RU2130971C1 - Рекомбинантный вектор на основе вируса оспы птиц, рекомбинантный вектор для вакцинации домашней птицы - Google Patents
Рекомбинантный вектор на основе вируса оспы птиц, рекомбинантный вектор для вакцинации домашней птицы Download PDFInfo
- Publication number
- RU2130971C1 RU2130971C1 SU5052222A SU5052222A RU2130971C1 RU 2130971 C1 RU2130971 C1 RU 2130971C1 SU 5052222 A SU5052222 A SU 5052222A SU 5052222 A SU5052222 A SU 5052222A RU 2130971 C1 RU2130971 C1 RU 2130971C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- virus
- sequence
- tir
- protein
- recombinant
- Prior art date
Links
- 239000013598 vector Substances 0.000 title claims abstract description 29
- 244000144977 poultry Species 0.000 title claims abstract description 24
- 201000006082 Chickenpox Diseases 0.000 title claims abstract description 4
- 206010046980 Varicella Diseases 0.000 title claims abstract description 4
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 title description 12
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims abstract description 184
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 149
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 65
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 57
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 56
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims abstract description 14
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims abstract description 14
- 241000711450 Infectious bronchitis virus Species 0.000 claims abstract description 11
- 208000003495 Coccidiosis Diseases 0.000 claims abstract description 7
- 206010023076 Isosporiasis Diseases 0.000 claims abstract description 7
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims abstract description 7
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims abstract description 6
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims abstract description 6
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 claims abstract description 5
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 claims abstract description 5
- 230000003071 parasitic effect Effects 0.000 claims abstract 3
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 claims description 56
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 claims description 56
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 35
- 235000013594 poultry meat Nutrition 0.000 claims description 21
- 241000271566 Aves Species 0.000 claims description 15
- 108010076039 Polyproteins Proteins 0.000 claims description 15
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 claims description 10
- 241000700647 Variola virus Species 0.000 claims description 9
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 9
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 claims description 5
- 241000711404 Avian avulavirus 1 Species 0.000 claims description 4
- 241000223932 Eimeria tenella Species 0.000 claims description 4
- 101710125507 Integrase/recombinase Proteins 0.000 claims description 4
- 208000007502 anemia Diseases 0.000 claims description 4
- 101710159752 Poly(3-hydroxyalkanoate) polymerase subunit PhaE Proteins 0.000 claims description 3
- 101710130262 Probable Vpr-like protein Proteins 0.000 claims description 3
- 101000833492 Homo sapiens Jouberin Proteins 0.000 claims description 2
- 101000651236 Homo sapiens NCK-interacting protein with SH3 domain Proteins 0.000 claims description 2
- 102100024407 Jouberin Human genes 0.000 claims description 2
- 101150065732 tir gene Proteins 0.000 claims 7
- 108091029795 Intergenic region Proteins 0.000 claims 2
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 claims 2
- 101000768957 Acholeplasma phage L2 Uncharacterized 37.2 kDa protein Proteins 0.000 claims 1
- 101000823746 Acidianus ambivalens Uncharacterized 17.7 kDa protein in bps2 3'region Proteins 0.000 claims 1
- 101000916369 Acidianus ambivalens Uncharacterized protein in sor 5'region Proteins 0.000 claims 1
- 101000769342 Acinetobacter guillouiae Uncharacterized protein in rpoN-murA intergenic region Proteins 0.000 claims 1
- 101000823696 Actinobacillus pleuropneumoniae Uncharacterized glycosyltransferase in aroQ 3'region Proteins 0.000 claims 1
- 101000786513 Agrobacterium tumefaciens (strain 15955) Uncharacterized protein outside the virF region Proteins 0.000 claims 1
- 101000618005 Alkalihalobacillus pseudofirmus (strain ATCC BAA-2126 / JCM 17055 / OF4) Uncharacterized protein BpOF4_00885 Proteins 0.000 claims 1
- 102100020724 Ankyrin repeat, SAM and basic leucine zipper domain-containing protein 1 Human genes 0.000 claims 1
- 101000967489 Azorhizobium caulinodans (strain ATCC 43989 / DSM 5975 / JCM 20966 / LMG 6465 / NBRC 14845 / NCIMB 13405 / ORS 571) Uncharacterized protein AZC_3924 Proteins 0.000 claims 1
- 101000823761 Bacillus licheniformis Uncharacterized 9.4 kDa protein in flaL 3'region Proteins 0.000 claims 1
- 101000819719 Bacillus methanolicus Uncharacterized N-acetyltransferase in lysA 3'region Proteins 0.000 claims 1
- 101000789586 Bacillus subtilis (strain 168) UPF0702 transmembrane protein YkjA Proteins 0.000 claims 1
- 101000792624 Bacillus subtilis (strain 168) Uncharacterized protein YbxH Proteins 0.000 claims 1
- 101000790792 Bacillus subtilis (strain 168) Uncharacterized protein YckC Proteins 0.000 claims 1
- 101000819705 Bacillus subtilis (strain 168) Uncharacterized protein YlxR Proteins 0.000 claims 1
- 101000948218 Bacillus subtilis (strain 168) Uncharacterized protein YtxJ Proteins 0.000 claims 1
- 101000718627 Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki Putative RNA polymerase sigma-G factor Proteins 0.000 claims 1
- 101000641200 Bombyx mori densovirus Putative non-structural protein Proteins 0.000 claims 1
- 101000947633 Claviceps purpurea Uncharacterized 13.8 kDa protein Proteins 0.000 claims 1
- 101000948901 Enterobacteria phage T4 Uncharacterized 16.0 kDa protein in segB-ipI intergenic region Proteins 0.000 claims 1
- 101000805958 Equine herpesvirus 4 (strain 1942) Virion protein US10 homolog Proteins 0.000 claims 1
- 101000790442 Escherichia coli Insertion element IS2 uncharacterized 11.1 kDa protein Proteins 0.000 claims 1
- 101000788354 Escherichia phage P2 Uncharacterized 8.2 kDa protein in gpA 5'region Proteins 0.000 claims 1
- 101000770304 Frankia alni UPF0460 protein in nifX-nifW intergenic region Proteins 0.000 claims 1
- 101000797344 Geobacillus stearothermophilus Putative tRNA (cytidine(34)-2'-O)-methyltransferase Proteins 0.000 claims 1
- 101000748410 Geobacillus stearothermophilus Uncharacterized protein in fumA 3'region Proteins 0.000 claims 1
- 101000772675 Haemophilus influenzae (strain ATCC 51907 / DSM 11121 / KW20 / Rd) UPF0438 protein HI_0847 Proteins 0.000 claims 1
- 101000631019 Haemophilus influenzae (strain ATCC 51907 / DSM 11121 / KW20 / Rd) Uncharacterized protein HI_0350 Proteins 0.000 claims 1
- 101000768938 Haemophilus phage HP1 (strain HP1c1) Uncharacterized 8.9 kDa protein in int-C1 intergenic region Proteins 0.000 claims 1
- 101000785414 Homo sapiens Ankyrin repeat, SAM and basic leucine zipper domain-containing protein 1 Proteins 0.000 claims 1
- 101000782488 Junonia coenia densovirus (isolate pBRJ/1990) Putative non-structural protein NS2 Proteins 0.000 claims 1
- 101000811523 Klebsiella pneumoniae Uncharacterized 55.8 kDa protein in cps region Proteins 0.000 claims 1
- 101000818409 Lactococcus lactis subsp. lactis Uncharacterized HTH-type transcriptional regulator in lacX 3'region Proteins 0.000 claims 1
- 101000878851 Leptolyngbya boryana Putative Fe(2+) transport protein A Proteins 0.000 claims 1
- 208000006758 Marek Disease Diseases 0.000 claims 1
- 101000758828 Methanosarcina barkeri (strain Fusaro / DSM 804) Uncharacterized protein Mbar_A1602 Proteins 0.000 claims 1
- 101001122401 Middle East respiratory syndrome-related coronavirus (isolate United Kingdom/H123990006/2012) Non-structural protein ORF3 Proteins 0.000 claims 1
- 101001055788 Mycolicibacterium smegmatis (strain ATCC 700084 / mc(2)155) Pentapeptide repeat protein MfpA Proteins 0.000 claims 1
- 101000740670 Orgyia pseudotsugata multicapsid polyhedrosis virus Protein C42 Proteins 0.000 claims 1
- 101000769182 Photorhabdus luminescens Uncharacterized protein in pnp 3'region Proteins 0.000 claims 1
- 101000961392 Pseudescherichia vulneris Uncharacterized 29.9 kDa protein in crtE 3'region Proteins 0.000 claims 1
- 101000731030 Pseudomonas oleovorans Poly(3-hydroxyalkanoate) polymerase 2 Proteins 0.000 claims 1
- 101001065485 Pseudomonas putida Probable fatty acid methyltransferase Proteins 0.000 claims 1
- 101000711023 Rhizobium leguminosarum bv. trifolii Uncharacterized protein in tfuA 3'region Proteins 0.000 claims 1
- 101000948156 Rhodococcus erythropolis Uncharacterized 47.3 kDa protein in thcA 5'region Proteins 0.000 claims 1
- 101000917565 Rhodococcus fascians Uncharacterized 33.6 kDa protein in fasciation locus Proteins 0.000 claims 1
- 101000790284 Saimiriine herpesvirus 2 (strain 488) Uncharacterized 9.5 kDa protein in DHFR 3'region Proteins 0.000 claims 1
- 101000936719 Streptococcus gordonii Accessory Sec system protein Asp3 Proteins 0.000 claims 1
- 101000788499 Streptomyces coelicolor Uncharacterized oxidoreductase in mprA 5'region Proteins 0.000 claims 1
- 101001102841 Streptomyces griseus Purine nucleoside phosphorylase ORF3 Proteins 0.000 claims 1
- 101000708557 Streptomyces lincolnensis Uncharacterized 17.2 kDa protein in melC2-rnhH intergenic region Proteins 0.000 claims 1
- 101000649826 Thermotoga neapolitana Putative anti-sigma factor antagonist TM1081 homolog Proteins 0.000 claims 1
- 101000827562 Vibrio alginolyticus Uncharacterized protein in proC 3'region Proteins 0.000 claims 1
- 101000778915 Vibrio parahaemolyticus serotype O3:K6 (strain RIMD 2210633) Uncharacterized membrane protein VP2115 Proteins 0.000 claims 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 abstract description 28
- 239000000427 antigen Substances 0.000 abstract description 25
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 abstract description 24
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 abstract description 24
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 6
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 abstract description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 abstract description 3
- 230000010354 integration Effects 0.000 abstract 2
- 208000027954 Poultry disease Diseases 0.000 abstract 1
- 108010008038 Synthetic Vaccines Proteins 0.000 abstract 1
- 229940124551 recombinant vaccine Drugs 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 109
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 64
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 47
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 46
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 38
- 102100029796 Protein S100-A10 Human genes 0.000 description 35
- 238000000034 method Methods 0.000 description 35
- 241000700663 Avipoxvirus Species 0.000 description 29
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 27
- 101710081079 Minor spike protein H Proteins 0.000 description 24
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 23
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 23
- 101000977023 Azospirillum brasilense Uncharacterized 17.8 kDa protein in nodG 5'region Proteins 0.000 description 21
- 101000961984 Bacillus thuringiensis Uncharacterized 30.3 kDa protein Proteins 0.000 description 21
- 101000644901 Drosophila melanogaster Putative 115 kDa protein in type-1 retrotransposable element R1DM Proteins 0.000 description 21
- 101000747702 Enterobacteria phage N4 Uncharacterized protein Gp2 Proteins 0.000 description 21
- 101000758599 Escherichia coli Uncharacterized 14.7 kDa protein Proteins 0.000 description 21
- 241000700662 Fowlpox virus Species 0.000 description 21
- 101000768930 Lactococcus lactis subsp. cremoris Uncharacterized protein in pepC 5'region Proteins 0.000 description 21
- 101000976302 Leptospira interrogans Uncharacterized protein in sph 3'region Proteins 0.000 description 21
- 101000778886 Leptospira interrogans serogroup Icterohaemorrhagiae serovar Lai (strain 56601) Uncharacterized protein LA_2151 Proteins 0.000 description 21
- 101001121571 Rice tungro bacilliform virus (isolate Philippines) Protein P2 Proteins 0.000 description 21
- 101000818098 Spirochaeta aurantia Uncharacterized protein in trpE 3'region Proteins 0.000 description 21
- 101001026590 Streptomyces cinnamonensis Putative polyketide beta-ketoacyl synthase 2 Proteins 0.000 description 21
- 101000750896 Synechococcus elongatus (strain PCC 7942 / FACHB-805) Uncharacterized protein Synpcc7942_2318 Proteins 0.000 description 21
- 101000916321 Xenopus laevis Transposon TX1 uncharacterized 149 kDa protein Proteins 0.000 description 21
- 101000760088 Zymomonas mobilis subsp. mobilis (strain ATCC 10988 / DSM 424 / LMG 404 / NCIMB 8938 / NRRL B-806 / ZM1) 20.9 kDa protein Proteins 0.000 description 21
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 21
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 21
- 101000666833 Autographa californica nuclear polyhedrosis virus Uncharacterized 20.8 kDa protein in FGF-VUBI intergenic region Proteins 0.000 description 20
- 101000977027 Azospirillum brasilense Uncharacterized protein in nodG 5'region Proteins 0.000 description 20
- 101000962005 Bacillus thuringiensis Uncharacterized 23.6 kDa protein Proteins 0.000 description 20
- 101000785191 Drosophila melanogaster Uncharacterized 50 kDa protein in type I retrotransposable element R1DM Proteins 0.000 description 20
- 101000747704 Enterobacteria phage N4 Uncharacterized protein Gp1 Proteins 0.000 description 20
- 101000861206 Enterococcus faecalis (strain ATCC 700802 / V583) Uncharacterized protein EF_A0048 Proteins 0.000 description 20
- 101000769180 Escherichia coli Uncharacterized 11.1 kDa protein Proteins 0.000 description 20
- 101000976301 Leptospira interrogans Uncharacterized 35 kDa protein in sph 3'region Proteins 0.000 description 20
- 101000658690 Neisseria meningitidis serogroup B Transposase for insertion sequence element IS1106 Proteins 0.000 description 20
- 101000748660 Pseudomonas savastanoi Uncharacterized 21 kDa protein in iaaL 5'region Proteins 0.000 description 20
- 101000584469 Rice tungro bacilliform virus (isolate Philippines) Protein P1 Proteins 0.000 description 20
- 101000818096 Spirochaeta aurantia Uncharacterized 15.5 kDa protein in trpE 3'region Proteins 0.000 description 20
- 101000766081 Streptomyces ambofaciens Uncharacterized HTH-type transcriptional regulator in unstable DNA locus Proteins 0.000 description 20
- 101000804403 Synechococcus elongatus (strain PCC 7942 / FACHB-805) Uncharacterized HIT-like protein Synpcc7942_1390 Proteins 0.000 description 20
- 101000750910 Synechococcus elongatus (strain PCC 7942 / FACHB-805) Uncharacterized HTH-type transcriptional regulator Synpcc7942_2319 Proteins 0.000 description 20
- 101000644897 Synechococcus sp. (strain ATCC 27264 / PCC 7002 / PR-6) Uncharacterized protein SYNPCC7002_B0001 Proteins 0.000 description 20
- 101000916336 Xenopus laevis Transposon TX1 uncharacterized 82 kDa protein Proteins 0.000 description 20
- 101001000760 Zea mays Putative Pol polyprotein from transposon element Bs1 Proteins 0.000 description 20
- 101000678262 Zymomonas mobilis subsp. mobilis (strain ATCC 10988 / DSM 424 / LMG 404 / NCIMB 8938 / NRRL B-806 / ZM1) 65 kDa protein Proteins 0.000 description 20
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 20
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 18
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 18
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 16
- 102100026189 Beta-galactosidase Human genes 0.000 description 14
- 208000000666 Fowlpox Diseases 0.000 description 14
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 14
- 206010046865 Vaccinia virus infection Diseases 0.000 description 14
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 14
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 14
- 208000007089 vaccinia Diseases 0.000 description 14
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 13
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 13
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 13
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 13
- 101000787132 Acidithiobacillus ferridurans Uncharacterized 8.2 kDa protein in mobL 3'region Proteins 0.000 description 12
- 101000827262 Acidithiobacillus ferrooxidans Uncharacterized 18.9 kDa protein in mobE 3'region Proteins 0.000 description 12
- 101000811747 Antithamnion sp. UPF0051 protein in atpA 3'region Proteins 0.000 description 12
- 101000827607 Bacillus phage SPP1 Uncharacterized 8.5 kDa protein in GP2-GP6 intergenic region Proteins 0.000 description 12
- 101000961975 Bacillus thuringiensis Uncharacterized 13.4 kDa protein Proteins 0.000 description 12
- 101000964407 Caldicellulosiruptor saccharolyticus Uncharacterized 10.7 kDa protein in xynB 3'region Proteins 0.000 description 12
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 12
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 101000768777 Haloferax lucentense (strain DSM 14919 / JCM 9276 / NCIMB 13854 / Aa 2.2) Uncharacterized 50.6 kDa protein in the 5'region of gyrA and gyrB Proteins 0.000 description 12
- 101000607404 Infectious laryngotracheitis virus (strain Thorne V882) Protein UL24 homolog Proteins 0.000 description 12
- 101000735632 Klebsiella pneumoniae Uncharacterized 8.8 kDa protein in aacA4 3'region Proteins 0.000 description 12
- 101000818100 Spirochaeta aurantia Uncharacterized 12.7 kDa protein in trpE 5'region Proteins 0.000 description 12
- 101001037658 Streptomyces coelicolor (strain ATCC BAA-471 / A3(2) / M145) Glucokinase Proteins 0.000 description 12
- 230000001133 acceleration Effects 0.000 description 12
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 12
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 11
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 11
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 11
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 10
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 10
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 9
- 230000004044 response Effects 0.000 description 9
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 8
- WQZGKKKJIJFFOK-FPRJBGLDSA-N beta-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-FPRJBGLDSA-N 0.000 description 8
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 8
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 8
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 8
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 7
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 7
- 241000223924 Eimeria Species 0.000 description 7
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 7
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 7
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 7
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 7
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 7
- 239000000047 product Substances 0.000 description 7
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 6
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 6
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 6
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 6
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 6
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 6
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 6
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 6
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl beta-D-galactoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CNC2=CC=C(Br)C(Cl)=C12 OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 0.000 description 5
- 241000725585 Chicken anemia virus Species 0.000 description 5
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 5
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 241000286209 Phasianidae Species 0.000 description 5
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 5
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 5
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 5
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 5
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 5
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 5
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 5
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 5
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 4
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 4
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 4
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 4
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 4
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 4
- 238000009739 binding Methods 0.000 description 4
- 206010006451 bronchitis Diseases 0.000 description 4
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 4
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 4
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 4
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 4
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 4
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 4
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 4
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 4
- 238000007873 sieving Methods 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 4
- 101000743047 Autographa californica nuclear polyhedrosis virus Protein AC23 Proteins 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 3
- 101710136297 Protein VP2 Proteins 0.000 description 3
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 3
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 3
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 3
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 3
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 3
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 3
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 3
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 3
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 3
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- 101000977065 Acidithiobacillus ferridurans Uncharacterized 11.6 kDa protein in mobS 3'region Proteins 0.000 description 2
- XEPSCVXTCUUHDT-AVGNSLFASA-N Arg-Arg-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N XEPSCVXTCUUHDT-AVGNSLFASA-N 0.000 description 2
- 206010003694 Atrophy Diseases 0.000 description 2
- 239000007992 BES buffer Substances 0.000 description 2
- 101000765604 Bacillus subtilis (strain 168) FlaA locus 22.9 kDa protein Proteins 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 241000702628 Birnaviridae Species 0.000 description 2
- 101000964402 Caldicellulosiruptor saccharolyticus Uncharacterized protein in xynC 3'region Proteins 0.000 description 2
- 241000711573 Coronaviridae Species 0.000 description 2
- 101000861180 Cupriavidus necator (strain ATCC 17699 / DSM 428 / KCTC 22496 / NCIMB 10442 / H16 / Stanier 337) Uncharacterized protein H16_B0147 Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 2
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 2
