CN1278302A

CN1278302A - 用于减少同源重组现象的腺病毒载体及方法

Info

Publication number: CN1278302A
Application number: CN98810749A
Authority: CN
Inventors: J·克鲁采特; J－J·罗伯特; E·维格尼; P·耶
Original assignee: Aventis Pharma SA
Current assignee: Aventis Pharma SA
Priority date: 1997-11-17
Filing date: 1998-11-17
Publication date: 2000-12-27
Anticipated expiration: 2018-11-17
Also published as: JP2003504004A; KR100796060B1; KR20010032146A; NO20002504L; DE69839403T2; HU226018B1; EP1032695B1; WO1999025861A3; CZ299797B6; HUP0101827A3; CN1201013C; JP4376454B2; PL196606B1; NO329784B1; KR20070103483A; PL340601A1; FR2774699A1; AU3129400A; WO1999025861A2; HUP0101827A2

Abstract

本发明涉及减少核酸间重组现象的方法,还涉及该方法在生产无复制性粒子污染之缺陷病毒中的应用,还涉及新的病毒构建体。

Description

用于减少同源重组现象的腺病毒载体及方法

本发明涉及用于减少核酸间重组现象的方法，还涉及该方法在制备诸如质粒或病毒载体等核酸过程中的应用。本发明还涉及新的病毒构建体。

核酸间的重组是分子生物学领域熟知的现象。重组是产生遗传物质新组合的分子机制，为自然选择提供物质基础，从而支持达尔文的进化论。遗传重组需要所参与的核酸间有强序列同源性，一般称为同源重组。在同源重组时，在核酸的两个区域间发生遗传信息的交换，交换可以是相互的(“交换”)或不是相互的(转换)。

在减数分裂时，同源重组产生遗传信息的重新分配，并在染色体的正确分离中起重要作用。在有丝分裂中，重源重组参与DNA的修复。它可以导致基因组重排，如当涉及分散的重组区域时产生缺失和重复，或在涉及串联重复序列时产生收缩或扩张。

已部分阐明了产生同源重组的机理。例如在细菌中，从干预一个单链末端阶段开始同源重组过程(Holliday，1964；Meselson，1975)。而在真核细胞中，大部分的结果提示为一种双链断裂机制(DSB“double-stand break”)(Szostak等，1983)。DSB似乎是同源重组两个主要机制的起源：一种是保守性的，所有参与重组的核酸序列均可见于重组产物中(Szostak等)，另一种是非保守性的，在此过程中某些序列丢失。在哺乳动物体细胞中，大部分经DSB的同源重组看来是以非保守机制进行的(Lin等，1990，Jeong-Yu，1992)。

随着生物技术的不断发展，要使用越来越大的DNA：制备重组蛋白，创制转基因动物，基因和细胞治疗等。在这些不同的领域中，不加控制的重组现象有时可能构成一种缺点。

例如，在制备重组蛋白时，表达质粒中的重组现象(分子内重组)可以导致例如转基因表达盒被切割，从而丧失表达能力。重组现象还可能导致稳定整合在生产宿主细胞基因组中的表达盒被切割，从而导致失去稳定性。

另一个例子是，在构建和生产载体(尤其是病毒载体)时易发生与同源重组现象有关的不利影响。病毒载体(腺病毒、逆转录病毒、腺相关病毒、疱疹病毒等)是在体外、离体或体内向细胞中转移核酸的特别有效的工具。为了构建缺陷病毒载体，一般从基因组中删除野生病毒复制所必需的区域，代之以目的核酸。为了产生和扩增这些病毒，需要反式提供这些功能(在质粒中，或以整合在生产细胞基因组中的形式，或用辅助病毒)。然而在某些情况下，在缺陷病毒基因组和补充功能间仍存在同源重组现象，可重建复制性病毒粒子。例如，来自腺病毒的载体一般在补充细胞系(293细胞系或其衍生系列)中生产，其该细胞系中整合了腺病毒基因组的一部分。更准确地讲，293细胞系包含血清型5腺病毒(Ad5)基因组的左侧末端(约11-12％)，包括左侧ITR、包壳化区域和E1区(包括Ela和Elb)、及编码蛋白pIX和IVa2之区域的一部分。该细胞系能反式补充E1区缺陷的重组腺病毒，即失去复制所需E1区全部或部分的重组腺病毒。然而，在该细胞系基因组中整合的该腺病毒区域与所希望产生的重组病毒的DNA间存在同源性区域。因此，在病毒生产过程中，会发生各种重组现象，生成复制性病毒粒子，特别是E1+型腺病毒。如图1所示，这可能涉及简单的重组事件，然后是染色体断裂(图1A)，或涉及双重重组(图1B)。这两种类型的修饰都致使重组DNA的左侧部分(不含功能性E1区)被存在于细胞基因组中的相应部分所代替，而后者带有一个E1区的功能性拷贝。另外，考虑到293细胞系产生的重组载体的滴度高，这些重组现象的概率也应高。事实上，已证明多批缺陷重组腺病毒载体被复制性病毒粒子所污染。

在病毒样品中存在复制性粒子对于体外或体内转移基因的应用是严重的缺点(病毒繁殖和扩散失控的危险)。

在生产缺陷性逆转录病毒中存在同样的问题。例如，缺陷逆转录病毒构建体一般缺失了编码性病毒区域(gag，pol和env)，这些区域由生产细胞系反式补充。同样，对于已报道的一些细胞系中，在缺陷逆转录病毒基因组与该细胞所带互补功能间存在重叠区域。PA317、Psi2等细胞尤其如此。因而在这些区域中易产生同源重组现象，产生复制性粒子。

本发明涉及一种用于减少给定核酸间重组现象，从而减小这些现象对生物过程之影响的方法。

更具体地讲，本发明涉及用于减小两给定核酸或两核酸区域间同源重组事件之频率的方法。

为了减少同源重组现象，现有技术教导了多种方法，它们都基于相同的原理：替代或消除同源区域。例如，一些用于表达目的基因的质粒带有与宿主细胞基因组同源的区域，特别是启动子区、标志基因或复制起始区。为了减小重组危险，迄今已提出用其他非同源性区域(不同启动子等)代替这些区域。另外，为了限制在病毒载体生产过程中的重组危险性，已提出消除补充基因与缺陷病毒基因组间的同源性序列。

例如，专利申请WO97/00326描述了一种腺病毒生产细胞系，称为PER，其含有腺病毒基因组的一个有限单元，包含E1区。在该细胞系中，减少了与缺陷病毒基因组同源的侧翼序列，这可以限制它们之间同源重组的危险。同样，专利申请WO95/11984描述了一种重组腺病毒的构建，其带有延伸至pIX基因一部分的E1区缺失。在此情况下，不再是修饰(减少)补充区域，而是修饰缺陷基因组中的缺失，即缺失被扩张。结果也减小了重组危险，即使仍存在同源性区域。

但即使这些方法验减小细胞和病毒基因组间的重组危险，从而减小产生有复制性粒子污染的病毒的危险，它们不能完全消除这些危险及/或需要构建新的细胞系并证明其有效，这种工作很繁重。另外，一些区域用其他区域替代并不令人完全满意，尤其是效率方面。

本申请公开了一种用于减少分子间或分子内同源重组现象的新方法。本发明还公开了该方法在生产无复制性粒子污染之缺陷病毒中的应用。本发明还公开了新的病毒构建体，其能够在现有的生产细胞系中就滴度而言最有效地扩增，而产生复制性粒子的危险大大减小。

同源重组的第一步也最重要的一步是两个配对核酸间(分子间重组)或核酸的两个区域间(分子内重组)的识别。该步是两个同源区域间直接相互作用的结果。两个核酸间的同源重组因而基于相同性的存在、或这些核酸的两区域间强序列同源性的存在，这一般取决于两个因素：同源性程序和同源性长度(即核酸或两个核酸所携带同源性区域)。另外，同源重组的频率还受核酸某些特定区域的影响。例如，已观察到某些区域能够以高于平均频率的频率重组。另外还确定，这些区域化的频率差异可能起因于特定的序列，如大肠杆菌中的CHI位点或S.pombe中的M26位点(Gangloff等，1994)。

