon Pharmaccines Ltd Fowlpox recombinant genome
CA2857025C (en) 2011-11-30 2021-08-03 Merial Limited Recombinant hvt vectors expressing antigens of avian pathogens and uses thereof
EP2845904A1 (en) 2013-09-06 2015-03-11 Ceva Sante Animale Recombinant Marek's disease viruses and uses thereof
EP3050572A1 (en) 2015-01-29 2016-08-03 Ceva Sante Animale Recombinant MDV1 and the uses thereof
EP3263129A1 (en) 2016-06-29 2018-01-03 Ceva Sante Animale Duck enteritis virus and the uses thereof
KR20230170803A (ko) 2016-12-14 2023-12-19 뵈링거 잉겔하임 애니멀 헬스 유에스에이 인코포레이티드 조류 병원체의 다중 항원을 발현하는 재조합 hvt 벡터 및 그를 포함하는 백신
EP3902561A1 (en) 2018-12-27 2021-11-03 Ceva Santé Animale Recombinant viruses and the uses thereof
MA58717A1 (fr) 2020-06-17 2023-06-28 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Vecteurs hvt recombinants exprimant l'hémagglutinine de la grippe et compositions immunogènes, et leur fabrication et leurs utilisations

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1988002022A1 (en) * 1986-09-22 1988-03-24 Commonwealth Scientific And Industrial Research Or Recombinant poxviruses
FR2632863B2 (fr) * 1987-10-29 1990-08-31 Transgene Sa Virus du fowlpox recombinant et vaccins derives de ces virus
DE68912441T2 (de) * 1988-06-24 1994-05-11 British Tech Group Nichtessentielle Geflügelpockenvirus-Regionen.
KR940001265B1 (ko) * 1988-12-29 1994-02-18 닛뽕 제온 가부시끼가이샤 프로모터, 그를 함유하는 플라스미드 및 재조합 아비폭스비루스
WO1990015140A1 (en) * 1989-05-30 1990-12-13 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Production of ibdv vp2 in highly immunogenic form

Also Published As

Publication number Publication date
DE69230627T2 (de) 2000-09-28
AU1632392A (en) 1992-12-03
PT517292E (pt) 2000-06-30
MX9202512A (es) 1995-01-31
CA2069594A1 (fr) 1992-11-28
JP3411307B2 (ja) 2003-05-26
RU2130971C1 (ru) 1999-05-27
HUT62331A (en) 1993-04-28
CN1055501C (zh) 2000-08-16
SG49876A1 (en) 2002-04-16
AR248045A1 (es) 1995-05-31
IE921686A1 (en) 1992-12-02
BR9202024A (pt) 1993-01-19
EP0517292A1 (fr) 1992-12-09
ZA923321B (en) 1993-01-27
KR920021706A (ko) 1992-12-18
IL101780A (en) 2000-12-06
CN1069068A (zh) 1993-02-17
JPH05244939A (ja) 1993-09-24
KR100244601B1 (ko) 2000-03-02
AU656185B2 (en) 1995-01-27
ATE189480T1 (de) 2000-02-15
DK0517292T3 (da) 2000-05-08
HU9201746D0 (en) 1992-08-28
IL101780A0 (en) 1992-12-30
BE1004877A3 (fr) 1993-02-16
NZ242620A (en) 1993-09-27
TW288048B (hu) 1996-10-11
DE69230627D1 (de) 2000-03-09
ES2145000T3 (es) 2000-07-01
EP0517292B1 (fr) 2000-02-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20240082390A1 (en) Multivalent recombinant avian herpes viruses and vaccines for immunizing avian species
HU215531B (hu) Rekombináns Avipox vírusok, a vírusokkal fertőzött sejttenyészetek, a vírusokat tartalmazó, baromfiak oltására alkalmas vakcinák, a vírusok kialakítására alkalmas transzfer szekvenciák, ilyeneket tartalmazó plazmidok, valamint eljárások ezek előállítására
JP2538367B2 (ja) Ｆｏｗｌｐｏｘウィルスの非必須領域
US5187087A (en) Recominbant herpesvirus of turkeys and live vector vaccines derived thereof
EP0719864B1 (fr) Vaccin vivant recombinant aviaire, utilisant comme vecteur un virus herpès de dindes
EP0968297B1 (fr) Vaccin vivant recombinant aviaire, utilisant comme vecteur le virus de la laryngotracheite infectieuse aviaire
FR2728794A1 (fr) Vaccin recombinant aviaire a base de virus herpes aviaire, notamment contre la maladie de gumboro
US6913751B2 (en) Recombinant avian herpesvirus useful in vaccine production
US5651972A (en) Use of recombinant swine poxvirus as a live vaccine vector
US20100008948A1 (en) Recombinant herpesvirus useful in vaccine production
US6241989B1 (en) Recombinant multivalent viral vaccine
JPH09503647A (ja) 組換えブタポックスウイルス
US7087234B1 (en) Recombinant multivalent viral vaccine
JPH09505726A (ja) 組換え感染性喉頭気管炎ウイルス及びそれらの使用
JPH07255488A (ja) 組換えマレック病ウイルスおよびその作出法

Legal Events

Date Code Title Description
DGB9 Succession in title of applicant

Owner name: DIMMINACO AG/SA/LTD., CH

HMM4 Cancellation of final prot. due to non-payment of fee