CN1069068A - 重组禽痘病毒，培养被上述病毒感染的细胞以及从上述病毒得到的家禽疫苗 - Google Patents
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Abstract
本发明是关于从禽痘病毒减毒菌株衍生的重组
禽痘病毒，其基因组的非必需部分含至少一个编码与
禽痘病毒异源的全部或部分蛋白的DNA序列。该
基因组的非必需部分由TIRS(末端颠倒重复区域)
的基因间区域组成。
本发明也涉及用这些病毒感染的细胞培养物，涉
及含该禽痘病毒重组体的疫苗以及这些病毒作为能
表达与病毒异源的全部或部分蛋白的载体的应用。
Description
本发明涉及从禽痘病毒尤其是从产生家禽天花的病毒中得到的重组病毒，家禽天花通常称作禽痘。本发明也涉及通过细胞培养产生这病毒的方法，使用这些病毒生产疫苗的方法以及含有这些病毒的疫苗。本发明也涉及用于将重组病毒插入基因组中的转移序列，以及携带这些序列的质粒。
产生家禽天花的病毒，或禽痘病毒（FPV）属于痘病毒科的禽痘属。
禽痘病毒有典型的痘病毒特征。这些病毒是大型病毒，其基因组是约300kb的线性双链DNA且其单链末端共价连接。已将基因组的约20kb定序，特别是末端颠倒重复序列（TIR）（Campbell等人，1989，Tomley等人，1988）。末端颠倒重复序列是以反向定位于每一基因组末端的两个相同长度的序列。
牛痘病毒或牛痘是第一种发展成为能够表达外源蛋白的活重组病毒的痘。被表达的蛋白质种类很多。尤其是，已经能够表达许多外源抗原，从而获得抗各种疾病的免疫作用。
使用禽痘病毒作为载体表达异源蛋白以用于制备疫苗的目的，也就是说在重组病毒染色体组的非编码区内整合一个编码异源蛋白的DNA序列的重组病毒的使用。已经在欧洲专利申请：0，314，569中提出;上述非编码区是位于开放式阅读框架（ORF）ORF7和ORF9之间的32个核苷酸的短序列，并已通过遗传操作将该区域放在一非必需的插入位点。在上述短基因间区域中，这种插入具有从其基因分离转录信号，结果诱导一个使该基因失活的突变的高度危险性。这能说明这种情况：的确，32核苷酸序列看起来是必需的区域，因为为了避免在ORF9的启动子和ORF7的3′编码序列间的可能重叠，已经将32-核苷酸序列延长到55个核苷酸。对于分隔ORF9和ORF7的该区域的情况，插入物进入天然序列中况且是不稳定的（Spehner等人，1990），必需对它进行安排。进一步说，已提出的安排短基因间区域的方法不可能得到推广。
此外，构建重组禽痘病毒和特点在于有外源DNA插入到胸苷激酶基因的其它重组禽痘病毒的方法已在国际专利申请WO88/02022中申请。这种插入在基因中产生一个能减弱病毒传染性的突变。这存在使菌株过量减毒和使从重组病毒中得到的疫苗的免疫原性降低的危险。
此外，使用重组禽痘病毒作为载体表达异源蛋白已经在欧洲专利申请0，353，851中提出。在定位于末端颠倒重复序列（TIR）中的阅读框架中完成了将外源基因插入到病毒基因组中。将一种或更多的外源基因插入到阅读框架中存在一种导致基因突变的危险，这种突变的功能是未知的。
本发明提供用于将一种或多种外源基因插入到病毒基因组中的其它区域，这些区域不再有前面所述插入区的缺点。
就这方面而论，本发明涉及从一个禽痘病毒的减毒菌株中得到的一个重组禽痘病毒，并且该重组病毒在其基因组的非必需部分至少含有一种与禽痘病毒异源的编码整个或部分蛋白质的DNA序列以及含有能够确保在所说重组病毒感染的细胞内表达该蛋白的因子，和由一个禽痘病毒的非编码基因间区域，一个位于两个开放式阅读框架之间的包含它们的表达信号的区域组成的基因组的非必需部分。
禽痘病毒基因组的非必需部分是指一个可以经修饰而不影响病毒在体外和体内发育所涉及的功能的区域。选择位于两个ORFs间的，包括其表达信号的，基因组的非编码基因间区域作为非必需部分。
本发明的基因间区域是大的，因而插入物分隔开其相应基因的转录信号的危险性最小并且也不必安排这些区域。此外，这些基因间区域序列是非编码的，因此没有在ORF中产生突变的危险。一个大区域是指含有60以上核苷酸序列的区域。通常选择有100个以上核苷酸序列的区域。优选地是选择有200以上核苷酸序列的区域。在特别优选的方法中，选择有400以上核苷酸序列的区域。
此外，通常选择至少克隆一个DNA序列的，位于禽痘病毒的两个TIR区域之一内的一个基因间区域。正常地，至少将一个DNA序列克隆在至少是禽痘病毒两个TIR区域中的一个中。优选地，至少将一个DNA序列克隆到病毒的两个TIR区域中。更优选地选择称作β1区域的基因间区域，和/或称作β2区域的基因间区域，称作β1区的基因间区域定位在1675和2165核苷酸之间，称作β2区的基因间区域位于2672和3605核苷酸之间，两者作为启始核苷酸BamHⅠ限制位点位于TIRs中。在此所用的BamHⅠ限制位点定位在基因间区域，是由Tomley等人，1988公开的第一种核苷酸序列。关于本发明的这些区域也定义如下：称作β1区的基因间区域位于开放阅读框架ORF1和ORF2之间，开放阅读框架ORF1位于416位核苷酸（ATG的A核苷酸）和1674位（终止密码子的第三个核苷酸）之间，开放阅读框架ORF2位于2166位核苷酸（ATG的A核苷酸）和2671位（终止密码子的第三个核苷酸）之间，该区域作为TIRs中BamHⅠ限制位点的启始核苷酸，称作β2区的基因间区域位于开放阅读框架ORF2和ORF3之间，开放阅读框架ORF2位于2166核苷酸-ATG的A核苷酸和2671-终止密码子的第三个核苷酸之间，开放阅读框架ORF3位于3606核苷酸-终止密码子的第三个核苷酸和4055-ATG的A核苷酸之间，该区域作为TIRs中BamHⅠ限制位点的启始核苷酸。在特别优选的方法中，在β1区中选择其位于1775核苷酸和2065核苷酸之间的部分，在β2区中选择其位于核苷酸2772和3505之间部分。通过在位于β1区域内的称为β1插入位点的1842位核苷酸上，和/或在位于β2区域内的称为B2插入位点的3062位核苷酸上进行克隆已获得了满意结果。
当将至少一个DNA序列克隆到β2区，该β2区在禽痘病毒的两个TIR区中的一个内，即可获得好结果。当将一个DNA序列克隆到在两个TIRs的每个β1区时，也可获得好结果。由于可能获得每个基因组2个拷贝的异源DNA序列，所以这也代表了本发明的另一优点。
从一种减毒的禽痘病毒菌株得到的重组禽痘病毒是指一种属于禽痘属的病毒，该重组病毒被减毒并且其基因组含有一个带表达信号的异源序列。通常，将禽痘属的病毒如禽痘，鸽痘或金丝雀痘用作病毒。正常地，将禽痘用作病毒。优选地，将鸡天花病毒或禽痘的疫苗菌株，如商标为POXINE由SOLVAY公司生产和注册的疫苗或商标为CHICK-N-POX，POULVAC CHICK-N-POX，CHICK-N-POX TC，POULVAC CHICK-N-POX TC，POULVAC POXINE和POULVAC P，由SOLVAY公司生产和注册的疫苗用作禽痘病毒。在特别优选的方法中，将由SOLVAY注册的商标为CHICK-N-POX，POULVAC CHICK-N-POX，CHICK-N-POX TC，POULVAC CHICK-N-POX TC，POULVAC POXINE和POULAVCP的疫苗缩写为CNP用作禽痘病毒。
如果病毒已适应培养的细胞，通过在胚胎上连续传代培养或通过在细胞培养物上传代培养获得减毒作用。
能够保证编码异源蛋白的基因在由所述的重组病毒感染的细胞中表达的因子是指遗传表达信号，这些因子是病毒识别，特别是指启动子和终止区，这些因子是本领域专业人员熟知的，例如，特别是由Moss，1990描述的。通常用一个痘启动子。标准的是用牛痘或禽痘启动子。优选地，是用来自牛痘的启动子P11和启动子P7.5，由Venkatesan等人，1981，Cochran等人，1985和Bertholet等人，1985描述。
至少一种编码全部或部分相对于禽痘病毒是异源的一种蛋白质的DNA序列是指任何带有表达信号的从基因组提取的DNA片段，或一种cDNA拷贝或选择的一种合成DNA，并且该片段的序列编码整个或部分相对于禽痘病毒是异源的一种蛋白质。
为了对本发明作更好地说明绘制了图1到11。
图1表示重组禽痘的构建，选自Mackett等人，1984。用转移质粒转染（T：转染）用禽痘病毒（FPV）感染（I：感染）的细胞。该质粒（P）携带一启动子（Pr），启动子的定向允许表达两侧均有病毒DNA序列的相邻异源基因（g）。同源重组（R）发生在细胞质（C）中，在基因侧面序列与病毒基因组一序列之间发生重组。这样导致异源基因插入到病毒基因组中。包装基因组并且产生重组病毒颗粒（VR）。N代表细胞（C）核。
图2：用示意图表示带由长方形表示的右侧TIR（TIR-R）和左侧TIR（TIR-L）以及带有用直线表示的特有的序列的禽痘基因组末端。虚线表示基因组的中间区域。TIR-L的EcoR1限制性片段是6.2kb，同样TIR-R的该片段是9.0kb。这样的图说明这两个片段有一共同序列和一个特有序列。指明BamH1位点位于TIRs中的EcoR1的下游。
图3表示质粒pTIRB1（PTIRB1）中一些特有位点以及ORFs的位置的限制图谱。用特定BamH1位点克隆异源基因。ori（ORI）：大肠杆菌（E.coli）中该质粒的复制起点;Ap：氨苄青霉素抗性基因;ORF1到ORF6：禽痘的开放阅读框架。
图4代表一个与图3相似的图，但是有关质粒pTIRB2（PTIRB2）的。
图5表示质粒p11Lac（P11LAC）的限制图谱。该质粒携带在牛痘启动子p11控制下的E.coli LacZ基因。p11：牛痘启动子p11;LACZ：β-半乳糖苷酶编码基因;ori：在E.coli中的复制起点;链+：包装在噬菌体M13中的链;Ap：氨苄青霉素抗性基因。
图6表示一个将LacZ基因转移到TIRs中的载体的实例。此载体是pTIRB1P75Lac（PTIRB1P75LAC）。以顺时针方向将P7.5-LacZ盒克隆到pTIRB1的BamH1位点。P7.5：牛痘启动子P7.5。
图7是LacZ基因（由阴影长方形表示）插入到CNP基因组的示意图。P7.5-LacZ和P11-LacZ盒以任一定向插入到末端区域（TIR）。没表示右TIR区。箭头表示由长方形表示的基因的转录方向，比例不精确。
图8：表示来自IBDV的片段A，引物的位置以及由反向转录和通过扩增来自Edgar菌株的片段A的RNA而得到的各种片段。
A：ORFs的构造