与现有技术提出的策略不同，本发明的方法不靠消除配对核酸间的同源性区域。本发明的方法以新颖的方式基于修饰重组的两配对核酸中至少一个的序列，从而减小这些核酸间存在的同源性。

本发明的第一个主题涉及一种用于减小分子内或两核酸分子间同源重组现象之频率的方法，其特征在于简并化重组配对核酸中至少一个的序列，减小与其它配偶体的同源性。

本发明中“减小同源重组现象的频率”指与未修饰的相应核酸相比，该频率的任何降低。这种降低易于通过本领域技术人员已知的常规试验测定(特别是“标志拯救”试验或复制性病毒粒子的生成试验)。有利的是，术语“减小”指同源重组频率的显著性降低，优选至少一个对数单位。

分子间同源重组指两个不同的核酸(或两个核酸的两个区域)间的同源重组。分子内同源重组指同一核酸的两个区域间的同源重组。另外，同源重组的配对核酸可以是染色体外核酸，染色体核酸或两者的组合(即染色体核酸和染色体外核酸)。染色体外核酸可以是质粒、载体、附加体、病毒基因组等。

本发明的方法特别适用于减小染色体核酸与染色体外核酸间分子间同源重组现象的频率。

本发明的方法一般包括以下步骤：

(i)鉴别出同源重组区域，

(ii)修饰这种区域，

(iii)核验序列，

(iv)合成修饰的序列(称为同质基因)

(v)用同质基因替代原序列。

(i)按任何已知方法进行核酸间同源重组区域的鉴别。具体地讲，一旦发现重组现象，经序列分析就可以找到相关的区域：寻找核酸间(分子间)或核酸内(分子内)的同源性区域。

当鉴别出重组所涉及序列时，就可以确定用于第(ii)步即修饰的区域，包括所述序列的全部或一部分。

(ii)序列的修饰

一般认为，在足够长的区域有很高的同源性时才能发生显著频率的重组现象。具体地讲，文献数据显示，发生这样的现象需要至少约200bp长度上的完全同源的区域。实际上，即使在更短的区域上可以发生重组，其频率也低得多，而且不规律。另外，在同源性被降低19％的这种区域上，重组频率看来降低约1000倍(Waldman和Liskay，1987)。

可以用不同的方式修饰该序列。对于编码性序列，这种修饰可建立在遗传密码的简并性上。这样，虽然序列改变，因而同源性降低，但表达产物仍相同。

因而本发明的要点特别在于修饰序列，防止两同源区域间的配对。这种修饰可以减小两相关区域间同源性的长度和程序。

有利的是，在本发明方法中以至少每20个碱基对中一个碱基对的比例对核酸序列的同源重组相关区域进行简并化。更优选以至少每10个碱基对中一个碱基对的比例进行简并化。

按照本发明的一个特定实施方案，在所有可能的位点上进行序列的简并化。

本发明序列的简并化最好根据将使用该核酸的细胞或生物体的密码子使用情况进行。对于在人类细胞系中进行生产的病毒载体而言，尽可能选择人体中密码子的优先使用习惯进行序列的简并化是特别有意义的(见实施例)。

另外，可以对核酸序列进行补充修饰。例如，在非编码性区域中，可以减小某些元件的长度(表达调节序列、启动子)或修饰这些元件或用外源区域代替一些其他元件。

按照本发明的一种具体实施方案，当同源性区域跨越多个基因时，一方面可以通过对一个或多个基因进行简并化来减小同源区域，另一方面可以通过改变同源区域中存在的某些基因的基因组位置来达到这一目的，即在腺病毒基因组内在不同于其原位置的基因组位点上安排这些基因。改变了基因组位点的基因序列也可以被简并化。优选只对没有移位的基因序列进行简并化。

(iii)序列的核验

按信息论的方法进行核验，检查可能影响同质基因活性的调节元件、次级结构等的存在。见实施例。

(iv)同质基因的合成

同质基因可以按本领域技术人员已知的任何技术合成，尤其是利用核酸合成仪。

(v)用同质基因替代原序列

一旦合成了同质基因，将其引入核酸中以替代原序列。该步骤同样可以按本领域技术人员熟知的常规分子生物学技术完成。

本发明方法的应用之一是生产不含具复制能力之病毒粒子(RCV)的载体，特别是病毒载体。对此，本发明方法更具体地用于减小编码补充缺陷病毒功能之染色体核酸与含所述缺陷病毒基因组之染色体外核酸间同源重组现象的频率。

相关的病毒最好是腺病毒、逆转录病毒、腺相关病毒(AAV)或疱疹病毒，尤其是腺病毒。

这样，本发明的一个具体实施方案为减小含腺病毒基因组E1区和侧翼序列的染色体核酸与含E1区缺陷之腺病毒基因组的染色体外核酸间同源重组现象频率的方法。

有利的是，在该具体方法中，本发明的简并化序列包括E1区缺陷之腺病毒基因组的pIX基因。更优选地，简并化序列包括腺病毒基因组的pIX和IVa2基因。

根据另一实施方案，简并化序列包括腺病毒基因组的pIX基因，而Iva2基因序列从其天然基因座位移向E4区。

本发明的方法特别适用于在293细胞系或一个衍生细胞系中生产E1区缺陷的重组腺病毒。

如上文所述，293细胞系在其基因组中含有腺病毒基因组的左侧部分，特别包括E1区和位于E1区下游(3’)的一个侧翼区，后者特别包括pIX基因和IVa2基因的一部分。正是在该侧翼区发生同源重组，产生复制活性腺病毒(RCA)。“衍生细胞系”指带有腺病毒E1区和易于引起与缺陷病毒重组的侧翼区的细胞系。这可以是比293中短的区域(例如限于pIX)或比293中的更长的区域。衍生细胞系还可以是通过引入另外的补充序列(如E4)从293细胞构建的细胞系。

因此，本发明还涉及一种通过在293细胞系或衍生细胞中引入缺陷重组腺病毒基因组而制备缺陷重组腺病毒的方法，其特征在于所述基因组包括：

-E1区的缺失，

-pIX和/或IVa2基因的简并化。

本发明还涉及基因组中含有至少一个序列简并化的区域的任何病毒载体，特别是逆转录病毒(在gag、pol和/或env基因中含简并化序列)、腺相关病毒(在rep和/或cap基因中带有简并化序列)或腺病毒。

特别有利的是基因组中含简并化pIX基因的腺病毒。优选pIX基因的简并化序列是SEQ ID No.1或SEQ ID No.4的序列。更优选，这种腺病毒还在Iva2基因的基因组位置含有修饰。该基因最好被放置在E4区。

根据另一实施方案，涉及pIX和IVa2基因均简并化的腺病毒。优选，pIX基因的天然序列被SEQ ID No.1的序列或SEQ ID No.4的序列取代，而IVa2基因的简并化序列是序列SEQ ID No.2或SEQ ID No.5。优选，基因pIX和IVa2的天然序列被序列SEQ ID No.3取代。

根据另一实施方案，所述腺病毒的pIX和IVa2基因被简并化，并在pIX基因的启动子序列中有修饰和/或改换了这些基因的多聚腺苷酸化序列。优选，所述腺病毒含有SEQ ID No.8的序列。

所述腺病毒最好另外含有E1区的至少一种缺失。更优选，这些腺病毒中至少E1和E3区的全部或部分缺陷。还可以是E1和E4区的全部或部分以及可能的E3区缺陷的重组腺病毒。另外，这些腺病毒可以是不同血清型的。对于人源的腺病毒，优选分类至C组的那些。

在人腺病毒的不同血清型中，本发明更优选使用2型或5型腺病毒(Ad2或Ad5)。在源自动物的不同腺病毒中，本发明中优选使用源自狗的腺病毒，特别是腺病毒CAV2的任何毒株[如manhattan株或A26/61(ATCC VR-800)]。其他动物腺病毒尤其记载在专利申请WO94/26914中，后者引入本文作为参考。腺病毒的构建策略以及这些载体中可用于引入目的基因的位点在现有技术中有详细描述，特别是WO95/02697、WO96/10088、WO96/13596或WO96/22378。