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 2
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 2
- 241000701063 Gallid alphaherpesvirus 1 Species 0.000 description 2
- 101000977779 Lymantria dispar multicapsid nuclear polyhedrosis virus Uncharacterized 33.9 kDa protein in PE 3'region Proteins 0.000 description 2
- 208000028018 Lymphocytic leukaemia Diseases 0.000 description 2
- 241001430197 Mollicutes Species 0.000 description 2
- 101000827630 Narcissus mosaic virus Uncharacterized 10 kDa protein Proteins 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 2
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 2
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 2
- 230000037444 atrophy Effects 0.000 description 2
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 2
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 2
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 2
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 2
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 230000005802 health problem Effects 0.000 description 2
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 2
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 2
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 2
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 2
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 2
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 2
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 2
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 2
- 101150066555 lacZ gene Proteins 0.000 description 2
- 231100000636 lethal dose Toxicity 0.000 description 2
- KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M lithium chloride Chemical compound [Li+].[Cl-] KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 208000003747 lymphoid leukemia Diseases 0.000 description 2
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 2
- 229940126619 mouse monoclonal antibody Drugs 0.000 description 2
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 2
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 2
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 2
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 2
- -1 0.1% Chemical compound 0.000 description 1
- 102000008482 12E7 Antigen Human genes 0.000 description 1
- 108010020567 12E7 Antigen Proteins 0.000 description 1
- KIZQNNOULOCVDM-UHFFFAOYSA-M 2-hydroxyethyl(trimethyl)azanium;hydroxide Chemical compound [OH-].C[N+](C)(C)CCO KIZQNNOULOCVDM-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- IQUPABOKLQSFBK-UHFFFAOYSA-N 2-nitrophenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1[N+]([O-])=O IQUPABOKLQSFBK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000701242 Adenoviridae Species 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 241001600407 Aphis <genus> Species 0.000 description 1
- 208000032467 Aplastic anaemia Diseases 0.000 description 1
- 241000204725 Ascaridia galli Species 0.000 description 1
- 241000228212 Aspergillus Species 0.000 description 1
- 241000606767 Avibacterium paragallinarum Species 0.000 description 1
- 108030001720 Bontoxilysin Proteins 0.000 description 1
- 208000027312 Bursal disease Diseases 0.000 description 1
- 101100148606 Caenorhabditis elegans pst-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000282465 Canis Species 0.000 description 1
- 241000242722 Cestoda Species 0.000 description 1
- 241000606161 Chlamydia Species 0.000 description 1
- 241001647378 Chlamydia psittaci Species 0.000 description 1
- 206010008631 Cholera Diseases 0.000 description 1
- 241000193403 Clostridium Species 0.000 description 1
- 241000193155 Clostridium botulinum Species 0.000 description 1
- 241000193468 Clostridium perfringens Species 0.000 description 1
- 241000193466 Clostridium septicum Species 0.000 description 1
- 208000008953 Cryptosporidiosis Diseases 0.000 description 1
- 206010011502 Cryptosporidiosis infection Diseases 0.000 description 1
- UHDGCWIWMRVCDJ-CCXZUQQUSA-N Cytarabine Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-CCXZUQQUSA-N 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 230000007023 DNA restriction-modification system Effects 0.000 description 1
- 101150082674 E2 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000223934 Eimeria maxima Species 0.000 description 1
- 241000499563 Eimeria necatrix Species 0.000 description 1
- 241001288713 Escherichia coli MC1061 Species 0.000 description 1
- 241001524679 Escherichia virus M13 Species 0.000 description 1
- 241000701047 Gallid alphaherpesvirus 2 Species 0.000 description 1
- 102100036263 Glutamyl-tRNA(Gln) amidotransferase subunit C, mitochondrial Human genes 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 108010051696 Growth Hormone Proteins 0.000 description 1
- 241000606790 Haemophilus Species 0.000 description 1
- 241000700586 Herpesviridae Species 0.000 description 1
- 101001001786 Homo sapiens Glutamyl-tRNA(Gln) amidotransferase subunit C, mitochondrial Proteins 0.000 description 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 1
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 1
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 1
- 102000004407 Lactalbumin Human genes 0.000 description 1
- 108090000942 Lactalbumin Proteins 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 239000012901 Milli-Q water Substances 0.000 description 1
- 241000204022 Mycoplasma gallisepticum Species 0.000 description 1
- 241000202942 Mycoplasma synoviae Species 0.000 description 1
- 241000244206 Nematoda Species 0.000 description 1
- 108091092724 Noncoding DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000712464 Orthomyxoviridae Species 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 241000711504 Paramyxoviridae Species 0.000 description 1
- 241000606860 Pasteurella Species 0.000 description 1
- 241000606856 Pasteurella multocida Species 0.000 description 1
- 241000709664 Picornaviridae Species 0.000 description 1
- 206010035148 Plague Diseases 0.000 description 1
- 241000700625 Poxviridae Species 0.000 description 1
- 101800003658 Protein VP4 Proteins 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 1
- 241000607683 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Pullorum Species 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 102100038803 Somatotropin Human genes 0.000 description 1
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 1
- 241000194017 Streptococcus Species 0.000 description 1
- 101100257766 Streptococcus agalactiae serotype III (strain NEM316) strA gene Proteins 0.000 description 1
- 101100043717 Streptomyces griseus aphD gene Proteins 0.000 description 1
- 101000946719 Synechococcus elongatus (strain PCC 7942 / FACHB-805) Carboxysome assembly protein CcmN Proteins 0.000 description 1
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 description 1
- 208000037386 Typhoid Diseases 0.000 description 1
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 1
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 241000607479 Yersinia pestis Species 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001509494 [Clostridium] colinum Species 0.000 description 1
- 108700010877 adenoviridae proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 108010080488 arginyl-arginyl-leucine Proteins 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 1
- 229940053031 botulinum toxin Drugs 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 1
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 description 1
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 description 1
- 238000005352 clarification Methods 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 229960000684 cytarabine Drugs 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 238000011037 discontinuous sequential dilution Methods 0.000 description 1
- 239000003651 drinking water Substances 0.000 description 1
- 235000020188 drinking water Nutrition 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 1
- 238000001493 electron microscopy Methods 0.000 description 1
- 201000002491 encephalomyelitis Diseases 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N ethyl mercaptane Natural products CCS DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 101150045500 galK gene Proteins 0.000 description 1
- 101150041954 galU gene Proteins 0.000 description 1
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 238000012252 genetic analysis Methods 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 description 1
- 101150096208 gtaB gene Proteins 0.000 description 1
- 101150085823 hsdR gene Proteins 0.000 description 1
- 239000002955 immunomodulating agent Substances 0.000 description 1
- 229940121354 immunomodulator Drugs 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- 229940047122 interleukins Drugs 0.000 description 1
- 235000015110 jellies Nutrition 0.000 description 1
- 239000008274 jelly Substances 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 229940124590 live attenuated vaccine Drugs 0.000 description 1
- 229940023012 live-attenuated vaccine Drugs 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 244000000010 microbial pathogen Species 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 201000009240 nasopharyngitis Diseases 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 230000017448 oviposition Effects 0.000 description 1
- 244000045947 parasite Species 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 1
- 229940127557 pharmaceutical product Drugs 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 101150098466 rpsL gene Proteins 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 208000017520 skin disease Diseases 0.000 description 1
- 239000010802 sludge Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002123 temporal effect Effects 0.000 description 1
- 238000009210 therapy by ultrasound Methods 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 201000008297 typhoid fever Diseases 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/44—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from protozoa
- C07K14/455—Eimeria
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/24011—Poxviridae
- C12N2710/24041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2710/24043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/20011—Coronaviridae
- C12N2770/20022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Virology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Immunology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для получения вакцин. Рекомбинантный вектор конструируют на основе аттенуированного вируса оспы птиц путем интеграции нуклеотидной последовательности, определяющей синтез гетерологичного белка микроорганизма, патогенного для домашней птицы, в некодирующую межгенную область, расположенную в концевых инвертированных поворотах (TIR). Межгенная область β1 и β2 расположена между нуклеотидами 1675 и 2165 TIR и 2672 и 3605 TIR соответственно. Клетки, трансформированные конструированным вектором, способны экспрессировать гетерологический протеин. Протеин может быть антигеном патогенных для птиц агентов: вирус болезни Гумборо, вирус инфекционного бронхита, вирус болезни Марека, паразитического простейшего, вызывающего кокцидиоз. Изобретение позволяет создать новые рекомбинантные вакцины против болезней птиц. 2 с. и 6 з.п. ф-лы, 13 ил., 9 табл.
Description
Изобретение относится к рекомбинантным вирусам, производным от вируса Avipox и, в частности, от вируса, ответственного за оспу у птиц, обычно называемую Fowlpox. Изобретение относится также к способу получения этих вирусов в результате культивирования клеток, к применению этих вирусов для получения вакцин и к вакцинам, содержащим эти вирусы. Изобретение относится также к последовательностям переноса для включения в геном этого рекомбинантного вируса, а также к плазмидам, которые несут эти последовательности.
Вирус, ответственный за оспу у птиц, или Fowlpox вирус (FPV), принадлежит к роду Avipox семейства Poxviridae.
Вирус Fowlpox имеет характеристики, типичные для Pox. Эти вирусы большого размера, геном которых представляет собой ДНК в виде линейной двойной спирали величиной 300 ко, у которой концевые части простой цепи связаны ковалентным образом. Примерно 20 ко этого генома были собраны в виде последовательности, в частности последовательность обратных терминальных повторений (TIR для Terminal Inverted Repeats) (Campbell et al. 1989; Tomley et al. 1988). Обратные терминальные повторения представляют собой две длинные идентичные последовательности, находящиеся на каждом конце генома, с противоположной ориентацией.
Вирус коровьей оспы или Vaccinia был первым из Pox, который был выведен в качестве живущего рекомбинантного вируса, способного выражать чужеродные протеины. Перечень выраженных протеинов является очень длинным. В частности, экспрессия многочисленных чужеродных антигенов позволила получить иммунизацию против различных болезней.
В заявке на европейский патент 0 314 569 было предложено применение вируса Fowlpox в качестве вектора экспрессии гетерологичных протеинов с целью получения вакцины, т. е. применение рекомбинантного вируса, который интегрировал в некодирующую внутригенную область своего генома последовательность ДНК, кодирующую гетерологичный протеин; эта область представляет собой короткую последовательность из 32 нуклеотидов, расположенную между открытыми фазами для считывания (ORF для Open Reading Frame) ORF 7 и ORF 9, причем эта область была преобразована генетическим путем в неосновной сайт включения. В таких коротких внутригенных областях велик риск того, что включение отделит сигнал транскрипции от гена и тем самым введет мутацию, которая инактивирует этот ген. Это подтверждается: действительно, эта последовательность из 32 нуклеотидов оказывается является существенной областью, потому что она должна была увеличиться на 55 нуклеотидов, чтобы избежать возможного перекрывания между промотором фазы ORF 9 и кодирующей последовательностью 3' фазы ORF 7. В случае области, которая отделяет ORF 7 от ORF 9, включение в природной последовательности является, кроме того, нестабильным (Spehner et al., 1990), и его преобразование является необходимым. Более того, предложенный способ преобразования короткой внутригенной области не является общим.
С другой стороны, в заявке на международный патент WO 88/02022 было также предложено конструирование вируса Fowlpox и других рекомбинантных Pox у птиц, отличающихся включением чужеродной ДНК в ген тимидинкиназы. Это включение создает мутацию в гене, которая могла бы уменьшить заражающую способность вируса. Это имеет риск слишком большого ослабления штамма и уменьшенной иммуногенной способности вакцины, выведенной из рекомбинантного вируса.
Кроме того, в заявке на европейский патент 0 353 851 было предложено применение рекомбинантного вируса Fowlpox в качестве вектора экспрессии гетерологичного протеина. Включение чужеродного гена в вирусный геном осуществляется в открытых фазах для считывания (ORF), расположенных в обратных терминальных повторениях (TIR). Включение одного или нескольких чужеродных генов во внутреннюю часть открытых фаз для считывания имеет риск произвести мутацию гена, функция которого не известна.
Настоящее изобретение предоставляет другие области для включения одного или нескольких чужеродных генов в вирусный геном, которые больше не имеют недостатков, свойственных указанным выше областям включений.
В связи с этим настоящее изобретение относится к рекомбинантному вирусу Avipox, выведенному из ослабленного штамма вируса Avipox и содержащему в неосновной части своего генома по меньшей мере одну последовательность ДНК, кодирующую полностью или частично протеин, гетерологичный по отношению к вирусу Avipox, а также элементы, способные обеспечить экспрессию этого протеина в клетке, зараженной указанным рекомбинантным вирусом, причем неосновная часть генома образована внутригенной некодирующей областью вируса Avipox, т. е. областью, расположенной между двумя открытыми фазами для считывания, включая их сигналы экспрессии.
Под неосновной частью генома вируса Avipox понимают область, которая может быть модифицирована без ухудшения функций, задействованных в преобразовании вируса in vitro и in vivo. В качестве неосновной части выбирают некодирующую внутригенную область генома, т.е. расположенную между двух ORF, включая их сигналы экспрессии.
Внутригенные области по изобретению являются широкими, так чтобы риск того, что включение отделит сигналы транскрипции от их соответствующих генов, был минимален, а также чтобы их преобразование было бы не нужно. С другой стороны, последовательности этих внутригенных областей являются некодирующими, и, следовательно, риск мутации в ORF является нулевым. Под широкой областью понимают область, имеющую последовательность из более чем 60 нуклеотидов. Обычно выбирают область, имеющую последовательность из более чем 100 нуклеотидов. Предпочтительно выбирают область, имеющую последовательность из более чем 200 нуклеотидов. По особенно предпочтительному способу выбирают область, имеющую последовательность из более чем 400 нуклеотидов.
С другой стороны, обычно выбирают внутригенную область, в которой клонируется по меньшей мере одна последовательность ДНК, расположенную в одной из двух областей TIR вируса Avipox. Обычно по меньшей мере одна последовательность ДНК клонируется в по меньшей мере одной из двух областей TIR вируса Avipox. Предпочтительно по меньшей мере одна последовательность ДНК клонируется в обеих областях TIR вируса. По еще более предпочтительному способу выбирают внутригенную область, называемую область β1, и/или внутригенную область, называемую область β2, причем внутригенная область, называемая область β1, располагается между нуклеотидами 1675 и 2165, а внутригенная область, называемая область β2, располагается между нуклеотидами 2672 и 3605, принимая в качестве исходного нуклеотида сайт рестрикции BamHI, находящийся в TIR. Этот сайт рестрикции BamHI, выбираемый здесь для отсчета внутригенных областей, представляет собой первый нуклеотид последовательности, опубликованной в работе Tomley et al. 1988. Можно также определить эти области по изобретению следующим образом: внутригенная область, называемая область β1, располагается между открытыми фазами для считывания ORF 1 и ORF 2, причем открытая фаза для считывания OFR 1 находится между нуклеотидами 419 (нуклеотид A из ATG) и 1674 (3-й нуклеотид стоп-кодона), а открытая фаза для считывания ORF 2 находится между нуклеотидами 2166 (нуклеотид A из ATG) и 2671 (3-й нуклеотид стоп-кодона), принимая в качестве исходного нуклеотида сайт рестрикции BamHI и TIR, а внутригенная область, называемая область β2, располагается между открытыми фазами для считывания ORF 2 и ORF 3, причем открытая фаза для считывания ORF 2 находится между нуклеотидами 2166 (нуклеотид A из ATG) и 2671 (3-й нуклеотид стоп-кодона), а открытая фаза для считывания ORF 3 находится между нуклеотидами 3606 (3-й нуклеотид стоп-кодона) и 4055 (нуклеотид A из ATG), принимая в качестве исходного нуклеотида сайт рестрикции BamHI в TIR. По более предпочтительному способу в области β1 выбирают часть, расположенную между нуклеотидами 1775 и 2065, а в области β2 - часть, расположенную между нуклеотидами 2772 и 3505. Хорошие результаты были получены при клонировании на уровне нуклеотида 1842, называемого сайтом включения B1, который расположен в области β1, и/или на уровне нуклеотида 3062, называемого сайтом включения B2, который расположен в области β2.
Хорошие результаты были получены, когда по меньшей мере одна последовательность ДНК клонируется в области β2 в одной из двух областей TIR вируса Avipox. Хорошие результаты также были получены, когда одна последовательность ДНК клонируется в области β1 в каждой из двух областей TIR. Это является другим преимуществом изобретения, потому что можно получить две копии гетерологичной последовательности ДНК на один геном.
Хорошие результаты были получены, когда по меньшей мере одна последовательность ДНК клонируется в области β2 в одной из двух областей TIR вируса Avipox. Хорошие результаты также были получены, когда одна последовательность ДНК клонируется в области β1 в каждой из двух областей TIR. Это является другим преимуществом изобретения, потому что можно получить две копии гетерологичной последовательности ДНК на один геном.
Под рекомбинантным вирусом Avipox, выведенным из ослабленного штамма вируса Avipox, понимают ослабленный вирус, принадлежащий к роду Avipox, геном которого содержит гетерологичную последовательность в сопровождении сигналов экспрессии. Обычно в качестве вируса используют вирус рода Avipox, такой как Fowlpox, Pigeonpox или Canarypox. Обычно в качестве вируса используют Fowlpox. Предпочтительно в качестве вируса Fowlpox используют вакцинальный штамм вируса оспы кур или Fowlpox такого как вакцина, производимая и поставляемая в торговлю фирмой СОЛЬВЕЙ под маркой POXINE или вакцина, производимая и поставляемая в торговлю фирмой СОЛЬВЕЙ под марками CHICK-N-POX, POULVAC CHICK-N-POX, CHICK-N-POX TC, POULVAC CHICK-N-POX TC, POULVAC POXINE, POULVAC P. По более предпочтительному способу в качестве вируса Fowlpox используют вакцину, поставляемую в торговлю фирмой СОЛЬВЕЙ под марками CHICK-N-POX, POULVAC CHICK-N-POX, CHICK-N-POX TC, POULVAC CHICK-N-POX Tc, POULVAC POXINE, POULVAC P, сокращенно CNP.
Ослабление получается в результате последовательных прохождений через эмбрион или, если вирус был адаптирован к культивируемым клеткам, в результате прохождений через культуру клеток.
Под элементами, способными обеспечить экспрессию гена, который кодирует гетерологичный протеин в клетке, зараженной указанным рекомбинантным вирусом, понимают сигналы генетической экспрессии, узнаваемые вирусом, в частности промотор и терминатор, т.е. элементы, известные специалисту, такие как, в частности, описанные, например, у Moss, 1990. В общем случае используют промотор для Pox. Обычно используют промотор для Vaccinia или для Fowlpox. Предпочтительно используют промотор P11 и промотор P7.5 для Vaccinia, такие как описанные у Venkatesan et al., 1981; Cochran et al., 1985 и Bertholet et al, 1985.
Под по меньшей мере одной последовательностью ДНК, кодирующей полностью или частично протеин, гетерологичный по отношению к вирусу Avipox, понимают любой фрагмент ДНК, извлеченный из генома, или копию ДНКк или еще синтезированную ДНК в сопровождении сигналов экспрессии, последовательность которой кодирует полностью или частично протеин, чужеродный для Avipox.
Фиг. 1-11 были подготовлены, чтобы позволить лучше понять изобретение.
Фиг. 1 изображает конструирование рекомбинантного вируса Avipox, модифицированного согласно Mackett et al. 1984. Клетки, зараженные (I : инфекция) вирусом Fowplpox (FPV), трансфектируются (T : "трансфекция") плазмидой переноса. Эта плазмида (P) несет ориентированный промотор (Pr), чтобы обеспечить экспрессию смежного гетерологичного гена (q), с той и с другой стороны которого располагаются последовательности вирусной ДНК. Гомологичная рекомбинация (R) имеет место в цитоплазме клетки (C) между последовательностями, которые окаймляют ген, и последовательностями, находящимися на вирусном геноме. Это приводит к включению гетерологичного гена в вирусный геном. Этот геном может упаковываться и производить рекомбинантные вирусные частицы (VP). N означает ядро клетки (C).