P：用于完成片段A扩增的“引物”。
＞，＜：与片段A编码序列相应的“引物”的方向。
fgtPCR：通过扩增片段A的RNA而产生的片段。
pb：碱基对。
图9（图9a到图9e）表示与来自Edgar菌株的片段A的RNA相对应的扩增的DNA核苷酸序列以及将ORFs1，2和3翻译成的氨基酸。引物0、1、1b、2、3、4、5和6：指通过反转录以及扩增反应生产与来自Edgar菌株的片段A相对应的DNA片段时的所用的引物。
图10：表示使用通过反转录和扩增作用获得的片段重新构建与来自Edgar菌株的片段A相对应的DNA片段的示意图。＊：位点特异性诱变。
图11：表示质粒pTIR75E1LAC（PTIR75E1LAC）的限制图谱。
用粗线表示的质粒部分对应于与FPV基因组同源的序列。ori（ORI）：质粒在E.coli中的复制起点;Ap：氨苄青霉素抗性基因;P7.5：牛痘启动子P7.5;ORF1-IBDV：来自Edgar菌株的片段A的ORF1;P11：牛痘启动子P11;LACZ：β-半乳糖苷酶编码基因;pb：碱基对;ORF1到ORF6：禽痘的开放阅读框架。
图12表示通过ELISA试验测得在FPV/IBDV重组体中表达的IBDV蛋白的特征。该特征按如下方法测定：每孔放50μl细胞上清液以及这些上清液的2倍连续稀释液。培养第二抗IBDV抗体（单克隆抗-VP3或抗-VP2）后，通过用与碱性磷酸酶共轭的生物素+抗生蛋白链菌素标记的鼠抗IgG系统将信号放大。
图12A相应于用抗-VP3单克隆抗体的检测结果。
图12B相应于用抗-VP2单克隆抗体的检测结果。
在这些图中，X轴以对数单位表示细胞提取物的2倍连续稀释液，Y轴表示在690nm和405nm处测得的吸收率。
图13表示通过Western印迹分析测得的在FPV/IBDV重组体中表达的IBDV蛋白的特征。该特征按如下方法测定：以3，000g离心细胞悬浮液并在185，000g超速离心获得的上清液;收集从两次离心得到的沉淀，并在PBS缓冲液（磷酸缓冲的盐水，Gibco）中重新悬浮。在SDS-丙烯酰胺凝胶上，每孔放20到40μg的FPV/IBDV重组体蛋白和5μg的IBDV感染细胞（阳性对照）。在转移到膜上后，借助能识别全部IBDV蛋白的多克隆血清检测IBDV蛋白，见图13B。通过用生物素和抗生蛋白链菌素-碱性磷酸酶共轭物标记的抗-IgG系统完成信号放大。PM：分子量标记蛋白。
在图1中图解表示出完成本发明所用的方法（根据Mackett等人，1984的方法进行修改）。用一转移质粒转染用鸡痘或禽痘感染的细胞。该质粒携带一正确定向的启动子，以便允许表达两侧均有病毒DNA序列的相邻的异源基因。在基因侧面序列与病毒基因组的序列间，在细胞质中发生同源重组。从而导致将异源基因插入到病毒基因组中。包装该基因组并产生重组病毒颗粒。已经发展了牛痘的通过痘感染细胞然后使用一质粒进行转移插入的技术以及该技术通常在许多实验室中用于构建重组痘病毒（Mackett等人，1985）。
关于本发明的方法通常含有下列步骤：
-第一步的关键是构建可筛选的转移质粒，
-第二步的关键是将编码异源抗原的基因克隆到转移质粒中。
-第三步的关键是构建重组体禽痘病毒和
-第四步的关键是用重组病毒进行接种试验。
优选的是，本方法含如下步骤：
a：构建可筛选的转移质粒：
-克隆携带TIR的片段。
-将克隆位点插入到TIRs。
-克隆牛痘启动子P11和P7.5。
-构建携带LacZ基因和P11或P7.5下游序列的盒。
-将P11LacZ或P7.5LacZ克隆到TIR-转移质粒中。
b：构建重组体CNP病毒（LacZ基因用于完成初步试验）：
-用CNP病毒和转移质粒转染QT35细胞。
-通过表达LacZ基因筛选并接着纯化重组体。
-分析重组体基因组和LacZ的表达。
c：接种试验：
-用重组体病毒接种鸡并通过LacZ重组体病毒得到抗家禽天花痘的保护作用。
d.将编码异源抗原（异源蛋白）的基因克隆到转移质粒中：
-克隆P11或P7.5下游的编码异源抗原的基因。
-将P11-抗原和P7.5-LacZ或P7.5-抗原和P11-LacZ盒克隆到质粒TIR中。
e.构建重组体CNP病毒：
-用CNP病毒和转移质粒转染QT35细胞。
-根据LacZ基因的表达筛选并随后纯化重组体病毒。
-分析在细胞培养基中表达的抗原并分析重组体病毒的基因组。
f.接种：
-用重组体CNP病毒接种。
-估算通过表达异源抗原抗CNP的保护水平。
本发明也涉及能够将异源DNA插入到上述禽痘病毒基因组，特别是插入到B1或B2位点的转移序列。本发明也涉及携带这些序列的质粒。转移质粒是指一种含有受禽痘识别的启动子影响的异源基因的质粒，该异源基因的两侧均有，位于B1位点的两侧或B2位点的两侧的序列。与FPV同源并在异源基因侧面的这些序列的长度应足够长，以便可在异源基因的左、右发生重组。通常，选择至少1kb长的序列。对于B1，在其上游侧面有一个约1850个核苷酸的序列，在其下游侧面有一个约4321个核苷酸序列，对于B2，其上游侧面有约3070个核苷酸，其下游侧面有3100个核苷酸序列时可获得满意结果。转移质粒在分离重组禽痘病毒，转染预先用禽痘病毒感染的鹌鹑细胞QT35的方法中发挥作用。
本发明也涉及用从减毒禽痘病毒菌株得到的重组体禽痘病毒感染的真核细胞培养物并含有：在禽痘病毒基因组的非必需部分至少有一个编码全部或部分与有关的禽痘病毒异源的蛋白质的DNA序列，以及含有能够保证该蛋白质在用所述重组体病毒感染的细胞中表达的元素，基因组的非必需部分是由位于两个ORFs之间的禽痘病毒的非编码基因间区域组成，包括它们的表达信号。
优选地是使用家禽细胞培养物。通过用鹌鹑细胞培养物已得到好结果。通过用鹌鹑QT35细胞培养物已得到最好的结果，如由Cho（1981）所描述的。
将本发明的重组体禽痘病毒发展作为一种能表达全部或部分异源蛋白的载体。因此本发明也涉及使用本发明的病毒作为一种能表达全部或部分异源蛋白如尤其是抗原的载体。
本发明也涉及一种含从减毒禽痘病毒菌株得到的重组体禽痘病毒的疫苗并在重组体病毒的基因组的非必需部分含有至少一个编码全部或部分与禽痘病毒异源的蛋白质的DNA序列，以及含有能够保证在用所述重组体病毒感染的细胞中表达该蛋白质的元素，基因组的非必需部分由位于两个ORFs之间的禽痘病毒的非编码基因间区域组成，包括它们的表达信号。
异源蛋白是指任何与禽痘病毒异源的蛋白质或蛋白质部分;或一种天然或修饰过的蛋白质。通常，这种蛋白质可以是一种能成为抗病原生物疫苗的抗原。常规地，这些抗原尤其是感染家禽、病毒、细菌、衣原体、支原体，原生动物，真菌和虫的蛋白试剂。
它们特别是指腺病毒科，如引起再生障碍性贫血（AA）和蛋落综合症（EDS）的病毒，Birnaviridae，如感染性囊病病毒（IBDV），冠状病毒科，如感染性支气管炎病毒（IBV），疱疹病毒科，如马立克氏病病毒（MDV）和引起感染性喉气管炎的病毒（ILTV），正粘病毒科，如引起流感的病毒，副粘病毒科，如新城疫病毒（NDV）小核糖核酸病毒科，如引起脑脊髓炎（AE）的病毒，呼肠病毒科，引起腱鞘炎，反录病毒，如引起造淋巴细胞组织增生（L.L）的病毒，引起鸡贫血的病毒（CAV）。
它们特别是指衣原体，如鹦鹉热衣原体（Chlamydia psittaci）。
它们特别是指支原体，如鸡败血支原体和滑液支原体。
它们特别是指细菌，如大肠杆菌，嗜血杆菌属包括引起鼻炎的副鸡嗜血杆菌，包括引起霍乱的多杀巴斯德氏菌的巴斯德氏菌属，包括引起斑疹伤寒的鸡沙门氏菌和鸡瘟沙门氏菌的沙门氏菌属，包括引起肉毒中毒的肉毒梭菌，产气
膜梭菌，和引起皮膜病的败血梭菌，和C.colinum的梭菌属，弯曲菌空肠亚种（Campilobacter jejuni），金黄色葡萄球菌。
它们特别是指原生动物，如引起球虫病的艾美球虫属和引起潜生内孢子虫病的Cryptosporidiosis baileyi。
它们特别是指虫，如绦虫和包括肠道寄生虫的线虫。
它们特别是指如烟曲霉的真菌。
那些感染性囊病病毒（IBDV），感染性支气管炎病毒（IBV），引起鸡贫血的病毒（CAV）引起球虫病的原生动物艾美球虫，新城疫病毒（NDV）和马立克氏病病毒（MDV）是优选的抗原。
感染性囊病病毒（IBDV），感染性支气管炎病毒（IBV），引起鸡贫血的病毒（CAV），和引起球虫病的原生动物艾美球虫是特别优选的抗体。在如下条件下已得到好结果：
-对于IBDV：含有多聚蛋白质和部分多聚蛋白质的整个或部分开放阅读框架。上述蛋白质特别是指VP2，VP3和VP4。也包括其结合物和修饰产物。这些修饰包括例如断裂位点的插入。
-对于IBV：抗原E2。
-对于艾美球虫：天然的表面抗原TA4和已修饰其蛋白断裂位点的表面抗原TA4。
-对于CAV：蛋白质P50。
用IBDV已获得最好的结果，异源蛋白质是多聚蛋白质的部分，该多聚蛋白质包括从氨基酸1到493，493接着1010到1012位，其中包括蛋白质VP2;表示在图9中。
DNA序列可编码完整的蛋白质或者是蛋白质的片段，并可在动物中诱导相应的免疫应答。其它分子，除抗原外，也可以考虑进去，包括生长因子和免疫调整试剂如白细胞介素。本发明也涉及在体内，在家禽中生产对动物新陈代谢起作用的因子。如生长激素或生长激素诱导因子。本发明也涉及在体外细胞培养物中制备蛋白质或肽或者在动物中体内制备蛋白质或肽。根据所诱导的异源蛋白质，它尤其适用于，作为酶，营养物质或，在人或动物健康方面，作为适于人或兽使用的药用产物。
此外，将几个基因克隆到同一基因组，同一位点或不同区域或位点，可产生携带数个异源基因的多重组体病毒。通过结合不同的重组病毒也可以产生多价产物。
本发明禽痘病毒的动物靶目标是鸟，特别是家禽，也可以在家禽的其它种中使用该重组病毒。
本发明的疫苗可以本领域专业人员熟知的各种形式给药。常规地，将疫苗放在饲料或饮用水中口服，通过鼻内途径，皮下注射，气雾剂，肌肉注射或根据所谓“翼网状”方法刺穿翅膀给药。优选地，将疫苗通过根据所谓的“翼网状”方法刺穿翅膀膜，或肌肉内注射或皮下注射给药。
本发明疫苗以本领域专业人员熟知的方法配制。常规地，疫苗组合物包含适合于疫苗给药形式的稳定剂，它可以冻干形式保存。
本发明将通过下列实施例进行说明。
实施例1-CNP病毒和其DNA的纯化