根据一种特别有利的方案，在本发明的重组腺病毒中，在Ad5腺病毒的序列上E1区通过缺失从454位至3328位核苷酸的PvuII-BglII片段而失活。该序列可在文献中及数据库(特别见Genebank No.M73260)中找到。根据另一优选的实施方案，E1区通过缺失382-3446位核苷酸的HinfII-Sau3A片段而失活。

有利的是，本发明的重组腺病毒另外还含有欲在细胞、器官或机体中转移和/或表达的外源核酸序列。

具体地讲，外源DNA序列可以包含一个或多个治疗基因和/或一个或多个编码抗原性多肽的基因。

可以被如此转移的治疗基因是在靶细胞中转录和有时翻译产生有治疗效果之产物的任何基因。

特别涉及编码有治疗效果之蛋白产物的基因。所编码的蛋白产物可以是蛋白质、肽、氨基酸等。该蛋白产物可以与靶细胞同源(即在无任何疾病时靶细胞中正常表达的产物)。这种情况下，蛋白的表达例如可以缓解细胞中表达不足或由于变异引起的表达蛋白无活性或活性弱的问题，或可以超量表达所述蛋白。治疗基因还可以编码稳定性提高、活性改变等的细胞蛋白的变异体。这种蛋白产物还可以与靶细胞异源。在这种情况下，所表达的蛋白例如可以补充或带来细胞中所缺陷的活性，从而可以与疾病作斗争。

在本发明的治疗产物中，更具体地可以举出酶，血液衍生物，激素，淋巴因子：白介素、干扰素、TNF等(FR9203120)，生长因子，神经递质或其前体或合成酶，营养因子：BDNF、CNTF、NGF、IGF、GMF、VEGF、aFGF、bFGF、NT3、NT5等；载脂蛋白：ApoAI、ApoAIV、ApoE等(FR9305125)，肌营养不良蛋白或小营养不良蛋白(FR9111947)，肿瘤抑制基因：p53、Rb、Rap1A、DCC、k-rev等(FR9304745)，编码凝血因子的基因：因子VII、VIII、IX等，编码GAX蛋白的基因，自杀基因：胸苷激酶、胞苷脱氨酶等，编码单链抗体(scFV)的基因。

治疗基因还可以是反义基因或序列，其在靶细胞中的表达可以控制细胞基因的表达或mRNA的转录。这种序列例如可以在靶细胞中被转录成与细胞mRNA互补的RNA，从而阻断其翻译或蛋白质，按专利EP 140308中记载的技术进行。

如上文所述，外源DNA序列还可以包含编码能在人体中产生免疫答应之抗原肽的一个或多个基因。在一个具体实施方案中，利用本发明可以制备用于免疫人的病苗，特别是对抗微生物或病毒。特别涉及EB病毒、HIV病毒、乙型肝炎病毒(EP 185573)、伪狂犬病病毒的特异性抗原肽，或肿瘤的特异性抗原肽(EP 259212)。

一般而言，外源核酸序列还含有一个在所感染的细胞中有功能的转录启动区。当在所感染细胞中起作用时，特别可以是天然负责目标基因表达的启动子区。也可以是不同来源的区域(负责其他蛋白的表达，甚至是合成的)。尤其可以是真核或病毒基因的启动子序列。例如，可以是来自欲感染细胞之基因组的启动子序列。同样，可以是来自病毒基因组(包括所用的腺病毒)的启动子序列。对此，例如可以举出E1A、MLP、CMV、RSV等基因的启动子。另外，这些启动子区可以通过添加活化序列、调节序列、或允许组织特异性或集中表达的序列而被修饰。另外，当外源核酸不含启动子序列时，可以在所述缺陷病毒基因组中这种序列的下游插入所述核酸。

另外，外源核酸序列还可以含有-特别是在治疗基因的上游-引导所合成治疗产物进入靶细胞分泌道的信号序列。这种信号序列可以是治疗产物的天然信号序列，但也可以是任何其他功能性信号序列或人工信号序列。

在一有利的具体实施方案中，本发明的载体另外还具有在外源启动子控制下的功能性E3基因。更优选地，这些载体具有能表达gp19K蛋白的E3基因的一部分。该蛋白具有避免腺病毒载体成为免疫反应靶子的作用，所述免疫反应(i)可能限制载体的作用，及(ii)可以有不利的付作用。

这些重组载体可用于核酸向细胞中的体外、离体或体内转移。

本发明还涉及含有一种或多种上述重组腺病毒的任何药物组合物。可配制本发明的药物组合物，用于通过局部、口服、胃肠外、鼻内、静脉内、肌内、皮下、眼内、透皮途径给药。

优选本发明的药物组合物含有适于注射制剂的药物载体，特别是无菌等渗盐水溶液(磷酸单钠盐、二钠盐、氯化钠、钾、钙或镁，等等，或这些盐的混合物)；或为干组合物，特别是冻干品，根据情况加入无菌水或生理盐水后可构成注射溶液。

用于注射的病毒剂量可根据不同的参数调节，特别是根据所用的给药方法、所涉及的疾病、待表达的基因、或寻求治疗的时期。一般而言，本发明的重组腺病毒可以按10⁴-10¹⁴pfu/ml、优选10⁶-10¹⁰pfu/ml的剂量配制和给药。术语pfu(“噬斑形成单位”)相当于病毒溶液的感染能力，通过感染适当的细胞培养物并一般在5天后测定被感染细胞的空斑数目来测定。测定病毒溶液pfu滴度的技术在文献中有大量记载。

借助于下列实施例将更详细地描述本发明，这些实施例应视为说明性的而非限制性的。附图说明

图1：腺病毒和293细胞系间的重组现象。

图2：同质基因的图示结构。

图3：质粒pJJ105的限制图谱。

图4：质粒pJJ110的限制图谱。

图5：质粒pJJ206的限制图谱。

图6：用同质基因代替天然区段的缺陷病毒的构建。

图7：寡核苷酸Oigosyngen I和OligosyngenII的限制性图谱。

图8：pIX基因的天然核苷酸序列和简并化序列(SEQ ID No.1)及相应的氨基酸序列。

图9：Iva2基因的天然核苷酸序列和简并化序列(SEQ ID No.2)及相应的氨基酸序列。

图10：同质基因#1的核苷酸序列(SEQ ID No.3)。

图11：293细胞基因组与重组Ad5载体间同源性的示意图。载体Ad5p53在E1区下游具有连续898个核苷酸的与293细胞基因组的同源序列。引入点突变将同源性的最大长度减至同质基因#1(AV 1.7#1 CMV p53)中的连续92个核苷酸和同质基因#2(AV1.7#2 CMV lacZ)中的29个核苷酸。

图12：在293细胞中连续7次扩增后检测载体Ad5 p53和AV1.7#1 p53的RCA。分子生物学的一般技术

分子生物学中使用的常规方法是本领域技术人员熟知的并在文献中有充分记载，如质粒DNA的制备性提取、质粒DNA的氯化铯梯度离心、琼脂糖或丙烯酰胺凝胶上的电泳、DNA片段的电洗脱纯化、蛋白质的苯酚或苯酚-氯仿提取，盐水介质中DNA的乙醇或异丙醇沉淀、大肠杆菌中的转化等等[Maniatis T.等，分子克隆实验室指南(Molecular Cloning，aLaboratory Manual)，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold SpringHarbor，NY.，1982；Ausubel F.M.等(编)，分子生物学的现代方法(CurrentProtocols in Molecular Biology)，John Wiley & Sons，纽约，1987]。

质粒pIC-20R(Invitrogen)和pBS(Stratagen)是从市场上购得的。

为了进行连接，DNA片段可在琼脂糖或丙烯酰胺凝胶上电泳按大小分离、用苯酚氯仿混合物提取、用乙醇沉淀，然后在T4噬菌体DNA连接酶(Biolabs)存在下按供应商的说明进行保温。

可按供应商的说明用大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段(Biolabs)进行5’突出末端的补平。按制造商的说明使用T4噬菌体DNA聚合酶(Biolabs)进行3’突出末端的破坏。用核酶S1处理进行5’突出末端的破坏。

利用合成寡核苷酸的体外定向诱变可按Taylor等研制的方法[核酸研究(Nucleic Acid Res.13(1985)8749-8764]利用Amersham销售的试剂盒进行。