Фиг. 2 схематично изображает концевые части генома Fowlpox с TIR справа (TIR-R) и слева (TIR-L), обозначаемыми прямоугольниками, и с единственной последовательностью, обозначаемой чертой. Пунктир обозначает центральную область генома. Фрагмент рестрикции EcoRI из TIR-L имеет величину 6,2 ко, тогда как аналогичный фрагмент из TIR-R имеет величину 9,0 ко. Эта схема показывает, что эти два фрагмента имеют общую последовательность, причем единственную последовательность. Показан сайт BamHI, расположенный ниже EcoRI в TIR.
Фиг. 3 изображает карту рестрикции плазмиды pTIRBI (PTIRBI) для некоторых единичных сайтов и положение ORF. Единичный сайт BamHI используется для клонирований гетерологичных генов.
ori (ORI): начало репликации плазмиды в Escherichia coli (E.coli); Ap: ген устойчивости к ампициллину; ORF 1 - ORF 6; открытые фазы для считывания в Fowlpox.
Фиг. 4 представляет собой рисунок, подобный фиг. 3, но для плазмиды pTIRB2 (RTIRB2).
Фиг. 5 изображает карту рестрикции плазмиды pIILac (PIILAC). Эта плазмида несет ген LacZ микроорганизма E.coli под контролем промотора PII для Vaccinia. PII : промотор PII для Vaccinia; LACZ: ген, кодирующий β-галактозидазу; ori: начало репликации в E.coli; Brin + : цепь, упакованная в фаге M13 : AP : ген устойчивости к ампициллину.
Фиг. 6 изображает пример вектора переноса для гена LacZ в TIP. Этот вектор представляет собой плазмиду pTIRBIP75Lac (PTIRBIP75LAC). Кассета P7.5-LacZ клонируется в сайте BamHI плазмиды pTIRBI (в направлении по часовой стрелке). P7.5 : промотор P7.5 для Vaccinia.
Фиг. 7 является схематическим изображением включений гена LacZ (представленного заштрихованным прямоугольником) в геноме CNP. Кассеты P7.5 LacZ и PII-LacZ включаются в терминальные области (TIR) в том или ином направлении. Область TIR справа не представлена. Стрелки указывают направление транскрипции генов, изображенных в виде прямоугольников. Масштаб не соблюдается.
Фиг. 8 изображает сегмент A для IBDV, положение праймеров и различные фрагменты, полученные в результате обратной транскрипции и амплификации ARN сегмента A из штамма Edgar.
A : строение ORF
p : "праймеры", используемые для осуществления амплификации сегмента A.
p : "праймеры", используемые для осуществления амплификации сегмента A.
>, < : ориентация праймеров по отношению к кодирующей последовательности сегмента A.
fgt PCR : фрагменты, генерируемые в результате амплификации ARN сегмента A.
pb : пар оснований.
Фиг. 9 (от 9a до 9e) изображает нуклеотидную последовательность увеличенной ДНК, соответствующей ARN сегмента A штамма Edgar и трансляцию аминокислот фаз ORF 1, 2 и 3.
Primers 0,1, 1b, 2, 3, 4, 5, и 6 : праймеры, используемые для генерирования (путем обратной транскрипции и амплификации) фрагментов ДНК, соответствующих сегменту A штамма Edgar.
Фиг. 10 изображает схему реконструирования сегмента ДНК, соответствующего сегменту A штамма Edgar, исходя из фрагментов, полученных в результате обратной транскрипции и амплификации.
* : направленный мутагенез.
Фиг. 11 изображает карту рестрикции плазмиды pTIR75EI LAC (PTIR75EILAC).
Часть плазмиды, обозначенная жирной чертой, соответствует гомологичным последовательностям генома FPV. ori (ORI) : начало репликации плазмиды в E. coli; Ar : ген устойчивости к ампициллину; P7.5 : промотор P7.5 для vaccinia; ORF 1 - IBDV : ORF I сегмента A штамма Edgar; P11 : промотор P11 для vaccinia; LACZ : ген, кодирующий β-галактозидазу; pb : пар оснований; OFR 1 - ORF 6 : открытые фазы для считывания в Fowlpox.
Фиг. 12 изображает описание при помощи теста ELISA протеинов IBDV, выраженных в рекомбинантах FPV (IBDV). Описание было осуществлено следующим образом: по 50 мкл клеточных суспензий и последовательных разбавлений вдвое этих суспензий были помещены в чашечки. После инкубации второго антитела анти-IBDV (моноклональный анти-VP3 или анти-VP2) была осуществлена имплификация сигнала при помощи системы анти-IgG мыши, меченной посредством биотин + стрептавидин совместно со щелочной фосфатазой.
Фиг. 12a соответствует детектированию при помощи моноклонального антитела анти-VP3. Фиг. 12B соответствует детектированию по помощи моноклонального антитела анти-VP2.
На этих фигурах абцисса изображает последовательные разбавления в 2 раза клеточных экстрактов в логарифмических единицах, а ордината изображает отношение поглощений, измеренных при 690 мм и 405 мм.
Фиг. 13 изображает описание при помощи Western blot протеинов IBDV, выраженных в рекомбинантах FPV (IBDV). Это исследование было осуществлено следующим образом: клеточные суспензии центрифугируются с ускорением 3000 g, а полученные всплывшие продукты подвергаются ультрацентрифугированию с ускорением 185 000 g; остатки, полученные после двух процессов центрифугирования, объединяются и снова переводятся в суспензию при помощи буферного раствора PBS (Phosphate Buffered Saline, Gibco).
Отстой протеинов в количестве от 20 до 40 мкг для рекомбинант FPV/IBDV и 5 мкг для клеток, зараженных при помощи IBDV (положительный контроль) наносится в расчете на одну лунку на гель типа акриламид-SDS. После переноса на мембрану протеины IBDV детектируются при помощи поликлональной сыворотки, распознающей все протеины IBDV, для фиг. 13A, или при помощи моноклонального антитела анти-VP3 для фиг. 13B. Амплификация сигнала реализуется при помощи системы анти-IgG, меченной биотином и сопряженной системой стрептавидин-щелочная фосфатаза. PM (mW): протеины с известными молекулярными массами.
Способ, используемый для осуществления изобретения, схематично показан на фиг. 1 (модифицированный согласно Mackett et al., 1984). Клетки, зараженные при помощи Avipox или Fowlpox, трансфектируются плазмидой переноса. Эта плазмида несет промотор, ориентированный так, чтобы разрешить экспрессию смежного гетерологичного гена, окаймленного с обеих сторон последовательностями вирусной ДНК. Гомологичная рекомбинация происходит в цитоплазме клетки между последовательностями, которые окаймляют ген, и последовательностями, находящимися на вирусном геноме. Таким образом, происходит включение гетерологичного гена в вирусный геном. Этот геном может упаковаться и производить рекомбинантные вирусные частицы. Этот способ включения путем заражения клеток при помощи Pox с последующим переносом плазмидой был разработан для Vaccinia и обычно используется во многих лабораториях для конструирования рекомбинантных Pox (Mackett et al., 1985).
Способ по изобретению включает обычно следующие стадии:
- первая стадия заключается в конструировании плазмид переноса, разрешающих просеивание,
- вторая стадия заключается в клонировании генов, кодирующих гетерологичные антигены в плазмидах переноса,
- третья стадия заключается в конструировании рекомбинантных вирусов Avipox, и
- четвертая стадия заключается в проведении тестов по вакцинации с рекомбинантными вирусами.
- первая стадия заключается в конструировании плазмид переноса, разрешающих просеивание,
- вторая стадия заключается в клонировании генов, кодирующих гетерологичные антигены в плазмидах переноса,
- третья стадия заключается в конструировании рекомбинантных вирусов Avipox, и
- четвертая стадия заключается в проведении тестов по вакцинации с рекомбинантными вирусами.
Предпочтительно способ включает следующие стадии:
a. Конструирование плазмид переноса, разрешающих просеивание:
- клонирование фрагментов, несущих TIR,
- включение сайта клонирования в TIR,
- клонирование промоторов P11 и P7.5 из Vaccinia;
- конструирование кассеты, несущей ген LacZ, и ее клонирование ниже P11 или P7.5,
- клонирование элементов P11 LacZ или P.7.5 LacZ в плазмидах переноса TIR.
a. Конструирование плазмид переноса, разрешающих просеивание:
- клонирование фрагментов, несущих TIR,
- включение сайта клонирования в TIR,
- клонирование промоторов P11 и P7.5 из Vaccinia;
- конструирование кассеты, несущей ген LacZ, и ее клонирование ниже P11 или P7.5,
- клонирование элементов P11 LacZ или P.7.5 LacZ в плазмидах переноса TIR.
b. Конструирование рекомбинантных вирусов CNP (ген LacZ для осуществления предварительного теста):
- перенос клеток QT35 вирусом CNP и плазмидой переноса,
- просеивание с последующей очисткой рекомбинант благодаря экспрессии гена LacZ,
- анализ геномов рекомбинант и экспрессии гена LacZ
c. Тест вакцинации:
- вакцинация цыплят рекомбинантными вирусами и защита от птичьей оспы, внесенной при помощи рекомбинантного вируса LacZ.
- перенос клеток QT35 вирусом CNP и плазмидой переноса,
- просеивание с последующей очисткой рекомбинант благодаря экспрессии гена LacZ,
- анализ геномов рекомбинант и экспрессии гена LacZ
c. Тест вакцинации:
- вакцинация цыплят рекомбинантными вирусами и защита от птичьей оспы, внесенной при помощи рекомбинантного вируса LacZ.
d. Клонирование генов, кодирующих гетерологичные антигены (гетерологичный протеин) в плазмидах переноса:
- клонирование генов, кодирующих гетерологичные антигены ниже P11 или P7.5,
- клонирование кассет P11-антиген и P7.5 - LacZ или P7.5-Антиген и P11-LacZ в плазмидах TIR.
- клонирование генов, кодирующих гетерологичные антигены ниже P11 или P7.5,
- клонирование кассет P11-антиген и P7.5 - LacZ или P7.5-Антиген и P11-LacZ в плазмидах TIR.
e. Конструирование рекомбинантных вирусов CNP:
- перенос клеток QT35 вирусом CNT и плазмидой переноса,
- просеивание с последующей очисткой рекомбинантных вирусов благодаря экспрессии гена LacZ,
- анализ экспрессии антигена на культуре клеток и анализ генома рекомбинантных вирусов.
- перенос клеток QT35 вирусом CNT и плазмидой переноса,
- просеивание с последующей очисткой рекомбинантных вирусов благодаря экспрессии гена LacZ,
- анализ экспрессии антигена на культуре клеток и анализ генома рекомбинантных вирусов.
f. Вакцинация:
- вакцинация рекомбинантными вирусами CNP,
- оценка степени защиты, обусловленной экспрессией антигена, гетерологичного по отношению к CNP.
- вакцинация рекомбинантными вирусами CNP,
- оценка степени защиты, обусловленной экспрессией антигена, гетерологичного по отношению к CNP.
Изобретение относится также к последовательностям переноса, которые позволяют включать гетерологичную ДНК в геном вируса Avipox, как определено выше, и, в частности, на сайтах B1 или B2. Изобретение относится к также к плазмидам, которые несут эти последовательности. Под плазмидой переноса понимают плазмиду, которая содержит гетерологичный ген под контролем промотора, распознаваемого вирусом Avipox, который окаймлен с обеих сторон последовательностями, расположенными с одной и с другой стороны от сайта B1 или от сайта B2. Длина этих последовательностей, гомологичных для FPV, которые окаймляют гетерологичный ген, должна быть достаточно велика, чтобы разрешить рекомбинацию слева и справа от гетерологичного гена. Обычно выбирают последовательности величиной не менее 1 ко. Хорошие результаты получаются для B1, окаймленного последовательностью величиной примерно 1850 нуклеотидов сверху и 4321 нуклеотидов снизу, а для B2 - примерно 3070 нуклеотидов сверху и 3100 нуклеотидов снизу. Плазмиды переноса принимают участие в процессе для изолирования рекомбинантных Avipox, причем способ вводит в действие перенос клеток перепелки QT35, предварительно зараженных вирусом Avipox.
Изобретение относится также к культивированию эукариотных клеток, зараженных рекомбинантным вирусом Avipox, выведенным из ослабленного штамма вируса Avipox и содержащим в неосновной части своего генома по меньшей мере одну последовательность ДНК, кодирующую полностью или частично протеин, гетерологичный для вируса Avipox, а также элементы, способные обеспечить экспрессию этого протеина в клетке, зараженной указанным рекомбинантным вирусом, причем неосновная часть образована некодирующей внутригенной областью вируса Avipox, расположенной между двух OFR, включая их сигналы экспрессии.
Предпочтительно применяют культивирование клеток домашней птицы. Хорошие результаты были получены с культурой клеток перепелки. Превосходные результаты были получены с культурой клеток перепелки QT35 такой, которая описана Cho (1981).
Рекомбинантный вирус Avipox по изобретению развивается в качестве векторов, способных выражать полностью или частично гетерологичный протеин. Следовательно, настоящее изобретение относится также к применению вируса по изобретению в качестве вектора, способного выражать полностью или частично гетерологичный протеин, такой как, в частности, антиген.
Изобретение относится также к вакцине, содержащей рекомбинантные вирус Avipox, выведенный из ослабленного штамма вируса Avipox и содержащий в неосновной части своего генома по меньшей мере одну последовательность ДНК, кодирующую полностью или частично протеин, гетерологичный для вируса Avipox, а также элементы, способные обеспечить экспрессию этого протеина в клетке, зараженной указанным рекомбинантным вирусом, причем неосновная часть генома образована некодирующей внутригенной областью вируса Avipox, расположенной между двумя ORF, включая их сигналы экспрессии.
Под гетерологичным протеином понимают любой протеин или часть протеина, которые чужеродны по отношению к вирусу Avipox, причем протеин может быть естественным или модифицированным. В общем случае этот протеин может быть антигеном, позволяющим разработать вакцину против патогенного организма. Обычно антигенами являются, в частности, протеины агентов, заражающих птиц: вирусов, бактерий, хламид, микоплазм, простейших одноклеточных организмов, грибов и червей.
Это, в частности, Adenoviridae, такие как вирус, ответственный за апластичную анемию (AA) или за синдром снижения кладки яиц (EDS), Birnaviridae, такие как вирус болезни Гумборо (IBDV), Coronaviridae, такие как вирус инфекционного бронхита (IBY), Herpesviridae, такие как вирус болезни Макера (MDV) и вирус, ответственный за инфекционный ларинготрахеит (ILTV), Orthomyxoviridae, такие как вирус, ответственный за грипп (Influeusa), Paramyxoviridae, такие как вирус болезни Ньюкасла (NDV), Picornaviridae, такие как вирус, ответственный за энцефаломиелит (AE), Roeviridae, ответственный за тенозиновит, Retrovirus, такие как вирус, ответственный за лимфоидный лейкоз (LL), вирус, ответственный за анемию у кур (CAV).
Это, в частности, хламиды, такие как Chlamydia psittaci.
Это, в частности, микоплазмы, такие как Mycoplasma gallisepticum и M. synoviae.
Это, в частности, бактерии, такие как Escherichia coli, Haemophilus, в том числе H. paragallinarum, которая является ответственной за насморк, Pasteurella, в том числе P. multocida, которая является ответственной за холеру, Salmonella, в том числе S.gallinarium, ответственная за тиф, и S. pullorum, Clostridium, в том числе C.botulinum, которая вырабатывает токсин, ответственный за ботулизм, C. perfringens и C.septicum ответственные за дерматозы, C.colinum, Campilobacter jejuni, Streptococcus aures.
Это, в частности, простейшие одноклеточные организмы, такие как Eimeria, ответственный за кокцидиоз, и Cryptosporidiosis baileyi, ответственный за криптоспородиоз.
Это, в частности, черви, такие как ленточные черви и круглые черви, в том числе Ascaridia galli.
Это, в частности, грибы, такие как Aspergillus fumigatis.
Предпочтительными антигенами являются антигены вируса болезни Гумборо (IBDV), вируса инфекционного бронхита (IBV), вируса, ответственного за анемию у кур (CAV), простейшего одноклеточного организма Eimeria, ответственного за кокцидиоз, вируса болезни Ньюкасла (NDY) и вируса болезни Марека (MDV).
Особенно предпочтительными антигенами являются антигены вируса болезни Гумборо (IBDV), вируса инфекционного бронхита (IBV), вируса, ответственного за анемию у кус (CAV) и простейшего одноклеточного организма Eimeria, ответственного за кокцидиод. Хорошие результаты были получены в следующих условиях:
- для IBDV : полностью или частично открытые фазы для считывания, в том числе полипротеин и части полипротеина. Такими протеинами являются, в частности, VP2, VP3, VP4. Сюда входят также все их комбинации или модификации. Эти модификации представляют собой, например, включение сайта расщепления,
- для IBV : антигена E2,
- для Eimeria : естественный поверхностный антиген TA4 и поверхностный антиген, у которого последовательность сайта протеолитического расщепления была модифицирована,
- для CAV : протеин P50.
- для IBDV : полностью или частично открытые фазы для считывания, в том числе полипротеин и части полипротеина. Такими протеинами являются, в частности, VP2, VP3, VP4. Сюда входят также все их комбинации или модификации. Эти модификации представляют собой, например, включение сайта расщепления,
- для IBV : антигена E2,
- для Eimeria : естественный поверхностный антиген TA4 и поверхностный антиген, у которого последовательность сайта протеолитического расщепления была модифицирована,
- для CAV : протеин P50.
Превосходные результаты были получены с IBDV, причем гетерологичным протеином является часть полипротеина, содержащая аминокислоты с 1 по 493, за которыми следуют аминокислоты с 1010 по 1012, причем в эту часть включен протеин VP2, как изображено на фиг. 9.
Последовательности ДНК могут кодировать протеин полностью или же фрагменты протеина и могут вызывать у животных соответствующую ответную реакцию иммунитета. Другие молекулы, отличные от антигенов, также могут приниматься во внимание, в том числе факторы роста и иммуномодуляторы, такие как интерлейкины. Целью настоящего изобретения является также производство in vivo (в домашней птице) фактора, участвующего в метаболизме животного, такого как, например, гормон роста или фактор, индуцирующий последний. Настоящее изобретение относится также к получению протеинов или пептидов путем культивирования клеток in vitro или in vivo у животных. В зависимости от введенного гетерологичного протеина он может выступать, в частности, в качестве фермента, в качестве компонента пищи или в области здоровья людей или животных в качестве фармацевтического продукта для медицинского или ветеринарного применения.
С другой стороны, могут генерироваться мультиплетные рекомбинантные вирусы, несущие несколько гетерологичных генов, т.е. путем клонирования нескольких генов в одном и том же геноме, в одном и том же сайте или в различных областях или сайтах. Полифункциональный продукт также может быть создан в результате комбинации различных рекомбинантных вирусов.
Мишенью животного происхождения для вируса Avipox по изобретению являются птицы, в частности домашние птицы. Рекомбинантный вирус может также применяться для объектов, отличных от птиц.
Вакцина по изобретению может вводится в виде различных форм, известных специалисту. Обычно вакцина вводится оральным путем с пищей или с водой для питья, интраназальным путем, в результате подкожной инъекции, в виде аэрозоля, в результате внутримышечной инъекции или путем прокалывания крыла в соответствии с методом, называемым "wing web". Предпочтительно вакцина вводится путем прокалывания перепонки крыла в соответствии с методом, называемым "wing web", в результате внутримышечной инъекции или в результате подкожной инъекции.
Рецептура вакцины по изобретению составляется известным специалисту способом. Обычно вакцинальная композиция содержит стабилизаторы, соответствующие способу введения вакцины. Вакцина может храниться в лиофилизированной форме.
Настоящее изобретение иллюстрируется последующими примерами.
Пример 1. Очистка вируса CNP и его ДНК.
В качестве вируса Fowlpox используют вакцинальный штамм, поставляемый в торговлю фирмой Сольвей под маркой POULVAC CHICK-N-POX, CHICK-N-POX, CHICK-N-POX TC, POULVAC CHICK-N-POX TC (CNP) в виде живущей ослабленной вакцины. Первоначальная колония происходит из почвенного штамма, пропущенного несколько раз через яйца и адаптированного к клеткам in vitro в результате 2 прохождений через CEF (фибробласты куриного эмбриона) и 5 прохождений через клеточное потомство перепелки QT35, описанное Chno (1981). Клеточное потомство перепелки QT35 получено у Dr.Moscovici (6816, Нортвест, 18-я авеню, Гайнесвиль, Флорида 32605, Соединенные штаты), который его выделил и распределяет его.