如禽痘病毒，将商标为POULVAC CHICK-N-POX，CHICK-N-POX，CHICK-N-POX TC，POULVAC CHICK -N-POX TC（CNP）由Solvay公司出售的疫苗菌株作为减毒活疫苗。在鸡旦上将野生菌株传递数代得到起始原种并且通过在CEF（鸡胚成纤维细胞）上传递2代并在由Cho（1981）描述的鹌鹑细胞系QT35上传递5代以使其适应体外细胞。可以从分离和区分它的Dr.Moscovici（6816 Northwest 18 th Avenue，Gainesville Florida 32605，United states）得到鹌鹑QT35细胞系。
在含有其培养基为E199（Gibco，500ml），F12（Gibco.500ml），LAH（Gibco，乳清蛋白水解产物，25ml），FCS（Gibco胎牛血清，25ml）和果糖（5ml浓度为200g/l的溶液）组成的QT35细胞系上培养CNP，于38℃在3%的CO2中保温培养。正常的多重感染（moi）是每细胞0.01病毒，80%的细胞会聚在一起。
病毒菌株按如下纯化：将用禽痘病毒感染并置于PBS磷酸缓冲液（磷酸缓冲的盐水，Gibco）中的细胞，在6，000g离心（15分钟）。将沉淀重新悬浮在Tris（pH9，1mM）中，胰酶消化（胰蛋白酶的最后浓度为0.25mg/ml，Gibco）并超声处理。将材料置于36%（重量/体积）的蔗糖层上并在30，000g离心45分钟。取出沉淀放在1mM Tris，pH9.0中。最后，在40，000g将病毒离心30分钟。将沉淀放在裂解缓冲液中：10mM Tris-HCl，pH8.0，10mM EDTA，1%SDS（十二烷基磺酸钠），500μg/ml蛋白酶K（Boehringer），0.1mg/ml RNA酶（Boehringer）并于37℃保温培养2小时。用乙醇沉淀酚提取的DNA。从40个感染的150-cm2广口瓶中纯化出约20μg的DNA。
实施例2-构建CNP的EcoR1基因文库和BamH1基因文库
所用的遗传技术由Maniatis等人，1982描述。由Pharmacia，Boehringer和Biolabs公司提供限制酶、聚合酶、连接酶和磷酸酶。由Eurogentec公司提供合成的DNAs。
将病毒DNA的EcoR1或BamH1限制片段连接到由Messing（1983）描述的pUC18载体中，并导入到细菌E.coliMC1061（araD139，（ara，Leu）7697，lacX74、galU、galK、hsdR、strA，由Pharmacia公司出售）中。将两种基因文库以转化细胞的两种悬浮液的形式于-70℃贮存在甘油中。24%的质粒含插入序列。根据其大小和Bg12或HinF1的限制性切割形式，区分出17个BamH1片段和45个EcoR1片段。插入序列的大小是0.5到15kb;因此BamH1插入序列的量是82kb，EcoR1片段的量是210kb。禽痘基因组的大小接近300kb（Coupar等人，1990）。因此对全部基因组来说分离的25%的片段表示是BamH1的，70%的片段是EcoR1的。
实施例3-克隆携带TIR的片段
末端颠倒重复序列（TIR）是两个以相反方向位于痘基因组末端的相同序列。已经公开（Campbell等人，1989和Tomley等人，1988）了一个在禽痘HP菌株基因组一个末端的大于17kb的序列。它含有约10kb的重复序列和7.0kb的相邻序列。
完成TIR EcoR1片段的克隆。该重复序列含一个EcoR1位点。如在图2所示，克隆了两个EcoR1片段：每片段携带部分TIR和一特有的相邻序列。这个特有序列由距TIRs最近的EcoR1位点分界。借助一个与位于重复部分的序列互补的寡核苷酸分离这两个片段。第一个片段的大小是6.2kb，按照惯例，叫作TIR-L。第二片段的大小是9.0kb，按照惯例，指TIR-R。CNP的TIR-L EcoR1片段序列与公开的一个序列相同。
TIR和通过比较TIR-L和TIR-R序列推导出的特定序列之间的接点位于4007位核苷酸，即由Tomley等人（1988）公开的序列的BamHⅠ位点，以此作为核苷酸序号1。该接点位于由这些作者称为ORF3的开放式阅读框架中。
实施例4-通过位点特异性诱变在TIR中创制。BamHⅠ位点
从TIRs的核苷酸序列分析推导出开放阅读框架（ORF）。特别是，ORF1位于核苷酸416和1674之间，ORF2位于核苷酸2166和2671之间以及，最后，ORF3位于核苷酸3606和4055之间，并在互补链上编码。TIRs的BamHⅠ位点的第一个核苷酸G作为No.1核苷酸。将这些ORFs分成两个大非编码基因间序列，一方面是ORF1和ORF2之间的β1区域，另一方面是ORF2和ORF3之间的β2区域这些是选作插入区域的两个基因间区域。
在β1和β2中通过位点特异性诱变（生物放射突变盒）引入一特有的克隆位点。选择BamH1位点作为克隆位点，因为该位点与其他的Bcl1和Bgl2限制性位点相一致。将克隆位点大约定位在每一基因间区域的中部以避免任何将转录信号与它们相应的基因分隔的危险，就是说：
-在β1区域中：位点B1是序列5′GAT C3′，在1842核苷酸上，通过在5′端插入G并在3′端插入C而将B1位点转化成BamH1 GGATCC;
-在β2区域中：位点B2的序列是5′GGATT3′，在3062位核苷酸上，通过将第二个T突变为CC而将B2位点转化成BamH1位点。
在携带TIR-L片段的质粒中，有两个BamH1位点（实施例3）。一个位点是从载体pUC18得到的。第二个位点是从TIR得到的并位于用于克隆的EcoR1位点下游的71位核苷酸（Campbell等人，1989;图2）。通过BamH1限制，随后用Klenow聚合酶填充并连接而从携带TIR-L的质粒上缺失这两个BamH1位点。从而得到pTIR1质粒。
为了在B1中产生BamH1位点，将0.9kb的pTIR1的HindⅡ片段克隆到由Stratagene公司出售的pBSPlus载体中。突变引物是：5′TTTCGAAAGACTTTGGATCCGTAGTATAATATTATA 3′。就是说，粗线表示的核苷酸GGATCC是由BamH1识别的序列。
为了在B2中产生BamH1位点，将1.7kbpTIR1的XbaⅠ片段克隆到p BSPLus中。引物是：5′TATATCACGGGATCCAAAAGGTTATTAGTAGTC 3′。就是说，粗线表示的核苷酸GGATCC是由BamH1识别的序列。
将每一突变片段再插入到pTIR1中就是连接的结果：
-对B1：pTIR1的Hind 3-Scal（1491bp）+突变后pBSPlus的Scal-Aat2（485bp）+pTIR1的Aat2-EcoR1（4220bp）+pTIR1的EcoR1-Hind3（2635bp）;
-对B2：pTIR1的Xho1-Spl1（8512bp）+突变后pBSPlus的Spl1-Xho1（318bp）。
这两个连接产生载体pTIRB1和pTIRB2。图3和4是它们的限制图谱。
从质粒pTIR1上，通过缺失它的2657-bp的EcoR1
-Hpal片段产生质粒pTIRB1D。
实施例5-克隆牛痘启动子p11和p7.5
p11和P7.5是已知的牛痘启动子。p11是编码蛋白质p11的基因启动子，蛋白质p11是在病毒感染的后期翻译出的。p7.5是编码蛋白质p7.5的基因的启动子，蛋白质p7.5是在即早期和晚期翻译出的。
构建有特有的Bgl2和Bcl1位点的载体
构建含特有的Bgl2，Bcl1和BamH 1位点的两个克隆载体以便可连续克隆与BamH 1相容的盒。通过克隆下列合成DNA将Bgl2和Bcl1位点序列导入pBSPlus的BamH 1位点：
Bg12 Bc11 BamH1
5' GATCGAGATCTTGATCAG 3'
3' CTCTAGAACTAGTCCTAG 5'
载体是pBSLK1和pBSLK2。连接子的方向是：
pBSLK1……Ava1/Sma1-BamH1-Bcl1-Bgl2-Xba1……
pBSLK2……Ava1/Sma1-Bgl2-Bcl1-BamH1-Xba1……
克隆启动子p7.5
质粒pGS20的143bp长的Bcl1-BamH1片段含p7.5启动子序列（Mackett等人，1984）。该序列列于下文中（Venkatesan et al.，1981;Cochran et al.，1985）。下面划线的是后期和即早期启动子。最后的BamH1碱基是在从基因的起始子ATG开始的10bp。
将Bcl1-BamH1片段克隆到质粒pBSLK1和pBSLK2的Bcl1和BamH1位点，相应地产生p1p75和p2p75质粒。为了允许Bcl1进行消化，从JM110菌株提取pBSLK1和pBSLK2，该菌株可从ATCC（美国典型培养物收集中心）得到，保藏号为ATCC47013。
克隆启动子p11
使用从Bertholet等人，1985得到的序列资料，克隆合成DNA形式的启动子p11的序列。Hanggi等人，（1986）已知道一个在mRNA的第一个核苷酸上游的30-核苷酸片段含有该启动子。
该合成DNA是一个在其末端携带Bgl2和BamH1位点的40-聚体片段。为了得到p1P11和p2P11，将该DNA分别克隆到pBSLK1和pBSLK2中。随后，将p2P11的Bgl2-BamH1片段克隆到pACYC184的Xho2-BamH1位点。pACYC184是一个由Chang和Cohen（1978）描述过的载体。连接Xho2（GGATCT）和Bgl2（AGATCT）重新得到Bgl2。
P11携带的合成DNA的序列是：
5' GATCAAATTTCATTTTGTTTTTTTCTATGCTATAAATAAG
3' TTTAAAGTAAAACAAAAAAAGATACGATATTTATTCCTAG
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Bgl2 BamH1
实施例6-构建一个与BamH1限制位点相容的携带LacZ基因的盒
根据LacZ基因的表达可以筛选重组体病毒。通过位点特异性诱变构建携带LacZ基因的Bgl2-BamH1盒。将该盒克隆到缺失LacZα片段的pBSPlus质粒（stratagene）中，缺失LacZα片段是为了避免两个同源序列，一个有LacZ，另一个有LacZα之间发生重组。这个质粒是pBSMutLacZ1。下面给出突变后LacZ基因末端的序列。其编号与天然蛋白质中氨基酸的编号相对应。
En 5',
Bgl2 Nco1 8 9 10
... AGATCTCACC ATG GCC GTC GTT ...
Met Ala Val Val
<-1 β-gal -
En 3',
... CAA AAA TAA TAA TAA CCGGGCAGG GGGGATCC ...