通过所谓的PCR技术[聚合酶链式反应，Saiki R.K.等，科学(Science)230(1985)1350-1354；Mullis K.B.和Faloona F.A.，酶学方法(Meth.Enzym.) 155(1987)335-350]对DNA片段的酶扩增可按制造商的说明用“DNA热循环仪”(Perkin Elmer Cetus)进行。

核苷酸序列的验证按Sanger等研制的方法[美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，74(1977)5463-5467]利用Amersham销售的试剂盒进行。所用的细胞系

-人胎肾细胞系293(Graham等，普通病毒学杂志(J.Gen.Virol.)36(1977)59)。该细胞系含表整合在其基因组中的人腺病毒Ad5基因组的左侧部分(12％)。实施例1：腺病毒中的同源重组

腺病毒基因组可遭受遗传重组的报道已有25年以上(Williams和Ustacelibi，1971)。但支持这些现象的机制仍远未被阐明。有人提出重组和复制可能紧密相关，一些资料支持这样的重组模型，其中复制会产生腺病毒感染时常观察到的重组所需的特异性底物。问题之一是要知道病毒或细胞蛋白是否参与重组中间体的形成和中间体向最终重组产生的转化。对此，所试验的病毒基因无一被表明参与了重组现象：E1b、E4、E1a、E3(Epstein，1991；Weinberg等，1986；Young，1995)。同样，没能证明任何细胞蛋白的参与。最后提出了腺病毒基因组中重组机制的两种模型，两者都预言伸展杂合双链的形成(Ahern等，1991；Young，1995)。

负责缺陷基因组和细胞系间同源重组的区域已被特别定位于腺病毒基因组的pIX和IVa2基因。缺陷基因组中该区域的结构示于图2中。

进行了参与与细胞基因组重组之腺病毒基因组的序列修饰。更具体地讲，通过引入沉默突变修饰了pIX和IVa2基因的天然序列，减小了与天然序列的同源性，而不影响这些基因的表达产物的结构。

所得序列(称为同质基因)用于替换腺病毒的相应天然序列，以构建缺陷载体。1.鉴别重组相关区域

基因作图研究表明存在于293细胞基因组中的腺病毒基因组部分相应于腺病毒基因组的左侧部分，占基因组的约12％，即约4300bp(Aiello等，1979；Spector等，1983)。申请人用PCR法进行了补充性基因作图实验，表明4420位存在于293的基因组中。选择该4420位作为以下实验中同源区域的右边界，从而作为同质基因的右边界。出于克隆的技术原因，被修饰的片段延伸至4445位，在此引入了克隆位点。

在pIX基因的表达调节元件中选择同质基因的左末端，特别是在pIX基因的-56位。实际上已证明pIX基因的启动子可被减至56个核苷酸的区域。含SP1连接位点和TATA盒的该区域的活性与250个核苷酸片段的相当(Babiss等，1991；Matsui等，1989)。

因而同源性区域被确定为从缺陷病毒基因组的第3520位延伸至4445位(见图2)。2.设计修饰序列

申请人制作了Ad5腺病毒基因组中的密码子使用情况表，用于确定表达病毒蛋白的最佳密码子使用。该表是综合分析10种腺病毒蛋白后所得数据而获得的：pIX、Hexon、pIII、pVII、52-55k、pPol、pTP、DBP、23K和19K(见表)。所得结果然后与人的密码子使用情况表进行比较，后者是利用GCG程序分析Genbank中1952个基因获得的。

从而确定了密码子使用的优先顺序，用于修饰pIX和IVa2基因的编码序列：

·当天然序列中使用的密码子不是优选的密码子时，在同质基因中使用该优选的密码子。

·当天然序列中使用的密码子是优选的密码子时，使用第二优选的密码子。

在某些情况下，如为了引入限制性位点，可以使用第三优选的密码子，特别是当其频率与第二优选的密码子足够接近时。

下表表示在人和腺病毒(ADV5)中的密码子使用频率，在A列中显示人中的优先顺序，在B列中显示腺病毒中的优先顺序，C列中为同质基因合成中采用的选择。

表1：密码子的使用频率

ADV5 人 A H C

F TTT Phe 2,3 54,2％ 1,5 43,0％ 1 2 -F TTC 1,9 45,8％ 2,1 57,0％ 2 1 -L TTA Leu 0,1 1,4％ 0,6 6,0％ 6 6 6L TTG 1,2 14,2％ 1,1 12,0％ 4 4 4L CTT Leu 1,3 15,6％ 1,1 12,0％ 3 3 3L CTC 1,7 20,5％ 1,9 20,0％ 2 2 2L CTA 1,1 12,6％ 0,6 7,0％ 5 5 5L CTG 3 35,6％ 4 43,0％ 1 1 1I ATT Ile 1,3 34,6％ 1,5 35,0％ 2 2 2I ATC 1,6 43,8％ 2,3 52,0％ 1 1 1I ATA 0,8 21,6％ 0,7 14,0％ 3 3 3M ATG Met 2,6 100,0％ 2,2 100,0％V GTT Val 0,8 13,1％ 1 17,0％ 3 3 3

V GTC 1,4 22,2％ 1,5 25,0％ 2 2 2V GTA 0,8 12,5％ 0,6 10,0％ 4 4 4V GTG 3,3 52,2％ 2,9 48,0％ 1 1 1Y TAT Tyr 0,8 21,6％ 1,2 41,7％ 2 2 2Y TAC 3 78,4％ 1,7 58,3％ 1 1 1* TAA end 0,1 23,8％* TAG 0,1 16,7％H CAT His 0,5 21,3％ 1,4 59,3％ 2 1 -H CAC 1,7 78,7％ 1 40,7％ 1 2 -Q CAA Gln 1,1 27,4％ 1,2 26,7％ 2 2 2Q CAG 3 72,6％ 3,3 73,3％ 1 1 1N AAT Asn 1,2 24,5％ 1,6 43,5％ 2 2 2N AAC 3,6 75,5％ 2,1 56,5％ 1 1 1K AAA Lys 1,4 35,2％ 2,2 39,8％ 2 2 2K AAG 2,5 64,8％ 3,4 60,2％ 1 1 1D GAT Asp 1,6 29,2％ 2,1 44,2％ 2 2 2D GAC 3,9 70,8％ 2,7 55,8％ 1 1 1E GAA Glu 2,4 37,0％ 2,8 41,5％ 2 2 2E GAG 4,1 63,0％ 3,9 58,5％ 1 1 1S TCT Ser 0,8 11,7％ 1,4 18,0％ 4 3 3S TCC 1,7 25,9％ 1,7 23,2％ 2 2 2S TCA 0,6 9,6％ 1,1 14,7％ 5 4 4S TCG 0,9 13,6％ 0,4 5,9％ 3 6 5P CCT Pro 1,2 18,4％ 1,8 29,0％ 4 2 2

P CCC 2,7 39,9％ 2,1 33,0％ 1 1 1P CCA 1,3 18,7％ 1,7 27,0％ 3 3 3P CCG 1,5 23,0％ 0,1 11,0％ 2 4 4T ACT Thr 1,1 17,7％ 1,3 23,0％ 2 3 2T ACC 3,3 55,0％ 2,2 38,0％ 1 1 1T ACA 0,8 12,8％ 1,5 27,0％ 4 2 4T ACG 0,9 14,5％ 0,1 12,0％ 3 4 3A GCT Ala 1,2 13,7％ 2 28,0％ 3 2 2A GCC 4 45,7％ 2,8 40,0％ 1 1 1A GCA 1,1 12,6％ 1,6 22,0％ 4 3 3A GCG 2,4 27,9％ 0,7 10,0％ 2 4 4C Cys TGT 0,3 21,5％ 1 41,8％ 2 2 2C TGC 1,1 78,5％ 1,4 58,2％ 1 1 1* end TGA 0,3 61,9％W Trp TGG 1,3 100,0％ 1,5 100,0％R Arg CGT 0,8 10,4％ 0,5 9,3％ 3 6 6R CGC 4,1 52,4％ 1,1 19,4％ 1 3 1R CGA 0,6 7,0％ 0,6 10,0％ 5 5 5R CGG 1,1 13,9％ 1 18,6％ 2 4 2S Ser AGT 0,4 6,6％ 1 13,6％ 6 5 6S AGC 2,1 32,6％ 1,9 24,7％ 1 1 1R Arg AGA 0,5 6,2％ 1,2 21,0％ 6 2 4R AGG 0,8 10,2％ 1,2 21,7％ 4 1 3G Gly GGT 1 17,7％ 1,4 18,3％ 4 4 4