CNR культивируется на клеточном потомстве QT35, среда для роста которого состоит из E199 (Gibco 500 мл), F12 (Gibco 500 мл), LAH (Gibco, гидролизат лактальбумина, 25 мл), FCS (Gibco, Foetal Calf Serum 25 мл) и фруктозы (5 мл раствора с концентрацией 200 г/л), инкубация при температуре 38oC, 3% CO2. Обычная мультиплетность заражения (MOI) составляет 0,01 вируса на одну клетку, причем клетки на 80% находятся в слиянии.
Вирусная колония очищалась следующим образом: клетки, зараженные вирусом Fowlpox CNP и извлеченные из фосфатного буферного раствора PBS (Phosphate Buffered Saline, Gibco) центрифугируются с ускорением 6000 g (15 минут). Осадок после центрифугирования снова переводится в суспензию в буферном растворе Трис (pH 9,1 мМ), обрабатывается трипсином (конечная концентрация трипсина 0,25 мг/мл; Gibco) и ультразвуком. Этот продукт помещается в среду с 36% сахарозы (вес/объем) и центрифугируется в течение 45 минут с ускорением 30000 g. Остаток после центрифугирования извлекается в буферном растворе Трис с концентрацией 1 мМ, pH = 9,0. Вирусы центрифугируются последний раз в течение 30 минут с ускорением 40000 g. Осадок после центрифугирования извлекается в буферном растворе для разложения лизинами : 10 мМ Трис-HCl, pH = 8,0, 10 мМ ЭДТА, 1% SDS (додецилсульфат натрия), 500 мкг/мл протеиназы K (Boehringer) 0,1 мг/мл RN-азы (Boehringer), и инкубируется в течение 2 часов при температуре 37oC. Экстрагированная в феноле ДНК осаждается в этаноле. Было очищено порядка 20 мкг ДНК, исходя из 40 зараженных чашек с площадью 150 см2.
Пример 2. Конструирование геномного банка EcoRI и геномного банка BamHI для CNP
Используемые генетические методы описания у Maniatis et al., 1982. Ферменты рестрикции, полимеразы, лигазы и фосфатазы были поставлены фирмами Pharmacia, Boehringer et Biolabs. Синтетические ДНК были поставлены фирмой Eurogentec.
Используемые генетические методы описания у Maniatis et al., 1982. Ферменты рестрикции, полимеразы, лигазы и фосфатазы были поставлены фирмами Pharmacia, Boehringer et Biolabs. Синтетические ДНК были поставлены фирмой Eurogentec.
Фрагменты рестрикции вирусной ДНК посредством EcoRI или BamHI были связаны в векторе PUC18, описанном у Messing (1983), и введены в бактерию E. coli MC1061 (araD139, (ara, Leu) 7697, LacX74, galU, galK, hsdR, strA, продаваемые фирмой Фармация). Оба геномных банка хранятся при температуре -70oC в глицерине в виде двух трансформированных клеточных суспензий. Восемьдесят % плазмид содержат одно включение. Семнадцать фрагментов BamHI и 45 фрагментов EcoRI были дифференцированы на основе их размера и их модели рестрикции посредством Bg12 или HinFI. Включения имеют размеры от 0,5 до 15 ко; сумма охарактеризованных таким образом включений BamHI составляет 82 ко и 210 ко для фрагментов EcoRI. Размер генома Pox у птиц близок к 300 ко (Coupar et al. , 1990). Выделенные фрагменты составляют тем самым 25% для BamHI и 70% для EcoRI от всего генома.
Пример 3. Клонирование фрагментов, несущих TIR
Обратные терминальные повторения (TIR) представляют собой две идентичные последовательности, находящиеся на концах генома вирусов Pox и имеющие противоположное направление. Последовательность величиной более 17 ко одного конца генома штамма HP вируса Fowlpox была опубликована (Campbell et al., 1989 и Tomley et al., 1988). Она содержит примерно 10 ко повторяемой последовательности и 7,0 ко ее смежной последовательности.
Обратные терминальные повторения (TIR) представляют собой две идентичные последовательности, находящиеся на концах генома вирусов Pox и имеющие противоположное направление. Последовательность величиной более 17 ко одного конца генома штамма HP вируса Fowlpox была опубликована (Campbell et al., 1989 и Tomley et al., 1988). Она содержит примерно 10 ко повторяемой последовательности и 7,0 ко ее смежной последовательности.
Осуществляют клонирование фрагментов EcoRI для TIR. Повторяемая последовательность содержит сайт EcoRI. Как это показывает фиг. 2, клонируются два фрагмента EcoRI: каждый несет одну часть TIR и одну единичную смежную последовательность. Единичная последовательность ограничена наиболее близким сайтом EcoRI из TIR. Эти два фрагмента были выделены благодаря олигонуклеотиду, комплементарному по отношению к последовательности, расположенной в повторяемой части. Первый фрагмент имеет размер 6,2 ко и будет называться (по договоренности) TIR-L. Второй имеет размер 9,0 ко и будет называться (по договоренности) TIR-R. Последовательность фрагмента EcoRI TIR- для CNP является идентичной с опубликованной последовательностью.
Место соединения между TIR и единичной последовательностью, идентифицированной при сравнении последовательностей TIR-L и TIR-R, находится на нуклеотиде 4007, причем сайт BamHI последовательности, опубликованной у Tomley et al., (1988), принимается за нуклеотид номер 1. Место соединения находится в открытой фазе для считывания, называемой ORF 3 указанными авторами.
Пример 4. Создание в результате направленного мутагенеза сайтов BamHI в TIR
Открытые фазы для считывания (ORF) были идентифицированы в результате анализа нуклеотидных последовательностей TIR. В частности, OFR 1 находится между нуклеотидами 416 и 1674, OFR 2 находится между нуклеотидами 2166 и 2671 и, наконец, ORF 3 находится между нуклеотидами 3606 и 4055 и кодируется на комплементарной цепи. Мы принимаем в качестве нуклеотида N 1 первый нуклеотид G сайта BamHI из TIR. Эти ORF ограничивают две больших некодирующих внутригенных последовательности, называемых область β1, между ORF 1 и ORF 2, с одной стороны, и область β2, между ORF 2 и ORF 3, с другой стороны. Именно эти две внутригенные области выбираются в качестве областей для включения.
Открытые фазы для считывания (ORF) были идентифицированы в результате анализа нуклеотидных последовательностей TIR. В частности, OFR 1 находится между нуклеотидами 416 и 1674, OFR 2 находится между нуклеотидами 2166 и 2671 и, наконец, ORF 3 находится между нуклеотидами 3606 и 4055 и кодируется на комплементарной цепи. Мы принимаем в качестве нуклеотида N 1 первый нуклеотид G сайта BamHI из TIR. Эти ORF ограничивают две больших некодирующих внутригенных последовательности, называемых область β1, между ORF 1 и ORF 2, с одной стороны, и область β2, между ORF 2 и ORF 3, с другой стороны. Именно эти две внутригенные области выбираются в качестве областей для включения.
Единичный сайт клонирования был введен в результате направленного мутагенеза (оборудование для мутагенеза фирмы БиоРад) в области β1 и β2. Сайт BamHI был выбран в качестве сайта клонирования, потому что он совместим с другими сайтами рестрикции, в том числе Bg11 и Bg12. Положение сайта клонирования выбиралось примерно в середине каждой внутригенной области, чтобы избежать всякого риска отделить сигналы транскрипции от их соответствующих генов, т.е.:
- в области β1 : сайт B1 представляет собой последовательность 5' GATC 3' на нуклеотиде 1842, трансформированную в BamHI GGATCC путем включения G в 5' и C в 3';
- в области β2 : сайт B2 представляет собой последовательность 5' GGATT 3' на нуклеотиде 3062, трансформированную в BamHI путем мутации второго T в CC.
- в области β1 : сайт B1 представляет собой последовательность 5' GATC 3' на нуклеотиде 1842, трансформированную в BamHI GGATCC путем включения G в 5' и C в 3';
- в области β2 : сайт B2 представляет собой последовательность 5' GGATT 3' на нуклеотиде 3062, трансформированную в BamHI путем мутации второго T в CC.
Два сайта BamHI находятся в плазмиде, которая несет фрагмент TIR-L (пример 3). Один сайт происходит из вектора pUC18. Второй сайт происходит из TIR и находится на 71 нуклеотид ниже сайта EcoRI, выбранного для клонирования (Campbell et al., 1989, фиг. 2). Эти два сайта BamHI были подвергнуты делеции из плазмиды, несущей TIR-L, путем рестрикции BamHI с последующим заполнением на полимеразе Klenow и связыванием. Плазмида, которая при этом получается, представляет собой pTIRI.
Для генерирования сайта BamHI в B1 фрагмент Hind П величиной 0,9 ко плазмиды pTIRI был клонирован в векторе pBSPIus, поставляемом в торговлю фирмой Стратаген. Праймер мутагенеза представлял собой:
5' TTTCGAAAGACTTTGGAT
CCGTAGTATAATATTATA 3'
Подчеркнутые нуклеотиды, т. е. GGATCC, представляют собой последовательность, указываемую сайтом BamHI.
5' TTTCGAAAGACTTTGGAT
CCGTAGTATAATATTATA 3'
Подчеркнутые нуклеотиды, т. е. GGATCC, представляют собой последовательность, указываемую сайтом BamHI.
Для генерирования сайта BamHI в B2 фрагмент Xbal величиной 1,7 ко плазмиды pTIRI был клонирован в PBSRI us. Прамер представлял собой:
5' TATATCACGGGATCCA
AAAGGTTATTAGTAGTC 3'
Подчеркнутые нуклеотиды, т. е. GGATCC, представляют собой последовательность, узнаваемую сайтом BamHI.
5' TATATCACGGGATCCA
AAAGGTTATTAGTAGTC 3'
Подчеркнутые нуклеотиды, т. е. GGATCC, представляют собой последовательность, узнаваемую сайтом BamHI.
Повторное включение каждого мутированного фрагмента в pTIRI является результатом связываний:
- для B1: Hind 3 - Scal плазмиды pTIRI (1491 по) + Scal-Aat 2 из pBSPIus после мутагенеза (485 по) + Aat 2 - EcoRI из pTIRI (4220 по) + EcoRI-Hind 3 из плазмиды pTIRI (2635 по),
- для B2: Xhol-SpII из плазмиды pTIRI (8512 по) + SpII-Xhol из pBSPIus после мутагенеза (318 по).
- для B1: Hind 3 - Scal плазмиды pTIRI (1491 по) + Scal-Aat 2 из pBSPIus после мутагенеза (485 по) + Aat 2 - EcoRI из pTIRI (4220 по) + EcoRI-Hind 3 из плазмиды pTIRI (2635 по),
- для B2: Xhol-SpII из плазмиды pTIRI (8512 по) + SpII-Xhol из pBSPIus после мутагенеза (318 по).
Эти два связывания генерировали векторы pTIRBI и PTIRB2. Их карты рестрикции приведены на фиг. 3 и 4.
Исходя из плазмиды pTIRI, была генерирована плазмида pTIRBID в результате делеции своего фрагмента EcoRI-Hpal величиной 2657 по.
Пример 5. Клонирование промоторов P11 и P7.5 из Vaccinia.
P11 и P7.5 являются известными промоторами для Vaccinia. P11 представляет собой промотор гена, кодирующего протеин P11, который подвергается транскрипции в ходе поздней фазы вирусного заражения. P7.5 представляет собой промотор гена, кодирующего протеин P7.5, который подвергается транскрипции одновременно в ходе ближайшей и поздней фаз.
Конструирование векторов с единичными сайтами Bg12 и Bc11.
Два вектора клонирования, содержащие единичные сайты Bg12, Bc11 и BamHI, были сконструированы, чтобы обеспечить последовательные клонирования кассет, совместимых с BamHI. Последовательности сайтов Bg12 и Bc11 были введены в сайт BamHI из pBSPIus путем клонирования следующей синтезированной ДНК:
Векторами являются pBSLK1 и pBSLK2. Линкерами являются в направлении:
pBSLK1... Ava/Smal-BamHI-Bc11-Bg12-Xbal...
Векторами являются pBSLK1 и pBSLK2. Линкерами являются в направлении:
pBSLK1... Ava/Smal-BamHI-Bc11-Bg12-Xbal...
pBSLK2... Ava/Smal-Bg12-Bc11-BamHI-Xbal...
Клонирование промотора P7.5
Фрагмент Bc11-BamHI длиной 143 по плазмиды pGS20 содержит промотирующую последовательность p7.5 (Mackett et al. , 1984). Эта последовательность приводится ниже (Venkatesan et al., 1981, Cochran et al., 1985). Запаздывающий и ближайший промоторы подчеркнуты. Последнее основание у BamHI отстоит на 10 по от ATG, инициирующего ген.
Фрагмент Bc11-BamHI длиной 143 по плазмиды pGS20 содержит промотирующую последовательность p7.5 (Mackett et al. , 1984). Эта последовательность приводится ниже (Venkatesan et al., 1981, Cochran et al., 1985). Запаздывающий и ближайший промоторы подчеркнуты. Последнее основание у BamHI отстоит на 10 по от ATG, инициирующего ген.
Фрагмент Bc11-BamHI был клонирован в сайтах Bc11 и BamHI плазмид pBSLK1 и pBSLK2, генерирующих соответственно плазмиды p1P65 и p2P75. Чтобы разрешить переваривание Bc11, плазмиды pBSLK1 и pBSLK2 экстрагируются из штамма JM110, который доступен в АТСС (American Type Culture Collection) под шифром АТСС 47013.
Клонирование промотора P11
Последовательность промотора P11 была клонирована в виде синтезированной ДНК, исходя из данных о последовательностях Bertholet et al., (1985), Hanggi et al. , (1986) показали, что фрагмент из 30 нуклеотидов выше первого нуклеотида ATNm содержит промотор.
Последовательность промотора P11 была клонирована в виде синтезированной ДНК, исходя из данных о последовательностях Bertholet et al., (1985), Hanggi et al. , (1986) показали, что фрагмент из 30 нуклеотидов выше первого нуклеотида ATNm содержит промотор.
Синтезированная ДНК представляет собой 40-мер, несущий сайт Bg12 и сайт BamHI на своих концах. Эта ДНК была клонирована в pBSLK1, чтобы генерировать p1P11, и в pBSLK2, чтобы генерировать p2P11. Фрагмент Bg12-BamHI из p2P11 был затем клонирован в сайтах Xho2-BamHI из pACYC184. pACYC184 представляет собой вектор, описанный у Chang et Cohen (1978). Связывание между Xho2 (GGATCT) и Bg12 (AGATCT) восстанавливает Bg12.
Последовательность синтетической ДНК, несущей p11, представляет собой:
Пример 6. Конструирование кассеты, несущей ген LacZ, совместимый с сайтом рестрикции BamHI.
Пример 6. Конструирование кассеты, несущей ген LacZ, совместимый с сайтом рестрикции BamHI.
Экспрессия гена LacZ даст возможность для просеивания рекомбинантных вирусов.
Кассета Bg12-BamHI, несущая ген LacZ, была преобразована в результате направленного мутагенеза. Эта кассета была клонирована в плазмиде pBSPIus (стратаген), подвергнутой делеции фрагмента LacZα, причем последнее для того, чтобы избежать рекомбинации между двумя гомологичными последовательностями: одной из LacZ, а другой на LacZα. Эта плазмида представляет собой pASMut LacZ1. Последовательность на концах гена LacZ после мутагенеза приводится ниже. Номера соответствуют номерам аминокислот природного протеина.
Кассета LacZ, Bg12-BamHI, из pBSMut LacZ 1 была клонирована в сайтах Bg12-BamHI из p2P75 и из p2P11 для генерирования соответственно p75 Lac и P11 Lac. Получают экспрессию гена LacZ в E.coli, когда он находится позади промоторов P7.5 или P11. Трансформированные колонии имеют голубой цвет на среде, содержащей X-Gal (хромогенный субстрат: 5-бром-4-хлор-3-индолил-β-D-галактопиранозид), который вызывает голубое окрашивание под действием β-галактозидазы. Этот тест доказывает, что ген является функциональным. Кассета P11 Lac в виде фрагмента Bg12-Hind 3 плазмиды P11 Lac также была клонирована в сайтах Xho2 и Hind3 плазмиды pACYC184, генерирующей pACP11 Lac. Карта p11 Lac приведена на фиг. 5.
Пример 8. Клонирование кассет p75 Lac и P11 Lac в плазмидах pTIRB1 и pTIRB2
Фрагмент Bg12-BamHI из p11 Lac (или pACP11 Lac) и фрагмент Bg12-BamHI из p75 Lac несут кассету "промотор P7.5 или P11, за которым следует ген LacZ" (пример 7). Эти фрагменты были клонированы в сайтах BamHI плазмиды pTIRB1 и плазмиды pTIRB2 (пример 4) в двух возможных направлениях при помощи фетотипа LacZ для просеивания. Были выделены шесть плазмид из восьми возможных рекомбинант. Их нумерация приводится ниже. Примем, что ориентация "+" - это та, которая размещает транскрипцию гена LacZ в направлении от ORF 1 к ORF 2 или от ORF 2 к ORF 3, а ориентация "-" - это та, которая соответствует противоположной ориентации. Названия плазмид "P75 Lac" и "P11 Lac" означают, что эти кассеты имеют ориентацию "+", тогда как "LacP75" и "LacP11" означают, что эти кассеты имеют ориентацию "-". В качестве примера на фиг. 6 приводится карта плазмиды pTIRBIP75 Lac (табл. 1).
Фрагмент Bg12-BamHI из p11 Lac (или pACP11 Lac) и фрагмент Bg12-BamHI из p75 Lac несут кассету "промотор P7.5 или P11, за которым следует ген LacZ" (пример 7). Эти фрагменты были клонированы в сайтах BamHI плазмиды pTIRB1 и плазмиды pTIRB2 (пример 4) в двух возможных направлениях при помощи фетотипа LacZ для просеивания. Были выделены шесть плазмид из восьми возможных рекомбинант. Их нумерация приводится ниже. Примем, что ориентация "+" - это та, которая размещает транскрипцию гена LacZ в направлении от ORF 1 к ORF 2 или от ORF 2 к ORF 3, а ориентация "-" - это та, которая соответствует противоположной ориентации. Названия плазмид "P75 Lac" и "P11 Lac" означают, что эти кассеты имеют ориентацию "+", тогда как "LacP75" и "LacP11" означают, что эти кассеты имеют ориентацию "-". В качестве примера на фиг. 6 приводится карта плазмиды pTIRBIP75 Lac (табл. 1).
Примечание к табл. 1.
N - номер, данный плазмиде
Пром - промотор.
Пром - промотор.
Сайт B1 или B2 - сайт клонирования BamHI, выделенный в TIR.
Ор - ориентация. Ориентация является "+", когда направление транскрипции LacZ совпадает с направлением от ORF 1 к ORF 2 или от ORF 2 к ORF 3. Ориентация "-" является противоположной.
Название - название плазмиды переноса.
Пример 9. Выяснение условий переноса и просеивания и выделения рекомбинантных вирусов CNP/LacZ
Принцип конструирования рекомбинантного вируса CNP представлен на фиг. 1. Протокол опыта переноса является следующим:
В день Д = 1 : в пересчете на чашку с площадью 25 см2 инокулируют 2,5 • 106 клеток QT35 в среде роста (состав описан в примере 1).
Принцип конструирования рекомбинантного вируса CNP представлен на фиг. 1. Протокол опыта переноса является следующим:
В день Д = 1 : в пересчете на чашку с площадью 25 см2 инокулируют 2,5 • 106 клеток QT35 в среде роста (состав описан в примере 1).
В день Д = 2 осуществляют перенос.