... Gln Lys *** *** ***
_>
实施例7-克隆在启动子P7.5或P11后面的LacZ基因
为了相应地得到p75 Lac和p11 Lac，将pBSMutLacZ1盒，LacZ，Bgl2-BamH1分别克隆到p2P75和p2P11的Bgl2-BamH1位点。当将LacZ基因定位于启动子P7.5或P11后面时，可在E.coli中获得该基因的表达。转化体菌落在含X-Gal（染色底物：5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃半乳糖苷）的培养基上呈兰色，X-Gal在β-半乳糖苷酶的作用下呈现兰色。这一试验证明该基因是起作用的。将p11 Lac盒以质粒p11 Lac的Bgl2-Hind3片段的形式克隆到pACYC184的Xho2和Hind3位点，从而得到pACP11Lacp11Lac的图谱在图5。
实施例8-将p75Lac和p11Lac盒克隆到质粒pTIRB1和pTIRB2中
p11Lac（或pACP11Lac）的Bgl2-BamH1片段和p75Lac的Bgl2-BamH1片段携带“跟随有LacZ基因的启动子P7.5或P11”的盒（实施例7）。将这些片段以两个可能的方向克隆到pTIRB1和pTIRB2（实施例4）的BamH1位点，使用LacZ表现型进行筛选。在8个可能的重组体中分离6个质粒。下面给出它们的标号。让我们假设“+”方向是从ORF1到ORF2或ORF2到ORF3的方向转录LacZ基因，相应的反方向就是“-”方向。在质粒的名字中，“p75Lac”和“p11Lac”是指盒是+方向的，而“LacP75”和“LacP11”是指盒是“-”方向。作为举例，图6是质粒pTIRB1P75Lac的图谱。
实施例9-转移和筛选条件的最佳方案和分离CNP-LacZ重组病毒
在图1中表示了构建重组体CNP病毒的原理。转移过程如下：
在天数D＝1时，在每25-cm2的广口瓶中，将2.5×106QT35细胞接种到5ml的生长培养基中（在实施例1中描述的组合物）。
在天数D＝2时，完成下列转移：
病毒：1ml小瓶的冻干CNP疫苗与3ml的无菌Milli Q水再水合并在-70℃保存。将此病毒材料融化并经1分钟温和地超声处理。然后在E119-F 12标记的培养基中稀释以完成在2ml的培养基中每细胞0.05病毒的多重感染，该培养基与实施例1中描述的E119培养基相对应，只是没有LAH或血清或果糖。用病毒悬浮液代替培养基并在38℃保温培养2小时。
质粒：将20μg的质粒与400μl水和100μl的1.25M CaCl2混合，将500μl的2×BBS缓冲液（硬脂酸丁氧乙酯缓冲盐）（50mM的BES（Sigma），280mM NaCl，1.5mM Na2HPO4;pH7.0）一滴一滴加入，然后将混合物在25℃保温培养15到30分钟。除去培养基后，将1ml的质粒制剂加入到细胞中。然后在38℃将混合物保温培养30分钟。然后加入用5%FCS和15mM Hepes（Sigma）pH7.2补充的4ml不含LAH的培养基。然后又在38℃将混合物保温培养4小时。用5ml E199标记的生长培养基（在实施例1中描述的组合物）代替上述培养基。
在天数D＝0时，按照实施例1中描述的方法收集病毒细胞。
根据产生的β-半乳糖苷酶进行筛选，在培养皿上通过“噬菌斑检测”试验检测β-半乳糖苷酶。在6-cm培养皿上的过程如下：
在天数D＝1时：将2.5×106细胞接种到5ml的生长培养基中。
在天数D＝2时：用以1∶10和1∶100稀释的1ml病毒感染该培养物，在38℃将混合物保温培养4小时并然后加入4ml的生长培养基（在实施例1中描述的组合物）。
在天数D＝3时：用-5ml的琼脂糖层代替上述培养基。该琼脂糖层由1体积的2%琼脂糖〔见溶解在水中的噬菌斑琼脂糖（FMC）〕和1体积的下列混合物组成：9ml的2×199培养基（Gibco），0.5ml的LAH（Gibco）和0.1ml的Hepes（pH7.2，终浓度为15mM）和1.0ml的FCS。在混合前，将融化的琼脂糖和混合物保持在38℃。然后在室温下将琼脂糖成胶30分钟并且然后在38℃培养。
在天数D＝6时，在培养物上覆盖一层溶于含0.3mg/ml X-Gal（5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃半乳糖苷，Boehringer）的PBS（Gibco）中的2ml 1%琼脂糖，X-Gal以30mg/ml溶于DMSO（二甲基亚砜，Fluka）中。
当天数D＝7时：计算兰色噬菌斑与无色噬菌斑的数目和比例。然后用巴斯德吸管分别转移5个噬菌斑。在-70℃于500μl的生长培养基中保存病毒细胞。
在下列表中写出了每一质粒的重组频率。重组体病毒的符号是V，后面带着转移质粒的序号（如在实施例8中定义的）。重组体百分数是0.1%到0.5%范围，与有关痘病毒文献资料记载相一致。图7中图示了重组体基因组。
兰色/总数＝兰色噬菌斑的数量/噬菌斑总数
%＝兰色噬菌斑的百分率
实施例10-纯化CNP/LacZ重组病毒
在培养皿中连续纯化一个兰色噬菌斑而获得一克隆（如在实施例9中描述）。原则上，当所有的噬菌斑是兰色时，所有的病毒都表达LacZ基因并不再被野生病毒污染。为了达到这种同质性，需要传递3到4代。通过举例的方法，在传代过程中兰色噬菌斑的比例变化如下：
在用重组体病毒V8感染的QT35细胞切片的电子显微镜照片上，清楚地看到其结构是典型的痘病毒结构，特别是有狗骨形状的内部结构。
实施例11-生产大量的各种重组体
在广口瓶中通过3代连续培养扩增6个重组体。第二代的滴定度是每ml4×105到1.1×107TCID50（组织培养感染剂量）。只有V10的滴定度小于104。对滴定度常规在105和107之间的其它重组体，也与野生菌株一样增加。
实施例12-通过“噬菌斑测试”分析插入到TIR中的LacZ基因的稳定性
根据发生的重组类型，插入到病毒基因组中的LacZ基因可以是稳定的或不稳定的（这已由Shuman等人，1989清楚地阐明）。因此，如在插入序列的任一边发生两个重组，则插入的LacZ基因是稳定的。另一方面，一个简单的重组导致整个转移质粒和LacZ的插入。这种病毒得到兰色噬菌斑。但是，病毒基因组以顺向携带同源序列，其重组可导致插入序列的缺失并显出非兰色噬菌斑。
此外，在痘病毒中，在TIR序列中的改变可以在病毒感染和复制循环中转移给其它的TIR。双重组可将LacZ插入到TIR-L中;该病毒的噬菌斑呈兰色。在下列感染期间，在此重组TIR-L和野生TIR-R之间的重组产生TIR-L/LacZ，TIR-L/LacZ-TIR-R/LacZ和WT（野生的）病毒的一个混合群体。另一方面，其它重组可以产生最后一种可能类型，即TIR-R/LacZ。结果，兰色噬菌斑可包含三种类型的病毒：丢失LacZ基因的病毒，携带单一拷贝LacZ基因的病毒和携带两拷贝LacZ基因的病毒。
在液体培养基上（实施例9）经几次连续感染后，使用“噬菌斑检测”测试病毒制剂的同源性。第三代V3、V4、V5、V8、V9和V10病毒的“噬菌斑检测”产生下列兰色比例：
P3和P6＝第3代和第6代的病毒。
兰色/总数＝兰色噬菌斑数/噬菌斑总数
%＝兰色噬菌斑的百分数
-＝没有检测
结论：制备的重组体V8和V9病毒是同质的。重组体V8稳定到第6代。另一方面，制备的V3、V4和V5不是同质的。它们含5到20%的野生型病毒。这一比例甚至比V10高。
实施例13-通过Southern吸印试验分析CNP/LacZ基因组
通过Southern印迹分析（Maniatis等人，1982）测试病毒制剂的同质性。重组病毒和非重组病毒基因组的限制片段可根据它们的大小区分。
制备病毒DNA的过程如下：
在天数，D＝1时：将2×106QT35细胞接种到含5ml生长培养基的25-cm2广口瓶中，
在天数，D＝2时：以0.01的感染多重性感染细胞。
在天数，D＝5时：使用刮器（Costar）将细胞分离。以6，000g将混合物离心10分钟。向离心沉淀中加入500μl由10mM Tris-Hcl，pH8.0，10mM EDTA，0.1%SDS，0.1mg/ml RNase，0.1mg/ml蛋白酶K组成的裂解缓冲液。将细胞转移到-Eppendorf试管中。搅拌得到的悬浮液并在50℃培养1小时。将液相用苯酚氯仿提取3次。用0.3M乙酸钠和2体积乙醇在-20℃，经15分钟沉淀DNA。以18，300g将混合物离心10分钟。将离心沉淀悬浮在500μl的水中。由此得到的共5μl的DNA悬浮液足以用于Southern印迹分析。
对B1位点：
用EcoR1消化基因组。用EcoR1消化的pTIRB1LacP75质粒是探针。该探针可区分重组体和母体的TIR-L和TIR-R片段。对野生型病毒来说，两片段的大小是9.3和6.2kb，对V3来说，是7.4，5.1（一对之一）和4.4kb，对V8来说是7.4、4.9和4.4kb，并最后，对VP来说是10.4，7.3和2.0kb（一对之一）。病毒V8和V9需要两个拷贝的LacZ基因，在每一TIR中需要一个，并且不含任何母体型的TIR片段。另一方面对病毒V3是这种情况。
由于可以将一拷贝的LacZ克隆到每一TIR中，所以可以得出结论：插入位点B1对于病毒的发育和其在培养细胞中的生长是非必需的。此外，得到的LacZ基因大小约3kb，分离这些双倍重组体，证实，每一CNP病毒的基因组中可插入6kb。
对B2位点：
Southern印迹表明存在重组体TIR-L和TIR-R片段，而且在V4、V5和V10制剂中也存在母体片段。这三种制剂因此不是同质的。
实施例14-可供选择的用于分离B1插入位点中的双重组体的方法
在TIRs中重组体的发育预示在携带野生TIR和重组体TIR的病毒的后代中出现稳定的双重组体。使用培养皿“噬菌斑检测”，或者通过一新的“噬菌体检测”或者在96-孔微滴定盘上从一兰色噬菌斑再分离病毒噬菌体。通过Southern印迹分析或PCR分析每一新噬菌斑的基因组。开发这些不同的可能性。
将从V3的第三代的“噬菌斑检测”中获得的10个不同的兰色噬菌斑病毒基因组进行Southern印迹分析结果表明，对于这10个噬菌斑的病毒基因组，其制剂是同质的并在每一TIRs中含有一个LacZ插入序列。
对微滴定盘试验进行稀释以便每孔有零或1个病毒噬菌斑。通过先前的滴定估计最佳稀释度。通过用50μl的病毒悬浮液感染微滴定盘（200μl/每孔，20ml/每盘）得到好结果，该病毒悬浮液是从培养皿“噬菌体检测”中1ml装载物得到的。当清楚地看到噬菌斑时，保留含噬菌斑的孔，冷冻并融化后，每孔放100μl的培养基。
对PCR，按下列条件快速提取总DNA：以10，000g将混合物离心10分钟，将沉淀放在200μl的裂解缓冲液（10mM Tris-HCl，pH8.0，10mM EDTA，0.1%SDS）中，其中用RNase（0.1mg/ml）和蛋白酶K（0.1mg/ml）补充，并将所得的混合物在50℃培养1小时，然后用苯酚/氯仿提取液相3次。用乙醇从该液相中沉淀DNA。得到的沉淀置于50μl水中。每次PCR使用10μl的该悬浮液，所用的PCR条件是由Perkin Elmer推荐的（Gene Amp DNA扩增试验盒）。在琼脂糖凝胶上分析扩增的片段。
在B1插入位点的两侧序列，相应地该位点的下游和上游与引物5168和5169杂交。它们的序列如下：
序号 5'到3'序列 互补序列
5169 5' CCTTTACTGTTAGTTCTACAATCGAAATTATGC 3' FPV