G GGC 2,4 41,3％ 2,5 33,2％ 1 1 1G GGA 1,3 21,5％ 1,9 25,7％ 2 2 2G GGG 1,1 19,4％ 1,7 22,8％ 3 3 3

在同质基因的第一个具体实例(同质基因#1)中，进行了如下修饰：

-在pIX启动子中：尽可能缩短该序列：保留的片段只含56个核苷酸，而不是该载体中的135个核苷酸。还可以对SP1连接位点和TATA盒之间的9个核苷酸进行额外修饰。

-在pIX基因中：按上述原则对可能位点都进行了简并化，而不改变产生的氨基酸序列(SEQ ID No.1)。天然序列和简并化序列的比较以及这些序列表达产物的结构示于图8中。根据另一策略，只在每10个核苷酸中的一个位点上简并化。在另一策略中，仅在每20个中简并化一个位点。

-在pIX和IVa2间隔区中：在此例中不修饰该59个核苷酸区域的序列。

-在IVa2基因中：按上述原则，对IVa2基因的编码序列中每20bp中的一个进行简并化，而不改变产生的氨基酸的序列(见SEQ ID No.2)。天然序列、简并化序列和生成的氨基酸序列示于图9中。根据另一策略，对每10bp中的一个、甚至所有位点进行简并化，均不改变所产生的氨基酸序列。

同质基因#1的结构示于图2中。同质基因#1的序列示于图2和SEQ IDNo.3中。

同质基因的另一实例为同质基因#2，其中：

-pIX基因的启动子序列用如SEQ ID No.6中所示修饰的序列代替。

-pIX基因的序列由SEQ ID No.4中所示序列代替，而不改变生成的氨基酸序列。

-IVa2基因的序列由SEQ ID No.5中所示序列代替，而不改变生成的氨基酸序列。

-多聚腺苷酸化区域用7型腺病毒(Ad7)中产生相同功能的区域代替：Ad7是用作基因转移载体的B亚组的一种腺病毒(Abrahamsen等，1997，病毒学杂志(J.Virol.)，71，8946-8951)。该序列示于SEQ ID No.7中。

修饰序列的全部称为同质基因#2，示于SEQ ID No.8中。3.同质基因序列的核验

通过信息分析核验天然序列和同质基因的碱基特征。这种核验的目的是研究同质基因中特定结构的存在与否，特别是：

·绞接的供者或受者位点(SpliceView和/或Splice Net程序)，

·多聚腺苷酸化位点(Hcpolya程序)，

·转录因子的潜在连接位点(Transfac程序)，

·易于形成直接重复、别针型特定二级结构的区域(Sigscan程序，BNL)，包括相应的sRNA中的(RNA折叠)，

·CHI或M26型保守位点。

当鉴别出这种序列时，相应的碱基可任选性地按上述第2点中的策略进行替换。4.用同质基因#1取代相应天然区域的缺陷病毒的构建

1)起始材料：

·同质基因#1(SEQ ID No.3)

·分别相应于同质基因#1 5’和3’末端的寡核苷酸SyngenI和syngenII示于图7中。

·质粒pJJ105(图3)

·质粒pJJ110(图4)

·质粒pIC-20R(Invitrogen)

·质粒pSyngen：同质基因克隆在pBS(Stratagen)中。

2)缺陷病毒基因组的构建

构建策略示于图6中。

质粒pJJ110用XbaI消化，生成的4.8和5.0kb的XbaI片段互相连接形成质粒pJJ201。质粒pJJ201然后用BstEII和XmaI消化、填平并连接，形成质粒pJJ202。BstEII和XmaI两个位点被保留。

利用寡核苷酸syngenI和syngenII及作为模板的质粒pJJ105制备相应于IVa2基因片段(Fgt IVa2，图6)的PCR扩增产物。寡核苷酸syngen I的序列(SEQ ID No.9)AACTGCAGGCCGGCCACTAGTCGCGATGTTCCCAGCCATATCCC寡核苷酸syngenII的序列(SEQ ID No.10)CCGCTCGAGGTGACCGCTAGCCATTATGGACGAATGC

将扩增的片段插入在pIC-20R的SamI位点，生成pJJ203。用NsiI/BstEII切下质粒pJJ105中IVa2基因的邻接片段(片段2，在图6中称为Fgt2 Iva2)，然后插入在pJJ203的相应位点上，生成pJJ204。然后用FseI/NruI消化同质基因(图6)，插入在pJJ204的相应位点间，生成pJJ205。

pJJ205的完整片段(同质基因#1-Fgt 1+2 IVa2)用Sse8387I/BstEII消化，并插入在pJJ202的相应位点，生成pJJ206(图5)。

该片段然后用于按Crouzet等(PNAS(94)1414-1419(1997))描述的方法制备含腺病毒修饰基因组(E1及可能的E3缺陷，含同质基因#1)的原核质粒。然后将所得的质粒转染在293细胞中，以产生相应的病毒。

进行了一项实验，比较两病毒AV.17#1CMVp53和Ad5CMVp53借助于293细胞繁殖时，RCA(复制活性腺病毒)出现的能力。

含有序列SEQ ID No.3(同质基因#1)并带有p53表达盒(CMV-p53-polyASV40)的载体(AV1.7#1CMVp53)按Crouzet等(PNAS(94)1414-1419(1997))的方法构建。

Ad5CMVp53含有Ad5(未修饰)的pIX-IVa2区。两种病毒的p53表达盒是同源的。两种病毒AV1.7#1CMVp53和Ad5CMVp53在293细胞中有相似的生产能力。对于每种病毒，在293细胞上纯化到5个噬斑。在7次连续转代中，扩增了2×5个噬斑。该扩增后，在RCA检测试验中分析了第7次传代的2×5个样品。该试验以3份平行进行。结果示于图12中。

RCA的检测方法是一种定量方法，可计算所测样品剂量中的噬斑，其数目相应于RCA的数目。给定剂量的样品病毒(一般3×10¹⁰pv)用于感染一层非补充性细胞(即不表达E1，如A549细胞)，在其上铺一层琼脂。14天后，当起始的感染病毒中含RCV时在细胞层中可观察到噬斑的形成。

以三份重复进行的RCA检测实验的结果为：AV1.7#1CMVp53的0 RCA和Ad5CMVp53的6 RCA。当使用一种利用观察条件概率的比较统计方法时，该结果是相当显著的。与常规载体相比，载体AV1.7#1CMVp53在293细胞中繁殖时RCA出现频率的降低有统计学显著的改善。这些结果一起证明同质基因的存在不影响所产生病毒的滴度，以及含同质基因#1的病毒产品没有RCA的污染。5.用同质基因#2替代相应天然区域的缺陷病毒的功能性

以同样方式构建了具有同质基因#2、带有LacZ表达盒(CMV-LacZ)的相似载体：AV1.7#2CMV lacZ。该载体的生产能力与带有LacZ表达盒(RSVLacZ)但pIX和IvaZ区未修饰(野生Ad5的序列)的载体AV1.0RSV lacZ进行了比较。在293细胞中平行测试了两种载体AV1.7#2 CMV lacZ和AV1.0RSV lacZ的生产能力。结果示于下表中。

	AV1.7#2CMV lacZ	AV1.0RSV lacZ
	AV1.7#2CMV lacZ	AV1.0RSV lacZ	储液1的滴度(pv/ml)	1.12×10¹²	1.50×10¹²
储液2的滴度(pv/ml)	1.52×10¹²	1.82×10¹²	储液1的滴度(pv/ml)	1.12×10¹²	1.50×10¹²
储液2的滴度(pv/ml)	1.52×10¹²	1.82×10¹²	对储液2测得的生产能力(pv/细胞)	10133	12133
对储液2测得的生产能力(tdu/细胞)	203	207	对储液2测得的生产能力(pv/细胞)	10133	12133