Вирусы: 1 мл лиофилизированной вакцины CNP в пробирке регидратируется при помощи 3 мл стерильной воды Милли-Q и хранится при температуре -70oC. Эта колония вирусов размораживается и подвергается мягкой ультразвуковой обработке в течение 1 минуты. Затем разбавляют в среде культивирования, обозначаемой E119-F12, которая соответствует среде E119, описанной в примере 1, но без LAH, сыворотки и фруктозы, чтобы достигнуть мультиплетности заражения величиной 0,05 вирусов на одну клетку в 2 мл среды. Затем заменяют среду для культивирования на вирусную суспензию и инкубируют культуру 2 часа при температуре 38oC.
Плазмиды: смешивают 20 мкг плазмид с 400 мкл воды и 100 мкл 1,25 М CaCl2, прибавляют по капле 500 мкл буферного раствора BBS /BES Buffer Saline/ с удвоенной концентрацией /50 мМ BES (Sigma), 280 мМ NaCl, 1,5 мМ Na2HPO4, pH = 7,0/ и инкубируют в интервале от 15 до 30 минут при температуре 25oC. Затем 1 мл препарата плазмид наносится на клетки после удаления среды. Потом инкубируют в течение 30 минут при температуре 38oC. Затем прибавляют 4 мл среды без LAH, но с добавкой 5% FCS и 15 мМ раствора Гепеса (Sigma) при значении pH = 7,2. Снова инкубируют в течение 4 часов при температуре 38oC. Затем заменяют среду на 5 мл среды роста, обозначаемой E199 (состав описан в примере 1).
В день Д = 0: собирают выращенные вирусы, как описано в примере 1.
Просеивание основывается на получении β-галактозидазы, выявляемом в результате опыта на чашке Петри "plaque assay". Протокол опыта для одной чашки Петри размером 6 см является следующим.
В день Д = 1 : инокулируют 2,5 • 106 клеток в 5 мл среды для роста.
В день Д = 2 : заражают эту культуру при помощи 1 мл вирусов с разбавлениями 1: 10 и 1:100, инкубируют в течение 4 часов при температуре 38oC, потом прибавляют 4 мл среды для роста (состав описан в примере 1).
В день Д = 3 : заменяют среду на 5 мл слоя агарозы, образованного 1 объемом 2%-й агарозы (Sea Plaque Agarose (FMC), растворенной в воде) и 1 объемом следующей смеси: 9 мл среды 199 2X (Gibco), 0,5 мл LAH (Gibco) и 0,1 мл раствора Гепеса (pH = 7,2, конечная концентрация 15 мМ) и 1,0 мл FCS. Растаявшая агароза и смесь выдерживаются при температуре 38oC перед смешением. Дают агарозе образовать студень в течение 30 минут при температуре окружающей среды, потом инкубируют при температуре 38oC.
В день Д = 6 : покрывают культуру посредством 2 мл 1%-й агарозы в PBS (Gibco), содержащей 0,3 мл/мл X-Gal (5-бром-4-хлор-3-индолил-β-D-галактопиранозид, Boehringer). X-Gal растворен с концентрацией 30 мг/мл в ДМСО (диметилсульфоксид, Флука).
В день Д = 7 : подсчитывают число и долю голубых областей по отношению к числу неокрашенных областей. Потом отбирают индивидуально 5 областей при помощи пипетки Пастера. Хранят вирусы в 500 мкл среды для роста при температуре -70oC.
Частота рекомбинации для каждой плазмиды представлена в приведенной табл. 2. Рекомбинантные вирусы обозначают символом "V" с последующим номером плазмиды переноса (таким, который определен в примере 8). Процентная доля рекомбинант варьируется от 0,1% до 0,5%, что соответствует литературным данным для Pox. Изображение рекомбинантных геномов схематично дается на фиг. 7.
Примечание к табл. 2.
Голубое/общее - число голубых областей/общее число областей.
% - процентная доля голубых областей.
Пример 10. Очистка рекомбинантных вирусов CNP/LacZ
Клон получается в результате последовательной очистки одной голубой области на чашке Петри (как описано в примере 9). В принципе, когда все области являются голубыми, то все вирусы выражают ген LacZ и больше не загрязнены диким вирусом. От трех до четырех переходов необходимо для достижения такой однородности. Так, например, эволюция доли голубых областей в ходе переходов была следующей (табл. 3).
Клон получается в результате последовательной очистки одной голубой области на чашке Петри (как описано в примере 9). В принципе, когда все области являются голубыми, то все вирусы выражают ген LacZ и больше не загрязнены диким вирусом. От трех до четырех переходов необходимо для достижения такой однородности. Так, например, эволюция доли голубых областей в ходе переходов была следующей (табл. 3).
Примечание к табл. 3.
Голубое/общее - число голубых областей/общее число областей.
% - процентная доля голубых областей.
На фотографии, полученной методом электронной микроскопии, среза клеток QT35, зараженных рекомбинантным вирусом V8, отчетливо видны типичные структуры вирусов Pox, в частности внутренняя структура, которая имеет форму собачьей кости.
Пример 11. Получение большого количества каждой рекомбинанты
Шесть рекомбинант были увеличены в результате трех последовательных переходов на чашках. Титр второго перехода варьируется от 4•105 до 1,1•107 TCID50 (Tissue Culture Infections Dose) на мл. Только вирус V10 имеет титр, меньший чем 104. Другие рекомбинанты размножаются фактически так же хорошо, как и дикий вирус, для которого титры обычно находятся в интервале от 105 до 107.
Шесть рекомбинант были увеличены в результате трех последовательных переходов на чашках. Титр второго перехода варьируется от 4•105 до 1,1•107 TCID50 (Tissue Culture Infections Dose) на мл. Только вирус V10 имеет титр, меньший чем 104. Другие рекомбинанты размножаются фактически так же хорошо, как и дикий вирус, для которого титры обычно находятся в интервале от 105 до 107.
Пример 12. Анализ на "plaque assay" стабильности гена LacZ, внедренного в TIR
Ген LacZ, внедренный в вирусный геном, может быть стабильным или нестабильным в зависимости от типа рекомбинации, которая имела место (это объясняется у Shuman et al., (1989). Так, если имеют место две рекомбинации с двух сторон от включения, то внедренный ген LacZ является стабильным. Например, простая рекомбинация приводит к включению всей плазмиды переноса и, следовательно, гена LacZ. Этот вирус дает голубые области. Однако вирусный геном несет гомологичные последовательности прямого направления, рекомбинация которых может привести к потере включения и к появлению неокрашенных областей.
Ген LacZ, внедренный в вирусный геном, может быть стабильным или нестабильным в зависимости от типа рекомбинации, которая имела место (это объясняется у Shuman et al., (1989). Так, если имеют место две рекомбинации с двух сторон от включения, то внедренный ген LacZ является стабильным. Например, простая рекомбинация приводит к включению всей плазмиды переноса и, следовательно, гена LacZ. Этот вирус дает голубые области. Однако вирусный геном несет гомологичные последовательности прямого направления, рекомбинация которых может привести к потере включения и к появлению неокрашенных областей.
С другой стороны, у вирусов Pox изменение в последовательности одного TIR может быть перенесено к другому TIR в ходе циклов заражения и репликации вируса. Двойная рекомбинация может внедрить LacZ в TIR-L, тогда область этого вируса становится голубой. В ходе последующих заражений рекомбинация между этим рекомбинантным TIR-L и диким TIR-R генерирует смешанную вирусную популяцию TIR-L/LacZ, TIR-L/LacZ-TIR-R/LacZ и WT /дикий/. Другие рекомбинации могут, кроме того, генерировать последний возможный тип, который представляет собой TIR-R/LacZ. Следовательно, голубая область может содержать три типа вирусов: вирусы, которые потеряли ген LacZ, вирусы, которые несут только одну копию гена LacZ, и вирусы, которые несут две копии гена LacZ.
Проверяют однородность вирусного препарата на "plaque assay" после нескольких последовательных заражений в жидкой среде (пример 9). На "plague assay" 3-го перехода вирусов V3, V4, V5, V8, V9 и V10 появились следующие доли голубых областей (табл. 4).
Примечание к табл. 4.
П3 и П6 - 3-й и 6-й переход вируса.
Голубое/общее - число голубых областей/общее число областей.
% - процентная доля голубых областей.
- - не проводился
Таким образом, препараты рекомбинантных вирусов V8 и V9 являются однородными. Рекомбинанта V8 является стабильной до 6-го перехода. Например, препараты вирусов V3, V4 и V5 не являются однородными. Они содержат долю от 5 до 20% вируса дикого типа. Эта доля имеет еще большее значение для вируса V10.
Таким образом, препараты рекомбинантных вирусов V8 и V9 являются однородными. Рекомбинанта V8 является стабильной до 6-го перехода. Например, препараты вирусов V3, V4 и V5 не являются однородными. Они содержат долю от 5 до 20% вируса дикого типа. Эта доля имеет еще большее значение для вируса V10.
Пример 13. Анализ геномов CNP/LacZ методом Southern blot.
Проверяют однородность вирусного препарата методом Southern blot (Maniatis et al., 1982). Фрагменты рестрикции геномов рекомбинантных вирусов и нерекомбинантных вирусов различаются по их размеру.
Протокол опыта для получения вирусной ДНК является следующим:
В день Д = 1: в чашке площадью 25 см2, содержащей 5 мл питательной среды, инокулируют 2 • 106 клеток QT35.
В день Д = 1: в чашке площадью 25 см2, содержащей 5 мл питательной среды, инокулируют 2 • 106 клеток QT35.
В день Д = 2: заражают с мультиплетностью инфекции величиной 0,01.
В день Д = 5: отделяют клетки при помощи скребка (Костар). Центрифугируют в течение 10 минут с ускорением 6000 g. К остатку после центрифугирования прибавляют 500 мкл буферного раствора для разложения лизинами, который состоит из 10 мМ Трис-HCl, pH = 8,0, 10 мМ ЭДТА, 0,1% SDS, 0,1 мг/мл RN-азы, 0,1 мг/мл протеиназы К. Переносят клетки в пробирку Эппендорфа. Затем перемешивают полученную суспензию и инкубируют в течение 1 часа при температуре 50oC. Потом экстрагируют водную фазу 3 раза в феноле с хлороформом. Осаждают ДНК при помощи 0,3 М ацетата натрия и 2 объемов этанола при температуре -20oC в течение 15 минут. Центрифугируют в течение 10 минут с ускорением 18300 g. Осадок после центрифугирования переводят в суспензию посредством 500 мкл воды. Порядка 5 мкл этой суспензии полной ДНК достаточно для метода.
Для сайта B1
Геномы перевариваются EcoRI. Зонд представляет собой плазмиду pTIRB1 LacP75, переваренную посредством EcoRI. Этот зонд различает рекомбинантные и родственные фрагменты TIR-L и TIR-R. Фрагменты имеют размеры 9,3 и 6,2 ко для дикого вируса, 7,4, 5,1 (дублет) и 4,4 для вируса V3, 7,4, 4,9 и 4,4 ко для вируса V8 и, наконец, для вируса V9 - 10,4, 7,7 и 2,0 (дублет) ко. Вирусы V8 и V9 приобрели две копии гена LacZ (по одной в каждом TIR) и не содержат фрагмент TIR родственного типа. Напротив, в случае вируса V3 последнее имеет место.
Геномы перевариваются EcoRI. Зонд представляет собой плазмиду pTIRB1 LacP75, переваренную посредством EcoRI. Этот зонд различает рекомбинантные и родственные фрагменты TIR-L и TIR-R. Фрагменты имеют размеры 9,3 и 6,2 ко для дикого вируса, 7,4, 5,1 (дублет) и 4,4 для вируса V3, 7,4, 4,9 и 4,4 ко для вируса V8 и, наконец, для вируса V9 - 10,4, 7,7 и 2,0 (дублет) ко. Вирусы V8 и V9 приобрели две копии гена LacZ (по одной в каждом TIR) и не содержат фрагмент TIR родственного типа. Напротив, в случае вируса V3 последнее имеет место.
Поскольку в каждом TIR можно клонировать одну копию гена LacZ, то можно сделать вывод, что сайт включения B1 является несущественным для развития вируса и для его роста на клетках при культивировании. С другой стороны, поскольку ген LacZ имеет размер 3 ко приблизительно, то выделение этих двойных рекомбинант доказывает, что можно внедрять 6 ко на геном вируса CNP.
Для сайта B2
Результаты по методу Southern показывают присутствие рекомбинантных фрагментов TIR-L и TIR-R, но также и родственных фрагментов в препаратах вирусов V4, V5 и V10. Эти три препарата, следовательно, не являются однородными.
Результаты по методу Southern показывают присутствие рекомбинантных фрагментов TIR-L и TIR-R, но также и родственных фрагментов в препаратах вирусов V4, V5 и V10. Эти три препарата, следовательно, не являются однородными.
Пример 14. Альтернатива для выделения двойной рекомбинанты в сайте включения B1
Эволюция рекомбинаций в TIR предсказывает появление стабильной двойной рекомбинанты в потомстве вируса, несущего дикое TIR и рекомбинантное TIR. Вирусные области повторно выделяются из голубой области в чашке Петри "plaque assay" либо в результате нового опыта на "plaque assay", либо на пластинках для титрования с 96 лунками. Можно анализировать геном из каждой новой области либо методом Southern либо методом ПЦР. Эти различные возможности были проработаны.
Эволюция рекомбинаций в TIR предсказывает появление стабильной двойной рекомбинанты в потомстве вируса, несущего дикое TIR и рекомбинантное TIR. Вирусные области повторно выделяются из голубой области в чашке Петри "plaque assay" либо в результате нового опыта на "plaque assay", либо на пластинках для титрования с 96 лунками. Можно анализировать геном из каждой новой области либо методом Southern либо методом ПЦР. Эти различные возможности были проработаны.
Метод Southern, осуществленный на геномах вирусов из 10 различных голубых областей, полученных на "plaque assay" для 3-го перехода вируса V3, показал, что в 10 областях препарат является однородным и содержит включение гена LacZ в каждом из TIR.
В случае пластинки для титрования разбавление является таким, что ноль или одна вирусная область приходится на одну лунку. Это оптимальное разбавление оценивается методом предварительного титрования. Хорошие результаты получаются при заражении пластики для титрования (200 мкл на лунку, 20 мл на пластинку) при помощи 50 мкл вирусной суспензии, взятой из чашки Петри "plaque assay" после извлечения в 1 мл. Когда области хорошо видны, то отмечаются лунки, которые содержат одну область. После замораживания с последующим размораживанием отбирают пробы по 100 мкл среды на одну лунку.
В случае метода ПЦР полная ДНК быстро экстрагируется в следующих условиях: центрифугируют в течение 10 минут с ускорением 1000 g, извлекают остаток после центрифугирования в 200 мкл буферного раствора для разложения лизинами (10 мМ Трис-HCl, pH = 8,0, 10 мМ ЭДТА, 0,1%, SDS) с добавлением RN-азы (0,1 мг/мл) и протеиназы K (0,1 мг/мл) и инкубируют полученную таким образом смесь в течение 1 часа при температуре 50oC. Потом экстрагируют водную фазу три раза в смеси фенол/хлороформ. Из этой водной фазы осаждают ДНК этанолом. Извлекают полученный осадок в 50 мкл воды. Используют 10 мкл этой суспензии для метода ПЦР. Условия, используемые для метода ПЦР, являются такими, которые рекомендуются фирмой Перкин Эльмер (Gene Amp DNA Amplification Reagent kit). Увеличенные фрагменты анализируются на геле агарозы.
Праймеры 5168 и 5169 гибридизируются с двух сторон от сайта включения B1, соответственно ниже и выше этого сайта. Их последовательность является следующей:
Фрагмент величиной 220 по увеличивается на диких TIR, а фрагмент величиной более 3 ко - для рекомбинантного TIR, содержащего ген LacZ. Для выявления гена LacZ вторая амплификация использует праймер 5168, расположенный ниже сайта B1, и праймер 3254, расположенный в гене LacZ. Увеличивается фрагмент величиной 674 по. Этот разумный выбор праймеров позволяет, следовательно, различать рекомбинантные TIR и нерекомбинантные TIR. Вирусная суспензия считается однородной, двойной рекомбинантной, если фрагмент WT (дикий) не увеличивается. Контрольными являются геном вируса WT и плазмиды pTIRB1 и pTIRB1 Lac (табл. 5).
Фрагмент величиной 220 по увеличивается на диких TIR, а фрагмент величиной более 3 ко - для рекомбинантного TIR, содержащего ген LacZ. Для выявления гена LacZ вторая амплификация использует праймер 5168, расположенный ниже сайта B1, и праймер 3254, расположенный в гене LacZ. Увеличивается фрагмент величиной 674 по. Этот разумный выбор праймеров позволяет, следовательно, различать рекомбинантные TIR и нерекомбинантные TIR. Вирусная суспензия считается однородной, двойной рекомбинантной, если фрагмент WT (дикий) не увеличивается. Контрольными являются геном вируса WT и плазмиды pTIRB1 и pTIRB1 Lac (табл. 5).
Примечание к табл. 5.
- - отсутствие увеличенного фрагмента.
Пример 15. Экспрессия гена LacZ при культивировании ткани рекомбинантными вирусами CNR/LacZ
Активность β-галактозидазы (β- gal) измеряют, используя о-нитофенил-β-галактопиранозид (ОНФГ) в качестве субстрата. Фермент превращает ОНФГ в галактозу и о-нитрофенол (ОНФ) желтого цвета, количество которого измеряется в результате поглощения при 420 нм. Это поглощение переводится в единицы β-gal при помощи калибровочной кривой в соответствии с правилом: "1 единица β-gal = 1 мкмоль полученного ОНФ (3 • 106 клеток) 60 минут инкубации экстрактов при 28oC".
Активность β-галактозидазы (β- gal) измеряют, используя о-нитофенил-β-галактопиранозид (ОНФГ) в качестве субстрата. Фермент превращает ОНФГ в галактозу и о-нитрофенол (ОНФ) желтого цвета, количество которого измеряется в результате поглощения при 420 нм. Это поглощение переводится в единицы β-gal при помощи калибровочной кривой в соответствии с правилом: "1 единица β-gal = 1 мкмоль полученного ОНФ (3 • 106 клеток) 60 минут инкубации экстрактов при 28oC".
Этот опыт "β-Gal" проводится, как будет видно, в чашке с поверхностью 25 см2. Для вирусов Pox различают ближайшую и запаздывающую фазы заражения. Ближайшая фаза является наиболее короткой; она длится примерно 6 часов. Она заканчивается в момент репликации генома. Запаздывающая фаза начинается с репликации и завершается по окончании цикла заражения высвобождением вирусных частиц, т.е. три дня спустя. Чтобы иметь достаточную экспрессию гена LacZ в ходе ближайшей фазы, предлевают искусственно ближайшую фазу при помощи цитозин-β-D-арабинофуранозида (АгаС), который является ингибитором репликации.
a. Клетки.
В день Д = 1: на чашке инокулируют 3 • 106 клеток QT35 в 5 мл питательной среды.
В день Д = X2: проводят заражение с мультиплетностью инфекции 3 вируса на клетку. Инкубируют в течение 1 часа при температуре 38oC. Затем удаляют вирусный инокулят при помощи пипетки. Потом прибавляют (на одну чашку) 5 мл среды для сохранения с добавкой или без добавки АгаС (Сигма) с концентрацией 40 мкг/мл. Инкубируют культуры в течение 16 часов при температуре 38oC.
b. Собирание в день Д = 3
Соскребают клетки с чашки.
Соскребают клетки с чашки.
Центрифугируют культуру в течение 10 минут с ускорением 6000 g. Снова переводят остаток после центрифугирования в суспензию посредством 500 мкл PBS, перемешивают эту суспензию и переносят ее в пробирку Эппендорфа с объемом 1,4 мл.
Затем лизируют клетки путем прибавления 50 мкл CHCl3 и 5 мкл 10% SDS. Перемешивают суспензию клеток в течение короткого времени. Потом центрифугируют эту суспензию в течение 5 минут с ускорением 9000 g.
с. Ферментативная реакция
Субстрат ОНФГ для 25 образцов приготавливается следующим образом: смешивают 27,7 мг ОНФГ (Сигма) и 50 мл разбавителя, состоящего из 1 мл 0,1 М MgSO4 и 1 мл 2-меркаптоэтанола (Мерк) в конечном объеме 100 мл буферного раствора (90 мл 0,1 М NaHPO4 с pH = 7,0, 0,1 М MgSO4, 1 мл меркаптоэтанола.