5168 5' CATGTAGATTTTAATCCGTTAACACGCGCAG 3' FPV
3254 5' GCCGGAAAACCTACCGGATTGATGG 3' LacZ
在野生型TIRs上扩增了一个220-bp片段，对含LacZ基因的重组体TIR，扩增了一个大于3kb的片段。为了检测LacZ基因，第二次扩增反应使用B1位点下游的引物5168和LacZ基因中的引物3254进行。扩增一个674-bp片段。因选择适宜的引物可以区别重组TIRs和非重组TIRs。如果不扩增WT（野生）片段，可以认为病毒悬浮液是同质的，双重组体。对照是WT病毒的基因组，质粒pTIRB1和pTIRB1Lac的。
引物 野生型片段 重组片段
5169+5168 220bp 3kb
3254+5168 -- 674bp
-＝未扩增片段。
实施例15-通过CNP/LacZ重组病毒在组织培养基中表达LacZ基因
用O-硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷（ONPG）作为底物检测β-半乳糖苷酶（β-gal）活性。该酶将ONPG转化成半乳糖和呈黄色的O-硝基苯酚并以在420nm的吸收值定量。使用根据“1βGgal单位＝生产1μmol ONP/3×106细胞/在28℃提取物培养60分钟”标准的校对曲线，将该吸收值转化成β-gal单位。
该“β-gal”试验按如下完成，用一表面积为25cm2的广口瓶。可以区分痘病毒感染的即早期和晚期。最短的是即早期，约持续6小时。在基因组复制时结束。晚期是从复制开始并在释放病毒颗粒的感染循环末期结束，这就是说3天后。为在即早期使LacZ充分表达，使用一种复制抑制剂胞密啶β-D-呋喃阿糖苷（AraC）人为地延长即早期。
a.细胞
在天数D＝1时，在每个含5ml生长培养期的广口瓶中，接种3×106QT35细胞。
在天数D＝2时：以每细胞3个病毒的多重感染感染细胞。在38℃将混合物培养1小时。用移液管转移病毒接种物。在每个广口瓶中加入5ml用或不用40μg/ml AraC（Sigma）补充的维持培养基。培养物在38℃培养16小时。
b.在天数D＝3时收集
从广口瓶中刮出细胞
以6，000g将培养物离心10分钟。在500μl的PBS中再悬浮离心后的沉淀，将该悬浮液混合并将其转移到1.4ml的Eppendorf试管中。
然后通过加入50μl的CHCl3和5μl的10%SDS裂解细胞。简短地混合细胞悬浮液。在9，000g将该悬浮液离心5分钟。
c.酶反应：
按如下方法制备25份样品的ONPG底物：27.7mg的ONPG（Sigma）和50ml由1ml0.1M MgSO4和1ml 2-巯基乙醇（Merck）组成的稀释液，用缓冲液（90ml 0.1M NaHPO4，pH7.0，0.1M MgSO4，1ml巯基乙醇）配制成终体积为100ml。
将1.95ml的ONPG溶液和50μl的细胞悬浮液混合，并在28℃将混合物培养1小时。在该悬浮液中加入2ml 1M的Na2CO3并在420nm测该悬浮液的吸收值。
下面以β-gal单位给出重组病毒β-gal活性比较：
wt＝非重组野生型
即早期（AraC）＝用AraC将即早期生长期人为地延长16小时
即早期+晚期（-AraC）＝未用AraC的天然即早期和晚期
Abs＝吸收值
μ β-gal＝测得的β-半乳糖苷酶单位
1∶5和1∶10＝预先的5-倍和10-倍提取物稀释液。
在感染的即早期和晚期（V3、V4和V5）牛痘启动子P7.5有功能;启动子p11只有晚期活性（V8和V9）;在牛痘中，启动子p11比p7.5更强。与两个启动子的相对强度一样，暂时调节因此也保存在CNP病毒中，要么插入到B1或B2中，要么该插入是在LacZ位点。
实施例16-用CNP/LacZ重组病毒给鸡接种。防止家禽天花。抗β-gal的免疫应答
测试CNP/LacZ重组体的接种强度。所选择用于测试的两个准则是防备家禽天花并且是抗β-半乳糖苷酶的免疫应答。
a.通过刺穿翅膀给药：
重组体病毒V4和V8的悬浮液或牛痘CNP菌株的悬浮液通过刺穿翅膀膜（称为翅膀网状物法，即WW）的方式给1天龄的鸡注射，以证明其无特异病原体（SPF）。
试验以28-30只鸡的三个组进行，给它们接种V4或V8或者CNP，并以一组15只未接种的鸡作为阴性对照。
每只鸡接种10μl悬浮液，该悬浮液每毫升含病毒5×105TCID50（组织培养物感染剂量），即每只鸡接种5×103TCID50。在第29天，将这些鸡与毒性病毒（从美国Aphis获得的家禽天花攻击病毒菌株）接触。
于10天后评估无损伤出现表明，所有接种过的鸡对家禽天花均具防备性。另一方面未接种的鸡有一半受到伤害。通过直接ELISA试验分析抗β-半乳糖苷酶的抗体效价表明，用V4病毒接种的29只鸡中有21只（72%），用V8病毒接种的28只鸡中有20只（71%）出现血清转化现象，这就是说是血清阳性的。
该ELISA效价系最后稀释度，其具有大于100的光密度，在这些鸡的血清中，平均抗β-半乳糖苷酶ELISA效价是1∶800。
b.经肌内和皮下途经给药
在第一天用10 4.4 TCID50的V8病毒通过肌肉注射途径（IM，27只鸡）或皮下注射途径（SC，34只鸡）给一天龄的鸡接种。在27天后将它们进行免疫性试验。它们均受到保护，免患家禽天花（100%）。通过IM途径接种的鸡27只中有24只（88%），而通过SC途径接种的34只鸡中有27只（79%）出现抗β-半乳糖苷酶的血清转化现象。
就此作出结论，免疫作用结果表明：
-在其基因组TIR区域，在B1或B2位点含LacZ基因的重组病毒保留其致免疫性;
-在动物中p7.5和p11启动子起作用;
-诱导出对抗β-半乳糖苷酶的抗体应答，在此它被考虑为由CNP重组体表达的异源蛋白;
-无论就对家禽天花的防备作用来说，还是抗β-半乳糖苷酶的血清转化百分率来看，肌内注射（IM），皮下注射（SC）和翅膀膜穿刺（WW）这几种给药途径均具相等效果。
实施例17-将编码家禽支气管炎病毒的糖蛋白E2的基因插入传递载体
引起传染性家禽支气管炎的病毒（IBV）系冠状病毒。这种病毒的最重要的表面抗原是蛋白E2，蛋白E2由两个亚基S1和S2组成（Cavanagh，1983，Cavanagh等1988）。存在许多种血清型，包括Massachusetts，以M41表示，以及Dutch血清型，具体的如D1466和D274（Kusters等人，1987）。
制备表达IBV E2蛋白的重组CNP疫苗，以便获得抗引起传染性家禽支气管炎的病毒（IBV）的有效疫苗。
血清型M41的蛋白E2的基因以及血清型D1466，D207和D274的E2基因的大片段均从Utrecht大学（NL）的Kusters博士处获得。
血清型M41的E2基因的BamH1暗盒通过特定位点诱变来构建。菌株D1466的完整基因和完整杂交基因D207/D274从也位于暗盒中与BamH1相容的片断来构建。将这三个暗盒克隆于启动子p7.5下游，这样产生三种质粒p75M41，p75D1466以及p75D207。
将暗盒p7.5-E2克隆于传递载体pTIRB1的BamH1位点，然后克隆暗盒P11Lac（E2的下游）于BamH1位。这些传递质粒是pTIRB1p75M41Lac，pTIRB1p75D1466Lac和pTIRB1P75D207Lac。按照例9、10和11的方法通过传递来构建重组病毒并提纯。按例13所述，用Southern印迹法分析基因组。通过下述免疫学技术来检测E2抗原的表达：使用特异性抗体的ELISA，Western印迹或免疫荧光法。生产重组病毒株。
用这些重组体一剂给家禽接种。利用在传染性支气管炎中使用的常规方法用致病病毒感染家禽，然后评估疫苗的效力，并通过估评抗病毒抗体水平来得出疫苗效力。
实施例18 将艾美球虫基因插入传递质粒-CNP/TA4重组体的构建
艾美球虫属包括引起球虫病的家禽寄生虫。有关E.tenella，E.necatrix、E.maxima种的表面抗原已有详细记载（欧洲专利申请0164176和0231537）。
正开发一种抗球虫病的有效重组疫苗。
E.tenella抗原，表示为TA4或A4，系由二硫桥连接的17kd和8kd二个亚基组成的25kd蛋白质。该基因从基因组库，也可从mRNA分离出。对该基因的全面描述已公开于上面提到的专利申请中。
TA4基因的BamH1暗盒通过亚克隆构建。质粒pTA406含TA4的编码序列。质粒pTA410携带有在分开两个亚基的蛋白水解序列处修饰过的TA4基因，通过特定位点诱变由Arg-Glu-Lys-Arg序列置换了天然Arg-Arg-Leu序列（由Kieny等人描述过，1988）。将这两个BamH1暗盒克隆于质粒p1P7.5的启动子p7.5的下游，其取向为TA4基因放置于p7.5控制之下。
将暗盒p7.5-TA406和p7.5-TA410克隆于传递载体pTIRB1D的BamH1位点。然后将暗盒p11-Lac克隆于TA4基因的BamH1位下游。该传递质粒是pTIRTA406Lac和pTIRTA410Lac。
重组病毒通过如例9、10和11所述转移方法得到。获得兰色噬菌斑。携带TA406基因的重组体是V20;携带TA410基因的重组体是V21。
将双重组V21病毒，即在各TIR上携带TA410和LacZ的拷贝的病毒，各自在微滴平板上提纯并如例14所述用PCR分析其基因组。下表列出所用引物和扩增片段的大小。引物1871与LacZ基因互补。
引物 野生片段 重组片段
5169+5168 220bp 4kb
5169+1871 -- 1.2kb
TA4抗原的表达由下述免疫学技术检测：ELISA，Western印迹或免疫荧光法（使用特异性抗体）。
生产重组病毒株。用一剂量此类重组体给家禽接种。用毒性艾美球虫攻击接种家禽，然后使用常规分析球虫病的方法包括分析血清、体重增加速率和临床症状，来评估该疫苗的效力。
实施例19-将传染性粘液囊炎病毒的多蛋白基因插入传递载体
传染性粘液囊炎病毒的起因剂是Birnaviridace科的一种病毒。该病毒称为IBDV（传染性粘液囊病病毒），引起高接触性感染病（传染性粘液囊病），该病侵袭小鸡，其特征是损坏Fabricius粘液囊的淋巴细胞。该病毒具有由两个双股RNA片段（称之为片段A，约3400碱基对和片段B，约2900碱基对）组成的基因组。该病毒微粒不带有包膜，是直径约60毫微米的二十面体形式。有四种病毒蛋白已清楚地鉴定出：分子量（MW）90K（K：千道尔顿）的VP1;分子量37K到40K的VP2;分子量32K到35K的VP3;分子量24K到29K的VP4（Dobos1979，Fahey等，1985）。VP2从分子量41K-54K的前体VPX衍生而来。
片段B编码可能是病毒多聚酶的VP1。片段A编码3种其它蛋白。这些蛋白通过蛋白水解裂解从相应于片段A的大开放阅读框架的分子量约为110K的前体产生。蛋白VP4参与该蛋白水解裂解（Jagadish等人，1988）。蛋白VP2和VP3构成病毒的壳体。VP2含能诱导中和病毒的抗体合成的抗原决定基（Becht等人，1988;Fahey等人，1989）。
正开发一种抗传染性粘液囊病的重组禽痘疫苗。
该研究步骤如下：
1.分离选择的IBDV菌株，即EDGAR菌株的遗传物质。该EDGAR病毒菌株可从美国农业部获得（USDA，APHIS6505Belcrest Road，Hyattsville，MD 20782，USA）。
2.合成、克隆及测定相应于片段A的cDNA核苷酸序列。
3.将cDNA以及在禽痘感染的动物细胞中表达该遗传物质所需的序列，和用于筛选重组禽痘病毒的序列，插入实施例4所述传递质粒pTIRB1中。