这些结果表明象同质基因#2这样的同质基因在被引入代替5型腺病毒的野生序列时，不仅是有效的而且使生产能力提高；同质基因#2具有比同质基因#1更低的同源性，除pIX和Iva2基因中的沉默突变外还含有非编码区中的修饰(即pIX基因的启动子和pIX和Iva2的交错多聚腺苷酸化序列中)。6.构建其中仅pIX基因的天然序列用SEQ ID No.1中的简并化序列代替而IVa2基因相应的同源区域转移到E4区中的缺陷病毒

根据另一实施方式，只有pIX基因的天然序列用示于SEQ ID No.1中的简并化序列取代，而Iva2基因的相应同源区域被转移到E4区中。Iva2基因的克隆记载于专利申请WO96/10088中，后者引入本文作为参考。

构建的第一个称为pIE11的质粒含有如下3个区域，克隆在带KanR和SacB基因的质粒colE1中：

-用下列引物从Ad5产生的PCR产物：

5′-atcgatcgATAACAGTCAGCCTTACC-3′和

5′-agctgaattcCATCATCAATAATATACC-3′；该PCR产物含有右侧ITR和直到orf1之ATG(不包括)的E4启动子(35525-35937核苷酸)。

-记载于专利申请WO96/10088中的IVa2基因的cDNA。

-含有E4 orf6绞接所需序列和直到EcoRV位点的orf6编码序列的Ad5 XcmI-EcoRV片段。

质粒pIE11中IVa2的cDNA之前有一个多余的ATG。用Clontech的Transformer定点诱变试剂盒进行定向诱变，破坏质粒pIE11上的该位点，形成其中该ATG已被破坏的质粒pIE12。

衍生自质粒pIE12的质粒pIE12c含有按如下修饰的5型腺病毒基因组：IVa2基因从其天然座位转移到E4区中，E4的orf1-4用IVa2的cDNA取代，缺失E3，在E1的位置上插入表达盒RSV-lacZ。通过如专利申请WO96/10088中所述利用Crouzet等(PNAS(94)1414-1419(1997)，引入本文作为参考)所述技术与质粒pXL2788βGal重组获得质粒pIE12c。

用PacI酶消化后，质粒pIE12c被感染在293细胞中，获得扩增的病毒。发现病毒AdIE12的限制性图谱与预期的一致。

对所产生的病毒产品的分析表明用pIX基因的简并化序列代替天然序列而IVa2基因转移到E4区中不影响所产生病毒的滴度，在上文所述条件下试验时发现病毒产品无RCA污染。

参考文献Abern等(1991)PNAS 88：105Aiello等(1979)病毒学(Virol.)94：460Babiss和Vales(1991)病毒学杂志(J.Virol.)65：598Epstein(1991)病毒学杂志65：4475Gangloff等(1994)Experientia 50：261Holliday(1964)遗传学研究(Genet.Res.)5：282-304Jeong-Yu和Carroll(1992)分子细胞生物学(Mol.Cell Biol.)12(1)：112-9。Lin等(1991)分子细胞生物学10(1)：103-12Matsui(1989)分子细胞生物学9：4265Meselson M.Radding C.(1975)美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，80：358-361。Spector(1983)病毒学130：533Szostak等(1983)细胞(Cell)33：25-35。Waldman和Liskay(1987)PNAS 84(15)5340-4Weinberg(1986)病毒学杂志57：833Williams和Ustacelibi(1971)普通病毒学杂志(J.Gen.Virol.)13：345Young(1995)微生物学和免疫学的现代话题(Current Topics in Microbiol.and Immunol.)199：89。

序列表(1)一般信息：

(i)申请人：

(A)名称：RHONE-POULENC RORER

(B)街道：Raymond Aron大街20号

(C)城市：Antony

(E)国家：法国

(F)邮编：92165

(H)传真：0155717291

(ii)发明名称：用于减少同源重组现象的方法

(iii)序列数目：

(iv)计算机可读形式：

(A)载体类型：软盘

(B)计算机：IBM PC兼容机

(C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS

(D)软件：PatentIn Release#1.0，#1.30版(EPO)(2)SEQ ID No.1的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：424碱基对

(B)类型：核苷酸

(C)链数：单链

(D)构型：线性

(ii)分子类型：cDNA

(iii)假拟：否

(iv)反义：否

(ix)特征：

(A)名称/关键词：CDS

(B)位置：1..424

(xi)SEQ ID No.1的序列描述：ATG TCC ACG AAT TCC TTT GAC GGC TCC ATC GTC TCC AGC TAC CTG ACC 48Met Ser Thr Asn Ser Phe Asp Gly Ser Ile Val Ser Ser Tyr Leu Thr1 5 10 15ACC CGG ATG CCT CCC TGG GCT GGC GTC CGC CAA AAC GTC ATG GGA AGC 96Thr Arg Met Pro Pro Trp Ala Gly Val Arg Gln Asn Val Met Gly Ser

20 25 30TCC ATC GAC GGC AGG CCT GTG CTC CCT GCC AAT AGC ACC ACT CTG ACT 144Ser Ile Asp Gly Arg Pro Val Leu Pro Ala Asn Ser Thr Thr Leu Thr

35 40 45TAT GAA ACT GTC AGC GGC ACC CCA CTG GAA ACC GCC GCA AGC GCT GCA 192Tyr Glu Thr Val Ser Gly Thr Pro Leu Glu Thr Ala Ala Ser Ala Ala

50 55 60GCC AGC GCT GCC GCC GCT ACT GCT CGG GGC ATC GTC ACC GAT TTC GCC 240Ala Ser Ala Ala Ala Ala Thr Ala Arg Gly Ile Val Thr Asp Phe Ala65 70 75 80TTT CTC TCC CCT CTG GCC TCC AGC GCT GCC AGC CGC AGC TCT GCT CGG 288Phe Leu Ser Pro Leu Ala Ser Ser Ala Ala Ser Arg Ser Ser Ala Arg

85 90 95GAC GAT AAA CTG ACC GCC CTG CTG GCT CAG CTG GAC AGC CTG ACT AGG 336Asp Asp Lys Leu Thr Ala Leu Leu Ala Gln Leu Asp Ser Leu Thr Arg

100 105 110GAG CTG AAC GTG GTG AGC CAA CAA CTC CTG GAC CTC CGG CAA CAA GTG 384Glu Leu Asn Val Val Ser Gln Gln Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gln Val

115 120 125AGC GCT CTC AAA GCC TCT AGC CCA CCT AAC GCC GTT TAA A 424Ser Ala Leu Lys Ala Ser Ser Pro Pro Asn Ala Val *

130 135 140(2)SEQ ID No.2的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：357碱基对

(B)类型：核苷酸

(C)链数：单链

(D)构型：线性

(ii)分子类型：cDNA

(iii)假拟：否

(iv)反义：否

(ix)特征：

(A)名称/关键词：CDS

(B)位置：1.354

(xi)SEQ ID No.2的序列描述：ATC GCG AAC CTA AAA ATA CAG TCC AAG ATG CAT CTG ATA TCC CCA CGT 48Ile Ala Asn Leu Lys Ile Gln Ser lys Met His Leu Ile Ser Pro Arg1 5 10 15ATG CAC CCC TCC CAG CTT AAC CGC TTC GTA AAC ACT TAC ACC AAG GGA 96Met His Pro Ser Gln Leu Asn Arg Phe Val Asn Thr Tyr Thr Lys Gly

20 25 30CTG CCC CTG GCA ATC AGC CTG CTA CTG AAA GAC ATT TTC AGG CAC CAC 144Leu Pro Leu Ala Ile Ser Leu Leu Leu Lys Asp Ile Phe Arg His His

35 40 45GCC CAG CGG TCC TGC TAC GAC TGG ATT ATC TAC AAC ACC ACT CCG CAG 192Ala Gln Arg Ser Cys Tyr Asp Trp Ile Ile Tyr Asn Thr Thr Pro Gln