Субстрат ОНФГ для 25 образцов приготавливается следующим образом: смешивают 27,7 мг ОНФГ (Сигма) и 50 мл разбавителя, состоящего из 1 мл 0,1 М MgSO4 и 1 мл 2-меркаптоэтанола (Мерк) в конечном объеме 100 мл буферного раствора (90 мл 0,1 М NaHPO4 с pH = 7,0, 0,1 М MgSO4, 1 мл меркаптоэтанола.
Смешивают 1,95 мл раствора ОНФГ и 50 мкл суспензии клеток, которую инкубируют в течение 1 часа при температуре 28oC. Потом прибавляют к этой суспензии 2 мл 1 М Na2CO3 и измеряют поглощение этой суспензии при 420 нм.
Сравнение активности β-gal для рекомбинантных вирусов приводится ниже в единицах β-gal (табл. 6).
Примечание к табл. 6.
WT - дикий тип, нерекомбинантный.
Ближайшая (АгаС) - ближайшая фаза роста, искусственно продленная на 16 часов за счет АгаС.
Ближайшая + Запаздывающая (-АгаС) - естественные ближайшая и запаздывающая фазы без АгаС.
Погл - поглощение.
ед β-gal - единица измерения β-галактозидазы.
1:5 и 1:10 - предварительные разбавления экстрактов в 5 и 10 раз.
Промотор P7.5 для Vaccinia действует в ходе ближайшей и запаздывающей фаз заражения (V3, V4 и V5), промотор P11 имеет исключительно запаздывающую активность (V8 и V9), промотор P11 является более сильным, чем промотор P7.5, как и для Vaccinia. Временное регулирование, а также относительная сила обоих промоторов, следовательно, сохраняются в вирусе CNP, будь то включение в B1 или B2 и какова бы ни была ориентация LacZ.
Пример 16. Вакцинация цыплят рекомбинантным вирусом CNP/LacZ. Защита от птичьей оспы.
Иммунная ответная реакция против β-gal.
Испытывают вакцинирующую способность рекомбинант CNP/LacZ. Двумя заказываемыми критериями являются защита против птичьей оспы и иммунная ответная реакция против β-галактозидазы.
a. Введение путем прокалывания крыла
Суспензия рекомбинантных вирусов V4, V8 или суспензия вакцинального штамма CNP вводились путем инъекции цыплятам в возрасте одного дня, освидетельствованным в том, что они свободны от патогенных микроорганизмов (SPF), в результате прокалывания перепонки крыла (способ, называемый "wing web" (WW).
Суспензия рекомбинантных вирусов V4, V8 или суспензия вакцинального штамма CNP вводились путем инъекции цыплятам в возрасте одного дня, освидетельствованным в том, что они свободны от патогенных микроорганизмов (SPF), в результате прокалывания перепонки крыла (способ, называемый "wing web" (WW).
Тесты распространяются на три группы от 28 до 30 цыплят, вакцинированных вирусами V4 или V8 или CNP, и на группу из 15 невакцинированых цыплят, рассматриваемую в качестве отрицательного контроля.
Каждый вакцинированный цыпленок получил 10 мкл суспензии с содержанием вирусов 5 • 105 ТСIД50 (Tissue Culture Infections Dose)/мл, что эквивалентно 5 • 103 TCID50 на одну птицу. На 29 день цыплята были приведены в контакт с вирулентным вирусом (штамм Fowlpox Challenge Virus, полученный из Афиса, США).
Отсутствие нарушений здоровья, оцениваемое десять дней спустя, свидетельствует о защите всех вакцинированных цыплят от птичьей оспы. Напротив, половина невакцинированных цыплят имела нарушения здоровья. Анализ титров антител против β-галактозидазы прямым методом ELISA показал, что 21 из 29 (72%) цыплят, вакцинированных вирусами V4, и 20 из 38 /71%/ цыплят, вакцинированных вирусом V8, имеют серологическую реакцию, т.е. являются сероположительными.
Поскольку титр ELISA является последним разбавлением, которое дает оптическую плотность, превышающую 100, то средний титр ELISA анти-β-галактозидазы в сыворотке этих цыплят составляет 1:800.
b. Введение внутримышечным и подкожным путем
Однодневные цыплята вакцинируются в первый день посредством 104,4 ТСIД50 вируса V8 внутримышечным путем (ВМ, 27 цыплят) или подкожным путем (ПК, 34 цыпленка). Они подвергаются испытанию здоровья спустя 27 дней. Они защищены от птичьей оспы (100%). Серологическая реакция против β-галактозидазы наблюдается у 24 из 27 (88%) цыплят, вакцинированных ВМ путем, и у 27 из 34 (79%) цыплят, вакцинированных ПК путем.
Однодневные цыплята вакцинируются в первый день посредством 104,4 ТСIД50 вируса V8 внутримышечным путем (ВМ, 27 цыплят) или подкожным путем (ПК, 34 цыпленка). Они подвергаются испытанию здоровья спустя 27 дней. Они защищены от птичьей оспы (100%). Серологическая реакция против β-галактозидазы наблюдается у 24 из 27 (88%) цыплят, вакцинированных ВМ путем, и у 27 из 34 (79%) цыплят, вакцинированных ПК путем.
Таким образом, результаты иммунизации показывают,
- что рекомбинантные вирусы, которые содержат ген LacZ в областях TIR их генома в сайте B1 или B2, сохранили свою иммуногенную способность,
- что промоторы P7.5 и P11 действуют в животных,
- что ответная реакция антител направлена против β-галактозидазы, рассматриваемой здесь в качестве гетерологичного протеина, выраженного рекомбинантной CNP,
- что внутримышечный (ВМ) путь, подкожный (ПК) путь и способ путем прокалывания перепонки крыла (WW) являются эквивалентными одновременно по отношению к защите от птичьей оспы и к доле серологической реакции против β-галактозидазы.
- что рекомбинантные вирусы, которые содержат ген LacZ в областях TIR их генома в сайте B1 или B2, сохранили свою иммуногенную способность,
- что промоторы P7.5 и P11 действуют в животных,
- что ответная реакция антител направлена против β-галактозидазы, рассматриваемой здесь в качестве гетерологичного протеина, выраженного рекомбинантной CNP,
- что внутримышечный (ВМ) путь, подкожный (ПК) путь и способ путем прокалывания перепонки крыла (WW) являются эквивалентными одновременно по отношению к защите от птичьей оспы и к доле серологической реакции против β-галактозидазы.
Пример 17. Включение генов, которые кодируют гликопротеин E2 вируса птичьего бронхита, в векторы переноса
Вирусом, ответственным за инфекционный птичий бронхит (IBV), является коронавирус. Наиболее важным поверхностным антигеном этого вируса является протеин E2, образованный двумя субъединицами S1 и S2 (Cavanagh, 1983, Cavanagh et al., 1988). Существуют многочисленные серотипы, в том числе массачусеттский, называемый M41, и галландские серотипы, в частности Д1466 и Д274 (Kusters et al., 1987).
Вирусом, ответственным за инфекционный птичий бронхит (IBV), является коронавирус. Наиболее важным поверхностным антигеном этого вируса является протеин E2, образованный двумя субъединицами S1 и S2 (Cavanagh, 1983, Cavanagh et al., 1988). Существуют многочисленные серотипы, в том числе массачусеттский, называемый M41, и галландские серотипы, в частности Д1466 и Д274 (Kusters et al., 1987).
Разрабатывают рекомбинантную вакцину CNP, которая выражает протеин E2 для IBV, чтобы получить эффективную вакцину против вируса, ответственного за инфекционный птичий бронхит (IBV).
Ген протеина E2 серотипа M41 был получен доктором Кустерсом из Утрехтского Университета (Голландия), также как и большие фрагменты генов E2 серотипов D1466, D207 и D274.
Кассета BamHI гена E2 для M41 была сконструирована в результате направленного мутагенеза. Полный ген штамма D1466 и полный гибридный ген D207/D274 были сконструированы, исходя из фрагментов, а также на кассетах, совместимых с BamHI. Эти три кассеты были клонированы ниже промотора P7.5, генерирующего три плазмиды p75M41, p75D1466 и p75D207.
Кассеты P7.5-E2 клонируются в сайте BamHI вектора переноса pTIRBI, потом кассета P11Lac клонируется ниже E2 в сайте BamHI. Эти плазмиды переноса представляют собой pTIRBIP75M41Lac, pTIRBIP75D1446Lac и pTIRBIP75D207Lac. Рекомбинантные вирусы конструируются путем переноса и очищаются, как описано в примерах 9, 10 и 11. Геномы анализируются методом Southern blot, как описано в примере 13. Экспрессия антигена E2 выявляется иммунологическими методами: ELISA, Western blot или иммунофлуоресценция при помощи специфических антител. Получают колонию рекомбинантных вирусов. Домашняя птица вакцинируется дозой этих рекомбинант. Эффективность вакцины оценивается после заражения патогенными вирусами в соответствии с классическими методами для инфекционного бронхита и в результате оценки содержания антител против вируса.
Пример 18. Включение гена Eimeria в плазмиды переноса - конструирование рекомбинант CNP/TA4
Род Eimeria включает паразитов домашней птицы, ответственных за кокцидиоз. Были описаны поверхностные антигены, в частности, для микроорганизмов E. tenella, E. necatrix, E.maxima (заявки на европейский патент 0 164 176 и 0 231 537).
Род Eimeria включает паразитов домашней птицы, ответственных за кокцидиоз. Были описаны поверхностные антигены, в частности, для микроорганизмов E. tenella, E. necatrix, E.maxima (заявки на европейский патент 0 164 176 и 0 231 537).
Разрабатывают эффективную рекомбинантную вакцину против кокцидиоза.
Антиген для E.tenella, обозначаемый TA4 или A4, представляет собой протеин с молекулярным весом 25 кДа, состоящий из двух субъединиц с 17 кДа и 8 кДа, соединенных дисульфидным мостиком. Ген был выделен из геномного банка, а также исходя из mARN. Полное описание гена было опубликовано в вышеуказанных заявках на патент.
Кассета BamHI гена TA4 была сконструирована в результате субклонирования. Плазмида pTA406 содержит кодирующую последовательность из TA4. Плазмида pTA410 несет ген TA4 с модификацией в протеолитической последовательности, которая разделяет две субъединицы. В результате направленного мутагенеза природная последовательность Arg-Arg-Leu была заменена на последовательность Arg-Glu-Lys-Arg (описана Kieny et al., 1988). Эти две кассеты BamHI были клонированы ниже промотора P7.5 плазмиды pIP7.5 в направлении, которое размещает ген TA4 под контроль P7.5.
Кассеты P7.5-TA406 и P7.5-TA410 клонируются в сайте BamHI вектора переноса pTIRBID. Потом кассета P11-Lac клонируется в сайте BamHI ниже гена TA4. Плазмидами переноса являются pTIRTA406Lac и pTIRA410Lac.
Рекомбинантные вирусы были получены путем переноса, как описано в примерах 9, 10, 11. Получаются голубые области. Рекомбинанта, несущая ген TA406, представляет собой вирус V20, рекомбинанта, несущая ген TA410, представляет собой вирус V21.
Двойной рекомбинантный вирус V21, т. е. носитель одной копии TA410 и одной копии LacZ в каждой области TIR, очищается на пластинке для титрования, а его геном анализируется методом ПЦР, как описано в примере 14. Используемые праймеры и размер увеличенных фрагментов даются в приведенной ниже таблице. Праймер 1871 является комплементарным для гена LacZ (табл. 7).
Экспрессия антигена TA4 выявляется иммунологическими методами: ELISA, Western blot или иммунофлуоресценция при помощи специфических антител.
Получают колонию рекомбинантных вирусов. Домашняя птица вакцинируется дозой этих рекомбинант. Эффективность вакцины оценивается после испытания ("Challenge") вирулентными микроорганизмами Eimeria в соответствии с классическими методами для кокцидиоза, такими как анализ сывороток, скорость приращения веса и клинические признаки.
Пример 19. Включение гена полипротеина Гумборо в векторы переноса
Агентом, ответственным за болезнь Гумборо, является вирус из семейства Birnaviridae. Вирус, называемый IBDV (Infections Bursal Disease Virus), вызывает очень заразную болезнь (болезнь Гумборо), которая поражает молодых кур и характеризуется разрушением лимфоидных клеток сумки Фабрициуса. Вирус имеет геном, состоящий из двух сегментов двойной цепи РНК, называемых сегмент A (примерно 3400 пар оснований; по) и сегмент B (примерно 2900 по). Вирусные частицы являются незакрученными и имеют форму икосаэдра с диаметром примерно 60 нанометров. Четыре вирусных протеина были четко идентифицированы: VP1 с молекулярным весом (МВ) 90 кДа (кДа: кило-Дальтон), VP2 с МВ от 37 кДа до 40 кДа; VP3 с МВ от 32 кДа до 35 кДа и VP4 с МВ от 24 кДа до 29 кДа (Dobos, 1979, Fahey et al., 1985). Протеин VP2 является производным предшественника VPX с МВ от 41 кДа до 54 кДа.
Агентом, ответственным за болезнь Гумборо, является вирус из семейства Birnaviridae. Вирус, называемый IBDV (Infections Bursal Disease Virus), вызывает очень заразную болезнь (болезнь Гумборо), которая поражает молодых кур и характеризуется разрушением лимфоидных клеток сумки Фабрициуса. Вирус имеет геном, состоящий из двух сегментов двойной цепи РНК, называемых сегмент A (примерно 3400 пар оснований; по) и сегмент B (примерно 2900 по). Вирусные частицы являются незакрученными и имеют форму икосаэдра с диаметром примерно 60 нанометров. Четыре вирусных протеина были четко идентифицированы: VP1 с молекулярным весом (МВ) 90 кДа (кДа: кило-Дальтон), VP2 с МВ от 37 кДа до 40 кДа; VP3 с МВ от 32 кДа до 35 кДа и VP4 с МВ от 24 кДа до 29 кДа (Dobos, 1979, Fahey et al., 1985). Протеин VP2 является производным предшественника VPX с МВ от 41 кДа до 54 кДа.
Сегмент B кодирует VP1, который в действительности является вирусной полимеразой. Сегмент A кодирует 3 других протеина. Последние генерируются в результате протеолитического расщепления, исходя из предшественника с МВ примерно 110 кДа, который соответствует большой открытой фазе для считывания сегмента A. В этом протеолитическом расщеплении задействован протеин VP4 (Jagadish et al., 1988). Протеины VP2 и VP3 образуют вирусный капсид. Протеин VP2 содержит антигенные детерминанты, способные вызывать синтез антител, нейтрализующих вирус (Becht et al., 1988, Fahey et al., 1988).
Разрабатывается рекомбинантная вакцина Fowlpox против болезни Гумборо.
Стадии этой разработки являются следующими:
1. Выделение генетического материала из выбранного штамма IBDV, а именно из штамма EDGAR. Штамм вируса EDGAR можно достать в сельскохозяйственном департаменте Соединенных Штатов (USDA, APHIS 6505 Belcrest Road, Hyattsville, МД 20782, Соединенные Штаты).
1. Выделение генетического материала из выбранного штамма IBDV, а именно из штамма EDGAR. Штамм вируса EDGAR можно достать в сельскохозяйственном департаменте Соединенных Штатов (USDA, APHIS 6505 Belcrest Road, Hyattsville, МД 20782, Соединенные Штаты).
2. Синтез, клонирование и определение нуклеотидной последовательности ДНК, соответствующей сегменту A.
3. Внедрение ДНКк, а также последовательностей, необходимых для экспрессии этого генетического материала в клетках животного происхождения, зараженных вирусом Fowlpox, и последовательностей, позволяющих просеивать рекомбинантные вирусы Fowlpox, в плазмиду переноса pTIRBI, описанную в примере 4.
4. Выделение, очистка рекомбинантных вирусов.
5. Генетический анализ рекомбинантных вирусов.
6. Анализ экспрессии in vitro (при культивировании клеток) генов из IBDV, носимых этими рекомбинантными вирусами.
7. Вакцинация цыплят рекомбинантными вирусами и анализ защиты из болезни Гумборо.
Стадия 1.
Вирусная РНК штамма EDGAR была выделена, исходя из сумок цыплят, зараженных вирусом.
Примерно 40 г сумок, собранных спустя 7 дней после заражения вирусом, измельчаются в 40 мл буферного раствора TNE (TNE: 10 мМ Трис-HCl, 100 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, pH = 8). Измельченная масса центрифугируется с ускорением 17000 g, и полученная водная фаза наносится на предварительно сформированный сахарозный градиент, состоящий из 2 слоев с содержанием сахарозы 40% и 60% (% как отношение вес/объем, в буферном растворе TNE). Градиент центрифугируется с ускорением 134000 g в течение 2 часов 30 минут. Собирают фазу поверхности раздела 40 - 60% сахарозного градиента, которая содержит частично очищенный вирус. Прибавляют 5 мл этой фазы к 5 мл буферного раствора, содержащего 10 мМ Трис-HCl, 100 мМ NaCl, 0,5% SDS, 10 мМ ЭДТА, 2 мг/мл Протеиназы K при значении pH = 7,5. Смесь инкубируется в течение 1 часа при температуре 37oC. Затем водная фаза экстрагируется в смеси фенол/хлороформ. Нуклеиновые кислоты водной фазы осаждаются в этаноле в присутствии 0,8 М LiCl и извлекаются в 500 мкл воды.
Стадия 2.
Синтез и амплификация ДНКк, соответствующей сегменту A, были осуществлены по методу, описанному в "GENEAMP RNA PCR KIT, PERKIN ELMER CETUS", при помощи синтетических олигонуклеотидов или "праймеров", комплементарных для последовательности сегмента A, в качестве затравки для синтеза первой цепи ДНК под действием обратной транскриптазы. Выбор этих синтетических нуклеотидов был определен в результате анализа опубликованных последовательностей сегментов A других штаммов IBDV: австралийского штамма 002-73 (Hudson et al. , 1986), немецкого штамма CU-1 (Spies et al., 1989) и британского штамма 52/70 (Bayliss et al., 1990). Последовательность праймеров и их положение относительно сегмента A штамма EDGAR приведены на фиг. 8 и 9.
Анализ опубликованных последовательностей штаммов IBDV показывает, что помимо большой открытой фазы для считывания (ORF 1), кодирующей протеины VP2, VP4, VP3, существуют две другие открытые фазы для считывания на той же самой цепи, кодирующей сегмент A. Одна, ORF 2, начинающаяся на 34 по выше ATG фазы ORF 1, находится выше последней и имеет длину 435 по. Другая, ORF 3, начинается на 32 по выше ORF 2 и имеет длину 31 по. Возможная роль этих ORF в биологии вируса в настоящее время не определена.
Были генерированы четыре фрагмента двойной цепи ДНКк, ограниченные соответственно парами "праймеров": 0-1b/585 по/ 1-2 (1129 по), 3-4 (670 по), 5-6 (1301 по), и покрывающие фазы ORF 1 и ORF 2 сегмента A (смотри фиг. 8).
Эти фрагменты были клонированы в плазмидах pBSPIus или pBSLKI, шесть плазмид были сконструированы указанным образом (смотри фиг. 8 и 10) (табл. 8).
Нуклеотидные последовательности фрагментов IBDV этих плазмид были определены и выровнены так, чтобы восстановить последовательность увеличенного сегмента A штамма EDGAR методом ПЦР (смотри фиг. 9). Первоначальные последовательности штамма EDGAR, которые были заменены в результате использования "праймеров", определенных на основе опубликованных последовательностей других штаммов IBDV, также были определены, исходя из продуктов увеличения этих областей при помощи "праймеров", расположенных снаружи последних.
Реконструирование сегмента A, исходя из полученных клонов, схематично изображено на фиг. 10.