4.分离和提纯该重组病毒。
5.重组病毒的遗传分析。
6.分析在体外，在细胞培养物中由这些重组病毒携带的IBDV基因的表达。
7.用该重组病毒给鸡接种，并分析其对传染性粘液囊炎症的防备作用。
步骤1：
从病毒感染的鸡的粘液囊中分离出EDGAR菌株的病毒RNA
将受病毒感染后7天收集到的约40g粘液囊，于40ml TNE缓冲液（TNE：10mM Tris-Hcl，100mM NaCl，1mM EDTA，pH8）中研碎。该研碎的产物于17000g离心处理，将获得的水相倒在予制的蔗糖梯度上，该梯度由两层组成，含40%和60%蔗糖（由重量/体积百分数表示，于TNE缓冲液中）。将该梯度于134000g离心处理2小时30分钟。收集蔗糖梯度的40%-60%的中间相，它含有部分提纯的病毒。将该相的5ml加入到5ml缓冲液中，该缓冲液含10mM Tris-HCl，100mM NaCl，0.5%SDS，10mM EDTA，2mg/ml蛋白酶K，pH7.5。该混合物于37℃保温1小时。然后用苯酚/氯仿提取水相。水相中的核酸由乙醇（有0.8M LiCl存在）沉淀出并溶于500μl水。
步骤2：
根据“GENEAMP RNA PCR KIT，PERKIN ELMER CETUS”中描述的方法，并使用合成寡核苷酸或引物（与片段A序列互补）。合成和扩增与片段A相对应的cDNA，以此作为由逆转录酶合成第一条DNA链的引物。通过分析已公开的其他IBDV菌株：澳大利亚002-73菌株（Hudson等人，1986），德国CU-1菌株（Spies等人，1989）和英国52/70菌株（Bayliss等人，1990）的A片段的序列而决定对这些合成寡聚核苷酸的选择。这些引物的序列和它们与EDGAR菌株的A片段的相对位置已表示于图8和9中。
从对IBDV菌株已发表的序列的分析表明，除了编码蛋白质VP2、VP4和VP3的大型开放阅读框架ORF1外，在片段A的该编码链上有两个其它的开放阅读框架。其1是ORF2，它起始于ORF1的ATG的34bp上游，与后者重叠，其长度为435bp。另一个是ORF3，起始于ORF2的32bp上游，其长度为31bp。这些ORFs在病毒生物学上的可能作用迄今尚不清楚。
产生出分别由引物碱基对，0-1b（585bp），1-2（1129bp），3-4（670bp），5-6（1301bp）划界的，并跨越片段A的ORF1和ORF2（见图8）的4个双股cDNA片段。
将这些片段克隆于质粒pBSPlus或pBSLK1;于是构建出6个个质粒（见图8和10）：
测定这些质粒的IBDV片段的核苷酸序列，并排列，以便重建EDGAR菌株的A片段序列，将其通过PCR加以扩增（见图9）。EDGAR菌株的原始序列（它被所用的，根据其它IBDV菌株的已发表的序列定义的引物置换过）也可通过利用位于这些序列外的引物从这些区域的扩增产物来确定。
从获得的克隆重新构建A片段的过程图示于图10中。
该步骤表示如下：
1.pEDGAR12的构建：
pBS1A2（EcoR1+T4 DNA聚合酶，Sac1）
+pBS1B（Sph1+T4 DNA聚合酶，Sac1）
2.通过pEDGAR12上的特定位点诱变来构建pEDGARM12：
a.缺失位于IBDV序列上游的pEDGAR12的Sph1位点：
原始序列
Sphl
5' GTCTGATCTCTACGCATGCAAGCTTTTGTTCCCTTTAGTGAGGG 3'
诱变引物
5' GTCTGATCTCTACGGTTCCCTTTAGTGAGGG 3'
b.缺失pEDGAR12的EcoR1位点并将IBDV序列的下游Sph1位点引入;
原始序列
EcoRl
5' CGACTCACTATAGGGCGAATTCCCCCCAGCGACCGTAACGACTG 3'
<- IBDV -
诱变引物
Sphl
5' CGACTCACTATAGGGCGGATCCCGCATGCCCCAGCGACCGTAACGACTG 3'
3.pACEDGARM12的构建：
将pEDGARM12的Bcl1-Sph1片段插入pACYC184位Bcl1-Sph1位点。
4.通过pEDGAR34i上的特定位点诱变来构建pEDGARM34i：由Nsi1位点置换Sph1位点;
原始序列：
Sphl
5' GCTCGAAGTTGCTCAGGCATGCAAGCTTTTG 3'
- IBDV ->
诱变引物
Nsil
5' GCTCGAAGTTGCTCATGCATGCAAGCTTTTG 3'
- IBDV ->
5.构建pEDGAR45：
pBS3A（Hinc2+Pst1）+pEDGAR34i的Hinc 2-Pst1片段
6.构建pACEDGAR14：
pACEDGARM12（Sph1+T4 DNA聚合酶，BamH1）+pEDGARM34i（Nsi1+T4 DNA聚合酶，BamH1）
7.构建pACEDGAR15：
pACEDGAR14（BamH1+T4DNA聚合酶，Sal1）+pEDGAR45（Pvu 2-Sal1）
8.构建pACEDGAR1：
pACEDGAR15（Sph1+EcoRV）+pBS3B（Sph 1+Pvu 2）该质粒在Bcl 1-BamH 1片段上含有A段的ORF1的完整序列。
9.通过pBSIBDVO的特定位点诱变来构建pBSIBDVOb
将ORF3引入携带ORF1和ORF2开端的pBSIBDVO中。
原始序列
- pBSPlus -> --ORF2-->
5' CCCGGGGATCCTCTAGAGTCCCTCCTTCTACAACGTGATCATTGATGG 3'
Bcll
诱变引物
--ORF2-->
pBSPlus -> -ORF3->
5' CCCGGGGATCCTCTAGAGTCTGATCAGGATGGAACTCCTCCTTCTACAACGCTATCATTCATGG 3,
10.pACEDGAR2和pACEDGAR3的构建：
分别用质粒pBSIBDVO和pBSIBDVOb的Bcl1-Rsr 2
片段来置换质粒pACEDGAR1的Bcl1-Rsr2区域而获得获得质粒pACEDGAR2和pACEDGAR3。
因此在pACEDGAR1，pACEDGAR2和pACEDGAR3三个质粒的Bcl1-BamH1片段上能分别分离到EDGAR菌株的A片段的ORF1，ORF1-ORF2和ORF1-ORF2-ORF3。
这三个质粒的序列（在ORFs的ATG边）表示如下：
Bcll
pACEDGARl: 5' TGATCACAGCGATGACA ... 3'
---ORFl---->
Bcll
步骤3
然后将这些Bcl1-BamH1片段克隆于质粒p2P75的BamH1位点，于是产生质粒p75EDGAR1，p75EDGAR2和p75EDGAR3并将A片断的编码序列置于启动子P7.5的控制之下。
将这些编码序列也置于启动子P11的控制之下。将携带启动子p11的质粒pACP11的Bcl1-BamH1片断插入质粒pACEDGAR1，pACEDGAR2和pACEDGAR3的BamH1位点以分别产生质粒p11EDGAR1，p11EDGAR2和p11EDGAR3。
从不同的质粒中分离Bcl1-BamH1暗盒，p75-EDGAR或p11-EDGAR并插入到质粒pTIRB1的BamH1位点，于是产生质粒pTIR75EDGAR1，pTIR75EDGAR2，pTIR75EDGAR3，pTIR11EDGAR1，pTIR11EDGAR2和pTIR11EDGAR3。这些保存于质粒pTIRB1内的Bcl1-BamH1暗盒所取方向要使得从启动子P7.5和P11起始的转录方向与存在在质粒pTIRB1内的ORF1和ORF2方向相一致。
将质粒pACP11LAC的Bgl2-BamH1片断（携带P11-LACZ暗盒）插入质粒pTIR75EDGAR1和pTIR75EDGAR2的BamH1位点，以使分别产生质粒pTIR75E1LAC和pTIR75E2LAC。P11-LACZ在这些质粒中的取向要满足这样要求，即使得LACZ基因的转录方向与ORF1和ORF2的方向相一致。
以相似的方法，通过将P75-LACZ暗盒（以质粒p75LAC的Bgl2-BamH1片断的形式分离出）分别插入质粒pTIR11EDGAR1，pTIR11EDGAR2和pTIR11EDGAR3的BamH1位点产生质粒pTIR11E1LAC，pTIR11E2LAC和pTIR11E3LAC。
最后，将质粒p11EDGAR1的Xho1（用T4DNA聚合酶处理过）-Bgl2片断插入质粒pTIR11E1LAC的PpuM1（用T4DNA聚合酶处理过）和Bgl2位点产生质粒pTIR11VP2LAC传递质粒pTIR11VP2LAC（于启动子P11控制之下）含蛋白质VP2的完整序列以及蛋白质VP4的氨基末端部分;借助于构建工程，多蛋白的最后三个氨基酸（Asp，Leu和glu;VP3的羧基末端部份）和翻译终止密码子（TGA）在同相中融合。因此可从图9看见该异源蛋白相应于多蛋白上含1-493氨基酸，以及接着1010至1012氨基酸的部分，其中包括蛋白VP2。
作为例子，质粒pTIR75E1LAC示于图11中。
步骤4和步骤5
根据例9、10、11、12、13和14的方法分离，提纯并表征重组禽痘病毒（其中已整合了EDGAR菌株的ORFs）。
该重组病毒的标记如下：
V11＝P7.5E1 V12＝P7.5E2
V14＝P11E1 V15＝P11E2
V17＝P11VP2 V16＝P11E3
通过PCR选择双重组体TIRS使用的引物可区分WT TIRs和含LacZ，E1，E2，E3或VP2的TIRs。引物的结合和扩增片段的大小在下表给出。
引物IBDV16，3，1b和22与IBDV杂交，引物IBDV16，1b和3与VP2的编码部分杂交，引物IBDV22与VP3的编码部分杂交而不与V17基因组杂交，引物5168和5169与FPV杂交，引物1871与β-半乳糖苷酶基因杂交。这些引物序列在表“引物目录和序列”中加以定义。
引 物 病毒 片段
（nt）
5169 + 5168 WT 220
重组体 6.0kb
5169 + 1871 V8 310
重组体 3.6kb
5169 + IBDV16 V11 341
V14,V17 339
V12 373
V15 371
V16 402
5169 + IBDV1b V17 766
IBDV22 + 1871 V11,V12 379
V14,V15,V16 479
V17 --
IBDV3 + 1871 V14,V15,V16 2280
V17 732
步骤6：
比较在QT35细胞中重组病毒的IBDV抗原的表达。
使用的抗体（抗IBDV菌株Cu-1）由H.Müller教授（Institut für Virologie Justus-Liebig-Universitaet Giessen，Germany）。好意提供。
这些抗体是：
1.经抗Cu-1菌株超免疫处理的兔多克隆血清（No.B22）
2.识别天然和变性形式的VP3蛋白质的抗-VP3鼠单克隆抗体（No.I/A10）。
3.识别VP2蛋白的构象表位的抗VP2鼠单克隆抗体;B1抗体是能中和病毒菌株Cu-1的抗体。
a.感染的实验条件
在D＝1天，在每个25-cm2烧瓶中将2.5×106QT35细胞接种于生长培养基中（例1描述的组合物）。共制备8个烧瓶。在D＝2天。用每种重组病毒V11、V12、V14、V15、V16、V17、V8（阴性对照）和IBDV（荠碱（bursine）菌株2，阳性对照）以每个细胞0.01病毒对细胞进行多重感染。
在D＝5天，收集感染细胞并经冷冻接着解冻而除去培养液。