50 55 60CAT GAA GCT CTC CAG TGG TGC TAC CTC CAT CCC AGA GAC GGG CTT ATG 240His Glu Ala Leu Gln Trp Cys Tyr Leu His Pro Arg Asp Gly Leu Met65 70 75 80CCT ATG TAT CTG AAC ATC CAG AGC CAC CTT TAC CAC GTC CTC GAA AAA 288Pro Met Tyr Leu Asn Ile Gln Ser His Leu Tyr His Val Leu Glu Lys

85 90 95ATA CAC AGG ACC CTG AAC GAC CGA GAC CGC TGG TCT CGG GCC TAC CGC 336Ile His Arg Thr Leu Asn Asp Arg Asp Arg Trp Ser Arg Ala Tyr Arg

100 105 110GCG CGG AAA ACC CCT AAA TAA 357Ala Arg Lys Thr Pro Lys

115(2)SEQ ID No.3的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：941碱基对

(B)类型：核苷酸

(C)链数：单链

(D)构型：线性

(ii)分子类型：cDNA

(iii)假拟：否

(iv)反义：否

(ix)特征：

(A)名称/关键词：外显子

(B)位置：1.941

(xi)SEQ ID No.3的序列描述：GGCCGGCCGT CGACTGTGTG GGCGTGGCTT AAGGGTGGGA AAGAATATAT AAGGTGGGGG 60TCTTATGTAG TTTTGTATCT GTTTTGCAGC AGCCGCCGCC GCCATGTCCA CGAATTCCTT 120TGACGGCTCC ATCGTCTCCA GCTACCTGAC CACCCGGATG CCTCCCTGGG CTGGCGTCCG 180CCAAAACGTC ATGGGAAGCT CCATCGACGG CAGGCCTGTG CTCCCTGCCA ATAGCACCAC 240TCTGACTTAT GAAACTGTCA GCGGCACCCC ACTGGAAACC GCCGCAAGCG CTGCAGCCAG 300CGCTGCCGCC GCTACTGCTC GGGGCATCGT CACCGATTTC GCCTTTCTCT CCCCTCTGGC 360CTCCAGCGCT GCCAGCCGCA GCTCTGCTCG GGACGATAAA CTGACCGCCC TGCTGGCTCA 420GCTGGACAGC CTGACTAGGG AGCTGAACGT GGTGAGCCAA CAACTCCTGG ACCTCCGGCA 480ACAAGTGAGC GCTCTCAAAG CCTCTAGCCC ACCTAACGCC GTTTAAAACA TAAATAAAAA 540ACCAGACTCT GTTTGGATTT GGATCAAGCA AGTGTCTTGC TGTCTTTATT TAGGAGTTTT 600CCGCGCGCGG TAGGCCCGAG ACCAGCGGTC TCGGTCGTTC AGGGTCCTGT GTATTTTTTC 660GAGGACGTGG TAAAGGTGGC TCTGGATGTT CAGATACATA GGCATAAGCC CGTCTCTGGG 720ATGGAGGTAG CACCACTGGA GAGCTTCATG CTGCGGAGTG GTGTTGTAGA TAATCCAGTC 780GTAGCAGGAC CGCTGGGCGT GGTGCCTGAA AATGTCTTTC AGTAGCAGGC TGATTGCCAG 840GGGCAGTCCC TTGGTGTAAG TGTTTACGAA GCGGTTAAGC TGGGAGGGGT GCATACGTGG 900GGATATGAGA TGCATCTTGG ACTGTATTTT TAGGTTCGCG A 941(2)SEQ ID No.4的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：423碱基对

(B)类型：核苷酸

(C)链数：单链

(D)构型：线性

(ii)分子类型：cDNA

(iii)假拟：否

(iv)反义：否

(ix)特征：

(A)名称/关键词：CDS

(B)位置：1.423

(xi)SEQ ID No.4的序列描述：ATG AGC ACG AAT TCG TTT GAC GGA AGC ATC GTC AGC TCA TAC TTG ACC 48Met Ser Thr Asn Ser Phe Asp Gly Ser Ile Val Ser Ser Tyr Leu Thr1 5 10 15ACG CGC ATG CCT CCC TGG GCC GGG GTG CGC CAG AAT GTC ATG GGC TCC 96Thr Arg Met Pro Pro Trp Ala Gly Val Arg Gln Asn Val Met Gly Ser

20 25 30AGC ATT GAC GGT CGC CCT GTC CTG CCT GCA AAC TCT ACC ACT TTG ACC 144Ser Ile Asp Gly Arg Pro Val Leu Pro Ala Asn Ser Thr Thr Leu Thr

35 40 45TAC GAA ACC GTG TCT GGC ACG CCG TTG GAA ACT GCA GCA TCC GCC GCC 192Tyr Glu Thr Val Ser Gly Thr Pro Leu Glu Thr Ala Ala Ser Ala Ala

50 55 60GCT AGC GCC GCT GCA GCT ACC GCC CGC GGG ATC GTG ACT GAT TTT GCT 240Ala Ser Ala Ala Ala Ala Thr Ala Arg Gly Ile Val Thr Asp Phe Ala65 70 75 80TTT CTG AGC CCG CTT GCC AGC AGT GCA GCC TCC CGT TCA TCT GCC CGC 288Phe Leu Ser Pro Leu Ala Ser Ser Ala Ala Ser Arg Ser Ser Ala Arg

85 90 95GAT GAC AAA TTG ACG GCT CTT CTG GCT CAG CTG GAT TCT TTG ACT CGG 336Asp Asp Lys Leu Thr Ala Leu Leu Ala Gln Leu Asp Ser Leu Thr Arg

100 105 110GAA CTT AAC GTC GTT TCT CAG CAA CTG TTG GAC CTG CGC CAG CAA GTT 384Glu Leu Asn Val Val Ser Gln Gln Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gln Val

115 120 125TCT GCC CTC AAG GCT TCT TCC CCT CCC AAT GCC GTT TAA 423Ser Ala Leu Lys Ala Ser Ser Pro Pro Asn Ala Val *

130 135 140(2)SEQ ID No.4的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：141氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)构型：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(xi)SEQ ID No.4的序列描述：Met Ser Thr Asn Ser Phe Asp Gly Ser Ile Val Ser Ser Tyr Leu Thr1 5 10 15Thr Arg Met Pro Pro Trp Ala Gly Val Arg Gln Asn Val Met Gly Ser

20 25 30Ser Ile Asp Gly Arg Pro Val Leu Pro Ala Asn Ser Thr Thr Leu Thr

35 40 45Tyr Glu Thr Val Ser Gly Thr Pro Leu Glu Thr Ala Ala Ser Ala Ala

50 55 60Ala Ser Ala Ala Ala Ala Thr Ala Arg Gly Ile Val Thr Asp Phe Ala65 70 75 80Phe Leu Ser Pro Leu Ala Ser Ser Ala Ala Ser Arg Ser Ser Ala Arg

85 90 95Asp Asp Lys Leu Thr Ala Leu Leu Ala Gln Leu Asp Ser Leu Thr Arg

100 105 110Glu Leu Asn Val Val Ser Gln Gln Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gln Val

115 120 125Ser Ala Leu Lys Ala Ser Ser Pro Pro Asn Ala Val *

130 135 140(2)SEQ ID No.5的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：270碱基对

(B)类型：核苷酸

(C)链数：单链

(D)构型：线性

(ii)分子类型：cDNA

(iii)假拟：否

(iv)反义：否

(ix)特征：

(A)名称/关键词：CDS

(B)位置：1.270

(xi)SEQ ID No.5的序列描述：ACC AAG GGC CTG CCC CTC GCA ATC AGC TTG CTA CTC AAA GAC ATT TTT 48Thr Lys Gly Leu Pro Leu Ala Ile Ser Leu Leu Leu Lys Asp Ile Phe1 5 10 15AGG CAT CAC GCC CAG CGC TCC TGT TAC GAC TGG ATC ATC TAC AAT ACC 96Arg His His Ala Gln Arg Ser Cys Tyr Asp Trp Ile Ile Tyr Asn Thr

20 25 30ACC CCG CAG CAT GAA GCC CTG CAG TGG TGC TAC CTG CAC CCC AGA GAC 144Thr Pro Gln His Glu Ala Leu Gln Trp Cys Tyr Leu His Pro Arg Asp