Стадии являются следующими:
1. Конструирование pEDGAR12:
pBSIA2 (EcoRI + T4 ДНК-полимераза, SacI) + pBSIB (SphI) + T4 ДНК-полимераза, SacI)
2. Конструирование плазмиды pEADGARM12 в результате направленного мутагенеза на pEDGAR12:
a) делеция сайта SphI из pEDGAR12, распложенного выше последовательности IBDV:
- первоначальная последовательность:
5' GTCTGATCTCTACGG
TTCCCTTTAGTGAGGG 3'
b) делеция сайта EcoRI из плазмиды pEDGAR12 и введение сайта SphI ниже последовательности IBDV:
- первоначальная последовательность:
3. Конструирование pACEDGARM12:
Включение фрагмента Bc11-SphI плазмиды pEDGARM12 в сайты Bc11-SphI плазмиды pACYC184.
1. Конструирование pEDGAR12:
pBSIA2 (EcoRI + T4 ДНК-полимераза, SacI) + pBSIB (SphI) + T4 ДНК-полимераза, SacI)
2. Конструирование плазмиды pEADGARM12 в результате направленного мутагенеза на pEDGAR12:
a) делеция сайта SphI из pEDGAR12, распложенного выше последовательности IBDV:
- первоначальная последовательность:
5' GTCTGATCTCTACGG
TTCCCTTTAGTGAGGG 3'
b) делеция сайта EcoRI из плазмиды pEDGAR12 и введение сайта SphI ниже последовательности IBDV:
- первоначальная последовательность:
3. Конструирование pACEDGARM12:
Включение фрагмента Bc11-SphI плазмиды pEDGARM12 в сайты Bc11-SphI плазмиды pACYC184.
4. Конструирование pEDGARM34i путем направленного мутагенеза на pEDGAR34i
Замена сайта SphI на сайт NsiI:
- первоначальная последовательность:
5. Конструирование pEDGAR45:
pBS3A (Hinc2 + Pst1) + фрагмент Hinc2-Pst1 плазмиды pEDGAR34i
6. Конструирование pACEDGAR14:
pACEDGARM12 (SphI + T4 ДНК-полимераза, BamHI) + pEDGARM34i (NsiI + T4 ДНК-полимераза, BamHI)
7. Конструирование pACEDGAR15:
pACEDGAR14 (BamHI + T4 ДНК-полимераза, SaII) + pEDGAR45 (PVu2-SaII)
8. Конструирование pACEDGAR1:
pACEDGAR15 (SphI + EcoRI) + pBS3B (SphI + PVu2).
Замена сайта SphI на сайт NsiI:
- первоначальная последовательность:
5. Конструирование pEDGAR45:
pBS3A (Hinc2 + Pst1) + фрагмент Hinc2-Pst1 плазмиды pEDGAR34i
6. Конструирование pACEDGAR14:
pACEDGARM12 (SphI + T4 ДНК-полимераза, BamHI) + pEDGARM34i (NsiI + T4 ДНК-полимераза, BamHI)
7. Конструирование pACEDGAR15:
pACEDGAR14 (BamHI + T4 ДНК-полимераза, SaII) + pEDGAR45 (PVu2-SaII)
8. Конструирование pACEDGAR1:
pACEDGAR15 (SphI + EcoRI) + pBS3B (SphI + PVu2).
Эта плазмида содержит полную последовательность фазы ORF 1 сегмента A на фрагменте BcII-BamHI.
9. Конструирование плазмиды pBSIBDVOb в результате направленного мутагенеза pBSIBDV0:
Введение фазы ORF 3 в плазмиду pBSIBDV0, которая несет начало фаз ORF 1 и ORF 2:
- первоначальная последовательность:
10. Конструирование pACEDGAR2 и pACEDGAR3:
Плазмиды pACEDGAR2 и pACEDGAR3 были получены в результате замены области BcI-I-Rsr2 плазмиды pACEDGAR1 на фрагмент BcII-Rsr2 плазмид pBSIBDVO и pBSIBDVOb соответственно.
Введение фазы ORF 3 в плазмиду pBSIBDV0, которая несет начало фаз ORF 1 и ORF 2:
- первоначальная последовательность:
10. Конструирование pACEDGAR2 и pACEDGAR3:
Плазмиды pACEDGAR2 и pACEDGAR3 были получены в результате замены области BcI-I-Rsr2 плазмиды pACEDGAR1 на фрагмент BcII-Rsr2 плазмид pBSIBDVO и pBSIBDVOb соответственно.
3 плазмиды pACEDGAR1, pACEDGAR2 и pACEDGAR3 позволяют, таким образом, выделить на фрагменте BcII-BamHI соответственно ORF 1, ORF 1 - ORF 2 и ORF 1 - ORF 2 - ORF 3 сегмента A штамма EDGAR.
Затем эти фрагменты BcII-BamHI были клонированы в сайте BamHI плазмиды p2P75, которая генерирует плазмиду p75EDGAR1, p75EDGAR2 и p75EDGAR3 и помещает одну или несколько кодирующих последовательностей сегмента A под контроль промотора P7.5.
Эти кодирующие последовательности помещались также под контроль промотора P11. Фрагмент BcII-BamHI плазмиды pACP11, несущий промотор p11, был включен в сайт BamHI плазмид pACEDGAR1, pACEDGAR2 и pACEDGAR3, чтобы генерировать соответственно плазмиды pIIEDGAR1, pIIEDGAR2 и pIIEDGAR3.
Кассеты BcII-BamHI P75-EDGAR или P11-EDGAR были выделены из этих различных плазмид и включены в сайт BamHI плазмиды pTIRBI, которая производит плазмиды pTIR75EDGAR1, pTIR75EDGAR2, pTIR75EDGAR3, pTIR11EDGAR1, pTIR11EDGAR2 и pTIR11EDGAR3. Ориентация кассет BcII-BamHI в плазмиде pTIRBI, которая была сохранена, является такой, чтобы направление транскрипции, инициируемой, начиная с промоторов P7.5 и P11, совпадало бы с направлением фаз ORF 1 и ORF 2, находящихся в плазмиде pTIRBI.
Фрагмент Bg12-BamHI плазмиды pACP11LAC, несущий кассету P11-LacZ, был включен в сайт BamHI плазмид pTIR75EDGAR1 и pTIR75EDGAR2, чтобы генерировать соответственно плазмиды pTIR75E1LAC и pTIR75E2LAC. Ориентация P11 - LacZ в этих плазмидах является такой, чтобы направление транскрипции гена LacZ совпадало бы с направлением открытых фаз ORF 1 и ORF 2.
Аналогичным образом плазмиды pTIR11E1LAC, pTIR11E2LAC и pTIR11E3LAC были генерированы путем включения в сайт BamHI соответственно плазмид pTIR11EDGAR1, pTIR11EDGAR2 и pTIR11EDGAR3 из кассеты P75-LacZ, выделенной в виде фрагмента Bg12-BamHI плазмиды p75LAC.
Наконец, плазмида pTIR11VP2LAC была генерирована путем включения в сайты PpuMI (обработанный ДНК-полимеразой T4) и Bg12 плазмиды pTIR11E1LAC фрагмента XhoI (обработанного ДНК-полимеразой T4) - Bg12 плазмиды p11EDGAR1. Плазмида переноса pTIR11VP2LAC содержит под контролем промотора P11 полную последовательность протеина VP2, а также амино-терминальную часть протеина VP4; для конструирования объединяются в фазу три последних аминокислоты (Asp, Leu, Glu; карбокси-терминальная часть протеина VP3) и кодон окончания трансляции (TGA) полипротеина. В соответствии с фиг. 9 этот гетерологичный протеин соответствует, следовательно, одной части полипротеина, содержащей аминокислоты с 1 по 493, за которыми следуют аминокислоты с 1010 по 1012, в которую включен протеин VP2.
В качестве примера на фиг. 11 изображена плазмида pTIR75E1LAC.
Стадия 4 и Стадия 5.
Рекомбинантные вирусы из Fowlpox, в которых были интегрированы открытые фазы ORF штамма Edgar, были выделены, очищены и охарактеризованы в соответствии с методами, описанными в примерах 9, 10, 11, 12, 13 и 14.
Обозначение рекомбинантных вирусов является следующим:
V11 = P7.5E1; V12 = P7.5E2;
V14 = P11E1; V15 = P11E2;
V17 = P11VP2; V16 = P11E3.
V11 = P7.5E1; V12 = P7.5E2;
V14 = P11E1; V15 = P11E2;
V17 = P11VP2; V16 = P11E3.
Праймеры, используемые для селекции двойных рекомбинантных TIR в методе ПЦР, различают TIR WT, TIR, содержащие LacZ, E1, E2, E3 или VP2. Комбинации праймеров и размер увеличенных фрагментов даются в табл. 9.
Праймеры IBDV16, 3, 1b и 22 гибридизируются с IBDV. Праймеры IBDV16, 1b и 3 гибридизируются с кодирующей частью протеина VP2. Праймер IBDV22 гибридизируется c кодирующей частью протеина VP3 и, следовательно, не гибридизируется с геномом V17. Праймеры 5168 и 5169 гибридизируются с FPV. Праймер 1871 гибридизируется с геном β-галактозидазы. Последовательность этих праймеров определена в таблие "Список и последовательности праймеров".
Стадия 6.
Сравнивалась экспрессия антигенов IBDV рекомбинантных вирусов в клетках QT35.
Используемые антитела, настроенные против штамма IBDV Си-1, были любезно предоставлены профессором Г.Мюллером, Институт вирусологии, Юстус-Либих-Университет, Гессен, Германия.
А именно:
1 - поликлональная сыворотка (N B22) гипериммунизированного кролика против штамма Си-1,
2 - моноклональное антитело мыши анти-VP3 (N 1/A10), распознавающее протеин VP3 в природной и денатурированной форме,
3 - моноклональное антитело мыши анти-VP2 (N B1), распознающее конформационный эпитоп протеина VP2; антитело, B1 является антителом, способным нейтрализовать вирусный штамм Си-1.
1 - поликлональная сыворотка (N B22) гипериммунизированного кролика против штамма Си-1,
2 - моноклональное антитело мыши анти-VP3 (N 1/A10), распознавающее протеин VP3 в природной и денатурированной форме,
3 - моноклональное антитело мыши анти-VP2 (N B1), распознающее конформационный эпитоп протеина VP2; антитело, B1 является антителом, способным нейтрализовать вирусный штамм Си-1.
a. Экспериментальные условия заражения
В день Д = 1: в расчете на одну чашку площадью 25 см2 инокулируют 2,5 • 106 клеток QT35 в 5 мл питательной среды (состав описан в примере 1). Приготавливают восемь чашек.
В день Д = 1: в расчете на одну чашку площадью 25 см2 инокулируют 2,5 • 106 клеток QT35 в 5 мл питательной среды (состав описан в примере 1). Приготавливают восемь чашек.
В день Д = 2 : заражают клетки с мультиплетностью заражения 0,01 вирусов на одну клетку при помощи каждого рекомбинантного вируса, V11, V12, V14, V15, V16, V17, V8 (отрицательный контроль) и IBDV (штамм Bursine 2, положительный контроль).
В день Д = 5 : собирают зараженные клетки и среду после замораживания с последующим размораживанием.
b. Анализ продуктов экспрессии методом ELISA типа сэндвич-метода.
тест ELISA проводят, используя в качестве первого антитела поликлональное антитело B22, а в качестве второго антитела - либо моноклональное антитело анти-VP3 (N 1/A10), либо моноклональное антитело, нейтрализующее анти-VP2 (N B1). Кривые методы ELISA представлены на фиг. 12A для анти-VP3 и 12B для анти-VP2.
Результаты этих анализов показывают, что:
1 - фиг. 12A: протеин VP3 выражен во всех рекомбинантах (V11, V12, V14, V15 и V16), которые содержат по крайней мере последовательность, кодирующую полипротеин (ORF 1, протеины VP2-VP4-VP3), но не выражен в рекомбинанте V17, потому что она содержит только область, кодирующую VP2, и амино-терминальную часть протеина VP4, и не выражен в рекомбинанте V8, потому что она не содержит никакой последовательности IBDV.
1 - фиг. 12A: протеин VP3 выражен во всех рекомбинантах (V11, V12, V14, V15 и V16), которые содержат по крайней мере последовательность, кодирующую полипротеин (ORF 1, протеины VP2-VP4-VP3), но не выражен в рекомбинанте V17, потому что она содержит только область, кодирующую VP2, и амино-терминальную часть протеина VP4, и не выражен в рекомбинанте V8, потому что она не содержит никакой последовательности IBDV.
Уровень экспрессии протеина VP3 является более слабым в рекомбинантах V11 и V12, чем в рекомбинантах V14, V15 и V16, что в действительности коррелируется с силой промоторов, присутствующих в различных рекомбинантах : активность промотора p7.5 (рекомбинанты V11 и V12) является менее сильной, чем активность промотора p11 (рекомбинанты V14, V15, V16) (смотри пример 15).
Не наблюдают различия уровня экспрессии протеина VP3 в зависимости от фаз считывания сегмента A, введенных в различные рекомбинанты: ORF 1 для рекомбинант V11 и V14, ORF 1 + ORF2 для рекомбинант V12 и V15 и ORF 1 + ORF 2 + ORF 3 для рекомбинанты V16.
2 - фиг. 12B : протеин VP2 выражен во всех рекомбинантах, за исключением V8, которая не содержит последовательностей IBDV.
Уровень экспрессии является наиболее высоким для рекомбинанты V17; в этом случае он близок к уровню экспрессии протеина VP2, выраженного в клетках, зараженных вирусом IBDV.
Снова наблюдают корреляцию между силой промоторов, присутствующих в различных рекомбинантах, и уровнем экспрессии протеина VP2.
Эти результаты показывают, с одной стороны, что эпитоп протеина VP2, распознаваемый антителом, нейтрализующим B1, которое настроено против штамма Си-1, также присутствует в протеине VP2 американского штамма Edgar, и, с другой стороны, что первоначальная конформация протеина VP2 сохраняется во всех рекомбинантах по крайней мере в этой области.
c. Анализ продуктов экспрессии методом Western blot.
Анализ при помощи метода Western blot протеинов, произведенных различными рекомбинантами, был осуществлен, с одной стороны, при помощи поликлональной сыворотки (B22), распознавающей совокупность протеинов IBDV, и, с другой стороны, при помощи моноклонального антитела анти-VP3 (1/A10).
Результаты, иллюстрируемые фиг. 13A, показывают, что поликлональная сыворотка распознает в экстрактах клеток, зараженных при помощи IBDV, в основном 3 протеина, соответствующих VP2 (≈ 40 кДа), VP3 (≈ 32 кДа) и VP4 (≈ 28 кДа). Протеин с молекулярным весом примерно 46 кДа также является наблюдаемым и мог бы представлять собой предшественника (VPX, ≈ 48-49 кДа) протеина VP2.
Для всех рекомбинант (V11, V12, V14, V15 и V16), которые содержат по крайней мере последовательность, кодирующую полипротеин (ORF1, VP2-VP3-VP4), выявлены при помощи поликлональной сыворотки анти-IBDV (рисунок 13A) протеины с молекулярным весом (МВ), совпадающим соответственно с МВ для VP3, VP4 и, вероятно, VPX. Для рекомбинанты V17 детектирован только один протеин, молекулярный вес которого близок к молекулярному весу протеина слияния VP2 + аминотерминальная область протеина VP4 (≈ 52 кДа).
Моноклональное антитело анти-VP3 (фиг. 13B) распознает в основном два протеина: VP3 и, вероятно, продукт разложения VP3 в клетках, зараженных при помощи IBDV, и все рекомбинанты, выражающие полипроетин. Никакой протеин из IBDV не распознается в рекомбинанте V17, выражающей протеин слияния VP2-VP4.
Совокупность этих результатов указывает, что фаза для считывания, кодирующая полипротеин (ORF 1), транслируется во всех рекомбинантах независимо от присутствия дополнительных фаз для считывания ORF 2 (рекомбинанты V12, V15) или ORF 2 и ORF 3 (рекомбинанта V16). Расщепление предшественника полипротеина осуществляется корректно, но оказывается неполным в том, что касается VP2, было предложено, что полное созревание предшественника VPX будет осуществляться в ходе или после переноса вирусных частиц IBDV к поверхности клеток (Muller et al., 1982).
Стадия 7.
Испытывают вакцинирующую способность рекомбинант FPV/IBDV.
a. Серологическая реакция под действием VII
Первая компания по вакцинации рекомбинантной FPV/IBDV сравнивала серологическую реакцию против β-галактозидазы и против вируса IBDV для трех различных путей введения: внутримышечным путем (ВМ), подкожным путем (ПК) и путем прокалывания крыла (WW или wing web).
Первая компания по вакцинации рекомбинантной FPV/IBDV сравнивала серологическую реакцию против β-галактозидазы и против вируса IBDV для трех различных путей введения: внутримышечным путем (ВМ), подкожным путем (ПК) и путем прокалывания крыла (WW или wing web).
Однодневные цыплята вакцинируются при помощи 104,4 рекомбинантных вирусов V11 в соответствии с тремя путями введения ВМ, ПК или WW. Они умерщвляются 11 дней спустя.
Анализ сывороток прямым методом ELISA показал, что 2/14 (14%) цыплят, вакцинированных внутримышечным путем, 3/6 (50%) цыплят, вакцинированных подкожным путем, и 8/15 (53%) цыплят, вакцинированных путем прокалывания крыла, имеют антитела против β-галактозидазы, тогда как 5/14 (36%) цыплят, вакцинированных внутримышечным путем, 1/6 (17%) цыплят, вакцинированных подкожным путем и 1/15 (7%) цыплят, вакцинированных путем прокалывания крыла, имеют антитела против вируса IBDV.
Таким образом, протеины IBDV выражаются рекомбинантной FPV/IBDV11 у вакцинированного животного и вызывают ответную реакцию антител у некоторых цыплят. Из трех путей введения внутримышечный путь вызывает ответную реакцию, большую, чем для всех других.
b. Ранняя защита под действием вирусов V11, V15 и V16.
Однодневные цыплята получили дозу величиной 104,4 вирусов V8 (отрицательный контроль) V11, V15 или V16 внутримышечным путем и были подвергнуты вливанию. 10 дней спустя под действием 100 LD50 (стократная летальная доза) вируса 849 VB, введенного через глаз. Штамм 849 VB описан Van Den Berg et al., 1991.
Цыплята умерщвляются 210 дней спустя.
Умноженное на 100 отношение между весом сумки и общим весом является коэффициентом защиты.
Для контрольной группы, вакцинированной вирусом V8 и не подвергавшейся испытанию IBDV, это отношение составляет 0,57 (среднее для 10 цыплят).
Для группы V8, подвергнутой испытанию, это отношение доходит до 0,11 (9 цыплят).
Для цыплят, вакцинированных вирусами V11, V15 и V16, это отношение составляет соответственно 0,1 (20 цыплят), 0,12 (18 цыплят) и 0,12 (18 цыплят).
Применение этого критерия показывает, что отсутствует ранняя защита против вируса IBDV под действием рекомбинант V11, V15 и V16.
c. Поздняя защита под действием V11, V15 и V16.
Цыплята, вакцинированные вирусами V8, V11, V15 и V16, как описано в предыдущем пункте, были подвергнуты испытанию вирусом IBDV спустя 42 дня после инъекции.
Отобранные для анализа сыворотки перед испытанием анализируются методом ILISA, чтобы оценить ответную реакцию антител против β-галактозидазы и вируса IBDV.
Ответная реакция против β-галактозидазы показывает, что 100%-ная серологическая реакция получается у всех вакцинированных цыплят, т.к. всего у 70 цыплят. Титры варьируются от 1:200 до 1:51200. Нет существенной разницы между титрами, полученными для V11, у которого ген LacZ находится под контролем P7.5, и V8, V15 и V16, у которых гены LacZ находятся под контролем промотора P11.
Ответная реакция против IBDV у 10 цыплят, вакцинированных вирусом V8, является нулевой, она является положительной у всех цыплят, вакцинированных вирусами V11, V15 и V16. Подробности следующие: титры ответных реакций у 20 цыплят, вакцинированных вирусом V11, варьируются от 1:800 до 1:51200 при среднем 1:6400. Они составляют от 1:6400 до 1:102400 при среднем 1:25600 для 20 цыплят, вакцинированных вирусом V15. Они находятся между 1:6400 и 1: 204800 при среднем 1: 25600 у 20 цыплят, вакцинированных вирусом V16. Содержание антител является явно более высоким для групп, вакцинированных вирусами V15 или V16, чем в случае V11.