b.通过夹心型ELISA分析表达产物
使用多克隆抗体B22（作为第一抗体），和抗-VP3单克隆抗体（No.I/A10）或抗-VP2中和单克隆抗体（No.B1）（后二者作为第二抗体）进行ELISA试验。抗VP3的ELISA曲线绘在图12A中，抗VP2的ELISA曲线绘在图12B中。
这些分析结果表示：
1-图12A：蛋白VP3在所有至少含编码多聚蛋白（ORF1，VP2-VP4-VP3蛋白）的序列的重组体（V11、V12、V14、V15和V16）中表达，而不在仅含编码VP2和VP4氨基末端部分区域的重组体V17中表达，也不在无IBDV序列的重组体V8中表达。
蛋白VP3的表达水平在重组体V11和V12中要低于在重组体V14，V15和V16中，这可能与各种重组体中存在的启动子的强度有关：启动子P7.5（重组体V11和V12）的活性要低于启动子P11（重组体V14，V15和V16）的活性（见例15）。
由于片段A的阅读框架的功能（这些阅读框架引入各种重组体中：ORF1引入重组体V11和V14，ORF1+ORF2引入重组体V12和V15，ORF1+ORF2+ORF3引入重组体V16中），使得VP3的表达水平没发现不同。
2-图12B：蛋白VP2在除不含IBDV序列的V8以外的所有重组体中均表达。
重组体V17的表达水平最高;在这种情况下，它接近于在由IBDV病毒感染的细胞中表达蛋白VP2的表达水平。
再一次观察到在各种重组体中存在的启动子的强度与蛋白VP2的表达水平之间的相关性。
一方面，这些结果表明，由抗菌株Cu-1的中和抗体B1识别的蛋白VP2的表位也存在于美国菌株Edgar的蛋白VP2中。另一方面表明，在所有重组体中保留着蛋白VP2的原始构象（至少在该区域）。
c.通过Western印迹法分析表达产物
由各种重组体产生的蛋白质的Western印迹分析，一方面采用识别所有IBDV蛋白的多克隆血清（B22）进行，另一方面采用抗VP3单克隆抗体（I/A10）进行。
示于图13A的结果表明，多克隆血清基本上识别在经IBDV感染的细胞提取物中的3种蛋白，分别相当于VP2（～40kd），VP3（～32kd）和VP4（～28kd），也观察到约46kd的蛋白，它可能构成VP2前体（VPx，～48-49kd）。
对于所有重组体（V11、V12、V14、V15和V16）（至少含编码多蛋白的序列（ORF1，VP2-VP3-VP4））具分别相当于VP3、VP4或许VPx的分子量（MW）的蛋白质用抗-IBDV多克隆血清来检测（图13A）对于重组体V17，仅检测出一种蛋白，该蛋白的分子量接近融合蛋白VP2+VP4的氨基末端区域（～52kd）。
抗VP3单克隆抗体（图13B）主要识别由IBDV感染的细胞中或表达多聚蛋白的所有重组体中的两种蛋白：VP3和可能是VP3的一种降解产物。在表达融合蛋白VP2-VP4的重组体V17中没有识别出IBDV蛋白。
所有这些结果表明，在所有重组体中，不管其它读码ORF2（重组体V12和V15）或ORF2和ORF3（重组体V16）的存在，编码多蛋白的读码（ORF1）都被翻译，前体多蛋白的裂解确实存在，但在VP2的情况下，显示切割不完全;这意味着前体VPx的完全成熟发生在IBDV病毒颗粒转移在细胞表面期间或其后。（Müller等人，1982）。
步骤
重组体FPV/IBDV接种效力的测试。
a.以V11进行血清转换
以重组FPV/IBDV进行第一次接种活动，比较以三种不同的给药方式：肌肉内注射方式（IM），皮下注射方式（SC）和翅膀刺穿方式（WW或Wing Web）的抗β-半乳糖苷酶和抗IBDV病毒的血清转换作用。
使用三种给药方式：IM.SC和WW，用104.4V11重组病毒给一天龄的鸡接种，11天后，以无痛致死方式杀死这些鸡。
通过直接ELISA血清分析表明，以肌肉注射方式接种的鸡有2/14（14%），以皮下注射方式接种的鸡有3/6（50%）。以刺穿翅膀方式接种的鸡有8/15（53%）出现抗β-半乳糖苷酶抗体。而以肌肉注射方式接种的鸡有5/14（36%）以皮下注射方式接种的鸡有1/6（17%），以刺穿翅膀方式接种的鸡有1/15（7%）出现抗IBDV病毒抗体。
由此得出结论，在接种鸡中IBDV蛋白由重组体FPV/IBDV11表达并且它们在一些鸡中诱导出抗体应答。三种给药方式中，肌肉注射方式能诱导出比其它两种方式更高的应答。
b.V11、V15和V16的早期保护作用
用肌肉注射方式给一天龄的鸡注射1剂104.4V8（阴性对照）V11、V15或V16病毒，10天后以眼内滴注给药途径，用100LD50（100倍致死剂量）病毒849VB攻击这些鸡。849VB菌株由Van Den Berg等人（1991）介绍过。
20天后用无痛致死法杀死这些鸡。
粘液囊重与总重之比乘以100即为保护性指数。
对于以V8接种，未以IBDV攻击的对照组来说，该比例是0.57（以10只鸡平均计）。
对于遭受攻击的V8组，该比例变为0.11（9只鸡平均）。
对于用V11、V15和V16接种的鸡这些比例分别是0.11（20只鸡），0.12（18只鸡）和0.12（18只鸡）。
按照这些标准来看，重组体V11、V15和V16无抗IBDV病毒的早期保护作用。
c.V11、V15和V16的后期保护作用
如前一部份所述用V8、V11、V15和V16给鸡接种，注射后42天用IBDV攻击。
攻击前收集血清，用ELISA法分析，以评估抗β-半乳糖苷酶和IBDV病毒的抗体应答。
抗β-半乳糖苷酶应答表明，在所有接种鸡中获得100%血清转换（总共70只鸡），效价范围从1∶200到1∶51200。以V11（其LacZ基因置于P7.5控制之下），获得的效价，与用V8、V15和V16（其LacZ基因置于启动子P11控制之下）获得的效价之间没有明显的差别。
用V8接种的10只鸡的抗IBDV应答是零，而以V11、V15和V16接种的所有鸡则是阳性。具体说来，用V11接种的20只鸡的应答效价范围是1∶800到1∶51200，平均为1∶6400。用V15接种的20只鸡，该数据是从1∶6400到1∶102400，平均为1∶25600，而以V16接种的20只鸡是介于1∶6400和1∶204800之间，平均为1∶25600。用V15或V16接种的组其抗体水平明显高于用V11接种的抗体水平。
疫苗菌株PBG68（适合培养细胞）的血清中和效价，对V11是1∶10（作为阴性对照）;对V15来说20个血清中有4个，对V16来说20个血清中有1个其血清中和效价是1∶20。该效价较低且仅在少数动物中观察到。
在未受到病毒攻击的V8对照组（10只鸡）其比例（粘液囊重/总重）×100的平均值为0.66。
在受到攻击的V8组（仅1只存活）该值变成0.1。对于三组V11（3只鸡）、V15（11只鸡）和V16（8只鸡）该值分别为0.1，0.11和0.11。该疫苗对粘液囊萎缩无防备作用。
经受病毒攻击后四天期间的死亡率。对于对照组来说几乎是全部死亡（10只中有9只死去）。对V11组来说20只中有3只存活，而以V15接种的20只中有11只存活，以V16接种的20只中有8只存活。因此以V15或V16接种的动物，其保护性约为50%。
d.V14、V15和V17的保护作用
三周龄的家禽分为四组，分别给以0.2ml V8（阴性对照）、V14、V15或V17重组病毒。每只鸡的病毒量是106.4TCID50。给药方式是肌肉注射。
21天后从每只动物收集血清，以评估抗IBDV抗体效价。用100倍致死剂量的IBDV注射入V14、V15和V17组动物，以及V8组的一些动物（即给以重组病毒V8的家禽组）。
11天后，也就是说接种以后32天，将V8组对照动物及受病毒攻击存活的动物以无痛致死术杀死，测定比例（粘液囊重/家禽重）×100。
其结果是
-死亡率：死于攻击的家禽数可以如下数字相除：
对V8来说：12只家禽/14（85%），对V14来说：21/24（87%），对V15来说：17/25（68%），对V17来说：0/25（0%）。
换言之，以重组体V17接种的家禽均能抗病毒攻击，该组中得到完全保护，而且没有一只表现出那怕是最轻微的临床症状。以重组体V15获得的保护是32%，与前面实验获得的50%保护相近。
-ELISA：估计到的抗病毒的平均效价为：对于V8，效价低于1∶100，认为阴性;对于V14，效价为1∶12800（从1∶6400到1∶51200），对于V15，效价为1∶6400（从1∶800到1∶25600）;对于V17，除3只家禽外效价低于1∶100（这三只动物效价为1∶800，1∶6400和1∶51200）。
因而，抗IBDV的抗体应答（由重组FPV/IBDV的多蛋白表达所诱导的）是很高的。相反，对完整病毒的应答（由V17诱导）却很低。
-血清中和：抗PBG68菌株的血清中和效价平均值为：对V8、V14和V15来说，小于1∶10，认为阴性;对V17来说，20只中有5只家禽效价在1∶20以上，即具体说来，该值为1∶20（两次），1∶40，1∶80和1∶320。
因而，仅仅在用V17接种的家禽血清中观察到血清中和作用。
-粘液囊：比例（粘液囊重/总重）×100的平均值为：对未受攻击的V8来说比例是0.68（±0.13），对受攻击的V8来说比例是0.09（±0.01），对V14来说比例是0.10（±0.02），对V15来说比例是0.13（±0.04），而对V17来说比例是0.34（±0.23）。
因此，仅仅在V17组中观察到对法氏囊的部分保护作用。实际上，24只家禽中有8只其比例值与未受攻击的对照组相似。其它16只比受攻击对照组具更高比例值。
结论
这些接种实验的主要结论是：
-表达IBDV多蛋白的重组体在家禽中诱导出很强ELISA应答，对病毒具高效价抗性。
-表达多蛋白的VP2部分的重组体可完全保护家禽免于死亡，并部分保护其避免粘液囊萎缩。
质粒目录
名称 特征
克隆于大肠杆菌中的载体
pUC18 克隆载体（Messing 1983）
pBSPlus 克隆载体（Stratagene）
pBSLK1 多接头内带有Bcl1和Bgl2位点的pBSPlus
pBSLK2 相似于pBSLK1，但Bcl1和Bgl2位点以相反方向排列
pACYC184 克隆载体（Chang 1978）
牛痘启动子
pGS20 牛痘的传递载体（Mackett，1984）
p1P75 pBSLK1+在Bcl1-BamH1中带有牛痘启动子P7.5的pGS20的Bcl1-BamH1片段
p2P75 除在pBSLK2内以外，与p1P75相同
p1P11 pBSLK1+在Bgl2-BamH1中带有牛痘启动子P11的40-聚体合成DNA
p2P11 除在pBSLK2内以外与p1P11相同
pACP11 除在pACYC184的Xho2-BamH1内以外与p1P11相同
LacZ基因
pBSMutLacZ1 在Bgl2-BamH1暗盒中带LacZ的pBSPlus
名称 特征
p75Lac p2P75+在Bgl2-BamH1中带有LacZ的Bgl2-BamH1暗盒
p11Lac 除在p2P11内以外与p75Lac相同
pACP11Lac pACYC184+在Xho2-Hind3中含有p11Lac的Bgl2-Hind3片段中的p11-Lac暗盒
CNP的传递载体
pTIR1 带CNP的EcoRI TIR-L片段的pUC18缺失分隔CNP BamH1的pUC18接头的BamH1位点的片段
pTIRB1 BamH1接入pTIR1（ORF1和ORF2之间）
pTIRB2 除了ORF2和ORF3之间以外与pTIRB1相同
pTIRB1D 除缺失EcoR1-Hpa1片段外与pTIRB1相同