35 40 45GGG CTG ATG CCC ATG TAT CTG AAT ATC CAG AGT CAC CTT TAT CAC GTC 192Gly Leu Met Pro Met Tyr Leu Asn Ile Gln Ser His Leu Tyr His Val

50 55 60CTG GAA AAA ATA CAT AGG ACC CTC AAC GAC CGA GAT CGC TGG TCC CGG 240Leu Glu Lys Ile His Arg Thr Leu Asn Asp Arg Asp Arg Trp Ser Arg65 70 75 80GCC TAT CGC GCG CGC AAA ACC CCT AAA TAA 270Ala Tyr Arg Ala Arg Lys Thr Pro Lys *

85 90(2)SEQ ID No.5的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：90氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)构型：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(xi)SEQ ID No.5的序列描述：Thr Lys Gly Leu Pro Leu Ala Ile Ser Leu Leu Leu Lys Asp Ile Phe1 5 10 15Arg His His Ala Gln Arg Ser Cys Tyr Asp Trp Ile Ile Tyr Asn Thr

20 25 30Thr Pro Gln His Glu Ala Leu Gln Trp Cys Tyr Leu His Pro Arg Asp

35 40 45Gly Leu Met Pro Met Tyr Leu Asn Ile Gln Ser His Leu Tyr His Val

50 55 60Leu Glu Lys Ile His Arg Thr Leu Asn Asp Arg Asp Arg Trp Ser Arg65 70 75 80Ala Tyr Arg Ala Arg Lys Thr Pro Lys *

85 90(2)SEQ ID No.6的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：103碱基对

(B)类型：核苷酸

(C)链数：单链

(D)构型：线性

(ii)分子类型：其它核酸

(iii)假拟：否

(iv)反义：否

(ix)特征：

(A)名称/关键词：-

(B)位置：1.103

(xi)SEQ ID No.6的序列描述：GGCCGGCCGT CGACTGTGTG GGCGTGGCAT AAGGGTGGGA AAGAATATAT AAGGTCGGGG 60TCTCATCTAG TCTTGTATCT GATTTGCAGT AGCCGCCGCC ACC 103(2)SEQ ID No.7的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：52碱基对

(B)类型：核苷酸

(C)链数：单链

(D)构型：线性

(ii)分子类型：cDNA

(iii)假拟：否

(iv)反义：否

(ix)特征：

(A)名称/关键词：-

(B)位置：1..52

(xi)SEQ ID No.7的序列描述：

AGATCTCAAA TCAATAAATA AAGAAATACT TGTTATAAAA ACAAATGAAT GT 52(2)SEQ ID No.8的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：847碱基对

(B)类型：核苷酸

(C)链数：单链

(D)构型：线性

(ii)分子类型：其它核酸

(iii)假拟：否

(iv)反义：否

(ix)特征：

(A)名称/关键词：-

(B)位置：1.847

(xi)SEQ ID No.8的序列描述：GGCCGGCCGT CGACTGTGTG GGCGTGGCAT AAGGGTGGGA AAGAATATAT AAGGTCGGGG 60TCTCATCTAG TCTTGTATCT GATTTGCAGT AGCCGCCGCC ACCATGAGCA CGAATTCGTT 120TGACGGAAGC ATCGTCAGCT CATACTTGAC CACGCGCATG CCTCCCTGGG CCGGGGTGCG 180CCAGAATGTC ATGGGCTCCA GCATTGACGG TCGCCCTGTC CTGCCTGCAA ACTCTACCAC 240TTTGACCTAC GAAACCGTGT CTGGCACGCC GTTGGAAACT GCAGCATCCG CCGCCGCTAG 300CGCCGCTGCA GCTACCGCCC GCGGGATCGT GACTGATTTT GCTTTTCTGA GCCCGCTTGC 360CAGCAGTGCA GCCTCCCGTT CATCTGCCCG CGATGACAAA TTGACGGCTC TTCTGGCTCA 420GCTGGATTCT TTGACTCGGG AACTTAACGT CGTTTCTCAG CAACTGTTGG ACCTGCGCCA 480GCAAGTTTCT GCCCTCAAGG CTTCTTCCCC TCCCAATGCC GTTTAAAGAT CTCAAATCAA 540TAAATAAAGA AATACTTGTT ATAAAAACAA ATGAATGTTT ATTTAGGGGT TTTGCGCGCG 600CGATAGGCCC GGGACCAGCG ATCTCGGTCG TTGAGGGTCC TATGTATTTT TTCCAGGACG 660TGATAAAGGT GACTCTGGAT ATTCAGATAC ATGGGCATCA GCCCGTCTCT GGGGTGCAGG 720TAGCACCACT GCAGGGCTTC ATGCTGCGGG GTGGTATTGT AGATGATCCA GTCGTAACAG 780GAGCGCTGGG CGTGATGCCT AAAAATGTCT TTGAGTAGCA AGCTGATTGC GAGGGGCAGG 840CCCTTGG 847(2)SEQ ID No.9的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：44碱基对

(B)类型：核苷酸

(C)链数：单链

(D)构型：线性

(ii)分子类型：其它核酸

(iii)假拟：否

(iv)反义：否

(ix)特征：

(A)名称/关键词：-

(B)位置：1..44

(xi)SEQ ID No.9的序列描述：

AACTGCAGGCCGGCCACTAGTCGCGATGTTCCCAGCCATATCCC(2)SEQ ID No.10的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：37碱基对

(B)类型：核苷酸

(C)链数：单链

(D)构型：线性

(ii)分子类型：其它核酸

(iii)假拟：否

(iv)反义：否

(ix)特征：

(A)名称/关键词：-

(B)位置：1..37

(xi)SEQ ID No.10的序列描述：

CCGCTCGAGGTGACCGCTAGCCATTATGGACGAATGC

Claims

1.用于减小核酸间分子内或分子间同源重组现象之频率的方法，其特征在于至少配对重组核酸之一的序列被简并化，以减小与其他配偶体的同源性。

2.根据权利要求1的方法，其特征在于以每20个碱基对中1个碱基对的比例对序列简并化。

3.根据权利要求1的方法，其特征在于以每10个碱基对中1个碱基对的比例对序列简并化。

4.根据权利要求1的方法，其特征在于在所有可能的位点上对序列简并化。

5.根据权利要求1的方法，其特征在于根据将使用核酸的细胞或机体中的密码子使用情况进行所述简并化。

6.根据权利要求1的方法，其用于减小染色体核酸与染色体外核酸间分子间同源重组现象的频率。

7.根据权利要求6的方法，其特征在于染色体核酸编码缺陷病毒的补充功能，染色体外核酸包含所述缺陷病毒的基因组。

8.根据权利要求7的方法，其特征在于染色体核酸包含腺病毒基因组的E1区以及一个侧翼序列，染色体外核酸包含E1区缺陷的腺病毒基因组。

9.根据权利要求8的方法，其特征在于E1区缺陷的腺病毒基因组的序列在pIX基因中简并化。

10.根据权利要求1的方法，其特征在于E1区缺陷的腺病毒基因组的序列在IVa2基因中简并化。

11.通过在293细胞系或衍生细胞中引入缺陷重组腺病毒的基因组制备所述缺陷重组腺病毒的方法，其特征在于所述基因组中含：

-E1区的缺失

-pIX和IVa2基因中的简并化。

12.一种缺陷重组腺病毒，其特征在于其基因组包含序列被简并化的至少一个区域。

13.根据权利要求12的腺病毒，其特征在于简并化区域包括pIX基因。

14.根据权利要求13的腺病毒，其特征在于pIX的简并化序列选自SEQ ID No.1或SEQ ID No.4的序列。

15.根据权利要求13或14的腺病毒，其特征在于另外IVa2基因处于不同于其原始位置的基因组位置中。

16.根据权利要求15的腺病毒，其特征在于IVa2基因位于E4区中。

17.根据权利要求12的腺病毒，其特征在于简并化区域包含pIX和IVa2基因。

18.根据权利要求17的腺病毒，其特征在于简并化区域是SEQ ID No.3或SEQ ID No.8的序列。

19.根据权利要求12-18之一的腺病毒，其特征在于它包含E1区的缺失。