Титры серонейтрализации вакцинального штамма PBG68, адаптированного к культивируемым клеткам, составляет 1:10 для V11, в качестве отрицательного контроля, 4 сыворотки из 20 для V15 и 1 сыворотка из 20 для V16 имеют титры серонейтрализации величиной 1:20. Следовательно, этот титр является слабым и наблюдается только у некоторых животных.
Отношение (вес сумок/общий вес) • 100 составляет в среднем 0,66 в контрольной группе V8, не подвергавшейся вливанию (10 цыплят). Оно доходит до 0,1 в группе V8, подвергнутой испытанию "Challenge" (1 выживший). Оно составляет 0,1, 0,11 0,11 для трех групп V11 (3 цыпленка), V15 (11 цыплят) и V16 (8 цыплят) соответственно. Отсутствует защита против атрофии сумок.
Смертность через четыре дня, которые следуют за испытанием "Challenge", была практически полной для контрольной группы (9 цыплят из 10). В группе V11 выжили 3 цыпленка из 20, тогда как выжили 11 цыплят из 20, вакцинированных вирусом V15, и 8 цыплят из 20, вакцинированных вирусом V16. Таким образом, наблюдают защиту порядка 50% животных, вакцинированных вирусами V15 или V16.
d. Защита под действием вирусов V14, V15 и V17.
Четыре группы домашней птицы с возрастом три недели получили 0,2 мл рекомбинантных вирусов V8 (отрицательный контроль), V14, V15 или V17. Количество вирусов на одного цыпленка составило 106,4 ТСIД50. Путь введения является внутримышечным.
Спустя двадцать один день отбирается для анализа сыворотка от каждого животного, чтобы оценить титр по антителам типа анти-IBDV. Пятикратная летальная доза IBDV вводится животным из групп V14, V15 или V17 и части животным из группы V8 (т.е. из группы домашней птицы, получившей рекомбинантный вирус V8).
Спустя 11 дней, т. е. 32 дня после вакцинации, животные-свидетели из группы V8 и те, которые выжили при испытании, умерщвляются, и определяется отношение (вес сумок/вес домашних птиц) • 100.
Результаты следующие:
- Смертность: число домашних птиц, не выдержавших вливания, распределяются следующим образом:
для V8: 12 птиц из 14 (85%), для V14: 21/24 (87%),
для V15 : 17/25 (68%) и для V17 : 0/25 (0%).
- Смертность: число домашних птиц, не выдержавших вливания, распределяются следующим образом:
для V8: 12 птиц из 14 (85%), для V14: 21/24 (87%),
для V15 : 17/25 (68%) и для V17 : 0/25 (0%).
Другими словами, все домашние птицы, вакцинированные рекомбинантой V17, устойчивы к вливанию. В этой группе защита является полной. Кроме того, ни одна из домашних птиц не показала ни малейшего клинического признака болезни. Защита величиной 32%, полученная для рекомбинанты V15, близка к защите величиной 50%, полученной в предыдущем эксперименте.
- Метод ELISA: средние оцененные титры против вируса составляют: для V8 титры меньше 1: 100 и рассматриваются как отрицательные, для V14 титры величиной 1: 12800 (от 1:6400 до 1:51200), для V15 титры величиной 1:6400 (от 1: 800 до 1: 25600), для V17 титры меньше 1:100, за исключением 3 домашних птиц (1:800, 1:6400 и 1:51200).
Следовательно, ответная реакция антител против IBDV, вызванная экспрессией полипротеина рекомбинантного FPV/IBDV, является очень высокой. Ответная реакция против полного вируса, вызванная посредством V17, является, напротив, слабой.
- Серонейтрализация: титры серонейтрализации против штамма PBG68 составляют в среднем: для V8, V14 и V15 титры меньше 1:10 и рассматриваются как отрицательные; для V17 5 домашних птиц из 20 имеют титр, превышающий 1:20, т.е, в частности, 1:20 (два раза), 1:40, 1:80 и 1:320.
Следовательно, серонейтрализация наблюдается исключительно в сыворотке домашних птиц, вакцинированных вирусом V17.
- Сумки: среднее отношение (вес сумок/общий вес) • 100 является следующим: для V8, не подвергавшихся вливанию, отношение составляет 0,68 (± 0,13), для V8, подвергнутых испытанию "Challenge", отношение составляет 0,09 (± 0,01), для V14 отношение составляет 0,10 (± 0,02), V15 отношение составляет 0,13 (± 0,04) и для V17 отношение составляет 0,34 ± 0,23).
Следовательно, частичная защита сумок Фабрициуса наблюдается исключительно в группе V17. Действительно, 8 домашних птиц из 24 имеют отношение, подобное тому, которое имеют свидетели, не подвергавшиеся вливанию. Шестнадцать других имеют отношение, более высокие, чем у свидетелей, подвергнутых испытанию "Challenge".
Выводы.
Основные выводы из этих компаний по вакцинации являются следующими
- Рекомбинанты, которые выражают полипротеин из IBDV, вызывают у домашних птиц сильную ответную реакцию ELISA с высокими титрами против вируса.
- Рекомбинанты, которые выражают полипротеин из IBDV, вызывают у домашних птиц сильную ответную реакцию ELISA с высокими титрами против вируса.
- Рекомбинанта, которая выражает часть VP2 полипротеина, полностью защищает домашних птиц от гибели и частично от атрофии сумки.
Список плазмид, список микроорганизмов, список и последовательности праймеров приведены после формулы изобретения.
Claims (8)
1. Рекомбинантный вектор на основе вируса оспы птиц, происходящий из аттенуированного штамма вируса оспы птиц, определяющий синтез гетерологичного белка микроорганизма, патогенного для домашней птицы, характеризующийся следующими признаками: содержит по крайней мере одну последовательность гетерологичного белка микроорганизма, патогенного для домашней птицы, интегрированную в часть генома, несущественную для жизнедеятельности вируса, представляющую собой некодирующую межгенную область не более чем 60 нуклеотидов, расположенную в концевых инвертированных повторах (TIR) между двумя открытыми рамками считывания (ORF) и включающую их сигналы экспрессии, а также структурные элементы, способные обеспечить экспрессию указанного гетерологичного белка в клетках, трансформированных данным рекомбинантным вектором, причем межгенная область представляет собой β1 и/или β2, и β1 расположена между нуклеотидами 1675 и 2165 TIR, при условии, что за точку отсчета принят сайт рестрикции для ВАМН1 нуклеазы в TIR, а между двумя открытыми рамками считывания ORF1 и ORF2, находящимися между нуклеотидами 416-1674 и 2166-2671 соответственно, а β2 расположена между нуклеотидами 2672 и 3605 TIR при условии, что за точку отсчета принят сайт рестрикции для нуклеазы ВАМН1 в TIR, и между двумя открытыми рамками считывания ORF2 и ORF3, находящимися между нуклеотидами 2166-2671 и 3606 и 4055 соответственно.
2. Вектор по п.1, отличающийся тем, что получен при использовании аттенуированного штамма вируса оспы кур.
3. Вектор по п.2, отличающийся тем, что последовательность гетерологичного белка интегрирована в область β1 в каждом из двух TIR.
4. Вектор по п.2, отличающийся тем, что последовательность гетерологичного белка интегрирована в область β2 одного из двух TIR.
5. Вектор по п.3, отличающийся тем, что последовательность гетерологичного белка представляет собой последовательность антигенного белка вируса болезни Гумборо (ВБГ), или вируса инфекционного бронхита (ВИБ), или вируса анемии цыплят (ВАЦ), или вируса болезни Ньюкасла, или вируса болезни Марека, или последовательность антигенного белка паразитического простейшего Eimeria tenella, вызывающего кокцидиоз.
6. Вектор по п.5, отличающийся тем, что последовательность антигенного белка в случае ВБГ представляет собой последовательность полибелка или его части, в случае ВИБ - последовательность белка E2 или его части, в случае ВАЦ - последовательность белка Р50 или его части и в случае паразитического простейшего Eimeria tenella - последовательность поверхностного антигенного белка ТА4 или его части.
7. Вектор по п.6, отличающийся тем, что часть последовательности полибелка ВБГ содержит аминокислоты 1-493 и далее аминокислоты 1010-1012.
8. Вектор на основе вируса оспы птиц, охарактеризованный в любом из пп. 1-7 формулы, используемый для вакцинации домашней птицы.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
BE09100507 | 1991-05-27 | ||
BE9100507A BE1004877A3 (fr) | 1991-05-27 | 1991-05-27 | Virus de l'avipox recombinant, culture de cellules infectees par ce virus et vaccins pour la volaille derives de ce virus. |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2130971C1 true RU2130971C1 (ru) | 1999-05-27 |
Family
ID=3885526
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
SU5052222A RU2130971C1 (ru) | 1991-05-27 | 1992-05-27 | Рекомбинантный вектор на основе вируса оспы птиц, рекомбинантный вектор для вакцинации домашней птицы |
Country Status (23)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP0517292B1 (ru) |
JP (1) | JP3411307B2 (ru) |
KR (1) | KR100244601B1 (ru) |
CN (1) | CN1055501C (ru) |
AR (1) | AR248045A1 (ru) |
AT (1) | ATE189480T1 (ru) |
AU (1) | AU656185B2 (ru) |
BE (1) | BE1004877A3 (ru) |
BR (1) | BR9202024A (ru) |
CA (1) | CA2069594A1 (ru) |
DE (1) | DE69230627T2 (ru) |
DK (1) | DK0517292T3 (ru) |
ES (1) | ES2145000T3 (ru) |
HU (1) | HU215531B (ru) |
IE (1) | IE921686A1 (ru) |
IL (1) | IL101780A (ru) |
MX (1) | MX9202512A (ru) |
NZ (1) | NZ242620A (ru) |
PT (1) | PT517292E (ru) |
RU (1) | RU2130971C1 (ru) |
SG (1) | SG49876A1 (ru) |
TW (1) | TW288048B (ru) |
ZA (1) | ZA923321B (ru) |
Families Citing this family (22)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CA2110505A1 (en) * | 1991-07-26 | 1993-02-18 | Enzo Paoletti | Infectious bursal disease virus recombinant poxvirus vaccine |
EP1489165A1 (en) * | 1992-01-13 | 2004-12-22 | Virogenetics Corporation | Recombinant fowlpox vaccine for protection against marek's disease |
FR2697534A1 (fr) * | 1992-11-02 | 1994-05-06 | Rhone Merieux | Virus herpès de la dinde recombinant pour la réalisation de vaccin de la maladie de Gumboro, son procédé de préparation et vaccin obtenu. |
US6136318A (en) * | 1993-02-26 | 2000-10-24 | Cochran; Mark D. | Recombinant fowlpox viruses and uses thereof |
WO1994019015A1 (en) * | 1993-02-26 | 1994-09-01 | Syntro Corporation | Recombinant fowlpox viruses and uses thereof |
US5925358A (en) * | 1993-02-26 | 1999-07-20 | Syntro Corporation | Recombinant fowlpox viruses and uses thereof |
FR2728794B1 (fr) * | 1994-12-30 | 1997-03-21 | Rhone Merieux | Vaccin recombinant aviaire a base de virus herpes aviaire, notamment contre la maladie de gumboro |
FR2728795B1 (fr) * | 1994-12-30 | 1997-03-21 | Rhone Merieux | Vaccin vivant recombinant aviaire, utilisant comme vecteur un virus herpes aviaire |
GB9711957D0 (en) | 1997-06-09 | 1997-08-06 | Isis Innovation | Methods and reagents for vaccination |
GB0118532D0 (en) | 2001-07-30 | 2001-09-19 | Isis Innovation | Materials and methods relating to improved vaccination strategies |
GB2396814B (en) | 2001-11-30 | 2006-07-19 | Isis Innovation | Fowlpox vector |
GB2382578A (en) * | 2001-11-30 | 2003-06-04 | Isis Innovation | Fowlpox-based vaccine |
CN100494388C (zh) * | 2002-05-16 | 2009-06-03 | 巴法里安诺迪克有限公司 | 改进的安卡拉痘苗病毒(mva)基因组中作为插入位点的基因间隔区 |
CA2515890C (en) * | 2003-02-20 | 2013-09-17 | Therion Biologics Corporation | Novel insertion sites in pox vectors |
GB2402391A (en) * | 2003-06-04 | 2004-12-08 | Oxxon Pharmaccines Ltd | Fowlpox recombinant genome |
SI2785373T1 (sl) | 2011-11-30 | 2020-02-28 | Boehringer Ingelheim Animal Health USA Inc. | Rekombinantni vektorji HVT, ki izražajo antigene aviarnih patogenov in uporabe le-teh |
EP2845904A1 (en) | 2013-09-06 | 2015-03-11 | Ceva Sante Animale | Recombinant Marek's disease viruses and uses thereof |
EP3050572A1 (en) | 2015-01-29 | 2016-08-03 | Ceva Sante Animale | Recombinant MDV1 and the uses thereof |
EP3263129A1 (en) | 2016-06-29 | 2018-01-03 | Ceva Sante Animale | Duck enteritis virus and the uses thereof |
MA49874A (fr) | 2016-12-14 | 2020-06-24 | Boehringer Ingelheim Animal Health Usa Inc | Vecteurs hvt recombinants exprimant de multiples antigènes de pathogènes aviaires, et vaccins les contenant |
MX2021007761A (es) | 2018-12-27 | 2021-10-13 | Ceva Sante Animale | Virus recombinantes y sus usos. |
WO2021257706A1 (en) | 2020-06-17 | 2021-12-23 | Boehringer Ingelheim Animal Health USA Inc. | Recombinant hvt vectors expressing influenza hemagglutinin and immunogenic compositions, and production and uses thereof |
Family Cites Families (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1988002022A1 (en) * | 1986-09-22 | 1988-03-24 | Commonwealth Scientific And Industrial Research Or | Recombinant poxviruses |
FR2632863B2 (fr) * | 1987-10-29 | 1990-08-31 | Transgene Sa | Virus du fowlpox recombinant et vaccins derives de ces virus |
GB2220941B (en) * | 1988-06-24 | 1991-09-11 | Nat Res Dev | Fowlpox virus non-essential regions |
KR940001265B1 (ko) * | 1988-12-29 | 1994-02-18 | 닛뽕 제온 가부시끼가이샤 | 프로모터, 그를 함유하는 플라스미드 및 재조합 아비폭스비루스 |
WO1990015140A1 (en) * | 1989-05-30 | 1990-12-13 | Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation | Production of ibdv vp2 in highly immunogenic form |
-
1991
- 1991-05-27 BE BE9100507A patent/BE1004877A3/fr not_active Expired - Lifetime
-
1992
- 1992-03-19 SG SG9608014A patent/SG49876A1/en unknown
- 1992-05-05 IL IL10178092A patent/IL101780A/xx active IP Right Grant
- 1992-05-06 NZ NZ242620A patent/NZ242620A/xx unknown
- 1992-05-06 TW TW081103546A patent/TW288048B/zh active
- 1992-05-07 ZA ZA923321A patent/ZA923321B/xx unknown
- 1992-05-18 AU AU16323/92A patent/AU656185B2/en not_active Ceased
- 1992-05-19 ES ES92201406T patent/ES2145000T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1992-05-19 EP EP92201406A patent/EP0517292B1/fr not_active Expired - Lifetime
- 1992-05-19 AT AT92201406T patent/ATE189480T1/de not_active IP Right Cessation
- 1992-05-19 DE DE69230627T patent/DE69230627T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1992-05-19 PT PT92201406T patent/PT517292E/pt unknown
- 1992-05-19 DK DK92201406T patent/DK0517292T3/da active
- 1992-05-26 HU HU9201746A patent/HU215531B/hu not_active IP Right Cessation
- 1992-05-26 CA CA002069594A patent/CA2069594A1/fr not_active Abandoned
- 1992-05-26 AR AR92322400A patent/AR248045A1/es active
- 1992-05-27 JP JP13533192A patent/JP3411307B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1992-05-27 RU SU5052222A patent/RU2130971C1/ru active
- 1992-05-27 BR BR929202024A patent/BR9202024A/pt not_active Application Discontinuation
- 1992-05-27 MX MX9202512A patent/MX9202512A/es unknown
- 1992-05-27 KR KR1019920009005A patent/KR100244601B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1992-05-27 CN CN92105030A patent/CN1055501C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1992-07-01 IE IE168692A patent/IE921686A1/en not_active Application Discontinuation
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
KR920021706A (ko) | 1992-12-18 |
HU215531B (hu) | 2000-05-28 |
AU656185B2 (en) | 1995-01-27 |
IL101780A0 (en) | 1992-12-30 |
JPH05244939A (ja) | 1993-09-24 |
BR9202024A (pt) | 1993-01-19 |
AU1632392A (en) | 1992-12-03 |
EP0517292B1 (fr) | 2000-02-02 |
DE69230627T2 (de) | 2000-09-28 |
EP0517292A1 (fr) | 1992-12-09 |
BE1004877A3 (fr) | 1993-02-16 |
ZA923321B (en) | 1993-01-27 |
CN1069068A (zh) | 1993-02-17 |
TW288048B (ru) | 1996-10-11 |
CN1055501C (zh) | 2000-08-16 |
AR248045A1 (es) | 1995-05-31 |
PT517292E (pt) | 2000-06-30 |
IL101780A (en) | 2000-12-06 |
DK0517292T3 (da) | 2000-05-08 |
NZ242620A (en) | 1993-09-27 |
SG49876A1 (en) | 2002-04-16 |
ATE189480T1 (de) | 2000-02-15 |
ES2145000T3 (es) | 2000-07-01 |
KR100244601B1 (ko) | 2000-03-02 |
MX9202512A (es) | 1995-01-31 |
CA2069594A1 (fr) | 1992-11-28 |
DE69230627D1 (de) | 2000-03-09 |
HUT62331A (en) | 1993-04-28 |
IE921686A1 (en) | 1992-12-02 |
HU9201746D0 (en) | 1992-08-28 |
JP3411307B2 (ja) | 2003-05-26 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
RU2130971C1 (ru) | Рекомбинантный вектор на основе вируса оспы птиц, рекомбинантный вектор для вакцинации домашней птицы | |
KR0179994B1 (ko) | 칠면조의 재조합 포진바이러스 및 이로부터 유도된 생존상태의 벡터 백신 | |
RU2766003C2 (ru) | Мультивалентные рекомбинантные вирусы птичьего герпеса и вакцины для иммунизации птиц | |
EP0968297B1 (fr) | Vaccin vivant recombinant aviaire, utilisant comme vecteur le virus de la laryngotracheite infectieuse aviaire | |
US10188720B2 (en) | Recombinant Marek's disease viruses and uses thereof | |
EP0914458A1 (fr) | Vaccin vivant recombinant aviaire, utilisant comme vecteur le virus de la laryngotracheite infectieuse aviaire | |
JPH10506782A (ja) | 組換え型シチメンチョウヘルペスウイルス、及びその使用 | |
JPH08500969A (ja) | 七面鳥の組換えヘルペスウイルス及びそれらの使用 | |
CA2166371A1 (en) | Avian herpesvirus-based live recombinant avian vaccine, in particular against gumboro disease | |
US10821170B2 (en) | Duck Enteritis Virus and the uses thereof | |
HUT62325A (en) | Chicken anaemia virus vaccine and diagnostic | |
US6913751B2 (en) | Recombinant avian herpesvirus useful in vaccine production | |
CA2110505A1 (en) | Infectious bursal disease virus recombinant poxvirus vaccine | |
DE69227860T2 (de) | Rekombinante Geflügelpockenvazzine zum Schutz gegen die Marek-Krankheit | |
US20100008948A1 (en) | Recombinant herpesvirus useful in vaccine production | |
US6241989B1 (en) | Recombinant multivalent viral vaccine | |
US10246685B2 (en) | Recombinant MDV1 and the uses thereof | |
US7087234B1 (en) | Recombinant multivalent viral vaccine | |
JPH07255488A (ja) | 組換えマレック病ウイルスおよびその作出法 | |
JPH06141853A (ja) | 組換え鶏伝染性喉頭気管炎ウイルス及びその製法 | |
JPH05244940A (ja) | 組み換えアビポックスウィルス及びそれから成るワクチン |