带LacZ的传递载体
pTIRB1P75Lac pTIRB1+克隆于BamH1的Bgl2-BamH1片段中的p75Lac的p75-Lac暗盒
pTIRB2P75Lac 除在pTIRB2内以外同上
pTIRB2LacP75 除取相反方向外同上
名称 特征
pTIRB1P11Lac pTIRB1+克隆于BamH1的Bgl2-BamH1片段内的p11Lac的p11-Lac暗盒
pTIRB1LacP11 除取相反方向外同上
pTIRB2LacP11 除在pTIRB2内以外同上
携带IBV的E2的质粒
p75M41 血清型M41的E2基因，克隆于P7.5的下游
p75D1466 除血清型D1466外同上
p75D207 除血清型D207/D274外同上
带IBV的E2的传递载体
pTIRB1P75M41Lac 克隆于TIRB1的BamH1位点的M41和P11-Lac的P7.5-E2暗盒
pTIRB1P75D1466Lac 除D1466的E2外同上
pTIRB1P75D207Lac 除D207/D274的E2外同上
携带艾美球虫的TA4的质粒
pTA406 克隆于BamH1暗盒的Eimeria tenella TA4抗原的cDNA
pTA410 除蛋白水解位点不同外其余同上
p75TA406 克隆于P7.5下游的TA406基因
p75TA410 除TA410基因外同上
名称 特征
pTIRTA406 克隆于pTIRB1D的BamH1的P7.5-TA406暗盒
pTIRTA410 除P7.5-TA410暗盒外同上
携带艾美球虫的TA4的传递载体
pTIRTA406Lac 克隆于pTIRTA406的P11Lac暗盒
pTIRTA410Lac 除在pTIRTA410内以外同上
克隆于IBDV的质粒
pBSIBDVO pBSPLus（Pst1-Hinc2），该产品+由PCR获得的EDGAR0-1b片断的277bp Pst1片断
pBSIBDVOb 由通过特定位点诱变的pBSIBDVO衍生而来
pBS1A2 pBSLK1（Pst1+T4DNA聚合酶，Sac1）+通过PCR获得的EDGAR1-2片断的760-bp Sacl片段
pBS1B pBSLK1（Pst1+T4DNA聚合酶，Sac1）+通过PCR获得的EDGAR1-2片段的369-bp Sac1片段
pEDGAR34i pBSLK1（Pst1+T4DNA聚合酶，Hinc2）+通过PCR获得的670-bp EDGAR3-4片段
pEDGARM341 通过特定位点诱变从pEDGAR34i衍生而来
pBS3A pBSLK1（Pst1+T4DNA聚合酶，Sph1）+通过PCR获得的EDGAR5-
名称 特征
6片段的956-bp Sph1片段
pBS3B pBSLK1（Pst1+T4DNA聚合酶，Sph1）+由PCR获得的EDGAR5-6片段的345-bp Sph1片段
pEDGAR12 pBS1A2（EcoR1+T4DNA聚合酶，Sac1）+pBS1B片段（Sph1+T4DNA聚合酶，Sac1）
pEDGARM12 通过特定位点诱变从pEDGAR12衍生而来
pACEDGARM12 将pEDGARM12的Bcl1-Sph1片段插入pACYC184的Bcl1-Sph1位点
pEDGAR45 pBS3A（Hinc2-Pst1）+pEDGAR34i的Hinc2-Pst1片段
pACEDGAR14 pACEDGARM12（Sph1+T4DNA聚合酶，BamH1）+pEDGARM34i片段（Nsi1+T4DNA聚合酶，BamH1）
pACEDGAR15 pACEDGAR14（BamH1+T4DNA聚合酶，Sal1）+pEDGAR45片段（Pvu2-Sal1）
pACEDGAR pACEDGAR15（Sph1-EcoRV）+pBS3B片段（Sph1-Pvu2）
pACEDGAR2 由pBSIBDVO的Bcl1-Rsr2片段置换pACEDGAR1的Bcl1-Rsr2片段
pACEDGAR3 与pBSIBDVOb的Bcl1-Rsr2片段相同
名称 特征
携带IBDV和牛痘启动子的质粒
p75EDGAR1 pACEDGAR1的Bcl1-BamH1片段插入p2P75的BamH1位点
p75EDGAR2 与pACEDGAR2的Bcl1-BamH1片段相同
p75EDGAR3 与pACEDGAR3的Bcl1-BamH1片段相同
p11EDGAR1 携带pACP11的P11的Bcl1-BamH1片段插入pACEDGAR1的BamH1位点
p11EDGAR2 除了在质粒pACEDGAR2内以外同上
p11EDGAR3 除了在质粒pACEDGAR3内以外同上
只带IBDV的传递载体
pTIR75EDGAR1 将p75EDGAR1的Bcl1-BamH1片段插入到pTIRB1的BamH1位点
pTIR75EDGAR2 与p75EDGAR2质粒相同
pTIR75EDGAR3 与p75EDGAR3质粒相同
pTIR11EDGAR1 与p11EDGAR1质粒相同
pTIR11EDGAR2 与p11EDGAR2质粒相同
pTIR11EDGAR3 与p11EDGAR3质粒相同
带IBDV和Lac的传递载体
pTIR75E1LAC pACP11LAC的Bgl2-BamH1片段插入pTIR75EDGAR1的BamH1位点
pTIR75E2LAC 与质粒pTIR75EDGAR2相同
名称 特征
pTIR11E1LAC p75LAC的Bgl2-BamH1片段的插入pTIR11EDGAR1的BamH1位点
pTIR11E2LAC 与质粒pTIR11EDGAR2相同
pTIR11E3LAC 与质粒pTIR11EDGAR3相同
pTIR11VP2LAC p11EDGAR1的Xho1（T4DNA聚合酶）-Bgl2片段克隆到pTIR11E1LAC的PpuM1（T4DNA聚合酶）-Bgl2位点
生物体目录
名称 特征
1.大肠杆菌细菌
MC1061 araD139，（ara，Leu）7697，LacX 74，galU，galK，hsdR，StrA（pharmacia）
JM1110 使用其dam-表型（N3837 dam4）
2.CNP病毒
LVCO USDA的标准禽痘攻击菌株
CNP 禽痘疫苗菌株（SOLVAY）
V3 在TIRB1中带P7.5-LacZ暗盒的重组CNP病毒
V4 除暗盒在TIRB2外与V3相同
V5 除暗盒取相反方向外与V4相同
V8 除暗盒是P11-Lac外与V3相同
V9 除暗盒取相反方向外与V8相同
V10 除暗盒在TIBB2中外与V9相同
3.IBDV病毒
EDGAR EDGAR菌株，美国人从S.A.EDGAR中分离出（Auburn 大学），在鸡中繁殖3次，在胚胎蛋中繁殖一次，USDA标准攻击型
849VB 由Van Den Berg等人（1991）描述的致病菌株
PBG98 适应于CEF细胞的菌株
名称 特征
Bursine2 适应于QT35细胞的疫苗菌株
4.细胞
QT35 Quail细胞系
CEF 鸡胚胎成纤维细胞
5.CNP/IBD病毒
V11 携带暗盒P11Lac和P7.5E1
V12 携带暗盒P11Lac和P7.5E2
V14 携带暗盒P7.5E1和P11Lac
V15 携带暗盒P7.5E2和P11Lac
V16 携带暗盒P7.5E3和P11Lac
V17 携带暗盒P7.5VP2和P11Lac
6.CNP/TA4病毒
V21 携带暗盒P11Lac和P7.5TA410
引物目录和序列
编号 从5'到3'的序列 互补
5169 5' CCTTTACTGTTAGTTCTACAATCGAAATTATGC 3' FPV
5168 5' CATGTAGATTTTAATCCGTTAACACGCGCAG 3' FPV
3254 5' GCCGGAAAACCTACCGGATTGATGG 3' Lac
1871 5' GAAACCAGGCAAAGCGCC 3' Lac
IBDV16 5' CCAGGGTGTCGTCCGGAATGG 3' IBDV
IBDVlb 5' CCCAAGATCATATGATGTGGGTAAGCTGAGG 3' IBDV
IBDV3 5' TGAGCAACTTCGAGCTGATCCCAAATCCTG 3' IBDV
IBDV22 5' CTGCTCTTGACTGCGATGGAG 3' IBDV
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xxx
Claims (18)
1、从减毒的禽痘病毒菌株中生产重组禽痘病毒的方法，该重组病毒在其基因组的非必需部分至少含有一个编码对于禽痘病毒是异源的蛋白质的全部或部分的DNA序列以及能确保该蛋白质所说重组病毒感染的细胞中表达的因子，其特征在于该方法包括在基因组的非必需部分克隆DNA序列，该非必需部分是由位于两个开放式阅读框架(ORF)(包括基表达信号)之间的非编码基因间区域组成。
2、根据权利要求1的方法，其特征在于该病毒来源于禽痘病毒的减毒菌株。
3、根据权利要求1或2的方法，其特征在于，在由基因间区域组成的非必需部分进行克隆，该区域是大于60个核苷酸的序列。
4、根据权利要求1至3之一的方法，其特征在于，在位于病毒的两个TIR区域之一的基因间区域进行克隆。
5、根据权利要求4的方法，其特征在于，它含有克隆于病毒的两个TIR区域的至少一个DNA序列的克隆。
6、根据权利要求4或5的方法，其特征在于，它在基因间区域含有克隆，该基因间区域称为β1区域，位于核苷酸1675和2165之间，作为TIRs中存在的BamH1限制位点的起始核苷酸。
7、根据权利要求4或5的方法，其特征在于，它在基因间区域含有克隆，该基因间区域称为β2区域，位于核苷酸2672和3605之间，作为TIRs中存在的BamH1限制位点的起始核苷酸。
8、根据权利要求5和6的方法，其特征在于，在两个TIRs的每一个中，在β1区域克隆一个DNA序列。
9、根据权利要求1-8之一的方法，其特征在于该异源蛋白选自传染性粘液囊病毒（IBDV），传染性支气管炎病毒（IBV），引起鸡贫血的病毒（CAV），引起球虫病的原生动物艾美球虫，新城病病毒（NDV）以及Marek病病毒（MDV）的抗原。
10、根据权利要求9的方法，其特征在于该异源蛋白选自如下这些病毒或球虫的抗原：传染性粘液囊病病毒（IBDV），传染性支气管炎病毒（IBV），引起鸡贫血的病毒（CAV）以及原虫艾美球虫属。
11、根据权利要求10的方法，其特征在于该异源蛋白选自含多蛋白和多蛋白部分的IBDV的全部或部分开放读码，IBV的抗原E2，艾美球虫属的表面抗原TA4以及CAV的蛋白P50。
12、根据权利要求11的方法，其特征在于该异源蛋白是含氨基酸1-493接着由氨基酸1010-1012随其后的多蛋白部分。
13、生产真核细胞培养物的方法，其特征在于该方法包括用根据权利要求1-12任一项获得的重组禽痘病毒进行感染。
14、根据权利要求13的方法，其特征在于它与家禽细胞相关。
15、生产疫苗的方法，其特征在于该疫苗含根据权利要求1-12任一项获得的禽痘病毒。
16、表达全部或部分蛋白的方法，该蛋白系病毒的异源蛋白，其特征在于它包括使用根据权利要求1-12之任一项获得的禽痘病毒作为载体。
17、插入根据权利要求1-12之任一项获得的禽痘病毒基因组的方法，其特征在于它包括利用能使DNA序列（编码全部或部分异源蛋白）进行插入的传递序列。
18、根据权利要求17的方法，其特征在于它包括利用携带传递序列的质粒。
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